Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Бета-гликозидазы женьшеня (Panax ginseng, G.A.Meyer)

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Бета-гликозидазы женьшеня (Panax ginseng, G.A.Meyer)"

МИНИСТЕРСТВО НАУКИ, ВЫСШЕЙ ШКОЛЫ И ТЕХНИЧЕСКОЙ ПОЛИТИКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

1

Ростовский ордена Трудового Красного Знамени

государственный университет Специализированный совет К 063.52.09.

На правах рукописи. УДК.577.154.2.

р-Гликозидазы женьшеня (Рапах ginseдg> С.А.Меуег).

(03.00.04-биологическая химия)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук.

Тувик Валентина Перфирьевна

Ростов на Дону 1993год.

/

Работа выполнена в Научно-исследовательском биологическом

институте при Ростовском ордена Трудового Красного Знамени

i

государственном университете.

Научный руководитель- кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Р.М.Кесслер (г. Ростов на Дону). Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

института им. А.Н.Баха РАЯ В.А.ГТасешниченко (г. Москва); кандидат биологических наук, старший научный сотрудник НПО "Дон" А.К.Сулейманов (г.Ростов на Дону). Ведущая организация: Институт молекулярной биологии и генетики

АН Украины (г.Киев).

Защита диссертации состоится " /у" ■ ,J 1993г. на засе-

дании специализированного совета К 063.52.09. в Ростовском государственном университете (r.FocroB на Дону, ул. Б.Садовая, 105).

С диссертацией мокно ознакомиться в библиотеке РГУ.

Автореферат разослан " 3 " С&и'г1. ?о1993г.

Ученый секретарь специализированного совета,

доктор биологических яэук /^¡'^ В.Н.Кирой

Актуальность проблемы. р-Гликозидазы представляют собой обширную и разнообразную группу гидролитических ферментов, которые катализируют гидролиз гликозидшх связей в различных углеводсо-.даржзщих-собдинениях. Среди многочисленных функций, осуществляемых р-гликозидазами, следует отметить их важную роль в метаболизме вторичных соединений, разнообразие и богатство которых является отличительным свойством растительного мира. Исследований, касающихся участия р-гликозидаз в указанных процессах, пока крайне недостаточно. В особенности, это относится к культивируемым тканям растений- продуцентам Физиологически активных веществ.

Особое значение изучение активности и свойств р-гликозидаз в различных органах, тканях, клеточных культурах приобретает в

том случае, если в качестве объекта исследования используются

i

ценные лекарственные растения, такие, например, как женьшень.

В корнях и наземной части женьшеня содержатся стероидные гликозидц- гинзенозида, обладающие уникальными лекарственными' свойствами. Стероидные гликозиды из корней женьшеня настоящего (Panax ginseng, G.A.Meyer) обладают ярко выраженной биологической активностью, в том числе адаптогенной, противоопухолевой, антимутагенной, антиоксидантной, противосклеротической и многими другими. Несомненно, что в последние года при возрастающем дефиците природных препаратов и сырья, большое значение приобретает проблема поиска источников сырья методами биотехнологии и изучение метаболизма гинзенозидов.

Сравнительное изучение р-гликозидаз в различных органах и культуре тканей женьшеня, динамики ферментативной активности и изоферментного спектра на различных этапах развития растений и роста культуры клеток будет способствовать выяснению механизмов

регуляции активности этих ферментов и их функциональной роли в процессе жизнедеятельности дифференцированных и дедифференциро-вэнных клеток.

Изучение активности р-гликозидаз женьшеня может иметь не только теоретическое, но и практическое значение, поскольку сведения об их распространении и динамике в различных органах и тканях могут оказаться полезными при выборе сроков сбора, условий хранения и переработки растительного сырья, времени пассирования культивируемых тканей. Активность р-гликозидаз в определенной степени может служить биохимическим индикатором метаболизма стероидных гликозидов.

Цель и задачи исследования.Настоящая работа посвящена изучению активности, свойств и особенностей действия 8-глюкозидазы

I

и (З-галактозидазы корня, листьев и каллусной культуры женьшеня на синтетические и природные субстраты. ■

Целью работы было изучение р-гликозидаз женьшеня настоящего и установление их участия в..трансформации стероидных гликозидоа. __ Для достижения этой цели нами были поставлены следующие задачи:

1.Выделение и очистка р-гликозидаз из различных тканей женьшеня.

2.Исследование уровня активности, изоферментного спектра и молекулярных форм р-гликозидаз в различных дифференцированных и дедифференцированных тканях женьшеня настоящего.

3.Изучение некоторых физико-химических свойств р-гликозидаз.

4. Сравнительное изучение сезонных изменений изоферментного спектра в запасающих тканях женьшеня.

5. Изучение гадролазной и гликозилирушей способностей р-гликозидаз женьшеня з отношении эндогенных субстратов.

Научная новизна работы состоит в выявлении в различных тканях женьшеня комплекса р-гликозидаз, которые расщепляют эндоген-

ные стероидные гликозиды. Впервые выделены и частично очищены ¡3-глюкозидаза и (3-галактозидаза из различных тканей женьшеня. Определены их физико-химические свойства (рН-оптимум, отношение к ингибиторам, молекулярные массы, кинетические константы и др.).

Изучена сезонная динамика ферментов и их изоферментный спектр в корне женьшеня. Обнаружены изменения в активности р-гликозидаз и содержании гинзенозидов в каллусной культуре женьшеня. Полученные сведения расширяют представления о свойствах и роли р-гликозидаз и указывают на возможность их участия в метаболизме сапонинов женьшеня.

Практическая значимость работы. Уровень активности р-гликозидаз может быть использован как адекватный биохимический показатель стадии и уровня синтетической активности культивируемых тканей женьшеня. Препараты р-глюкозидззы можно использовать для модификации стероидных гликозидов в биотехнологических процессах. Экспериментальные данные полученные в работе могут быть использованы для разработки технологии хранения и переработки ценного растительного сырья. Апробация работы. Результаты работы докладывались на научно-практической конференции "Женьшень и люда" (г. Москва,1991), II Съезде общества физиологов растений (г.Минск, 1991), 4 Международной конференции "Виоантиоксидант" (г.Москва, 1992), 2 Международной конференции "Биология культивируемых клеток и биотехнология" (г.Алма-Ата, 1993).

Результаты исследований опубликованы в 6 печатных работах. Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов работы, обсуждения результатов, выводов и списка использованной литературы, содержащего 185 наименований. Работа

изложена на 153 страницах машинописного текста, включая 13 таблиц и 47 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

В качестве источника р-гликозидазных активностей были ис-пользоеэны различные органы и ткани женьшеня Panax ginseng, C.A.Meyer. Для исследования брали зрелые листья, корни и каллус-ную культуру женьшеня, полученную из листьев месячных проростков.

Получение ферментного препарата. НаЕеску материала (кал-лусная ткань или органы растения) измельчали и экстрагировали в 4-кратном объеме 0,008 M раствора диэтилдитиокарбамата натрия, (Колоколова Н.С. с сотр., 1987). Полученный экстракт очищали от фенолов, пигментов, диэтилдитиокарбамата натрия и других низкомолекулярных соединений методом гель-фильтрации на сефадексе G-25. Полученный экстракт использовали для определения р-галактозидазной и р-глюкозидазной активностей.

Определение активности р-глюкозидазы и р-галактозидазы проводили с использованием соответствующих метилумбеллифероновых (4-метилумбеллиферил-р-Б-глюко- и галактопиранозид) субстратов.

Интенсивность флюоресценции отщепившегося 4-метилумбелли-ферона определяли на спектрофлюориметре "Hitachi 650-60" при к возб.= 375 нм и X эмис.=450 нм. Общая ферментативная активность выражалась в мкМ/мин-мл экстракта, удельная активность-- в' мкМ/мин-мг белка.

Содержание белка в пробах определяли по методу Лоури (Lowry О.Н. et al., 1951).

Поиск оптимальных значений рН проводился с использованием фосфат-цитратной буферной системы с диапазоном рН от 2,4 до 7,5 (2,4; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,5) при 37°С. В

качестве адсорбента при ионообменной хроматографии была выбрана карбоксиметил- целлюлоза (КМ-целлюлоза) ("ЗЗ^упа"). Элюирование осуществляли растворами фосфат-цитратного буфера со ступенчато „увеличивающейся ионной - силой -и рН. Были использованы следующие буферы: рН 5,2 (0,005 М; 0,01 М; 0,1 М; 0,2 М); рН 7,0 (0,2 М); рН 9,0 (0,4 М). '

Гель-фильтрацию проводили на колонке с Акрилексом Р-150 фирмы "НеапаГ* (Венгрия). Элюентом служил 0,05 М раствор фосфат-цитратного буфера рН 5,5. Сбор фракций осуществляли с помощью коллектора М1л1гас 17.000 фирмы ЬКВ (Швеция). Объем фракций - 3,5 мл. Скорость элюции составляла в среднем 9 мл/час.В полученных пробах определяли р-гликозидазные активности. Оптическую плотность белкового профиля определяли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм.

Для определения молекулярной массы ферментов колонка была откалибрована стандартными кристаллическими белками. Изучение зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации ингибиторов проводилось с использованием Б-глюкозы, В-галактозы, глюконо-1,5-лактона, галактоно-1,4-лактона в диапазоне концентраций 5-20 мМ.

Максимальную скорость реакции Ут и константу Михаэлиса й^ рассчитывали графически по методу двойных обратных величин согласно линейному уравнению Лайнуивера- Берка.

Определение активности р-гликозидаз при использовании в качестве субстратов суммарной гликозидной фракции (СГФ)и гинзено-зидов Яе и Я&1 проводилось следующим образом: навеску субстрата (СГФ или Яе, 10 мг растворяли в 0,5 мл даметилсульфоксида,

добавляли I мл фосфат-цитратного буфера (рН 4,5; 5мМ) и 2 мл препарата фермента. Инкубировали в течение 2 часов при 37°С.

Суммарная гликозидная фракция и гинзенозида Rgj и Rg любезно предоставлены Т.И.Полетаевой (BMP, г. Москва).

СГФ женьшеня, подвергшуюся обработке р-глюкозидазой I в течение 2 часов использовали для определения гликозилирующей функции фермента. Для этого в реакционную смесь был добавлен раствор

i

глюкозы, так что ее концентрация в пробе была равна 45 мМ.

Тонкослойную хроматографию продуктов ферментативной реакции проводили на пластинках Sllufol UV 254- (Чехославакия) в системе I бензол-этилацетат (1:1), которые проявляли опрыскиванием смесью уксусный ангидрид-серная кислота-этиловый спирт(5:5:90) с последующим нагреванием в сушильном шкафу в течение 5 мин при ПО°С. В качестве свидетелей использовали панаксатриол, панакса-диол, p-ситостерин и олеаноловую кислоту, любезно предоставленных Т.И.Полетаевой (ВИЛР, г.Москва) и В.А.Пасешниченко (институт биохимии им. А.Н.Баха РАН, г.Москва).

ТСХ гликозидов женьшеня проводили на пластинках Sllufol UV 254. (Чехославакия) в системе II хлороформ- метанол- вода (65:35: 10). Проявляли тагатм же образом как и в случае ТСХ в системе I.

Высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) гинзено-зидов каллусной культуры женьшеня проводили на хроматографе М11-lipore (USA). Колонка Dlasorb 130 С16Т(100x4mm), Эмкм. Предко-лонка Sllasorb SPHC18(50x4mm), 7мкм. Хроматография в линейном

градиенте: 50 мин: 85% А, 15% В->-0% А, Л00%. В__А.-15%..-ацетонит—

рил (MeCN), В- 60% MeCN. Скорость элюирования 1,5 мл/мин. А.=203нм. Для идентификации пиков использовали гинзенозиды Rx (x=bj, bo, с, d, е, g^, любезно предоставленные проф. Shlbata (Meljl college of Pharmacy, Tokyo, .Japan). Количественную оценку содержания гинзенозидов производили в сопоставлении с биомассой клеточной суспензионной культуры женьшеня Смутнинского завода,

тестированной по гинзенозидэм.

Для определения содержания гинзенозидов бутано'льные экстра-

I

кты также разделяли в режиме изократического элюирования. Для гликозидов на основе •* 20-Б-протопанаксадиола (ЙЬ1, использовали колонку В1аэогЬ ЗРН-С18 (100х4шш), 9мкм; элюент 30%-ннй МеСН. Для гликозидов на основе 20-3-протопанаксатриола (Яе, й^) использовали колонку Берагоп С 18 (100*4тт), 7мкм, элюент 20%-ный МеСЛ.

Полученные результаты во всех сериях опытов обрабатывали статистически (Владимирский Б.М., 1983).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Определение уровней активностей и оптимумов рН в различных органах и тканях женьшеня. | Нами проведено изучение р-глюкозидазы и р-галактозидазы в запасающей (корень), фотосинтезирущей (листья) и культивируемой тканях женьшеня. Все изучаемые ткани обладают и р-глюкозидазной и р-галактозидазной активностями.В корне, например, наблюдается наивысший уровень обеих активностей, однако, р-галактозидазная активность выше р-глюкозидазной в три раза. В листьях и каллусе удельная р-глюкозидазная активность в 20-25 раз ниже, чем в корне. Что же касается удельной р-галактозидазной активности в этих тканях, то она на порядок выше р-глюкозидазной (Табл. I).

Оптимум рН для каталитического действия р-глюкозидазной активности из листьев совпадает с оптимумом рН для р-глюкозидазной активности из каллуса (рН 4,5). Оптимальное значение рН для р-глжкозидззы корня равно 5,0. Оптимумы рН р-галактозидазной активности из листьев и каллусной ткани также совпадают (оптимум рН 4,0). р-Галактозидаза в корне имеет оптимум рН- 5,0.

Таблица I.

Активность р-гликозидэз в различных органах и тканях женьшеня.

Источник фермента Общая активность, х 10 мкМ/мин х мл Белок мг/мл Удельная активность хЮ мкМ/мин х мг .

р-глюко-зидаза р-галакто-зидаза р-глюко-зидаза р-галакто-зидаза

корень листья каллус 1,3-0,88 0,2-0,15 0,1±0,06 3,3-0,01 3,5±0,Ю 1,6-0,10 1,5-0,01 6,0-0,07 3,3-0,01 ■8,83-0,50 0,35-0,10 0,51-0,19 22,0-0,17 5,4-0,15 4,8-0,80

Изучение изоферментного спектра р-гликозидаз из различных органов и тканей женьшеня.

Используя метод гель-фильтрации на колонке с Акрилексом Р-150 в изученных тканях женьшеня выявили три изоформы р-глюкозидазы и четыре изоформы р-гэлактозидазы, которые обладают различными уровнями активностей1 и молекулярными массами (Рис. I). Для удобства изоформы с различными молекулярными массами обозначены римскими цифрами I, II, III, IV (Табл. 2).

Таблица 2.

Молекулярные массы изоферментов р-гликозидаз из различных органов и тканей женьшеня.

Источник Молекулярная масса (Дальтон)

фермента р-глюкозидаза р-галактозидазз

I II III I II III IV

корень 500000 --- --- 500000 300000 — 35500

листья 500000 150000 --- 500000 — — 35500

каллус 500000 150000 65000 500000 — 110000 ---

Использование другого принципа разделения- по зэряду-Зшпсо-вых молекул- на КМ-целлюлозе позволило разделить экстракты трех изучаемых тканей на несколько изоформ (I и II р-глюкозидазы и I, ТТ ттт > АНЗЛЛЗ К0МС'11Н31Х»1Й ИЗО^Х^^МРКТОВ В

А

180016001200 ',800-4000

750-

боо-

4503001500

корень

листья

каллус

зб бб 95 1Е

Рис. I. Относительная активность (А) р-глюкозидазы (I) и р-галактозидазы (2) во фракциях при разделении частично очищенных экстрактов различных органов и тканей женьшеня методом гель-фильтации па Акрилек-се Р-150.

Таблица 3.

Количество изоформ р-гликозидаз, выявленных методами ионообменной хроматографии (КМ-целлюлоза) и гель-фильтрации (Акрилекс Р-150).

Источник р-глюкозидаза р-галактозидаза

фермента ионообменная хроматография гель-фильтрация ионообменная хроматография гель-фильтация

корень I II - I - - - - III I II - IV

листья I II - I II - - II III I - - IV

каллус I - - I II III I - III I - III -

экстрактах (Рис. 2. Табл. 3) позволяет сделать заключение о су-

I

шествовании в тканях женьшеня отличных друг от друга изофермен-

I

тов ß-глюкозидазы и ß-галактозидазы. Каждая из тканей при этом обладает строго выраженными особенностями изоферментного спектра, отражающими их структурно-функциональные отличия.

pH 5,2

рН7,0

0,02М

О, IM

0,2М

0,2М

рН9,0

0,4M

А

180016001200800400.0 200160120-еа

400

20016012080 4СН О

корень

листья

I \

каллус

Л

I \ ' '2

V-\ , \

Va

/

li 20 з5 Й 50 Яфр.

Рис. 2. Относительная активность (А) р-глюкозидазы (I) и-Р-галактозидазы-(2) во фракциях при разделении частично очищенных экстрактов различных органов и тканей женьшеня методом ионообменной хроматографии на КМ-целлшозе. Примечание: корень, листья и каллус взяты в эксперимент в июле.

Изучение каталитических свойств р-гликозидаз.

Ингибиторное действие было изучено на Фракциях ; I ; р-глюкозидазы и фракции I р-галактозидазы из корня (Табл. 4).

В ходе эксперимента выяснилось, что активность р-глюкозидазы практически полностью ингибирует глюконо-1,5- ; лактон (98,5%) и на 70% глюкоза (20 мМ). Эти соединения оказывз- ^ ют на активность р-галактозидазы крайне незначительное ингибиру- 1 ющее действие.

Таблица 4.

Ингибирующее действие некоторых моносахаридов на активность

р-гликозидаз женьшеня.

Наименование Концентрация Проценты ингибирования

ингибитора ингибитора в мМ р-глюкозидазы р-галактозидазы

5 49,1 3,6

глюкоза 10 58,6 4,9

20 69,9 4,9

5 7,4 69.1 ;

галактоза 10 14,0 77,3

20 18,6 78,7

глюконо-1,5-лактон 5 10 20 98.4 98.5 98.6 8,4 1 13,5 | 17,3 ;

галактоно-I,4-лактон 5 10 20 8,4 16,0 21,4 94,3 96,3 96,3 ,

Аналогичная картина наблюдается и для другого фермента, ^ р-галактозидазы, активность которой также подавляется гэлэкто1ю- '¡. 1,4-лактоном и галактозой, но на которую почти не злияют ингибиторы р-глюкозидазы.

Полученные результаты сходны с литературными данными о кон- ; ФормгцксккоЯ прелпсчтителъкости Ферментов к знзлогзм переходного

состояния, к промежуточным между субстратом и продуктом формам. Так, у р-гликозидаз лактоны связываются в активном центре в 160 раз прочнее, чем глюкоза. Реакция расщепления гликозидной связи,

I

катализируемая гликозидазами, идет через промежуточное образование карбониевого, или карбоксилат, иона(й. «.Ргапск, 1992). Поэтому аналоги переходного состояния являются лучшими ингибиторами, -чем аналоги субстрата. Возможно, что активный центр у ферментов более комплементарен именно переходному состоянию субстратов .

I Величины кинетических констант (К,, и Ут01Г). сопоставляемых

| М 1Нс1Л.

ферментов из двух органов различны (Табл. 5).

I

| Таблица 5.

I ^

Характеристика скорости образования и распада комплекса

I

(З-рдикозидаз женьшеня с синтетическими метилумбеллифероноЕнми субстратами.

; .. Фермент (в мкМ) У_„.г(в мкМ/мин х мг)хЮ Шал.

;р-глюкозидаза из

листьев 0,0465 1,3

:р-галактозидаза

из листьев 0,1587 3,1

р-глюкозидаза из

корня 0,212 ""7,69

|з-галактозидаза

р корня 0,384 62,5

! Наиболее высокой ферментативной активностью обладает фракция ¡3-галактозидазы корня, что, по-видимому, определяется значительной величиной . У этого фермента скорость образования комплекса с субстратом также наибольшая (0,384 мкМ). Несколько меньшая И^ наблюдается для р-глюкозидазы корня, и значительно меньше (в 8 раз) V .

13 !

Наиболее низкой Ферментативной активностью характеризуется р-глюкозидаза листьев, имеющая самое низкое сродство к субстрату. Таким образом, несмотря на сходство условий выделения при гель-фильтрации фракций I с р-глюкозидазной активностью, кинетические параметры ферментов из корня и листьев довольно сильно различаются. То же самое можно сказать и о константах, определенных для р-гэлактозидазы из тех же органов.

Изучение сезонных изменений активности

I

р-гликозидаз в корне женьшеня.

Полученные данные показывают (Табл.6), что в период, предшествующий стадии покоя и в период покоя (ноябрь-январь) активность р-гликозидаз в корне резко уменьшается. Соответственно тормозятся и процессы превращений их.субстратов.

! Таблица 6.

Динамика р-гликозидазных активностей в корне в течение года.

Время года, месяц Общая активность х 10 мкМ/мин х мл Белок мг/мл Удельная активность -3 х!0 мкМ/мин х мг

р-глюкозидаза р-гзлакто-зидаза р-глюко-зидаза р-галакто-зидаза

ноябрь 0,47±0,02 4,42±1,50 7,95±0,I 0,59±0,02 5,56±0,19

январь 0,05±0,10 0,04±0,50 3,05±0,4 0,17±0,23 0,13±0.02

март 0,66±0,07 2,58±0,05 4,60±0,I 1,43±1,29 5,59±0,07

май 0,93±0,14 4,10±0,01 6,37±0,1 I,47±2,30 6,43±0,10

июль 1,3±0,88 3,30±0,01 1,5±0,01 8,83±0,50 22,0±0,17

На стадии цветения - наиболее важного для растения периода, когда идет формирование репродуктивных органов и активное накопление биомассы наземной части и корня, активность сравниваемых Ферментов максимальна.

На начальной стадии экспериментов (осень) были взята четырехлетние корни женьшеня. В конце опытов это были, по существу, ттатт* пагтитто тягчил— ОНТ^^Ма ЧЬК^аЙ ПО СК0пССТ»1 на^оплрнкя

рН 5,2

АхЮ 15; 1050

0.02М

0,1М] 0.2М

рН7,0 рНЭ.О

0.2М,1 0,4М

ноябрь

январь

15 104

5'

О

151050 15 1050

151050

Л

' ,2.

март

' Л

!\г

I . » , к У

I

май

/ \г

'ПГ^З "Ж 4Ш

Рис. 3. Динамика сезонных колебаний относительной активности (А) р-глюкозидазы (I) и р-галактозидазы (2) во фракциях при разделении частично очищенного экстракта корня женьшеня методом ионообменной хроматографии на КМ-целлюлозе.

гинзенозидов. Шестилетние и более старые корни от-

I

стают по темпам накопления

I

сапонинов; их состав также претерпевает изменения в сторону уменьшения некоторых гинзенозидов (Полетаева Т.И., 1991). Максимальное количество сапонинов приходится на летние месяцы и лучшее время сбора урожая- конец лета 5-го года жизни (Бо1(1а1:1 Р., Тапака 0., 1984). Таким образом, максимум активности ферментов совпадает с максимумом накопления

этих вторичной соединения. Изучение изоферментного спектр;) ß-гликозидаз в течение сезона также показало его заметную вйриа-

бельность. Особенно это касается изофюрм ß-глюкозидазн (Fhcí 3),

Í

количество которых может колебаться от одной (ноябрь) до трех (май). Растения обладают тонкой системой регуляции активности ферментов, уровень которой, вероятно, определяется ■ необходимостью юс участия в трансформации (расщепление, синтез) природных субстратов.

Динамика ß-гликозидаз в культивируемых тканях женьшеня.! 1

, , ,

Как показано (Табл. 7), изменения в уровне ß-гликозидазных активностей в каллусной культуре в какой-то степени повторяют' / динамику ферментов в течение года. Низкая активность ферментов лаг-фазе (латентной) и в фазе экспоненциального роста достигав максимума на завершающих стадиях развитая. При этом активность \

i

р-глюкозидазы в каллусе ниже, чем в корне в 16 раз, а \ р-галактозидазы в 4 раза. По-видимому, синтез изучаемых фермен-' ¡ ¡ тов в культуре сильно зарепроссирован в результате дедифференци- j ровки. I

Различный уровень активности ферментов, а также некоторая! разница в сроках возрастания их до максимума (р-глюкозидаза- на| 28-ые сутки, р-галзктозидаза- на 35-ые сутки) может указывать не >, только на различие в регуляции их активности, но и на некоторое ■' • отличие в функциях. i

Для большинства изученных гликозидэз в культивируемых клет-

I

ках максимум их активности приходится на 12-14 сутки. Такие данные получены для ферментов следующих клеточных культур: р-глюкозидазы и р-гэлактозидазы подсолнечника (Кесслер Р.М: с сотр., 1991), кислой инвертазы сахарной свеклы (Дубинина И.М.; с j сотр., 1978), целлюлазы и полигалактуронидззы Rosa glauca;

н! I | 1 !

| Таблица 7.

Динамика р-гликозидазных активностей в каллусной культуре женьшеня ь течение цикла пассирования а Ю )•

р-глгскозидазная р-галактозидазная

Сутки Количество активность активность

пассирования белка,мг/мл общая удельная общая удельная

_мкМ _мкМ _мкМ _мкМ

мин мл мин мг мин мл мин м

7-ые 0,33- 1,22± 3,96- 0,509- 1,64-

0,23 0,09 0,05 0,35 0,74

14-ые 0,33± 0,68- 3,43± 0,78- 3,94-

0,81 0,02 0,16 0,54 1,1

21-ые 0,21- 0,56- 3,73- 0,35- 2,36-

0,38 0,02 0,1 0,03 0,16

28-ые 0,43- 9,54± 24,9- 4,95± 12,9-

0,1 0,54 0,68 3,77 4,04

35-ые 0,19- 2,04- 15,1± 2,19- 16,3±

0,78 0,06 0,38 0,67 5,98

!(1озе1еаи Л.-Р., СйатЬа!; С., 1980). Указанные ферменты играют значительную роль в растяжении клеточных стенок. Рост р-гликозидазных активностей на завершающих стадиях развития -культуры клеток женьшеня может указывать на возможность их участия в осуществлении не только этих, но и других функций. Не исключено, что эти функции связаны с формированием спектра гинзе-

I

нозидов.

I

Изучение динамики гинзенозидов в культивируемой ткани женьшеня. ; Использование метода ВЭЖХ в линейном .^радиенте и режиме изократического элюирования указывает на существенные сдвиги в метаболизме гинзенозидов в культуре в течение одного пассажа. Уже на 10 сутки из обычного для женьшеня спектра сапонинов не

Flic. 4. Хроматограмма бу'тт-нольной Фракции экстракта биомассы каллу спой культуры женьшеня (34 сутки). Колонка Separon С18 (100x4 mm), 9мнм. Элюент 20% MeCN, скорость 1,2 мл/мин, Х= 203 нм. Неиленти фицированный пик 10 (8,8мин).

остается ни одного в количествах, достаточных для определения этим чувствительным методом. На заключительных стадиях (34 сутки) на фоне следовых содержаний гликозидов в других пиках выявляются лишь фракции со временем удерживания 6,2 и 8,8 мин . Первая из них - минорная. Однако, вторая по содержанию вещества

о

(12,5 х 10 ж/%) превышает сумму всех гинзенозидов группы ИЬ и Ид (СГФ), которые обнаруживаются на 41 сутки пассирования. Эта фракция (8,8 мин) наиболее значительна и на 10 сутки, но в пять раз меньше, чем на 34 сутки (Рис.4). Можно предположить, что эта фракция является основным предшественником гликозидов группы НЬ на основе 20-5-протопэнаксадиолэ (БЫ, №2, Ее, йй)доминирую-тих в кэллуснсй культуре женьшеня (10 х 10 л мг/%). Совпал?»;!-? ее максимума с активностью ферментов в этот период (28-35 сутки) : может ук'пыь^ть на возможность их участия, наряду с друга« Тор-уент^мх. з метаболизме гинзенозидов.

';• 18

Изучение действия р-гликозидаз женьшеня на гинзенозиды. Для непосредственной проверки этого предположения были проведены эксперименты по изучению воздействия р-гликозидаз женьшеня на эндогенные субстраты, а именно, суммарную гликозидную фра, кцию (СГФ) и сумму гинзенозидов , йе. На рис.5 представлены I типичные хроматограммы метанолышх экстрактов смеси И ^, Ие и РГФ до и после воздействия р-глжозидазы I из корня, выделенной " , на Акрнлексе Р-150 (Рис. I). В результате гидролитического действия фермента все фракции, располагавшиеся в зоне, характерной для сумш гинзенозидов (Й1 0,15-0,45), исчезают. Продукты ферментативной реакции смеси И ^ и Не обнаруживаются в виде двух пятен С НГ 0,83; 0,91, совпадающих по подвижности с олеаноловой кисло; той и р-ситостерином. При гидролизе СГФ р-глзокозидазой появляются пятна различной интенсивности в верхней ча*Ьти хроматограммы. Щ некоторых из них совпадают с ИГ панаксатриола, панаксадиола, олеаноловой кислоты и р-ситостерина.

Добавление избытка глюкозы в'реакционную смесь после двухчасового гидролиза ферментом СГФ приводило к полному восстановлению спектра гинзенозидов (Рис.5).' Подвижность полученных фракций совпадала с ЯГ компонентов СГФ корня, однако это не позволяет сделать окончательных выводов о полной идентичности этих

I |

веществ. Тем не менее, не вызывает сомнений, что р-глюкозидаза

I

женьшеня способна катализировать как реакции гидролиза, так и

. I ;

гликозилировашш эндогенных сапонинов.

Энзиматический гидролиз гинзенозидоЕ, очевидно, идет с об''. разеванием просапогешшов и аглжонов, но вряд .та доходит до стадии их превращения в панаксаднол и панаксатрпол. Циклизация боковой цели с обращением конфигурации хирального С-20 центра .¡: является необратимой и препятствует образованию гинзенозидов из

1.0Т 0,9

0,8 0,70,60,5

0,40,30,2] 0,1

®

Щ

09

©

О О

я

0 О 0

0 ©

© ©

<22> «я»

О О

с?

о ^

«г? иЗ г-, с?

О @ ©

° О ©

о О

О

о

О

г

<=22^2?

чн' О

та О

О

в» С?

тттттттт

и

Тз

Рис. 5. ТСХ метанольных экстрактов в системе II хлороформ- метанол- вода (65:35:10).

1-СГФ, ЙГ 0,15;0,20;0,25;0,29;0,33;0,42, 2-стандартнне растворы

смеси гинзенозидов И,

£1

и Кр,ЯГ 0,24;0,44, 3-панаксадиол, ИГ

0,78,4-панаксатриол, "ИГ 0,67, 5-р-ситостерин, ИГ 0,91, 6-олеаноловая кислота, ИХ 0,83, 7-СГФ поело воздействия р-глюкозидазы 1.НГ 0,5;0,56;0,б7;0,75;0,78; 8-СГФ после воздействия р-глюкозидазы 11,0,82;0,8б;0,91, 9-СГФ после воздействия, экстракта корня женьшеня, ИГ 0,13;0,15;0,2;0,25;0,3б, 10-СГФ после воздействия экстракта каллусной ткани женьшеня,НГ 0,13;0,15; 0,20;0,25;0,3б, I1-СГФ после воздействия р-глюкозидазы каллус-ной ткани женьшеня,

12-смесь р после воздействия р-глюкозидэзы I,

13-смесь Н^ е после воздействия р-глюкозвдазы II,

14-СГФ после воздействия р-глюкозидазы I последующе г: гликознлирования.

15-СГФ после действия р-галактозидазы из корня женьшеня.

панаксадиола и панаксатриола путем их гликозилирования. Увеличение подвижности фракций и их количества в результате гидролитического действия ß-глюкозидазы, по-видимому, можно объяснит! частичной потерей гидроксильных групп за счет уменьшения числа углеводных остатков у всех без исключения гинзенозидов.

I

Судя по данным, полученным в настоящей работе, оба типа реакций (гидролиз и гликозилирование), катализируемых р-глюкозидазой, протекают не хаотически, а с высокой степенью селективности.

Избирательное гликозилирование наблюдалось при добавлении в среда культиЕируемых клеток женьшеня фенольных и стероидных соединений (Ushiyama М., Furuya Т., 1989; Kawaguchl К. et al., 1990). При этом остатки глюкозы в дисахаридах образовавшихся гликозидов преимущественно были связаны р-(1->2) и ß-(I->6) свя-

> I

зями, типичными для сапонинов женьшеня. Имеются сведения об участии в гликозилировагши фитостеринов некоторых растительных гликозилтрансфораз, использующих в качестве донора гликозильных остатков УДФ-глюкозу (Schatte H.-R., 1987).

Наряду с изучением р-глюкозидазы, мы исследовали действие р-галактозвдазы на СГФ (Рис. 5). Спектр выявленных фракций включает в себя остатки гинзенозидов в виде слабо окрашенных пятен и туродуктов их частичного гидролиза. В области расположения проса-погешшов отсутствуют вещества с НГ- 0,67 и 0,78, обнаруженные после действия р-глюкозидазы, но появляются зоны с Ri 0,62 и 0,65. ! Поскольку Фракция р-галактозидазы, взятая в эксперимент, при разделении частично перекрывается фракцией р-глюкозидазы (Fnc. I), соотношение этих активностей при действии из СГФ было 1:1. Возможно поэтому данная ß-галактозидазная Фракция способна частично гидролизовать ß-глвкозиды. В то же время

р-галактозидаза некоторых растений отщепляет a-L-арабшюзные фрагменты субстратов (Кесслер P.M., Колоколова Н.С., 1993). Для р-глвкозидаз также характерна способность катализировать реакцию гидролиза p-D-ксилозных остатков (Кесслер P.M., Колоколова Н.С., 1993). р-Глюкозидаза I из корня женьшеня также расщепляет р-ксилозиды в соотношении с основной активностью 10:1.

Как мы видам, р-глюкозидаза и р-галактозидаза женьшеня потенциально ; способны произвести каталитическое расщепление почти всех углеводных остатков гинзенозидов, содержащих p-D-глюкозу, p-D-ксилозу и a-L-арабинозу в пиранозной форме. Исключение составляют гинзенозиды Re и Rg, имеющие в качестве концевого остатка при С-6 агликона рамнозу и гинзенозид Rc с арабинозой в фура-нозной форме при С-20.

^ Коммерческий препарат р-глюкозидазы миндаля и частично очищенные фракции р-глюкозидазы и р-галактозидазы подсолнечника не действовали на гинзенозиды.

ВЫВОДЫ

I. В корнях, листьях и культуре тканей женьшеня впервые обнаружены и исследованы р-глюкозидазная и р-галактозидазная активности. Обе активности в корнях намного выше, чем в листьях и каллусной культуре.

I 2. Изучены физико-химические свойства ферментов. Определен оптимум рН, каталитические свойства ферментов. Максимальное число Фракций р-глюкозидазы, обнаруженных в тканях женьшеня - три; их молекулярные массы- 500; 150; 65 кДа. р-Галактсзидазная активность выявляется в четырех фракциях; молекулярные массы изоформ-500; 2СО; ПО; 35,5 кДа.

: 2. Впервые изучена динамика сезонных изменений активности Pi-гликозидзз корня женьшеня. р-Глюкозидазная и р-гзлактозпдазная

- ' ?2 I

активности максимальны в середине лета (июль). Они выше, чём в период покоя корня (январь), соответственно, более, чем в 50 И; >■ 200 раз. Изоферментный спектр обеих активностей в течение года

изменяется незначительно. j

¡

4. Исследована динамика ß-гликозидаз в каллусной культуре В| течение цикла пассирования. Максимум активности ферментов вняв-' ляется на заключительных циклах роста культивируемых тканей.

5. Показано, что частично очищенная фракция ß-глюкозидас.

из корня женьшеня катализирует реакции гидролиза и гликозилиро- • \

вания эндогенных сапонинов. , !

! , i

По материалам диссертации опубликованы следующие работа: ¡ ¡ . i

Ii'!

I-Ананян A.A., Милютина Н.П., Тувик В.П., Кесслер P.M. Антиради-I кальное и антиоксидантное действие женьшеня// Всесоюз. конф. - ; "Женьшень и люди"- Москва, 1991.- С.З. 1

2.Тувик В.П., Кесслер P.M. ß-Гликозидазы женьшеня// II Всесбюз. съезд общества физиологов растений.- Минск, 1991.- С.35. ' [

3.Милютина Н.П., Ананян A.A., Тувик В.П., Кесслер P.M. Антирадикальная активность женьшеня// 4 Меэдународ. конф. "Биоантиокси-дант".- Москва, 1992.- I.- С. 19. j

4.Тувик В.П., Кесслер P.M., Полетаева Т.И. Сравнительная характеристика ß-гликозидаз каллусной ткани, листьев и корня Panax ginseng// 2 Мездународ. конф. "Биология культивируемых клеток и; биотехнология".- Алма-Ата,1993,- С.199.

5.Полетаева Т.И., Тувик В.П., Кесслер P.M. Динамика гинзенозиДов и ß-гликозидаз в процессе культивирования каллусных тканей Panax ginseng// 2 Меэдународ. конф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология".- Алма-Ата,Г993.- С.190. ¡

6.Тувик В.П., Полетаева Т.И., Кесслер P.M. ß-Глюкозидаза из корня женьшеня (Panax ginseng, C.A.Meyer)// Докл. РАИ (в печати)]

Амм-

jHUtjí