Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние шаперонина Groel и пептида β-амилоида1-42 на денатурацию и ренатурацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия
Автореферат диссертации по теме "Влияние шаперонина Groel и пептида β-амилоида1-42 на денатурацию и ренатурацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы"
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА
Кафедра биохимии Биологического факультета и отдел биохимии животной клетки Института физико-химической биологии им. А.II. Белозерского
На правах рукописи
НАЛЕТОВА ИРИНА НИКОЛАЕВНА
УДК 577.152.121
ВЛИЯНИЕ ШАПЕРОНИНА СЖОЕТ И ПЕПТИДА р-ЛМИЛОИДЛ1Ч2 НА ДЕНАТУРАЦИЮ И РЕНЛТУРАЦИЮ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ
03.00,04-биохимия
АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук
Москва-2006
Работа выполнена в отделе биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В. Ломоносова
Научный руководитель: доктор биологических наук,
профессор В.И. Муронец
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук, профессор Н.Н. Чернов
доктор биологических наук, А.Г. Катруха
Ведущая организация:
Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН
лр
Защита состоится "_30_" _октября_2006 г. в "(Б" часов на заседании Диссертационного совета Д.501.001.71 в Московском Государственном Университете им. М.В. Ломоносова по адресу: 119992, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.
Автореферат разослан у,, ; л Т ■_2006 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук - М.В. Медведева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Глинеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (NAD -зависимая фосфорилирующая D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа, КФ 1.2.1.12) катализирующая центральную стадию гликолиза - реакцию окисления глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата с образованием NADH, является одним из самых изучаемых ферментов гликолиза. Это связано не только с важностью изучения его основной гликолитической функции, но и с обнаружением многочисленных негликолитических активностей данного фермента в клетке. Важность разнообразных негликолитических функций ГАФД в регуляции функционирования клеток связана еще и с тем, что содержание этого фермента в тканях составляет 10-15% от общего количества растворимых белков. Очевидно, что из-за такой высокой концентрации ГАФД в клетке невозможно пренебрегать никакими сведениями об участии этого белка в тех или иных процессах. Особенно важно изучение роли ГАФД в агрегации белков, образовании амилоидных структур и функционировании системы шаперонов, так как в этих случаях первостепенное значение имеет именно концентрация белка в клетке. В нашей работе основное внимание было уделено исследованию денатурации, ренатурации и агрегации ГАФД и участию в этих процессах шаперонина и пептида р-амилоидаМ2- Мы полагаем, что именно благодаря очень высокой концентрации ГАФД в различных тканях этот белок является полноправным участником развития многих патологических процессов, обусловленных накоплением агрегированных белков и формированием амилоидных структур. Правильность такого предположения подтверждается постоянным появлением все новых фактов участия ГАФД в возникновении различных «конформационных болезней», прежде всего нейродсгенеративных заболеваний, при которых происходит накопление белковых агрегатов. К подобной патологии могут приводить нарушения функционирования шапероновой системы. В настоящей работе представлялось целесообразным изучить возможность блокирования шаперонов неправильно свернутыми формами ("misfolded forms") белков, полученными при окислении полипептидных цепей ГАФД перекисью водорода.
В последние годы накопилось много данных по исследованию участия ГАФД в нейродегеративных заболеваниях, в том числе о взаимодействии ГАФД с предшественником амилоидного белка (Tamaoka et al., 1996). Однако ничего не известно о взаимодействии ГАФД с пептидом р-амилоида,^ - ключевым
*Список сокращений: ГАФД - D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа, ГАФДо* -D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа окисленная НгОг, ЛДГ -лактатдегидрогеназа, р-амилоидмг - пептид р-амилоидац2, ДСК дифференциальная сканирующая калориметрия, ДСН - додецилсульфат натрия, ПААГ - полиакриламидный гель, Тм — температура, при которой наблюдается максимальное теплопогиощение препарата белка, 3-ФГА — глицеральдегид-3-фосфат, NFTs - нейрофибриллярные клубки.
фактором болезни Альцгеймера. Это определило второй раздел настоящего исследования. Таким образом, исследование участия ГАФД в развитии нейродегенеративных заболеваний тесно переплетается с изучением систем, защищающих ГАФД от агрегации — это прежде всего система шаперонов, и с проблемой взаимодействия ГАФД с пептидом р-амилоида^. Цели и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, основной целью нашей работы явилось изучение блокирования шаперонина неправильно свернутыми формами ГАФД, а также возможного участия глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в образовании амилоидных структур. В соответствии с целями были сформулированы задачи:
1. Изучить особенности взаимодействия различных ненативных форм ГАФД (денатурированной, денатурированной и окисленной, а также термоинактивированной) с шаперонином ОгоЕЬ.
2. Исследовать термодинамические параметры комплексов термоденатурированной ГАФД с шаперонином.
3. Изучить влияние ненативных форм ГАФД на шаперонин-зависимый фолдинг белков.
4. Изучить взаимодействие различных форм ГАФД с пептидом р-амилоидамг и его агрегатами.
5. Исследовать связывание пептида Р-амилоида^ с шаперонином вгоБЬ. Научная новизна и практическая значимость работы.
В настоящей работе впервые было продемонстрировано необратимое связывание шаперонина вгоБЬ с окисленной денатурированной формой глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, приводящее к блокированию СгоЕБЛЗгоЕЗ-зависимой реактивации неокисленной денатурированной ГАФД, но не лактатдегидрогеназы (ДДГ). Последнее свидетельствует о различных механизмах рефолдинга для ГАФД и ЛДГ. Предполагается, что денатурированные формы белков, неспособные достигнуть нативной конформации, могут взаимодействовать с шаперонами, блокировать их функционирование и приводить к развитию патологий сопровождающихся накоплением белковых агрегатов. Представлены данные по взаимодействию шаперонина СгоЕЬ и ГАФД с р-амилоидомщг- Они позволяют оценить действие последнего как на СгоЕЬ/СгоЕБ-зависимый рефолдинг фермента, так и на сам фермент, то есть на вовлечение шаперонов и ГАФД в развитие амилоидозов. Таким образом, установлена возможность непосредственного взаимодействия шаперонина, а также различных ненативных форм ГАФД с пептидом Р-амилоида1.42- Вероятно, в процессе формирования сенильных бляшек ненативные формы ГАФД, присутствующие в клетке, участвуют в этом процессе, а не связываются с уже сформированной бляшкой, то есть взаимодействие денатурированной формы ГАФД с пептидом Р-амилоидацг непосредственно вовлечено в образование амилоидных структур. Следовательно, соединения предотвращающие денатурацию ГАФД и/или препятствующие взаимодействию этой формы с пептидом Р-амилоидаь42 могут влиять на развитие болезни Альцгеймера. Таким образом, видится целесообразным использование ГАФД в качестве новой молекулярной
мишени для отбора факторов пригодных в перспективе для создания методов лечения нейродегенеративных заболеваний.
Апробация работы. Результаты работы были доложены на совместном заседании кафедры биохимии Биологического факультета МГУ и отдела биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского МГУ (2006), а также на Международной конференции студентов и аспирантов по фундаментальным наукам "Ломоносов" (Москва, 2003, 2004, 2005), Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics (Ukraine, Kyiv), International Conference "Chemistry, structure and function of biomolecules" (Byelorussia, Minsk), Third Moscow international congress "Biotechnology: State of the art and prospects of development" (Russia, Moscow), Conference devoted to 70th anniversary of V.P. Skulachev "Russian bioenergetics: from molecules to the cell" (Russia, Moscow), EMBO-FEBS WORKHOP on Biology of Molecular Chaperones. Heat Shock Proteins in Molecular Medicine Misfolding Disease and Cancer (Poland, Zakopane), International Conference "Biocatalysis-2005: Fundamentals and Application" (Russia, St. Peterburg-Kizhiy-Valaam), International alumni seminar on "Biotechnology and health" (Armenia, Erevan), Moscow international conference "Biotechnology and medicine" (Russia, Moscow). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 14 печатных работ, включая одну журнальную статью и статью в сборнике. Структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы. Объем работы составляет 151 стр., содержит 32 рисунка и 4 таблицы.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназу из скелетных мыши кролика выделяли по методу Скоупса (Scopes and Stoter, 1982) с последующей гельфильтрацией на сефадексе G-100. Белок хранили при 4°С в виде суспензии в полунасыщенном растворе (NH^SO^
Шаперонин GroEL и ко-шаперонин GroES выделяли по методике Корралеса и Фершта с некоторыми модификациями (Corrales and Fersht, 1996). GroEL и GroES хранили в 10 мМ калий фосфатном буфере, рН 7,5, при температуре -70°С.
Концентрацию белка определяли методом Бредфорд (Bradford, 1976) и спектрофотометрически по поглощению при длине волны 280 нм (А 0,1% для ГАФД 1,0; ЛДГ - 1,45; GroEL - 0,18; GroES - 0,14; иммуноглобулинов - 1,5). Определение концентрации антител и GroEL. иммобилизованных па сефарозе 4В проводили по модифицированному методу Бредфорд (Asryants et al, 1985). Определение ферментативной активности ГАФЛ проводили спектрофотометрически при 25°С, измеряя скорость образования NADH при 340 нм в ходе реакции окисления 3-ФГА. За единицу активности принимали
количество фермента, которое катализирует превращение 1 мкмоля NAD+ в минуту.
Денатурация и реактивация ГАФД или ЛДГ. Для денатурации ферменты инкубировали в 4 М гуанидин гидрохлориде в 10 мМ КН2РО4, рН 7,5,1 мМ ЭДТА, 2 мМ меркаптоэтанол. Реактивацию инициировали 50- или 100-кратным разбавлением денатурированного фермента. В случае шаперонин-зависимой реактивации добавляли 2 мМ АТР, 2 мМ Mg2+, 0,3-0,6 мкМ GroELu и 0,6-1,2 мкМ GroES7.
Окисление ГАФД перекисью водорода проводили в 4М гуанидин хлориде в присутствии 10-кратного молярного избытка перекиси водорода по отношению к содержанию сульфгидрильных групп, что приводило к окислению всех сульфгидрильных групп фермента.
Кинетику термоагрегаиии глииеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы измеряли в термостатируемой кювете на спектрофотометре "SIM Aminco DW - 2000" (США). За ходом термоагрегации белка следили по увеличению мутности раствора при 320 нм. Полученные результаты кинетических кривых агрегации обрабатывали при помощи компьютерной программы "ORIGIN 7.5". Анализ методом дифференииальной сканирующей калориметрии проводили на адиабатическом микрокалориметре DASM — 4 (Биоприбор, Пущино, Россия) в кювете объемом 0,47 мл при скорости сканирования 1°/мин. Электрофорез белков в ПААГ в денатурирующих условиях проводили по методу Лэммли (Laemmli, 1970). с использованием прибора для электрофореза "Mini-Protean 3" (BioRad).
Для иммобилизации антител и GroEL на сефарозе 4В вначале проводили активацию сефарозы 4В с помощью BrCN, а затем проводили иммобилизацию по разработанной в нашей лаборатории методике (Cherednikova et. al., 1981). Исследование образования и диссоциаиии комплексов GroEL-ГАФД при помощи иммобилизованных антител 6С5. К сефарозе с иммобилизованными антителами добавляли раствор, содержавший денатурированную ГАФД (в присутствии или отсутствии GroEL). Пробы инкубировали, отмывали, добавляли концентрированный буфер с ДСН и меркаптоэтанолом и нагревали. При такой обработке происходило разрушение нековалентных связей между антителами и денатурированной ГАФД, а также частично ковалентных связей между антителами и сефарозой. Сефарозу осаждали центрифугированием и анализировали супернатант при помощи ДСН-электрофореза в ПААГ.
Метод динамического светорассеяния (ДСР) использовали для определения среднего размера частиц, образующихся в процессе тепловой денатурации. Опыты были проведены на приборе «Zetasizer Nano-ZS» (Malvern Instruments, Malvern, Великобритания), используемом для измерения размеров частиц в диапазоне от 1 до 10000 нм.
Взаимодействие пептида Р-амилоида].42 и ГАФД изучалось при помощи метода поверхностного плазмонного резонанса с использованием установки Biacore X при 25°С. В работе использовали сенсорный чип СМ5. Обработка данных производилась при помощи программного пакета Biaevaluation v.3.1.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Основной задачей 1 части данной работы было изучение особенностей взаимодействия шаперонина GroEL с различными типами ненативных белков, которые могли бы присутствовать в клетке. Были изучены 3 типа ненативных белков - развернутые полипептидные цепи (аналог синтезирующейся полипептидной цепи), термоинактивированный белок и его агрегаты (аналоги продуктов, образующихся при тепловом шоке) и, наконец, развернутые полипептидные цепи, модифицированные путем окисления сульфгидрильных групп перекисью водорода. Мы предположили, что развернутые модифицированные полипептидные цепи сходны по своим свойствам с продуктами модификации синтезируемых на рибосоме полипептидов различными внутриклеточными реагентами. В тех случаях, когда модификация полипептидной цепи происходит до ее окончательного сворачивания, могут образовываться ненативные белковые структуры, так называемые "misfolded protems", которые в ряде случаев в принципе не могут свернуться в нативную конформацию. Именно развернутые модифицированные формы белка были основным объектом нашего исследования, так как главной нашей задачей был поиск таких форм ненативных ферментов, которые бы снижали эффективность функционирования шаперонина и, следовательно, могли бы быть их ингибиторами in vivo. Таким образом, мы изучали влияние шаперонина (свободного и в комплексе с модифицированными белкам) на сворачивание развернутых полипептидных цепей, на процессы термоденатурации и агрегации белков, а также исследовали свойства комплексов, образующихся при связывании шаперонина. В качестве главного объекта при оценке эффективности действия шаперонина GroEL мы использовали глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (ГАФД). Выбор этого белка был обусловлен, прежде всего, его высоким содержанием во всех типах клеток, а также сведениями об участии ГАФД в развитии целого ряда заболеваний, обусловленных накоплением в тканях белковых агрегатов. На основании этих сведений можно было предположить, что различные ненативные формы этого фермента (модифицированные, термоинактивированные и агрегированные) могут быть партнерами шаперонинов при их функционировании в клетке. Влияние окисленной развернутой ГАФД на GroEL-зависимое сворачивание денатурированной формы этого фермента. Для получения развернутых полипептидных цепей фермента мы инкубировали ГАФД в присутствии 4 М гуанидин гидрохлорида. Было показано, что в течение 15-20 минут белок полностью теряет свою активность. При этом происходило полное разворачивание белковой глобулы, так как в спектрах кругового дихроизма при измерении в коротковолновой области (220 нм) исчезали пики, характерные для вторичной структуры нативного фермента (данные не приведены). Для инициации рефолдинга денатурированный
Рис. 1. Шаперон-зависиман реактивация ГАФД, денатурированной в 4 М гуанидин гидрохлориде.
1. спонтанная реактивация ГАФД
2. реактивация ГАФД в присутствии 1 мкМ GroEL, 1 мкМ GroES
3. реактивация ГАФД в присутствии 1 мкМ GroEL, 2 мМ ЛТР, 2 мМ Mg2+
4. реактивация ГАФД в присутствии 1 мкМ GroEL, 1 мкМ GroES, 2 мМ АТР, 2 мМ Mg2+.
Время, мин.
фермент разводили буфером для реактивации и следили за восстановлением активности (рис. 1). Как видно из рисунка 1 (кривая 1), уровень спонтанной реактивации фермента составляет около 2%. Присутствие в среде только GroEL/GroES в отсутствие Mg-ATP (рис. 1, кривая 2) или же только шаперонина GroEL и Mg-ATP (рис. 1, кривая 3) полностью блокирует спонтанную реактивацию фермента. Такое блокирование свидетельствует, во-первых, о связывании денатурированной ГАФД шаперонином и, во-вторых, о том, что для шаперонин-зависимого рефолдинга необходимо одновременное присутствие GroEL, GroES и Mg-ATP, которое позволяет увеличить уровень реактивации приблизительно в 10 раз. Как было отмечено выше, в основе этой работы лежала гипотеза о том, что одной из возможных причин нарушений в работе шаперонов может быть их блокирование ненативными формами белков-субстратов, которые из-за неспособности в принципе достигнуть своего нативного состояния, препятствуют шаперонам в выполнении их функций. На основе этих предположений мы попытались получить подобную форму ГАФД из развернутого в гуанидингидрохлориде фермента,
20 40 60 80 100 120 140
Время, мин
Рис. 2. Шаперон-зависимая реактивация ГАФД денатурированной в
гуанидингидрохлориде в присутствии ГАФД, окисленной Н202 и денатурированной.
1. спонтанная реактивация ГАФД
2. реактивация ГАФД в присутствии ГАФДо*
3. реактивация ГАФД в присутствии 1 мкМ GroEL, 1 мкМ GroES, 2 мМ АТР, 2 мМ Mg2+.
4. реактивация ГАФД в присутствии ГАФДОТ 1 мкМ GroEL, 1 мкМ GroES, 2 мМ АТР, 2 мМ Mg2t.
окисленного перекисью водорода по всем 4 сульфгидрильным группам полипептидной цепи (ГАФД0Х). Как следует из приведенных на рисунке 2
результатов, присутствие ГАФДоХ не влияет на спонтанную ренатурацию ГАФД (рис. 2, кривые 1 и 2). Однако, при добавлении ГАФД<,Х к полной системе, содержащей СгоЕЬ, ОгоЕЗ и М§-АТР, в которой обычно эффективно происходит ОгоЕЬ-зависимая ренатурация ГЛФД (рис. 2, кривая 3), этот процесс полностью блокируется (рис. 2, кривая 4). Исходя из полученных результатов, можно было предположить, что окисление развернутой цепи ГАФД перекисью водорода приводит к образованию формы белка неспособной к формированию нативной структуры. При этом полученная форма ГАФДох, вероятно, может взаимодействовать с СгоЕЬ и ингибировать СгоЕЬ-СгоЕБ зависимый фолдинг белков. Для проверки этого предположения нами было исследовано связывание окисленной развернутой формы фермента с шаперонином и зависимость взаимодействия между двумя белками от присутствия 1^-АТР.
Выявление комплекса между разными формами денатурированной ГАФД и СгоЕЬ при помощи антител 6С5, иммобилизованных на сефарозе. Для
изучения взаимодействия между (ЗгоЕЬ и двумя формами денатурированной ГАФД (окисленной и немодифицированной) мы использовали иммобилизованные моноклональные антитела типа 6С5, которые специфически связывают только ненативные формы ГАФД, но не обладают сродством к нативным тетрамерам фермента. После инкубации иммобилизованных антител с растворами, содержащими ненативные формы ГАФД, можно легко извлекать и анализировать различные денатурированные или субъединичные формы фермента (Сг^опеуа & а1., 1999). Мы предположили, что если при совместной инкубации эквимолярных количеств
97,4
66,2
авйг
!
1. Денатурированная ГАФД (образец №1)
2. Антитела 6С5 иммобилизованные на сефарозе после инкубации с образцом №1
3. Денатурированная ГАФД в присутствии шаперонина (образец №3)
4. Антитела 6С5 иммобилизованные на сефарозе после инкубации с образцом №3
5. Денатурированная ГАФД в присутствии шаперонина и 1^-АТР (образец №5)
6. Антитела 6С5 иммобилизованные на сефарозе после инкубации с образцом №5
Рис. 3. Выявление комплекса между денатурированной ГАФД и СгоЕЬ при помощи антител 6С5, иммобилизованных на сефарозе 4В.
ОгоЕЬ
Тяжелые цепи антител ГАФД
Легкие
цепи
антител
45,0'
31,0
засеас
1 2 3 4
21,5
14,4
денатурированной формы ГЛФД с шаперонином вгоЕЬ между двумя этими белками будет образовываться прочный комплекс, то в растворе нельзя будет обнаружить свободный фермент. Следовательно, из такой смеси нельзя будет извлечь денатурированные формы ГАФД с помощью иммобилизованных антител 6С5. При распаде комплекса шаперонин-денатурированный фермент в растворе должны снова появляться полипептидные цепи, специфические связывающиеся с антителами. Полученные нами результаты представлены на рисунках 3 и 4. Прежде всего, мы изучили связывание с шаперонином развернутых в гуанидин гидрохлориде полипептидных цепей ГАФД, не подвергавшихся никакой модификации и способных к ренатурации в присутствии СгоЕЬ (рис. 3). Как видно из рисунка 3 (дорожка 2) после инкубации денатурированной ГАФД с антителами, иммобилизованными на сефарозе, на электрофореграмме присутствуют три белковых полосы: тяжелая и легкая цепи антител (соответственно 50 и 25 кДа) и полоса ГАФД (36 кДа). Таким образом, происходит связывание денатурированной ГАФД с антителами. Совсем другая ситуация наблюдается после предварительной инкубации денатурированной ГАФД с шаперонином с последующим добавлением к этой смеси иммобилизованных на сефарозе антител. В этом случае полоса, соответствующая ГАФД, отсутствует (рис. 3, дорожка 4), что говорит об образовании комплекса между денатурированным ферментом и шаперонином, вследствие чего становится невозможным взаимодействие денатурированного фермента с антителами. Однако этот комплекс может быть разрушен добавлением в инкубационную среду М§-АТР (рис. 3, дорожка 6).
1. ГАФДо* (образец №1)
2. Иммобилизованные антитела типа 6С5 после инкубации с образцом №1
3 ГАФДох в присутствии шаперонина (образец №3)
4. Иммобилизованные антитела типа 6С5 после инкубации с образцом №3
5. ГАФДо* в присутствии шаперошша и ]У^-АТР (образец №5)
6. Имобилизованные антитела типа 6С5 после инкубации с образцом №5
Рис. 4. Выявление комплекса между развернутой окисленной ГАФД и СгоЕЬ при помощи антител 6С5, иммобилизованных на сефарозе 4В.
Аналогичные эксперименты были поставлены для изучения взаимодействия с шаперонином развернутых полипептидных цепей ГАФД, окисленных по
СгоЕЬ
Тяжелые цепи антител
ГАФД
Легкие цепи антител
1 2
3 4 5 6
сульфгидрильным группам. Как видно из рисунка 4, после инкубации ГАФД0Х с антителами, также как и в случае с неокисленным ферментом, происходит ее связывание с антителами (рис. 4, дорожка 2). После предварительной инкубации ГАФДох с GroEL, а затем с антителами на электрофореграмме видны только полосы свободных антител (рис. 4, дорожка 4), что говорит о связывании ГАФДох шаперонином. В присутствии Mg2+H ATP наблюдается та же самая картина (рис. 4, дорожка 6). Отсутствие полосы ГАФД при добавлении в систему Mg2+ и АТР говорит о том, что ГАФД,Х не высвобождается в раствор и следовательно, необратимо связывается с шаперонином. Таким образом, окисление ГАФД, денатурированной в присутствие гуанидингидрохлорида, приводит к образованию белка, неспособного свернуться в нативную структуру, вследствие чего он не высвобождается из полости шаперонина в раствор даже в присутствии Mg2+ и АТР. Это наблюдение представляется нам весьма важным, так оно свидетельствует о необратимом характере связывания модифицированных развернутых форм белка с шаперонином, что, вероятно, и является причиной уменьшения эффективности их действия.
GroEL-зависимое сворачивание денатурированной лактатдегидрогеназы в присутствии окисленной развернутой ГАФД. Исходя из полученных выше данных, можно предположить, что увеличение содержания неправильно свернутых и денатурированных белков в клетке, ведет к блокированию ими шаперонов, т. е. к образованию прочных недиссоциирующих комплексов. Возникает вопрос, насколько широким может быть влияние этого процесса на способность системы шаперонов реактивировать другие белки?
Рис. 5. Шаперон-зависимая реактивация ЛДГ денатурированной в гуанидин гидрохлориде в присутствии окисленной ГЛФД.
1. спонтанная реактивация ЛДГ
2. реактивация ЛДГ в присутствии вгоЕЬ
3. реактивация ЛДГ в присутствии вгоБЬ, ОгоЕв, Ми-АТР
4. реактивация ЛДГ в присутствии ГАФДох СгоЕЦ ОгоЕБ, 1^-АТР
Время, мин
В качестве первого шага в этом направлении мы предприняли попытку изучения процесса реактивации другого фермента - лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в системе с окисленной ГАФД. Как видно из рисунка 5, только в присутствии всех компонентов, необходимых для шаперонин-зависимого сворачивания ЛДГ, наблюдается значительное увеличение уровня реактивации (кривая 3). Однако добавление ГАФДоХ не оказывает на шаперонин-зависимое сворачивание такого эффекта, который мы наблюдали
при изучении сворачивания ГАФД. Как следует из приведенных кривых, добавление развернутой окисленной ГАФД не препятствует реактивации ДЦГ (рис. 5, кривые 3 и 4). Этот факт может свидетельствовать о том, что шаперонин-зависимое сворачивание двух дегидрогеназ может осуществляться по разным механизмам. Действительно одна из них (ЛДГ) может сворачиваться при участии шаперонина, содержащего связанный неправильно свернутый белок. Однако такой блокированный шаперонин абсолютно не эффективен при сворачивании денатурированной ГАФД. В литературе существуют сведения о том, что шаперонин-зависимое сворачивание разных белков может осуществляться по разным механизмам. То есть, для сворачивания одних белков совершенно обязательной является стадия их проникновения в гидрофильную полость, формируемую GroEL и GroES, а для других вполне достаточным является связывание с апикальным доменом GroEL с последующим высвобождением в раствор. Такого рода наблюдения были сделаны при изучении механизма GroEL-зависимой реактивации аконитазы (Farr et al., 2003). Рефолдинг ЛДГ в данном случае происходит путем связывания развернутой молекулы ЛДГ с апикальным доменом GroEL и последующим высвобождением ЛДГ в раствор. Мы полагаем, что молекула ГАФДох инкапсулирована в гидрофобную камеру, формируемую GroEL и GroES. Гидролиз АТР и переход г^мс-кольца в состояние GroEL-GroES- ADP позволяет связаться молекуле ЛДГ с противоположным {транс-) кольцом до того как ГАФДох покинет ^мс-кольцо. Тем не менее, ГАФДох не высвобождается из комплекса и, по-видимому, снова связывается с апикальным доменом в г/иокольце. Вследствие этого, развернутая молекула ЛДГ не может быть инкапсулирована и остается связанной с апикальным доменом в транс-кольце. В конечном счете, связывание АТР и GroES в цис-кольце приводит к высвобождению ЛДГ из транс-кольца в раствор. Однако, как известно, ЛДГ является тетрамером, состоящим из четырех субъединиц по 35 кДа каждая. Следовательно, данный белок может сворачиваться по так называемому цис-механизму, однако в присутствии ГАФД0х, которая блокирует одно из колец, транс- механизм рефолдинга является единственным объяснением реактивации ЛДГ в подобных условиях. В то же время, как видно из рисунка 5, уровень шаперонин-зависимой реактивации ЛДГ практически не меняется как в отсутствие (рис. 5, кривая 3) так и в присутствии (рис. 5, кривая 4) ГАФД0х. Это означает, что ЛДГ может реактивироваться при помощи двух различных механизмов, в отличие от ГАФД так как для рефолдинга ГАФД необходимо ее инкапсулирование в камеру (рис. 1).
Термоинактивация и реактивация ГАФД в присутствии GroEL. В
следующей части данной работы мы обратились к исследованию влияния шаперонинов на процессы термоинативации и термоагрегации, то есть на те процессы, в которых и должны играть первостепенную роль «heat-shock-proteins». Влияние шаперонина на термоинактивацию и последующую реактивацию фермента мы исследовали, прежде всего, с целью изучения взаимодействия GroEL с разными формами белка. Кроме того, необходимо
было выяснить может ли восстанавливаться активность термоденатурированых форм фермента в присутствии шаперонина, как это происходило в случае ГАФД, развернутой в гуанидингидрохлориде. Как видно ■ из рисунка б, присутствие (ЗгоЕЬ незначительно влияет на процесс термоинактивации ГАФД. После термоденатурации раствор ГАФД, содержавший шаперонин (ЗгоЕЬ (рис. 6, кривые 2 и 3), охлаждали до 25 °С, после чего добавляли ОгоЕБ и 1^-АТР. Восстановления активности в данной системе не наблюдалось. При добавлении СгоЕЬ, вгоЕБ и Мц-АТР к ферменту, инактивированному в отсутствие шаперонина (рис. 6, кривая 1), также не происходило никакой реактивации фермента. Следовательно, термоденатурация ГАФД даже при относительно низких температурах приводит к необратимой инактивации фермента.
100 120
Рис. 6. Термоинактивация ГАФД.
1. ГАФД
2. ГАФД в присутствии СЗгоЕЬ (1:1)
3. ГАФД в присутствии ОгоЕЬ (1:0,5)
Время, мин
Исследование взаимодействия ГАФД и ЛДГ с (ЗгоЕЬ методом дифференциальной сканирующей калориметрии. На рисунке 7 представлены кривые теплопоглощения ГАФД и шаперонина вгоЕ!,, а также результаты экспериментов по совместному прогреванию этих двух белков. Как видно из рисунка 7, величина Тм для ГАФД без добавления шаперонина
Рис. 7. Кривые теплопоглощения ГАФД в СгоЕЬ.
Температура, °С
составляет 55°С (рис. 7, кривая 1). Свободный СгоЕЬ характеризуется величиной Тм 60,6° (рис. 7, кривая 2). В присутствии ГАФД наблюдаются существенные изменения термограммы шаперонина (рис. 7, кривые 2, 3). Параметры термоденатурации СгоЕЬ (энтальпия Д НСАЬ, Тм и ширина пика) в отсутствие и в присутствии различных концентраций ГАФД представлены в таблице 1.
Таблица 1. Параметры термоденатурации СгоЕЬ в отсутствие и в присутствии разных концентраций ГАФД и ЛДГ.
Образец ДНиАи Тм Ширина пика
(кДж/моль)
СгоЕЬ без добавок 2508 60,6 3,1
СгоЕЬ + ГАФД (1:1) 3613 63, б 2,1
СгоЕЬ + ГАФД (1:2) 3424 63,7 2,1
СгоЕЬ + ГАФД (1:3) 3238 63,7 2,2
СгоЕЬ+ЛДГ (1:4) 3167 64,0 2,3
Как видно из таблицы 1, похожие эффекты наблюдаются при прогревании шаперонина как в присутствие ГАФД, так и в присутствии ЛДГ. Это говорит о том, что при связывании двух разных термоденатурированных дегидрогеназ происходят сходные процессы при образовании комплекса между денатурированным ферментом и шаперонином. Эти наблюдения показывают, что первый этап взаимодействия денатурированных форм двух дегидрогеназ с шаперонином происходит сходным образом. Вероятно, на этом этапе происходит связывание денатурированных форм с апикальным доменом СгоЕЬ (в отсутствие СгоЕБ и М^-АТР). Описанная ранее разная эффективность реактивации двух дегидрогеназ нативным и блокированным СгоЕЬ, вероятно, обусловлена особенностями их взаимодействия с шаперонином на более поздних стадиях цикла его функционирования. Влияние СгоЕЬ на термоагрегацию ГАФД. В двух предыдущих разделах было доказано, что термоденатурированная ГАФД прочно связывается с шаперонином СгоЕЬ. Изучение роли такого связывания в процессе термоагрегации фермента было нашей следующей задачей. За ходом термоагрегации ГАФД в присутствии шаперонина и без его добавления следили по увеличению мутности раствора при 320 нм, а также по результатом динамического светорассеяния. На рисунке 8 (кривая 1) показана типичная кривая увеличения мутности раствора фермента во времени в ходе инкубации при 45 °С. По данным светорассеяния до агрегации размеры белковых частиц тетрамеров ГАФД составляли 12-13 нм, а в ходе агрегации существенно увеличивались до 800-1000 нм. При этом число частиц, соответствующих размеру тетрамера ГАФД, за 13 минут нагревания снижается до нуля, а крупные частицы начинают образовываться уже в первые минуты инкубации. До 10-ой минуты инкубации включительно практически все частицы имеют размер, близкий к размеру отдельной
СгоТХ
Время, мин
Рис. 8. Влияние ОгоЕЬ на термоагрегацию ГАФД при 45 "С.
1. ГАФД
2. ГАФД в присутствии СгоЕЬ
3. ГАФД, Через 70 минут инкубации был добавлен бгоЕЬ
молекулы тетрамера ГАФД, а затем начинается их быстрая агрегация. Вероятно, именно этим обусловлен лаг-период на кривой увеличения мутности (рис. 8). Отсутствие изменения мутности раствора при нагревании ГАФД в присутствие ОгоЕЬ свидетельствует о предотвращении агрегации фермента даже если на одну молекулу шаперонина приходится до двух мономеров ГАФД (рис. 8, кривая 2). Методом динамического светорассеяния при подобной постановке эксперимента не удается обнаружить в растворе крупных частиц (диаметром более 500 нм). В последующих экспериментах мы исследовали способность ОгоЕЬ разрушать уже образовавшиеся агрегаты.
Таблица 2. Изменение размеров белковых частиц при разрушении агрегатов ГАФД в присутвии шаперонина, определенные по параметрам динамического светорассеяния
(шаперонин был добавлен к агрегированной ГАФД после 70 мин ее инкубации при
№ № Время инкубации с СгоЕЬ1 г-ауе^е, ни2 1-ый пик, нм 2-ой пик, нм 3-ий пик, нм Интенсивность светорассеяния пиков, %
1-ый пик 2-ой пик 3-ий пик
1 66 без вгоБЬ 979,7 516,8 0 0 100 0 0
2 8 1094 427,9 0 0 100 0 0
3 И 1053 381,8 0 0 100 0 0
4 14 1091 386,2 0 0 100 0 0
5 18 1151 425 0 0 100 0 0
6 21 1036 695,8 15,95 0 94,21 5,791 0
7 25 1066 655 34,6 0 90,12 9,876 0
8 28 660 689,7 59,67 0 83,89 16,11 0
9 31 432,1 748,3 94,06 0 75,59 24,41 0
10 35 574,3 632,1 92,57 0 75,79 24,21 0
11 38 505,6 697,8 129,5 0 70,86 29,14 0
12 41 410,6 556 112,7 0 78,83 21,17 0
13 45 538,9 562,8 114,6 0 81,94 18,06 0
14 48 508,8 555,9 111,7 5560 88,34 10,45 1,203
15 71 696,8 683,2 85,09 0 93,66 6,345 0
16 116 без ОгоЕЬ 1020 426,4 0 0 100 0 0
Если в образец № 3 (рис. 8) после 70 минут инкубации при 45 °С добавляли ОгоЕЬ, то происходило понижение поглощения раствора вследствие разрушения уже имеющихся агрегатов при их взаимодействии с шаперонином (рис. 8, кривая 3). Снижение размера частиц происходило уже через 8 мин после добавления шаперонина (таблица 2). Через 20 мин инкубации в системе содержались в основном частицы размером менее 100 нм. Через 70 минут после начала инкубации с шаперонином система стабилизируется, и содержание частиц со средним диаметром 75 нм составляет 100%. Возможно, эти частицы представляют собой комплексы шаперонина с фрагментами агрегатов ГАФД. Таким образом, было показано, что добавление шаперонина к термоагрегированному ферменту вызывает разрушение крупных белковых агрегатов. После добавления К%-АТР как в пробу, которая содержала исходно шаперонин (рисунок % кривая 2), так и в пробу №3 (рисунок % кривая 3) после разрушения агрегатов шаперонином без понижения температуры не происходило увеличения мутности раствора. Это говорит о том, что высвобождения фермента из комплекса с шаперонином при 45 °С не происходит. Так же при инкубации данного образца в присутствии СггоЕЗ и М£-АТР ни восстановления активности фермента, ни изменения мутности раствора также не наблюдается (данные не представлены). Эти результаты еще раз свидетельствуют о том, что в случае ГАФД термоденатурированный белок связывается с шаперонином необратимо.
Взаимодействие пептида рчгмилоидас ГАФД и шаперонином СгоЕЬ.
Существует много наблюдений об участии глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в развитии различных нейродегенеративных заболеваний. Хотя механизм вовлечения ГАФД в индукцию этих болезней практически неизвестен, однако уже используются специфические лиганды для ГАФД в качестве лекарственного препарата при лечении болезни Паркинсона. Особенно противоречивы наблюдения о роли ГАФД в развитии болезни Альцгеймера. В следующей части работы мы исследовали взаимодействие пептида р-амилоидамг с различными формами ГАФД для того, чтобы выяснить, являются ли определенные формы фермента важным элементом при формировании амилоидных структур, или просто сорбируются на уже образованных белковых агрегатах. Второй аспект этой части работы посвящен изучению особенностей взаимодействия пептида р-амилоида^г с шаперонином СгоЕЬ. Мы попытались сравнить его действие на шаперонин с блокирующим влиянием неправильно свернутых форм белков, которые были объектом описанных выше экспериментов.
Изучение взаимодействия ГАФД с пептидом р-амилоида^г методом поверхностного плазменного резонанса. Для изучения реакции связывания пептида р-амилоида^ (Р-амилоидаМ2) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы мы использовали метод поверхностного плазмонного резонанса, который при помощи установки В1асоге позволяет оценить кинетические параметры взаимодействия макромолекул различной природы в режиме реального времени и без использования каких-либо меток для детектирования макромолекул. На первом этапе исследования на поверхности
сенсорного чипа (ячейка РС2) иммобилизовали пептид р-амилоида^- Ячейка РС1 была подвергнута идентичным процедурам, но раствор для иммобилизации не содержал белка. Затем обе ячейки промывали раствором, содержавшим денатурированную форму ГАФД. Оптический сигнал из ячейки БСЛ автоматически вычитался из сигнала РС2. Как видно из кинетической кривой (сенсограммы) (рис. 9) при пропускании денатурированной ГАФД через обе ячейки (контрольную и с иммобилизованным амилоидом) происходит увеличение резонансного сигнала, что свидетельствует о взаимодействии двух белков.
Прочность иммобилизованного комплекса денатурированная ГАФД-|3-амилоидм2 оценивали, промывая его различными буферными растворами: 100 мМ глицин рН 1,5; 100 мМ глицин, рН 2,0, 150 мМ NaCl; 10 мМ Tris-HCl, рН 11,0 и рН 12,0, 150 мМ NaCl. Уровень сигнала существенно не изменялся, то есть разрушения комплекса не происходило.
Взаимодействие между ГАФД и амилоидным пептидом было также исследовано в другой постановке. Мы использовали чип с пришитыми к нему антителами, выработанными против суммарных антител мыши. Через такой чип пропускали мышиные моноклональные антитела 6С5 к ненативной форме ГАФД. Затем в систему вводили денатурированную форму ГАФД, после чего пропускали раствор (3-амилоидаМ2- При использовании данной схемы мы вновь получили кривую характеризующую, специфическое взаимодействия ненативной ГАФД и р-амилоидаМ2 (данные не представлены). Данная схема эксперимента позволяет так же проверить наличие взаимодействия нативной формы ГАФД с пептидом р-амилоидамг- Для этого эксперимента вместо антител типа 6С5 мы использовали антитела типа 6С7, которые взаимодействуют с нативной формой ГАФД. При пропускании р-амилоидаМ2, через ячейку с иммобилизованным на антителах нативным ферментом, наблюдалось незначительное связывание около 1% от сигнала, который наблюдался в случае денатурированной ГАФД (данные не представлены). Следовательно, только ненативная форма ГАФД взаимодействует с р-амилоидоммг- Так же нам представлялось важным выяснить возможность взаимодействия между денатурированной формой ГАФД и агрегированным р-амилоидом^. Для этого мы использовали пептид р-амилоида^г.
Рис. 9. Взаимодействие денатурированной формы ГАФД с Р-амнлондомм2, иммобилизованном на чипе.
о
2QO
400 Время, с«к
600
образовавший агрегаты, которые были видны невооруженным глазом. Как и в вышеописанном эксперименте с денатурированной ГАФД, иммобилизованной на антителах 6С5, мы пропускали агрегированный пептид Р-амилоидамг против денатурированной ГАФД (рис. 10).
Э 230
ее
с
Я 200
пропусками* антител типа 6С!
промывание буфером НВЗ-ЕР
пропускание р-емилоида,.,,
400 воо 000
Время, сек
Рис. 10.
Взаимодействие агрегированного р-амилоидаиг с денатурированной формой ГАФД,
иммобилизованной на антителах 6С5.
В данном случае при введении агрегированного р-амилоида^ увеличения резонансного сигнала не происходило, что свидетельствует о невозможности связывания агрегированного р-амилоидамг и предварительно инактивированной ГАФД.
Влияние пептида амилоидана термоагрегацию ГАФД. Влияние {$-амилоидащг на термоагрегацию ГАФД изучали с помощью метода динамического светорассеяния. Кинетику образования агрегатов изучали при инкубации ГАФД в присутствии Р-амилоидамг и без него в термостатируемой кювете при при температуре 45°С.
Рис. 11. Влияние пептида р-амилоидаь 2 на термоагрегацию ГАФД.
1 1. ГАФД
2. ГАФД в присутствии Р-амилоида^;
О 10 2а 30 40 90 60 то
время,мин
На рисунке 11 представлены кривые характеризующие изменение гидродинамического радиуса частиц в процессе агрегации ГАФД (кривая 1), а также агрегации фермента при совместной инкубации с р-амилоидом при 45°С (кривая 2). при температуре 45°С ГАФД агрегирует медленно с выраженным лаг-периодом. В течение первых 10 минут инкубации
практически не образуется крупных агрегатов и почти все белковые частицы представляют собой индивидуальные тетрамеры размером около 10 нм (рис. 11, кривая 1). После добавления амилоида крупные белковые агрегаты появляются практически сразу, а затем размер белковых агрегатов остается более высоким в его присутствии практически в течение всего периода наблюдения. Можно предположить, что амилоид способен «сшивать» друг с другом инактивированные тетрамерные молекулы ГАФД еще до того, как они диссоциируют на мономеры. Именно этим можно объяснить исчезновение лаг-периода на кривой 2 (рис. 11).
Было также проверено влияние Р-амилоида^ на термоагрегацию предварительно полностью развернутых в 4 М гуанидин гидрохлориде молекул фермента. Как видно из рисунка 12, в присутствии р-амилоида^ происходит существенное ускорение помутнения раствора, а также увеличение достигаемого уровня мутности в процессе термоагрегации ГАФД (кривая 3) по сравнению с контролем (кривая 1).
/
7
V-»
Рис. 12. Термоагрегация р-амилоида|_42 и ГАФД, предварительно денатурированной в 4 М гуанидин гидрохлориде.
1 -ГАФД
2 - пептид Р-амилоидамг
3 - ГАФД в присутствии р-амилоидамг
Время, мин
На рисунке 13 представлены кривые характеризующие изменение гидродинамического радиуса частиц в процессе агрегации ГАФД, предварительно денатурированной в гуанидин гидрохлориде (рис. 13, кривая 1), а также агрегации фермента при совместной инкубации р-амилоида при 45°С (рис. 13, кривая 2). Как видно из приведенных кривых в течение первых десяти минут происходит быстрое увеличение размера частиц, причем в присутствии р-амилоида размер частиц выше. Затем увеличение размера замедляется, достигая постоянных значений. Размер белковых частиц также остается более высоким в присутствии р-амилоида. Если сравнить эти кривые с данными, приведенными на предыдущем рисунке, то следует обратить внимание на уменьшение мутности раствора после 10 минут инкубации. Вероятно, это связано с тем, что в этот период происходит увеличение
> 1300' £ 1200■ |[ 1100-
1400
2
Рис. 13. Термоагрегация р-амилоида^ и ГАФД, предварительно денатурированной в 4 М гуанидин гидрохлориде.
1000'
1. ГАФД
2. ГАФД в присутствии Р-амилоида^»
500
400
о
40
60
время, УИН
размера частиц не за счет присоединения к ним новых молекул белка, а за счет агрегации нескольких частиц друг с другом. Уменьшение общего числа частиц и приводит к уменьшению мутности, несмотря на увеличение их размера. Агрегация предварительно денатурированной ГАФД существенно отличается от денатурации исходно нативного фермента, для которого характерен лаг-период. Однако во обоих случаях в присутствии р-амилоида увеличивается размер белковых агрегатов. Вероятно, р-амилоид участвует в формировании белковых агрегатов в качестве дополнительного компонента, причем, как мы предполагаем, он может стимулировать слипание не только денатурированных субъединиц ГАФД, но и инактивированных тетрамеров фермента. Последнее заключение можно сделать на основании стимуляции р-амилоидом агрегации ГАФД даже в том случае, когда она еще не распадается на субъединицы.
Из представленных экспериментов видно, что р-амилоид^ взаимодействует не только с термоденатурированным ферментом, но и с полностью развернутым ферментом, и способен влиять на процесс термоагрегации ГАФД.
Влияние пептида р-амилоида¡^ па СгоЕЬ-зависимое сворачивание денатурированной формы ГАФД. Как было отмечено выше, второй аспект этой части работы посвящен изучению особенностей взаимодействия пептида Р-амилоида;.« с шаперонином СггоЕЬ. Мы попытались сравнить его действие на шаперонин с блокирующим влиянием неправильно свернутых форм белков, которые были объектом описанных выше экспериментов. Как видно из рисунка 14, в случае спонтанной реактивации фермента в присутствии р-амилоида1_42 происходит ее уменьшение (кривые 1, 2). Это наблюдение соответствует приведенным выше данным о взаимодействии р-амилоидамг с денатурированными формами ГАФД. Из данных представленных на рисунке 14 (кривые 1 и 2) следует, что образование достаточно прочного комплекса денатурированная ГАФД - р-амилоида исключает спонтанную реактивацию фермента. Отсюда возникает предположение, что р-амилоид может подавлять также и ОгоЕЬ-зависимую реактивацию ГАФД, препятствуя взаимодействию с шаперонином связанных с ним полипептидных цепей фермента. Однако этого не происходит (рис. 14, кривые 3 и 4).
Рис. 14. Спонтанная н СгоЕЬ-зависимая реактнвнция ГЛФД в присутствии амнлоидацг-
1. спонтанная реактивация ГАФД
2. в присутствии Р-амилоидам2
3. в присутствии ОгоЕЬ, СгоЕБ, М§-АТР
4. в присутствии р-амилоида^ СгоЕЬ, ОтоЕБ, М§-АТР
Следовательно, в присутствии шаперонина не происходит образования комплекса ГАФД и Р-амилоидамг. Наиболее вероятным представляется предположение, что р-амилоид1.42 , обладающий гидрофобными мотивами, характерными для ненативных белков, может связываться с шаперонином ОгоЕЬ. Эксперимент, представленный на рисунке 15, подтверждает это предположение.
Взаимодействие пептида р-амилоида¡^ с шаперонином СгоЕЬ. На
рисунке 15 представлена кинетика связывания ОгоЕЬ с р-амилоидом].,^. Как видно из графика, Р-амилоида связывается с шаперонином (кривая 2) в соотношении 1,5 моль Р-амилоида^/ 1 моль ОгоЕЬ. При инкубации р-амилоидаМ2 с контрольной сефарозой связывания не происходит (рис. 15, кривая 1). При исходном соотношении 0,58 мкМ р-амилоидамг и 0,24 мкМ ОгоЕЬ, количество амилоида, образовавшего комплекс с шаперонином составляет около 64%.
Рис. 15. Взаимодействие |к-амилоида1. 42 с ОгоЕЬ, иммобилизованным на сефарозе 4В
1. Р-амилоида инкубировали в присутствии контрольной сефарозы
2. р-амилоид1_42 инкубировали с СгоЕЬ, иммобилизованным на сефарозе
Время, мин
Таким образом, была проверена гипотеза о возможности взаимодействия р-амилоидамг с шаперонином ОгоЕЬ. Продемонстрировано, что ОгоЕЬ связывается с р-амилоидомм2> однако не препятствует шаперонин-зависимому рефолдингу ГАФД. Возможно, что связывание ГАФД и р-амилоида^г происходит на различных сайтах шаперонина или небольшая молекула р-амилоида^ не оказывает на его функционирование заметного эффекта.
Заключение
Таким образом, нами было показано, что шаперонин GroEL по разному связывается с тремя типами денатурированных форм ГАФД — развернутой в присутствии детергента, развернутой и окисленной по сульфгидрильным группам и термоденатурированной. Только в первом случае (развернутая в присутствии детергента форма ГАФД) может происходить диссоциация полипептидных цепей ГАФД из комплекса с шаперонином после добавления к нему Mg-ATP, а другие формы не выходят из состава комплекса даже в таких условиях. Естественно, что реактивация денатурированных форм в полной системе шаперонина (GroEL, GroES и Mg-ATP) наблюдается только при их получении с помощью детергентов. Термоинактивация ГАФД является необратимой даже в присутствии GroEL, GroES и Mg-ATP.
Блокирование окисленной денатурированной ГАФД0Х шаперонина в полной системе, в которой наблюдается GroEL-зависимая ренатурация фермента, полностью предотвращает шаперон-зависимую ренатурацию последней. Следовательно, при недостаточности антиоксидантной защиты или при избытке активных форм кислорода в клетке может происходить окисление вновь синтезированных полипептидных цепей белков и образование таких белковых форм, которые не способны свернуться в нативную структуру и поэтому необратимо связываются с шаперонами, делая их недоступными для субстратов. Таким образом, мы полагаем, что исследованная нами модель наиболее близка к ситуации, когда шаперонины участвуют в котрансляционном сворачивании синтезируемых белков в присутствии тех или иных агентов, способных модифицировать вновь синтезируемые полипептиды.
Сделанные нами наблюдения о влиянии шаперонина на термоденатурацию и термоагрегацию ГАФД в сочетании с литературными данными позволяют под новым углом взглянуть на проблему «heat-shock-response». Вероятно, синтез дополнительных количеств шаперонинов нужен для преодоления последствий теплового шока, но не для ренатурарации термоденатурированных белков, а для предотвращения их агрегации. Невысокая специфичность шаперонинов, связывающихся с разными типами ненативных белков делает их весьма уязвимым компонентом системы, осуществляющей поддержание клеточных белков в нативном состоянии, так как появление любых форм белков, необратимо блокирующих их функционирование, может оказывать разноплановое влияние на жизнедеятельность клетки.
Таким образом, можно предположить, что описанный выше механизм блокирования шаперонов может иметь значение в развитии тех патологий, которые сопровождаются накоплением неправильно свернутых форм белков с их последующей агрегацией (амилоидозы и другие «конформационные болезни»).
Вторая часть экспериментального исследования позволяет сделать следующее заключение. Р-Амилоид^ и денатурированная форма ГАФД
образуют комплекс. При этом р-амилоидм2 не взаимодействует с нативным ферментом и не влияет на его термоинактивацию. Также продемонстрировано, что Р-амилоидмг взаимодействует с термоденатурированной ГАФД и с ГАФД, предварительно денатурированной в гуанидин гидрохлориде, увеличивая размеры образующихся белковых агрегатов. Мы предполагаем, что ГАФД участвует в формировании амилоидных включений в клетке. Поскольку при патологическом синтезе пептида р-амилоида^, последний обогащается элементами р-структуры и начинает формировать агрегаты, то на этой стадии, а не только на стадии образования пептида р-амилоидаМ2 происходит взаимодействие денатурированной ГАФД с образовавшимся амилоидным включением. Продемонстрировано также, что ОгоЕЬ связывается с р-амилоидом^г, однако не препятствует шаперонин-зависимому рефолдингу ГАФД. Возможно, что связывание ГАФД и р-амилоида^г происходит на различных сайтах шаперонина или небольшая молекула Р-амилоида^ не оказывает на его функционирования заметного эффекта. Таким образом, представленные выше данные четко определяют спектр возможных взаимодействий р-амилоидащг, различных форм ГАФД и шаперонина и позволяют сделать новые предположения о роли ГАФД и шаперонов в развитии амилоидозов.
ВЫВОДЫ
1. Показано, что окисленная денатурированная форма глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы необратимо связывается с шаперонином ОгоЕЬ и полностью блокирует ОгоЕЬ/ОгоЕБ-зависимую реактивацию неокислеиного денатурированного фермента.
2. Показано, что окисленная денатурированная ГАФД, связанная с ОгоЕЬ, не препятствует ОгоЕЬ-зависимому сворачиванию лактатдегидрогеназы, что свидетельствует о различных механизмах шаперонин-зависимого рефолдинга для ГАФД и ЛДГ.
3. Показано, что ОгоЕЬ не влияет на термоинактивацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, но защищает фермент от термоагрегации, причем добавление ОгоЕЬ к уже агрегированному ферменту приводит к разрушению образовавшихся агрегатов.
4. С помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии обнаружено, что при взаимодействии с денатурированной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой увеличивается термостабильность ОгоЕЬ.
5. Показано, что пептид р-амилоидщ2 взаимодействует как с термоденатурированной ГАФД, увеличивая размеры образующихся белковых агрегатов, так и с ГАФД, денатурированной в гуанидингидрохлориде, блокируя ее спонтанную реактивацию. При этом р-амилоидмг не взаимодействует с нативным ферментом и не инактивирует его.
6. Показано, что пептид р-амилоида^ связывается с иммобилизованным на сефарозе шаперонином ОгоЕЬ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Налетова И.Н., Муронец В.И. (2003) Специфичность действа бактериального шаперонина GroEL в процессе сворачивания белко] различного происхождения. X Международная научная конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2003», Секци; Биология, Подсекция Биохимия, Россия, Москва, апрель 15-18, стр. 37.
2. Naletova I.N., Pleten' А.Р., Muronetz V.I. (2003) The influence of bacterial chaperonin GtoEL on the folding of homologous olygomeric proteins. Conference for young scientists, PhD students and students on molecular biology and genetics. Ukraine, Kyiv, September 25-27, p. 108,
3. Налетова И.Н., Шмальгаузен Е.В. (2004) Влияние бактериального шаперонина GroEL на термоинактивацию и тепловую агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. XI Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2004», Секция Биология, Подсекция Биохимия, Россия, Москва, апрель 12-15, стр. 116-117.
4. V. I. Muronetz, А. P. Pleten', I. N. Naletova, Е. V. Schmalhausen. (2004) Changes in the structure and the thermodynamic parameters of the chaperonin GroEL on its interaction with non-native protein forms. International Conference "Chemistry, structure and function of biomolecules". Byelorussia, Minsk, June 28-30, p. 81.
5. Naletova I. N., Schmalhausen E. V., Muronetz V. I. (2005) Increase in the efficiency of reactivation of enzymes in the presence of the additional cochaperonin of GroEl, new peroxyredoxine X. Third Moscow international congress "Biotechnology: State of the ait and prospects of development". Russia, Moscow, March 14-18, p. 203.
6. Irina N. Naletova, Irina N. Shalova, Luciano Saso, Elena V. Schmalhausen, Vladimir I, Muronetz. (2005) The role of oxidation of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase in the induction of apoptosis and in the formation of amyloid structures. Юбилейная конференция посвященная 70-летию основоположника российской школы биоэнергетики академика В.П. Скулачева. «Российская биоэнергетика: от молекул к клетке» Москва, МГУ, февраль 21-23.
7. Налетова И.Н., Шмальгаузен Е.В. (2005) Влияние шаперонина GroEL на тепловую агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы и на формирование амилоидных структур. XII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005», Секция Биология, Подсекция Биохимия, Россия, Москва, апрель 12-15, стр. 156-157.
8. Irina N. Naletova, Regina A. Asryants, Vladimir I. Muronetz (2005) The role of oxidation of glyceraldehydes-3-phospate dehydrogenase in the induction of apoptosis. EMBO - FEBS WORKHOP on Biology of Molecular Chaperones.
Heat Shock Proteins in Molecular Medicine Misfolding Disease and Cancer, Poland, Zakopane, 28 May - 2 June, p. 109.
9. Muronetz V.l., Polyakova O.V., Naletova I.N., Shalova I.N., Asryants R.A., Pleten' A.P., Saso L., Izumrudov V.A., Schmalhausen E.V. (2005) Mechanisms of protein denaturation and design of new inhibitors of protein aggregation for the treatment of condensation diseases. International Conference Biocatalysis -2005: Fundamentals and Application. Dedicated to 250th Anniversary of Moscow State University. St. Peterburg - Kizhiy - Valaam, Russian Federation, June 19-23, p. 58.
10. Vladimir I. Muronetz, Elena V. Schmalhausen, Oxana V. Poliakova, Irina N. Naletova, Irina N. Shalova, Luciano Saso. (2005) Amyloidoses and oxidative stress. International alumni seminar on "Biotechnology and health", Armenia, Erevan, October 18-21, p. 131-132.
11. Naletova I.N., Schmalhausen E.V, Saso L., Pleten' A.P., Muronetz V.I (2006) GAPDH as a promising target for a drug screening against neurodegenerative diseases. Moscow international conference "Biotechnology and medicine". Russia, Moscow, March 14-17, p. 195-195.
12. Naletova I.N., Muronetz V.l., Schmalhausen E.V. (2006) Unfolded, oxidized, and thermoinactivated forms of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase interact with the chaperonin GroEL in different ways. Biochim. Biophys. Acta. 1764:831-838.
13. K.A. Markossian, B.I. Kurganov, D.I. Levitsky, H.A. Khanova, N.A. Chebotareva, A.M. Samoilov, T.B. Eronina, N.V. Fedurkina, L.G. Mitskevich, A.V. Merem'yanin, S.Yu. Kleymenov, V.F. Makeeva, V.l. Muronetz, I.N. Naletova, I.N. Shalova, R.A. Asiyants, E.V. Shmalhausen, L. Saso, Yu.V. Panyukov, E.N. Dobrov, I.K. Yudin, A.C. Timofeeva, K.O. Muranov and M.A. Ostrovsky. (2006) Mechanism of the chaperone-like activity. Protein Folding: New Research. Nova Science Publishers, Inc., New York, USA, 91-174.
14. И.Н. Налетова, E.B. Шмальгаузен, И.Н. Шалова, А.П. Плетень, К. Цирюльников, Т. Эртль, В.И. Муронец (2006) Стимулирование агрегации белков нефункционирующим шаперонином GroEL. Биомедицинская химия, 52(5):518-524
Напечатано с готового оригинал-макета
Издательство ООО "МАКС Пресс" Лицензия ИД N 00510 от 01.12.99 г. Подписано к печати 14.09.2006 г. Формат 60x90 1/16. Усл.печ.л. 1,25. Тираж 100 экз. Заказ 612. Тел. 939-3890. Тел./факс 939-3891. 119992, ГСП-2, Москва, Ленинские горы, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2-й учебный корпус, 627 к.
Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Налетова, Ирина Николаевна
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.
ВВЕДЕНИЕ.
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.
Шапероны и их влияние на фолдинг белков.
Семейство шаперонинов \ lisp 60.
Шаперонины класса 1.
Структура шаперонина GroEL.
Структура кошаперонина GroES.
GroEL/GroES зависимый механизм сворачивания белков.
Изменения в структуре шаперонина при GroEL-зависимом фолдинге.
Взаимодействие полипептидов с шаперонином GroEL.
Цис- и транс-третичные комплексы GwEL-GroES-полипептид.
Симметричный комплекс.
Высвобождение ненативных форм белка из комплекса GroEL-GroES.
Взаимодействие GroEL с большими белками.
Взаимодействие шаперонов с прионовым белком.
Константы связывания белков с шаперонином.
Изучение связывания полипептидов с GroEL in vitro.
Шаперонины класса II.
Основные свойства и функции
D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы.
Механизм дегидрогеназной реакции.
Полифунщиональность ГАФД.
Образование и основные свойства пептида Р-амилоида^.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
Материалы.
Методы.
Методы выделения белков.
Выделение глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика.
Выделение шаперонина GroEL и ко-шаперонина GroES.
Аналитические методы.
Определение концентраций реагентов.
Определение ферментативной активности ГАФД.
Определение ферментативной активности ЛДГ.
Определение концентрации белка.
Денатурация ГАФД и ЛДГ.
Исследование реактивации ГАФД.
Исследование реактивации ЛДГ.
Окисление ГАФД перекисью водорода.
Титрование SH-групп ГАФД.
Кинетика термоагрегации ГАФД.
Дифференциальная сканирующая калориметрия.
Регистрация спектров кругового дихроизма.
Электрофорез белков ПААГв денатурирующих условиях.
Иммобилизация антител и GroEL на сефарозе 4В.
Исследование образования и диссоциации комплексов
GroEL-ГАФДпри помощи иммобилизованных антител 6С5.
Метод динамического лазерного светорассеивания.
Метод поверхностного плазмонного резонанса.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Влияние окисленной развернутой ГАФД на GroEL-зависимое сворачивание денатурированной формы этого фермента.
Выявление комплекса между разными формами денатурированной ГАФД и GroEL при помощи антител 6С5, иммобилизованных на сефарозе.
GwEL-зависгмое сворачивание денатурированной лактатдегидрогеназы в присутствии окисленной развернутой ГАФД.
Влияние шаперонина GroEL на процессы термоинактивации и термоагрегации ГАФД.
Термоинактивация и реактивация ГАФД в присутствии GroEL.
Исследование взаимодействия ГАФД и ЛДГс GroEL методом ДСК.
Влияние GroEL на термоагрегацию ГАФД.
Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние шаперонина Groel и пептида β-амилоида1-42 на денатурацию и ренатурацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы"
Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (NAD зависимая фосфорилирующая D-глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа, КФ 1.2.1.12) катализирующая центральную стадию гликолиза реакцию окисления глицеральдегид-3-фосфата до 1,3-дифосфоглицерата с образованием NADH, является одним из самых изучаемых ферментов гликолиза. Это связано не только с важностью изучения его основной гликолитической функции, но и с обнаружением многочисленных негликолитических активностей данного фермента в клетке. Существует также общирная информация об участии ГАФД в различных процессах просто за счет возникновения белок-белковых и белок-нуклеиновых взаимодействий без проявления какой-либо ферментативной активности. Важность разнообразных негликолитических функций ГАФД в регуляции функционирования клеток связана еще и с тем, что содержание этого фермента в тканях составляет 10-15% от общего количества растворимых концентрации ГАФД в белков. Очевидно, что из-за такой высокой клетке невозможно пренебрегать никакими сведениями об участии этого белка в тех или иных процессах. Особенно важно, на нащ взгляд, изучение роли ГАФД в агрегации белков, образовании амилоидных структур и функционировании системы щаперонов, так как в этих случаях первостепенное значение имеет именно концентрация белка в клетке. В нащей работе основное внимание было уделено исследованию денатурации, ренатурации и агрегации ГАФД и участию в этих процессах щаперонина и пептида Р-амилоида1.42. Мы полагаем, что именно благодаря очень высокой концентрации ГАФД в различных тканях этот белок является полноправным участником развития многих патологических процессов, обусловленных накоплением агрегированных белков и формированием амилоидных структур. Правильность такого предположения подтверждается постоянным появлением все новых фактов участия ГАФД в возникновении различных «конформационных болезней». Известно, что для того, чтобы вновь синтезируемый белок приобрел присущие ему функциональные строго свойства, он должен свернуться в пространстве определенпым структура образом. Хотя, нативная пространственная определяется аминокислотной последовательностью, за исключепием некоторых случаев она не может быть сформирована или восстановлена после повреждения без участия белковшаперонов, обеспечивающих их правильное сворачивание, фолдинг. Повреждения белков, вследствие химических модификаций, структурных повреждений, полученных из-за теплового или других стрессов, могут приводить к инактивации белков и к их агрегации. В нормальных условиях для предотвращения подобных нарушений функционирования клетки при увеличении внутриклеточной агрегации запускается «Heat-Shock ответ» и увеличивается синтез шаперонов. Существует ряд патологических состояний нейродегенеративных заболеваний, при которых происходит накопление неправильно свернутых белков, крупных белковых агрегатов. К подобной патологии могут приводить и нарушения функционирования шапероновой системы. Естественным является предположение, что одной из возможных причин нарушений в работе шаперонов может быть их перегрузка или блокирование такими поврежденными формами белков, которые из-за неспособности восстановить свое нативное состояние препятствуют щаперонам в выполнении их функций. Ранее в нашей лаборатории было исследовано взаимодействие шаперонина GroEL с различными формами фермента, неспособными к формированию нативной структуры: ГАФД из мышц кролика с SH- группами, модифицированными дитионитробензоатом, димерная форма ГАФД из Bacillus stearothermophilus с мутациями по Р-оси (Y46G/S48G и Y46G/R52G) О-Р-димеры и О-/?-днмеры: Y283V и Y283V/W84F. Было показано, что блокирование шаперонина GroEL происходило при добавлении химически модифицированных и мутантных форм ГАФД, неспособных сворачиваться в нативную конформацию (Polyakova et al., 2005). В настоящей работе представлялось целесообразным получить неправильно свернутые формы ("misfolded forms") белков в условиях более близких к реальным условиям функционирования тканей, в том числе при воздействии малых концентраций перекиси водорода, всегда присутствующих в клетках с аэробным метаболизмом. Такое исследование потребовало изучения некоторых элементов механизмов функционирования шаперонов и роли различных факторов, приводящих к нарушению этих функций. В последние годы накопилось много данных по исследованию участия ГАФД в нейродегеративных заболеваниях. Например, было продемонстрировано ее связывание с хантингтином и атаксином при спиноцеребральной атаксии и атаксином-3 при болезни Джозефа-Мохадо (Burke et. al., 1996; Cooper et. al., 1997). Так же продемонстрировано взаимодействие ГАФД с предщественником амилоидного белка (Tamaoka et. al., 1996), однако ничего не известно о взаимодействия ГАФД с пептидом рамилоида1.42 ключевым фактором болезни Альцгеймера. Это определило второй
Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Налетова, Ирина Николаевна
ВЫВОДЫ:
1. Показано, что окисленная денатурированная форма глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы необратимо связывается с шаперонином GroEL и полностью блокирует GroEL/GroES-зависимую реактивацию неокисленного денатурированного фермента.
2. Показано, что окисленная денатурированная ГАФД, связанная с GroEL, не препятствует GroEL-зависимому сворачиванию лактатдегидрогеназы, что свидетельствует о различных механизмах шаперонин-зависимого рефолдинга для ГАФД и ЛДГ.
3. Показано, что GroEL не влияет на термоинактивацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, но защищает фермент от термоагрегации, причем добавление GroEL к уже агрегированному ферменту приводит к разрушению образовавшихся агрегатов.
4. С помощью метода дифференциальной сканирующей калориметрии обнаружено, что при взаимодействии с денатурированной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой увеличивается термостабильность GroEL.
5. Показано, что пептид Р-амилоидм2 взаимодействует как с термоденатурированной ГАФД, увеличивая размеры образующихся белковых агрегатов, так и с ГАФД, денатурированной в гуанидингидрохлориде, блокируя ее спонтанную реактивацию. При этом р-амилоидмг не взаимодействует с нативным ферментом и не инактивирует его.
6. Показано, что пептид Р-амилоида].42 связывается с иммобилизованным на сефарозе шаперонином GroEL.
Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Налетова, Ирина Николаевна, Москва
1. Allison, W.S., Connors, M.J. (1970) The activation and inactivation of the acyl phosphatase activity of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Arch. Biochem. Biophys. 136:383-391
2. Anfinsen, C.B. (1973) Principles that govern the folding of protein chains. Science 181:223-230
3. Asryants, R.A., Duszenkova, I.V., Nagradova, N.K. (1985) Determination of Sepharose-bound protein with Coomassie brilliant blue G-250. Anal Biochem. 151:571-574
4. Azem, A., Diamant, S., Kessel, M., Weiss, C., Goloubinoff, P. (1995) The protein-folding activity of chaperonins correlates with the symmetric GroEL 14(GroES7)2 heterooligomer. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:1202112025
5. Azem, A., Kessel, M., Goloubinoff, P. (1994) Characterization of a functional GroEL 14(GroES7)2 chaperonin hetero-oligomer. Science. 265:653-656
6. Badcoe, I.G., Smith, C.J., Wood, S., Halsall, D.J., Holbrook, J.J., Lund, P., Clarke, A.R. (1991) Binding of a chaperonin to the folding intermediates of lactate dehydrogenase. Biochemistry. 30:9195-9200
7. Boisvert, D.C., Wang, J., Otwinowski, Z., Horwich, A.L., Sigler, P.B. (1996) The 2.4 A crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL complexed with ATP gamma S. Nat. Struct. Biol. 3:170-177
8. Bradford, M.M. (1976) Anal. Biochem. 72:248-254
9. Braig, K., Otwinowski, Z., Hegde, R., Boisvert, D.C., Joachimiak, A., Horwich, A.L., Sigler, P.B. (1994) The crystal structure of the bacterial chaperonin GroEL at 2.8 A. Nature. 371:578-586
10. Brunschier, R., Danner, M., Seckler, R. (1993) Interactions of phage P22 tailspike protein with GroE molecular chaperones during refolding in vitro. J. Biol. Chem. 268:2767-2772
11. Bukau, В., and Horwich, A.L. (1998) The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell. 92:351-366
12. Burke, J.R., Enghild, J.J., Martin, M.E., Jou, Y.S., Myers, R.M., Roses, A.D., Vance, J.M., Strittmatter, W.J. (1996) Huntingtin and DRPLA proteins selectively interact with the enzyme GAPDH. Nat. Med. 2:347-350
13. Burston, S.G., Weissman, J.S., Farr, G.W., Fenton, W.A., Horwich, A.L. (1996) Release of both native and non-native proteins from a cis-only GroEL ternary complex. Nature. 383:96-99
14. Carrell, R.W., Lomas, D.A. (1997) Conformational disease. Lancet. 350:134-138
15. Chandrasekhar, G.N., Tilly, K., Woolford, C., Hendrix, R., Georgopoulos, C. (1986) Purification and properties of the groES morphogenetic protein of Escherichia coli. J. Biol. Chem. 261:12414-12419
16. Chaudhuri, Т.К., Farr, G.W., Fenton, W.A., Rospert, S., Horwich, A.L. (2001) GroEL/GroES-mediated folding of a protein too large to be encapsulated. Cell. 107:235-246
17. Chen, S., Roseman, A.M., Hunter, A.S., Wood, S.P., Burston, S.G., Ranson, N.A., Clarke, A.R., Saibil, H.R. (1994) Location of a folding protein and shape changes in GroEL-GroES complexes imaged by cryo-electron microscopy. Nature. 371:261-264
18. Cherednikova, Т. V., Muronets, V.I., and Nagradova, N. K. (1981) Evidence for stabilizing effect of antibodies on the subunit association of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Mol. Immunol. 18:1055-1064
19. Collier, H.B. (1973) Letter: A note on the molar absorptivity of reduced Ellman's reagent, 3-carboxylato-4-nitro-thiophenolate. Anal. Biochem. 56:310-311
20. Corrales, F.J., Fersht, A.R. (1996) Kinetic significance of GroEL|4. (GroES7)2 complexes in molecular chaperone activity. Fold. Des. 1:265-273
21. Ditzel, L., Lowe, J., Stock, D., Stetter, K.O., Huber, H., Huber, R., Steinbacher, S. (1998) Crystal structure of the thermosome, the archaeal chaperonin and homolog of CCT. Cell. 93:125-138
22. Edenhofer, F., Rieger, R., Famulok, M., Wendler, W., Weiss, S., Winnacker, E.L. (1996) Prion protein PrPc interacts with molecular chaperones of the Hsp60 family. J. Virol. 70:4724-4728
23. EI Khoury, J., Hickman, S.E., Thomas, C.A., Cao, L., Silverstein, S.C., Loike, J.D. (1996) Scavenger receptor-mediated adhesion of microglia to beta-amyloid fibrils. Nature. 382:716-719
24. Ellis, J. (1987) Proteins as molecular chaperones. Nature 328:378-379
25. Ellis R.J. (1994) Molecular chaperones. Opening and closing the Anfinsen cage. Curr. Biol. 4:633-635
26. Ellis, R.J. (2000) Chaperone substrates inside the cell. Trends Biochem. Sci. 25:210-212
27. Ellman, G.L. (1959) Tissue sulfhydryl groups. Arch. Biochem. and Biophys. 82:70-77
28. Ewalt, K.L., Hendrick, J.P., Houry, W.A., Hartl, F.U. (1997) In vivo observation of polypeptide flux through the bacterial chaperonin system. Cell. 90:491-500
29. Farr, G.W., Fenton, W.A, Chaudhuri, Т.К., Clare, D.K., Saibil, H.R., Horwich, A.L. (2003) Folding with and without encapsulation by cis- and /гага-only GroEL-GroES complexes. EMBOJ. 22:3220-3230
30. Feldman, D.E. and Frydman J. (2000) Protein folding in vivo: the importance of molecular chaperones. Curr. Opin. Struct. Biol. 10:26-33
31. Fenton, W.A., Horwich, A.L. (1997) GroEL-mediated protein folding. Protein Sci. 6:743-760
32. Fenton, W.A., Kashi, Y., Furtak, K., and Horwich, A.L. (1994). Residues in chaperonin GroEL required for polypeptide binding and release. Nature. 371:614-619
33. Fenton, W.A., Weissman, J.S., and Horwich, A.L. (1996) Putting a lid on protein folding: structure and function of the co-chaperonin, GroES. Chem. Biol. 3:157-161
34. Frydman, J. (2001) Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones. Annu. Rev. Biochem. 70:603-647
35. Garavito, R.M, Rossmann, M.G, Argos, P, Eventoff, W. (1977) Convergence of active center geometries. Biochemistry 16:5065-5071
36. Gething, M.-J. and Sambrook, J. (1992) Protein folding in the cell. Nature 355:33-45
37. Goldberg, M.S., Zhang, J, Sondek, S„ Matthews, C.R, Fox, R.O, Horwich, A.L. (1997) Native-like structure of a protein-folding intermediate bound to the chaperonin GroEL. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 94:1080-1085
38. Goloubinoff, P, Christeller, J.T., Gatenby, A.A, and Lorimer, G.H. (1989) Reconstitution of active dimeric ribulose bisphosphate carboxylase from an unfoleded state depends on two chaperonin proteins and Mg-ATP. Nature 342:884-889
39. Good, P.F, Werner, P, Hsu, A, Olanow, C.W, Perl, D.P. (1996) Evidence of neuronal oxidative damage in Alzheimer's disease. Am. J. Pathol. 149:2128
40. Gordon, C.L, Sather, S.K, Casjens, S, King, J. (1994) Selective in vivo rescue by GroEL/ES of thermolabile folding intermediates to phage P22 structural proteins. J. Biol. Chem. 269:27941-27951
41. Gottesman, M.E, and Hendrickson, W.A. (2000) Protein folding and unfolding by Escherichia coli chaperones and chaperonins. Curr. Opin. Microbiol. 3:197-202
42. Gragerov, A, Nudler, E, Komissarova, N, Gaitanaris, G.A., Gottesman, M.E, Nikiforov, V. (1992) Cooperation of GroEL/GroES and DnaK/DnaJ heat shock proteins in preventing protein misfolding in Escherichia coli. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 89:10341-10344
43. Grantcharova,V, Aim, E.J, Baker, D, and Horwich, A.L. (2001) Mechanisms of protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol 11:70-82
44. Gray, Т.Е., Fersht, A.R. (1991) Cooperativity in ATP hydrolysis by GroEL is increased by GroES. FEBS Lett. 292:254-258
45. Grundke-Iqbal, I., Iqbal, K., Tung, Y., Quinlan, M., Wisniewski, H.M., Binder, L.I. (1986). Abnormal phosphorylation of the microtubule-associated protein tau in Alzheimer cytoskeletal pathology. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4913-4917
46. Gutsche, I., Essen, L.O., Baumeister, W. (1999) Group II chaperonins: new TRiC(k)s and turns of a protein folding machine. J Mol Biol. 293:295-312
47. Hardy, J., and Selkoe, D.J. (2002) The amyloid hypothesis of Alzheimer's disease: progress and problems on the road to therapeutics. Science 297:353356
48. Hartl, F.U. (1996) Molecular chaperones in cellular protein folding. Nature 381:571-579
49. SI. Harris, I., Meriwether, B.P., Park, J.H. (1963) Chemical nature of the catalytic sites in glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Nature. 198:154-157
50. Harris, J.I., Perham, R.N. (1968) Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase from pig muscle. Nature. 219:1025-1028
51. Hayer-Hartl, M.K., Martin, J., Hartl, F.U. (1995) Asymmetrical interaction of GroEL and GroES in the ATPase cycle of assisted protein folding. Science. 269:836-841
52. Hayer-Hartl, M.K., Weber, F., Hartl, F.U. (1996) Mechanism of chaperonin action: GroES binding and release can drive GroEL-mediated protein folding in the absence of ATP hydrolysis. EMBO J. 15:6111-6121
53. Hemmingsen, S.M., Woolford, C., van der Vies, S.M., Tilly, K., Dennis, D.T., Georgopoulos, C.P., Hendrix, R.W., and Ellis, R.J. (1988)
54. Homologous plant and bacterial proteins chaperone oligomeric protein assembly. Nature 333:330-334
55. Hilbich, C., Kisters-Woike, В., Reed, J., Masters, C.L., Beyreuther, K. (1991) Aggregation and secondary structure of synthetic amyloid b A4 peptides of Alzheimer's disease. J. Mol. Biol. 218:149-163
56. Hlodan, R., Tempst, P., Hartl, F.U. (1995) Binding of defined regions of a polypeptide to GroEL and its implications for chaperonin-mediated protein folding. Nat. Struct. Biol. 2:587-595
57. Horwich, A.L., and Willison, K.R. (1993) Protein folding in the cell: functions of two families of molecular chaperone, hsp 60 and TF55-TCP1. Philos. Trans. R. Soc. bond. B. Biol. Sci. 339:313-326
58. Houry, W.A., Frishman, D., Eckerskorn, C., Lottspeich, F., and Hartl, F.U. (1999) Identification of in vivo substrates of the chaperonin GroEL. Nature. 402:147-154
59. Huang, Y.S., Chuang, D.T. (1999) Mechanisms for GroEL/GroES-mediated folding of a large 86-kDa fusion polypeptide in vitro. J. Biol. Chem. 274:10405-10412
60. Hunt, J.F., Weaver, A.J., Landry, S.J., Gierasch, L., Deisenhofer, J. (1996) The crystal structure of the GroES co-chaperonin at 2.8 A resolution. Nature. 379:37-45
61. Itzhaki, L.S., Otzen, D.E., Fersht, A.R. (1995) Nature and consequences of GroEL-protein interactions. Biochemistry. 34:14581-14587
62. Jarrett, J.T., Berger, E.P., Lansbury, P.T. Jr. (1993) The C-terminus of the beta protein is critical in amyloidogenesis. Ann. NY Acad. Sci. 695:144-148
63. Jarrett, J.T., Berger, E.P., Lansbury, P.TJr. (1993) The carboxy terminus of the b amyloid protein is critical for the seeding of amyloid formation: implications for the pathogenesis of Alzheimer's disease. Biochemistr. 32:4693-4697
64. Kandror, O., Busconi, L., Sherman, M., Goldberg, A.L. (1994) Rapid degradation of an abnormal protein in Escherichia coli involves the chaperones GroEL and GroES. J. Biol. Chem. 269:23575-23582
65. Kannan, K., Jain, S.K. 2000 Oxidative stress and apoptosis. Pathophysiology. 7:153-163
66. Katsumata, K., Okazaki, A., Kuwajima, K. (1996) Effect of GroEL on the re-folding kinetics of alpha-lactalbumin. J. Mol. Biol. 258:827-838
67. Keller, J.N., Hanni, K.B., Markesbeiy, W.R. (2000) Impaired proteasome function in Alzheimer's disease. J. Neurochem. 75:436-439
68. Kitaguchi, N., Takahashi, Y., Tokushima, Y., Shiojiri, S. & Ito, H. (1988) Novel precursor of Alzheimer's disease amyloid protein shows protease inhibitory activity. Nature. 331:530-532
69. Kosik, K.S., Joachim, C.L., Selkoe, D.J. (1986) Microtubule-associated protein tau is a major antigenic component of paired helical filaments in Alzheimer's disease. Proc. atlAcad. Sci. USA. 83:4044-4048
70. Krebs, H., Rudolph, R., Jaenicke, R. (1979) Influence of coenzyme on the refolding and reassociation in vitro of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from yeast. Eur. J. Biochem. 100:359-364
71. Kang, J., Lemaire, H.G., Unterbeck, A., Salbaum, J.M., Masters, C.L., Grzeschik, K.H., Multhaup, G., Beyreuther, K., Muller-Hill, B. (1987) The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor. Nature. 325:733-736
72. Kurganov, B.I., Topchieva, I.N. (1998) Artificial chaperone-assisted refolding of proteins. Biochemistry (Mosc). 63:413-419
73. Laemmli K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227:680-685
74. Laminet, A.A., Ziegelhoffer, Т., Georgopoulos, C., Pluckthun, A. (1990) The Escherichia coli heat shock proteins GroEL and GroES modulate the folding of the beta-lactamase precursor. EMBOJ. 9:2315-2319
75. Langer, Т., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F.U. (1992) Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBOJ. 11:4757-4765
76. Landry, S.J., Zeilstra-Ryalls, J., Fayet, 0., Georgopoulos, C., Gierasch, L.M. (1993) Characterization of a functionally important mobile domain of GroES. Nature. 364:255-258
77. Lee, V.Y., Balin, B.J., Otvos, L. Jr., Trojanowski, J.Q. (1991) A68: a major subunit of paired helical filaments and derivatized forms of normal tau. Science 251:675-678
78. Llorca, О., Carrascosa, J.L., Valpuesta, J.M. (1996) Biochemical characterization of symmetric GroEL-GroES complexes. Evidence for a role in protein folding. J. Biol. Chem. 271:68-76
79. Ma, J., Karplus, M. (1998) The allosteric mechanism of the chaperonin GroEL: a dynamic analysis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 95:8502-8507
80. Martin, J., and Hartl, F.U. (1997) Chaperone-assisted protein folding. Curr. Opin. Struct. Biol 7:41-52
81. Marusich, E.I., Kurochkina, L.P., Mesyanzhinov, V.V. (1998) Chaperones in bacteriophage T4 assembly. Biochemistry (Moscow). 63:399-407
82. Mayhew, M., da Silva, A.C., Martin, J., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Hartl, F.U. (1996) Protein folding in the central cavity of the GroEL-GroES chaperonin complex. Nature. 379:420-426
83. Mazzola J.L., Sirover M.A. (2001) Reduction of glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase activity in Alzheimer's disease and in Huntington's disease fibroblasts. J. Neurochem, 76:442-449
84. Mazzola, J.L., Sirover, M.A. (2002) Alteration of intracellular structure and function of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: a common phenotype of neurodegenerative disorders? Neurotoxicology 23:603-609
85. McCampbell, A., Fischbeck, K.H. (2001) Polyglutamine and СВР: fatal attraction? Nat. Med. 7:528-530
86. Mendoza, J.A., Rogers, E., Lorimer, G.H., Horowitz, P.M. (1991) Chaperonins facilitate the in vitro folding of monomeric mitochondrial rhodanese. J. Biol. Chem. 266:13044-13049
87. Meyer, A.S., Gillespie, J.R., Walther, D., Millet, I.S., Doniach, S., Frydman, J. (2003) Closing the folding chamber of eukaryotic chaperonin requires the transition state of ATP hydrolysis. Cell 113:369-381
88. Meyer-Siegler, K., Mauro, D.J., Seal, G., Wurzer, J., deRiel, J.K., Sirover, M.A. (1991) A human nuclear uracil DNA glycosylase is the 37-kDa subunit of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. Proc. Natl. Acad. USA 88:8460-8464
89. Minton, A.P. (2000) A sense of frustration. Nurs Stand. 14:12-13
90. Missirlis, F, Phillips, J.P, Jackie, H. 2001 Cooperative action of antioxidant defense systems in Drosophila. Curr. Biol. 11:1272-1277
91. Mori, H, Takio, K, Ogawara, M., Selkoe, D.J. (1992) Mass spectrometry of purified amyloid beta protein in Alzheimer's disease. J. Biol Chem. 267:17082-17086
92. Nover, L, and Scharf, K.D. (1997) Heat stress proteins and transcription factors. Cell Mol Life Sci. 53:80-103
93. Parker, D.J., Allison, W.S. (1969) The mechanism of inactivation of glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase by tetrathionate, o-iodosobenzoate, and iodine monochloride. J. Biol Chem. 244:180-189
94. Peralta, D, Hartman, D.J, Hoogenraad, N.J, Hoj, P.B. (1994) Generation of a stable folding intermediate which can be rescued by the chaperonins GroEL and GroES. FEBSLett. 339:45-49
95. Perham R.N. (1969) The comparative structure of mammalian glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenases. Biochem. J. 111:17-21
96. Perrett, S, Zahn, R, Stenberg, G, Fersht, A.R. (1997) Importance of electrostatic interactions in the rapid binding of polypeptides to GroEL. J. Mol Biol 269:892-901
97. Prusiner, S.B., Scott, M.R., DeArmond, S.J., Cohen, F.E. (1998) Prion protein biology. Cell. 93:337-348
98. Ptitsyn, O.B. (1995) Molten globule and protein folding. Adv. Prot. Chem. 47:83-229
99. Privalov, P.L. (1979) Stability of proteins: small globular proteins. Adv. Prot. Chem. 33:167-241
100. Racker, I., Krimsky, J. (1952) The mechanism of oxidation of aldehydes by D- glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. J. Biol. Chem. 198:731-743
101. Roseman, A.M., Chen, S., White, H., Braig, K., Saibil, H.R. (1996) The chaperonin ATPase cycle: mechanism of allosteric switching and movements of substrate-binding domains in GroEL. Cell 87:241-251
102. Rudolph, R., Heider, I., Jaenicke, R. (1977) Mechanism of reactivation and refolding of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from yeast after denaturation and dissociation. Eur. J. Biochem. 81:563-570
103. Saibil, H. (2000) Molecular chaperones: containers and surfaces for folding, stabilising or unfolding proteins. Curr. Opin. Struct. Biol. 10:251-258
104. Schlesinger M.J. (1990) Heat shock proteins. J. Biol. Chem. 265:1211112114
105. Schmalhausen, E.V., Muronetz, V.I. (1997) An uncoupling of the processes of oxidation and phosphorylation in glycolysis. Biosci. Rep. 17:521:527
106. Schmalhausen, E.V., Muronetz, V.I., Nagradova, N.K. (1997) Rabbit muscle GAPDH: non-phosphorylating dehydrogenase activity induced by hydrogen peroxide. FEBS Lett. 414:247-252
107. Schmidt, M., Buchner, J. (1992) Interaction of GroE with an all-beta-protein. J. Biol. Chem. 267:16829-16833
108. Scopes, R.K., and Stoter, A. (1982) Purification of all glycolytic enzymes from one muscle extract. Methods Enzymol. 90 Pt E: 479-490
109. Selkoe, D.J. (1997) Alzheimer's disease: genotype, phenotype, and treatment. Science. 275:630-631
110. Shringarpure, R., Grune, Т., Davies, K.J. (2001) Protein oxidation and 20S proteasome-dependent proteolysis in mammalian cells. Cell Mol. Life Sci. 58:1442-1450
111. Sisodia, S.S., St.George-Hyslop, P.H. (2002) y-Secretase, Notch, A p and Alzheimer's disease: where do the presenilins fit in? Nat. Rev. Neurosci. 4:281-290
112. Skarzynski, Т., Moody, P.C., Wonacott, A.J. (1987) Structure of holo-glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase from Bacillus stearothermophilus at 1.8 A resolution. J. Mol. Biol. 193:171-187
113. Soto, C. (2001) Protein misfolding and disease; protein refolding and therapy. FEBSLett. 498:204-207
114. Spangfort, M.D., Surin, B.P., Oppentocht, J.E., Weibull, C., Carlemalm, E., Dixon, N.E., Svensson, L.A. (1993) Crystallization and preliminary X-ray investigation of the Escherichia coli molecular chaperone српбО (GroEL). FEBS Lett. 320:160-164
115. Sparrer, H., Lilie, H., Buchner, J. (1996) Dynamics of the GroEL-protein complex: effects of nucleotides and folding mutants. J. Mol. Biol. 258:74-87
116. Stockel, J., Hartl, F.U. (2001) Chaperonin-mediated de novo generation of prion protein aggregates. J. Mol. Biol. 313:861-872
117. Sturtevant, J. M. (1977) Heat capacity and entropy changes in processes involving proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74:2236-2240
118. Svensson, L.A., Surin, B.P., Dixon, N.E., Spangfort, M.D. (1994) The symmetry of Escherichia coli српбО (GroEL) determined by X-ray crystallography. J. Mol. Biol. 235:47-52
119. Tamaoka, A., Endoh, R., Shoji, S., Takahashi, H., Hirokawa, K., Teplow, D.B., Selkoe, D.J., Mori, H. (1996) Antibodies to amyloid beta protein (A beta) crossreact with glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase (GAPDH). Neurobiol. Aging. 17:405-414
120. Tatton N.A. (2000) Increased caspase 3 and Bax immunoreactivity accompany nuclear GAPDH translocation and neuronal apoptosis in Parkinson's disease. Exp. Neurol. 166:29-43
121. Tatzelt, J., Zuo, J., Voellmy, R., Scott, M., Hartl, U., Prusiner, S.B., Welch, W.J. (1995) Scrapie prions selectively modify the stress response in neuroblastoma cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92:2944-2948
122. Tian, G., Vainberg, I.E., Tap, W.D., Lewis, S.A., Cowan, N.J. (1995) Specificity in chaperonin-mediated protein folding. Nature. 375:250-253
123. Todd, M.J., Viitanen, P.V., Lorimer, G.H. (1994) Dynamics of the chaperonin ATPase cycle: implications for facilitated protein folding. Science. 265:659-666
124. Tohgi, H., Abe, Т., Yamazaki, K., Murata, Т., Ishizaki, E., Isobe, C. (1999) Alterations of 3-nitrotyrosine concentration in the cerebrospinal fluid during aging and in patients with Alzheimer's disease. Neurosci. Lett. 269:52-54
125. Trent, J.D., Nimmesgern, E., Wall, J.S., Hartl, F.-U. And Horwich, A.L. (1991) A molecular chaperone from a thermophilic archaebacterium is related to the eukaryotic protein t-complex polypeptide-1. Nature, 354:490493
126. Trentham D.R. (1971) Reactions of D-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase facilitated by oxidized nicotinamide-adenine dinucleotide. Biochem. J. 122:59-69
127. Verger, R., Sarda, L., and Desnuelle, P. (1971) On the sulfhydryl groups of porcine pancreatic lipase and their possible role in the activity of the enzyme. Biochim. Biophys. Acta. 242:580-592
128. Viitanen, P.V., Donaldson, G.K., Lorimer, G.H., Lubben, Т.Н., Gatenby, A.A. (1991) Complex interactions between the chaperonin 60 molecular chaperone and dihydrofolate reductase. Biochemistry. 30:9716-9723
129. Walters, C., Errington, N., Rowe, A.J., Harding, S.E. (2002) Hydrolysable ATP is a requirement for the correct interaction of molecular chaperonins српбО and cpnlO. Biochem. J. 364:849-855
130. Weissman, J.S., Hohl, C.M., Kovalenko, O., Kashi, Y., Chen, S., Braig, K„ Saibil, H.R., Fenton, W.A., Horwich, A.L. (1995) Mechanism of GroEL action: productive release of polypeptide from a sequestered position under GroES. Cell. 83:577-587
131. Weissman, J.S., Kashi, Y., Fenton, W.A., Horwich, A.L. (1994) GroEL-mediated protein folding proceeds by multiple rounds of binding and release of nonnative forms. Cell. 78:693-702
132. Weissman, J.S., Rye, H.S., Fenton, W.A., Beechem, J.M., Horwich, A.L. (1996) Characterization of the active intermediate of a GroEL-GroES-mediated protein folding reaction. Cell. 84:481-490
133. Welch, W.J., Gambetti, P. (1998) Chaperoning brain diseases. Nature. 392:23-24
134. Wickner, S., Maurizi, M.R., Gottesman, S. (1999) Posttranslational quality control: folding, refolding, and degrading proteins. Science. 286:1888-1893
135. Yatin, S.M., Varadarajan, S., Butterfield, D.A. (2000) Vitamin E prevents Alzheimer's amyloid beta-peptide (l-42)-induced neuronal protein oxidation and reactive oxygen species production. J. Alzheimers Dis. 2:123-131
136. Yifrach, O., Horovitz, A. (1995) Nested cooperativity in the ATPase activity of the oligomeric chaperonin GroEL. Biochemistry. 34:5303-5308
137. Yifrach, O., Horovitz, A. (1996) Allosteric control by ATP of non-folded protein binding to GroEL. J. Mol. Biol. 255:356-361
138. Yon, J.M. (1997) Protein folding: concepts and perspectives. Cell Mol Life Sci. 53:557-567; Ewbank, J.J., Creighton, Т.Е., Hayer-Hartl, M.K., Ulrich Hartl F. (1995) What is the molten globule? Nat Struct Biol. 2:10-11
139. Yura, Т., and Nakahigashi, K. (1999) Regulation of the heat-shock response. Curr. Opin. Microbiol. 2:153-158
140. Zimmerman, S.B., Minton, A.P. (1993) Macromolecular crowding: biochemical, biophysical, and physiological consequences. Annu. Rev. Biophys. Biomol. Struct. 22:27-65
-
Налетова, Ирина Николаевна
-
кандидата биологических наук
-
Москва, 2006
-
ВАК 03.00.04
- Влияние ненативных форм глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы на функционирование шаперонина GroEL
- Факторы, влияющие на взаимосвязь агрегации и каталитической активности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы
- Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа: роль в регуляции энергетического обмена, индукции апоптоза и агрегации белков
- Сравнительный анализ изоферментов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека
- Закономерности тепловой агрегации глобулярных олигомерных белков
