Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Внеядерные хлорофильные мутации высших растений, индуцированные N-нитрозо-N-метилмочевиной, и особенности их наследования

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Внеядерные хлорофильные мутации высших растений, индуцированные N-нитрозо-N-метилмочевиной, и особенности их наследования"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К. КОЛЬЦОВА

На правах рукописи УДК 575.224:582

УСАТОВ Александр Вячеславович

ВНЕЯДЕРНЫЕ ХЛОРОФИЛЬНЫЕ МУТАЦИИ ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ, ИНДУЦИРОВАННЫЕ 1М-НИТРОЗО-]Ч-МЕТИЛМОЧЕВИНОЙ, И ОСОБЕННОСТИ ИХ НАСЛЕДОВАНИЯ

03.00.15 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 2004

Раб« выполнена в лаборатории генетики растений научно-исследовательского Института биологии Ростовского Государственного Университета

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор ГУСЬКОВ Е.П. доктор биолог ических наук, профессор АВЕРИНА Н.Г.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор МИТРОФАНОВ В.Г. доктор биологических наук, профессор АСЛАНЯН М.М. доктор биологических наук, профессор КУЗНЕЦОВ Вл.В.

Ведущее учреждение: Кубанский Государственный Университет

Зашита состоится " ZV 2004 г. в часов

на заседании Диссертационного совета Д002.238.01 в Институте биологии развития им. Н К Кольцова РАН по адресу г Москва, ул. Вавилова, 26 Факс: (095) 145-80-12. e-mail: volina@proksima.idb.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им Н.К. Кольцова РАН

Автореферат разослан " " /ie^/o-^L 2004 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета кандидат биологических наук

Е В. Волина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования, Нехромосомная наследственность, как одна из ветвей генетики, была открыта при изучении наследования спонтанных хдорофильных мутаций у высших растений (Ваиг, 1909, Согтспб, 1909). Открытие ДНК в хлоропластах в начале 60-х годов, явилось стимулом к экспериментальным исследованиям пластид как относительно автономных генетических систем растительной клетки, и поставило вопрос о роли пластома в процессах регуляции развития и жизнедеятельности раститепьных организмов. ДНК пластид, на долю которой приходится всего несколько процентов всей клеточной ДНК, участвует в реализации жизненно важных функций растений. Геном пластид кодирует около половины белков, участвующих в фотосинтезе, а также ряд компонентов органелльной белок-синтезирующей системы (Одинцова, Юрина, 2003). С ним связаны многие хозяйственно ценные признаки растений, такие как общая продуктивность, устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды, некоторым антибиотикам, гербицидам, грибным патогенам

Мутанты для генетиков всегда представляли прекрасную модель для изучения проблемы «ген-признак». В этом плане не составляют исключение и пла-стидные хлорофильные мутации. Однако их ценность возрастает в связи с тем, что биогенез и функционирование хлоропластов, их фотосинтетическая активность находятся под двойным ядерно-органелльным контролем. Поэтому генетический анализ таких наследственных изменений дает возможность выявлять не только структурные компоненты органелл. детерминированные пластомом, но и закономерности пластидно-ядерньтх взаимоотношений. Именно благодаря изучению пластидных мутантов удалось локализовать целую группу питогенов, определяющих некоторые реакции фотосинтеза: 6 генов ФС I, 13 генов, кодирующих белки полипептидного комплекса ФС II, 11 генов комплекса цитохром Ь/£ АТФ-синтазы и белков стромы хлоропластов (Лос1шх, 1997) Кроме того, нельзя недооценивать роль пластидных мутаций в генетике устойчивости растений к абиотическим факторам. В настоящее время приходит признание цито-плазматической изменчивости, как значимого дополнительного фактора в эволюции и селекции растительных организмов.

Как правило, в естественных условиях мутации а пластидной ДНК возникают с частотой не выше 0,02 - 0,06% (Hagemann, 1971; 1979). Поэтому увеличение ассортимента пластидных мутаций с помощью индуцированного мутагенеза, существенно ускоряет решение многих проблем, относящихся не только к генетике пластид, но и к некоторым разделам биохимии, физиологии растений и селекции.

Долгое время четких и воспроизводимых способов получения мутаций пластид у высших растений не существовало, несмотря на неоднократные попытки, предпринимавшиеся в этом направлении (Белецкий, 1989). Для искусственного получения внеядерных мутантов были исследованы различные химические мутагены. Однако по причине низкой эффективности и отсутствия специфичности от большинства__из них пришлось довольно быстро отказаться (Даниленко, Давыденко, ;

впервые была доказана возможность индукции мутаций пластид у подсолнечника при помощи >}-нитрозо-М-метилмочевины (НММ) (Белецкий и др , 1969; Разорителева и др., 1970а; 19706). На базе этих пионерских работ в НИИ биологии РГУ было положено начало всестороннему исследованию НММ-мутагенеза пластид высших растений, в которых непосредственное участие принимал автор настоящей работы. Результат многолетних исследований в данной области оформился в виде уникальной коллекции внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника и горчицы (Разорителева и др . 1995, Ь'5а1оу е1 а! , 2001; Усатов и др., 2003а; Усатов и др., 20036; Усатов и др , 2004). Получение и исследование этих мутантных форм стало содержанием настоящей работы.

Цель и задачи исследования. Целью работы является оптимизация метода эффективного получения внеядерных хлорофильных мутантов у высших растений при использовании НММ: выявление закономерностей индукции и фенотипического выражения пластидных мутаций, а также способов модификации этих процессов; изучение возможности и особенностей ревертирования пластидных мутаций; анализ состояния системы биосинтеза хлорофилла, особенности биогенеза и функционирования фотосинтетического аппарата, оценка активности ряда гидролитических ферментов у мутантов; создание на основе НММ - мутагенеза солеустойчивых форм с/х культур.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- определить эффективность НММ как индуктора пластидных мутаций в зависимости от концентрации и времени действия мутагена на прорастающие семена подсолнечника;

- исследовать частоту и спектр внеядерных хлорофильных мутаций после обработки семян подсолнечника НММ и особенности их наследования;

- отобрать и поддерживать в поколениях, генетические линии, индуцированных пластомных мутантов;

- выявить особенности ревертирования и характерные типы реверсий внеядерных хлорофильных мутаций еп-сМоппа\

- оценить норму реакции хлорофилл-дефицитности у внеядерных пестролистных форм и мутантов еп:сЫоппа подсолнечника в зависимости от условий выращивания растений;

- изучить структурные изменения фотосинтетического аппарата у внеядерных пестролистных форм и мутантов еп:сЫоппа подсолнечника;

- определить содержание редуцирующих Сахаров и активность |3-гликозидаз у пестролистных форм и мутантов еп.хЫоппа подсолнечника;

- оптимизировать метод получения солеустойчивых форм подсолнечника и горчицы с помощью НММ-мутагенеза.

Научная новизна и значимость полученных результатов. Научная новизна исследования состоит в получении, поддержании и генетическом анализе уникальной коллекции внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника и горчицы, представленной более 100 линиями пестролистных химер, форм сМоппа и реверсионных мутантов, многоплановом изучении структурно функциональных характеристик мутантных пластид, выявлении способов реверти-

розания мутантов и получении, с помощью НММ-мутагенеза, солеустойчивых форм, не отягощенных хлорофильными дефектами.

В результате исследований впервые:

- экспериментально обоснованы наиболее чувствительные периоды развития проростков подсолнечника к действию НММ и определены оптимальные концентрации мутагена, приводящие к эффективной индукции внеядерных хлорофильных мутаций;

- проведен гибридологический, биохимический и ульраструктурный анализ полученных мутантов, свидетельствующий об их пластомной природе. Установлены внеядерный тип наследования мутантных признаков, постоянное соматическое расщепление, дефекты в структурно-функциональной организации хлоропластов, наличие гетеропластидных клеток, различия в структуре ДНК нормальных и мутантных пластид;

- проведен сравнительный анализ эффективности индукции хлорофильных мутаций у подсолнечника тремя алкилирующими мутагенами, НММ, ЭИ и ДЭС, показавший специфичность действия только НММ, как пластидного мутагена;

- создана модель для изучения особенностей становления внеядерных мутаций на уровне фенотипа, основанная на выщеплении в потомстве (на протяжении 7 генераций) пластомных мутантов еп-сЫоппа, после действия на них НММ, внеядерных ревертантных (мутантных) растений. Частота возникновения реверсионных мутантов, определенная по количеству семей Мь составила около 50%;

- обнаружено, что в пластидах мутантов \:аг-10 и еп-сМоппа-5 регистрируются все типы пигмент-белковых комплексов фотосинтетического аппарата, характерные для зеленых растений инбредной линии 3629, с измененным соотношением и редуцированным количеством. Первичным признаком дефицита хлорофилла является снижение светимости комплексов ФС 1, последующее разрушение комплексов ФС 2, а затем и ССК по мере усиления фотодеструкци-онных процессов. Нарушение структуры фотосинтетического аппарата сопровождается снижением активности РБФК, содержания редуцирующих Сахаров и активацией Р-гликозидаз;

- обнаружена свето- и температуро-зависимость хлорофилл - дефицитности у мутантов уаг-10 и еп-сМогта-5;

- разработан способ получения солеустойчивых форм подсолнечника и горчицы, с помощью НММ.

Практическая значимость полученных результатов. Разработаны методологические основы эффективного получения пластомных мутаций высших растений с помощью алкилирующего мутагена НММ. Обнаруженная в данном исследовании высокая изменчивость генетического материала клеточных орга-нелл может служить базой для создания разнообразных внеядерных форм у с/х культур, как исходного материала для селекции.

Показана принципиальная возможность получения солеустойчивых форм подсолнечника и горчицы с помощью НММ-мутагенеза, проявивших повы-

шенную продуктивность по сравнению с исходными растениями при их культивировании в условиях хлоридного засоления.

Уникальная коллекция внеядерных мутантов подсолнечника и горчицы с различной степенью выраженности хлорофильных дефектов, созданная в результате данного исследования, является моделью для изучения роли пластома в биогенезе и функционировании хлоропласгов, различных аспектов пластид-но-ядерных взаимоотношений.

Материалы диссертации включены в программу занягий студентов биолого-почвенного фак>льтета РГУ по специальным курсам на кафедрах генетики и биохимии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Воздействия НММ индуцирует появление у подсолнечника и горчицы хлорофильных мутантов двух гипов - пестролистные химеры (variegated) и желто-зеленые формы (en chlorina), с внеядерным типом наследования мутант-ных фенотипов. Выявлены специфические различия в реципрокных скрещиваниях с исходной формой, постоянное, на протяжении нескольких десятилетий, соматическое расщепление, дефекты структуры и функции мутантных пластид, наличие гетеропластидных клеток, изменения в структуре пластидной ДНК, что свидетельствует о пластомной природе индуцированных мутаций.

2. В потомстве пластомных мутантов en■ chlorina реверсии к исходной форме возникают спонтанно в единичных случаях Индуцированные НММ внеядер-ные реверсии возникают в потомстве мутантов en chlorina на протяжении как минимум 7-ми генераций с частотой около 50%, по количеству семей в М.. Ре-вертирование пластидных мутаций реализуется различными механизмами, приводя, либо к полному восстановлению мутантного фенотипа (истиная реверсия), или частичному - (ядерная, митохондриальная и пластидная супрессии).

3. Первичным проявлением дефицита хлорофилла у мутантов на уровне организации фотосинтетического аппарата является прогрессирующая редукция комплексов ФС I, а затем, по мере усиления с возрастом растений фотодест-рукционных процессов, разрушение комплексов ФС II и ССК.

4 Нарушения структурной организации фотосингетического аппарата у хлорофильных мутантов сопровождаются снижением активности темновых стадий фотосинтеза, редукцией содержания восстановленных Сахаров и усилением катаболических процессов, а именно многократным повышением активности (3-гликозидаз и интенсивной внутриклеточной вакуолизацией.

5. Индуцированный НММ мутагенез высших растений использован в практике для получения солеустойчивых форм подсолнечника и горчицы

Апробация работы. Резулыаш исследований были представлены и обсуждены на IV и V Всесоюзных межуниверситетских конференциях по «Биологии клетки» (Тбилиси, 1985; 1987); V и VI съездах ВОГиС им. Н.И Вавилова (Москва, 1987; Минск, 1992); Всесоюзном совещании «Химический мутагенз и проблемы экологии (Москва, 1992): 1, II и III съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Саратов, 1994; Санкт-Петербург, 2000; Москва 2004); Международной конференции «Молекулярно-генетические маркеры

растений» (Киев, 1996); Международной конференции «Актуальные проблемы с/х биотехнологии» (Москва, 1996); Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Москва, 2001); Международной конференции «Генетические коллекции, изогенные и аллоплазма-тические линии» (Новосибирск, 2001); научно-пракгической конференции с международным участием «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека» (Смоленск, 2001); VIII съезде генетиков и селекционеров Республики Беларусь (Минск, 2002); V съезде Белорусского общества фотобиологов и биофизиков (Минск, 2002); V съезде общества физиологов растений России (Пенза, 2003); Международной конференции «Клеточные ядра и пластиды растений: биохимия и биотехнология» (Минск, 2004); научных конференциях по генетике и селекции Ростовского отделения ВОГиС (Ростов-на-Дону, 1982 - 2004 гг).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 44 печатных работы.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, четырех глав результатов собственных исследований, заключения, выводов, списка литературы. Диссертация изложена на 229 страницах текста, содержит 47 таблицы и 36 рисунка. Список литературы включает 423 цитируемых источника.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследований служили растения инбредных линий 3629, к-2011, 922 подсолнечника (Helianthus annuus), сорта Донская-5 горчицы (Brassica junceae), а также хлорофильные мутанты и солеустойчивые формы, полученные на их генетической основе. Семена линии 3629 были любезно предоставлены нам А.И. Гундаевым (выведена автором из высокомасличной популяции подсолнечника ВНИИМК 20044 в 1959 г). Заразихоустойчивая линия 922 выделена Н.Г. Палеевым в 1974 г. из районированного в Росювской области сорта Маяк. Линия к-2011 из Мировой коллекции ВИР любезно предоставлена нам Ф.И. Горбаченко. Семена сортовых растений горчицы Донская-5 получены от автора сорта В.Г. Картамышева (Донская опытная станция масличных культур им. Л.А. Жданова, ВНИИМК).

Обработку семян растений растворами мутагенов проводили двумя способами. В первом случае воздушно-сухие семена замачивали в воде без доступа воздуха при комнатной температуре. Набухшие семена проращивали 24 ч, при 26° С. Через определенные промежутки времени, отбирали одинаково развивающиеся проростки, помешали их в раствор НММ и продолжали проращивать при тех же условиях. После окончания экспозиции в растворе НММ проростки отмывали от мутагена в проточной воде в течение 30 мин и высевали в поле. При втором способе, семена помещали в раствор НММ, ЭИ или ДЭС, без доступа воздуха, при 26° С на определенный временной интервал. Затем семена отмывали от мутагена в проточной воде в течение 30 мин и высевали в поле.

Обработку семян проводили растворами НММ, ЭИ или ДЭС в различных концентрациях и при разных экспозициях. Растворы мутагенов готовили непосредственно перед опытами на 0,25 М фосфатно-цитратном буфере; рН 7,0.

Полевые исследования. Растения выращивали на полях учебно-опытного хозяйства РГУ (п. Недвиговка). Почва - обыкновенный чернозем южно-европейской фации. За растениями М) проводили фенологические наблюдения. Каждое растение М| инцухтировали. Изучение состояло в учете и регистрации наблюдаемых изменений. В М-) изучали наследуемость изменений Мг и выявляли не наблюдавшиеся ранее изменения. Для выяснения генетической природы хлорофильных мутаций проводили реципрокные скрещивания мутантов с исходными формами Изучали - поколения. Для статистической оценки результатов расщепления применяли метод В фазу бутонизации в листьях среднего яруса определяли содержание пигментов. В фазу полного созревания измеряли высоту растений, диаметр корзинки, массу семян одного растения, массу 1000 семян. В промерах в каждом варианте использовали не менее 100 растений. Статистическую значимость результатов оценивали по критерию Стьюдента (Бейли, 1973).

Пользуясь тем, что в последние годы на территории Ростовской области чередовались засушливые и обычные по метеоусловиям годы, был проведен сравнительный анализ устойчивости мутантных линий к засухе. В качестве критериев устойчивости использовали показатели роста, продуктивности и содержания Хл в листовой ткани растений.

В вегетационных опытах растения выращивали в сосудах с почвой (вес почвы 22,6 кг) на вегетационной площадке в естественных условиях. Влажность почвы поддерживали на уровне 60 % влагоемкости при помощи ежедневного полива сосудов по весу почвы. Засоление проводили дробно по 0,2 % ЫаС1 или №2504 от веса сухой почвы в несколько приемов (Строганов, 1962). В качестве критериев солеустойчивости использовали всхожесть семян, рост и продуктивность растений в условиях действия стрессового фактора.

Исследования действия эритромицина проводили на 12-дневных растениях (фаза первой пары настоящих листьев) инбредной линии 3629 подсолнечника, выращенных стерильно на питательном растворе Эриксона с добавлением антибиотика в концентрациях от 1 до 5 мМ.

Для электронно-микроскопического анализа пластид использовали зрелые настоящие листья 3-х растений каждой исследуемой формы. Анализировали клетки палисадной паренхимы среднего участка листа, идентифицированные под светооптическим контролем на полутонких срезах, окрашенных ме-тиленовой синью. Электронное микроскопирование пластид проводили по стандартной методике (Прихоженко. Белецкий, 1979). Морфометрическая обработка включала в себя подсчет площадей среза пластид, внутренних мембран (гилакоидов стромы и тилакоидов фан), числа тилакоидов в гранах, площади крахмальных зерен в пластидах. Для оценки параметров исследуемых органелл использовали диалоговую автоматизированную систему обработки ультраструктурных изображений на базе ПЭВМ с соответствующим пакетом программ (Федоренко, Владимирский, 1992).

Электронно-микроскопичекое исследование хпДНК проводили методом белковой пленки (Kleinschmidt, Zahn, 1959). Осадок ДНК растворяли в 0,05М трис-HCl буфере (pH 7,9), до конечной концентрации ДНК 0,5 - 1,0 мкг/мл. Затем добавляли формамид и цитохром с до конечной концентрации 30% и 0,01%, соответственно. Смесь наслаивали на поверхность воды, содержащей 0,5% формамид. Образовавшуюся пленку снимали на медные сеточки, предварительно покрытые формваровой пленкой-подложкой и укрепленные углем. Образцы напыляли сплавом платина/палладий и исследовали в электронном микроскопе JEM-7A (Япония).

Рестрикцию хпДНК и мтДНК эндонуклеазными ферментами (Fermentas) и электрофорез в агарозном геле проводили согласно методу (Ма-ниатис и др., 1984), увеличив время реакции гидролиза до 12 ч и электрофореза - до 18-24 ч. ХпДНК и мтДНК из 7-10 - дневных проростков подсолнечника выделяли по модифицированной методике (Tnboush et al., 1988).

Фотосинтетический аппарат исследовали у пестролистной формы var-10, мутанта en.chlorina-5 и зеленых растений 3629. Растения выращивали в темноте (этиолированные) или в режиме 14-ч дня (освещенность 0 04 или 11 Вт/м2) и Ю-ч ночи до 38-дневного возраста при 20-22°С (в особых случаях - при 28-30°С). Зеленение этиолированных проростков проводили на свету в режиме, используемом для выращивания растений.

Содержание Хл а и b оценивали по спектрам поглощения 85%-ных ацетоновых экстрактов листьев, в листьях с низким содержанием Хл - по спектрам флуоресценции. Общее содержание каротиноидов определяли по (Шлык, 1971).

Некоррелированные СФ листьев in vivo регистрировали при — 196° С при спектральной ширине щели возбуждающего и регистрирующего монохро-маторов 2 нм, со светофильтром ОС-13 перед регистрирующим монохромато-ром (Доманский и др., 1986). Спектры поглощения регистрировали при -196°С на спектрофотометре UVIKON 931 (Kontron Instruments, Германия).

Для оценки эффективности фотосинтетического процесса использовали анализ индукционных кинетических кривых переменной флуоресценции Хл а. Флуоресценцию Хл а в интактных адаптированных в течение 20 мин к темноте листьях регистрировали на флуориметре РАМ 2000 (Walz, Germany) Анализ индукционных переходов переменной флуоресценции позволил рассчитать параметры, связанные с функционированием ФС II (Rohacek К., Bartak М, 1999):

Содержания реакционных центров ФС I (Р700) в тилакоидных мембранах хлоропласюв определяли по методу, описанному в (Melis A.. Brown J.S., 1980). Хлоропласты из листьев подсолнечника получали по методу (Sane Р V. et al., 1970). Солюбилизацию хлоропластных мембран осуществляли с помощью 0.2% Тритона Х-100. Для ишерения количества Р700 использовали реакционную смесь, содержащую 250 мкмоль Хл в 50 мМ буфере Трисина (pH 7.8), дополнительно включающем 5 мМ MgCL, 10 mM KCl, 12 мкМ 3-(3,4-дихлорфенил)-1,1-диметилмочевину (DCMU), 1.2 мМ аскорбат натрия, 0.5 мкМ дихлорфенол и 60 мкМ метилвиологен. Амплитуду изменения поглощения при 700 нм, индуцированного насыщающим светом (фильтр СЗС-22), измеряли на спектрофотометре Uvicon 931 (Contron, Germany) с помощью приставки, сконструирован-

ной в лаборатории ЛББФА (Институт фотобиологии НАНБ) Концентрацию Р700 рассчитывали, используя коэффициент экстинкции Р700 равный 64 мМ~ 'см'1 при 700 нм (Н1уата Т , Ке В., 1972).

Седиментацию 70 5 и 80 5 рибосом исследовали в аналитической ультрацентрифуге "Бртсо Е", ротор АпО при 42040 об/мин и температуре 20° С. Листья гомогенизировали в 0.01 М фосфатном буфере, рН 7,5 (1 " 0,5, вес • объем) и профильтрованный гомогенат подвергали аналитическому центрифугированию. По данным нескольких опытов относительное содержание 70 5 рибосом пластид рассчитывали по следующей формуле- (70 5/ (70 5+80 Л")) х 100

Удельную активность РБФК определяли радиометрически при 30°С во фракции растворимых белков по Романовой с согр (Романова и др , 1980). Содержание белка оценивали по методу Лоури (Ьо\Угу а1 , 1951). Удельную активность выражали в мкмоль/(мг белка мин).

Содержание редуцирующих Сахаров в водных экстрактах листовой ткани растений оценивали полумикрометодом (Арасимович, 1972). Содержание свободных Сахаров вычисляли в процентах к сухому веществу навески.

Активности водорастворимых р-глюкозидазы (р-Д-глюкозид-глюкоги-дролаза, КФ 3.2.1.21) и р-галактозидазы ((З-Д-галактозид-галактогидролаза, КФ 3.2.1.23) определяли в ферментативной реакции, в 0.05 М фосфатно-цитратном буфере, рН 5,0, для р-глюкозидазы и рН 3.5, для р-галактозидазы. Субстратами для определения б-глюкозидазной активности служили 4-нитрофенил- или 4-метилумбеллиферил-Р-Д-глюкозид, Р-галактозидазной - 4-нитрофенил- или 4-метилумбеллиферич-Р-Д-галактопиранозиды (Усатов и др , 2003) Активность пластидных р-гликозидаз изучали в суспензии пластид, фракция которых была получена методом седиментации (ТишсЬеуа е( а1., 1985). Определение содержания белков в хлоропластах проводили с помощью модифицированного метода Лоури (Магк\уе11 е1 а!., 1978).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Зависимость индуцированного НММ мутагенеза пластид от времени прорастания семян подсолнечника в момент обработки мутагеном

Впервые внеядерные хлорофильные мутации у подсолнечника с помощью НММ были индуцированы Ю.Д. Белецким и Е.К Разоригелевой (Белецкий и др., 1969). Однако направленное получение мутаций пластид у высших растений затрудняло отсутствие данных о механизмах их индукции. Поэтому для решения этой проблемы была исследована частота возникновения внеядер-ных хлорофильных мутаций после обработки семянок подсолнечника НММ в разные отрезки времени на разных сроках их прорастания.

Дозы мутагена, использованные в опытах, выбраны в соответствии с тем, что генетический и цитогенетический эффект зависит от концентрации НММ (Машкина, Усатов, 2003). У подсолнечника НММ в концентрациях (0,01% и 0,015%) индуцирует только внеядерные хлорофильные мутации (Усатов и др., 1995). Повышение до 0,02% приводит к индукции не только пластидных, но и

ядерных хлорофильных мутаций. Мутаген в концентрации 0,03% вызывает крупные структурные перестройки ядерного генетического материала, которые регистрируются как аберрации хромосом (Гуськов и др., 2001).

Результаты экспериментов по индукции НММ (0,01% и 0,015%) гшастид-ных мутаций в зависимости от того, в какой момент прорастания семянок проводили обработку мутагеном приведены в табл. 1 и 2.

После воздействия НММ (0,01%) во временном отрезке 12-15 ч с начала проращивания семянок (вар. 5) максимальная эффективность индукции пла-стидных мутаций составила 40,8 ±4,1% по числу семей М2 с нластидными мутациями и 3,8 ± 0,3% по числу пластидных мутантов. В предыдущем временном отрезке, когда обработку НММ проводили в интервале 9-12 ч (вар. 4), эффективность мутагена была ниже в 2,7 раза, как по числу семей М2 с пласгид-ными мутациями (15,2 ± 2,9%), так и по числу пластидных мутанюв (1,4 х 0,2%). Еще более сильное падение частоты пластидных мутаций наблюдали в варианте 6 (15-18 ч) - в 6,4 раза снижено число семей М2 с мутациями (6,4 ± 2,1%) и в 7,6 раза снижалось число мутантов (0,5 ± 0,1%) Обработка НММ проростков подсолнечника в другие временные интервалы не индуцировала пластидных хлорофильных мутаций.

Таблица 1

Частота индуцированных 0,01% НММ пластидных мутаций в зависимости от времени прорастания семянок подсолнечника в момент обработки мутагеном

Чис- Число семей М2 с Число растений Число растений М2

№ Время, ч ло се- пластидными мутациями с пластидными мутациями

мей М2 абс. % М2 абс. %

1 0-3 153 0 0 5112 0

2 3-6 147 0 0 4733 0 0

3 6-9 149 0 0 4602 0 о

4 9-12 151 23 15,2 ±2,9 5662 81 0

5 12-15 142 58 40,8 ±4,1 3768 142 1,4 ±0,2

6 15-18 141 9 6,4 ±2,1 3670 19 3,8 ± 0,3

7 18-21 146 0 0 4568 0 0,5 ±0,1

8 21-24 143 0 0 4213 0

9 9-15 152 32 21,1 ±3,3 5410 99 1,8 ±0,2

10 12-18 149 25 16,8 ±3,1 5792 83 1,4 ± 0,2

Увеличение концентрации НММ до 0,015% демонстрирует схожую с предыдущими результатами временную динамику индукции мутаций пластома (табл. 2). Так, пик индукции также приходится на вариант 5 (12-15 ч) - 44,4 ± 5,0% семей М2 с пластидными мутациями и 5,0 ± 0,4% пластидных мутантов. Во временном отрезке (9-12 ч) эффективность действия мутагена снижается в

1,8 раза по числу семей М2 (24,5 ± 4,3%) и в 1,9 раза по числу мутантов (2,6 ± 0,3%). Падение эффективности НММ, наблюдали после действия мутагена в интервале 15-18 ч - в 4,0 раза, как по числу семей М.2 (11,2 ± 3,2%), так и по числу мутантов (1,4 ± 0,2).

Таблица 2

Частота индуцированных 0,015% НММ пластидных мутаций в зависимости от времени прорастания семянок подсолнечника в момент обработки мутагеном

Чис- Число семей М2 с Число растений М2 '

№ Время, ч ло се- пластидными мутациями Число растений с пластидными мутациями

мей М2 абс. % М2 абс. %

1 0-3 101 0 0 2652 0

2 3-6 107 0 0 2830 0 0

3 6-9 94 0 0 2353 0 0

4 9-12 102 25 24,5 ±4,3 2764 72 0

5 12-15 99 44 44,4 ±5,0 2642 133 2,6 ±0,3

6 15-18 98 11 11,2 ±3,2 2703 39 5,0 ±0.4

7 18-21 102 0 0 2868 0 1,4 + 0,2

8 21-24 106 0 0 2921 0

9 9-15 107 32 36,4 ± 4,7 2820 91 3,2 ±0,Г

10 12-18 95 25 0 2526 0 _ _о

Таким образом, увеличение концентрации мутагена до 0,015%, повышая абсолютные показатели частоты индукции пластидных мутаций у подсолнечника, по сравнению с 0,01%, не изменяет характер временной динамики, индуцированного НММ мутагенеза. Пик индукции мутаций в исследованном временном интервале от 0 до 24 ч прорастания семянок приходится на 12-15 ч. В пограничных с ним трехчасовых интервалах эффективность индукции мутагенеза падает, особенно в период от 15 до 18 ч. В остальные временные периоды, нам не удалось выделить ни одного пластомного хлорофильного мутанта.

Для детализации этого феномена дополнительно были исследованы два шестичасовым временных отрезка обработки мутагеном прорастающих семянок - 9-15 ч (вар. 9) и 12-18 ч (вар. 10) (табл. 1; 2). Оба эти интервала включают в себя трехчасовой отрезок 12-15 ч, в пределах которого было выявлено максимальное количество пластидных мутаций.

Результаты, полученные после шестичасовых обработок НММ прорастающих семян (табл. 1; 2), оказались довольно неожиданными. Так во всех изученных вариантах опыта, кроме варианта 10 (НММ 0,015%) частота пластидных мутаций достигала только промежуточных показателей между таковыми, полученными при 3-х часовых экспозициях обработки НММ. То есть увеличение интервала времени воздействия НММ на проростки подсолнечника на 3 ч

как до 12 - 15 ч, так и после уменьшало эффективность пластидного мутагенеза. В варианте 10 (НММ, 015%) нам не удалось выявить ни одной пластидной хлорофильной мутации.

Спектр внеядерных мутаций оказался довольно узким - отмечены лишь хлорофильные аномалии, причем, большинство мутантов были представлены пестролистными формами. Мутанты chlorina выявлены только при воздействии НММ во временном интервале 12-15 ч. Жизнеспособность мутантов chlorina чрезвычайно низка. Большая часть растений вследствие низкой жизнеспособности, или отставании в развитии была исключена для дальнейшего изучения. По этой причине из 6 мутантов, выделенных после обработки проростков НММ (0,01%) и 11 мутантов - 0,015% НММ генетический анализ был проведен только для 2 и 3 растений, соответственно.

Результаты, приведенные в табл. 1 и 2, получены на мутантах, внеядерная природа которых, была ясно доказана гибридологическим анализом. Так, в Mi наблюдали появление единичных мозаичных растений и в других временных интервалах обработки НММ. Однако потомство этих растений не отличалось от зеленых растений 3629. В М| и М2 в различных временных отрезках обработки мутагеном было отмечено появление летальных растений (albina, xantha и др.), особенно после воздействия НММ в концентрации 0,015%. Тем не менее, полученные результаты позволили выявить оптимальные режимы обработки НММ семянок подсолнечника приводящие к индукции пластидных хлорофильных мутаций.

Таким образом, зависимость эффективности мутагенеза от времени обработки алкилирующими соединениями, впервые выявлена для цитоплазматиче-ских органелл, в представленных экспериментах. Существование достаточно узкого временного интервала реакции пластид на действие НММ указывает на то, что это свойство связано с кратковременным изменением физиологического состояния пластид, характеризующегося повышенной чувствительностью хпДНК к внешним воздействиям и высокой степенью синхронности метаболических процессов, протекающих в данном отрезке времени.

Особую трудность для интерпретации представляют варианты перекрывающихся обработок НММ. Вариант 12-18 ч при концентрации мутагена 0,015% возможно просто летален, так как уменьшение концентрации до 0,01% индуцирует примерно столько же мутантов, сколько неперекрывающиеся варианты. В остальных случаях с перекрывающимися обработками частота индукции мутаций имеет промежуточные значения между 3-х часовыми вариантами. Результаты эксперимента, приведенные в табл. 1 и 2, свидетельствуют, что критическим этапом развития подсолнечника является временной интервал 12-15 ч, обработка, в пределах которого обеими концентрациями мутагена индуцирует в М2 максимальный уровень пластидных мутаций. Обработка мутагеном, которая заканчивается до 12 ч либо начинается после 15 ч, в несколько раз снижает выход мутантных растений.

Мы предполагаем, что на ранних этапах развития растений существует временной период, являющийся "критическим звеном" - стадия, когда истощаются транслированные резервы, запасенные материнской цитоплазмой, и

еще не запущен в полной мере процесс трансляции белков de novo, как ядерною, так и пластидного компартментов клетки. Этот критический период должен быть наиболее чувствительным к воздействию различных факторов, в том числе и к мутагенам. Это предположение поддерживается фактом достоверного уменьшения частоты индукции мутаций после увеличения длительности обработки НММ (0,01%), обнаруженном при сравнении двух вариантов: 12-15 ч и 12-18 ч Падение эффективности действия НММ можно объяснить выходом развивающихся проростков из зоны чувствительное i и к мутагену после 15 ч от начала прорастания, когда начинается трансляция белков собственного генома клеток В результате этого 3-х часовая экспозиция проростков в мутагене после 15ч проращивания (вариант 15-18ч) приводит к значительному снижению индукции пластидных мутаций.

Все изложенное выше позволяет по-иному интерпретировать гипотезу замены доминирующей матрицы при пластидном мутагенезе, которая основана на принципе множественности копий хпДНК (несколько тысяч на клетку) в результате чего вероятность их одновременного мутирования нереальна (Давы-денко, 1984). Гипотеза постулирует существование a prion "запасных вариантов копий" хпДНК, которые получают селективные преимущества перед "дикими" хпДНК и вытесняют их в процессе репликации. Гипотеза опирается на ряд фактов, свидетельствующих о преадаптации части хпДНК к действию химических агентов, в частности к антибиотикам (Сэджер, 1975). Исходя из представленных выше результатов, воздействие НММ не "проявляет" нредсущест-вующие запасные варианты копий хпДНК, а индуцирует изменчивость в пластидном геноме, причем в достаточно узком интервале времени.

Фенотип растений M¡ и улътрасхруктура пласгид после воздействия НММ

Результат действия мутагена на растения в Mj проявляется в торможении роста растений, снижении выживаемости, повышении стерильности, увеличении длины вегетационного периода, появлении пестролистных растений.

Феномен высокой чувствительности хлоропластов подсолнечника к НММ подтверждает электронно-микроскопическое исследование первой пары настоящих листьев растений М, При анализе более 600 пластид не было обнаружено ни одного неизмененного хлоропласта (Белецкий и др., 1981). Следует отметить, что аномальная желто-белая пятнистость на растениях Mi появляется начиная с 3-5 пары настоящих листьев. Факт 100%-го изменения хлоропластов первой пары листьев под действием НММ особенно интересен в связи с тем, что ультраструктура пластид в зеленых участках мозаичною растения, на уровне 3-5 пары настоящих листьев, не отличается от нормы. В норме хлоропласты подсолнечника инцухт-линии 3629 имеют ультраструктуру, характерную для хлоропластов многих высших растений Овальные или линзообразные органел-лы окружены хорошо выраженной двойной мембраной и имеют развитую ла-меллярную систему, представленную ламеллами гран и ламеллами стромы. В довольно плотном мелкозернистом матриксе хлоропластов имеются электронно-прозрачные участки, в которых видны рибосомоаодобные частицы. На сре-

зах хлоропластов подсолнечника видны зерна крахмала, которые локализованы внутри электронно-прозрачных участков матрикса. Осмиофильные глобулы немногочисленны.

Электронно-микроскопическое исследование пластид, взятых из бесхло-рофильных участков 3-5 пары листьев растений М,, показало значительную гетерогенность их ультраструктуры Под действием мутагена существенно нарушается образование тилакоидной системы. Тилакоиды стромы и гран не заполняют всего внутреннего пространства органелл. На некоторых срезах тилакоиды вообще не обнаруживаются. Наблюдается вакуолизация пластид Однако, несмотря на разнообразные изменения ультраструктуры, можно отметить две характерные закономерности - все анализируемые пластиды содержали значительное количество пластгоглобул, представляющих собой неструктурированные агрегаты белково-липидных пластидных компонентов мембран. Во всех пластидах присутствовали также рибосомо-подобные частицы. Можно предположить, что сборка фотосинтезирующих мембран в значительной степени нарушена, однако органельный синтез белков существенно не подавлен.

Вероятнее всего обработка НММ индуцирует полиморфизм метаболических состояний измененных хпДНК, часть которых в процессе деления хлоропластов вытесняется нормальной "дикой" ДНК, часть даег начало мутантным клонам хлоропластов, часть сохраняет метастабильное состояние, подчиняясь регулирующим "командам" внешней среды и наследуется как длительная модификация (Давыденко, 1984; 2001)

Следовательно, ультраструктурные изменения части хлоропластов первой пары настоящих листьев М, имеют модификационную природу, при которой не затрагивается генетическая основа органелл. Характерной особенностью модификаций является возврат к норме после устранения фактора, вызывающего данные ненаследственные изменения. В наших опытах НММ действует на пластиды, из которых в дальнейшем развиваются зрелые хлоропласты. Пластиды, с неизмененной генетической информацией, в ходе последующих митоти-ческих делений клеток и рассортировкой органелл определяют появление зеленых участков пестролистных растений в Мь а с измененной - мутаптных (белых или желтых) В этом случае частоту возникновения мозаичных растений в М; можно рассматривать как критерий эффективности и специфичности мутагена.

Таким образом, можно сделать вывод, что пестролистность подсолнечника в Мь индуцированная НММ, в основном имеет пластидную природу. Подобную картину наблюдали авторы и на других объектах, что дало им основание оценивать частоту пластидных мутаций уже в М| (Hagemann, Borner, 1979; Hagemann, 1980)

Анализ пдастидной природы внеядерных хлорофилльных мутаций, индуцированных НММ

Внеядерные хлорофилльные мутанты подсолнечника, выделенные после воздействия НММ, были разделены на два феношпически различающихся

класса - это пестролистные формы уаг и мутанты сЫогта, которые возникали с различной частотой. Подробный анализ пластидной природы внеядерных хло-рофильных мутаций проведен на базе коллекционных линий, растения которых в течение нескольких десятилетий устойчиво сохраняют мутантные фенотипы.

Фенотипически пестролистные формы подсолнечника, мутантных линий \<аг выделенные после НММ-мутагенеза в М2 не отличаются от пестролистных растений в М|. Иногда пестролистность у этого типа мутантов можно наблюдать уже на стадии семядолей, но чаще у первых и последующих настоящих листьев, где она сохраняется до их естественного отмирания, при этом граница между измененной и нормальной зеленой тканью листа четко выражена.

Таблица 3

Расщепление в потомстве пестролистных растений мутантых линий уаг после самоопыления

Год наблюдения Количество изученных семей Количество растений в потомстве Количество мутантных растений, %

зеленых пестрых белых (желтых)

1967 50 432 199 88 39,9

1968 60 1128 536 491 47,7

1969 53 1404 584 537 44,4

1970 59 | 1126 457 310 40,5 ,

2000* 15 556 267 192 45,2

2001* 15 547 227 162 41,6

2003* 15 461 283 126 47,1

2004* 15 ! 395 201 179 49,0

Примечание: * - приведены результаты только по тем линиям пестролистных растений, которые были получены в 1967 году.

В табл. 3 приведены результаты расщепления после самоопылении пестролистых растений мутантных линий var в потомстве. Пестролистные химеры всех изучаемых линий расщепляются на три типа проростков: зелёные, пёстрые и летальные (белые или жёлтые). Последние погибают на стадии развития первой пары настоящих листьев. Хотя числовые отношения расщепления признаков непостоянны, однако они носят устойчивый, регулярно повторяющийся характер, подтверждая генетическую непрерывность пластид в ряду клеточных поколений.

Для доказательства однородительского материнского наследования му-ташного признака были проведены реципрокные скрещивания пестролистных форм с растениями исходной инбредной линии. В том случае, когда пестролистные растения опыляли пыльцой зеленых растений, гибридное потомство расщеплялось в F\ как и при самоопылении. При обратном направлении скрещивания, то есть когда в качестве материнского растения использовали зеле-

ное, а отцовским растением служила пестролистная форма, все потомство было зеленым и не расщеплялось в последующих поколениях (табл. 4). Следует отметить, что константными оставалось и потомство зеленых растений, выщеп-ляющихся в потомстве пестролистных форм.

Таблица 4

Расщепление в потомстве реципрокных гибридов от скрещивания пестролистных форм с зелеными растениями линии 3629

Направление скрещивания Кол-во растений в Ft | Кол-во му-

зеленых пестрых тантных белых , , растении, (желтых) 0/ !

пестрое х зеленое 688 373 188 44,9

зеленое х пестрое 763 0 0 0

пестрое х зеленое 1329 598 345 I 41,5

зеленое х пестрое 602 0 0 0

Поскольку фенотипически мутантные растения отличаются от исходных зеленых окраской листьев (от белой до желто-зеленой) было проведено сравнительное исследование содержания Хл и каротиноидов Визуально по окраске мутантной ткани пестролистные формы можно разбить на 3 группы. Зеленые растения с белыми участками содержат в белых секторах фактически следы Хл (0,2-3,0% ог контроля) и каротиноидов (8-10% от контроля). Чуть больше пигментов у растений с желтыми секторами (содержание Хл в желтых секторах до 9%, каротиноидов - до 41% от контроля). В растениях с желто-зелеными пятнами содержание зеленых пигментов и каротиноидов в мутантной ткани достигает 36,7% и 87,6% от контроля соответственно. Зеленые участки по содержанию Хл приближаются к контрольным показателям или даже превышают их. Поскольку мутантная ткань фотосинтетически не активна и поддерживается за счет зеленой части, снабжающей ее продуктами фотосинтеза, функциональная активность последней может повышаться, что мы наблюдали в зеленых тканях пестролистных растений с белыми мутантными участками.

Для пластид в мутантных тканях характерны глубокие изменения ультраструктуры. Это, прежде всего частичное или полное отсутствие тилакоидной системы в жёлтых и белых участках соответственно, а также изменение размеров и числа пластоглобул. Эти изменения коррелируют с данными по содержанию пигментов.

Тест на соматическое расщепление потомства ещё со времён Э. Баура и К. Корренса является одним из самых чётких критериев пластомной обусловленности дефекта пластид. Этот тест широко применяется для анализа пла-стидной природы пестролистности. При электронно-микроскопическом исследовании пестролистных растений из различных линий уаг на границе между зеленой и мутантной тканями были обнаружены гетеропластидные клетки.

Таким образом, на основании приведенных результатов (постоянное соматическое расщепление, однородительское материнское наследование му-тантного признака, изменения внутренней структуры пластид, наличие на границе между нормальными и мутантными тканями гетеропластидных клеток) был сделан вывод о пластидной природе хлорофильных мутаций, индуцированных НММ, у внеядерных пестролистных форм подсолнечника.

По частоте индукции НММ второй группой жизнеспособных хлорофильных мутантов после пестролистных химер являются желто-зеленые формы или сЫоппа, по классификации А. Густафсона (О^аГБвоп, 1940).

Таблица 5

Реципрокные скрещивания мутантов еп сМогта с зелеными растениями исходной линии 3629

Вид скрещивания Фенотип растенй Р] Фенотип растенй Р2

зеленые сЫоппа зеленые сЫоппа

еп:сЫоппа-1 х 3629 0 51 0 568

3629 х еп:сЫоппа-\ 42 0 996 0

еп:сЫоппа-2 х 3629 0 41 0 373

3629 х еп:сЫогта-2 37 0 583 0

еп:сМоппа-Ъ х 3629 0 59 0 601

3629 х еп:сЫоппа-3 54 0 861 0

еп сЫоппа-5 х 3629 0 33 0 395

3629 х еп сЫоппа-5 57 0 712 0

еп:сЫоппа-в х 3629 0 31 0 443

3629 х еп:сЫогта-6 52 0 691 0

еп:сЫоппа-1 х 3629 0 44 0 412

3629 х еп:сЫоппа-1 41 0 786 0

еп:сЫоппа-$ х 3629 0 56 0 312

3629 х еп:сЫогта-% 35 о 403 0

В табл. 5 приведены результаты реципрокных скрещиваний 7 линий сЫоппа с зелеными растениями, свидетельствующие о строго внеядерном характере наследования данных мутаций. Когда в скрещиваниях с мутантами материнским растением является исходная линия 3629, в всегда появляются только зеленые растения При реципрокных скрещиваниях в Т7, представлен исключительно мутантный фенотип. В последующих поколениях Р2 Г, и т.д. ни зеленые, ни мутантные формы не расщепляются Это1 тип мутаций получил обозначение как еп. сЫоппа.

Однако не все мутанты сЫоппа проявляют "классические" различия при реципрокных скрещиваниях Об этом свидетельствуют данные, приведенные в табл. 6. На основании анализа потомства гибридов ¥\ растения этих линий были отнесены к мутантам, имеющим сложный тип наследования хлорофильного дефекта, обусловленный взаимодействием ядра и цитоплазмы.

Таблица 6

Расщепление гибридов о г скрещивания мутантов сЫогта с зелеными растениями исходной линии 3629

Вид скрещивания Количество растений F\

зеленые chlorina xantha

chlorina-A х 3629 3629 х chlorina-A 7 15 0

33 0 0

chlorina-9 х 3629 3629 х chlorina-9 62 21 0

99 0 0

chlorina-XQ x 3629 3629 x chlorina-10 46 76 34

83 0 0

chlorina-11 x 3629 3629 x chlorina-11 38 12 0

44 0 0

chlorina-12 x 3629 3629 x chlorina-12 51 39 0

46 0 0

Мутанты chlorina различаются между собой, и в первую очередь, отличаются от зелёных растений количеством зелёных пигментов, габитусом и продуктивностью. Результаты полевых измерений показали, что все рассматриваемые мутанты это относительно низкорослые, малопродуктивные и мелкосе-мянные формы с пониженным содержанием Хл (54,6%-91,6%) по сравнению с контрольными растениями 3629. С недостатком пигментов коррелирует степень нарушения структурной организации пластид - вакуолизация некоторых ламелл, общая дезорганизация ламелярной системы, менее мощное развитие тилакоидов гран. Следует отметить, что мутанты en.chlorina в отличие от пестролистных химер не расщепляются в потомстве и не имеют гетеропластидных клеток.

Методом электронного микроскопирования был проведен сравнительный анализ формы и размеров хпДНК линии 3629 и мутантов en.chlorina-5 и chlo-rina-12. Показано, что хпДНК у 3-х исследуемых линий кольцевой формы и находятся в сверхспирализованном и релаксированном состояниях (рис. 1), с контурной длиной 49,2±0,9 ммк; 50,6±1,2 ммк и 49,7±0,6 ммк, соответственно.

Для прямых доказательств изменения последовательности нуклеотидов ДНК органелл у мутантов chlorina в лаб. чл.-корр. НАНБ О. Г. Давыденко (ИЦиГ, НАНБ) был проведен сравнительный рестрикционный анализ хпДНК и мтДНК, позволяющий проводить исследования на уровне фрагментов.

Сравнительный электрофоретический анализ, рестрицированной 13-ю эндонуклеазными ферментами (BamH I, Bgl II, Bgl III, Bsp 681, EcoR I, Hind III, Нра I, Pst I, Sac I, Sal I, Sma I, Xba I, Xho I) хпДНК мутантных линий chlorina и исходной родительской формы 3629, выявил полиморфизм хпДНК только у одного фермента - Hind III. В электрофоретическом спектре хпДНК у линии en.chlorina-6 исчезает фрагмент размером 8,9 т.п.н. и появляются два дополнительных, более легких фрагмента длиной - 5,2 т.п.н. и 3,7 т.п.н. (рис. 2). Сумма

размеров вновь появившихся равняется размеру исчезнувшего - 8,9 т.п.н. Это означает, что в 8,9 т п.н/HindIII-фрагменте хпДНК линии eirchlorina-6, возникла мутация, в результате которой появился новый сайт узнавания (AJ-AGCTT) для эндонуклеазы Hind III.

Рис. 1. Электронная микрофотография кольцевой молекулы хпДНК подсолнечника (инбредная линия 3629)

Новый сайт для фермента Hind III был обнаружен в рестрикционных спектрах хпДНК еще двух мутантов: en:chlorina-2 и en:chlorina-l (рис. 2). В хпДНК этих линий возник аналогичный тип перестройки нуклеотидной последовательности: исчез один фрагмент размером 6,7 г.п.н и появились два дополнительных более легких фрагмента 3,2 т.п.н. и 3,5 т.п.н. Сравнение суммарного размера вновь появившихся фрагментов с исчезнувшим, позволяет предположить возникновение мутантного сайта для эндонуклеазы Hind III в нуклеотидной последовательности фрагмента размером 6,7 т.п.н.

Сравнительный анализ локализации мутаций enxhlorina-2, en.chlorma- 6, en.chlorina 7 с результатами многочисленных филогенетических исследований хпДНК высших растений свидетельствует, что области локализации индуциро-ваных НММ мутаций en chlorina у подсолнечника находятся в так называемых «горячих» точках эволюции, т.е. участках хпДНК наиболее часто подверженных эволюционным изменениям в результате делеций. инссрций и замен нук-леотидов (Tassopulu, Kung, 1984; Hipkins et al., 1995).

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15

8.9 тпн-

6,7 тпн ■ 5.2 тпн ■

3,7 тпн -3.5 тпн -3.2 тпн •

W

. -л ■ --4 —' • —=363

'51 р-

est tj tsl M * *

. г 4' и» г* tr

* . В - -к —

Рис. 2. Электрофоретический спектр хпДНК мутантов chlorina подсолнечника, рестрицированной эндонуклеазой Hind III

1 - X/Pst I; 2 - X/Hind III; 3 - en.chlorina-!-, 4 - en:chlorina-2\ 5 -en.chlorina-3; 6 - en.chlorina-5; 7 - en:chlorina-6; 8 - en:chlorina-7\ 9 - 3629; 10 -en:chlorina-8; 11 - chlorina-9; 12 - chlorina-10; 13 - chlorina-11; 14 - chlorina-\2; 15-3629

Изменений в последовательности нуклеотидов мтДНК у мутантов chlorina не обнаружено. Однако полностью исключить наличие точечных мутаций в мтДНК у исследованных мутантных линий нельзя, так как они могут лежать за пределами разрешающей способности использованного метода.

Результаты данного исследования убедительно подтверждают пластом-ную природу мутаций еп ■chlorina у внеядерных мутантов подсолнечника. Более того, к одному типу мутаций chlorina (желто-зеленая окраска листьев) приводят обнаруженные изменения в двух различных областях физической карты хпДНК подсолнечника. Очевидно, что в данном случае можно предполагать наличие различных пластомных мутаций у мутантов en. chlorina, приводящих к сходным фенотипическим проявлениям по окраске листьев.

Специфичность мутагенного действия НММ на пластом подсолнечника

Впервые проблему специфичности мутагенеза обозначил В.В. Сахаров (Сахаров, 1938). Он отметил, что характер реакции организма на действие мутагенных факторов зависит и от его внутренних особенностей и от специфики воздействия. В последующие годы были получены многочисленные подтверждения этого положения. Следовательно, в проблеме специфичности химического мутагенеза можно выделить две стороны единого процесса - это специфичность действия мутагена, как химического соединения (мутагенная специфичность) и специфичность реакции организма на это действие (специфичность объекта). Для определения роли генотипа растений инбредной линии 3629 в пластидном мутагенезе, индуцированном НММ, был проведен сравнительный анализ эффективности индукции внеядерной пестролистности у трех зеленых линий 3629, 922 и К-2011 (табл. 7). Полученные результаты свидетельствуют, что для всех трех генетически различных инбредных линий подсолнечника характерна высокая чувствительность хлоропластов к данному мутагену.

Таблица 7

Частота внеядерных пестролистных мутаций индуцированных НММ (0,02%) у растений различных инбредных линий подсолнечника.

Линия Количество семей М2 Количество семей М2 с мутациями Количество растений М2 Количество мутантов М2

абс. абс. % абс. абс. %

3629 103 43 41,8±4,9 4866 299 6,1±0,3

922 105 40 38,1±4,7 5112 305 5,9±0,3

К-2011 88 19 21,6±4,4 3722 171 4,6±0,4

Для оценки специфичности действия НММ на пластиды подсолнечника был проведен сравнительный анализ частоты хлорофильных мутаций, индуцированных ЭИ и ДЭС, у растений 3629 и определен тип их наследования. Выбор мутагенов был не случаен. Они, как и НММ, относятся к классу алкилирующих агентов, обладающих мощным мутагенным эффектом, который был открыт И.А. Рапопортом (Рапопорт, 1947; 1948).

Результаты, приведенные в табл. 8 свидетельствуют, что ЭИ и ДЭС с высокой частотой индуцируют у подсолнечника хлорофильные мутации, среди которых подавляющая часть была представлена летальными формами типа albina, xaníha, lutescens, chlorina. В небольшом количестве выявлены и жизнеспособные жёлто-зелёные формы chlorina. Однако вследствие отставания в развитии многие из них не формировали семян. Пестролистные растения ни в М| ни в М2 обнаружены не были. Анализ потомства в F¡ и F2 после реципрокных скрещиваний жизнеспособных мутантов chlorina с растениями исходной линии 3629 показал, что все выделенные мутации имеют только ядерную природу.

Таблица 8

Частота индуцированных ЭИ (0,01%) и ДЭС (0,03%) хлорофильных мутаций у подсолнечника(линия3629)

Вариант опыта Зыживае-гость В Mi (%) Количество семей М2

Всего Количество семей М2 с мутациями Количество семей М2 с жизнеспособными мутациями

абс. % абс. (%)

Контроль 98,0 294 - - - -

ДЭС 54.0 216 92 42,6±3,4 3 1,4±0.80

ЭИ 66,8 267 112 41,9±3,0 29 10,9±1,9

В традиционном понимании специфичность мутагенного фактора выражается в различных количественных соотношениях разных типов индуцированных мутаций в пределах их общего спектра (Зоз, 1968). Развитие технических возможностей манипуляции с клеточными геномами, в последнее время привело к направленному изменению генов в хпДНК (Bock et al., 1999; Staub et al., 2000; De Cosa et al., 2001; Ruf et al.. 2001). Эти методы получили название сайт-специфического мутагенеза. (Rochaix, 1997). В нашем случае специфичность НММ проявляется в ее способности эффективно индуцировать пластид-ные мутации у подсолнечника и некоторых высших растений.

Результаты, полученные на другом виде масличных культур, горчицы со-рептской полностью подтвердили это положение. После обработки семян горчицы НММ (0,01% - 0,03%) были выделены и включены в коллекцию 22 пестролистные химеры с внеядерным типом наследования хлорофильных дефектов. Ядерные мутации chlorina выделены в единичных случаях при использовании мутагена в концентрациях 0,02% и 0,03%.

Особенности ревертирования пластомных хлорофильных мутантов

Реверсионный анализ является классическим методом изучения мутационного процесса. В литературе широко освещены исследования по возвратному мутированию ядерных и митохондриальных генов высших растений (Boguta et al., 1992; Bellaoui et al., 1998; Green et al., 1998; Jancka et al, 1998). Однако пока крайне редко используются тесгы на ревертирование мутант ных признаков, контролируемых пластогенами. Тем не менее, применение реверсионного анализа актуально не только для глубокого исследования природы мутаций в хпДНК, но и для понимания функциональных особенностей пласгид, механизмов их взаимодействия с ядерным геномом. В связи с этим, были изучены особенности ревертирования мутантных признаков подсолнечника, контролируемыми пластогенами, а также проведен генетический и морфо-физиологический анализ спонтанных и индуцированных НММ ревертантов из коллекции пла-стидных хлорофильных мутантов подсолнечника.

В серии экспериментов использовали модель, основанную на анализе возникающих в потомстве (на протяжении 7-и генераций) пластомных мутантов еп:сМоппа фенотипически однородных ревертантных растений В связи с тем, что реверсии пластидных хлорофильных мутаций возникают спонтанно только в единичных случаях, для повышения частоты ревертирования использовали НММ. При этом действие НММ. как цитоплазматического мутагена, модифицировали кофеином.

Семянки пластомных еп-сЫоппа-\, еп-сЫоппа-1 и ядерного п сМоппа-9 (монофакториальный, рецессивный тип наследования) мутантов обрабатывали НММ (0,02%). Контрольные семена помещали в воду. Часть семян, обработанных НММ, дополнительно обрабатывали 5х10"3М раствором кофеина. В М| в каждом варианте опыта отбирали растения, фенотипически сходные с исходными мутантами сМоппа Все растения стали родоначальниками линий, потомство которых изучали на протяжении 7-и генераций. В М2 и последующих поколениях, до М7 включительно, высевали по 100 семянок от одного растения из каждой изучаемой семьи, фенотипически сходное с соответствующими мутантами сМоппа. Семьей мы обозначили потомство от самоопыления одного исходного растения М, Такая схема опыта позволила регистрировать возникновение новых реверсионных мутантов в каждом поколении по исходным семьям М| раздельно.

Таблица 9

Количество семей с ядерными и внеядерными реверсиями, возникшими в М3-М7 генерациях после действия НММ на мутанты сМоппа

Чис -ло семей Число семей с ревертантами в Общее кол-во семей с реверсиями

№ Вариант опыта М3 м4 м5 Мб М,

Яя Вне яд Яд Вне яд Яд Вне-яд Яд Вне-яд Яд Вне яд Яд Внеяд

еп-сЫ 1 НММ 19 - 1 - 1 - 2 - 1 2 1 1 ' 36,8%

НММ+ кофеин 12 1 1 - 1 - 1 4 - 1 6* 50,0%

еп- сЫ7 НММ 16 - 1 - - - 2 - 5 - - 7* 43,8%

НММ+ кофеин 14 1 2 - 1 - 4 - 2 - - 1 7,1% 8* 57,1%

псЫ 9 НММ 27 3 з 11,1 % -

НММ+ кофеин 18 5 5 27 8 % -

Примечание- « - в трех вариантах опыта общее количество внеядерных ревертаншв меньше, чем их арифметическая сумма так как, что в потомстве 3 растений М, возникли и полные и частичные реверганты, а именно' еп-сМоппа-1 (НММ -1- кофеин) -М4 (г-еп-сМоппа) и М0 (рг-еп-сЫогта), еп-сМоппа-1 (НММ) - М3 {г-еп-сМоппа) и М6 (рг-еп-сМоппа); еп-сМоппа-1 (НММ -кофеин)-М, (г-еп-сМоппа) и М5 (рг-еп-сМоппа).

В М| и М2 после обработки семянок мутантов сМогта как НММ, так и совместно НММ с кофеином, ревергашных растений не выявлено. Ревертанты в потомстве ядерного и пластомных мутантов впервые проявились только в М3, при этом возникновение ядерных реверсий в последующих поколениях не наблюдали, а внеядерные реверсии у плас томных мутантов продолжали выщеп-ляться до М7 включительно (табл. 9).

Внеядерные реверсионные мутанты, выделенные в М3 - М7 были разделены на два типа' полные ревергашы (г-ск1огша), у которых полностью восстанавливались цвет листьев и габитус до нормальных зеленых растений 3629, и частичные ревертанты (рг-сЫоппа), у которых восстанавливался только габитус, а цвет листьев и соответственно содержание пигментов не отличались от исходных растений сМоппа.

Все зеленые ревертанты (8 семей), выделенные в потомстве ядерного мутанта п. сМоппа-9, имели только ядерную природу реверсий. Полные ревертанты, выделенные в потомстве пластомных мутантов, имели как ядерный (2 семьи), так и внеядерный тип наследования, а частичные - только внеядерный тип наследования. Постобработка кофеином у всех 3-х мутантов сМоппа, увеличивала в различной степени частоту как ядерных, так и внеядерных (полных и частичных) реверсий, по отношению к действию одной НММ Тем не менее, это не привело к принципиальному изменению характера динамики ревертиро-вания, после индуцированного НММ мутагенеза. Частота внеядерных реверсий, определенная по количеству семей М], за 7 лс1 наблюдений, составила около 50%.

Реверсии пластидных хлорофильных мутаций у подсолнечника

На протяжении ряда лет воспроизводства коллекции пластомных мутантов подсолнечника у мутантов еп сМоппа-Ъ и еп сМоппа-Ь мы наблюдали появление реверсий. Результаты гибридологического анализа спонтанных ревер-тантов сведены в табл. 10. Ген-супрессор в пластоме обусловил возникновение реверсии г-еп:сМоппа-5 (Усатов и др., 2004). Реверсия г-епхЫоппа-3 является ядерной доминантной мутацией. Она супрессирует проявление пластидной хлорофильной мутации не только у мутанта еп сИ1огта-3, но и у еп:сМоппа-Ь и еп. сМоппа-2.

Примеры генетической комплементации при совмещении различных наследственных систем в литературе известны. Так еще в 60-х годах Ес^агеоп показал, что при скрещивании растений табака с внеядерной песфолистностью в качестве женского родителя с 7-ю разновидностями этой культуры в 2-х скрещиваниях происходило устранение пестролистности в (Пёшатьоп, 1966). Однако, в нашем случае ядерная супрессорная мутация ревертанта г-сп сМогта-Ъ возникла на единой ядерной генетической основе исчоднои линии 3629, а не при совмещении генетически чужеродного ядра с мутантными пластомами.

В коллекцию были включены полный ревертант г-еп сИ1огта-1, выделенный вМ)И частичные ревертанты рг(I-9)-еп:сМоппа-1, выделенные в М6, после обработки семянок мутанта еп:сМоппа-1 мутагеном (см. выше) Результ? "е-

нетического анализа этих ревертантов свидетельствуют о строго материнском наследовании выделенных реверсий.

Таблица 10

Генетический анализ спонтанных реверсий г-еп -сЫоппа-3 и г-еп сМоппа-5

Вид скрещивания Фенотип растений Fi Фенотип растений Fi

зеленые chlorina зеленые chlorina X2P

en.chl-Ъ х r-en:chl-3 108 0 63 20 0,037; 0,9>P>0,75

r-en:chl-3 х en. chl-Ъ 87 г 0 1 126 39 0,164; 0,75>P>0.5

en:chl-5 х г-еп:сМ-Ъ 112 0 59 19 0,017; 0,95>P>0,9

r-en:chl-3 х en:chl-5 76 0 142 45 0,087; 0,9>P>0,75

en:chl-2 х r-en:chl-3 76 0 96 29 0,205; 0,75>P>0,5

r-en:chl-3 x en~chl-2 119 0 153 48 0,134; 0,75>P>0,5

en chl-5 x r-en:chl-5 0 47 0 178 -

r-en:chl-5 x en:chl-5 61 0 137 0 -

r-en:chl-5 x 3629 15 0 130 0 -

Мы полагаем, что мутационные изменения в пластоме приводят к полным реверсиям, а возникновение частичных ревертантов обусловлено мутациями в мтДНК, имеющими супрессивный или компенсаторный характер (Усатов и др., 2004). Это предположение подтвердили результаты сравнительного моле-кулярно-генетического исследования хпДНК и мтДНК ревертантов и их исходных форм (3629 и en.chlorina-1), проведенные в лаборатории О.Г. Давыденко ИЦиГ HAH Беларуси. Оказалось, что у полного ревертанта r-en:chlorina-1 произошла истинная реверсия в хлоропластном геноме, а у всех частичных ревертантов prl 9- en:chlorina-l сохраняется измененная первичная структура хпДНК мутанта en:chlonna-7 по сравнению с таковой у линии 3629 (Tnboush et al., 1999). Однако при этом у всех частичных ревертантов обнаружены перестройки в последовательности нуклеотидов мтДНК (Трибуш, и др., 1998).

Сравнительный морфофизиологический анализ реверсионных мутантов и их исходных форм показал, что степень и характер восстановления фенотипа зависит от типа реверсии. Истинная реверсия (r-en:chlorina-7) восстанавливает все морфофизиологические признаки растений. Ядерная супрессорная мутация (r-en:chlorina-3) полностью снимает негативные последствия мутации, возникшей в хпДНК. У ревертантов восстанавливается нормальное содержание Хл. Показатели габитуса и продуктивность растений не только восстанавливаются, а даже превышают таковые, у исходных растений 3629. Однако у ревертанта сохраняется повышенная устойчивость к сульфатному засолению, присущая мутанту en.chlorina-З. Наличие пластидной (r-en:chlorina-5) или митохондри-альной (рг/.9 -en:chlorina-l) супрессорных мутаций приводят к реверсиям по отдельным признакам. Пластидный ген-супрессор восстанавливает содержание

Хл в листьях растений. При этом у ревертантов исчезает повышенная устойчивость к засухе, присущая исходному мутанту. Наличие митохондриальной супрессии не влияет на уровень Хл и структуру хлоропластов. В то же время у частичных ревертантов в различной степени восстанавливаются показатели габитуса и продуктивность по сравнению с мутантом. Таким образом, тип реверсии определяет степень восстановления морфологических и физиологических признаков пластидных мутантов.

Структурно-функциональные особенности мутантных пластид

подсолнечника

Исследование влияния пластидной мутации на первичное проявление Хл-дефицитности в разных условиях выращивания растений проводили на растениях мутантной линии varlO, листья которых при выращивании в условиях нормальной смены дня и ночи были полностью белыми и, следовательно, имели самые глубокие нарушения фотосинтетического аппарата среди хлоро-филльных мутантов подсолнечника (Усатов и др., 2004), а также у жизнеспосо-бого мутанта en:chlorina-5.

Сравнительный анализ состава фотосинтетических пигментов, мембранных полипептидов пластид, а также спектральных характеристик листовой ткани мутанта varlO и исходной линии в процессе развития растений, позволил сделать вывод, что первичным проявлением недостатка Хл на уровне структурной организации фотосинтетического аппарата является нарушение соотношения между комплексами фотосистем: на всех этапах развития листьев мутанта для них характерна избирательная редукция комплексов ФС I. По мере развития у мутанта фотодеструкционных процессов наблюдаемые нарушения усиливаются, вызывая постепенное разрушению комплексов ФС II, а затем и ССК, что согласуется с повышенным содержанием у мутанта лютеина и виолаксан-тина (Рассадина и др., 2001).

Было обнаружено, что проявление хлорофильного дефекта в пластидах мутанта varlO зависит от условий выращивания растений (разные температурные и световые режимы) - он либо проявлялся, либо отсутствовал. Свето- и температурозависимость мутантного признака, наблюдали только на ранней стадии формирования пигментсодержащих тканей. Прохождение этой стадии на свету высокой интенсивности или в условиях высоких температур способствовало максимальному развитию у мутанта дефицита Хл и каротиноидов. Напротив, прохождение этой стадии при низкой освещенности не только не приводило к Хл-дефицитности в мутантной ткани, но и блокировало развитие в ней этого процесса при переносе мутанта в условия, способствующие проявлению максимальной пигментной аномалии.

Анализ низкотемпературных (-196°С) спектров поглощения и флуоресценции листьев растений 18-дневного возраста, выращенных в условиях освещенности 2000 лк показал, что у мутанта enxhlorina-S на фоне общего снижения всех спектральных форм Хл происходит преимущественная редукция форм, принадлежащих Хл ФС I. Количество реакционных центров ФС I (Р700)

на единицу поверхности листа, также как и количество Хл на Р700 в мутантных растениях понижено, относительно таковых показателей у зеленых растений 3629 (табл. 11), что согласуются с результатами спектральных измерений свидетельствующих об определенных нарушениях в результате мутации в комплексах ФСI.

Квантовый выход первичных реакций разделения зарядов в реакционных центрах ФС II (Ф®с п), эффективность работы электрон-транспортной цепи (ЕТЯ), компоненты фотохимического (цР) и нефотохимического (ОТС)) тушения флуоресценции Хл ФС II в листьях мутанта оставались такими же, как в контроле (табл. 12), свидетельствуя об отсутствии изменений в функционировании ФС II в листьях мутанта еп:сМогта-5.

Таблица 11

Содержание хлорофиллов (нмоль/г свежего веса), параметры флуоресценции хлорофилла а и содержание Р 700 в листьях мутанта еп:сМоппа-5 и линии 3629

подсолнечника

Тип расте ния Хл, нмоль/г ETR ФФСП qP NPQ Хл/ Р700 Р700/ S*

3629 2540±70 35.22±1.07 0.699±0.021 0.885±0.021 0.341±0.017 360 175

СМ- 5 1420±40 32,7±0.99 0.649±0.02 0.824± 0.02 0.329±0.03 305 102

* S=38.5 мм - суммарная площадь 5-ти высечек, различных листьев

Таким образом, первичные нарушения структуры фотосинтетического аппарата в листьях мутанта en:chlorina-5, так же как и в случае мутанта var 10, связаны с нарушениями в формировании ФС I.

В литературе описан ряд внеядерных хлорофильных мутантов высших растений и водорослей, характеризующихся пониженным содержанием или отсутствием 70 S рибосом (Hagemann, 1982). Определение относительного количества 70 S рибосом в зеленых (линия 3629), белых (\ar9, var 10) и желтых (vari 1, vari 3) мутантных тканях показало, что все исследованные ткани содержат два типа рибосом - 70 S и 80 S (табл. 12). Полисомы у мутантов не были обнаружены. У линий с белой мутантной тканью относительное содержание 70 S рибосом было снижено примерно на 25%, а с желтой - оставалось на уровне контрольной, зеленой линии. Ранее, аналогичная, положительная корреляция между количеством 70 S рибосом и содержанием Хл была обнаружена у желтых мутантов Chlamydomonas reinhardtii с материнским характером наследования мутантного признака (Gyuijan et al., 1980).

Косвенным показателем функционирования рибосом в мутантных пластидах может служить уровень активности РДФК - «основного белка фотосинтеза», малая субъединица которой транслируется в цитоплазме на 80 S рибосомах, а большая - на 70 S рибосомах пластид. Из приведенных в табл. 12 данных видно, что уровень активности РДФК коррелирует с содержанием Хл и относительным количеством 70 S рибосом в мутантных тканях пестролистных линий.

Таблица 12

Доля фракции 70 8 рибосом, содержание хлорофилла (в расчете на сухой вес) и удельная (в расчете на белок) активность РДФК в листовой ткани пестролистных растений подсолнечника

Линия, фенотип листьев или их участков Относительное содержание 70S рибосом, в % от 70S+80S Хлорофилл а+Ь, мг/г Активность РДФК, мкмоль/(мин мг)

3629 зеленые 41.6 7.9±0.5 0.36±0.04

Уаг 13 - желтые 39.9 0.71±0.1 0.25±0.03

Уаг 11 - желтые 40.5 0.64+0.1 0.18±0.03

Уаг 10 - белые 28.7 0.2510.1 0.02±0.005

Уаг 9 - белые 31.5 0.21 ±0.1 0.02±0.005

Следовательно, в мутантных пластидах рибосомы функционируют. Однако, в растениях с белыми участками, в которых определяются лишь следы Хл (\>аг9, VIIг 10) активность РБФК резко подавлена. Таким образом, у мутанта уаг-10, с наибольшим нз пестролистных химер дефицитом Хл, резко снижена активность как световой, так и темновой фаз фотосинтеза.

Содержание редуцирующих Сахаров и активность р-кшкозидаз в пластидных хлорофильных мутантах

Снижение фотосинтетической активности у хлорофильных мутантов, очевидно, должно отразиться на количестве восстановленных Сахаров, как первичных продуктов фотосинтеза. В данном эксперименте использовали как белые участки листьев линии уаг-10, содержащей лишь следы Хл, так и зеленые участки тех же листьев с нормальным количеством зеленых пигментов. В качестве объекта сравнения использовали мутант еп.сМоппаА с пониженным содержанием Хл (85% от контрольных показателей у растений 3629). Контролем служили растения исходной линии 3629.

В табл. 13 приведены количества редуцирующих Сахаров в течение вегетации растений. Мутантные участки листьев пестролистной формы уаг-10 на протяжении всего периода роста растений по количеству восстановленных Сахаров значительно уступают зеленым тканям. Содержание Сахаров в этих участках было в 3-23 раза ниже, чем в соседних зеленых участках листьев той же линии, а по сравнению с зеленой тканью растений линии 3629 в 5-35 раз. Зеленой и желто-зеленой тканям м>гантных линий var-\0, еп.сМоппа-1 соответствует достаточно высокий уровень углеводов, хотя все же он несколько снижен по сравнению с линией 3629. Максимальное количество углеводов у мутантов, в отличие от контрольной линии 3629, накапливается в фазе поздней бутонизации. Последующее уменьшение их содержания, вероятно, связано с усиленной утилизацией углеводов в репродуктивных органах в фазу цветения.

Таблица 13

Содержание редуцирующих еахаров (% к сухому весу) в листьях пластомных мутантов подсолнечника на различных стадиях развития

Линия, фенотип ткани Фаза развития

3-4 пара листьев 5-6 пара листьев 7-8 пара листьев ран. бу- позд. бу-тониз. тониз. цветение

3629,зеленая 3,В0±0,36 4,27±0,43 4,32^0,82 3.88±0,77 1 3,71+0,96 1.31±0,11

еп сМ-1 желто-зеленая 2,08-0,41 !,35±0,28 1,64±0,22 1,85±0,62 1 2,83±0,39 1 0,97±0,16

тг-10, зеленая 2,28±0,59 2,76±0,85 2,79±0,58 3,34±0,28 1 3,86±0,32 1 2,96±0,35

гаг-10, белая | 0,67±0,17 0,36±0,03 0,12±0,01 0,70±0,07 | 1,64±0,72 1,17=0,15

Полученные результаты свидетельствуют о наличии прямой связи между активностью фотосинтезирующей системы и содержанием углеводов: чем больше выражена хлорофильная недостаточность в мутантных пластидах, тем ниже концентрация Сахаров в тканях растений.

Поскольку моносахара также являются продуктами гидролитических реакций, катализируемыми )3-гликозидазами, а галактоза и глюкоза представляют моносахара большинства гликозидов, олиго- и полисахаридов, в мутантных тканях различных линий в течение вегетации растений была определена активность водорастворимых б-галакто- и /3-глюкозидаз.

Результаты, полученные в этой серии экспериментов, позволяют сделать вывод, что на протяжении всего периода роста растений (за исключением фазы цветения) в мутантных тканях с ярко выраженной хлорофильной недостаточностью (линии \аг-6, уаг-ХО, \'аг-19, уаг-23), по сравнению с зеленой тканью линии 3629 многократно повышены /3-гликозидазные активности. В водорастворимой фракции преобладала (3-галактозидазная активность, уровень которой в зависимости от стадии развития растений в мутантных тканях возрастал, относительно контроля в 2-4 раза. При этом показатели активности /3-галактозидазы из мутантной и зеленой тканей одного и того же пестролистного растения (линия шг-10) различались в 2-5 раз. /3-глюкозидазная активность из водорастворимой фракции зеленых тканей растений 3629 и уаМО была на уровне следовых значений, а в мутантных участках пестролистных химер она повышалась в 3-12 раз. Однако, в отличие от пестролистных химер у мутанта еп-сЫоппа-1 /3-гликозидазные активности находились на уровне контроля.

В хлоропластах подсолнечника нам удалось идентифицировать как /3-галакто-, так и /З-глюкозидазную активности. В связи с этим представлял особый интерес выявить зависимость между степенью хлорофильной недостаточности и уровнем активности /З-гликозидаз, локализованных непосредственно в мутантных пластидах. С этой целью были выделены фракции пластидных мембран контрольной линии 3629, нескольких пестролистных химер и мутанта en.chlorina.-5. Удельная активность мембраносвязанных /3-гликозидаз и содержание Хл в пластидах изучаемых линий приведены в табл. 14. Аналогично

ферментам из водорастворимой фракции мембраносвязанные р-гликозидазы пластид проявляют повышенную активность в мутантных тканях пестролистных линий по сравнению с контрольными значениями, причем уровень удельной активности р-гликозидаз коррелирует с уровнем содержания Хл.

Таблица 14

Активность пластидных Р-гликозидаз и содержание хлорофилла в листьях пластомных мутантов подсолнечника

Активность (мкМ/мин мг белка)х10"3 Содержание хло-

Линия р-галактозидаза Р-глюкозидаза рофилла (мг/г сухого веса)

3629 2.1±0.20 5.53±1.16 6.3±0.53

епсМ- 5 2.2±0.22 4.85±0.68 5.5^-0.46

уаг-Ь 2.06±0.39 6.0+0.84 4.3±0.52

уаг-9 5.8±1.16 15.l5i2.58 0.15-1:0.06

уаг-10 6.15±1.60 16.8±4.37 0.25±0.09

уаг-11 3.7±0.34 11.45±3.55 0 66±0.23

V аг-13 4.35±1.13 12.25±2.57 0.70±0.18

Таким образом, различные формы Р-гликозидаз независимо от их локализации в клетке подчиняются общей закономерности: их активность резко возрастает в тканях, в которых наблюдается дефицит продуктов фотосинтеза. При этом в мугантных тканях происходит интенсификация автолитических процессов, проявляющихся в вакуолизации внутриклеточных структур, достшая своего крайнего выражения, когда вакуоль занимает все внутриклеточное пространство, а находящиеся в ней органеллы, подвергаются лизису. Вместе с тем, увеличение активности происходит лишь в том случае, когда нарушения внутренних структур пластид достаточно глубоки, как это имеет место в мутантных участках пестролистных химер. Если же изменения в хлоропластах не столь глубоки как например у мутантов сЫогта, то данный эффект не проявляется. По-видимому, существуют некоторые критические концентрации фотосингети-ческих продуктов, и в первую очередь, моносахаров, которые инициируют рост активности р-гликозидаз. В связи с тем, что данные ферменты, кодируются ядерными генами, представленные данные также указывают на существование обратной регуляторной связи между пластидами и ядром. Нарушения в генетическом материале пластид могут приводить к изменению экспрессии ядерных генов, в результате чего происходит существенное увеличение акшвносш Р-гликозидаз в самих мутантных органеллах.

Моделирование эритромицином хлорофильных дефектов у подсолнечника

Структурно-функциональные нарушения фотосинтетическо! о аппарата, вызванные мутационными изменениями в пластоме, приводят к глубоким сдвигам нормального ипте^чния , п „ , 1- , •

ным изменениям могут приводить и эпигенетические факторы. В качестве такого фактора мы исследовали антибиотики, блокирующие белковый синтез на 70 5 рибосомах. В предварительных экспериментах было показано, что действие антибиотиков приводят к тем же фенотипическим эффектам, что и хлоро-фильные мутации. Наиболее эффективным в этом отношении для подсолнечника оказался эритромицин.

Влияние эритромицина изучали на 12-дневных проростках подсолнечника зеленой линии 3629. Вариации окраски листьев проростков зависели от содержания эритромицина в питательной среде. При низких концентрациях (0,5 и 1 мМ) листья приобретали светло-зеленую окраску, на листовой пластинке появлялись обесцвеченные участки. Эти участки увеличивались в размерах при повышении дозы антибиотика до 2 мМ. Дальнейший рост концентрации эритромицина в среде (3-5 мМ) приводил практически к полному обесцвечеваиию листьев. В полном соответствии с изменением окраски листьев проростков, происходило снижение количества зеленых пигментов (рис. 3).

И высокие концентрации антибиотика (3-5 мМ), и летальная мутация (га/--10) приводят к необратимым нарушениям структуры фотосинтетического аппарата. Электронно-микроскопическое исследование образцов листовой ткани, обесцвеченной под влиянием эритромицина, показало, что антибиотик сильно подавляет развитие тилакоидной системы фотосинтезир>ющих мембранных комплексов. Отдельные немногочисленные мембранные образования формируются в виде укороченных протилакоидов. Уменьшение электронной плотности матрикса органелл, местами почти до полной электронной прозрачности, свидетельствуют о значительном снижении числа рибосом Сходная степень деградации была отмечена и у пластид в мутантной ткани линии тг-10.

Таким образом, в основе фенотипического сходства пластидной мутации и модификации, вызванной эритромицином, лежат аналогичные изменения в содержании пигментов и ультраструктуры хлоропластов. В крайних проявлениях действия антибиотика можно наблюдать не только разрушения пластид, но и интенсивную вакуолизацию цитоплазмы. Иногда вакуоль может захватывать всю клетку, при этом находящиеся в цитоплазме органеллы лизируются. Подобные процессы, свидетельствующие об усиления автолиза, развиваются и при летальной мутации.

Листовая ткань проростков подсолнечника линии 3629, выращенных на среде с эритромицином, отличается от ткани контрольных растений высоким уровнем активности водорастворимых Р-гликозидаз, причем показатели этой активности практически не зависят от повышения концентрации антибиотика в среде (рис. 3). Сравнительно низкая концентрация эритромицина (1 мМ), которая вызывает незначительное обесцвечивание листовой ткани и не влияет на жизнеспособность проростков, индуцировала, вероятно, максимально возможный в данном эксперименте рост как Р-глюкозидазной, так и Р-галактозидазной активности. Очевидно, активация данных ферментов является одним из звеньев ответной реакции растений на стрессовое воздействие, возникающее в результате снижения концентрации углеводов, индуцированного как хлорофильными мутациями, так и действием антибиотика.

0 12 3 4

Концентрация эритромицина, мМ

Рисунок 3. Зависимость между концентрацией эритромицина, содержанием хлорофиллов и активностью Р-гликозидаз (1 - содержание хлорофилла, (а+в); 2 - активность Р-глюкозидазы; 3 - активность Р-галактозидазы; в листьях растений линии 3629 подсолнечника.

Полученные данные позволяют считать активность р-гликозидаз информативным маркерным признаком, а пластомные мутанты и растения, модифицированные эритромицином - перспективными моделями при изучении ядер-но-пластидных взаимодействий.

Индукция НММ у подсолнечника и горчицы форм, с повышенной устойчивостью к экстремальным факторам среды

Основанием для этого направления исследований явился следующий отправной факт. На протяжении ряда лет культивирования внеядерных хлоро-фильных мутантов подсолнечника мы обнаружили, что растения некоторых генетических линий обладают повышенным потенциалом адаптивности к различным внешним воздействиям. Так, один из коллекционных мутантов en.chlorina-5 вследствие плейотропного эффекта хлорофильной мутации оказался устойчивым к водной депривации. В условиях действия жесткой засухи, которая часто наблюдается во время вегетации подсолнечника на юге Ростовской области, у растений enchlorina-5 содержание зеленых пигментов и продуктивность практически не изменяются, в отличие от исходной линии 3629 и других мутантов, у которых эти показатели уменьшаются вплоть до 50 %, от контрольных значений в физиологически нормальных условиях вегетации.

Очевидно, что своеобразная реакция на засуху мутанта en.chlorina-5 определяется особенностями мутационных изменений хлоропластов у данной формы, в связи, с чем этот мутант может вовлекаться в гибридизацию с различ-

ными инбредными линиями и сортами, передавая при этом по материнской линии мутантные пластиды Так на основе мутанта еп-сЫогта-5 и районированного в Ростовской области сорта Маяк были получены гибриды (Г\: еп:сМоппа-5 х Маяк), сочетающие повышенную резистентность к засухе с комплексом хо-зяйственно-ценчых свойств сорта В засушливые годы урожайность гибрида F1 в среднем была на 20-25% выше, чем у сортовых растений Например, в исключительно засушливый 1986 год на площади 2,5 га она составила 24,5 ц/га, против 14 га у сорта В то же время гибрид между растениями исходной линии 3629 и растениями сорта <<Маяк» (Р[ 3629 х Маяк) по этому показателю оставался на уровне сортовых растений.

Растения линии еп'сЫоппа-6 обладают повышенной устойчивостью к хлоридному засолению. Обнаружено, что за исключением мутанта еп ■сЫоппа-в засоление приводит к снижению всхожести семян мутантных линий пропорционально концентрации №зС/ в среде. Высокая устойчивость мутанта проявляется в его способности развиваться при высоких концентрациях ЫаС! (2,9 и 5,8%), при которых семена остальных линий не прорастают.

Среди мутантов еп сМогта были выделены линии, и в первую очередь еп-сМогта-Ъ, характеризующиеся повышенной сульфатоустойчивостью. В условиях вегетационного опыта мутант еп-сЫоппа-Ъ при 1%-ном засолении Ма2804 формировач более чем в 3 раза высокий урожай по сравнению с исходной формой.

Целенаправленная селекция на создание высокоустойчивых к засолению сортов и гибридов сельскохозяйственных растений представляет один из основных путей эффективного освоения засоленных земель Первым шагом в этом направлении является получение солеустойчивых форм как исходного генетического материала для дальнейшей селекционной работы. Так кзк хлоро-фильные мутанты являются малопродуктивными формами с уменьшенным габитусом, что делает их непосредственное использование в практике нецелесообразным, особый интерес представляет получение при помощи НММ галоре-зистентных форм, не отягощенных хлорофильными дефектами.

Для получения солеустойчивых форм были изучены различные режимы обработки НММ семян подсолнечника С этой целью семена инбредной линии 3629 предварительно замачивали в воде (в анаэробных условиях) при комнатной температуре в течение 12. 16, 20 и 24 ч. Затем семянки проращивали в растворах НММ (0,005%, 0,008% 0,012% или 0,015%) при температурах 15°С, 20°С, 25°С или 30°С в течение 3 ч, 6 ч, 9 ч или !2 ч, а также в течение 6 ч спустя 6- или 12- часового роста после окончания замачивания. После проращивания на растворе мутагена семянки высевали в поле и получали растения М|. Соле-устойчивые формы выявляли в М2. Частоту солеустойчивости определяли по отношению взошедших на 1,7% растворе ИаС1 растений к общему числу высаженных семян. Большая часть растений М2 после иицухтирования была полностью или частично стерильна (3-5 плодов). Тем не менее, в последующих генерациях при прорастании семян на провокационном фоне с высокой концентрацией хлоридов (1,7% раствор А'аС/), в течение нескольких лет были отобраны наиболее перспективные для дальнейшей селекции 7 галорезистентных линий

ЯЯ. В условиях вегетационного опыта на пресном фоне и при почвенном засолении (1% ЫаСГ) определяли продуктивность SR растений (табл. 15).

Таблица 15

Продуктивность растений БЯ (вес сухих семянок одной корзинки, г), выращенных на пресном и засоленном (1% ИаСГ) фоне в условиях вегетационного опыта

Линия Контроль 1% ЫаС1

3629 16,1 ±1,2 5,910,8***

SR] 18,311,2 17,010,7

БЯ2 13,810,9 16,711,0*

SR^, 19,211,0 13,710,9***

ЗЯ4 16,610,7 17,111,1

5Л5 21,211,4 15,910,8***

5*6 17,311,1 14,810,6*

14,310,9 15,011,4

Примечание *** - достоверные отличия по сравнению с соответствующим

контролем при Р<0.001; * - достоверные отличия по сравнению с соответствующим контролем при Р<0,05

В контрольных условиях продуктивность растений солеустойчивых линий (за исключением SRs) не отличается от исходной линии 3629. В условиях 1%-го хлоридною засоления у растений 3629 продуктивность уменьшалась в 2,7 раза относительно контроля. У форм ЯР,, продуктивность снижа-

лась только в 1,4; 1,3; 1,2 раза, соответственно. Однако продуктивность данных форм в условиях засоления достоверно превышает продуктивность растений линии 3629 Продуктивность растений 5/?4 SR1 при хлоридном засолении остаётся на уровне контрольных значений, а у формы 57?2 даже наблюдается некоторая продукционная стимуляция - урожайность растений 57? 2 при этом же уровне засоления достоверно превышает контрольные показатели. Следовательно, 5Л формы подсолнечника сохраняют повышенную устойчивость к хло-ридному засолению по сравнению с растениями исходной линии 3629.

Таким образом, на основе полученных результатов, предложен способ эффективного получения солеустойчивого первичного материала у подсолнечника : семена выдерживают в воде без доступа воздуха в объёме, превышающем объем семянок в 9-10 раз (анаэробные условия) в течение 16-20 ч. Эта процедура синхронизирует у семянок начало ростовых процессов. Затем, не позднее 6 ч после выдерживания в воде семена проращивают в течение 6-12 ч в 0,008-0,012% растворе НММ. Проращивание осуществляют при 20-25°С. После обработки семена высевают в поле и в М2 выявляют формы с повышенной со-леустойчивостью

Предложенный метод может быть использован для получения солеустойчивых форм и у других видов с/х растений. Так положительный результат, полученный при индукции НММ БЯ форм у подсолнечника, позволил апробировать этот метод на районированном в Ростовской области сорте Донская-5 гор-

чицы Brassica junceae Были выделены и размножены в последующих поколениях солеустойчивые растения, не имеющие хлорофильных дефектов, которые по аналогии с подсолнечником были обозначены как SR формы. В условиях вегетационного опыта при хлоридном засолении (1% NaCl) растения SR линий сохраняли показатели продуктивности по сравнению с контрольными условиями вегетации в отличие от сортовых растений.

В табл. 16 приведены данные о содержании редуцирующих Сахаров в листьях растений SR линий и исходного сорта, в контрольных условиях вегетации и в условиях, почвенного засоления. В контроле растения трех линий по данному показателю не отличаются друг от друга. В условиях хлоридного засоления (1,2% NaCt) уровень первичных продуктов фотосинтеза в листьях сортовых растений снижается на 35,4%. В то же время, у SR форм, уровень редуцирующих Сахаров или не изменяется (SR2), или даже превышает контрольные показатели на 21,3% (57?з), что может свидетельствовать, о высокой активности процесса фотосинтеза у SR растений в условиях хлоридного засоления.

Таблица 16

Содержание редуцирующих Сахаров в листьях растений сорта Донская 5 и SR форм горчицы (мкг/г сырого веса) в контроле и в условиях засоления

Вариант Содержание редуцирующих Сахаров

Контроль 1 % NaCl | 1,2 % NaCl

Донская-5 9.2Ю.9 9.3±0.7 6.4±0.6б

SR-2 8.5±0.6 lO^iO."-6 7.1 ±0.7

SR-3 8.9+0.5 12.8±0.4"'г 10.8±0.6""

Примечание: а - достоверное отличие по сравнению с линией Донская-5 при соответствующих условиях роста при Р<0 001; б - достоверное отличие по сравнению с соответствующим контролем при Р<0.05; г - достоверное отличие по сравнению с соответствующим контролем при Р<0.001

Физиологический статус растительной клетки во многом зависит от состояния внутриклеточных мембран и органоидов, функционирование которых определяет основные метаболические процессы. Прежде всего, это относится к пластидам и митохондриям, которые обеспечивают ключевые процессы жизнедеятельности организмов - внутриклеточное дыхание, окислительное фосфо-рилирование, фотосинтез Эти процессы более чем какие-либо другие определяют адаптивность и продуктивность организмов. Хотя изменения ультраструктуры клеток, как правило, имеет неспецифический характер, однако степень этого изменения и пороговая величина внешнего фактора, который ее вызывает, зависят от уровня устойчивости организма к данному воздействию. Результаты, ульт'раструктурного анализа пластид горчицы, свидетельствуют, что при изученных режимах хлоридного засоления изменения структуры хлоропла-стов сортовых растений, проявляются значительно сильнее, чем у SR форм. При этом структурные изменения сопряжены с функциональными, в частности, со снижением уровня редуцирующих Сахаров. В свою очередь структурно-

функциональные изменения хлороиластов в условиях солевого cipecca приводят к снижению продуктивности рас1сний.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальные данные, изложенные в данной работе, вносят вклад в один из наименее разработанных разделов генетики - нехромосомной наследственности высших растений. В результате многолетних исследований мутагенеза подсолнечника, индуцированного НММ, выявлены закономерности эффективной индукции пластидкых хлорофильных мутаций, после воздействия мутагеном в малых дозах (0,01% и 0,015%; 3 ч) на прорастающие семена, в определенные временные интервалы развития Получены сотни линий мутантов, поддерживаемые в течение как минимум 10 поколений, внеядерная природа которых была строго доказана гибридологическим анализом. Для их дальнейшего изучения отобраны и в настоящее время продолжают культивироваться несколько десятков наиболее типичных форм, которые включены в генетическую коллекцию НИИ Биологии РГУ (Разорителева и др., 1995, Usatov et al, 2001; Усатов и др., 2004).

Анализ данных литературы (Hagemann, 1982; Hosticka, Hanson, 1984, Davidson et al., 1987; Walters et al.. 1990) и результатов, представленных в данной работе, позволяют сделать вывод, что среди видов высших расюний, у которых были индуцированны внеядерные хлорофильные мутации, наиболее чувствительным к действию НММ является подсолнечник Исходя из этого, можно было предположить, что высокая чувствительность хлороиластов подсолнечника к НММ в основном определяется особенностями объекта, а не воздействующим фактором. Однако, используя такие мощные vyrai ены как ЭИ и ДЭС, были получены только ядерные хлорофильные мутанты. Эффективность НММ, как пластидного мутагена, также была подтверждена на другом виде масличных культур - Brassica junceae (Усатов и др., 2003). Очевидно, что НММ как химический агент обладает свойствами, которые при определенных, контролируемых условиях, обеспечивают ее преимущественное взаимодействие с вне-ядерными генетическими детерминантами.

На уровне химии нуклеиновых кислот молекулярные механизмы возникновения мутаций и их причины, как в ядерном геноме, так и в геномах клеточных органелт. являются общими. Однако, при их реализации на уровне фенотипа, возникают существенные различия. Специфические трудности в выделении цитоплазмагических мутаций обусловлены, в первую очередь, множественностью копий цитоплазматических ДНК, длительной рассортировкой орга-нелл, многоуровневым механизмом их отбооа (Albert et al , 1996). Для проявления цитоплазматической мутации на уровне фенотипа организма необходима серия последовательных событий- сначала должна возникнуть ор;анелла, содержащая только мутантные ДНК, затем клетка, имеющая только мугатные органеллы, затем участок ткани, состоящий только из таких клеток, и, наконец, организм, состоящий из таких тканей. Безусловно, что это более сложный и многоступенчатый процесс, по сравнению с реализацией ятер>и/х Myvvii' "

Специфичность НММ, как пластидного мутагена, проявляется и в ее особенности изменять структуру хлоропластов растений уже в М.. Пестролист-ность, которая возникает у растений, после воздействия НММ, начиная с 3-5 пары листьев, является следствием индуцированной мутационной изменчивости в геноме пластид. То есть рассортировка мутантных и исходных копий ДНК, и соответственно пластид, и клеток, фенотипически проявляется после митотических делений в первом поколении растений после воздействия НММ.

Как правило, за редким исключением, все пестролистные формы, возникшие в М| и успевшие за вегетационный период сформировать жизнеспособные семена, расщепляются в М2 на зеленые и мутантные растения Этот факт свидетельствует о высокой степени вероятности попадания мутантных копий хпДНК в спорогенную ткань, и соответственно в яйцеклетки растений М,. В последующих поколениях М3, М4 и тд. потомство пестролистных форм М! продолжает расщепляться неопределенно долго.

Так, за многие годы исследований нами были проанализированы сотни линий внеядерных пестролистных химер подсолнечника, но ни в одной из них не произошло полной рассортировки мутантных и нормальных (зеленых) пластид. Более того, анализ временной динамики выщепления мутантных растений в потомстве пестролистных форм (табл. 3), позволяет заключить, что расщепление пестролистных химер носит устойчивый, регулярно повторяющийся (для 15 линий уяг, на протяжении более 35 лет) характер, демонстрируя генетическую непрерывность пластид в ряду клеточных поколений Таким образом, после однократной обработки семени мутагеном, мутантные пластиды, сохраняя свою индивидуальность, при прохождении через тысячи делений в соматических клетках и цитоплазматический мейотический отбор, воспроизводятся в последующих поколениях. Это свидетельствует о возможности адаптивного пути цитоплазматической эволюции, основанной на сохранении гетерогенности генетического материала клеточных органелл.

Второй тип жизнеспособных пластидных хлорофильных мутаций -еп:сМоппа - возникает только после мейотического отбора, в результате которого в яйцеклетку попадают исключительно мутантные хпДНК. Подтверждением этому свидетельствует то, что после инцухтирования данный тип мутантов никогда не расщепляется в потомстве. Более того, два мутанта еп.сШоппа были выделены нами после расщепления в потомстве внеядерных пестролистных химер с желто-зеленым фенотипом мутантной ткани.

Для определения природы первичных, связанных с хлорофильными аномалиями, признаков пластомных мутаций у подсолнечника, степени стабильности этих признаков, возможности их усиления, либо ослабления при изменении условий выращивания растений, был изучен ряд структурных и биохимических характеристик мутантных пластид, прослежен характер изменений в составе фотосинтетического аппарата в условиях разной интенсивности света и температуры выращивания растений, усиливающих либо ослабляющих фотодеструк-ционные процессы, активно протекающие в листьях мутантов.

Результаты, полученные в этой серии экспериментов, свидетельствуют о том, что первичные нарушения структуры фотосинтетического аппарата в ли-

стьях мутанта en chlorina-5. так же как и в случае мутанта var 10, связаны с нарушениями в формировании ФС I Таким образом, первичная редукция светимости Хл ФС I является признаком, обидим для всех изученных нами типов пластомных мутантов подсолнечника, полученных с помощью НММ (albina, chlorinä) Как правило, это характерно для частично дифференцированных хло-ропластов (Kusnetsov et al 1996) На основании полученных результатов, можно заключить, что индуцированное мутациями в пластогенах блокирование на ранних стадиях развития организма темперагуро- и светозависимого синтеза белков, контролирующих образование полипептидов ФС 1, явилось причиной необратимого нарушения дифференцировки пластид в листьях мутантов и отмеченной нами редукции свечения комплексов фоюсисгем. В свою очередь, вызванное как мутацией, так и фотодеструкционными процессами нарушение внутренней структуры пластид является сигналом для изменения синтеза кодируемых ядерной ДНК полипептидов ССК (Jarvis 2001), что на более поздних этапах развития мутантных листьев приводит к редукции свечения и этих комплексов, что отчетливо проявилось в случае Myiama vat ¡0, имеющего самые глубокие нарушения фотосинтетического аппарата.

Нарушение структурной организации фотосинтетического аппарата у хлорофильных мутантов вызывает снижение активности темповых стадий фотосинтеза (активность РБФК), редукцию содержания восстановленных Сахаров и усиление катаболических процессов, в результате повышения активности ß-гликозидаз и интенсивной внутриклеточной вакуолизации К таким же последствиям приводит и хлорофильная недостаточность, индуцированная эритромицином, антибиотиком избирательно блокирующим трансляцию полипепшдов на 70 S рибосомах. Очевидно, автолиз, который мы наблюдали в обеих ситуациях, играет роль реконструктивного фактора, i.e при недостатке пластических веществ, клетка поддерживает уровень метаболизма за счет расщепления собственных структурных компонентов и последующего использования продуктов расщепления в качестве строительного и энергетического материала. На биохимическом уровне, усиление автолитических процессов выражается, в частности, в активации различных гидролитических ферментов Эта рефляция может осуществляться двумя способами. Во-первых, активность ß-гликозидаз и, соответственно, скорость катализируемых ими реакций может непосредственно зависеть от концентрации Сахаров в клетке. Во-вторых, можно предположить, что недостаток углеводов в тканях с пониженным уровнем фотосинтеза опосредованно активирует ядерные гены, детерминирующие ß-r ликозидазы. В этом случае индукция синтеза данных ферментов при дефиците продуктов фотосинтеза имеет непосредственное отношение к проблеме пластидпо-ядерных взаимодействий. Механизмы, регулирующие эти взаимодействия на биохимическом уровне, до сих пор мало изучены Многие исследователи склонны рассматривать пластидные факторы как регуляторы экспрессии ядерных генов. Некоторые предполагают белковую природу этих сигналов (Brown et al., 2001). Если эго действительно так, то при блокировании белок-синтезирующей системы пластид, генерируемые ими сигналы будут исчезать В связи с этим интересно отметить, что активность ß-гликозидаз в проростках подсотнечника, выращен-

ных на среде с эритромицином резко возрастает уже при низкой концентрации антибиотика.

Таким образом, результаты данной серии экспериментов показали, что мутации и модификации, которые приводят к нарушениям в работе 70 S рибосом или снижают их число, вызывают повышение активности р-гликозидаз. Аналогичное увеличение а-амилазной активности наблюдали и при подавлении антибиотиками линкомицином и хлорамфениколом функции рибосом в хлоро-пластах проростков гороха (Saed, Duke, 1990). Нарушения аппарата трансляции пластид может приводить к избыточному накоплению синтезированных в цитоплазме субъединиц, предназначенных для сборки олигомеров хлоропластной локализации. Для их быстрого расщепления необходим рост активности ферментов гидролитического комплекса. Поскольку большинство белков растительной клетки являются гликопротеинами, в их гидролизе принимают участие не только протеазы, но и гликозидазы.

В связи с тем, что в результате постоянного расщепления в потомстве внеядерных хлорофильных химер утрачивается большое количество материала, вследствие выщепления летальных форм, ограничивая тем самым возможности изучения качественных и количественных характеристик ревертирования хлорофильных пластидных мутаций, нами была разработана и апробирована новая модель, основанная на возникновении в потомстве пластомных мутантов en:chlorina, после их обработки НММ, фенотипически однородных реверсион-ных мутантов. В качестве объекта сравнения мы использовали такой же фено-типический класс мутаций chlorina, только с ядерным типом наследования

Результаты, полученные на этой модели, четко показали, что возникающие в потомстве мутантов, после воздействия на них НММ. реверсии могут быть как ядерной, так и внеядерной природы, причем внеядерные реверсии возникали ежегодно, в М3 - М7 генерациях. Однако у ядерного мутанта n:chlorina, нам не удалось выделить ни одной внеядерной реверсии. Очевидно, что в данном случае, цитогены не могут супрессировать проявление мутантно-го признака, детерминированного ядерными генами, и тем самым компенсировать хлорофильную недостаточность. В то же время, в потомстве пластомных мутантов en.chlorina (в двух семьях) возникли ядерные мутации, полностью супрессирующие хлорофильные дефекты, детерминированные пластогенами.

Возникшие в потомстве мутантов en.chlorina внеядерные ревертанты были разделены на два четко различающихся фенотипических класса: полные ревертанты (r-en:chlorina), у которых полностью восстанавливались цвет листьев и габитус до показателей исходных зеленых растений 3629 и частичные ревертанты (pr-en. chlorina). у которых восстанавливался только габитус, а содержание хлорофиллов и, соответственно, цвет листьев, оставались на уровне исходных мутантов en.chlorina На основании результатов рестрикционного анализа хпДНК и мтДНК внеядерных ревертантов, полученных в лаб. чл.-корр. НАНБ О.Г. Давыденко ИЦиГ НАН Беларуси (Трибуш идр., 1998, Triboush et al., 1999), мы пришли к выводу, что восстановление содержания хлорофиллов и габитуса растений у полных ревертантов, вызвано мутациями в пластогенах, а частичные реверсии габитуса, при сохранении мутантной окраски листьев у частичных ревертантов, являются следствием митохондриальных мутаций.

В связи с тем, что в данном 7-и летнем эксперименте потомство, обработанных НММ мутантов, мы изучали Сфого по семьям Мь была определена общая частота выщепления внеядерных реверсионных мутантов, а также относительные доли изменчивости геномов пластид и митохондрий Оказалось, что в потомстве практически каждого второго семени пластомных муташов после их обработки НММ, за время 7-и генераций, возникли четко регистрируемые вне-ядерные реверсионные мутанты, причем частота возникновения полных и частичных ревертантов была соизмерима. Более того, эш реверсионные формы стабильно сохраняют свои фенотипы на протяжении уже более 15 лет. Результаты эксперимента свидетельствуют о возможности сохранения значительного объема фенотипически скрытой генетической изменчивости, локализованной в суммарных геномах клеточных органелл (пластидах и митохондриях) растений, несмотря на их ограниченную индивидуальную информационную емкость.

Генетический и морфо-физиологический анализ спонтанных и индуцированных НММ ревертантов подсолнечника позволил прийти к следующим выводам. Во-первых, спонтанное ревертирование пластидных хлорофильных мутаций, происходит крайне редко. Так, за многолетние наблюдения при культивировании нескольких десятков мутантов еп.сЫоппа, реверсии к зеленой окраске возникли только в двух линиях (r-en.chlorina.-3 и г-еп'сЫогта-5). Во-вторых, ревертирование хлорофильных пластидных мутаций может быть реализовано как полное восстановление мутантного фенотипа (истинная реверсия), или частичное - (ядерная, митохондриальная и пластидная супрессии). При этом характер реверсии определяет степень восстановления морфолот ических и физиологических признаков у пластомных мутантов. И, наконец, сохранение повышенной устойчивости к засолению у ядерного ревертанта г-еп.сМоппа-З, характерной для исходного мутанта еп.Могма 3, свидетельствует, что улучшение продуктивных свойств пластидных солеустойчивых мутантов возможно путем получения у них реверсий к зеленой окраске, в результате ядерной супрессии пластомных хлорофильных мутаций.

Еще одним затруднением, возникающим при изучении внеядерных мутаций у высших растений, является их фенотипическое однообразие. Как правило, исследователи в этой области изучают дефекты фотосинтеза (песгролист-ность), устойчивость к антибиотикам и цитоплазматическую мужскую стерильность (Давыденко, 2001). Сложившаяся ситуация связана с методическими трудностями регистрации таких мутаций.

В своей работе мы предприняли попытку на основе НММ-мутагенеза выделить на селективной среде, в течение нескольких генераций, солерезистеш-ные формы, которые могут служить исходным материалом для дальнейшей селекции. В результате этого, полученные формы у подсолнечника и горчицы, стабильно сохраняющие в поколениях повышенную устойчивость к хлоридно-му засолению, по сравнению с исходными растениями свидетельствуют о принципиальной возможности с помощью НММ получать формы высших растений, не отягощенных хлорофильными дефектами, с повышенной устойчивостью к стрессовым факторам.

Одним из наиботее фундаментальных свойств биологических систем является избыточность соподчиненных структурных единиц, как необходимая предпосылка их устойчивости. Это свойство живой материи особенно наглядно проявляется в структурной организации генетических систем клеточных орга-нелл высших организмов, представленных в виде многочисленных копий (десятки тысяч на клетку) их геномов. Такой тип организации, отобранный в ходе филогенеза, является основой сохранения гомеостаза генетических программ органелл и, соответственно, самих энергетических органелл - пластид и митохондрий. Однако, эта устойчивость не абсолютна. Воздействием НММ на высшие растения мы можем нарушать эту устойчивость, индуцируя с высокой частотой внеядерные хлорофильные мутации. Установленный нами факт неопределенно долгого наследования (многолетние расщепления в потомстве вне-ядерных пестролистных химер) летальных мутаций пластогенов, при особых контролируемых условиях, свидетельствует о биологическом гомеостазе, направленном на поддержание определенной генетической изменчивости органелл, несмотря на доминантную роль ядра в процессах формообразования и функционирования биологических структур.

ВЫВОДЫ

1 Методологически обоснован и методически оптимизирован способ получения внеядерных хлорофильных мутаций у подсолнечника с помощью НММ. Установлено, что обработка семян мутагеном, при концентрациях 0,01% и 0,15%, с экспозицией 0-24 ч, индуцирует пластомные мутации только в интервале 9-18 ч с максимальным эффектом, приходящимся на 12-15 ч.

2. Специфичность действия НММ на пластиды растений подтверждена сравнительным анализом природы хлорофильных мутаций у подсолнечника, индуцированных НММ. ЭИ, ДЭС. Показано, что из трех алкилирующих мутагенов, только НММ индуцирует пластидные мутации. Используя ЭИ и ДЭС. были выделены ядерные хлорофильные мутанты.

3. После воздействия НММ выделены внеядерные хлорофильные мутанты двух фенотипических классов - пестролистные химеры (variegated) и желто-зеленые формы (chlorina). Гибридологическим, биохимическим и ультра-труктурным анализом установлено, что индуцированные хлорофильные мутации удовлетворяют критериям пластидной наследственности: однороди-тельское (материнское) наследование мутантных признаков, постоянное соматическое расщепление, дефекты строения и функции хлоропластов, наличие гетеропластидных клеток, различия в структуре ДНК нормальных и мутантных пластид.

4 Показано, что в пластидах мутантов var-Ю и en-chlorina-5 регистрируются все типы пигмент-белковых комплексов фотосинтетического аппарата, характерные для зеленых растений инбредной линии 3629, с измененным соотношением и редуцированным количеством. Первичным признаком дефицита Хл на уровне организации фотосинтетического аппарата является снижение светимости комплексов ФС I, последующее разрушение комплексов

ФС II, а затем по мере усиления фотодеструкционных процессов и ССК, что отчетливо проявилось у мутанта уаг-10, имеющего наиболее выраженную хлорофильную недостаточность. Нарушение структуры фотосинтегического аппарата сопровождается снижением активности РБФК, редукцией пула восстановленных Сахаров и активацией Р-гликозидаз.

5. Разработана и апробирована модель реализации цитоплазматических мутаций, основанная на анализе внеядерных ревертантных форм в потомстве пластомных мутантов еп сЫоппа подсолнечника, на протяжении 7-и генераций после действия на них НММ. Установлено, что все внеядерные реверси-онные мутанты принадлежат к двум фенотипическим классам - полные ре-вертанты (г-сЫоппа) и частичные ревертанты (рг-сЫоппа), у которых восстанавливается только габитус, а цвет листьев и, соответственно, содержание хлорофиллов не отличаются от исходных мутантов Моппа. Показано, что после однократной обработки мутагеном семянок мутантов еп.сМоппа, как полные, так и частичные ревертанты возникали ежегодно в течение М3 -М7 поколений, в соизмеримых соотношениях с обшей частотой около 50%, определенной по количеству семей

6. Ревертирование пластидных мутаций подсолнечника может происходить различными путями, приводя к полному восстановлению мутантного фенотипа (истинная реверсия) или частичному - (ядерная, митохондриальная и пластидная супрессии) При этом характер реверсии определяет степень восстановления морфологических и физиологических признаков у пластомных мутантов еп.сМоппа.

7. Летальные мутации пластогенов, индуцированные НММ, приводящие в процессе роста и развития пестролистных растений к активации катаболши-ческих реакций в пластидах и, в конечном итоге, к автолизу клеток мутант-ной ткани пестролистных химер, могут быть смоделированы действием на зеленые растения исходной линии эпигенетическою фактора (антибиотика-эритромицина, избирательно блокирующего трансляцию полипетидов на 70 5 органельных рибосомах;.

8. Специфичность НММ, как пластидного мутагена, подтверждена на районированном в Ростовской области сорте горчицы Донская-5. После обработки семян растворами НММ (0,01% - 0,03%) выделены и включены в коллекцию 22 линии пестролистных химер, с установленным гибридологическим анализом внеядерным типом наследования мутантных фенотипов. Ядерные мутации псМоппа были выделены в единичных случаях при использовании НММ в концентрациях 0,02% и 0,03%.

с>. Разработан и апробирован метод получения солеустойчивых форм высших растений, основанный на индуцированном НММ мутагенезе и отборе на провокационном фоне с высокой концентрацией хлоридов (1,7% №С1) в течение нескольких генераций. Выделенные формы у подсолнечника и горчицы, при хлоридном засолении в условиях вегетационного опыта, показали повышенную продуктивность, по сравнению с исходными растениями, стабильно сохраняя этот признак в биологических поколениях.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Таран С.Ф., Усатов A.B. Выяснение первичного эффекта пластидной мутации подсолнечника // Сб. трудов IV Всесоюзной межуниверситетской конференции по «Биологии клетки». - Тбилиси - 1985. - Т. 2. - С. 684-685.

2 Усатов A.B. Активность рибулозо-1,5-бифосфат карбоксилазы у пластидно-го мутанта подсолнечника и полученных на его основе гибридов // Тезисы докл. V съезда ВОГиС им. Н И. Вавилова. - Москва. - 1987. - Т. 3. - С. 156.

3. Усатов A.B., Разорителева Е.К., Таран С.Ф. Изменение нормы реакции пла-стомного мутанта подсолнечника и гибрида, полученного на его основе, в зависимости от условий выращивания Ч Сб. трудов V Всесоюзной межуниверситетской конференции по «Биологии клетки». - Тбилиси. 1987. - Т. 2. -С. 1005-1006.

4. Усатов A.B., Таран С Ф., Дмитриев В.В., Белецкий Ю.Д. Динамика включения 3Н-тимидина в пластидную и ядерную ДНК зародышей на начальных этапах проращивания семянок подсолнечника // Цитология. - 1990. - Т. 32. -№3.-С. 298-300.

5 Белецкий Ю Д , Усатов A.B., Разорителева Е.К. Частота индуцированной N-нитрозо-М-метилмочевиной внеядерной пестролистности у подсолнечника в зависимости от уровня репликации пластидной ДНК // Доклады Академии Наук СССР, - 1990.-Т. 313. -№ 3.-С. 716-718.

6 Усатов A.B., Таран С.Ф , Прихоженко Э.Я. Сравнительный рестрикционный анализ ДНК хлоропластов у пластомных хлорофильных мутантов подсолнечника // Тезисы докладов VI съезда ВОГиС им. Н.И. Вавилова. - Минск, 1992.-С. 217.

7 Усатов A.B., Таран С Ф., Прихоженко Э.Я. Способ получения и ультраструктурная характеристика пластомных мутантов подсолнечника // Материалы всесоюзного совещания «Химический мутагенез и проблемы экологии».-Москва, 1992.-С. 171-173.

8. Усатов A.B. Эффективность пластидного мутагенеза, индуцированной N-нитрозо-М-метилмочевиной, в зависимости от возраста проростков подсолнечника в момент обработки // Труды I съезда ВОГиС - 1994. - Генетика. -Т. 30.-С. 162.

9 Усатов A.B., Таран С.Ф., Гуськов Е.П. Зависимость пластидного мутагенеза, индуцированного М-нитрозо-1Ч-метилмочевиной, от возраста прорастающих семянок подсолнечника в момент обработки // Генетика. - 1995. - Т. 31. -№2. - С. 222 - 227.

10. Разорителева Е.К., Таран С.Ф., Усатов A.B. Генетическая коллекция пластомных мутантов подсолнечника И В сб. «Генетические коллекции растений. Выпуск 3» под ред. С.Ф. Коваля - Новосибирск. - 1995. - С. 197-216.

] 1 Таран С.Ф , Усатов А В Биохимическая характеристика пластомных мутантов подсолнечника, индуцированных М-нитрозо-Ы-мегил мочевиной // Там же.-С. 217-228

12.Трибуш CO., Даниленко П.Г., Давыденко О.Г., Разорителева Е.К., Таран С.Ф., Усатов A.B. Хлоропластные мутанты «chlorina» у подсолнечника: из-

менена ли ДНК митохондрий9 // Сб. трудов между народной конференции «Молекулярно-генегические маркеры растений» Киев - 1996. - С. 84-85.

13 Трибуш С О , Даниленко Н Г.. Давыденко О.Г., Разорителева Е К., Таран С Ф , Усатов AB Рестрикционный анали5 ДНК хлоропластов и митохондрий внеядерных мутантов подсотнечника // Материалы междун. конференции «Актуальные проблемы с/х биотехнологии». Москва. - 1996 С. 36.

14 Машкина Е В , Усатов А В. Маркин Н.В Влияние теплового шока на Myia-генный эффект нитроюметилмочеаины // Труды II сьеада ВОГиС. Санкт-Петербург, 2000 -Т. 1. - С.219-220.

15 Гуськов Е.П., Маркин Н.В., Усатов A.B., Машкина ЕВ. Модификация действия нирозометилмочевины на проростки подсолнечника тепловым шоком // Генетика. - 2001. - Т 37. - № 3. - С. 336 - 343.

16 Маркин Н.В., Усатов A.B. Чувствительность к тепловому шоку ядерною и пластомного мутантов подсолнечника // Сб трудов международного симпозиума «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования». - Москва. - 2001. - Т. 1. - С. 347.

17 Markin N.V., Mashkina E.V., Usatov A V., Guskov E.P. Biochemical characters of sunflower chlorophyll mutants '/ Proc. Int. Conf. "Genetic collections, isogenenic and alloplasmic lines". - Novosibirsk. - 2001.- P 82-84.

18 Usatov A.V, Razoriteleva E.K., Kolokolova N.S , Taran S F Genetic collection of sunflower chlorophyll mutant Helianthus annum ll Proc. Int. Conf. "Genetic collections, isogenenic and alloplasmic lines".-Novosibirsk. - 2001. P. 108-111

19 Усатов А.В , Машкина ЕВ, Маклецова МГ, Маркин Н.В. Модификация мутагенного действия нитрозометилмочевины чесночным нутрицевтиком алисат II Материалы конференции «Свободные радикалы, антиоксиданты и болезни человека». Смоленск. - 2001. - С. 342-34?

20 Машкина Е.В., Маркин Н.В., Усатов А В., Г'уськоь Ь.11. Реакция мутантных линий подсолнечника на тепловой шок // Физиотогия растений - 2001. -Т.48. -№6. -С. 906-910

21 Усатов A.B., Машкина Е.В., Маркин Н.К., Гуськов Е.П Мутагенный эффект нитрозометилмочевины, модифицированный тепловым шоком на ранних этапах развития проростков подсолнечника // Генетика - 2001. - Т 37. -№12.-С. 1650-1656.

22 Машкина Е.В., Усатов A.B., Гуськов Е.П. Дейсшие тепловою стресса на хлорофильные мугачты подсолнечника (Helianthus annuus) П VIII съезд генетиков и селекционеров Республики Беларусь Материалы международной конференции «Генетика и селекция в XXI веке» Минск.-2002. С 113-114

23 Усатов А В , Федоренко Г М , Машкина F. В Солеустойчивые формы юрчи-цы Brassica jiinceae, индуцированные ^нитрозо^-метилмочевиной // Там же.-С 168-169.

24 Рассадина В.В , Дудко Ю С., Аверина Н Г, Усаюв А В. Сесчозависимость проявления дефицита хлорофилла в пластомном мутанте подсолнечника Helianthus annuus Var-10 II Там же С. 279-281.

25 Рассадина В.В , Дудко Ю.С , Усатов A.B., Аверина Н Г. Функциональное состояние системы биосинтеза хлорофилла в плас томных мутантах подсол-

нечника (Helianthus annuus) типа chlorina II Материалы международной конференции «Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем». - Минск. - 2002,- С. 36.

26 Усатов A.B., Разорителева Е.К., Федоренко Г.М. Специфичность мутагенного действия Ы-нитрозо-Ы-метилмочевины на пластом подсолнечника Helianthus annuus Н Известия высших учебных заведений. Северо - Кавказ-кий регион. Естественные науки. - 2002. - № 4. - С. 64-67.

27. Усатов A.B., Разорителева Е.К., Федоренко Г.М. Совмещение мутантных пластид с мутантными хлорофильными ядерными генами у подсолнечника Helianthus annuus II Там же. - 2003. - № 2. - С. 67-68.

28.Усатов A.B., Кеслер P.M., Колоколова Н.С., Машкина Е.В. Влияние пла-стидных мутаций и эритромицина на активность ß-гликозидаз у подсолнечника Helianthus annuus II Там же. - 2003. - № 3. - С. 70-74.

29. Рассадина В.В., Дудко Ю.С., Усатов A.B., Аверина Н.Г. Влияние пластомной мутации en-chlorina-5 на состояние фотосинтетического аппарата хлоропла-стов подсолнечника (Helianthus annuus) II V съезд общества физиологов растений России. Материалы международной конференции «Физиология растений - основа фотобиотехнологии». - Пенза. - 2003. - С. 68-69.

30.Машкина Е.В., Усатов A.B., Колоколова Н.С. Влияние прямой и обратной пластомной мутации на чувствительность проростков подсолнечника к окислительному стрессу // Там же. - С. 301-302.

31 Машкина Е.В., Усатов A.B., Прокофьев В.Н. Действие теплового стресса на антиоксидантный статус клеток проростков ядерного и пластомного мутантов подсолнечника Helianthus annuus II Там же. - С. 302-303.

32. Усатов A.B., Прихоженко Э.Я., Таран С.Ф. Ультраструкт\ра хлоропластов подсолнечника Helianthus annuus как показатель галорезистентности растений // Там же. - С. 344-345.

33.Усатов A.B., Федоренко Г.М., Машкина Е.В. Биохимический и ультраструктурный анализ галорезистентных форм горчицы Brassica junceae // Там же. -С. 345-346.

34.Усатов A.B., Разорителева Е.К., Федоренко Г.М., Щербакова Л.Б., Машкина Е.В. Хлорофильные мутанты горчицы Brassica junceae, индуцированные N-нитрозо-1Ч-метилмочевиной // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказкий регион. Естественные науки. - 2003. - № 4. - С. 63-66.

35.Усатов A.B., Машкина Е.В., Колоколова Н.С. Развитие генетических исследований хлорофильных мутантов подсолнечника в НИИ Биологии РГУ // В сб. «Генетика и селекция растений на Дону. Выпуск 3» под ред. В.Г. Карта-мышева. - Ростов н/Д: Изд-во «Акра». - 2003. - С. 277-283.

36.Машкина Е.В., Усатов A.B. Пластидный мутагенез у подсолнечника, индуцированный нитрозометилмочевиной // Там же. - С. 284-289.

37.Разорителева Е.К., Усатов A.B., Машкина Е.В. Галорезистентные формы подсолнечника, индуцированные М-нитрозо-М-метилмочевиной // Известия высших учебных заведений. Северо-Кавказкий регион. Естественные науки. -2004. -№ 1.-С. 67-69.

38 Усатов A.B., Разорителева Е.К., Машкина Е.В , Улитчева И.И. Спонтанные и

индуцированные нитрозометилмочевиной реверсии плас томных хлорофиль-ных мутантов подсолнечника Helianthus annuus П Генетика. - 2004. - Т 40. -№2. - С. 248-255

39 Усатов A.B., Рассадина В.В., Аверина Н.Г., Лежнева Л.А., Дудко Ю.С., Машкина Е.В., Прихоженко Э.Я., Колоколова Н С. Структурно - функциональные особенности мутантных пластид внеядерных пестролистных форм подсолнечника // Физиология растений. - 2004. - Т. 51. - № 2. - С. 175-183.

40 Федоренко Г".М , Усатов А В., Машкина Е В, Щербакова Л.Б Солеустойчи-вые формы горчицы Brassica junceae, индуцированные N-нитрозо-М-метилмочевиной // Экологический вестник научных центров Черноморского экономического содружества. - 2004. - № 2. - С. 14-21.

41 Рассадина В В , Усатов A.B., Аверина Н.Г. Структурно-функциональная организация хлоропластов в растениях подсолнечника мутант ной линии en-chlorina-5 // Материалы международной конференции «Клеточные ядра и пластиды растений: биохимия и биотехнология». - Минск, 2004. - С. 36-41.

42. Машкина Е.В., Усатов A.B., Даниленко В.А., Дмитрученко О.Г Влияние внеядерных мутаций подсолнечника на устойчивость растений к экстремальным факторам // III съезд ВОГИС. Материалы международной конференции «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития». - Москва - 2004 - Т. 1 - С. 228

43 Усатов А В., Машкина Е.К., Гуськов Е.П Мутагенное действие нитрозометилмочевины на проростки подсолнечника и окислительный стресс // Там же. - Т. 2. - С. 477.

44. Усатов A.B., Машкина Е.В., Даниленко В.А., Колоколова Н.С. Влияние внеядерных мутаций подсолнечника на устойчивость растений к экстремальным факторам внешней среды // Известия высших учебных заведений Северо-Кавказкий регион. Естественные науки. - 2004. - № 4. - С. 69-72.

45 Усаюв А.В , Федоренко I М., Щербакова Л.Ь , Машкина Е.В. Ультраструктура хлоропластов горчицы Brassica junceae как показатель галорезистеит-ности//Цитология. - 2004 -№12.

46. Усатов A.B., Машкина EJ3., Гуськов Е.П. Влияние окислительного стресса . на мутагенез у подсолнечника Helianthus annuus L., индуцированный нитрозометилмочевиной И Генетика. - 2005, Т. 41. - №1.

Список использованных сокращений:

НММ - 1Ч-нитрозо-Ы-метилмочевина;

ЭИ - этиленимин,

ДЭС - диэт илсульфат;

Хл - хлорофилл;

Хп ДНК - хлоропластная ДНК;

Мт ДНК - митохондриальная ДНК;

ФС I - фотосистема I;

ФС II - фотосистема II;

ССК - светособирающий комплекс.

РНБ Русский фонд

2006i4 4711

Издательство ООО «ЦВВР». Лицензия ЛР № 65-36 от 05.08.99 I Подл в печать 7.11.04 г. Зак. №717. Тир. 100 экз. Усл.Печ.л. 2,75. Типография- Издательско-полиграфический комплекс «Биос» РГУ. 344091, г Ростов-на-Дону, ул.Зорге, 28/2, корп. 5 «В», тел 929-516, 659-532. Лицензия на полиграфическую деятельность № 65-125 от 09.02.98 г.

0 3

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Усатов, Александр Вячеславович

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Особенности наследования генетических детерминант пластид и митохондрий у высших растений

1.2. Генетическая система пластид

1.3. Пластомные мутанты как генетические модели

1.4. Структурно-функциональная организация митохондриального генома расте

1.5. Митохондриальные мутации у высших растений

1.6. Реверсии цитоплазматических мутаций у растений

1.7. Индукция пластидных мутаций химическими мутагенами

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Объекты исследований

2.2. Обработка семян подсолнечника и горчицы растворами НММ

2.3. Полевые исследования

2.4. Вегетационные опыты

2.5. Выделение ДНК из хлоропластов и митохондрий

2.5.1. Выделение хлоропластов из свежего растительного материала

2.5.2. Выделение митохондрий из свежего растительного материала

2.5.3. Выделение и очистка хлоропластной и митохондриальной ДНК

2.6. Обработка ДНК ферментами рестрикции и фракционирование ДНК методом электрофореза в агарозном геле

2.7. Электронно-микроскопические методы

2.7.1. Исследование ультраструктуры пластид

2.7.2. Приготовление пленки-подложки

2.7.3. Исследование хлоропластной ДНК

2.8. Исследование фотосинтетического аппарата хлорофильных мутантов

2.8.1. Выращивание растений

2.8.2. Определение содержания пигментов

2.8.3. Регистрация спектров флуоресценции (СФ) и поглощения in vivo

2.8.4. Определение характеристик флуоресценции хлорофилла в интактных листьях

2.8.5. Определение содержания реакционных центров ФС I (Р700) в тилакоид-ных мембранах хлоропластов

2.9. Аналитическое ультрацентрифугирование 70 S и 80 S рибосом

2.10. Определение удельной активности РБФК

2.11. Определение содержания редуцирующих Сахаров

2.12. Определение удельной активности /5-гликозидаз

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Индукция хлорофильных мутаций у подсолнечника и горчицы с помощью

3.1.1. Зависимость индуцированного НММ мутагенеза пластид от времени прорастания семян подсолнечника в момент обработки мутагеном

3.1.2. Фенотип растений Mi и ультраструктура пластид после воздействия НММ

3.1.3. Анализ пластидной природы внеядерных хлорофильных мутаций, индуцированных НММ

3.1.3.1. Пестролистные формы

3.1.3.2. Мутанты chlorina

3.1.4. Специфичность мутагенного действия НММ на пластом подсолнечника

3.1.5. Мутагенез у горчицы, индуцированный НММ

3.2. Реверсии пластидных хлорофильных мутаций у подсолнечника

3.2.1. Особенности ревертирования пластомных мутантов en:chlorina

3.2.2. Типы реверсий пластидных хлорофильных мутаций

3.3. Структурно-функциональные особенности мутантных пластид подсолнеч

3.3.1. Формирование фотосинтетического аппарата в мутантных пластидах пестролистной формы var

3.3.2. Структура фотосинтетического аппарата у растений мутантной линии en:chlorina

3.3.3. Содержание 70 S рибосом и активность РБФК в мутантной ткани пестролистных растений

3.3.4. Содержание редуцирующих Сахаров и активность /?-гликозидаз в плас-тидных хлорофильных мутантах

3.3.5. Моделирование эритромицином хлорофильных дефектов у подсолнечника

3.4. Солеустойчивые формы подсолнечника и горчицы, полученные с помощью НММ

3.4.1. Получение солеустойчивых форм подсолнечника, с помощью НММ

3.4.2. Солеустойчивые формы горчицы, индуцированные НММ 172 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ 182 Выводы 191 Список литературы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Внеядерные хлорофильные мутации высших растений, индуцированные N-нитрозо-N-метилмочевиной, и особенности их наследования"

Нехромосомная наследственность, как одна из ветвей генетики, была открыта при изучении наследования спонтанных хлорофильных мутаций у высших растений (Baur, 1909; Correns, 1909). Открытие ДНК в хлоропластах в начале 60-х годов, явилось стимулом к экспериментальным исследованиям пластид как относительно автономных генетических систем растительной клетки, и поставило вопрос о роли пластома в процессах регуляции развития и жизнедеятельности растительных организмов. ДНК пластид, на долю которой приходится всего несколько процентов всей клеточной ДНК, участвует в реализации жизненно важных функций растений. Геном пластид кодирует около половины белков, участвующих в фотосинтезе, а также ряд компонентов органелльной белок-синтезирующей системы (Одинцова, Юрина, 2003). С ним связаны многие хозяйственно ценные признаки растений, такие как общая продуктивность, устойчивость к неблагоприятным факторам внешней среды, некоторым антибиотикам, гербицидам, грибным патогенам.

Мутанты для генетиков всегда представляли прекрасную модель для изучения проблемы «ген-признак». В этом плане не составляют исключение и пластид-ные хлорофильные мутации. Однако их ценность возрастает в связи с тем, что биогенез и функционирование хлоропластов, их фотосинтетическая активность находятся под двойным ядерно-органелльным контролем. Поэтому генетический анализ таких наследственных изменений дает возможность выявлять, не только структурные компоненты органелл, детерминированные пластомом, но и закономерности пластидно-ядерных взаимоотношений. Именно благодаря изучению пластидных мутантов удалось локализовать целую группу цитогенов, определяющих некоторые реакции фотосинтеза: 6 генов ФС I, 13 генов, кодирующих белки полипептидного комплекса ФС II, 11 генов комплекса цитохром b/f, АТФ-синтазы и белков стромы хлоропластов (Rochaix, 1997). Кроме того, нельзя недооценивать роль пластидных мутаций в генетике устойчивости растений к абиотическим факторам. В настоящее время приходит признание цитоплазматической изменчивости, как значимого дополнительного фактора в эволюции и селекции растительных организмов.

Как правило, в естественных условиях, мутации в пластидной ДНК возникают с частотой не выше 0,02 - 0,06% (Hagemann, 1971; 1979). Поэтому увеличение ассортимента пластидных мутаций с помощью индуцированного мутагенеза, существенно ускоряет решение многих проблем, относящихся не только к генетике пластид, но и к некоторым разделам биохимии, физиологии растений и селекции.

Долгое время четких и воспроизводимых способов получения мутаций пластид у высших растений не существовало, несмотря на неоднократные попытки, предпринимавшиеся в этом направлении (Белецкий, 1989). Для искусственного получения внеядерных мутантов высших растений были исследованы различные химические мутагены. Однако по причине низкой эффективности и отсутствия специфичности от большинства из них пришлось довольно быстро отказаться (Дани-ленко, Давыденко, 2003). В 1969г. Ю.Д. Белецким и Е.К. Разорителевой впервые была доказана возможность индукции мутаций пластид у подсолнечника при помощи >1-нитрозо-]Ч-метилмочевины (НММ) (Белецкий и др., 1969; Разорителева и др., 1970а; 19706). На базе этих пионерских работ в НИИ биологии РГУ было положено начало всестороннему исследованию НММ-мутагенеза пластид высших растений, в которых непосредственное участие принимал автор настоящей работы. Результат многолетних исследований в данной области оформился в виде уникальной коллекции внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника и горчицы (Разорителева и др., 1995; Usatov et al., 2001; Усатов и др., 2003; Усатов и др., 2004). Получение и исследование этих мутантных форм стало содержанием настоящей работы.

Цель и задачи исследования. Целью работы является оптимизация метода эффективного получения внеядерных хлорофильных мутантов у высших растений при использовании НММ; выявление закономерностей индукции и фенотипиче-ского выражения пластидных мутаций, а также способов модификации этих процессов; изучение возможности и особенностей ревертирования пластидных мутаций; анализ состояния системы биосинтеза хлорофилла, особенности биогенеза и функционирования фотосинтетического аппарата, оценка активности ряда гидролитических ферментов у мутантов; создание на основе НММ-мутагенеза соле-устойчивых форм с/х культур.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- определить эффективность НММ как индуктора пластидных мутаций в зависимости от концентрации и времени действия мутагена на прорастающие семена подсолнечника;

- исследовать частоту и спектр внеядерных хлорофильных мутаций после обработки семян подсолнечника НММ и особенности их наследования;

- отобрать и поддерживать в поколениях, генетические линии, индуцированных пластомных мутантов;

- выявить особенности ревертирования и характерные типы реверсий вне-ядерных хлорофильных мутаций en-chlorina;

- оценить норму реакции хлорофилл-дефицитности у внеядерных пестролистных форм и мутантов en:chlorina подсолнечника в зависимости от условий выращивания растений;

- изучить структурные изменения фотосинтетического аппарата у внеядерных пестролистных форм и мутантов en:chlorina подсолнечника;

- определить содержание редуцирующих Сахаров и активность Р-гликозидаз у пестролистных форм и мутантов en:chlorina подсолнечника;

- оптимизировать метод получения солеустойчивых форм подсолнечника и горчицы с помощью НММ-мутагенеза.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. Воздействия НММ индуцирует появление у подсолнечника и горчицы хлорофильных мутантов двух типов - пестролистные химеры (variegated) и желто-зеленые формы (en: chlorina), с внеядерным типом наследования мутантных фенотипов. Выявлены специфические различия в реципрокных скрещиваниях с исходной формой, постоянное, на протяжении нескольких десятилетий, соматическое расщепление, дефекты структуры и функции мутантных пластид, наличие гетеро-пластидных клеток, изменения в структуре пластидной ДНК, что свидетельствует о пластомной природе индуцированных мутаций.

2. В потомстве пластомных мутантов en: chlorina реверсии к исходной форме возникают спонтанно в единичных случаях. Индуцированные НММ внеядерные реверсии возникают в потомстве мутантов en: chlorina на протяжении как минимум

7-ми генераций с частотой около 50%, по количеству семей в Mj. Ревертирование пластидных мутаций реализуется различными механизмами, приводя, либо к полному восстановлению мутантного фенотипа (истиная реверсия), или частичному -(ядерная, митохондриальная и пластидная супрессии).

3. Первичным проявлением дефицита хлорофилла у мутантов на уровне организации фотосинтетического аппарата является прогрессирующая редукция комплексов ФС I, а затем, по мере усиления с возрастом растений фотодеструкционных процессов, разрушение комплексов ФС II и ССК.

4. Нарушения структурной организации фотосинтетического аппарата у хлоро-фильных мутантов сопровождаются снижением активности темновых стадий фотосинтеза, редукцией содержания восстановленных Сахаров и усилением катаболи-ческих процессов, а именно многократным повышением активности р-гликозидаз и интенсивной внутриклеточной вакуолизацией.

5. Индуцированный НММ мутагенез высших растений использован в практике для получения солеустойчивых форм подсолнечника и горчицы.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Усатов, Александр Вячеславович

191 Выводы

1. Методологически обоснован и методически оптимизирован способ получения внеядерных хлорофильных мутаций у подсолнечника с помощью НММ. Установлено, что обработка семян мутагеном, при концентрациях 0,01% и 0,15%, с экспозицией 0-24 ч, индуцирует пластомные мутации только в интервале 9-18 ч с максимальным эффектом, приходящимся на 12-15 ч.

2. Специфичность действия НММ на пластиды растений подтверждена сравнительным анализом природы хлорофильных мутаций у подсолнечника, индуцированных НММ, ЭИ, ДЭС. Показано, что из трех алкилирующих мутагенов, только НММ индуцирует пластидные мутации. Используя ЭИ и ДЭС, были выделены ядерные хлорофильные мутанты.

3. После воздействия НММ были выделены внеядерные хлорофильные мутанты двух фенотипических классов - пестролистные химеры (variegated) и желто-зеленые формы (chlorina). Гибридологическим, биохимическим и ультратрук-турным анализом установлено, что индуцированные хлорофильные мутации удовлетворяют критериям пластидной наследственности: однородительское (материнское) наследование мутантных признаков, постоянное соматическое расщепление, дефекты строения и функции хлоропластов, наличие гетеропла-стидных клеток, различия в структуре ДНК нормальных и мутантных пластид.

4. Показано, что в пластидах мутантов var-10 и en-chlorina-5 регистрируются все типы пигмент-белковых комплексов фотосинтетического аппарата, характерные для зеленых растений инбредной линии 3629, с измененным соотношением и редуцированным количеством. Первичным признаком дефицита Хл на уровне организации фотосинтетического аппарата является снижение светимости комплексов ФС I, последующее разрушение комплексов ФС II, а затем по мере усиления фотодеструкционных процессов и ССК, что отчетливо проявилось у мутанта var-10, имеющего наиболее выраженную хлорофильную недостаточность. Нарушение структуры фотосинтетического аппарата сопровождается снижением активности РБФК, редукцией пула восстановленных Сахаров и активацией р-гликозидаз.

5. Разработана и апробирована модель реализации цитоплазматических мутаций, основанная на анализе внеядерных ревертантных форм в потомстве пластомных мутантов en:chlorina подсолнечника, на протяжении 7-и генераций после действия на них НММ. Установлено, что все внеядерные реверсионные мутанты принадлежат к двум фенотипическим классам - полные ревертанты (r-chlorina) и частичные ревертанты (pr-chlorina), у которых восстанавливается только габитус, а цвет листьев и, соответственно, содержание хлорофиллов не отличаются от исходных мутантов chlorina. Показано, что после однократной обработки мутагеном семянок мутантов en:chlorina, как полные, так и частичные ревертанты возникали ежегодно в течение М3 — М7 поколений, в соизмеримых соотношениях с общей частотой около 50%, определенной по количеству семей Mj.

6. Ревертирование пластидных мутаций подсолнечника может происходить различными путями, приводя к полному восстановлению мутантного фенотипа (истинная реверсия) или частичному - (ядерная, митохондриальная и пластид-ная супрессии). При этом характер реверсии определяет степень восстановления морфологических и физиологических признаков у пластомных мутантов en:chlorina.

7. Летальные мутации пластогенов, индуцированные НММ, приводящие в процессе роста и развития пестролистных растений к активации катаболитических реакций в пластидах и, в конечном итоге, к автолизу клеток мутантной ткани пестролистных химер, могут быть смоделированы действием на зеленые растения исходной линии эпигенетического фактора (антибиотика - эритромицина, избирательно блокирующего трансляцию полипетидов на 70 S органельных рибосомах).

8. Специфичность НММ, как пластидного мутагена, подтверждена на районированном в Ростовской области сорте горчицы Донская-5. После обработки семян растворами НММ (0,01% - 0,03%) выделены и включены в коллекцию 22 линии пестролистных химер, с установленным гибридологическим анализом внеядер-ным типом наследования мутантных фенотипов. Ядерные мутации n:chlorina были выделены в единичных случаях при использовании НММ в концентрациях 0,02% и 0,03%.

Разработан и апробирован метод получения солеустойчивых форм высших растений, основанный на индуцированном НММ мутагенезе и отборе на провокационном фоне с высокой концентрацией хлоридов (1,7% NaCl) в течение нескольких генераций. Выделенные формы у подсолнечника и горчицы, при хлоридном засолении в условиях вегетационного опыта, показали повышенную продуктивность, по сравнению с исходными растениями, стабильно сохраняя этот признак в биологических поколениях.

194

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Экспериментальные данные, изложенные в данной работе, вносят вклад в один из наименее разработанных разделов генетики - нехромосомной наследственности высших растений. В результате многолетних исследований мутагенеза подсолнечника, индуцированного НММ, были выявлены закономерности эффективной индукции пластидных хлорофильных мутаций, при воздействии мутагеном в малых дозах (0,01% и 0,015%; 3 ч) на прорастающие семена, в определенные временные интервалы развития (раздел 3.1.1). Получены сотни линий мутантов, внеядерная природа которых была строго доказана гибридологическим анализом. Для их дальнейшего изучения отобраны и в настоящее время продолжают культивироваться несколько десятков наиболее типичных внеядерных мутантных форм, которые включены в генетическую коллекцию НИИ Биологии РГУ (Разорителева и др., 1995; Usatov et al., 2001; Усатов и др., 2003; Усатов и др., 2004).

Анализ данных литературы (Hagemann, 1982; Hosticka, Hanson, 1984; Davidson et al., 1987; Walters et al., 1990) и результатов, представленных в данной работе, позволяют сделать вывод, что среди видов высших растений, у которых были ин-дуцированны внеядерные хлорофильные мутации, наиболее чувствительным к действию НММ является подсолнечник. Высокая чувствительность хлоропластов подсолнечника к НММ в основном определяется особенностями объекта, а не воздействующим фактором, так как используя такие мощные мутагены как ЭИ и ДЭС, были получены только ядерные хлорофильные мутанты (раздел 3.1.4). Эффективность НММ, как пластидного мутагена, была подтверждена на другом виде масличных культур - Brassica junceae (раздел 3.1.5). Очевидно, что НММ как химический агент обладает свойствами, которые при определенных, контролируемых условиях, как показано в разделе 3.1, обеспечивают ее преимущественное взаимодействие с внеядерными генетическими детерминантами.

На уровне химии нуклеиновых кислот молекулярные механизмы возникновения мутаций и их причины, как в ядерном геноме, так и в геномах клеточных органелл, являются общими. Однако, при их реализации на уровне фенотипа, возникают существенные различия. Специфические трудности в выделении цитоплазма-тических мутаций обусловлены, в первую очередь, множественностью копий цитоплазматических ДНК, длительной рассортировкой органелл, многоуровневым механизмом их отбора (Albert et al., 1996). Для проявления цитоплазматической мутации на уровне фенотипа организма необходима серия последовательных событий: сначала должна возникнуть органелла, содержащая только мутантные ДНК, затем клетка, имеющая только мутантные органеллы, затем участок ткани, состоящий только из таких клеток, и, наконец, организм, состоящий из таких тканей. Безусловно, что это более сложный и многоступенчатый процесс, по сравнению с реализацией моногенных ядерных мутаций. Очевидно, по этой причине индукция пластидных мутаций у водорослей, зачастую имеющих один - два хроматофора, не вызывала особых затруднений (Сэджер, 1975; Wurtz et al., 1979).

Специфичность НММ, как пластидного мутагена, проявляется и в ее особенности изменять структуру хлоропластов растений уже в Mj. Пестролистность, которая возникает у растений, после воздействия НММ, начиная с 3-5 пары листьев, является следствием индуцированной мутационной изменчивости пластидной ДНК (раздел 3.1.2). Т.е. рассортировка мутантных и исходных копий ДНК, и соответственно пластид, и клеток, фенотипически проявляется после митотических делений в первом поколении растений после воздействия НММ.

Как правило, за редким исключением, все пестролистные формы, возникшие в Mj и успевшие за вегетационный период сформировать жизнеспособные семена, расщепляются в М2 на зеленые и мутантные растения. Этот факт свидетельствует о высокой степени вероятности попадания мутантных копий хпДНК в спорогенную ткань, и соответственно в яйцеклетки растений В последующих поколениях М3, М} и т.д. потомство пестролистных форм Mi продолжает расщепляться неопределенно долго.

Так, за многие годы исследований нами были проанализированы сотни линий внеядерных пестролистных химер подсолнечника, но ни в одной из них не произошло полной рассортировки мутантных и нормальных (зеленых) пластид. Более того, анализ временной динамики выщепления мутантных растений в потомстве пестролистных форм (табл. 3.4), позволяет заключить, что расщепление пестролистных химер носит устойчивый, регулярно повторяющийся (для 15 линий var, на протяжении более 20 лет) характер, демонстрируя генетическую непрерывность пластид в ряду клеточных поколений. Таким образом, после однократной обработки семени мутагеном, мутантные пластиды, сохраняя свою индивидуальность, при прохождении через тысячи делений в соматических клетках и цитоплазматический мейотический отбор, воспроизводятся в последующих поколениях. Это свидетельствует о возможности адаптивного пути цитоплазматической эволюции, основанной на сохранении гетерогенности генетического материала клеточных органелл.

Второй тип жизнеспособных пластидных хлорофильных мутаций -en:chlorina - вероятно возникает только после мейотического отбора, в результате которого в яйцеклетку попадают исключительно мутантные хпДНК (раздел 3.1.3.2). Подтверждением этому свидетельствует то, что после инцухтирования данный тип мутантов никогда не расщепляется в потомстве. Более того, два мутанта en:chlorina были выделены нами после расщепления в потомстве внеядерных пестролистных химер с желто-зеленым фенотипом мутантной ткани. Скорее всего, исходные и мутантные копии хпДНК с этим фенотипичеким жизнеспособным классом мутаций расщепляются на уровне органелл и клеток растений Мь аналогично летальным мутациям в хпДНК пестролистных форм. Однако, незначительное снижение содержания хлорофиллов в мутантной ткани и, соответственно, изменения цвета листьев, затрудняет визуализацию четкой цветовой секториальности листьев растений Mt.

Для определения природы первичных, связанных с хлорофильными аномалиями, признаков пластомных мутаций у подсолнечника, степени стабильности этих, признаков, возможности их усиления, либо ослабления при изменении условий выращивания растений, был изучен ряд структурных и биохимических характеристик мутантных пластид, прослежен характер изменений в составе фотосинтетического аппарата в условиях разной интенсивности света и температуры выращивания растений, усиливающих либо ослабляющих фотодеструкционные процессы, активно протекающие в листьях мутантов.

Результаты, полученные в этой серии экспериментов, свидетельствуют о том, что первичные нарушения структуры фотосинтетического аппарата в листьях мутанта en:chlorina-5 (раздел 3.5.2), так же как и в случае мутанта var 10 (раздел 3.5.1), связаны с нарушениями в формировании ФС1. Таким образом, первичная редукция светимости хлорофиллов ФС 1 является признаком, общим для всех изученных нами типов пластомных мутантов подсолнечника, полученных с помощью

НММ (albina, chlorina). Как правило, это характерно для частично дифференцированных хлоропластов (Kusnetsov et al. 1996). На основании полученных результатов (раздел 3.3), можно заключить, что индуцированное мутациями в пластогенах блокирование на ранних стадиях развития организма температуре- и светозависи-мого синтеза белков, контролирующих образование полипептидов ФС 1, явилось причиной необратимого нарушения дифференцировки пластид в листьях мутантов и отмеченной нами редукции свечения комплексов фотосистем. В свою очередь, вызванное как мутацией, так и фотодеструкционными процессами нарушение внутренней структуры пластид является сигналом для изменения синтеза кодируемых ядерной ДНК полипептидов ССК (Jarvis 2001), что на более поздних этапах развития мутантных листьев приводит к редукции свечения и этих комплексов, что отчетливо проявилось в случае мутанта var 10, имеющего самые глубокие нарушения фотосинтетического аппарата.

Нарушение структурной организации фотосинтетического аппарата у хлорофильных мутантов вызывает снижение активности темновых стадий фотосинтеза (активность РБФК), редукцию содержания восстановленных Сахаров и усиление катаболических процессов, в результате повышения активности Р-гликозидаз и интенсивной внутриклеточной вакуолизации (разделы 3.3.3; 3.3.4). К таким же последствиям приводит и хлорофильная недостаточность, индуцированная эритромицином, антибиотиком избирательно блокирующим трансляцию полипептидов на 70 S рибосомах (раздел 3.3.5). Очевидно, автолиз, который мы наблюдали в этих двух случаях, играет роль реконструктивного фактора, т.е. при недостатке пластических веществ, клетка поддерживает уровень метаболизма за счет расщепления собственных структурных компонентов и последующего использования продуктов расщепления в качестве строительного и энергетического материала, что можно рассматривать как апоптоз внутриклеточных систем, либо некротический апоптоз (Скулачев, 1999). На биохимическом уровне, усиление автолитических процессов выражается, в частности, в активации различных гидролитических ферментов. Водорастворимые и мембранносвязанные формы Р-гликозидаз, утилизируя разнообразные соединения углеводной природы участвуют в накоплении необходимого для жизнедеятельности клетки пула простых Сахаров. В свою очередь моносахара регулируют активность р-гликозидаз. Эта регуляция может осуществляться двумя способами. Во-первых, активность р-гликозидаз и, соответственно, скорость катализируемых ими реакций может непосредственно зависеть от концентрации Сахаров в клетке. Во-вторых, можно предположить, что недостаток углеводов в тканях с пониженным уровнем фотосинтеза опосредованно активирует ядерные гены, детерминирующие р-гликозидазы. В этом случае индукция синтеза данных ферментов при дефиците продуктов фотосинтеза имеет непосредственное отношение к проблеме пластидно-ядерных взаимодействий. Механизмы, регулирующие эти взаимодействия на биохимическом уровне, до сих пор мало изучены. Многие исследователи склонны рассматривать пластидные факторы как регуляторы экспрессии ядерных генов. Некоторые предполагают белковую природу этих сигналов (Brown et al., 2001). Если это действительно так, то при блокировании белок-синтезирующей системы пластид, генерируемые ими сигналы будут исчезать. В связи с этим интересно отметить, что активность Р-гликозидаз в проростках подсолнечника, выращенных на среде с эритромицином резко возрастает уже при низкой концентрации антибиотика.

Таким образом, результаты данной серии экспериментов показали, что мутации и модификации, которые приводят к нарушениям в работе 70 S рибосом или снижают их число, вызывают повышение активности р-гликозидаз. Аналогичное увеличение а-амилазной активности наблюдали и при подавлении антибиотиками линкомицином и хлорамфениколом функции рибосом в хлоропластах проростков гороха (Saed, Duke, 1990). Нарушения аппарата трансляции пластид может приводить к избыточному накоплению синтезированных в цитоплазме субъединиц, предназначенных для сборки олигомеров хлоропластной локализации. Для их быстрого расщепления необходим рост активности ферментов гидролитического комплекса. Поскольку большинство белков растительной клетки являются глико-протеинами, в их гидролизе принимают участие не только протеазы, но и гликози-дазы.

В связи с тем, что в результате постоянного расщепления в потомстве вне-ядерных хлорофильных химер утрачивается большое количество материала, вследствие выщепления летальных форм, ограничивая тем самым возможности изучения качественных и количественных характеристик ревертирования холрофильных пластидных мутаций, нами была разработана и апробирована новая модель, основанная на выщеплении в потомстве пластомных мутантов en:chlorina, после их обработки НММ, фенотипически однородных реверсионных мутантов. В качестве объекта сравнения мы использовали такой же фенотипический класс мутаций chlorina, только с ядерным типом наследования.

Результаты, полученные на этой модели, четко показали, что возникающие в потомстве мутантов, после воздействия на них НММ, реверсии могут быть как ядерной, так и внеядерной природы, причем внеядерные реверсии возникали ежегодно, в М3 - М7 генерациях (раздел 3.2.1). Однако у ядерного мутанта n:chlorina, нам не удалось выделить ни одной внеядерной реверсии. Очевидно, что в данном случае, цитогены не могут супрессировать проявление мутантного признака, детерминированного ядерными генами, и тем самым компенсировать хлорофильную недостаточность. В то же время, в потомстве пластомных мутантов en:chlorina (в двух семьях) возникли ядерные мутации, полностью супрессирующие хлорофильные дефекты, детерминированные пластогенами (раздел 3.2.2).

Возникшие в потомстве мутантов en:chlorina внеядерные ревертанты были разделены на два четко различающихся фенотипических класса: полные ревертанты (r-en:chlorina), у которых полностью восстанавливались цвет листьев и габитус до показателей исходных зеленых растений 3629 и частичные ревертанты (рг-en:chlorina), у которых восстанавливался только габитус, а содержание хлорофиллов и, соответственно, цвет листьев, оставались на уровне исходных мутантов en:chlorina. На основании результатов рестрикционного анализа хпДНК и мтДНК внеядерных ревертантов, полученных в лаб. О.Г. Давыденко ИЦиГ НАН Беларуси (Трибуш идр., 1998; Triboush et al., 1999), мы пришли к выводу, что восстановление содержания хлорофиллов и габитуса растений у полных ревертантов (r-en:chlorina), вызвано мутациями в пластогенах, а частичные реверсии габитуса, при сохранении мутантной окраски листьев у (pr-en:chlorina), являются следствием митохондри-альных мутаций.

В связи с тем, что в данном 7-ми летнем эксперименте потомство, обработанных НММ мутантов, мы изучали строго по семьям Мь была определена общая частота выщепления внеядерных реверсионных мутантов, а также относительные доли изменчивости геномов пластид и митохондрий. Оказалось, что в потомстве практически каждого второго семени пластомных мутантов после их обработки

НММ, за 7 генераций, возникли четко регистрируемые внеядерные реверсионные мутанты, причем частота возникновения полных и частичных ревертантов была соизмерима. Более того, эти реверсионные формы стабильно сохраняют свои фенотипы на протяжении уже более 15 лет. Результаты данного эксперимента свидетельствуют о возможности сохранения значительного объема фенотипически скрытой генетической изменчивости, локализованной в суммарных геномах клеточных органелл (пластидах и митохондриях) растений, несмотря на их ограниченную индивидуальную информационную емкость.

Генетический и морфо-физиологический анализ спонтанных и индуцированных НММ ревертантов подсолнечника позволил прийти к следующим выводам.

Во-первых, спонтанное ревертирование пластидных хлорофильных мутаций, происходит крайне редко. Так, за многолетние наблюдения при культивировании нескольких десятков мутантов emchlorina, реверсии к зеленой окраске возникли только в двух линиях {r-en:chlorina-3 и r-en:chlorina-5).

Во-вторых, ревертирование хлорофильных пластидных мутаций может быть реализовано как полное восстановление мутантного фенотипа (истинная реверсия), или частичное - (ядерная, митохондриальная и пластидная супрессии). При этом характер реверсии определяет степень восстановления морфологических и физиологических признаков у пластомных мутантов.

И, наконец, сохранение повышенной устойчивости к засолению у ядерного ревертанта r-en:chlorina-3, характерной для исходного мутанта en:chlorina-3, свидетельствует, что улучшение продуктивных свойств пластидных солеустойчивых мутантов возможно путем получения у них реверсий к зеленой окраске, путем ядерной супрессии пластомных хлорофильных мутаций.

Еще одним затруднением, возникающим при изучении внеядерных мутаций у высших растений, является их фенотипическое однообразие. Как правило, исследователи в этой области изучают дефекты фотосинтеза (пестролистность), устойчивость к антибиотикам и цитоплазматическую мужскую стерильность (Давыденко, 2001). Сложившаяся ситуация связана с методическими трудностями регистрации таких мутаций. В своей работе мы предприняли попытку на основе НММ-мутагенеза выделить на селективной среде солерезистентные формы, которые могут служить исходным материалом для дальнейшей селекции.

Основанием для этого направления исследований явились два отправных факта. На протяжении ряда лет культивирования внеядерных хлорофильных мутантов подсолнечника мы обнаружили, что растения некоторых генетических линий обладают повышенным потенциалом адаптивности к различным внешним воздействиям, в том числе и к почвенному засолению (раздел 3.3.2). Так как хлорофильные мутанты являются малопродуктивными формами с уменьшенным габитусом, что делает их непосредственное использование в практике нецелесообразным, особый интерес представляет получение при помощи НММ галорезистентных форм, не отягощенных хлорофильными дефектами.

Известно, что солеустойчивость растений — это комплексная система адаптации полигенной природы. Однако сложные фенотипические признаки, обладающие адаптивной ценностью, определяются не единичными генами, а их сочетаниями, причем в большинстве случаев очень сложными. Подобные комбинации генов, вовлекающие различные аллели, действуют коадаптивно и согласованно. При этом вклад каждого единичного гена, в сложных генотипах, как например, у высших растений, относительно невелик. Может быть, по этой причине в конце 80-х годов генетики и селекционеры утратили доверие к «могуществу» химического мутагенеза, не способного «уплотнив» время, отпущенное для спонтанного мутационного процесса, смоделировать процесс органической эволюции и ответить практически на все вопросы, стоящие перед эволюционной теорией и селекцией.

Следует различать галотолерангность, как качественный филогенетический признак (градиент содержания солей, в которых организм развивается и функционирует без существенных перестроек метаболизма) и галорезистентность, как количественный индивидуальный признак (свойства индивидуумов проходить стадии онтогенеза на границе нормы реакции). Ядерный геном на основе общих регуля-торных систем обеспечивает галотолерангность. То есть в процессе филогенеза отбираются генетически стабильные формы, с определенными границами солеустой-чивости. Галорезистентность - это онтогенетическая граница реакции организма на экстремальный фактор, определяемая состоянием цитоплазмона (в первую очередь энергетических органелл - пластид и митохондрий), ответственного за метаболизм. Таким образом, с помощью НММ, как эффективного индуктора внеядерных мутаций, мы можем изменить границы галорезистентности как индивидуального количественного признака, при этом сохранив тот же геном и качественные характеристики исходного сорта.

Исходя из данной концепции, были изучены результаты воздействия различных режимов обработки НММ семян инбредной линии 3629 подсолнечника для наиболее эффективного получения галорезистентпых форм (раздел 3.6.1). В результате последующего отбора прорастающих семян на провокационном фоне с высокой концентрацией хлоридов (1,7 % раствор NaCl), в течение нескольких лет, отобраны 7 таких форм, стабильно сохраняющих в последующих поколениях повышенную устойчивость, по сравнению с исходными линейными растениями, к хлоридному засолению. Апробация метода на районированном в Ростовской области сорте горчицы Донская-5 также дала положительный результат (раздел 3.6.2). Таким образом, показана принципиальная возможность с помощью НММ получать формы высших растений, не отягощенных хлорофильными дефектами, с повышенной устойчивостью к стрессовым факторам.

Одним из наиболее фундаментальных свойств биологических систем является избыточность соподчиненных структурных единиц, как необходимая предпосылка их устойчивости. Это свойство живой материи особенно наглядно проявляется в структурной организации генетических систем клеточных органелл высших организмов, представленных в виде многочисленных копий (десятки тысяч на клетку) их геномов. Такой тип организации, отобранный в ходе филогенеза, является основой сохранения гомеостаза генетических программ органелл и, соответственно, самих энергетических органелл - пластид и митохондрий. Однако, эта устойчивость не абсолютна. Воздействием НММ на высшие растения мы можем нарушать эту устойчивость, индуцируя с высокой частотой внеядерные хлорофиль-ные мутации. Установленный нами факт, неопределенно долгого наследования (многолетние расщепления в потомстве внеядерных пестролистных химер) летальных мутаций пластогенов, при особых контролируемых условиях, свидетельствует о биологическом гомеостазе, направленном на поддержание определенной генетической изменчивости органелл, несмотря на доминантную роль ядра в процессах формообразования и функционирования биологических структур.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Усатов, Александр Вячеславович, Ростов-на-Дону

1. Арасимович В.В. Методы определения Сахаров // Методы биохимического исследования растения - М.: Колос. - 1971. - С. 141.

2. Ауэрбах Ш. Проблемы мутагенеза. М.: Мир. - 1978. - 463 с.

3. Бабурина O.K., Шевякова Н.И. Влияние экзогенного глицинбетаина на рост и метаболизм люцерны в условиях засоления // Физиология растений.- 1988. -Т. 35.-С. 1177-1182.

4. Бабурина O.K., Шевякова Н.И. Бетаины как доноры метальных групп в побегах люцерны при засолении // Физиология растений.- 1995. -Т. 42. С. 862-870.

5. Бейли Н. Статистические методы в биологии. М.: Мир. - 1973. - 271с.

6. Белецкий Ю.Д. Искусственные мутации хлоропластов у высших растений. Ростов н/Д: РГУ. - 1989. - 80 с.

7. Белецкий Ю.Д., Разорителева Е.К. Взаимодействие ядра и пластома у подсолнечника. Сообщение III. Подавление чужеродным ядром фенотипического выражения пластидной мутации // Генетика. 1988. - Т. 24. - С. 885-888.

8. Белецкий Ю.Д., Разорителева Е.К. Жданов Ю.А. Цитоплазматические мутации подсолнечника, индуцированные действием Ы-нитрозо-М-метилмочевины // Доклады АН СССР.-1969.-Т. 166.-С. 1425-1426.

9. Белецкий Ю.Д., Разорителева Е.К., Кульпина А.И. Мутационный процесс, индуцированный Ы-нитрозо-М-метилмочевиной, у подсолнечника // Цитология и генетика. 1969. - Т. 3. - С. 421-425.

10. Ю.Белецкий Ю.Д., Федоренко Г.М., Разорителева Е.К., Степанова Л.Б. Реверсия у пластомного мутанта подсолнечника типа chlorina II Цитология и генетика. — 1981.-Т. 15.-С. 34-37.

11. П.Белецкий Ю.Д., Щербакова Л.Б., Федоренко Г.М. Влияние N-Hmp030-N-метилмочевины на ультраструктуру пластид подсолнечника Mi // Цитология и генетика.-1981.-Т. 15.-С. 3-6.

12. Браше Е. Биохимическая эмбриология. М.: Мир. — 1961. - 280с.

13. Гаврилова В.А., Анисимова И.Н. Подсолнечник. СПб.: ВИР. - 2003. - 209с.

14. Гершенович З.С., Кричевская А.А., Лукаш А.И. и др. Мочевина в живых организмах. Ростов н/Д: РГУ. - 1979. - 82с.

15. Голоенко И.М., Давыденко О.Г., Шимкевич A.M. Нарушение расщеплений маркерных ядерных генов у алло- и изоплазматических линий ячменя // Генетика -2002. Т. 38. - С.791-795.

16. Горбачева JI.B. Кукушкина Г.В. Механизм действия противоопухолевых соединений из класса N-замещенных питрозомочевин // Эксперим. онкология. 1981. -Т. 3,-С. 21-28.

17. Гуриелидзе К.Г., Пасешниченко В.А., Васильева И.С. Локализация олигофуро-станозидов и расщепляющей их специфической р-глюкозидазыв листьях Dio-scorea deltoidea II Физиол. растений. 1986. - Т. 33. — С. 1144-1151.

18. Гуськов Е.П., Маркин Н.В., Усатов А.В., Машкина Е.В. Модификация действия нирозометилмочевины на проростки подсолнечника тепловым шоком // Генетика. 2001. - Т. 37. - С. 336 - 343.

19. Давыденко О.Г. Нехромосомные мутации. Минск: Наука и техника. — 1984. -164с.

20. Давыденко О.Г. Нехромосомная наследственность. Минск: БГУ. - 2001. - 188с.

21. Даниленко И.И. Роль липидов в мутагенной активности нитрозоалкилмочевин // Генетика. 1982.-Т. 18.-С. 1067-1074.

22. Даниленко Н.Г. РНК-эдитинг: генетическая информация корректируется после транскрипции // Генетика. 2001. - Т. 37. - С. 294-316.

23. Даниленко Н.Г., Давыденко О.Г. Миры геномов органелл. Минск: Тэхналопя. -2003.-494с.

24. Дин Р. Процессы распада в клетке. М.: Мир. - 1981. - 120с.

25. Доманский В.П., Самойленко А.Г., Лис П.И. Автоматизированная флуоресцентная установка с управлением от микроЭВМ // Весщ АН БССР. Сер б1ял на-вук.- 1986.-С. 100-103.

26. Зосимович В.П., Андрощук А.Ф. Изменчивость ячменя, индуцированная химическими мутагенами // Мутационная селекция. М.: Наука. — 1968. - С. 47-52.

27. Колотенков П.В., Зоз Н.Н., Макарова С.И. Экспериментальные мутации гороха // Супермутагены. М.: Наука. - 1966. - С. 135-140.

28. Лавлес А. Генетические эффекты алкилирующих соединений. М.: Наука. -1970.- 255с.

29. Ладыгин В.Г. Структурно-функциональная организация фотосистем в хлоро-пластах Chlamydomonas reinhardtii II Физиол. растений. — 1998. Т. 45. - С. 741762.

30. Манниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М: Мир.-1984.-385 с.

31. Машкина Е.В., Усатов А.В. Пластидный мутагенез у подсолнечника, индуцированный нитрозометилмочевиной / Генетика и селекция растений на Дону. Вып. 3. под ред. Картамышева В.Г. Ростов н/Д: АКРА. - 2003. - С. 284-289.

32. Нейфах А.А., Тимофеева М.Я. Молекулярная биология процессов развития. -М.: Наука.-1977.-312с.

33. Николов Н.Н., Хубавенска Н.Б., Велев Ч.К. Роль NO-группы в проявлении высокого мутагенного эффекта М-нитрозо-М-метилмочевин у Scenedesmus acutus Н Генетика. 1978. - Т. 14. - С. 673-677.

34. Одинцова М.С. Геном хлоропластов: организация и экспрессия // Итоги науки и техники ВИНИТИ. 1987. - Т. 6. - С. 1-114.

35. Одинцова М.С., Юрина Н.П. Геном высших растений и водорослей: структура и функции // Мол. Биолог. 2003. - Т. 37. - С. 768- 783.

36. Орлов П.А. Взаимодействие ядерных и цитоплазматических генов в детерминации развития растений. Минск: Наука и техника. - 2001. - 170с.

37. Палилова А.Н., Люлькина Е.И., Давыденко О.Г. Генетический эффект акридиновых красителей в отношении ультраструктуры хлоропластов // ДАН БССР. -1972.-Т. 16.-С. 763-766.

38. Пахомова В.П. Основные положения современной теории стресса и неспецифический адаптационный синдром у растений // Цитология. 1995. - Т. 37.-С. 66-91.

39. Прихоженко Э.Я., Белецкий Ю.Д. Электронно-микроско-пическое изучение структуры пластид у некоторых пластомных пестролистных мутантов подсолнечника // Цитология и генетика. 1979. - Т. 13. - С. 467-470.

40. Разорителева Е.К., Белецкий Ю.Д., Жданов Ю.А. Генетическая природа мутаций подсолнечника, индуцированных N-нитрозо-метилмочевиной. Сообщение I. Пестролистные формы // Генетика. 1970 а. - Т. 6, № 8. - С.102-107.

41. Разорителева Е.К., Белецкий Ю.Д., Жданов Ю.А. Генетическая природа мутаций подсолнечника, индуцированных N-нитрозо-метилмочевиной. Сообщение II. Мутации chlorina. II Генетика. 1970 а. - Т.6, № 10 - С.43-44.

42. Разорителева Е.К., Таран С.Ф., Усатов А.В. Генетическая коллекция пластомных мутантов подсолнечника // Генетические коллекции растений. Выпуск 3. Под ред. Коваля С.Ф. Новосибирск: ЦиГ СО РАН. - 1995. - С. 197-216.

43. Рапопорт И.А. Наследственные изменения, происходящие под влиянием ди-этилсульфата и диметилсульфата // Докл. ВАСХНИИЛ. 1947. - Т. 12. - С. 1215.

44. Рапопорт И.А. Действие окиси этилена, глицида и гликолей на генные мутации // ДАН СССР. 1948. - Т. 247. - С. 469-472.

45. Рапопорт И.А. Взаимодействие этиленимина с генными белками и наследственные изменения // Бюлл. Моск. об-ва испытат. природы. 1962. - Т. 67. - N 1. - С. 96-114.

46. Рапопорт И.А. Преодоление универсального мутационного барьера с мутациями х-хромосомы выше 100% // ДАН СССР. 1963. - Т. 148. - С. 696-699.

47. Рапопорт И.А. Особенности и механизм действия супермутагенов // Супермутагены. М.: Наука. 1966. - С. 9-12.

48. Рапопорт И.А. Открытие химического мутагенеза. Избранные труды. — М.: Наука. 1993. - 304с.

49. Рассадина В.В., Лежнева Л.А., Яронская Е.Б., Таран С.Ф., Аверина Н.Г. Биогенез фотосинтетического аппарата и активность процесса биосинтеза хлорофиллав пластомном мутанте подсолнечника // Физиол. растений. 2001. — Т. 48. - С. 177-184.

50. Романова А.К., Веденина И.Я., Доман Н.Г. Карбоксилирование рибулозбифос-фата в бесклеточных препаратах водородных бактерий // Известия АН СССР. — 1980.-Т. 19.-№7.-с. 214-215.

51. Рыжков B.JI. Пластиды как мутирующие единицы // Докл. АН СССР. 1965. - Т. 162.-С.1177-1180.

52. Савин В.Н. Изменение частоты индуцированных мутаций у ячменя при различной длительности намачивания семян перед воздействиями мутагенами // Экс-пер. мутагенез в селекции. 1972. - С. 412-422.

53. Сальникова Т.В., Зоз Н.Н. Пестролистность у гексаплоидной пшеницы, индуцированная химическими мутагенами // Бюллетень МОИП. 1965. — Т. 4. - С. 145147.

54. Самсонова И.А. Исследование мутабильности пластома. Сообщение I. Характеристика пластомного мутанта томата // Генетика 1970. - Т 6. - № 6. — С. 36-42.

55. Самсонова И.А., Бетхер Ф. Исследование мутабильности пластома. Сообщение1.. Обратные мутации у пластомного мутанта томата Pl-alb 1 // Генетика. 1972. -Т. 8.-№7.-С. 21-30.

56. Самсонова И.А., Бетхер Ф. Исследование мутабильности пластома. Сообщение

57. I. Частота спонтанных обратных мутаций у пластомного мутанта томата Pl-alb 1 // Генетика 1973. - Т. 9. - № 5. - С. 44-51.

58. Самсонова И.А., Бетхер Ф. Исследование мутабильности пластома. Сообщение1.. Влияние рентгеновых лучей, этилметансульфоната на частоту обратных мутаций у пластомного мутанта томата Pl-alb 1 // Генетика. 1976. — Т. 12. - №1. — С. 41-46.

59. Самсонова И.А., Бетхер Ф. Исследование мутабильности пластома. Сообщение VI. Влияние акридиновых соединений на частоту обратных мутаций у пластомного мутанта томата Pl-alb 1 // Генетика. 1978. - Т. 14. - №11.- С. 1928-1934.

60. Сарычев Ю.Ф. Экспериментальный мутагенез у табака // Генетика. 1967. — Т. III.-С. 16-26.

61. Сахаров В.В. Специфичность действия мутационных факторов // Биолог, журнал. 1938. - Т. 7. - С. 595-618.

62. Серебряный A.M. К механизму мутагенного действия N-HHTp030-N-метилмочевины // Молек. механизмы генет. процессов. М.: Наука. - 1972. - С. 135-138.

63. Серебряный A.M., Андриевский Г. Механизм повреждения генетических детерминант этиленимином и его производными // Современные теории хим. мутагенеза. Таллин: АН ЭССР. - 1987. - С. 114-127.

64. Серебряный A.M., Рандалу К.Х.А. Карбамоилирование оснований в ДНК нит-розо-метилмочевиной // Биоорган, химия. 1977. - Т. 3. - С. 633-638.

65. Серебрянный A.M., Сальникова E.JL, Бахитова J1.M. и др. Специфичность мутагенного действия М-нитрозо-К-метилмочевины и связь ее мутагенной активности с карбамоилирующими свойствами // Генетика. 1988. — Т. 24. - С. 17861793.

66. Сидоров Б.Н., Соколов Н.Н., Андреев B.C. Высокоактивные вторичные мутагены, алкилирующие мутагены // Генетика. 1966. - № 7. С. 125-130.

67. Силаева A.M. Структура хлоропластов и факторы среды. Киев. 1978. - 203с.

68. Скулачев В.П. Феноптоз: запрограмированная смерть организма // Биохимия. -1999.-Т. 64.-№12.-С. 1679-1688.

69. Строгонов Б.П. Физиологические основы солеустойчивости растений при разнокачественном засолении. М.: Наука. - 1962. - 366с.

70. Струнников В.А. Природа гетерозиса и новые методы его повышения. М.: Наука. - 1994. - 108с.

71. Сыркин А.Б., Гобачева Л.Б. Биохимические механизмы действия N-алкил-М-нитрозомочевин. Возможные причины лекарственной устойчивости к этим соединениям // Эксперим. и клинич. фармокол. 1996. - Т. 59. - № 2. - С. 69-75.

72. Сэджер Р. Цитоплазматические гены и органеллы.- М.: Мир. 1975,- 424с.

73. Таран С.Ф., Усатов А.В. Биохимическая характеристика пластомных мутантов подсолнечника, индуцированных К-нитрозо-Ы-метилмочевиной // Генетические коллекции растений. Выпуск 3. Под ред. Коваля С.Ф. Новосибирск: ЦиГ СО РАН. - 1995.-С. 217-228.

74. Тарасенков И.И., Долгих С.Т. Спектр мутаций у гороха и томатов, полученный в М2 под действием химических мутагенов // Специфичность химического мутагенеза. М.: Наука. 1968. - С. 238-249.

75. Тарасов В.А. Молекулярные механизмы репарации и мутагенеза. М.: Наука. -1982.-226с.

76. Темпер Э.А. Мутационная изменчивость Scenedesmus obliquus, индуцированная N-нитрозометилмочевиной // Генетика. 1971. - Т. 7. - С. 42-45.

77. Трибуш С.О., Даниленко Н.Г., Маврищева Е.Б. и др. Индуцированные реверсии пластомных мутантов Helianthus annuus: полиморфизм ДНК и ультраструктура органелл // С/х биология. Материалы межд. научн.-практ. Конф. Горки. - 1998. -С. 161-165.

78. Удовенко Г.В. Диагностика устойчивости растений к стрессовым воздействиям. Л.:ВИР. 1988.-227 с.

79. Улитчева И.И. Комбинированное воздействие некоторых химических мутагенов на ядерные хлорофильные мутанты подсолнечника // Генетика. 1982. - Т. 18 — С. 817-823.

80. Уоддингтон К. Морфогенез и генетика. М.: Мир. - 1964. - 260с.

81. Усатов А.В., Разорителева Е.К., Машкина Е.В., Улитчева И.И. Спонтанные и индуцированные нитрозометилмочевиной реверсии пластомных хлорофильных мутантов подсолнечника Helianthus annuus II Генетика. 2004. - Т. 40. - С. 248255.

82. Усатов А.В., Рассадина В.В., Аверина Н.Г. и др. Структурно-функциональные особенности мутантных пластид внеядерных пестролистных форм подсолнечника // Физиология растений. 2004. - Т. 53 - С. 175-183.

83. Усатов А.В., Таран С.Ф., Гуськов Е.П. Зависимость пластидного мутагенеза, индуцированного 1Ч-нитрозо-К-метилмочевиной, от возраста прорастающих семянок подсолнечника в момент обработки // Генетика. 1995. - Т. 31. - С. 222 — 227.

84. Усатов А.В., Таран С.Ф., Дмитриев В.В., Белецкий Ю.Д. Динамика включения 3Н-тимидина в пластидную и ядерную ДНК зародышей на начальных этапах проращивания семянок подсолнечника // Цитология. — 1990. Т. 32. - С. 298-300.

85. Федоренко Г.М., Владимирский Б.М. Система анализа ультраструктуры клеток растительных и животных организмов. // Перспективные информационные технологии в анализе изображений. 1992. - Ташкент. - С. 22-25.

86. Фрадкин Л.И. Структурная локализация биосинтеза хлорофилла // Биогенез пигментного аппарата фотосинтеза. Под ред. Волотовского И.Д. - Минск: Наука и техника.-1988.-С. 164-191.

87. Фрей-Висслинг А., Мюлеталер К. Ультраструктура растительной клетки. М.: Мир. 1968.-С. 338-339.

88. Хо Ф.Т. Действие N-нитрозометилмочевины на возникновение нестабильных пигментных мутантов хламидомонады и хлореллы // Генетика. -1971. Т. 7. — С. 134-136.

89. Хохлов С.С. Апомиксис: классификация и распространение у покрытосеменных // Успехи соврем, генетики. М.: Наука. 1967. - Т. 1. — С. 43-105.

90. Хропова В.И. Нестабильные пигментные мутанты хлореллы, индуцированные 1Ч-нитрозо-1Ч-метилмочевиной // Хим. мутагенез и созд. селекц. материала,. -М.:Наука. 1972. - С. 140-147.

91. Худолей В.В. Канцерогены: характеристики, закономерности, механизмы действия. СПб.: НИИ Химии СПбГУ. - 1999. - 419с.

92. Шевцов В.И. Получение мутаций у овса // Генетика. 1969. - Т. 5. - № 2. — С. 511.

93. Шевякова Н.И. Солеустойчивость пластомных хлорофильных мутантов подсолнечника // Физиол. растений. 1982. - Т. 30. — С. 317-324.

94. Щербакова Jl.Б., Белецкий Ю.Д. Федоренко Г.М. Влияние водного дефицита на ультраструктуру пластид пластомного мутанта подсолнечника типа chlorina // Цитология и генетика. 1988. - Т. 22. - № 3. - С. 53-54.

95. Шлык А.А. Определение хлорофиллов и каротиноидов в экстрактах зеленых растений // Биохимические методы в физиологии растений. Под ред. Павлиновой О.А. М.: Наука. - 1971. - С. 154-170.

96. Юрина Н.П., Одинцова М.С. Сравнительная характеристика структурной организации геномов хлоропластов и митохондрий растений // Генетика. 1998. -Т. 34.-С. 5-22.

97. Эльконин Л.А., Тырнов B.C. Генетический контроль цитоплазматической мужской стерильности растений: состояние проблемы и современные подходы для ее исследования. // Генетика. 2000. -Т. 36. - С. 437-450.

98. Яковлева И.А. Реверсия к исходному фенотипу и ее частота у мутантов томатов wilty dwarf при воздействии различными мутагенными факторами // Генетика. 1988. - Т. 24. - С. 282-291.

99. Albert В., Godelle В., Atlan A., De Раере et al. Dynamics of plant mitochondrial genome: model of a three selection process // Genetics. 1996. - Vol. 144. — P. 369382.

100. Allison L., Simon L., Maliga P. Deletion of rpoB reveals a second dinstinct transcription system in plastids of higher plants // EMBO J. — 1996. Vol. 15. — P. 2802-2809.

101. Backert S., Lurz R. and Borner T. Electron microscopic investigation of mitochondrial DNA from Chenopodium album II Curr.Genet. -1996. Vol. 29. - P.427-436.

102. Backert S., Meibner K., Borner T. Unique features of the mitochondria rolling cir-cle-plasmid mpl from the higher plant Chenopodium album (L) И Nucleic Acids Res. -1997.-Vol. 25.-P. 582-589.

103. Barker G., Ribber M. Distribution of ribosomes in dormant and imbibed of Pisum arvense electron microscopes observations // J. Biochem. - 1967. - Vol. 105. — P. 1201-1204.

104. Baumgatner В., Rapp J., Mullet J. Plastid genes encoding transcription/translation apparatus are differentially transcribed early in barley (Hordeum vulgare) chloroplast // Plant Physiol. 1993. - Vol. 101. - P. 781-791.

105. Baur E. Das Wessen und die Erblichkeitsverhaltnisse der "Varietates albomargina-tae hort" von Pelargonium zonale И Z. Indukt. Abstamm. Und Vererbungsl. 1909. -B. l.-S. 330-351.

106. Bendich A. Why do chloroplasts and mitochondria contain so many copies of their genome? // Bioassays. 1987. - Vol. 6. - P. 279-282.

107. Beranek D.T. Distribution of methyl and ethyl adducts following alkylation with monofunctional alkylating agents // Mutation Research. 1990. - Vol. 231. - P. 1130.

108. Birky C.W. Relaxed and stringent genomes: why cytoplasmic genes don't obey Mendel's laws // J. Heredity. 1994. - Vol. 85. - P. 355- 365.

109. Birky Jr. Uniparental inheritance of mitochondrial and chloroplast genes: mechanisms and evolution//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. - Vol. 92.-P. 1331-1338.

110. Boblenz K., Nothnagel Т., Metzlaff M. Paternal inheritance of plastids in the genus Daucus // Mol. Gen. Genet. 1990. - Vol. 220. - P. 489-491.

111. Bock R., Drescher A., Ruf S. Reverse genetics in higher plant plastids // Symbiosis to Eucaryotism Endocytobiology VII / University of Geneva.; Wagner E. et al. (eds). -1999.-P. 427-437.

112. Bock R., Hagemann R. Plastid Genetics: manipulation of chloroplast genomes and biotechnological applications // Progress in Botany. 2000. - Vol. 61. - P. 76-90.

113. Bock R., Kossel H., Maliga P. Introduction of a heterologous editingsite into the tobacco plastid genome: the lack of RNA editing leads to a mutant phenotype // EMBO J. 1994. - Vol. 13. - P. 4623-4628.

114. Bolotin-Fukuhara M., Grivell LA. Genetic approaches to the study of mitochondrial ^ biogenesis in yeast // Antonie Leeuwenhoek. 1992. - Vol. 62. - P. 131-153.

115. Bonen L. Wheat mitochondrial genome // The Molecular Biology of Plant Mitochondria / Levings C.S., Vasil I.K. (eds.). The Netherlands, Dordrecht: Kluwer Academic Publishers - 1995. - P. 345-364.

116. Bonen L., Vogel J. The ins and outs of group II introns // Trends Genet. — 2001. — Vol. 17.-N6.-P. 322-331.

117. Boyton J., Gillham N., Newman S., Harris E. Organelle genetics and transformation of Chlamydomonas II Cell organelles Plant gene research / Hermann R.G. (ed). Berlin Heidelberg New York: Springer. - 1992. - P. 3-64.

118. Boynton J., Henningsem K. The physiology and chloroplast structure of mutants at loci controlling chlorophyll synthesis in barley // Stud. Biophys. 1967. — Vol. 5. - P.85.88.

119. Briton G. UV-visible spectroscopy // Carotenoids. V. IB. Spectroscopy / Eds. Briton G. et al. Basel Boston; Berlin: Birkauster Verlag. 1995. - P. 1-62.

120. Brown G.G. An overview of recent advances in plant mitochondrial gene expression // Plant mitochondria: from gene to function / Moller I., Gardenstrom P., Glimelius К and Glaser E. (eds.). Leiden, Netherlands: Backhuys Publishers, 1998. - P. 149-152.

121. Brown E.C., Somanchi A., Mayfield S.P. Interorganellar crosstalk: new perspectives on signaling from the chloroplast to the nucleus // Genome Biol. 2001. — Vol. 2. P. 10211-10244.

122. Brown G.G., Zhang M. Mitochondrial plasmids: DNA and RNA // The Molecular Biology of Plant Mitochondria / Levings C.S., Vasil IK (eds.). 1995. - P. 61- 91.

123. Budar F., Pelletier G. Male sterility in plants: occurrence, determinish, significance *" and use / C.R. Acad. Sci III. 2001. - Vol. 324. - N 6. - P. 543-550.

124. Byrne M., Taylor W. Analysis of mutator-induced mutations in the Iojap gene of maize // Mol. Gen. Genet. 1996. - Vol. 252. - P. 216-220.

125. Calderon I.L., Cerda O.E. Induction by N-methyl-N-Nitro-N-nitrosoguanidine of nuclear and cytoplasmic mutations in Saccharomyces cerevisiae II Mutat. Res. — 1983. -Vol. 108.-P. 133-146.

126. Chandler S., Thorpe T. Variation from plant tissue cultures: biotechnological appli-caton to improving salinity tolerance // Biotech. Adv. 1986. - Vol. 4. - P. 117-135.

127. Chang Т., Stoike L., Zarka D., Schewe G. e.a. Characterization of primary lesions caused by plastome mutator of Oenothera II Curr. Genet. 1996. - Vol. 30. - P. 522530.

128. Chaparro J., Werner D., O'Malley D., Sederoff R. Saturated molecular map of the rice genome based on the interspecific backcross population // Genetics. 1994. — Vol. 138.-P. 1251-1274.

129. Chapman Y.A., Rieber M. The development of polysomes in the seed of Pisum ar-vense II Biochem. J.- 1967. Vol. 105.-P. 1195-1198.

130. Chen Z., Muthukrishnan S., Liang G. A chloroplast DNA deletion located in RNA polymerase gene rpoC2 in CMS lines of sorghum // Mol. Gen. Genet. 1993. - Vol. 236.-P. 251-259.

131. Chen Z., Simpson C.L., Kindle K.L., Stern D.A. A dominant mutation in the Chla-mydomonas reinhardtii gene Sim 30 supresses translational defects caused by initiation codon mutations in chloroplast genes // Genetics. 1997. - Vol. 145. - P. 935943.

132. Chetrit P., Rios R., de Paepe R. Cytoplasmic male sterility is associated with large deletions in the mitochondrial DNA of two Nicotiana sylvestris protoclones // Curr. Genet. 1992.-Vol. 21.-P.131-137.

133. Chiba Т., Harada Т., Goto S et al. Transcription of tRNA genes from a large-scale plastid DNA deletion clearly reveals the action of nuclear-encoded RNA polymerase in the plastid II J. Plant Physiol. 1996. - Vol. 148. - P. 652-656.

134. Chiu W., Johnson E., Kaplan S., Blasko K., Sokalski M., Wolfson M., Sears B. Entree chloroplast DNA polymorphism associated with plastome mutator activity // Mol. Gen. Genet. 1990. - Vol. 221. - P.59-64.

135. Chiu W.L., Sears B.B. Plastome-genome interactions affect plastid transmission in Oenothera И Genetics. 1993. - Vol. 133. - P. 989-997.

136. Chiu W.L., Stubbe W., Sears B.B. Plastid inheritance in Oenothera: organelle genome determines the extent of biparental plastid transmission // Current Genetics. -1988.-Vol. 13.-P. 181-189.

137. Chory J., Nagpal P., Peto C.A. Phenotypic and genetic analysis of det2, a new mutant that affects light-regulated seedlings development in Arabidopsis II Plant Cell. — 1991.-Vol. 3.-P.445-459.

138. Clegg M.T., Gaut B.S., Learn G.H., Morton B.R. Rates and patterns of chloroplast DNA evolution II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 6795-3902.

139. Сое E.H. Maternally inherited abnormal plant types in maize // Maydica. — 1983. — Vol. 28.-P. 151-167.

140. Conklin P.L., Hanson M.R. Recombination of plant mitochondrial genomes // Homologous recombination and gene silencing in plants / J. Paszkowski (ed.). -1994. P. 61-81.

141. Correns C. Experimentelle Untersuchungen uber die Gynodiosie // Ber. Dtsch. Bot. Ges.-1904.-Bd. 22.-S. 506-517.

142. Correns C. Vererbungsversuche mit blass (gelb), grunen und buntblattrigen Sippen bei Mirabilis jalapa, Urtica pilulifera und Lunaria annua II Z. Indukt. Abstamm. Und Vererbungsl. 1909. - В. 1. - S. 291-329.

143. Corriveau J.L., Coleman A.W. Rapid screening method to detect potential biparental inheritance of plastid DNA and results over 200 angiosperm species // Am. J. Bot. 1988. - Vol. 75. - P. 1443-1458.

144. Davidson D., Fartens E., Armstrong S.W. Changes in frequencies of variegated leaves in NMU treated tobacco: evidence for a differential response to NMU // Theor. Appl. Genet. 1987. - Vol. 82. - P. 900-915.

145. Day A., Ellis T. Deletion forms of plastid DNA in albino plants from cereal anther culture II Curr. Genet. 1985. - Vol. 9. - P.671-678.

146. De Cosa В., Moar W., Lee S.-B. et al. Overexpression of the Bt cry2Aa2 operon in chloroplasts leads to formation of insecticidal crystals // Nature Biotechnol. 2001. -Vol. 19.-P. 71-74.

147. Derepas A., Dulieu H. Inheritance of the capacity to transfer plastids by the pollen parent in Petunia hybrida II J. Heredity. 1992. -Vol. 83. -P. 6-10.

148. De Verno L.L., Charest P.J., Bonen L. Inheritance of mitochondrial DNA in the conifer Larix // Theor. Appl. Genet. 1993. - Vol. 86. - P. 383 - 388.

149. Dix P., Kavanagh T. Transform in the plastome: genetic markers and DNA delivery systems // Euphytica. 1995. - Vol. 85. - P. 29-34.

150. Dix P., McKinley C., McCabe P. Antibiotic resistance mutants in Solanum nigrum II Progress in Plant Cell and Molecular Biology. Dordrecht: Kluwer Academic Publishers., 1990. - P. 169-174.

151. Drake J.W. The molecular basis of mutation. San Francisco, London, Cambridge, Amsterdam: Holden-day. - 1970.-P. 39-62.

152. Dudareva N.A., Kiseleva E.V., Boyarintseva A.E. et al. Structure of the mitochondrial genome of Beta vulgaris II Theor. Appl. Gen. 1988. - Vol. 76. — P. 753-759.

153. Dujon B. Mitochondrial genetics and functions // The molecular biology of Saccharomyces, life cycle and inheritance / Strathern J.N., Jones E.W., Broach J.R. (eds). Cold Spring Harbor: Cold Spring Harbor Laboratory Press. - 1981. - P. 505-635.

154. Dulieu H. Sur les differents types de mutations extranucleaires induites par le methane sulfonate d'etyle chez Nicotiana tabacum II Mut. Res. 1967. - Vol. 4. - P. 177189.

155. Dure L., Walters L. Long-liveal messenger RNA: evidence from cotton seed germination // Science. 1965. - Vol. 147. - P. 410-412.

156. Edwarson J.R. Gene control of non Mendelian variegation in Nicotiana tabacum L. И Genetics. 1966. -Vol. 52. - P.365-371.

157. Epp M. Nuclear gene-induced plastome mutations in Oenothera hookeri. I. Genetic analysis // Genetics. 1973. - Vol. 75. - P. 465-483.

158. Erickson L., Kemble R., Swanson E. The Brassica mitochondrial plasmid can be sexually transmitted. Pollen transfer of a cytoplasmic genetic element // Mol. Gen. Genet. 1989. - Vol. 218. - P. 419 - 422.

159. Faure S., Noyer J.L., Carreel F. et al. Maternal inheritance of chloroplast genome and paternal inheritance of mitochondrial genome in bananas (Musa acuminata) II Curr. Genet. 1994. - Vol. 25. - P. 265 -269.

160. Fauron C., Casper M., Gao Y., Moore B. The maize mitochondrial genome: dynamic, yet functional // Trends Genet. 1995. - Vol. 11. - P. 228-235.

161. Fauron C.M., Halvik M., Brettell R. The mitochondrial genome organization of maize fertile csmT revertant line is generated through recombination between two setsof repeats // Genetics. 1990. - Vol. 124. - P. 423-428.

162. Fluhr R., Moses P., Morelli G., Coruzzi G., Chua N. Expression dynamics of the pea rbsS multigene family and organ distribution of the transcripts // EMBO J. 1986. -Vol. 5.-P. 2063-2071.

163. Fox T.D., Leaver C.J. The Zea mays mitochondrial gene coding cytochrome oxidase subunit II has an intervening sequence and does not contain TGA codons // Cell. — 1981.-Vol. 26.-P. 315-323.

164. Gichner Т., Veleminsky J. Mechanisms of inhibition compounds-induced mutage-V necity // Mut. Res. 1988. - Vol. 202. - P. 325-334.

165. Giege P., Brennicke A. From gene to protein in higher plant mitochondria // C.R. Acad. Sci Paris / Life Sciences. -2001.- Vol. 324. P. 209-217.

166. Gillham N.W. Induction of chromosomal and non-chromosomal mutations in Chlamydomonas reinhardtii with N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine // Genetics. — 1965. Vol. 52. - P. 529-537.

167. Gray M.W., Hanic-Joyce P.J., Covello P.S. Transcription, processing and editing in plant mitochondria // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol 1992. -Vol.43. -P.145-175.

168. Gray M.W., Land B.W. Transcription in the chloroplasts and mitochondria: a tale of two polymerases // Trends Microbiol. 1998. - Vol. 6. - P. 1-3.

169. Greene Т., Kavakli I., Kahn M., Okita T. Generation of up-regulated allosteric variants of potato ADP-glucose pyrophosphorylase by reversion genetics // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1998. - Vol. 95 - P. 10322-10327.

170. Gruissem W., Tonkyn J.C. Control mechanisms of plastid gene expression. // Critical Reviews in Plant Sciences. 1993. - Vol. 12. - P. 19-55.

171. Gustafsson A. The mutation system of the chlorophyll apparatus // Lunds Univ. Arssktift. N. F. Adv. 2. 1940. - Vol. 36. - P. 1-40.

172. Gustafsson A. Chemical mutagenesis in higher plants // Erwin-Bauer-Gedachtnis-Vorlesungen /1. Abh.dt. Akad. Wiss., Berlin, (Med.). 1960. - № 1. - P.14-29.

173. Hagemann R. Structur und Funktion der genetischen Information in den Plastiden. I. Die Bedeutung von Plastommutanten und die genetischen Nomenklatur extranuclearer Mutationen // Biol. Zbl. 1971. -B. 90. - S. 409-418.

174. Hagemann R. Genetics and molecular biology of plastid of higher plants // Stadler Symp. Columbia. 1979. - Vol. 11. - P. 91-116.

175. Hagemann R. Plastome mutants of higher plants in the study of chloroplast biogenesis // Problems in general genetics. Proc. XIV Intern. Congress Genet. Moscow. -1980. -Vol. 11. B. 11.-P. 182-194.

176. Hagemann R. Induction of plastome mutations by nitrosourea-compounds // Methods in Chloroplast Molecular Biology / Edelman M., Hallick RB., Chua NH (eds). -Amsterdam: Elsevier, 1982.-P. 119-127.

177. Hagemann R. Plastiden genetics in higher plants // Cell organelles. Plant gene research / Hermann R.G. (ed). Berlin, Heidelberg, New York: Springer, 1992. - P. 6796.

178. Hagemann R., Berg W. Vergleichende Analyse der Paramutationssysteme bei hoherer Pflanzen // Biol. Zbl. 1977. - B. 96. - S. 257-301.

179. Hagemann R., Bock R., Hagemann M. Extranuclear inheritance: Plastid genetics // Progress in Botany.-1996. Vol. 57. - P. 197-217.

180. Hagemann R., Borner Th. Genetische, cytologische und molekularbiologische Analyse der Plastiden hoherer Pflanzen // Wiss. Z. Univ. Halle. 1979. B. 28. - S. 49-60; 137-142.

181. Hagemann R., Borner Th. Plastid genetics // Progr. Bot. 1981. - Vol. 43. - P. 159173.

182. Hagemann R., Hagemann M. Extranuclear inheritance: Plastid genetics // Progress in Botany. 1994. - Vol. 55. - P. 260-275.

183. Hagemann R., Hagemann M., Metzlaff. Extranuclear inheritance: Plastid genetics // Progress in Botany. 1987. - Vol. 49. - P. 245-263.

184. Hagemann R., Schroder M.B. The cytological basis of the plastid inheritance in an-giosperms // Protoplasma. -1989. Vol. 152. - P. 57-64.

185. Hallick R.B., Hong L., Drager R.G., Favreau M.R. et al. Complete sequence of Eu-glena gracilis chloroplast DNA // Nucleic. Acids. Res. 1993. - Vol. 21. - №15. - P. 3537-3544.

186. Han С., Сое E., Martienssen R. Molecular cloning and characterization of iojap, a pattern-striping gene of maize // EMBO J. 1992. - Vol. 11. - P. 4037-4046.

187. Hanson M.R. Plant mitochondrial mutations and male sterilility // Annu. Rev. Genet. 1991. - Vol. 25. - P. 461-486.

188. Hanson M., Folkerts О. Structure and function of the higher plant mitochondrial genome // International Rev. of Cytology. 1992. - Vol. 141. - P. 129-171.

189. Harris S.A., Ingram R. Chloroplast DNA and biosystematics: The effects of intrasp-esific diversity and plastid transmission // Taxon. 1991. - Vol. 40. - P. 393-412.

190. Hartmann C., Recipon H., Jubier M., Valon C. et al. Mitochondrial DNA varyability detected in a single wheat regenerant involves a rare recombination event across a short repeat // Curr. Genet. 1994. - Vol. 25. - P. 456-464.

191. Hayashida N., Matsubayashi Т., Shinozaki K. et al. The gene for the 9 kd polypeptide, a possible apopropein for the iron-sulfur centers A and В of the photosystem I complex, in tobacco chloroplast DNA // Curr Genet. 1987. - Vol. 12. - P. 247-250.

192. Hedtke В., Borner Т., Weihe A. Mitochondrial and chloroplst phage-type RNA-polymerases in Arabidopsis II Science. 1997. - P. 809-811.

193. Hedtke В., Legen J., Weihe A. et al. Six active phage-type PNA polymerase genes in Nicotiana tabacum II Plant J. 2002. - Vol. 30. - P. 625-637.

194. Henny R.J. Inheritance of foliar variegation in two Dieffenbachia cultivars II J. Heredity. 1982. - Vol. 73. - P. 384.

195. Herrmann R.G. Eukaryotism, towards a new interpretation. // Eukaryotism and Symbiosis / Schenk e.a. (eds) Springer-Verlag. - 1997. - P.73-118.

196. Herrmann R.G., Possingham J.V. Plastid DNA The Plastome / Ed. by J. Reinert. -Springer-Verlag., 1980. - P. 45 - 96.

197. Hiyama Т., Ke B. Difference spectra and extinction coefficient of P700 //Biochem. Biophys. Acta. 1972.-Vol. 267.-P. 160-171.

198. Hoch В., Maier R.M., Appel K. et al. Editing of a chloroplast mRNA by creation of an initiation codon // Nature. 1991. - Vol. 353. - P. 178-180.

199. Hoffmann M., Kuhn J., Daschner K., Binder S. The RNA world of plant mitochondria // Prog. Nucleic Acid Res. Mol. Biol. 2001. - Vol. 70. - P. 119-154.

200. Hopkins W. A. Light-Sensitive mutant in maize (Zea mays L.) IIZ. Pflanzenphysiol. 1980.-V. 99. - P. 417-426.

201. Horton P., Hague A. Studies on the induction of chlorophyll fluorescence in isolated barley protoplasts. IV. Resolution of non-photochemical quenching // Biochim. Biophys. Acta.- 1988.-Vol. 932.-P. 107-115.

202. Hostica J.G., Hanson M.N. Induction of plastid mutations in tomato by Nitro-somethylurea // Heredity. 1984. - Vol. 75. - P. 242-246.

203. Houchins J.P., Ginsburg H., Rohrbugh M. et al. DNA sequence analysis of a 5,27kb direct repeat occurring adjacent to the regions of S-episome homology in maize mitochondria//EMBO J. 1986.-Vol. 5.-P. 2781-2788.

204. Hunt M.D., Newton KJ. The NCS3 mutation: genetic evidence for the expression of ribosomal protein genes in Zea mays mitochondria // EMBO J. 1991. - Vol. 10. — P. 1045-1052.

205. Hupfer H., Swiatek M., Hornung S. e.a. Complete nucleotide sequence of the Oenothera elata plastid chromosome, representing plastome I of the five distinguishable Euoenothera plastomes // Mol. Gen. Genet. 1987. - Vol. 263 - P. 581-585.

206. Ikeda T.,Tsunewaki K. Deficiency of coxl gene expression in wheat plants with Aegilops columnaris cytoplasm // Curr. Genet. 1996. - Vol. 30. — P. 509-514.

207. Imai Y. Chlorophyll variegations due to mutable genes and plastids // Z. Vererb. -1937.-Vol. 71.-P. 61-83.

208. Janska H., Sarria R., Woloszynska M. Stoichiometric shifts in the common bean mitochondrial genome leading to male sterility and spontaneous reversion to fertility // The Plant Cell.- 1998.-Vol. 10.-P. 1163-1180.

209. Jarvis P. Intracellular signalling the chloroplast talks // Curr. Biol. — 2001. — Vol. 11. -P. 307-310.

210. Jmaguchi H., Tano S., Tatara A. et al. Mutations induced in germinating barley seeds by diethyl sulfate treatment at the interfase // Polyploidy and Induced Mutations Plant Breeding, Vienna. 1974. - P. 393-399.

211. Johns C., Lu M., Lysnik A., Mackenzie S. A mitochondrial DNA sequence is associated with abnormal pollen development in cytoplasmic male sterile bean plants // Plant Cell. 1992. - Vol. 4. - P. 435^49.

212. Kanevski I., Maliga P., Rhoades D., Gutteridge S.Increased Rubisco specificity through replacement of the large subunit gene in tobacco plastid // Mol. Gen. Genet. -1999. Vol. 24. - P. 457-469.

213. Kavanagh T.A., Driscoll R.O., McCabe P.F., Dix P.J. Mutations conferring linco-mycin, spectinomycin, and streptomycin resistance in Solatium nigrum are located in three different chloroplast genes // Mol. Gen. Genet. 1993. - Vol. 238. - P.345 -348.

214. Kiang A.-S., Connolly V., McConnell D.J., Kavanagh T.A. Paternal inheritance of mitochondria and chloroplasts in Festuca pratensis—Lolium perenne intergeneric hybrids // Theor. Appl. Genet. 1994. -Vol. 87. - P. 681-688.

215. Kirk J.T., Tilney-Bassett R. The Plastids. London and San-Francisco: Freeman and Company. - 1967. - 608 p.

216. Kirk J.T., Tilney-Bassett R. The Plastids: Their Chemistry, Structure, Growth and Inharitance. 2nd ed. Amsterdam; New York: Elsevier/North-Holland Biomedical Press. -1978.-650 p.

217. Kleinschmidt A.R., Zahn R.K. Uber deoxyribonucleinsaure molekelen in protein-mischfilmen // Z. Naturforsch. 1959. - Vol. 146. - P. 770-779.

218. Knoop V., Kloska S., Brennicke A. On the identification of group II introns in nucleotide sequence data // J. Mol. Biol. 1994. - Vol. 242. - P. 389 - 396.

219. Knorpp C., Azigyarto C., Glaser E. Evidence for a novel ATP-dependent membrane-associated protease in spinach leaf mitochondria // Biochem. J.- 1995. -Vol. 310. -P. 527-531.

220. Kolodner R., Tewari K.K .The molecular size and conformation of the chloroplast DNA from higher plants // Biochim. Biophys. Acta. 1975. - Vol. 402. - P. 372-390.

221. Kowallik K.V., Stoebe В., Schaffran I. et al. The chloroplast genome of a chlorophyll a + c-containing alga, Odontella sinensis II Plant Mol. Biol. Report . 1995.1. Vol. 13.-P. 336-342.

222. Krause G.H., Weis E. Chlorophyll fluorescence and photosynthesis: The basics // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1991. - Vol. 42. - P. 313-349.

223. Krugh B.K., Miles D. Energy transfer for low temperature fluorescence in PSII mutant thylakoids // Photosynthesis Research. 1995. - Vol. 44. - P. 117-125.

224. Kwok S.F., Piekos В., Misera S., Deng X.-W. A complement of ten essential and pleiotropic Arabydopsis COP/DET/FUS genes is necessary for repression of photo-morphogenesis in darkness // Plant Physiol. 1996. - Vol. 110. - P. 731-742.

225. Kubo Т., Nishizawa S., Mikami T. Alterations in organization and transcription of the mitochondrial genome of cytoplasmic male sterile sugar beet (Beta vulgaris) II Mol. Gen. Gen. 1999. - Vol. 262. - P. 283-290.

226. Kubo Т., Nishizawa S., Sugawara A. et al. The complete nucleotide sequence of themitochondrial genome of sugar beet (Beta vulgaris L.) reveals a novel gene for tRNA (Cys) (GCA) // Nucleic Acids Res. 2000. - Vol. 28. - P. 2571-2576.

227. Kucera J. Induction of developmental mutations by N-methyl-N-nitrosourea in Arabidopsis thaliana II Mechansm. Mut. and Indue. Factors, Prague. — 1966. — P. 313316.

228. Kutzelnigg H., Stubbe W. Investigations on plastome mutants in Oenothera I. General considerations // Sub-Cell Biochem. 1974. - Vol. 3. - P. 73-89.

229. Lang B.F., Gray M.W., Burger G. Mitochondrial genome evolution and the origin of eukaryotes // Ann. Rev. Genet. 1999. - Vol. 33. - P. 351- 397.

230. Leaver C.J., Gray M.W. Mitochondrial genome organization and expression in higher plants // Ann. Rev. Plant Physiol. 1982. -Vol. 33. - P. 373-402.

231. Leaver H., Reynolds S., Moneger F., Leave C. Mitochondrial genome organization and expression associated with cytoplasmic male sterility in sunflower (Helianthus annuus) II Plant J. 1991. - Vol. l.-P. 185-193.

232. Leon P., Arroyo A, Mackenzie S. Nuclear control of plastid and mitochondrial development in higher plants // Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. 1998. -Vol. 49. - P. 453-480.

233. Levings C., Brown G. Molecular biology of plant mitochondria // Cell. 1989. — Vol. 56.-№2.-P. 171-179.

234. Li H.-M., Gulligan K., Dixon R.A., Chory J. CUE1: a mesophyll cell-specific positive regulator of light-controlled gene expression in Arabidopsis II Plant Cell. — 1995. -Vol. 17.-P. 1599-1610.

235. Li X.-Q., Zhang M., Brown G.G. Cell-specific expression of mitochondrial in maize seedlings // Plant Cell. 1996. - Vol. 8. - P. 1961-1975.

236. Lilly J.W., Havey M.J., Jackson S.A., Jiang J. Cytogenetic analysis reveals the structural plasticity of the chloroplast genome in higher plants // Plant Cell. — 2001. —1. V Vol. 13.-P. 245-246.

237. Lonsdale D., Grienenbrg J. The mitochondrial genome of plants // Cell organelles. Plant gene Research. / Herrmann R. (ed). Springer, Berlin Heidelberg New York. -1992.-P.l 83-217.

238. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Farr A.L., Randall R.J. Protein measurement with the folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193. - P. 265-275.

239. Lu В., Wilson R., Phreaner C.G. et al. Protein polymorphism generated by differential RNA editing of a plant mitochondrial rps 12 gene // Mol. Cell. Biol. 1996. - Vol. 16.-P. 1543-1549.

240. Lupoid D.S., Caoile A.G., Stern D.B. The maize mitochondrial cox2 gene has five promoters in two genomic regions, including a complex promoter consisting of seven overlapping units // J. Biol. Chem. 1999. - Vol. 274. - P. 3897-3903.

241. Mackenzie S., Mcintosh L. Higher plant mitochondria // Plant Cell. 1999. - Vol. 11.-P. 571-586.

242. Maier R., Neckermann K., Igloi G., Kossel H.Complete sequence of the maize chloroplast genome:gene content, hotspot of divergence and fine tuning of genetic information by transcript editing // J. Mol. Biol. 1995. - Vol. 251. - P. 614-628.

243. Maliga P. Plastid transformation in flowering plants // Trends Biotechnol. — 1993. — Vol. 11. -P.101-107.

244. Maly R. Die Mutabilitat der Plastiden von Anthirrhinum majus L. Sippe 50 // Z. induct. Abstamm. Und Vererbungsl. 1958. - B. 89. - S. 692-696.

245. Marienfield J., Unseld M., Brandt P., Brennicke A. The mitochondrial genome of the flowering plant Arabidopsis thaliana is composed of both native and immigrant information // Trends Plant Sci. 1999. - Vol. 4. - P. 495 - 502.

246. Marcus A., Feeley J. Activation of protein synthesis in the inhibition phase of seed germination // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1964. - Vol. 51. - P. 1075-1076.

247. Marcus A., Feeley J. Protein synthesis in imbibed seeds // J. Biol. Chem. — 1965. — Vol. 240.-P. 1675-1678.

248. Markwell M.A., Haas S.M., Bieber L.L., Tolbert N.E. A modification of the Lowry procedure to simplify protein determination in membrane and lipoprotein samples // Anal. Biochem. 1978. - Vol. 87. - P. 206-210.

249. Martinez-Zapater J.M., Gil P., Capel J., Somerville C. Mutations at the Arabidopsis CHM locus promote rearrangements of the mitochondrial genome // Plant Cell. -1992.-Vol. 4.-P. 889-899.

250. McCabe T.C., Daley D., Whelan J. Regulatory, developmental and tissue aspects of mitochondrial biogenesis in plants // Plant Biol. 2000. - Vol.2. - P. 121-135.

251. McCala D.R. Chlorophyll mutagenesis: effect of N-methyl-N-nitro-N-nitrosoguanidine and some others on Euglena // Science. 1965. - Vol. 148. - P. 497499.

252. McNeis S., Nuccio M., Hanson A. Betaines and related osmoprotectants. Targets for metabolic engineering of stress resistance // Plant Physiol. Vol. 120 - P. 945-950.

253. Melis A., Brown J.S. Stoichiometry of system I and system II reaction centers and of plastoquinone in different photosynthetic membranes // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1980. - Vol. 77. - P. 4712-4716.

254. Menassa R., L'Homme Y., Brown G.G. Post-transcriptional and developmental regulations of a CMS-associated mitochondrial gene region by a nuclear restorer gene //Plant J. 1999.-Vol. 17.-P. 491-499.

255. Meng В., Matsubayashi Т., Wakasugi T. Ubiquity of the genes for components of a NADH dehydrogenase in higher plants chloroplast genomes // Plant Sci. 1986. -Vol. 47.-P. 181-184.

256. Michaelis P. Uber Plastiden-Restitutionen (Ruckmutationen) // Cytologia. 1969. -Vol. 34. Suppl. l.-P. 1-115.

257. Muller A., Mutationsauslosung durch Nitrosomethylharnstoff bei Arabidopsis II Der Zuchter. 1964. - B. 34. - S. 102-120.

258. Miller F.R. Inheritance of white stripe and rolledleaf characterictics in Sorghum bi-colorll Moench. Crop. Sci. 1968.-Vol. 8.-P. 769-771.

259. Miller G.W., Denney A., Wood J.K., Welkei G.W. Light-induced delta-aminolevulinic acid in dark-grown barley seedlings // Plant Cell Physiol. 1979. -Vol. 20.-P. 131-143.

260. Miller P.D., Vanghn K.S., Wilson K.G. Ethylmetanesulfonate induced chloroplast mutagenesis in crops. Induction and ultrastructure of mutants // J. Heredity. — 1984. — Vol. 75. - P. 86-92.

261. Milligan R.M., Maloney A.P., Walbot V. RNA processing and multiple transcription initiation sites result in transcript size heterogeneity in maize mitochondria // Mol. Gen. Genet. 1988. - Vol. 211. - P. 373-380.

262. Miyagishima S.-Y., Takahara M., Mori T. et al. Plastid division is driven by a complex mechanism that involves differential transicion of the bacterial and eukaryotic division rings // Plant Cell. 2001. - Vol. 13. P. 2257-2268.

263. Moneger F., Smart C., Leaver C. Nuclear restoration of cytoplasmic male sterility in sunflower is associated with tissue-specific regulation of a novel mitochondrial gene // EMBO J. 1994. - Vol. 13.-№8.-P. 8-17.

264. Mori Т., Kuroiwa H., Takahara M. et al. Visualization of an FtsZ ring in chloro-plasts of Lilium longifolium II Plant Cell Physiol. 2001. - Vol. 42. - P. 555-559.

265. Mukami Т., Kishima Y., Sugiura M., Kinoshita T. Organelle genome diversity in sugar beet with normal and different sources of male — sterile cytoplasms // Theor. Appl. Genet. 1985. - Vol. 71. - P. 166-171.

266. Muller A. Mutationsauslosung durch Nitrosomethylharnstoff bei Arabidopsis И Der Zuchter. 1964. - B. 34. - S. 102-120.

267. Naas M.M.K., Naas S. Intramitochondrial fibers with DNA characteristics. I. Fixation and DNA staining reactions // J. Cell. Biol. 1963a. - Vol. 19. P. 593-611.

268. Naas M.M.K., Naas S. Intramitochondrial fibers with DNA characteristics. II. Enzymatic and other hydrolytic treatments // J. Cell. Biol. 1963b. - Vol. 19. P. 613629.

269. Nagahashi H. et al. The pH dependent of p-glucosidase activity in isolated particu-* late fractions // Plant Sci. 1985. - Vol. 3. - P. 173-178.

270. Nagata N., Saito C., Sakai A. et al. The selective increase or decrease of organellar DNA in generative cells just after pollen mitosis one controls cytoplasmic inheritance // Planta. 1999. - Vol. 209. - P. 53-65.

271. Nagata N., Sodmergen C., Saito C. et al. Preferential degradation of plastid DNA with preservation of mitochondrial DNA in the sperm cells of Pelargonium zonale during pollen development // Protoplasma. 1997. - Vol. 197. - P. 217-219.

272. Nair C.K.K. Mitochondrial genome organization and male sterility in plants // J. Biosci.-1993.-Vol. 18.-P. 407-422.

273. Neale D.B., Marshall K.A., Harry D.E. Inheritance of chloroplast and mitochondrial DNA in incense-cedar (Calocedrus decurrens) // Can. J. For. Res. — 1991. Vol. 21. -P. 717-720.

274. V 300. Neale D.B., Marshall K.A., Sederoff R.R. Chloroplast and mitochondrial DNA arepaternally inherited in Sequoia sempervirens II Proc. Natl. Acad. Sci.USA 1989.-Vol. 86.-P. 9347-9349.

275. Neale D.B., Wheeler N.C., Allard R.W. Paternal inharitance of chloroplast DNA in

276. Douglas fir // Can. J. Forest Res. 1986. - Vol. 16. - P. 1152-1154.

277. Nesvera J. Nuclear and extranuclear mutations in yeast induced by ethylmethansul-fonate // Folia microbial. 1973. - Vol. 18. - P. 353-360.

278. Newton K.J., Сое E.H. Mitochondrial DNA changes in abnormal growth mutants of maize // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1986. - Vol. 83. - P. 7363-7366.

279. Newton K.J., Knudsen C., Gabay-Laughnan S., Laughnan J. An abnormal growth mutant in maize has a defective mitochondrial cytochrome oxidase gene // The Plant Cell. 1990. - Vol. 2. — P.107—113.

280. Nicolas P. Sensitivity of Euglena grasilis to chloroplast inhibiting antibiotics and properties of antibiotic-resistant mutants // Plant Sci. Lett. 1981. — Vol. 22. - P. 309316.

281. Nishiyra I., Ikushima Т., Ichikawa S. Radiobiological studies in plants. II. Further studies on somatic mutations induced by X-rays at the al locus of diploid oats // Ra-diat. Bot. 1966. - Vol. 6. - P. 211-218.

282. Oda K., Yamato K., Ohta E. et al. Gene organization deduced from the complete sequence of livewort Marchantia polymorpha mitochondrial DNA: a primitive form of plant mitochondrial genome I I J. Mol. Biol. 1992. - Vol. 223. - P. 1-7.

283. Ogihara Y., Isono K., Kojima T. et al. Chloroplast genome: complete sequence and contig clones Chinese Spring wheat (Triticum aestivum L.) // Plant Mol. Biol. Rep. -2000. Vol. 18. - P. 243 - 253.

284. Ohyama K., Fukusawa H., Kohchi Т., e. a. Chloroplast gene organization deduced from complete sequence of liverwort Marchantia polymorpha chloroplast DNA // Nature. 1986. - Vol. 322. - P. 572-574.

285. Palmer J. Contrasting modes and tempos of genome evolution in land plant organelles // TIG. 1990. - Vol.6. - № 4. - P. 115-120.

286. Palmer J.D. Comparison of chloroplast and mitochondrial genome evolution in plants // Cell organelles. Plant gene research. / Herrmann R. (ed) Berlin, Heidelberg, N.Y.: Springer. - 1992. - P. 99 -133.

287. Palmer J.D., Adams K.L., Cho Y., Parkinson C.L. et al. Dynamic evolution of plant mitochondrial genomes: mobile genes and introns and highly variable mutation rates // Proc. Nat. Acad. Sci. 2000. - Vol. 97. - P. 6960-6966.

288. Palmer J.D., Nugent J.M., Herbon L.A. Unusual structure of geranium chloroplast

289. DNA: a triple-sized inverted repeat, extensive gene duplications, multiple inversions and two repeat families // Proc. Natl. Acad. Sci. -1987. Vol. 84. - P. 769-773.

290. Parthier B. The Cooperation of nuclear and plastid genomes in plastid biogenesis and differentiation // Biochem. Physiol. Pflanzen. 1982. - Vol. 177. - P.283-317.

291. Pohlheim von F. Nachweis von Michzellen in vatigaten Adventisprossen von Saint-paula, entstanden nach Behandlung isolierter Blatter mit N-Nitroso-N-Methylharnsoff // Biol. Zbl. 1974. - B. 93. - S. 141-148.

292. Pohlheim von F. Genetischer Nachweiss einer NHH-induzierten Plastommutation bei Saintpaulia ionantha H. Wendl // Biol. Rdsch. 1981. - B. 19. - S. 47-50.

293. Potrycus I. Mutation und Ruckmutation Extrachromosomale vererbter Plas-tidenmerkmale von Petunia // Z. Pflanzenzuch. 1970. - Vol. 63. - P. 24-40.

294. Powell W., Machray G., Provan J. Polymorphism revealed by simple sequence repeat // Trends Plant Sci. 1996. - Vol. 1. - P. 215-222.

295. Powell W., Morgante M., McDevitt et al. Polymorphic simple sequence repeat regions in chloroplast genomes: application to the population genetics of pines // Proc. Natl. Acad. Sci USA. 1995. - Vol. 92. - P. 7759-7763.

296. Prina A. A mutator nuclear gene inducing a wide spectrum of cytoplasmically in-hereted chlorophyll deficiencies in barley // Theor. Appl. Genet. 1992. - Vol. 85. -P.245-251.

297. Prowan J., Soranzo N., Wilson N.J., Goldstein D.B. Powell W. A low mutation rate for chloroplast microsatellites // Genetics. 2001. - Vol. 153. - P. 943-947.

298. Руке K.A., Leech R.M. Chloroplast division and expansion is radically altered by nuckear mutations in Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1992. - Vol. 99. — P. 1005-1008.

299. Руке K.A., Leech R.M. A genetic analysis of chloroplast division and expansion in Arabidopsis thaliana // Plant Physiol. 1994. - Vol. 104. - P. 201-207.

300. Quail P.H., Boylan M.T., Parks B.M. et al. Phytochromes: photosensory perseption and signal transduction // Science. 1995. - Vol. 268. P. 675-660.

301. Quetier F., Lejeune В., Delorme S. et al. Molecular form and function of the wheatmitochondrial genome // Molecular Form and Function of the Plant Genome. New York: Plenum Press. 1985. - P. 413-420.

302. Ran Z., Michaelis G. Mapping of a chloroplast RFLP marker associated with the CMS cytoplasm of sugar beet {Beta vulgaris) II TAG. 1995. - Vol. 91. - P. 836-840.

303. Rana R.S. A radiation-induced chimera in annual Chrisanthemum II Naturwiss. -1964.-B. 51.-S. 642-643.

304. Raspe O. Inheritance of the chloroplast genome in Sorbus aucuparia L. (Rosaceae) I I J. Heredity. 2001. - Vol. 92. -N 6. - P. 507-509.

305. Reboyd X., Zeyl C. Organelle inheritance in plants // Heredity. 1994. - Vol. 72. -P. 132-140.

306. Redei G., Plurad S. Hereditary structural alterations of plastids induced by a nuclear gene in Arabidopsis // Protoplasma. 1973. - Vol. 77. - P. 361-380.

307. Reith, M. Munholland, J. Complete nucleotide sequence of the Porphyra purpurea chloroplast genome. Plant molecular biology reporter // Plant Mol. Biol. Report. -1995.-Vol. 13.-P. 333-335.

308. Renner O. Die pflanzlichen Plastiden als selbstandige Elemente der genetischen Konstitution // Ber. Verhandle. Sachsisch. Acad. Wiss. Leipzig. — 1934. B. 86. - S. 241-266.

309. Rep M., Grivell L.A. The role of protein degradation in mitochondrial function and biogenesis // Curr. Genet. 1996. - Vol. 30. - P. 367-380.

310. Richardson F.C., Richardson K.K. Sequence-dependent formation of alkyl DNA adducts: a review of methods, results, and biological cor-relates // Mut. Res. — 1990. — Vol. 233.-P. 127-138.

311. Riesenberg L., Van Fossen C., Arias D., Carter R. Cytoplasmic male sterility in sunflower: origin, inheritance and frequency in natural populations // Journal of Heredity. 1994. - Vol. 85 - P.233-238.

312. Ris H. Ultrastructure and molecular organization of genetic systems // Can. J. Genet. Cytol. 1961.-Vol. 3. - P. 95-102.

313. Ris H., Plaut W. The ultrastructure of DNA-containing areas in the chloroplasts of Chlamydomonas II J. Cell. Biol. 1962. - Vol. 13. - P. 383-391.

314. Robbelen G. Plastommutationen nach rontgenbestrahlung von Arabidopsis thailiana L. heynh IIZ. Vererb. Lehre. 1962. - Vol. 93. - № 1. - P. 25-34.

315. Robbelen G. The effects of two endogens factors on artificial mutagenesis in Arabidopsis thaliana II Ind. of and the Mut. Prosess, Prague. 1965. — P. 42-45.

316. Rochaix J.-D. Chlamydomonas reinhardtii as photosynthetic yeast // Annu. Rev. Genet. 1995. - Vol. 29. - P. 209-230.

317. Rochaix J.-D. Chloroplast reverse genetics: new insights into the function of plastid genes // Trends in plant science. 1997 - Vol. 2, №11- P. 419-425.

318. Rohacek K., Bartak M. Technique of the modulated chlorophyll fluorescence: basic concepts, useful parameters, and some applications // Photosynthetica- 1999 Vol. 37.-P. 339-363.

319. Rothenberg M., Hanson M.R. A functional mitochondrial ATP synthase proteolipid gene produced by recombination of parental genes in a Petunia somatic hybrid 11 Genetics. 1988. - Vol. 118.-P. 155-161.

320. Roussell D., Thompson D., Pallardy S., Miles D., Newton K. Chloroplast structure and function is altered in the NCS2 maize mitochondrial mutant // Plant Physiol. — 1991.-Vol. 96.-P. 232-238.

321. Ruf S., Hermann M., Berger I.J. et al. Stable genetic transformation of tomato plas-tids and expression of a foreign protein in fruit // Nature Biotechnol. 2001. - Vol. 19. -P. 870-875.

322. Ruf S., Kossel H., Bock R. Targeted inactivation of a tobacco intron-containing open reading frame reveals a novel chloroplast-encoded photosystem I related gene // The Journal of Cell Biology. - 1997. - Vol. 139, № 1. - P. 1-8.

323. Russel S. D. Quantitative cytology of the egg and central cell of Plumbago zelanica and its impact on the cytoplasmic inheritance patterns // Theor. Appl. Genet. — 1987. — Vol. 74. P. 693 - 699.

324. Saed M., Duke S.H. Chloroplastic regulation of apoplastic amylase activity in pea seedlings // Plant. Physiol. 1990. - Vol. 93. - P. 131-136.

325. Sager R. Genetic analysis of chloroplast DNA in Chlamydomonas II Adv. Genet. — 1977. Vol. 19. - P. 287-340.

326. Sakamoto W., Kondo H., Murata M., Motoyoshi F. Altered mitochondrial gene expression in a maternal distored leaf mutant of Arabidopsis induced by chloroplast mutator//The Plant Cell. 1996. - Vol. 8. - P. 1377-1390.

327. Sane P.V., Goodchild D.F., Park R.B. Characterization of photosystem 1 and 2 separated by a nondetergent method // Biochem. Biophys. Acta. 1970. Vol. 216. — P. 162-178.

328. Sarria R., Mackenzie S.A. A cytoplasmic male sterility associated mitochondrial peptide in common bean is post-translationally regulated // Plant Cell. - 1998. -Vol.10.-P. 1217-1228.

329. Sato N. Molecular organization and dynamism of chloroplast nucleoid, a eukaryo-prokaryotic hybrid // Tanpakushitsu Kakusan Koso. 2000. - Vol. 45, №2. - P. 116122.

330. Sato N., Alberiux C., Joyard J. Detection and characterization of a plastid envelope DNA-binding protein which may anchor plastid nucleoids // EMBO J. 1993. - Vol. 12.-P. 555-561.

331. Sato S., Nakamura У., Kaneko Т., Asamizu E., Tabata S. Complete structure of the */ chloroplast genome of Arabidopsis thaliana II DNA Res. 1999. - Vol. 6. - №5.1. P.283-290.

332. Saumitou-Laprade P., Cuguen J., Vernet P. Cytoplasmic male sterility in plants: molecular evidence and the nucleocytoplasmic conflict // TREE. 1994. - Vol. 9 .- №11.-P. 31-434.

333. Savin N.V., Swaminathan M.S., Sharma B. Enchancement of chemically-induced mutation frequency in barley through alteration in the duration of preasoking of seeds // Mut. Res. 1968. - Vol. 6. - P. 101-107.

334. Shannon M., Qualset C. Benefits and limitations in breeding salt-tolerant crops // Calif. Agr. 1984. - Vol. 38. - N 10. - P. 33-34.

335. Schinozaki K., Ohme M., Wakasugi T. et al. The complete nucleotide seguence of the tobacco chloroplast genomes: its gene organization and expression // EMBO J. -1986. Vol. 5. - P. 2043-2049.

336. Schmitz-Linneweber C., Maier R.M., Alcaraz J.P. et al. The plastid chromosome of spinach (Spinacia oleracea): complete nucleotide sequence and gene organization // Plant Mol. Biol. 2001. - Vol. 45. - P. 307 - 315.

337. Schumann C.M., Hancock J.F. Paternal inheritance of plastids in Medicago sativa II Theor. Appl. Gen. 1989. - Vol. 78. - P. 863-866.

338. Schuster W., Brennicke A. The plant mitochondrial genome: physical structure, information content, RNA editing, and gene migration to the nucleus // Annu. Re Vol. Plant. Physiol. Plant. Mol. Biol. 1994. - Vol. 45. - P. 61-78.

339. Sears B.B. Elimination of plastids during spermatogenesis and fertilization in the plant kingdom // Plasmid. 1980. - Vol. 4. - P. 233-255.

340. Serebryanyi A.M., Mnatsakanyan R.M. A study of the molecular mechanism of the mutagenic action of N-nitroso-N-alkilurea. Carbamoilation of nucleosides by N-nitroso-N-alkilurea // FEBS Letters. 1972. - Vol. 28. - P. 191-194.

341. Serebryanyi A.M., Salnikova L.E., Baknitova L.M., Paschin Yu. V. Role of the car-bomoylation reaction in the biological activity of methyl nitrosourea // Mut. Res. -1990.-Vol. 231.-P. 195-203.

342. Shinozaki K., Ohme M., Tanaka M. et al. The complete nucleotide sequence of the tobacco chloroplast genome: its gene organization and expression // EMBO J. 1986. -Vol. 5. - P. 2043 - 2049.

343. Shirzadegan M., Christey M., Earle E.D., Palmer J.D. Rearrangement, amplification and assortment of mitochondrial DNA molecules in cultured cells of Brassica campes-tris II Theor. Appl. Genet. 1989. - Vol. 77. - P. 17-25.

344. Shumway L.K., Bauman L.F. Nonchromosomal stripe of maize // Genetics. 1967. -Vol. 55.-P. 33-38.

345. Singer B. Mutagenesis from a chemical perspective: nucleic and resections, repair, translation and transcription // Mol. and Cell Mech. Mutagenes. Proc. Symp. Catlin-burg, Tenn., 5-6 Apr. 1981. N.Y.; London. 1982. -P. 1-41.

346. Small I., Issac P., Leaver J. Stoichiometric differences in DNA molecules containing the atpA gene suggest mechanisms for the mitochondrial genome diversity in maize // EMBO J. 1987. - Vol. 6. - P. 865-869.

347. Small I., Sufflok R., Leaver C. Evolution of plant mitochondrial genomes via sub-stochiometric intermediates // Cell. 1989. - Vol. 58. - P. 69-76.

348. Smith S.E. Biparental inheritance of organelles and its implications in crop improvement // Plant Breed. Rev. 1994. -Vol. 6. - P. 361-393.

349. Spreitzer R. Ogren W. Nuclear supressor of the photosensivity associated with defective photosynthesis in Chlamydomonas reinhardii II Genetics. — 1981. — Vol. 97. -№1. -P.101.

350. Spreitzer R., Thow G., Zhu G. Pseudoreversion substitution at large-subunit residue 54 influences the C02/02 specifity of chloroplast ribulosebiphosphate-carboxylase/oxygenase II Plant Physiology. 1995. - Vol. 109. - P. 681-685.

351. Staub J.M., Garcia В., Graves J. et al. High yield production of a human therapeutic protein in tobacco chloroplasts // Nat. Biotechnol. 2000. - Vol. 18. - P. 333-338.

352. Staub J.M., Maliga P. Accumulation of D1 polypeptide in tobacco plastids is regulated via the untranslated region of the psbA mRNA // EMBO J. 1993. - Vol. 91. -P.7468-7472.

353. Stern D., Newton K. Mitochondrial gene expression in Cucurbitaceae: conserved and variable features // Curr. Genet. 1985. -Vol. 9. - P.395-405.

354. Stine M., Sears B.B., Keatheley D.E. Inheritance of plastids in interspecific hybrids of blue spruce and white spruce // Theor. Appl. Gen. 1989. - Vol. 78. - P. 768-774.

355. Stirewalt V.L., Michalowski C.B., Loffelhardt W. et al. Nucleotide sequence of the cyanelle genome from Cyanophora paradoxa И Plant Mol. Biol. Reporter. — 1995. — Vol. 13.-P. 327-332.

356. Strauss S., Palmer J., Howe G., Doerksen A. Chloroplast genomes of two conifers lack an inverted repeat and are extensively rearranged // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. — 1988. Vol. 85. - P. 3898-3902.

357. Svab Z., Maliga P. Nicotiana tabacum mutants with chloroplast encoded streptomycin resistantce and pigment deficiency // Theor. Appl. Genet. 1986. - Vol. 72. — P. 637-643.

358. Svab Z., Maliga P. Mutation proximal to the tRNA binding region of the Nicotiana plant 16S rRNA confers resistance to streptomycin // Mol. Gen. Genet. 1991. — Vol. 228.-P. 316-319.

359. Sugita M, Sugiura M. Regulation of gene expression in chloroplasts of higher plants * // Plant Molecular Biology. 1996. - Vol. 32. - P. 315-326.

360. Sugiura M. The chloroplast genome // Plant Mol. Biol. 1992. -Vol. 19. - P. 149168.

361. Sugiura M., Hirose Т., Sugita M. Evolution and mechanism of translation in chloroplasts // Ann.Rev.Genet. 1998. - Vol. 32. - P. 437 - 459.

362. Sumaryati S., Negrutiu I., Jacobs M. Characterization and regeneration of salt- and water-stress mutants from protoplasts culture of Nicotiana plumbaginifolia (Viviana). II Theor. Appl. Genet. 1992. - Vol. 83. - P. 613-619.

363. Suzuki J.Y., Bollivar D.W., Bauer C.E. Genetic analysis of chloroplast biogenesis // Annu. Rev. Genet. 1997. - Vol. 31. - P. 61-89.

364. Takeda K., Koizumi K., Mochizuki M. et al. Suppressive factors for direct-acting mutagenecity of N-nitroso compounds // Mut. Res. Environ. Mutagenes. and Related Subj. 1988. - Vol. 203. - P. 390-391.

365. Tassopulu D., Kung S. Nicotiana chloroplast genome. Deletion and hotspot a proposed origin of the inverted repeats // Theor. Appl. Genet. - 1984. - Vol. 67. — P. 85— 193.

366. Testolini R., Cipriani G. Paternal inheritance of chloroplast DNA and maternal inheritance of mitochondrial DNA in the genus Actinidia II Theor. Appl. Genet. — 1997. Vol. 94. - P. 897-903.

367. Tewari K.K., Koldner R., Chu N.M., Meeker R.R. Structure of chloroplast DNA // Nucleic Acids and Protein Synthesis in Plant. New York; London: Plenum Press. -1977.-P. 15-36.

368. Thayer S.S., Conn E.E. Subcellular localization of during p-glucosidase and hy-droxynitrile lyase in the mesophyll cells of Sorghum leaf blades I I Plant. Physiol. -1981.-Vol. 67.-P. 617-622.

369. Thomson J.A. Apparent identity of chromoplast and chloroplast DNA in the daffodil Narcissuspseudonarcissus IIZ. Naturforsch. 1980. - Vol. 35.-P. 1101-1103.

370. Thompson D., Walbot V., Сое E.H. Plastid development in iojap and mutator affected maize plants // Am. J. Bot. - 1983. -Vol. 70. - P. 940-950.

371. Tilney-Bassett R.A.E., Almouslem A.B., Amoatey H.M. Complementary genes control biparental plastid inheritance in Pelargonium II Theor. Appl. Genet. 1992. — Vol. 85.-P. 317-324.

372. Travis D.M., Stewart K.D., Willson K.G. Nuclear and cytoplasmic chloroplast mutants induced by chemical mutagents in Mimulus cardinalis: genetics and ultrastructure // Theor. and Appl. Genet. 1975. - Vol. 46. - P. 67-77.

373. Triboush S.O., Danilenko N.G., Davydenko O.G. A method for isolation of chloroplast DNA and mitochondrial DNA from sunflower // Plant Mol. Biol. Rep. — 1998. — Vol. 16.-P. 183-189.

374. Triboush S.O., Danilenko N.G., Ulitcheva I.I., Davydenko O.G. Location of induced mutations and reversions in the chloroplast genome of Helianthus annuus II Plant Growth Regulation. 1999. - Vol. 27. - P. 75-81.

375. Tsunewaki K., Wang G.S., Matsuoka Y. Plasmon analysis of Triticum (wheat) and Aegilops. I. Production of alloplasmic common wheats and their fertilities // Genes Genet. Syst. 1996. - Vol. 71. - № 5.- P. 293-311.

376. Turischeva M.S., Samsonova I.A., Odintsova M.S. et al. Genetic control of plastid differentiation. 4. Induction and characterization of the plastom mutation Pl-exa I of Lycopersicon esculentum II Biol. Zbl. 1985. - Vol. 104. -N 2. - P. 183-187.

377. Ullstrup A.J., Troyer A., Forrest R. A lethall leaf spot of maize // Phytobiology. — 1972. Vol. 57. - P. 1282-1283.

378. Unseld M., Marienfeld J.R., Brandt P., Brennicke A. The mitochondrial genome in Arabidopsis contains 57 genes in 366.924 nucleotides I I Nat. Genet. 1997. - Vol. 15. -P. 57-61.

379. Vaughn J.C., Mason M.T., Sper-Witis G.L. et al. Fungal origin by horizontal transfer of a plant mitochondrial group I intron in the chimeric cox I gene of Peperomia I I J. Mol. Evol. 1995. - Vol. 41. - P. 563-572.

380. Vogel J., Hubschmann Т., Borner Т., Hess W.R. Splicing and intron-internal RNA editing of trnK-matK transcripts in barkey plastids: support for MatK as an essential splice factor// J. Mol. Biol. 1997. - Vol. 279. - P. 179-187.

381. Wakasugi Т., Nishikawa A., Yamada K., Sugiura M. Complete nucleotide sequence of the plastid genome from a fern, Psilotum nudum // Endocytobiosis Cell Res. (Suppl.).- 1998. Vol.13. - P. 147.

382. Wakasugi Т., Tsudzuki J., Ito S. Loss of all ndh genes as determined by sequencing the entire chloroplast genome of the black pine Pinus thumbergii II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1994. - Vol. 91. - P. 9794 - 9798.

383. Wallace D.C. Mitotic segregation of mitochondrial DNAs in human cell hybrids and expression of chloramphenicol resistance // Somatic Cell Mol. Genet. 1986. - Vol. 12.-P. 41-49.

384. Walters R.G., Horton P. Resolution of components of non-photochemical chlorophyll fluorescence quenching in barley leaves // Photosynth. Res — 1991- Vol. 27.-№2.-P. 121-133.

385. Walters Т., Maynthan M.R., Mutachler M.A., Earle E.D. Cytoplasmic mutants from seed of Brassica campestris with NMU // Can. J. Plant. Sci. 1990. - Vol. 81. - P. 214-216.

386. Wang Z.Y., Zheng F.Q., Guo X.L., Hong M.M. Occurence and partial characterization of RNA species in rice // Plant Sci. 1989. - Vol. 61. - P. 227-234.

387. Wei S.J.C., Chen B.P., Rice J.M. Comparative effects of methyl- and ethylnitro-sourea on DNA directing cell-free DNA-dependent synthesis of beta-galactosidase // Mol. Pharmacol. 1980. - Vol. 18. - P. 497-502.

388. Wettstein D.V., Gough S., Kannangara C.G. Chlorophyll biosynthesis // Plant Cell.- 1995. Vol. 7. - P. 1039-1057.

389. Wettstein D.V., Kritiansen K. Stock list for nuclear gene mutants affecting the chloroplast // Barley Genet. Newsl. 1973. - Vol. 3. - P. 113-117.

390. Wild A., Schwahn M. Die Plastiden als Trager genetischer Information // Biol. Zbl.- 1973. B. 92. - S. 273-305.

391. Wolfe K., Li W., Sharp P. Rates of nucleotide substitution vary greatly among plant mitochondrial, chloroplast and nuclear DNAs // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. -Vol. 84. - P. 9054-9058.

392. Wolstenholme D.R., Fauron C. Mitochondrial genome organization // The molecular biology of plant mitochondria / Levings C.S., Vasil I.K. (eds.). Dordrecht: Klu-wer AP.- 1995.-P. 1-59.

393. Wurtz E.A., Sear B.B., Rabert D.K. et al. A specific increase in chloroplast gene mutations following growth of Chlamydomonas in 5-fluorodeoxyuridine // Mol. And Gen. Genet. 1979. - Vol. 170. - P. 235-242.

394. Zacharias M., Ehrenberg L. Induction of leaf spots in leguminous plant by nuclea-toxic agents // Hereditas. 1962. - Vol. 48. - P. 284-296.

395. Zamechnik M., Zamechnik P.C. Mutation of chloroplast in Ageratum, following treatment with 5-bromdeoxyurine 11 Exp. Cell Res. 1967. -Vol. 45. - P. 218-229.