Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние свободного гемоглобина на гемокоагуляцию

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние свободного гемоглобина на гемокоагуляцию"

о

(сЯ- МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ II МПцицинской

'Ч

• ПРОМЫШЛЕННОСТИ РОГСИИСКСИ ФЕДЕРАЦИИ

ЧГЛЯБИИОКШ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ тЕДИЦИНСКЬЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи.

ШАПОВАЛОВПЕТРЯКОВЛЕВИЧ

У,г;к 612.115:Ы1-018.51+612.111.11/13

ВЛИЯНИЕ СВОБОДНОГО Гг.МОГЛОБИКА НА ГЕ М О К О АГ У Л Я Д И Ю

03.Си.04 - Биологическая химия.

АВТОРЕФЕРАТ диссертации ¡>а соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Челябинск - 1995

Работа выполнена на кафедре биологической химии в Тюменском государственном медицинском институте

Научный руководитель:

Член-корр. МАИ, доктор медицинских наук, профессор Бышевский А.Ш.

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Н.А.Глотов

Доктор медицинских наук, профессор К.Н.Груздева

Ведущая организация - Всероссийский Гематологический Научный Центр (ВГНЦ), Москва

Защита состоится "_"_ 1995 г. в_

на заседании специализированного совета Д-084.04.01 при Челябинском государственном медицинском институте (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинского медицинского института.

Автореферат разослан "_"_ 1995 г.

Ученый секретарь специализированного совета, доктор медицинских наук.

Л.В.Кривохижина

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В кровотоке постоянно присутствует свободный гемоглобин /НЬ/ за счет непрерывно происходящего с физиологической скоростью гемолиза. Концентрация НЬ колеблется в широких пределах'( 0,08 - 0,87 мкМ), возрастая при нарушениях свойств эритроцитарной мембраны, до значений, превышающих физиологическую в десятки и сотни раз /В.А.Левтов и др., 1982; Б.З.Баркаган, 1988/. Эритроциты в связи со свойственной их поверхностной мембране тромбопластической активностью, занимают важное место среди факторов, поддерживающих гемостатический потенциал /И.Я.Ашкинази, 1977/. Эта способность эритроцитов растет при дестабилизации мембраны /А.И.Грицюк и др., 1988/, вызываемой разнообразными факторами, в том числе мембраноли-тическими комплексами /Б.И.Кузник и др., 1989/. Роль НЬ, высвобождающегося при гемолизе, практически не изучен? в этом отношении, хотя и есть указания на его способность активировать свертывание крови. Число таких наблюдений невелико, их результаты противоречивы. Так, отмечено, что гемин ускоряет агрегацию тромбоцитов /Malik е.а., 1983/, что продукты деградации гематина имеют антикоагулянтные свойства / Jones, 1986/. Сообщалось о способности свободного НЬ сокращать тромбиновое время плазмы /Hopmeier е.а., 1991/. В другой работе отрицаются какие-либо гемокоагуляционные свойства НЬ по данным опытов на животных /Ning е.а., 1990/.

Приведенные данные обосновывают необходимость детального изучения гемокоагуляционной активности НЬ. Актуальность таких исследований объясняется еще и тем, что идея применения растворов НЬ как кислородтранспортного средства активно разрабатывается /М.А.Ажигирова и др., 1986; М.М.Великина и др., 1987; Ю.А.Литвиненко и др., 1991; Menu е.а., 1990/. Есть указания на

нефро- и гепатотоксичность препаратов НЬ, в том числе и высоко-очищенных /Feols е.а., 1990; Smith е.а., 1990/. К сожалению, в этих работах не исследовался гемостаз, однако описанные изменения напоминают возникающие при остром гемолизе. Это еще одно подтверждение необходимости изучать гемокоагуляционные свойства НЬ.

Цель работы - изучить гемокоагуляционные свойства свободного НЬ, установить звено коагуляционного гемостаза, на которое он влияет.

Задачи исследований. 1. Установить, влияет ли свободный НЬ на интегральные показатели состояния плазмокоагуляции в концентрациях, сопоставимых с реально существующими в крови; 2. Установить, какая из фаз плазмокоагуляции изменяется под действием НЬ; 3. Уточнить звено гемокоагуляционного каскада, являющееся мишенью свободного НЬ; 4. Определить, какой из компонентов НЬ обладает гемокоагуляционной активностью; 5. Ориентировочно оценить возможную роль свободного НЬ в поддержании гемостатического потенциала.

Научная новизна. Впервые установлено, что свободный НЬ в концентрациях, которые могут возникать в кровотоке при ускорении гемолиза, способен активировать плазмокоагуляцию, что звеном плазмокоагуляции, на активность которого влияет НЬ, является неферментативный этап коагуляционных превращений фибриногена - самосборка фибрина, что эффект НЬ на самосборку обусловлен взаимодействием белкового компонента молекулы (глобина) с фибринМономерами и фибринполимерами ранних стадий аутополи-меризации.

Впервые показано, что повышение концентрации свободного НЬ в кровотоке белых крыс ведет к фазным изменениям свертываемости крови: гиперкоагулемии с последующим снижением общей

свертывающей активности. Установлено, что в период гиперкоагу-лемии устойчивость животных к тромбопластнну резко падает.

Практическая ценность.■ Полученные в работе данные указывают на необходимость оценивать гемокоагуляционные свойства растворов НЬ, предназначаемых для применения в качестве кисло-родтранспортного средства и дополнительно обосновывают необходимость использовать в профилактике и лечении ДВС крови средств, способствующих стабилизации мембраны эритроцитов, так как снижение резистентности эритроцитов приводит к росту уровня свободного НЬ в крови.

Апробация и публикация. Основные положения диссертации доложены на научной конференции "Физиология и патология пере-кисного окисления липидов, гемостаза и иммуногенеза" (Полтава, 1993), региональной научно-практической конференции "Медицинская реабилитация больных и инвалидов" (Тюмень, 1994), заседаниях Тюменского отделения ВБО.

По материалам диссертации опубликовано 6 печатных работ.

Основные положения, выносимые на защиту. 1. Свободный НЬ, циркулирующий в кровотоке, повышает гемокоагуляционный потенциал, заметно ускоряя процесс самосборки фибрина, особенно его ранних стадий. 2. Рост уровня свободного НЬ в кровотоке, до значений, реально возможных при активации гемолиза, является фактором, снижающим устойчивость организма к тромбогенным воздействиям, следовательно, эффект НЬ накладывается на коагулирующий эффект теней эритроцитов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе использован коммерческий препарат бычьего НЬ (Иеапа1), а также НЬ из эритроцитов белых крыс /Г.П.Григорьев, 1987/, дополнительно очищенный гель-фильтрацией на колонках с Сефадексом. Для надежной очистки после первой гель-фильтрации отбирали фракции с максимальной концентрацией НЬ (1-2 пробирки) н дважды подвергали их рехроматографин. Количество НЬ в препарате первоначально устанавливали спектрофотометрически (280 нм) с помощью калибровочного графика по тирозину. Затем, используя этот раствор НЬ, строили калибровочный график зависимости оптической плотности растворов НЬ от разведения. Этот график применяли в работе для количественной оценки содержания НЬ. Мол. массу НЬ из эритроцитов крысы устанавливали гель-фильтрацией на колонке (20 х 450 мм, Сефадекс в-150). Колонку калибровали декстраном голубым (2 ООО кДа), альбумином (70 кДа, трипсиновым ингибитором (20 кДа) и рибонуклеазой (13,7 кДа) - рис. 1.

^ Рис. 1. Результаты ка-

у ? либровки колонки, заполнен-

^ ной Сефадексом в-бО

(20x450 мм). Абсцисса - значение молекулярной массы, ордината - отношение объема элюирования метчиков к внешнему объему колонки

----—¿5«-'(Уе/Уо). Обозначения: 1, 2 и

3 альбумин, трипсиновый ингибитор и рибонуклеаза соответственно, 4 - НЬ крысы. Стрелка -объем элюирования НЬ.

Белковый компонент НЬ отделяли ацетоном, подкисленным

НС1, согласно Е.А.Строеву и В.Г.Макаровой /1986/. Как субстрат

самосборки использовали раствор мономерного фибрина из бычьей

плазмы /И.М.Радзевич, Е.Л.Ходорова /1969/. Антиполимериза-

ционную активность Hb оценивали по его влиянию на время (скорость) самосборки в системе: 0,4 мл 0,075 М боратного буфера (pH 7,6)+ 0,1 мл исследуемого материала + 0,1 мл 2,2 мкМ раствора мономерного фибрина (опыт). В контроль вместо Hb вносили растворитель.

Гемокоагуляцию оценивали с помощью следующих показателей:

1. Время рекальцификации /ВР/; 2. Активированное время рекальцификации /АВР/; 3. Тромбиновое время /ТВ/; 4. Тромбопластиновое время; 5. Активированное частичное тромбо-пластиновое время. Все определения проводили по описанию /Г.Н.Детинкина и др., 1984/. 1-й и 2-й тесты отражают общую свертывающую активность плазмы (2-й - в стандартизированных условия), тест 3-й - активность III фазы свертывания в целом, тест 4-й - общую свертывающую активность по внутреннему пути. Пробы с дефицитной плазмой (Behring) проводили по фирменной инструкции, используя плазмы с дефицитом фактора XII, XI, IX, X, VIII, VII, V или И. Совокупность этих определений позволяла установить, может ли Hb замещать дефицит перечисленных прокоагу-лянтов или имитировать их активность.

Устанавливая уровень реализации эффекта Hb, определяли время самосборки мономерного фибрина в плазме / С.И.Тажудинова, 1987/, и степень ретракции сгустков /М.А.Котовщикова, Б.И.Кузник, 1965/ по объему самопроизвольно отделяющейся при инкубации сгустка жидкости (объем ретракции), А также количество белка в сгустке /Wadell, 1956/, чтобы составить представление о полноте включения в него фибриногена. Влияние Hb на лизис сгустка оценивали методом фибриновых пластин по Аструпу, формируя пластины в присутствии Hb и без него.

Для моделирования изолированных гемокоагуляционных систем использовали плазму 20 доноров из крови, взятой при плановом отборе, а также плазму крови 85 белых нелинейных крыс. Для получения плазмы кровь стабилизировали 3,8% раствором цитрата натрия (1:9) и центрифугировали (1000 g, 15 мин).

Опыты in vivo проведены на 300 беспородных белых крысах (100+15 г), кровь брали из яремной вены, предварительно фиксируя крыс в состоянии наркоза (диэтиловый эфир). В ту же вену вводили НЬ и тромбопластин.

Наряду с упомянутыми реактивами и препаратами использовали: Сефадексы G-15 (обессоливание или концентрирование белковых препаратов), G-150 (для гель-фильтрации) фирмы Pharmacia, тромбин, фибриноген и тромбопластин (Каунас).

Схемы постановки экспериментов и компоновки гемокоагуляционных систем приведены при описании результатов. Все количественные результаты обработаны методом вариационной статистики для малых рядов наблюдений с применением таблиц Стъю-дента-Фишера.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние коммерческого препарата НЬ на время рекальцифика-ции /ВР/ и тромбиновое время /ТВ/ плазмы. Ориентировочные исследования начали с изучения влияния НЬ на общую свертывающую активность /ВР/ и активность III фазы свертывания (ТВ) для оценки целесообразности дальнейшей работы. Субстратом здесь служила плазма крыс, материалом -• коммерческий препарат бычьего НЬ без дополнительной очистки и после нее.

Опыты проведены по схеме: 1) к плазме в пробирке на водяной бане (0,1 мл, 37°С) добавляли равный объем раствора НЬ в 0,14 М NaCI, смешивали; 2) вносили в смесь 0,1 мл 0,025 М раствора

СаС12 (или тромбина - 1 мг/мл), устанавливая момент появления сгустка. В контроль вместо НЬ вносили 0,14 М раствор №С1.

Таблица 1. Влияние коммерческого препарата НЬ на BP и ТВ (5 повторностей в этом и всех последующих опытах in vitro)

Конечная концентрация гемоглобина (г/л) ВР, с ТВ, с

0,0 109,8±3,0 40,0±0,20

(контроль)

0,33 104±0,8 39,3±1,2

0,17 110±1,0 39,3±1,2

0,08 109,5+6,4 38,9±1,1

0,04 94,0±0,2* 38,0±0,4

0,02 93,5±4,9* 38,3±0,4

0,01 89,8±3,9* 36,0±0,1

0,005 106,0+2,8 39,2±1,6

Примечание: знак "*" в этой и следующих таблицах - достоверно отличающиеся величины.

Оказалось (табл. 1), что при концентрациях НЬ, близких к реально возможным в кровотоке (ускорение гемолиза), общая свертывающая активность растет: ВР сокращается на 9,2-17,4% (при концентрациях НЬ 0,04-0,01 г/л). ТВ изменяется на 10% при концентрации 0,01 г/л.

Влияние бычьего НЬ после его очистки изучали по той же схеме и нашли, что при концентрациях НЬ 0,05, 0,025 и 0,01 г/л ВР сократилось на 19,5, 40,0% и 22,3% соответственно. ТВ при этих концентрациях сократилось на 21,5, 19,2 и 17,5%.

Таким образом, коммерческий препарат НЬ после дополнительной очистки повышает общую свертывающую активность крови и активность III фазы свертывания эффективнее, чем неочищенный, рто, видимо, обусловлено освобождением от примесей,- свойствен-ых препаратам НЬ /А.Б.Лившиц и др., 1992/. Четкой концентра-

ционной зависимости эффекта в этих опытах не найдено, однако та же направленность результатов и нх большая выраженность после очистки НЬ определили целесообразность дальнейших исследований.

Влияние НЬ из эритроцитов крысы на гемокоагуляцию.

В этой части работы и последующих использован свежеполу-ченный НЬ, хранившийся не более 4-6 ч без лиофилизации.

Достаточная степень очистки позволила выражать концентрацию в молях.

Прежде всего повторили опыты по изучению влияния НЬ на общую свертывающую активность'и на III фазу свертывания - на ВР и ТВ.

Оказалось (табл. 2), что в присутствии гомологичного НЬ ВР заметно сокращается при- концентрации 0,38 мкМ, что обнаруживается и при меньших концентрациях. Сокращается и ТВ, причем становится выраженной концентрационная зависимость эффекта.

Таблица 2. Влияние НЬ из эритроцитов белых крыс на ВР и ТВ плазмы белых крыс.

Показатель 0,0 Концентрация гемоглобина, мкМ 0,77 0,38 0,26 0,18

ВР, с ТВ, с 171,3±7,3 32,7±0,8 165,0±0,1* 153,0±2,8* 175,0±0,0 21,4±0,2* 23,7±0,8* 28,9±1,1 165,0±0,4 27,8±1,4

Примечание: в этой и всех следующих таблицах приводятся конечные концентрации НЬ в экспериментальной системе.

Существенно, что ВР сокращается в заметно меньшей степени, чем ТВ (при одинаковых концентрациях НЬ).

Принимая во внимание тот факт, что ТВ - небольшая часть ВР, уже на этом этапе исследований можно было допустить, что эффект НЬ реализуется на уровне III фазы свертывания, единствен»

ным фибринобразующим фактором которой служит тромбин (самосборка - не ферментативный процесс, а стабилизация сгустка

на ТВ не влияет. Важно и то, что даже заметное изменение активности III фазы в малой степени отразится на показателе общей свертывающей активности, что мы, видимо, и наблюдаем в наших опытах. Это подтверждается и отсутствием четкой концентрационной зависимости в тесте "ВР".

Для получения дополнительного свидетельства в пользу высказанного предположения изучили влияние НЬ на время свертывания плазм с ограниченным содержанием одного из факторов свертывания, 1-И фаз плазмокоагуляции. Выбор такого приема обусловлен тем, что в случае, если НЬ влияет на эти фазы свертывания как соединение, замещающее или имитирующее бдин из прокоагулян-тов, он изменит скорость свертывания плазмы с дефицитом этого прокоагулянта. К дефицитной плазме добавляли равный объем раствора НЬ в 0,14 М растворе №С1 и (после экспозиции - 37°С, 2 мин) - равный объем взвеси тромбопластина, затем - 0,025 М раствора СаС12 - т. е. определяли тромбопластиновое время плазмы с низким содержанием одного из прокоагулянтов. Применение этого теста вызвано тем, что ВР дефицитных плазм значительно удлинено - увеличивается ошибка определения.

Таблица 3. Влияние гомологичного гемоглобина (0,29 мкМ) на тромбопластиновое время дефицитных плазм

Плазма с Тромбопластиновое время, с дефицитом нормальная плазма фактора:_плазма_с дефицитом

XII 252,5±3,5 328,0±11,3

XI 132,0±3,5 133,0±2,1

IX 133,2+5,3 127,2+4,7

VIII 120,0±0,7 135,0±0,0

X 77,0±0,0 75,5±0,7

VII 25,0±0,0 24,5±0,7

V 156,5±4,9 157,5±3,5

II не свертывается 12 мин

V/ 1 . . V"

Ни в одной из дефицитных плазм (табл. 3) внесение НЬ не изменило время свертывания. Тромбопластиновое время свертывания отражает скорость генерации тромбина по внешнему и отчасти внутреннему путям - активность I-1I фаз свертывания. Следовательно, НЬ, повышая общую свертывающую активность (табл. 1 и 2), не влияет на контактную фазу (не замещает факторов XII-XI), на активацию протромбиназы по внутреннему пути (не замещает факторов VIII, IX и X) и по внешнему пути (не замещает фактора VII). То же относится и к субстрату тромбиногенеза - протромбину. Все это подтверждает, что гемокоагуляционная активность НЬ реализуется после реакций' I-II фаз плазмокоагуляции, следовательно, на уровне ее III фазы.

Влияние НЬ на плазмокоагуляцию на уровне III фазы свертывания. III фаза плазмокоагуляции включает: а) ферментативный этап - атака фибриногена тромбином с высвобождением фибринмо-номера, б) самосборку фибринполимеров и их агрегацию с образованием фибрина S ; в) стабилизацию фибрина S фактором XIII /Д.М.Зубаиров, 1978; А.Ш.Бышевский и др., 1991/. Показатели ТВ не зависят от фактора XIII, а отражают лишь первую и вторую стадии III фазы свертывания.

- Чтобы установить, не вызвано ли ускорение III фазы под влиянием НЬ активацией тромбина, провели опыты в системе тромбин фибриноген с гепарином и без него (табл. 4).

Выяснилось следующее (табл. 4): 1. НЬ ускоряет свертывание фибриногена тромбином, т.е. влияет на III фазу плазмокоагуляции, активируя тромбин или угнетая антитромбин III, присутствующий в следовых количествах в препаратах фибриногена; 2. НЬ не влияет на торможение тромбина гепарином. Это видно из того, что в системе фибриноген+гепарин+тромбин НЬ сокращает время свертывания (в %) в той же степени, что и без гепарина.

Таблица 4. Влияние НЬ на время реакции (с) тромбин-фибриноген в присутствии гепарина и без него.

Состав Концентрация гемоглобина в системе, мкМ

системы: 0,0 210 21 10 0,69

фибриноген 85,7±1,1 59,3+2,0 8,0+0,0* 78,0+0,0* 81,0±0,7

+ тромбин *(30,8) (20,6) (8,9) (5,5)

фибриноген 147±7,1 104+1,9 115±1,7 132±1,3 148±1,0

+ гепарин (29.2) (21,8) (10,2) -

+ тромбин

Примечания: 1) концентрация тромбин - 1, фибриногена - 5 мг/мл, гепарина - 10 ЕД/мл (равных объемах); 2) в скобках -отличия от контроля в %.

Следовательно, НЬ ускоряет III фазу свертывания, не изменяя активности тромбина или его основных /З.С.Баркаган, 1988/ ингибиторов - гепарина и антитромбина III. Поэтому возникла необходимость изучить влияние НЬ на самосборку фибрина. С этой целью самосборку фибрина изучали при разных концентрациях НЬ.

Эксперимент выявил, что время самосборки тем короче, чем выше концентрация НЬ в среде (рис. 2). То же повторилось при изучении расширенного диапазона концентраций НЬ. Следовательно, мишень НЬ в процессе свертывания - самосборка.

Рис. 2. Зависимость эффекта НЬ на самосборку от концентрации: абсцисса - концентрации НЬ, мкМ; ордината - укорочение времени самосборки относительно контроля, %.

Так как НЬ ускоряет самосборку, от динамики которой за-и /г с,ми висит эффективность ретракции

сгустка, мы изучили влияние НЬ на ретракцию, оценивая ее по количеству жидкости, самопроизвольно высвобождающейся из сгустка плазмы за 60, 120 и 180 мин. после начала свертывания в системе: 3 мл плаз мы + 3 мл 0,14 М раствора NaCl (контроль)

или 3 мл НЬ + 3 мл 0,025 М СаС12. Одновременно определяли количество белка в сгустке для суждения о том, влияет ли НЬ на содержание в нем фибриногена.

Таблица .5. Зависимость объема ретракции плазмы от количества НЬ.

Содержание

Концентрация Объем ретракции (мл) через: белка в

гемоглобина в 60 мин 120 мин 180 мин Сумма(У) сгустках,

плазме, мкМ мг/ мл

гидролизата

0,0 5 1,2 0,2 6,4 4,9

1,2 5 1,2 0,51* 6,71 4,4

25 6 1,9* 0,41* 8,31* 5,3

55 6,1 2,0* 0,42* 8,52* 5,3

74 6,2 2,0* 0,58* 8,78* 4,6

Примечания: избегая перегрузки таблицы, не приводим значений ш, отмечая лишь достоверность отличий по отношению к контролю.

Объем ретракции был выше при высоких концентрациях НЬ уже на 60-й мин и стал еще выше через 120 и особенно 180 мин. Одинаковое количество белка в сгустках при всех концентрациях НЬ в среде - указывает, что НЬ не влияет на включение фибриногена (табл. 5).

Таким образом, НЬ, активируя самосборку, косвенно интенсифицирует ретракцию сгустка. Это указало на необходимость сравнить эффективность фибринолиза сгустков, образованных в присутствии НЬ и без него. Фибриновые пластинки формировали на чашках Петри, не добавляя (контроль) или добавляя (опыт) НЬ к раствору фибриногена. На поверхность фибринового геля наносили свежую плазму (источник компонентов фибринолити'ческой системы). После экспозиции (37° С, 24 ч) измеряли зоны лизиса. Их

размеры были одинаковыми при всех концентрациях НЬ (25,0±0,0 мм2 в контроле, 20,3±3,2 - 24,7±3,6 мм2 в опытах).

Чтобы выяснить, активирует ли НЬ собственно аутополимери-зацию или же агрегацию фибринполимеров, провели следующий опыт: раствор фибринмономера (2,2 мкМ) в кислой среде разбавляли для провокации самосборки боратным буфером (рН 7,4) с низкой ионной силой (0,075 М), фиксируя время самосборки. В контроле к боратному буферу, используемому для провокации самосборки, добавляли 0,14 М раствор №С1, в опытах - раствор НЬ (конечная концентрация 12 мкМ). Суть эксперимента в том, что изменялось время внесения НЬ: до провокации самосборки и после нее через 10, 15 с и далее с интервалом в 5 с до 45 с.

Этот эксперимент (табл. 6) можно рассматривать как тест, при выполнении которого изменяются условия реакции в разное время

от начала самосборки, Что позволяет различать 2 этапа самосборки: 1-й - до внесения и 2-й - после внесения НЬ.

Таблица 6. Влияние НЬ на самосборку фибрина в зависимости от интервала времени между провокацией самосборкии внесением НЬ.

Интервал между провокацией Время Укорочение п

самосборки и внесением НЬ, с самосборки, с %%

0,0 37,3±1,5 39,1

5 38,0±0,1* 38,0

10 41,0±1,2* 33,7

15 43,1±1,2* 29,4

20 45,7±0,4* 25,4

25 48,0±0,2* 21,7

30 50,2±0,7* 18,1

35 54,0±0,7* 11,9

40 56,0±1,2 8,6

45 59,3±4,2 3,2

Гемоглобин внесен при 61,3+3,2 -

появлении сгустка

Такой прием позволил провести графический анализ (рис. 3): абсцисса А - общая продолжительность I этапа (до внесения НЬ), ордината - экспериментальное время образования фибрина при внесении НЬ в разные сроки от начала процесса, включая момент, когда сгусток уже образовался (61,3 с). Минимальное значение I этапа соответствует опыту, в котором НЬ внесли одновременно с провокацией самосборки (время I этапа = 0), максимальное значение I этапа соответствует опыту, в котором НЬ внесли в момент появления сгустка фибрина (длительность I этапа наибольшая и принимается за единицу, что соответствует всей продолжительно' сти процесса (61,3 с). Калибровка абсциссы А составлена из долей единицы, которые выражают одновременно доли времени и доли промежуточных превращений I этапа самосборки. Максимальное значение абсциссы Б равно 1 - А при А, равном нулю. На этой абсциссе отложены доли величины 1-А: они отражают доли времени и доли промежуточных превращений II этапа. Точки, соответствующие времени самосборки при минимальной продолжительности I (Т-1) и II (Т-2) этапов соединены прямой, характеризующей изменения времени самосборки в случае, если все ее этапы одинаково чувствительны к действию НЬ. Экспериментально установленное время самосборки при отсроченном внесении НЬ (т.е. при изменении длительности I и II этапов) - прерывистая линия.

Рис. 3. Влияние НЬ на самосборку фибрина в зависимости от промежутка между внесением НЬ и началом самосборки. Пояснения в тексте.

На рис. 3 видно, что прерывистая линия ниже непрерывной в части графика, характеризующего ранние стадии самосборки, и пересе-

кается с ней в точке, соответствующей 0,46 (46%) всей абсциссы А. Следовательно, НЬ активирует долю промежуточных превращений, составляющих около 46% от всей их совокупности. Более поздние превращения (54%) НЬ не активирует - их скорость близка к наблюдающейся в контроле. Однако до 35-й с (57% всего времени) сохраняется достоверный эффект НЬ (табл. 6 и рис. 4). На этапах, составляющих менее 43% от общей продолжительности самосборки, эффект НЬ не подтверждается статистически. Отмечается также неодинаковая чувствительность самосборки к НЬ и в пределах той доли превращений, которые им ускоряются. Так, при внесении НЬ на 5-й с скорость самосборки выше контрольной на 38%, на 10-й с - на 33,7, на 15-й, 20-й и 25-й на 29,4, 25,4 и 21,7%, на 30-й с - только 18, а на 35-й - 11,9%. На этом основании можно допустить, что НЬ активирует преимущественно аутополи-меризацию на стадии короткоцепочных фибринполимеров. При их удлинении эффект уменьшается, и исчезая при образовании полимеров, с массой, достаточной для агрегации. Следовательно взаимодействие молекулы НЬ с молекулами фибринмономера сильнее, чем с молекулами фибринполимеров, а с фибринполимерами, готовыми к агрегации, НЬ не взаимодействует.

Таким образом, НЬ влияет на'свертывание на уровне III фазы, интенсифицируя аутополимеризацию фибринмономеров преимущественно на ее начальных этапах, не действуя на заключительные.

Чтобы уточнить так ли это, провели опыт, в котором в раствор фибринмономера вносили НЬ. После инкубации смесь разбавляли, провоцируя самосборку, а после образования сгустка отделяли надосадок (6 ООО 30 мин), сравнивая концентрацию НЬ в нем с исходной. В других пробах НЬ тех же концентраций вносили в пробирки после завершения самосборки, повторяя те же проце-

дуры. В этом опыте устанавливали, связывается ли НЬ сформированным сгустком.

Таблица 7. Концентрация НЬ в надосадке после образования фибринового сгустка (концентрация фибринмономера - 2,2 мкМ; в скобках- снижение концентрации НЬ относительно созданной, %).

Концентрация гемоглобина (мкМ):

экспериментально обнаруживаемая в надосадке при внесении НЬ:

созданная до образования после образования

сгустка сгустка

1. 9,2 4,6 (50) 8,4 (8,7)

2. 3,8 3,4 (10) 3,8 (0,0)

3. 3,0 2,1 (30) 2,3 (23)

4. 2,3 2,0 (13) 2,16(6,1)

Установлено (табл. 7), что при формировании сгустка НЬ частично связывается с ним в степени, зависимой от исходной концентрации. Однако не весь связанный НЬ включился в сгусток при его формировании - часть НЬ сорбируется уже сформированным сгустком: при внесении НЬ после образования сгустка его концентрация в надосадке падает пропорционально исходной. Следовательно, изменение концентрации НЬ при формировании фибрина происходит и за счет включения НЬ в сгусток, и за счет связывания НЬ на поверхности сгустка (адсорбция). Разница между цифрами 2-й и 3-й колонок в (табл. 7) - связывание НЬ сгустком при его формировании. При пересчете оказалось, что на моль фибрина приходится от 0,07 до 0,58 моля НЬ при разных его исходных концентрациях. Следовательно образующиеся на ранних этапах ассоциаты фибрин-мономер-фибриноген распадаются при формировании полимерного фибрина.

Зависимость активирующего самосборку эффекта НЬ от ионной силы, рН, концентрации мочевины и температуры. Изменения ионной силы в экспериментах получали применением для разведения

- и-

фибринмономера боратного буфера. (0,075 М, рН 7,6) с разной концентрацией №С1. Эти растворы в контроле не содержали НЬ и содержали его в опытах (2 концентрации).

Рис. 4. Зависимость скорости самосборки в присутствии НЬ от ионной силы: 1 - без НЬ (контроль), 2 и 3 - с НЬ (конечная концентрацию 2,3 и 23 мкМ). Абсцисса - ионная сила, М; ордината -скорость самосборки (1/Т).

____Скорость самосборки в контро-

«07 «Я „у л, г

ле падает при росте ионной силы (рис. 4), так как при высокой ионной силе в агрегацию вовлекаются лишь более зрелые фибринполимеры /В.А.Белицер, Т.В.Варец-кая, 1975/. При низкой ионной силе активирующий эффект НЬ заметнее, чем при повышенной и не выявляется при концентрации №С1 0,28 М. Видимо, НЬ, взаимодействующий с мономерным фибрином при низкой ионной силе, утрачивает эту способность при ее повышении. Рост ионной силы ослабляет и электростатические взаимодействия между фибринмономерами, но в меньшей степени -самосборка продолжается и тогда, когда эффект НЬ уже не обнаруживается. Следовательно, НЬ взаимодействует с фибринмономерами за счет сил электростатического притяжения, которые в паре мономер-мономер значительнее, чем в паре мономер-НЬ.

Влияние рН на эффект НЬ изучали потому, что защелачивание среды изменяет самосборку подобно росту ионной силы (В.А.Белицер, Т.В.Варецкая, 1975). изменяли за счет 0,075 М боратного буфера.

«м.

401

t—'

Рис. 5. Зависимость скорости самосборки от рН: 1 - без НЬ (контроль), 2 и 3 в присутствии НЬ (конечная концентрация - 2,3 и 23 мкМ). Абсцисса - рН, ордината - скорость самосборки (1/Т).

Быстрее самосборка проходит при рН, близком к 7,5 (рис. 5). Максимальный эффект НЬ выявляется в кислой зоне, снижаясь при приближении к нейтральной и резко падая при основном рН. Это еще одно указание на роль электростатических сил во взаимодействии фибринмономер-НЬ.

Рис. 6. Влияние НЬ на скорость самосборки в присутствии мочевины: 1 - без НЬ (контроль), 2 и 3 - в присутствии НЬ (конечная концентрация 2,3 и 23 мкМ).

Разная скорость самосборки при нулевой и высокой (0,42 М) концентрации мочевины (около 31%) обусловлена тем, что в самосборке участвуют водородные связи мономер-мономер (АЖБышевский и др., 1987). При низких концентрациях мочевины (рис. 6) заметен активирующий эффект НЬ, ослабляющийся при росте концентрации мочевины от 0,14 до 0,25 М и не обнаруживающийся при более высоких концентрациях. Следовательно, во взаимодействии фибринмономер-НЬ участвуют водородные связи, причем, активнее, чем во взаимодействии мономер-мономер.

Для выявления роли гидрофобных взаимодействий в образовании ассоциатов фибринмономер-НЬ самосборку проводили без НЬ и в его присутствии при разных температурах.

ли Л

Рис. 7. Влияние НЬ на скорость самосборки в зависимости от температуры: 1 - скорость самосборки без НЬ (контроль), 1 и 2 - в' присутствии НЬ (конечная концентрация - 2,3 и 23 мкМ).

а

1Г « ¿.с

При повышении температуры от 2 до 25° С скорость самосборки росла почти линейно, а при дальнейшем

повышении температуры практически не изменялась. Аналогичные профили характеризуют влияние НЬ на самосборку при росте температуры: увеличение эффекта от 2 до 25° и постоянный эффект при повышении до 40°: при 15, 25, 37 и 40° отношение скорости самосборки в присутствии НЬ к скорости без него = 1,7, 2,0, 1,8 и 1,8 (большая концентрация НЬ). Следовательно, эффект НЬ на самосборку заметно не изменяется при росте температуры в пределах, допустимых в работе с белками, в то время как скорость самосборки повышается. Видимо, в самосборке гидрофобные взаимодействия существенны, а в образовании ассоциата фибрин-НЬ не участвуют.

Влияние гема и глобина на плазмокоагуляцию. В гемокоагуля-ционных системах, характеризующих общую свертывающую активность и активность отдельных прокоагулянтов, а также скорость самосборки, гем оказался индифферентным. Глобин же показывал эффект, аналогичный, но несколько более сильный, чем НЬ (табл.

На этом основании можно полагать, что НЬ активирует самосборку за счет белкового компонента молекулы.

О возможной роли свободного НЬ плазмы в плазмокоагуляции. В условиях физиологической нормы в крови циркулирует определенное количество свободного НЬ, концентрация которого в плазме колеблется от 0,08 до 0,78 мкмоль на л /Ю.В.Хмелевский,

7).

О.К.Усатенко 1987/, составляя менее 0,001 доли общего содержания НЬ в крови.

Таблица 7. Влияние глобина, выделенного из НЬ, на плазмоко-. агуляцию.

Исследуемые показатели Контроль Опыт

Время самосборки, с ■ 90,7 ±0,8 20,7±0,8 *

ВР, с 141,7±3,6 138,0±5,7

ТВ, с 26,5±0,7 23,0±0,0

ТПВ, с 17,0±0,0 17,0±0,0

АЧТВ, с 63,0±2,8 60,5±5,0

АВР, с 89,0±1,4 89,0±1,4

Плазма деф. по ф. XII 375,0±10,5 400,0±7,0

Плазма деф. по ф. XI 150,0+4,5 159,0±3,1

Плазма деф. по ф.УН 25,5±0,7 25,0±0,0

Плазма деф. по ф.Н не свертывается более 10 мин

Плазма деф. по ф. X 85,0+2,8 82,0±2,8

Плазма деф. по ф.У 145,0+0,7 135,0±7,1

Плазма деф. по ф.УШ 205,0+1,2 203,0±4,3

Плазма деф. по ф.1Х 275,0±3,5 254,0±7,1

Примечание: конечная концентрация глобина в тесте "Самосборка фибрина" - 0,78 мкМ, в других - 1,56 мкМ.

Используя плазму белых крыс и НЬ из эритроцитов крысы, мы изучили зависимость времени самосборки в плазме от добавок НЬ: нижняя граница концентрации вводимого извне НЬ была близка к максимальной физиологической, верхняя превышала ее в 25 раз. В контрольные пробы НЬ не вносили. Результаты опыта, (рис. 8) демонстрируют, как с ростом концентрации НЬ самосборка ускоряется.

Рис. 8. Зависимость времени самосборки в плазме крыс от концентрации дополнительно внесенного НЬ. Абсцисса - концентрация НЬ, ордината - время самосборки.

V с.«**

Еще более выражен эффект на плазме человека (рис. 9.).

Рис. 9. Зависимость времени самосборки плазме человека от концентрации дополнительно внесенного НЬ. Абсцисса - концентрация НЬ, ордината - время самосборки.

Известно, что ускорение самосборки сопровождается ростом ' " я общей свертывающей активности

/МХУмутбаева, 1985/. Видимо, рост уровня НЬ в крови должен активировать свертывание ¡n vivo. Для проверки этого предположения крысам вводили раствор гомологичного НЬ, оценивая общую свертывающую активность по активированному времени рекальци-фикации /АВР/, активность III фазы (ТВ), время самосборки фибрина и ретракцию сгустка. Изучены три дозы НЬ, при введении которых его концентрация в крови повышается в сравнительно небольшой степени (табл. 8).

Таблица 8. Влияние Hb на свертываемость in vivo.

Исследуемые Контроль Гемоглобин ввели в дозе (100 г массы):

показатели 10,5 мг 4,2 мг 2,1 мг

АВР, с 59,4±3,6 46,8±2,3* 52,6±2,7 58,0±3,9

ТВ, с 60,0±5,5 42,5±1,0* 61,3±1,1 64,0±0,7

Самосборка 21,4±0,8 10,8±0,6* 5,3±0,4* 19,7±0,4

фибрина, с

Ретракция, мл 1,2±0,07 1,7±0,08* 1,5±0,05* 1,3±0,05

(общий объем

за 180 мин)

Примечание: 1) в каждой группе 6 крыс; 2) в контроле вводили 0,14 М раствор №С1.

При наибольшей дозе (табл. 8) увеличились скорость самосборки, общая свертывающая активность, активность III фазы и

интенсивность ретракции. При дозе 4,2 мг/100 г активация самосборки и ретракции выявлялась, но рост общей свертывающей активности не обнаруживался. При наименьшей дозе сохранилась лишь тенденция к активации самосборки.

Видимо, заметный гемокоагуляционный сдвиг возникает при увеличении концентрации свободного НЬ, вызывающем превышение верхнего физиологического уровня (0,78 мкМ), примерно в 10 раз (при массе тела 100 г объем крови 5 мл; 10,5 мг : 5 = 2,1 мг/мл или 30,8 мкмоль; следовательно, концентрация НЬ в крови крысы повышается примерно в 30 раз). Столь заметное повышение концентрации свободного НЬ в крови вполне реально при ускоренном гемолизе, например, при иммуноконфликте, приводящем к агглютинации эритроцитов /А.М.С.Гафур, И.Е.Молоковская, 1983/.

Таблица 9. Изменение АВР, ТВ и самосборки фибрина in vivo после введения НЬ в кровоток (по 6 особей в группах).

Время отбора Исследуемые показатели, с

проб, мин АВР ТВ самосборка

Контроль 59,9±0,8 30,8±1,0 24,3±1,1

3 56,9±0,8* 28,0+0,4* 17,0±0,7*

30 91,7±1,1* 32,3±0,4 10,7±1,1*

60 87,7±1,5* 33,8±1,6* 13,7±1,1*

120 64,5±1,2* 31,3±1,4 16,0±0,7*

При исследовании свертываемости в динамике (табл. 9) выяснилось, что экспериментально повышенный уровень свободного НЬ тот час же повышает свертываемость за счет активации самосборки. По следующее изменение АВР, отражает снижение общей свертывающей активности и ее нормализацию к концу наблюдений - признак перехода в гипокоагулемию потребления.

Изучение толерантности крыс к тромбопластину (5 мг/100 г) на фоне повышенной концентрации свободного НЬ (10,5 мг/100 г)

обнаружило следующее: все контрольные крысы (20) выжили после провокации тромбиногенеза введением тромбопластина, из 20 крыс, которым тромбопластин ввели вместе с НЬ, погибли 9, т.е. 45%.

Тромбопластин при внутривенном введении ускоряет тромби-ногенез и вызывает гибель за счет внутрисосудистого тромбоза /Б.А.Кудряшов, 1975/. При недостаточно активной противосвер-тывающей реакции развивается гипокоагулемия потребления (А.Ш.Бышевский и др., 1991), что мы и наблюдали при введении тромбопластина на фоне НЬ.

В итоге отметим, что свободный НЬ, циркулирующий в кровотоке, не безразличен по отношению к гемокоагуляции: он активирует свертывание крови in vitro при концентрациях, превышающих верхнюю границу физиологического -уровня. Активация реализуется на уровне самосборки фибрина, обусловливаясь, по-видимому, электростатическими, а также водородными взаимодействиями между молекулами гемоглобина и мономерного (в меньшей степени полимерного) фибрина ранних стадий. Гидрофобные взаимодействия в этом не участвуют. Ответственен за активацию свертывания белковый компонент НЬ.

Вероятно, свободный НЬ плазмы крови играет некоторую роль в поддержании процесса самосборки активных форм фибрина, возникающих в ходе непрерывно осуществляющегося внутрисосудистого свертывания крови на низком уровне, являясь в этом смысле фактором, продолжающим на заключительной стадии свертывающего каскада эффект фрагментов клеточных мембран, катализирующих образование протромбиназы и тромбина. При патологических состояниях или воздействиях, ведущих к усиленному гемолизу свободный НЬ может рассматриваться как фактор, способствующий активации внутрисосудистого свертывания и участвующий в развитии ДВС, хотя с меньшей интенсивностью, чем тени эритроцитов.

Эта способность НЬ должна привлечь к себе внимание исследователей, изучающих возможность его инфузий в качестве переносчика кислорода.

ВЫВОДЫ

1. Свободный гемоглобин в концентрациях, сопоставимых с обнаруживающимися в кровотоке в условиях физиологической нормы, активирует свертывание крови в модельных гемокоагуляци-онных системах, содержащих все компоненты плазмокоагуляции, не замещая и не имитируя эффекта прокоагулянтов I и II фаз свертывания, а также тромбина.

2. Компонентом молекулы гемоглобина, ответственным за активацию свертывания крови, является белковая часть - глобин.

3. Эффект гемоглобина на гемокоагуляцию реализуется на уровне самосборки фибрина. Наиболее чувствительны к ■ воздействию гемоглобина этапы самосборки, составляющие около 1/2 всех долей неферментативной стадии коагуляционных превращений фибриногена.'

4. Степень ретракции сгустка фибрина, сформировавшегося в присутствии свободного гемоглобина, увеличивается, что не связано с изменением количества белка, вовлекаемого в сгусток, и не изменяет влияния на сгусток компонентов плазминовой системы.

5. При экзогенном повышении в крови концентрации свободного гемоглобина у животных развивается гиперкоагулемия с последующим переходом в гипокоагулемию. Наряду с гиперкоагулемией выявляется снижение толерантности к тромбогенному воздействию.

Список публикаций по теме диссертации

1. Ральченко И. В., Шаповалов П. Я. Влияние гемоглобина на плазмокоагуляцию / /Физиология и патология перекисного окис-

лення липндов, гемостаза и иммуногенеза: Тез. конф. молодых ученых. - Полтава, 1993. С. 205.

2. Бышевский А.Ш., Ральченко И.В., Шаповалов П.Я. Этап плазмокоагуляции, активируемый гемоглобином / / Там же. С. 146.

3. Бышевский А.Ш., Ральченко И.В., Шаповалов П.Я. О регуляции самосборки фибрина /Комплексное изучение медико-биологических проблем здоровья населения Тюменской области //Сборник научн. тр., посвященный 30 - летию Тюменского государственного медицинского института. Часть 2. - Тюмень. - 1993. -С. 103 - 105.

4. Ральченко И.В., Шаповалов П.Я. Влияние гемоглобина на самосборку мономерного фибрина . /Медицинская и социальная реабилитация больных и инвалидов//Сборник научных трудов региональной научно-практической конференции. Часть 3. - Тюмень. - 1994. - С. 167-168.

5. Шаповалов П.Я. /Влияние белкового компонента гемоглобина на гемокоагуляционные тесты. //Сборник научных трудов региональной научно-практической конференции. Часть 3. -Тюмень. - 1994. - С. 169.

6. Бышевский А.Ш., Ральченко И.В., Шаповалов П.Я. /Влияние гемоглобина на гемокоагуляционные тесты. //Сборник научных трудов региональной научно-практической конференции. Часть 3. - Тюмень. - 1994. - С. 171-172.

Ротапринт при АО НЙИПлесдрев . зак.№200" тираж ТОСТ экз. 26"Д2.94г.-