Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ изоферментов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека

ВАК РФ 03.01.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ изоферментов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека"

На правах рукописи

КУРАВСКИЙ Михаил Львович

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИЗОФЕРМЕНТОВ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА: ЭВОЛЮЦИЯ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

03.01.03 - молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 О ОКТ 2013

Москва-2013

005534669

Работа выполнена на факультете биоинженерии и биоинформатики Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университета имени М. В. Ломоносова»

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Гусев Николай Борисович, член-корреспондент РАН, доктор биологических наук, профессор, биологический факультет Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университета имени М. В. Ломоносова», кафедра биохимии, заведующий кафедрой.

Гельфанд Михаил Сергеевич, доктор биологических наук, кандидат физико-математических наук, профессор, учебно-научный центр "Биоинформатика" Федерального государственного бюджетного учреждения науки «Институт проблем передачи информации имени А. А. Харкевича» Российской академии наук, заведующий лабораторией.

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Институт биохимии имени А. Н. Баха» Российской академии наук

Защита состоится «2^» октября 2013 г. в часов °° минут на заседании Совета Д 501.001.76 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Московский государственный университета имени М. В. Ломоносова» по адресу: 119234, Москва, Ленинские горы, дом 1, стр. 12, биологический факультет, аудитория 389.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке МГУ имени М. В. Ломоносова (Фундаментальная библиотека, Ломоносовский проспект, 27, отдел диссертаций).

Автореферат разослан «]Ь» сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор

Муронец Владимир Израилевич

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования. В организме человека и других видов млекопитающих глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа представлена двумя тканеспецифическими изоферментами: соматическим (GAPD) и сперматозоидным (GAPDS). Их последовательности идентичны друг другу приблизительно на 70%. GAPD - хорошо изученный белок, который присутствует в клетках в очень высоких концентрациях. Исследования, проведенные в течение последних двух десятилетий, позволили установить, что GAPD вовлечена в большое количество негликолитических процессов (Seidler 2013).

GAPDS локализована в области цитоплазмы жгутика сперматозоида и прикреплена к цитоскелету (Krisfalusi et al. 2006). Ее функция заключается в снабжении энергией АТР моторного белка жгутика — динеина. Нарушения экспрессии GAPDS приводят к возникновению серьезных патологий, как правило, являющихся причиной возникновения бесплодия (Miki et al. 2004). Прочная связь между GAPDS и цитоскелетными белками препятствует выделению сперматозоидного изофермента и существенно усложняет его экспериментальное изучение. К моменту начала работы над диссертацией была опубликована лишь одна работа, посвященная выделению GAPDS из сперматозоидов и исследованию некоторых из ее энзиматических свойств, которые, как было показано, отличаются от свойств GAPD (Westhoff & Kamp 1997). Биоинформатический анализ последовательностей глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ млекопитающих позволил выдвинуть предположение о том, что для GAPDS, в отличие от GAPD, нехарактерно участие в негликолитических процессах (Куравский & Муронец 2007). Также было показано, что GAPDS может быть вовлечена в развитие раковых опухолей — меланом (Hoek et al. 2008) и болезни Альцгеймера (Wang et al. 2012).

Изучение GAPDS представляет огромный интерес как с точки зрения фундаментальной науки, так и с точки зрения перспектив практического применения полученных результатов. За время работы над диссертацией было опубликовано не менее 9 работ, посвященных этому белку (включая 5 работ, выполненных в нашей лаборатории). Соматический и сперматозоидный изоферменты глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы служат хорошей моделью для исследования функциональной дивергенции и тканеспецифической специализации дуплицированных генов. GAPDS является также и актуальным объектом для экспериментального изучения, так как играет важную роль в обеспечении подвижности сперматозоидов и, следовательно, фертильности.

Воздействие на вАРОБ может иметь практическое применение, связанное как с лечением бесплодия, так и с контрацепцией. Определенный интерес представляют и исследования экспрессии в А РОБ в соматических тканях при различных патологических состояниях (в первую очередь, в клетках меланом и при болезни Альцгеймера). Результаты исследований могут позволить лучше понять причины возникновения этих состояний и послужить основой для разработки новых средств диагностики и лечения.

Цели и задачи. Целью настоящей работы являлось изучение эволюции сперматозоидного и соматического изоферментов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека, получение растворимого и энзиматически активного препарата ОАРББ, изучение его физико-химических свойств и исследование экспрессии САРББ при заболеваниях. Были поставлены следующие задачи:

• анализ филогении генов, кодирующих изоферменты глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы;

• оценка давления естественного отбора, воздействующего на гены глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ;

• изучение процесса специализации вАРОБ в спермоспецифический белок;

• разработка методики выделения энзиматически активной ОАРББ из бактерий-продуцентов;

• исследование физико-химических свойств выделенного белка и его сравнение с соматическим изоферментом;

• получение поликлонапьных антител, которые могли бы быть использованы для детекции вАРОБ в сперматозоидах и других клетках человеческого организма;

• выявление ОАРББ в соматических клетках при различных патологиях и исследование возможной роли ее экспрессии.

Научная новизна и практическая значимость работы. Полученные результаты значительно расширяют круг имеющихся сведений об эволюции белкового семейства глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ. В частности, было показано, что ОАРОБ млекопитающих и ящериц специализировалась в спермоспецифический белок и приобрела дополнительный полипролиновый домен, необходимый для прикрепления к фиброзному слою жгутика сперматозоида. Выдвинуто предположение о том, что во взаимодействие с полипролиновым доменом вовлечены несколько различных белков цитоскелета, причем взаимодействие носит неспецифический характер. Установлено, что

экспрессия полипролинового домена GAPD-2 ящериц находится под контролем тканеспецифического альтернативного сплайсинга.

Была разработана методика получения рекомбинантной формы GAPDS, лишенной полипролинового домена (dN-GAPDS). Показано, что dN-GAPDS представляет собой адекватную модель для изучения энзиматических свойств полноразмерного белка и, в отличие от соматического изофермента, проявляет выраженную положительную кооперативность связывания NAD+. Анализ мутантных форм dN-GAPDS позволил установить, что важную роль в передаче структурных изменений, индуцируемых связыванием NAD+, играет ионная связь D311-H124.

Было показано, что dN-GAPDS существенно более устойчива к денатурации, чем GAPD. Результаты исследования мутантных форм dN-GAPDS свидетельствуют о том, что повышенная стабильность этого белка связана с наличием дополнительных остатков пролина Р157 и Р326, а также ионных связей Е96-Н394, E244-R320 и D311-H124. Выдвинуто предположение о возможной биологической роли повышенной стабильности GAPDS, которая может быть связана с отсутствием в зрелых сперматозоидов аппарата экспрессии генов.

Разработана методика получения поликлональных антител, узнающих либо только нативную, либо и нативную, и денатурированную конформации dN-GAPDS. Данная методика не требует какого-либо специального оборудования и может быть использована для получения антител против различных конформаций других белков. Такие антитела могут иметь широкий круг применения и являются хорошей альтернативой коммерческим препаратам моноклональных антител.

Было показано, что в некоторых линиях меланомных клеток происходит экспрессия GAPDS. Экспрессируемый белок локализован в цитоплазме, лишен полипролинового домена и формирует гетеротетрамерные комплексы с участием субъединиц GAPD. Выдвинуто предположение о том, что экспрессия GAPDS может повышать эффективность энергетического метаболизма меланомных клеток и препятствовать индукции апоптоза. Дальнейшее изучение экспрессии GAPDS в меланомных клетках может помочь в разработке новых методов диагностики и лечения этого заболевания.

Апробация работы. Результаты исследования были представлены и одобрены на совместном заседании отделов биохимии животной клетки и биокинетики НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского, а также на следующих конференциях: Biocatalysis-2013 (Москва, 2013), 22nd IUBMB & 37th FEBS Congress (Севилья, Испания, 2012) и Moscow Conference on Computational

Molecular Biology (Москва, 2011). Результаты работы были отмечены двумя дипломами победителю конкурса работ на присуждение грантов О. В. Дерипаска талантливым студентам, аспирантам и молодым ученым МГУ им. М. В. Ломоносова (2013,2012), стипендиями МГУ им. М. В. Ломоносова для молодых преподавателей и ученых, добившихся значительных результатов в преподавательской и научной деятельности (2012,2011), дипломом за 111-е место Всероссийского конкурса научно-исследовательских работ среди аспирантов в области биологических наук в рамках Всероссийского фестиваля науки (2011) и премией им. А. Д. Каулена за лучшую работу молодых ученых НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Белозерского (2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, включая 6 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ, и 3 материала международных конференций.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, разделов «Происхождение и эволюция гена GAPDS», «Экспериментальное исследование свойств рекомбинантной GAPDS» и «Экспрессия GAPDS в меланомных клетках», выводов и списка цитируемой литературы. Работа содержит 225 страниц машинописного текста, 19 таблиц и 57 рисунков. Список цитируемой литературы включает 416 отечественных и зарубежных источников.

Приняты следующие сокращения:

DLS — динамическое светорассеяние

dN-GAPDS - сперматозоидный изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы,

лишенный полипролинового домена

DSC - дифференциальная сканирующая калориметрия

ELISA — твердофазный иммуноферментный анализ

GAPD - соматический изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы GAPDS - сперматозоидный изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы GdnHCl - гуанидингидрохлорид

Ka/Ks - отношение частот синонимичных и несинонимичных замен

OD50 - концентрация антител, при которой оптическая плотность раствора, анализируемого методом ELISA, составляет 50% от максимального значения КМ-целлюлоза — карбоксиметилцеллюлоза

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ПРОИСХОЖДЕНИЕ И ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНА GAPDS1

Методы исследования

Выявление генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ. В исследовании, проведенном Стейнке и его коллегами (Steinke et al. 2006), изофермент GAPD-2 был выявлен только у некоторых представителей позвоночных. В связи с этим исследование эволюции генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ было ограничено позвоночными, а также другими вторичноротыми животными, не рассматривавшимися ранее.

Последовательности генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ были получены из баз данных Ensembl, Uniprot, Refseq и EST-подразделения GenBank (принадлежность найденных EST заявленным в их аннотациях организмам была подвергнута дополнительной проверке). В общей сложности было выявлено 197 генов, принадлежащих 131 виду живых организмов.

Реконструкция филогенетических деревьев проводилась на основе нуклеотидных последовательностей по байесовскому алгоритму, реализованному в программе MrBayes 3.1.2 (Altekar et al. 2004).

Анализ синтений. На первом этапе анализа было проведено выявление генов, расположенных по соседству с рассматриваемыми генами глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ. На втором этапе последовательности выявленных генов сравнивались друг с другом. Сходные последовательности свидетельствовали в пользу ортологичности тех генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ, вблизи которых они находятся.

Оценка воздействия естественного отбора. Для определения формы естественного отбора, воздействующего на различные участки последовательностей генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ, применялся метод вычисления Ka/Ks, совмещенный с методом скользящего окна и реализованный в пакете DnaSP 5.10 (Librado & Rozas 2009).

Для дальнейшего изучения воздействия естественного отбора использовались ветвь-специфические модели накопления мутаций, предусматривающие различные значения Ka/Ks для ветвей филогенетического дерева. Вычисления

1 Так как некоторые из ортологов вАРОЙ не являются спермоспецифическими белками, в данном разделе используются следующие обозначения: ОАРБ-1 — соматический изофермент, ОАРО-2 - сперматозоидный изофермент.

проводились с помощью пакета PAML (Yang 2007) в соответствии с методикой, описанной в работе (Hughes & Criscuolo 2008).

Результаты и их обсуждение

Последовательности генов глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназ. По два гена было выявлено у млекопитающих, ящериц, костистых рыб, хрящевых рыб, круглоротых и оболочников. По одному гену было обнаружено у птиц, рептилий (кроме ящериц), амфибий, осетровых рыб, ланцетника, иглокожих, Saccoglossus kowalevskii и Xenoturbella bocki. Для шпорцевой лягушки, асцидии и некоторых видов костистых рыб было показано наличие трех генов.

Тканеспецифическая экспрессия полипролинового домена. Помимо GAPD-2 млекопитающих, полипролиновый домен был выявлен в составе одного из изоферментов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы ящериц. В транскриптах, выделенных из соматических тканей ящерицы Anolis carolinensis, отсутствовал фрагмент, кодирующий 21 первых аминокислотных остатков полипролинового домена. Следующий возможный старт-кодон находился сразу после участка, кодирующего оставшуюся часть последовательности полипролинового домена. Таким образом, в соматических тканях трансляция мРНК этого изофермента должна начинаться со второго старт-кодона, а образующийся белковый продукт будет лишен полипролинового домена. В полноразмерных транскриптах, выделенных из семенников A. carolinensis, трансляция должна начинаться с первого старт-кодона. Наличие двух вариантов транскриптов, вероятно, является следствием тканеспецифического альтернативного сплайсинга.

Филогения генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ. По сравнению с предыдущим исследованием (Steinke et al. 2006), в настоящей работе было проанализировано существенно большее количество последовательностей. Это позволило повысить точность филогенетического анализа. Исходя из топологии реконструированного филогенетического дерева (рис. 1), гены глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ позвоночных животных могут быть разделены на две группы, одна из которых включает в себя GAPD-1 млекопитающих, а другая — GAPD-2. Дупликация, положившая начало этим группам, случилась в ходе ранней эволюции вторичноротых животных и, по-видимому, не связана ни с одной из двух полногеномных дупликаций, специфических для позвоночных.

В пределах группы GAPD-1 обнаруживается ряд независимых дупликаций, дающих начало дополнительным изоферментам костистых рыб, круглоротых, шпорцевой лягушки и асцидии. Дополнительные изоферменты шпорцевой

лягушки и асцидии, выявленные путем проведения поиска по транскриптому, по-видимому, являются аллельными вариантами одного и того же гена.

Рептилии, ЙДРО!

Бесхвостые амфибии

Костистые рыбы, йАРО-1

Хрящевыерыбы, САРО-1 Миноги

Иглокожие

Млекопитающие, 0АРР-2

Хрящевые рыбы, САРО-2 Костистые рыбы, САРСА2

Членистоногие

Плоские черви (аутфупги)

Рис. 1. Филогенетическое дерево генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ. Пунктирными линиями обозначены ветви, имеющие аномально большую длину (более 0,75) и, по-видимому, соответствующие псевдогенам. Некоторые детали топологии не согласуются с общепринятыми представлениями об эволюции, что может быть связано с высокой консервативностью рассматриваемых последовательностей.

Ветвь группы ОАРО-2 поддерживается низким значением апостериорной вероятности (77%). Она разделяется на кладу САРО-2 позвоночных животных, и кладу, включающую в себя единственный изофермент ланцетника, иглокожих,

5. ко^а1е\^ки и X. ЪосИ. Низкое значение апостериорной вероятности говорит о том, что объединение этих двух клад друг с другом является спорным и нуждается в дополнительной проверке.

Результаты анализа синтений в целом согласуются с результатами реконструкции филогенетического дерева. Они позволяют уточнить происхождение генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ ланцетника и асцидии, синтеничных генам клады САРО-1, а также свидетельствуют в пользу того, что третий изофермент костистых рыб образовался вследствие полногеномной дупликации.

Оценка давления естественного отбора. Все проанализированные последовательности глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ находятся под воздействием стабилизирующего отбора. Единственным исключением является участок гена ОАРБ-2 млекопитающих, кодирующий полипролиновый домен. Значение Ка/К3, вычисленное для этого участка, близко к единице.

Для дальнейшего изучения воздействия естественного отбора были привлечены ветвь-специфические модели. Их тестирование проводилось на выравниваниях последовательностей ОАРБ-1 и ОАРБ-2 млекопитающих, САРБ-1, ОАРБ-2 и САРБ-З костистых рыб, а также единственного изофермента насекомых. Значения функции правдоподобия, вычисленные в процессе тестирования моделей, приведены в табл. 1.

Табл. 1. Результаты тестирования ветвь-специфических моделей.

Модель Ка/К, Логарифм функции правдоподобия

Ш 0.06369 (все последовательности) -22221,41

Я2т 0.05363 (кроме ОАРО-2 млекопитающих) 0.12179 (ОАРО-2 млекопитающих) -22179,54

Я21 0.07405 (кроме ОАРО насекомых) 0.02642 (ОАРО насекомых) -22177,37

ЯЗ 0.06263 (кроме перечисленных ниже) 0.12186 (ОАРО-2 млекопитающих) 0.02567 (ОАРО насекомых) -22150,49

Я6 0.06672 (ОАРО-1 млекопитающих) 0.12187 (ОАРО-2 млекопитающих) 0.05218 (ОАРО-1 костистых рыб) 0.07492 (ОАРО-2 костистых рыб) 0.06218 (вАРО-З костистых рыб) 0.02593 (ОАРР насекомых) -22147,12

Полученные результаты свидетельствуют о том, что давление естественного отбора на последовательности GAPD-1 млекопитающих и всех изоферментов костистых рыб приблизительно одинаково (модель R3 не обладает статистически значимым преимуществом по сравнению с моделью R6). В то же время, давление отбора на GAPD-2 млекопитающих ослаблено, а на глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу насекомых усилено (модель R3 значимо лучше описывает наблюдаемые данные, чем Rl, R2m и R2i).

Известно, что если два белка, экспрессирующиеся в одних и тех же тканях, выполняют одни и те же функции, то один из них оказывается свободным от давления естественного отбора, и кодирующий его ген со временем деградирует (Lynch & Force 2000). У млекопитающих и ящериц GAPD-2 специализировалась в спермоспецифический белок, тем самым, избежав утраты. Оба изофермента костистых рыб экспрессируются в одних и тех же соматических тканях, при этом воздействующее на них давление естественного отбора ослаблено по сравнению с исходной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназой. Это согласуется с концепцией дупликации генов, предложенной Хьюзом (Hughes 1994): после дупликации гена исходного многофункционального белка каждая из копий специализируется и прекращает выполнять некоторые из первоначальных функций. Так как аминокислотные остатки активного центра сохранились в составе обоих изоферментов, GAPD-1 и GAPD-2 рыб могли специализироваться в направлении участия в различных негликолитических процессах.

Специализация GAPD-2 в спермоспецифический белок. Было показано, что GAPD-2 ящериц не только является спермоспецифическим белком, но и обладает полипролиновым доменом, не встречающимся в составе никаких других изоферментов кроме GAPD-2 млекопитающих. Так как полипролиновый домен служит для прикрепления к фиброзному слою жгутика сперматозоида, взаимосвязь между его наличием и тканеспецифичностью экспрессии GAPD-2 является очевидной. Остатки пролина в составе выявленных последовательностей полипролиновых доменов млекопитающих и ящериц сгруппированы в мотивы Рп и (РХ)П. Наличие двух мотивов позволяет предположить, что полипролиновый взаимодействует не менее чем с двумя различными белками фиброзного слоя. На неспецифичность этих взаимодействий указывают значения Ka/Ks, близкие к единице.

Давление естественного отбора на GAPD-2 млекопитающих ослаблено по сравнению с GAPD-1 млекопитающих и изоферментами глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы костистых рыб. Это может быть связано с утратой некоторых из негликолитических функций, которые были бы бесполезными для сперматозоидов.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ GAPDS

Методы исследования

Выделение dN-GAPDS. Экспрессия рекомбинантной dN-GAPDS проводилась в клетках Е. coli, содержащих плазмиду со вставкой соответствующего фрагмента кДНК человеческой GAPDS. Очистка dN-GAPDS осуществлялась методом ионообменной хроматографии на колонке, заполненной КМ-целлюлозой. Выделенный белок хранился при 4 °С в виде суспензии в полунасыщенном растворе сульфата аммония (pH 8,0).

Выделение мутантных форм dN-GAPDS. Введение мутаций в последовательность плазмидной ДНК, кодирующей dN-GAPDS, было проведено по методу QuikChange. Очистка мутантных форм E96Q, PI IIA, Р157А и Р326А проводилась по той же методике, что и очистка dN-GAPDS дикого типа. Для очистки мутантных форм E244Q и D311N использовался метод, основанный на фракционировании сульфатом аммония: фракция 50-60% подвергалась ряду последовательных перекристаллизаций до тех пор, пока значение удельной энзиматической активности не выходили на плато.

Выделение GAPD из скелетных мышц кролика осуществлялось по методу, предложенному Скоупсом, с последующей гель-фильтрацией (Hill et al. 1975).

Определение концентраций белков проводилось спектрофотометрически при длине волны 280 нм. Для определения концентрации разбавленных белковых растворов применялся колориметрический метод Брэдфорд (Bradford 1976).

Определение энзиматических активностей GAPD и dN-GAPDS проводилось спектрофотометрически по скорости образования NADH. Реакция инициировалась добавлением глицеральдегид-3-фосфата, после чего регистрировалась скорость образования NADH на начальном участке.

Определение констант связывания NAD*. Предварительные эксперименты показали, что связывание NAD+ оказывает влияние на триптофановую флуоресценцию как GAPD, так и dN-GAPDS, что дает возможность изучать взаимодействие обоих белков с коферментом методом флуоресцентного титрования. Измерения проводились с помощью спектрофлуориметра FluoroMax-3 (Horiba Scientific, Япония). Исследуемые белки предварительно инкубировались с активированным углем с целью получения апофермента. Для обработки результатов титрования использовались уравнения согласованной модели для тетрамера (Monod et al. 1965). Определение значений свободных параметров модели проводилось методом нелинейной регрессии.

Инактивация при денатурации в растворе GdnHCl. Для оценки устойчивости активных центров GAPD и dN-GAPDS к денатурации использовался 4 М раствор GdnHCl. К препаратам белков добавлялось необходимое количество сухого GdnHCl. В процессе инкубации каждые 2-4 мин отбирались пробы, в которых измерялась энзиматическая активность. Определение значений констант инактивации проводилось с использованием метода нелинейной регрессии согласно уравнению экспоненциального убывания.

Оценка устойчивости к денатурации в растворе GdnHCl. Готовился ряд проб, содержащих различные концентрации GdnHCl в диапазоне 0-6 М. В каждую из проб вносилось небольшое количество раствора белка. После 24-часовой инкубации проводилось определение соотношения концентраций нативной и денатурированной форм белка в каждой из проб путем изучения спектров триптофановой флуоресценции. Обработка экспериментальных данных осуществлялась по методике, описанной в работе (Эфтинк 1998).

Оценка термостабильности проводилась методом дифференциальной сканирующей калориметрии (DSC) с использованием адиабатического микрокалориметра ДАСМ-4 (Биоприбор, Россия).

Определение эффективных гидродинамических диаметров белковых молекул проводилось методом динамического светорассеяния (DLS) с использованием прибора Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments, Великобритания).

Результаты и их обсуждение

Экспрессия GAPDS. После разрушения бактериальных клеток, экспрессирующих полноразмерную GAPDS, и разделения полученной суспензии центрифугированием подавляющая часть рекомбинантного белка осталась в нерастворимом осадке. Ферментативная активность как осадка, так и супернатанта соответствовала активности аналогичных фракций, полученных из ^трансформированных бактерий и содержавших исключительно бактериальную глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназу (табл. 2). Эти данные свидетельствуют в пользу того, что в бактериальных клетках сворачивание полипептидной цепи GAPDS происходит неправильно, и, значит, экспрессируемый белок не пригоден для изучения ферментативных и ряда других физико-химических свойств. Возможно, причиной неправильного сворачивания является необычная аминокислотная композиция полипролинового домена. Ранее было показано, что активный и растворимый препарат GAPDS может быть получен после инкубации разрушенных ультразвуком сперматозоидов с трипсином (Westhoff & Kamp 1997). Такая

инкубация приводит к эндопротеолитическому расщеплению полипролинового домена, большая часть которого отделяется от GAPDS и остается связанной с белками цитоскелета. Поэтому для облегчения процесса сворачивания полипептидной цепи рекомбинантного белка в бактериальных клетках было принято решение вырезать участок гена GAPDS, кодирующий полипролиновый домен. Укороченный таким образом белок получил обозначение dN-GAPDS (GAPDS with deleted N-terminus).

Табл. 2. Суммарные глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназные активности супернатантов и осадков, полученных в результате разрушения 1 г бактериальных клеток ультразвуком и последующего центрифугирования.

Бактериальные клетки Суммарная активность, ед

Супернатант Осадок

^трансформированные 165 10

Экспрессирующие полноразмерную GAPDS 152 12

Экспрессирующие dN-GAPDS 455 8

Экспрессия рекомбинантной dN-GAPDS в клетках Е. coli была подтверждена с помощью SDS-электрофореза и иммуноблоттинга. Суммарная энзиматическая активность супернатанта и осадка, полученных из трансформированных бактерий, превышала суммарную активность фракций, полученных из нетрансформированных бактерий, в 2,8 раза (табл. 2). Таким образом, удаление полипролинового домена действительно облегчило процесс сворачивания полипептидной цепи GAPDS и позволило добиться экспрессии этого белка в активной и растворимой форме. Около 98% суммарной активности приходилось на супернатант, что указывает на успешную экстракцию рекомбинантного белка.

Выделение dN-GAPDS. Основываясь на предполагаемых свойствах dN-GAPDS, была разработана методика ее выделения из бактериального экстракта, основанная на ионообменной хроматографии. Значение изоэлектрической точки dN-GAPDS, предсказанное по ее аминокислотной последовательности, составляет 8,2. Это превышает значения изоэлектрических точек подавляющего большинства белков Е. coli, в том числе бактериальной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (Smejkal & Lazarev 2005). Таким образом, очистку dN-GAPDS от бактериальных белков целесообразно проводить методом ионообменной хроматографии на катионообменнике. В настоящей работе в качестве хроматографического носителя использовалась КМ-целлюлоза.

Элюат, полученный при финальном промывании колонки, содержал гомогенный белок массой 37 кДа, который взаимодействовал с антителами против GAPDS и

проявлял удельную активность на уровне 50-80 ед/мг. Выход белка составил 1,3 мг на 1 г бактериальных клеток. Препарат очищенной таким образом dN-GAPDS использовался для дальнейшего изучения ее свойств.

Каталитические свойства dN-GAPDS. Наибольшая энзиматическая активность dN-GAPDS наблюдалась при рН 8,9, что соответствует значению рН-оптимума GAPD. Максимальная удельная активность dN-GAPDS составляла 5080 ед/мг (в зависимости от фракции). Это приблизительно в 1,6 раза ниже максимальной удельной активности GAPD (100-110 ед/мг). Константа Михаэлиса dN-GAPDS по глицеральдегид-3-фосфату приблизительно в 2 раза превышала аналогичную величину, определенную для GAPD. В то же время, значение константы Михаэлиса dN-GAPDS по NAD+ оказалось в 2,5 раза ниже, чем для GAPD. Полученные значения в целом согласуются с данными, которые были получены для GAPDS, выделенной из сперматозоидов человека. Оба изофермента проявляли одинаковую чувствительность к окислению активного центра пероксидом водорода. Результаты исследования каталитических свойств dN-GAPDS приведены в табл. 3.

Табл. 3. Каталитические свойства dN-GAPDS и GAPD.

dN-GAPDS GAPD

Максимальная удельная активность, ед/мг 50-80 100-110

рН-оптимум 8,9 8,9

Км по глицеральдегид-3-фосфату, мкМ 540 ±70 290 ±60

Км по NAD+, мкМ 100 ± 10 270± 110

Константа инактивации Н2О2, мМ'мин"1 0,54 ± 0,02 0,60 ±0,07

Олигомерный состав dN-GAPDS. Для исследования олигомерного состава dN-GAPDS использовался метод DLS. Полученные значения эффективных гидродинамических диаметров молекул dN-GAPDS и GAPD практически не отличались друг от друга и составляли, соответственно, 9,1 и 8,7 нм. Это дает основания утверждать, что dN-GAPDS, так же как и GAPD, является тетрамером.

Оценка устойчивости dN-GAPDS к денатурации была проведена с использованием трех различных методов: измерения стационарного соотношения концентраций нативных и денатурированных форм белка при различных концентрациях GdnHCl, измерения скорости инактивации в присутствии 4 М GdnHCl и DSC. Каждый из этих методов позволяет оценить определенный аспект: соответственно, термодинамическую стабильность при воздействии GdnHCl, кинетическую стабильность активного центра при воздействии GdnHCl и термодинамическую стабильность при воздействии

повышенной температуры. Было показано, что dN-GAPDS существенно более стабильна, чем GAPD, по всем перечисленным выше параметрам (рис. 2 и табл. 4). Биологическая роль повышенной устойчивости GAPDS к денатурации может быть связана с тканеспецифичностью ее экспрессии. Известно, что на завершающих стадиях сперматогенеза происходит инактивация ядерной ДНК и элиминирование большей части цитоплазмы, содержащей молекулы аппарата трансляции. Таким образом, одни и те же молекулы фермента должны функционировать на протяжении всего периода жизни сперматозоида, что может требовать от них повышенной стабильности. В пользу данного предположения говорит то, что другой спермоспецифический фермент - лактатдегидрогеназа С — также обладает повышенной стабильностью по сравнению со своими соматическими гомологами (Goldberg 1972).

Причины повышенной устойчивости dN-GAPDS к денатурации. Одним из наиболее распространенных механизмов стабилизации белковых молекул является образование поперечных «сшивок», ограничивающих подвижность полипептидной цепи. В качестве таких «сшивок» могут выступать как дисульфидные связи, так и нековалентные взаимодействия (ионные и водородные связи). По данным имеющихся рентгеновских моделей, в составе обоих изоферментов дисульфидные связи не образуются, и, следовательно, повышенная стабильность dN-GAPDS должна объясняться другими причинами.

Было показано, что оба изофермента содержат по 20 ионных связей на субъединицу, 12 из которых являются общими. При этом dN-GAPDS обладает меньшим количеством ионных связей, экспонированных в раствор, но большим количеством ионных связей, скрытых внутри белковой глобулы. Если экспонированные ионные связи действительно оказывают дестабилизирующее воздействие (Dong & Zhou 2002), то повышенная стабильность dN-GAPDS может объясняться уменьшением их числа. Наоборот, дополнительные скрытые ионные связи могут повышать устойчивость к денатурации.

Снижение конформационной энтропии полипептидной цепи может быть достигнуто и за счет увеличения жесткости ее остова. В первом приближении, остатки пролина повышают жесткость полипептидной цепи, а остатки глицина снижают, однако оказываемый эффект сильно зависит от их расположения (Bogin et al. 1998). В составе dN-GAPDS было выявлено семь дополнительных остатков пролина. В то же время, последовательность GAPD содержит девять остатков глицина, отсутствующих в составе dN-GAPDS.

[GdnHCI], M Температура, 'С Продолжительность инкубации, мин

Рис. 2. Оценка стабильности dN-GAPDS (1) и GAPD (2). А. Зависимость доли денатурированного белка от концентрации GdnHCI. Соотношение концентраций нативных и денатурированных форм белка определялось исходя из спектров триптофановой флуоресценции. 10 мМ КН2РО4 (рН 7,5), 0,1 мг/мл белка. Б. Кривые теплопоглощения dN-GAPDS и GAPD, полученные методом DSC. 50 мМ КН2РО4 (рН 7,5), 0,5 мг/мл белка. В. Кинетика инактивации dN-GAPDS и GAPD в 4 М растворе GdnHCI. 10 мМ КН2РО4 (рН 7,5), 0,8 мг/мл белка.

Табл. 4. Параметры, характеризующие устойчивость вАРО, dN-GAPDS дикого типа и ее мутантных форм к денатурации. [Сс1пНС1]5о -концентрация GdnHCl, при которой в растворе содержится равное количество нативных и денатурированных форм белка, ДС<>° - изменение свободной энергии Гиббса при денатурации белка в отсутствии денатурирующего агента и АН" - калориметрическая энтальпия.

Термодинамическая стабильность при воздействии GdnHCI Термодинамическая стабильность при воздействии повышенной температуры Константа инактивации в

[GdnHCI]so, М AGo°, кДж/моль Температура перехода, °С АкДж/моль присутствии 4 М GdnHCI, мин"1

GAPD 0,65 ± 0,04 3,0 ±0,5 60,8 2125 > 10

dN-GAPDS дикого типа 1,89 ±0,02 30,1 ±3,2 68,5 2472 0,13 ±0,01

dN-GAPDS PI НА 2,29 ±0,02 24,4 ±1,4 70,5 3122 0,05 ± 0,01

dN-GAPDS Р157А 1,54 ±0,02 16,2 ± 1,1 69,3 3517 0,12 ±0,01

dN-GAPDS Р326А 1,79 ±0,01 28,5 ± 1,6 62,6 1863 0,15 ±0,01

dN-GAPDS E96Q 1,80 ±0,01 29,3 ± 2,3 66,5 2689 0,13 ±0,01

dN-GAPDS E244Q 1,91 ±0,03 18,2 ±1,9 68,5 2113 0,13 ±0,01

dN-GAPDS D311N 1,69 ±0,03 11,9 ± 1,1 70,6 2232 0,82 ±0,02

Дестабилизация dN-GAPDS путем введения в ее последовательность точечных мутаций. Для проверки выдвинутых гипотез о возможных причинах повышенной стабильности dN-GAPDS был создан ряд мутантных форм этого белка и проведена оценка их устойчивости к денатурации. В общей сложности были исследованы шесть точечных мутаций: Р111А, Р157А, Р326А, E96Q, E244Q и D311N, предположительно оказывающих дестабилизирующее воздействие. Первые три из них затрагивают специфические для dN-GAPDS остатки пролина, тогда как остальные разрушают дополнительные ионные связи.

Выделение dN-GAPDS Р111А, Р157А, Р326А и E96Q было проведено с использованием методики, разработанной для dN-GAPDS дикого типа. Полученные мутантные белки обладали удельной энзиматической активностью на уровне 50-70 ед/мг. Попытка применения данной методики для выделения dN-GAPDS E244Q и D311N оказалась неудачной: мутантные белки не взаимодействовали с КМ-целлюлозой. Поэтому для их очистки использовалось сульфатаммонийное фракционирование. Удельная активность dN-GAPDS E244Q составила приблизительно 60 ед/мг, D311N - 90 ед/мг.

Результаты оценки стабильности полученных мутантных форм представлены в табл. 4. Все исследованные мутации приводили к разнонаправленным изменениям параметров, характеризующих устойчивость dN-GAPDS к денатурации. К снижению термодинамической стабильности dN-GAPDS при воздействии повышенной температуры привели замены Р326А, E96Q и, в меньшей степени, E244Q. Значительное снижение термодинамической стабильности при воздействии GdnHCl вызвали замены Р157А и D311N, менее выраженное - Р326А, E96Q и E244Q. К кинетической дестабилизации активного центра привели замены Р326А и D311N. Мутации Р157А и D311N повысили устойчивость белка к повышению температуры, а Р111А — как к повышению температуры, так и к воздействию GdnHCl.

Полученные результаты подтверждают предположение о том, что повышенная стабильность dN-GAPDS по сравнению с соматическим изоферментом связана с наличием дополнительных остатков пролина Р157 и Р326, а также ионных связей Е96-Н394, E244-R320 и D311-H124. Разнонаправленный эффект некоторых из мутаций может объясняться различиями между механизмами термоденатурации и денатурации под действием денатурирующего агента, а также между влиянием GdnHCl на активный центр и на белковую молекулу в целом.

Взаимодействие dN-GAPDS с коферментом. По данным флуоресцентного титрования, связывание NAD+ обоими изоферментами носит положительно кооперативный характер, более выраженный в случае dN-GAPDS (рис. 3 и табл.

5). Полученные экспериментальные данные достаточно хорошо описываются согласованной моделью и не представляются последовательными моделями для тетраэдрических и для квадратных тетрамеров. Оба изофермента обладают близкими значениями констант диссоциации Кк (сМ-ОАРБЗ: 0,90 ± 0,12 мкМ, вАРО: 0,87 ± 0,08 мкМ). Величины констант диссоциации Кт свидетельствуют о том, что Т-состояния сШ-САРОЗ и вАРБ имеют крайне низкое сродство к коферменту. В отсутствии КАО+ доля Т-состояния dN-GAPDS почти на два порядка превышает долю Т-состояния вАРО: значение аллостерической константы изомеризации составляет 77 ± 32 для сМ-ОАРОЗ и 2,3 ± 0,8 для вАРО.

[NAD*] / [Protein] INADl»««' Protein]

Рис. 3. Результаты флуоресцентного титрования dN-GAPDS (1) и GAPD (2) коферментом. Экспериментальные данные были аппроксимированы кривыми, построенными в соответствии с уравнениями согласованной модели. 10 мМ КН2РО4 (рН 7,5), 0,25 мг/мл белка. Fo -интенсивность флуоресценции белка в отсутствии NAD+, F — интенсивность флуоресценции комплекса белка и NAD+, [Protein] - концентрация белка, [NAD*]bound - концентрация связанного NAD+, [Л'/Ш+]/гее - концентрация свободного NAD+, \NADV} = [NAD*~\bound + [NAD*\f-ee. А. Кривые титрования. Б. График Скэтчарда. Выпуклая форма кривых свидетельствует о положительной кооперативное™ связывания кофермента.

Табл. 5. Значения параметров согласованной модели, определенные для GAPD, dN-GAPDS дикого типа и ее мутантных форм.

KR, мкМ Л7", мкМ* Аллостерическая

константа изомеризации

GAPD 0,87 ± 0,08 10" 2,3 ± 0,8

dN-GAPDS дикого типа 0,90 ±0,12 1016 77 ±32

dN-GAPDS E96Q 0,70 ± 0,20 1018 326 ± 308

dN-GAPDS E244Q 0,64 ± 0,14 102 94 ±65

dN-GAPDS D311N 1,06 ±0,09 1015 0,7 ± 0,4

* Значения параметра определены ненадежно (р > 0,05).

Различия между dN-GAPDS и GAPD, касающиеся их взаимодействия с NAD+, могут быть связаны с особенностями сперматозоидного метаболизма. Так как энергия, необходимая для работы динеина жгутика, преимущественно генерируется в ходе гликолиза (Mukai & Okuno 2004), метаболизм сперматозоидов является практически анаэробным. Соотношение концентраций NADVNADH в цитоплазме сперматозоидов, вероятно, отличается от данного соотношения в цитоплазме соматических клеток. Это может потребовать от GAPDS иных кофермент-связывающих свойств, чем у GAPD.

Известно, что в распространение структурных изменений, индуцируемых лигандом и приводящих к появлению эффекта кооперативности, могут вовлекаться ионные связи (Cui & Karplus 2008). Наличие специфических ионных связей в составе dN-GAPDS дает основания предполагать, что эти связи могут являться причиной различий между изоферментами, касающихся их взаимодействия с NAD+. Для проверки этого предположения было проведено флуоресцентное титрование мутантных форм dN-GAPDS E96Q, E244Q и D311N.

Ни одна из исследованных замен не оказала значимого влияния на величину константы диссоциации KR. Мутации E96Q и E244Q практически не повлияли и на аллостерическую константу изомеризации, тогда как мутация D311N вызвала ее снижение приблизительно на два порядка, тем самым приблизив кофермент-связывающие свойства мутантного белка к свойствам GAPD (табл. 5). Следовательно, ионная связь D311-H124 действительно принимает участие в передаче структурных изменений, необходимых для обеспечения выраженной положительной кооперативности связывания кофермента.

ЭКСПРЕССИЯ GAPDS В М КЛАНОМ ПЫХ КЛЕТКАХ

Методы исследования

Твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) проводился по стандартной методике (Voller et al. 1978). Для оценки аффинности тестируемых антител использовалась величина OD50 - концентрация антител, при которой оптическая плотность раствора составляет 50% от максимального значения.

Иммунофлуоресцентное окрашивание использовалось для определения локализации GAPDS в меланомных клетках. Отрицательным контролем служили фибробласты, положительным - сперматозоиды. Окрашивание проводилось с помощью поликлональных антител против нативной формы dN-GAPDS (50 нг/мл). Готовые препараты исследовались с помощью инвертированного микроскопа Axiovert 200М (Carl Zeiss, Германия).

Получение иммуносорбентов. Для получения иммуносорбента, содержащего ковалентно связанную dN-GAPDS в нативной форме, была проведена ее иммобилизация на активированной CNBr-сефарозе (Cherednikova et al. 1980). Степень активации сефарозы составляла 3%. Для получения иммуносорбента с денатурированной dN-GAPDS использовался носитель, содержащий нативную форму этого белка, связанную за одну субъединицу (необходимая для этого степень активации сефарозы равнялась 0,5%). К суспензии носителя добавлялся сухой GdnHCl до конечной концентрации 4 М. После 16-часовой инкубации носитель промывался водой до полного исчезновения белка в элюате.

Выделение политональных антител против dN-GAPDS. Препарат сыворотки, полученный из крови иммунизированного кролика, наносился на колонку, заполненную иммуносорбентом. Связавшиеся с носителем антитела элюировались 50 мМ раствором глицина (рН 2,0). Фракции, содержащие антитела, объединялись и переводились в 10 мМ КН2РО4 (рН 7,5). Полученный раствор, после добавления NaN3, хранился при 4 °С.

Результаты и их обсуяедение

Экспрессия dN-GAPDS в норме и при заболеваниях. По имеющейся в литературе информации, GAPDS присутствует только в сперматозоидах. Тем не менее, имеются основания полагать, что экспрессия этого белка может запускаться и в соматических клетках при определенных патологических состояниях (Hoek et al. 2008; Wang et al. 2012). Для проверки этих предположений был проведен анализ данных, представленных в ArrayExpress (www.ebi.ac.uk/arrayexpress), на предмет экспрессии GAPDS в здоровых тканях человека, в клетках раковых опухолей и при нейродегенеративных заболеваниях. Было обнаружено, что высокие уровни экспрессии GAPDS наблюдались во многих меланомных клеточных линиях. Например, в клетках линии А15 содержание мРНК GAPDS составляло 45% от содержания мРНК GAPD.

Получение поликлональных антител против нативной и денатурированной конформаций dN-GAPDS. При исследовании роли GAPDS в развитии раковых заболеваний возникает потребность в детекции этого белка в клеточных экстрактах и определении его внутриклеточной локализации. Имеющиеся коммерческие моноклональные антитела не могут быть использованы для достижения этих целей, так как обладают низкой чувствительностью. Другая проблема, связанная с использованием коммерческих антител, может заключаться в преимущественном узнавании эпитопов, характерных для денатурированной конформации GAPDS. Во избежание перечисленных проблем

было проведено выделение поликлональных антител, обладающих более высокой чувствительностью и способных специфически связываться либо с нативной, либо с денатурированной формой ОАРОБ.

Было установлено, что в исходной антисыворотке присутствовали антитела, способные взаимодействовать как с (Ш-САРОБ, так и с вАРБ, при этом титр антител против нативной сШ-САРБ8 приблизительно на два порядка превышал титр антител против нативной вАРЭ (табл. 6). В антисыворотке также были обнаружены антитела против денатурированной сНЯ-ОАРОБ.

Табл. 6. Значения OD50, полученние при исследовании антисыворотки и очищенных антител методом ELISA.

Антиген OD50, нг/мл

Антисыворотка Антитела, очищенные на носителе с нативной dN-GAPDS Антитела, очищенные на носителе с денатурированной dN-GAPDS

Нативная dN-GAPDS 2,66 х 104 ± 0,15 х 104 25 ±3 94 ±3

Денатурированная dN-GAPDS 4,39 х 105 ± 0,64 х 105 > 104 143 ±10

Нативная GAPD 1,01 х Ю6 ± 0,18 х 106 > 104 440 ±71

Денатурированная GAPD >106 > 104 >500

Антитела, очищенные на иммуносорбенте с нативным антигеном, узнавали нативную форму сШ-ОАРОБ, но при этом практически не взаимодействовали с денатурированной сМ-ОАРОБ, а также с обеими формами вАРБ (табл. 6). Таким образом, полученные антитела могут быть использованы для детекции вАРОБ как в сперматозоидах, так и в соматических тканях (в последнем случае особенно важно то, что антитела не взаимодействуют с САРБ, которая преобладает среди растворимых белков соматических тканей).

Антитела, очищенные на иммуносорбенте с денатурированным антигеном, приблизительно с одинаковой эффективностью взаимодействовали с нативной и денатурированной формами сПЧ-вАРОБ (табл. 6). При повышении их концентрации наблюдалось взаимодействие и с ОАРБ. Таким образом, при использовании в качестве иммуносорбента денатурированной ёК-ОАРББ происходит отбор антител не только на антигенные детерминанты, экспонированные в раствор, но и на участки полипептидной

последовательности, скрытые внутри белковой глобулы. Широкая специфичность данных антител не является свойством, ограничивающим их применение: определение молекулярной массы полипетпидных цепей в совокупности с результатами иммуноблоттинга позволяет однозначно проводить идентификацию белков.

Детекция С А РОЯ в мелаиомных клетках2. Клеточные линии МеШ, Ме1Р и Ме1Р были предоставлены Российским онкологическим научным центром им. Н. Н. Блохина РАМН и НИИ онкологии им. Н. Н. Петрова (М1кЬау1оуа е1 а1. 2008). Детекция САРББ была проведена методом иммуноблоттинга с использованием антител против денатурированной сШ-САРОБ. В экстрактах всех рассмотренных клеточных линий окрашивалась белковая полоса на уровне 37 кДа. Это значение соответствует молекулярной массе вАРОБ без полипролинового домена и превышает молекулярную массу вАРО, равную 36 кДа.

Полученные данные не дают информации о том, правильно ли свернута вАРОЭ, и обладает ли она энзиматической активностью. Поэтому был поставлен эксперимент, заключавшийся в иммунопреципитации белков экстракта клеток Ме1Р антителами, узнающими нативную конформацию сперматозоидного изофермента. Преципитировавшиеся комплексы антител с клеточными белками были проанализированы методом ЗОБ-электрофореза (рис. 4). На полученной электрофореграмме отчетливо видны белковые полосы на уровне 36 и 37 кДа. Идентификация белков, проведенная методом масс-спектрометрии МАЬЭ1-ТОР, подтвердила, что белок с молекулярной массой 36 кДа представляет собой вАРО, а белок массой 37 кДа - САРОБ.

Рис. 4. Электрофореграмма белковых комплексов, полученных в результате иммунопреципитации экстракта меланомных клеток Ме1Р антителами, узнающими нативную форму сШ-САРПБ. Полоса А соответствует тяжелым цепям ^О. полоса Б-легким цепям [еО. полоса В - (1Ы-ОЛР[)Я и полоса Г -вАРО. Дорожки: 1 - преципитировавшие белковые комплексы. 2 - рекомбинантная с1М-0АР08.

Таким образом, было показано, что в некоторых линиях меланомных клеток происходит экспрессия САРЭ8. Экспрессируемый белок, по-видимому, лишен полипролинового домена. Об этом свидетельствует значение его молекулярной массы, равное молекулярной массе (ЛМ-ОАРОБ. Отсутствие полипролинового

2 Эксперименты были поставлены И. А. Севостьяновой.

домена, отвечающего за связывание с фиброзным слоем жгутика, выглядит логичным в клетках, лишенных данной структуры цитоскелета. Механизм, приводящий к утрате полипролинового домена, может быть связан как с протеолизом, так и с альтернативным сплайсингом, как это наблюдается у ящерицы A. carolinensis (см. раздел «Происхождение и эволюция гена GAPDS»).

Совместная иммунопреципитация обоих изоферментов означает, что GAPDS образует комплекс с GAPD, вероятно, в форме гетеротетрамеров. Одинаковая интенсивность окрашивания белковых полос, соответствующих изоферментам (рис. 4), говорит о том, что в среднем две субъединицы гетеротетрамера представляют собой GAPDS, а две - GAPD.

Преципитация GAPDS антителами, специфически узнающими только нативную форму этого белка, свидетельствует о том, что он правильно сворачивается и, по-видимому, обладает энзиматической активностью. Известно, что многие опухолевые клетки интенсивно эксплуатируют анаэробный путь производства АТР (гликолиз), при этом клеточное дыхание подавлено (Crabtree 1929). Сходная организация метаболизма характерна и для сперматозоидов (Mukai & Okuno 2004). Экспрессия GAPDS, адаптированной к анаэробному метаболизму, могла бы повысить эффективность производства АТР в меланомных клетках. Кроме того, замена GAPD на GAPDS может подавлять механизм индукции апоптоза, опосредуемый соматическим изоферментом (Arutyunova et al. 2003).

На рис. 5 представлены результаты иммунофлуоресцентного окрашивания клеток линии MelP антителами против нативной формы dN-GAPDS. Исходя из полученных результатов, GAPDS локализована в области цитоплазмы. В качестве отрицательного контроля было проведено окрашивание фибробластов, в качестве положительного - сперматозоидов (результаты не приведены).

Рис. 5. Локализация GAPDS в меланомных клетках линии MelP. А. Окрашивание меланомных клеток антителами против нативной конформации dN-GAPDS. Использовались вторичные антитела, конъюгированные с Alexa Fluor 488. Контр-окрашивания ядер было проведено с помощью DAPI. Б. Меланомные клетки после инкубации со вторичными антителами.

выводы

1. Гены, кодирующие ОАРБ и ОАРБ8, разошлись в ходе ранней эволюции вторичноротых животных. Их расхождение не связано ни с одной из двух полногеномных дупликаций, специфических для позвоночных. Ген, кодирующий ОАРББ, был утерян многими организмами и сохранился только у млекопитающих, ящериц и рыб.

2. Специализация ОАРББ в спермоспецифический белок случилась у общего предка млекопитающих и рептилий и сопровождалась приобретением полипролинового домена. Давление стабилизирующего отбора, воздействующее на последовательность вАРОБ млекопитающих, ослаблено по сравнению с соматическим изоферментом. Экспрессия полипролинового домена в составе вАРВБ ящерицы АпоШ сагоИпет1$ контролируется тканеспецифическим альтернативным сплайсингом.

3. Получен энзиматически активный препарат рекомбинантной ОАРОБ без полипролинового домена (сТЫ-ОАРОБ), который представляет собой адекватную модель для изучения энзиматических и физико-химических свойств полноразмерного белка. Показано, что (1М-ОАРВ8 является тетрамерным белком.

4. В отличие от соматического изофермента, (Ш-САРОБ проявляет выраженную положительную кооперативность связывания КАО+. Ключевую роль в передаче структурных изменений, индуцируемых взаимодействием с NAD+, играет ионная связь Б311-Н124.

5. Для с!М-ОАРВ8 характерная повышенная по сравнению с соматическим изоферментом устойчивость к денатурации. Одной из причин стабильности сШ-САРОБ является наличие дополнительных остатков пролина Р157 и Р326, а также ионных связей Е96-Н394, Е244-Я320 и 0311-Н124.

6. Разработана методика, позволяющая получать поликлональные антитела, узнающие либо нативную, либо и нативную, и денатурированную конформации сШ-САРОБ.

7. Злокачественная трансформация меланоцитов может приводить к запуску экспрессии САРОБ. Экспрессируемый белок локализован в цитоплазме клеток, лишен полипролинового домена и формирует гетеротетрамерные комплексы с участием субъединиц соматического изофермента.

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Sevostyanova I.A., Kulikova K.V., Kuravsky M.L., Schmalhausen E.V., Muronetz V.l. Sperm-specific glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase is expressed in melanoma cells. // Biochemical and Biophysical Research Communications. 2012. T. 427. № 3. C. 649-653.

2. Kuravsky M.L., Schmalhausen E.V., Pozdnyakova N.V., Muronetz V.l. Isolation of antibodies against different protein conformations using immunoaffinity chromatography. // Analytical Biochemistry. 2012. T. 426. № 1. C. 47-53.

3. Naletova I.N., Popova K.M., Eldarov M.A., Kuravsky M.L., Schmalhausen E.V., Sevostyanova I.A., Muronetz V.l. Chaperonin TRiC assists the refolding of sperm-specific glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. // Archives of Biochemistry and Biophysics. 2011. T. 516. № 1. C. 75-83.

4. Kuravsky M.L., Aleshin V.V., Frishman D., Muronetz V.l. Testis-specific glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase: origin and evolution. // BMC Evolutionary Biology. 2011. Т. 11. C. 160.

5. Elkina Yu.L., Kuravsky M.L., El'darov M.A., Stogov S.V., Muronetz V.l., Schmalgausen E.V. Recombinant human sperm-specific glyceraldehyde-3 -phosphate dehydrogenase: structural basis for enhanced stability. // Biochimica et Biophysica Acta. 2010. T. 1804. № 12. C. 2207-2212.

6. Щуцкая Ю.Ю., Элькина Ю.Л., Куравский M.JL, Брагина Е.Е., Шмальгаузен E.B. Исследование глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из сперматозоидов человека. // Биохимия. 2008. Т. 73. № 2. С. 228-237.

Тезисы докладов

1. Marakhovskaya A.S., Kuravsky M.L., Eldarov М.А., Schmalhausen E.V. Detecting stabilizing and destabilizing mutation effects on human GAPDS. // International conference Biocatalysis-2013: fundamentals and applications. Москва. 2013.

2. Kuravsky M.L., Marakhovskaya A.S., Eldarov M.A., Muronetz V.l., Schmalhausen E.V. The effect of point mutations on the stability of human sperm-specific glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase. // 22nd IUBMB - 37th FEBS Congress. Севилья, Испания. 2010. FEBS Journal. 2012. T. 279. Приложение 1. С. 411.

3. Kuravsky M.L., Schmalhausen E.V., Muronetz V.l. Investigation of NAD+ binding to glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase. // Moscow Conference on Computational Molecular Biology. Москва. 2011.

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Куравский, Михаил Львович, Москва

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М. В. ЛОМОНОСОВА

Факультет биоинженерии и биоинформатики

Отдел биохимии животной клетки НИИ физико-химической биологии им. А. Н. Б

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ИЗОФЕРМЕНТОВ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ЧЕЛОВЕКА: ЭВОЛЮЦИЯ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

Натравах рукописи

04201362543

КУРАВСКИЙ Михаил Львович

03.01.03 - молекулярная биология

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

В. И. Муронец

Москва, 2013

1. Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.............................................................................................................................5

1. ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................................7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ...........................................................................................................................10

2.1. Соматический изофермент глицермьдегид-3-фосфатдегидрогеназы.......................................10

2.2. Энергетический метаболизм и подвижность сперматозоидов........................................................17

2.2.1. Строение сперматозоида млекопитающих.................................................................................17

2.2.2. Строение и функции фиброзного слоя жгутика сперматозоида....................................20

2.2.3. Роль гликолиза в энергообеспечении сперматозоида.............................................................25

2.2.4. Спермоспецифические формы гликолитических ферментов............................................29

2.3. спермат030идный изофермент глицеральдегид-3-ф0сфатдегидр0геназы...............................36

2.3.1. Ранние исследования: вАРйБ является одним из компонентов фиброзного слоя жгутика сперматозоида.....................................................................................................................................37

2.3.2. вАРББ присутствует в сперматозоидах различных видов млекопитающих.........40

2.3.3. Ы-концевой домен связывает вАРОБ с другими белками фиброзного слоя................41

2.3.4. Происхождение гена вАРйБ.....................................................................................................................43

2.3.5. Экспрессия вАРйБ регулируется на уровне трансляции.......................................................44

2.3.6. вАРРБ необходима для подвижности сперматозоидов........................................................47

2.3.7. Энзиматические свойства и олигомерный состав вАРЭБ...................................................49

2.3.8. Правильное сворачивание вАРОБ может обеспечиваться шаперонином ТШС.......51

2.3.9. Роль вАРОБ в патогенезе..........................................................................................................................53

2.3.10. вАРИБ как мишень для специфического ингибирования......................................................54

2.4. Заключение................................................................................................................................................................57

3. ПРОИСХОЖДЕНИЕ И ЭВОЛЮЦИЯ ГЕНА САР05.........................................................................58

3.1. Материалы и методы.............................................................................................................................................58

3.1.1. Выявление генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ..................................................58

3.1.2. Множественное выравнивание и реконструкция филогенетических деревьев.....60

3.1.3. Анализ синтений...........................................................................................................................................62

3.1.4. Оценка воздействия естественного отбора на последовательности генов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ.....................................................................................................63

3.2. Результаты.................................................................................................................................................................65

3.2.1. Последовательности генов глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназ..........................65

3.2.2. Тканеспецифическая экспрессия полипролинового домена GAPD-2................................67

3.2.3. Реконструкция филогении генов глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназ...............69

3.2.4. Оценка давления естественного отбора.......................................................................................73

3.3. Обсуждение результатов.....................................................................................................................................77

3.3.1. Филогения генов глицералъдегид-3-фосфатдегидрогеназ...................................................77

3.3.2. Специализация GAPD-2 в спермоспецифический белок...........................................................82

3.4. Заключение................................................................................................................................................................85

4. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ СВОЙСТВ РЕКОМБИНАНТНОЙ GAPDS.......86

4.1. Материалы и методы.............................................................................................................................................86

4.1.1. Материалы.......................................................................................................................................................86

4.1.2. Аналитические методы............................................................................................................................87

4.1.3. Иммуноблоттинг.........................................................................................................................................97

4.1.4. Методы генетической инженерии.....................................................................................................98

4.1.5. Выделение белков........................................................................................................................................101

4.2. Результаты и их обсуждение..........................................................................................................................106

4.2.1. Экспрессия полноразмерной GAPDS..................................................................................................106

4.2.2. Экспрессия GAPDS, лишенной полипролинового домена (dN-GAPDS')............................108

4.2.3. Выделение dN-GAPDS из бактериального экстракта...........................................................110

4.2.4. Каталитические свойства dN-GAPDS............................................................................................113

4.2.5. Олигомерный состав dN-GAPDS.........................................................................................................116

4.2.6. Устойчивость dN-GAPDS к денатурации......................................................................................118

4.2.7. Причины повышенной устойчивости dN-GAPDS к денатурации....................................121

4.2.8. Дестабилизация dN-GAPDS путем введения в ее последовательность точечных мутаций........................................................................................................................................................................132

4.2.9. Взаимодействие dN-GAPDS с коферментом...............................................................................150

4.2.10. Влияние точечных мутаций на кооперативность связывания кофермента ....155

4.3. Заключение.............................................................................................................................................................161

5. ЭКСПРЕССИЯ GAPDS В МЕЛАНОМНЫХ КЛЕТКАХ..................................................................162

5.1. Материалы и методы..........................................................................................................................................162

5.1.1. Материалы.....................................................................................................................................................162

5.1.2. Определение концентрации антител............................................................................................163

5.1.3. Иммунохимические методы.................................................................................................................164

5.1.4. Выделение поликлональных антител против dN-GAPDS..................................................166

5.2. Результаты и их обсуждение..........................................................................................................................168

5.2.1. Экспрессия dN-GAPDS в норме и при заболеваниях..................................................................168

5.2.2. Получение поликлональных антител против нативной и денатурированной конформаций dN-GAPDS......................................................................................................................................170

5.2.3. Детекция GAPDS в меланомных клетках.....................................................................................184

5.3. Заключение.............................................................................................................................................................189

6. ВЫВОДЫ................................................................................................................................................190

7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................................................................191

Список СОКРАЩЕНИЙ

ADP - аденозиндифосфат

АТР - аденозинтрифосфат

сАМР - циклический аденозинмонофосфат

СССР - карбонилцианид-т-хлорфенилгидразон

DAB - 3,3'-Диаминобензидин

DAPI - 4',6-диамино-2-фенилиндол

DLS - динамическое светорассеяние

dN-GAPDS - сперматозоидный изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, лишенный полипролинового домена

DSC - дифференциальная сканирующая калориметрия

DTNB - 5,5'-дитиобис-(2-нитробензойная) кислота

DTT - дитиотреитол

EDTA - этилендиаминтетраацетат

ELISA - твердофазный иммуноферментный анализ

ELS - электрофоретическое светорассеяние

FITC - флуоресцеин-5-изотиоцианат

GAPD - соматический изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

GAPD-1 - соматический изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

GAPD-2 - сперматозоидный изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

GAPD-3 - изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, специфический для костистых рыб

GAPDS - сперматозоидный изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы

GdnHCl - гуанидингидрохлорид

HEPES - 4-(2-гидроксиэтил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота Ka/Ks - отношение частот синонимичных и несинонимичных замен

MALDI-TOF - матрично-активированная лазерная десорбционная ионизационая времяпролетная масс-спектрометрия

MOPS - 3-(М-морфолино)пропансульфоновая кислота

NADH - никотинамидадениндинуклеотид (восстановленный)

NAD+ - никотинамидадениндинуклеотид (окисленный)

NES - сигнал ядерного экспорта

NLS - сигнал ядерной локализации

OD50 - концентрация антител, при которой оптическая плотность раствора, анализируемого методом твердофазного иммуноферментного анализа, составляет 50% от максимального значения

OPD - о-фенилендиамин

SDS - додецилсульфат натрия

TAPS - 1^-Тпз(гидроксиметил)метил-3-аминопропансульфоновая кислота

TEMED - тетраметилэтилендиамин

Tris - трис(гидроксиметил)аминометан

КМ-целлюлоза - карбоксиметилцеллюлоза

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ФСБТ - фосфатно-солевой буфер с добавлением 0,1% Tween-20

1. Введение

Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа (ЕС 1.2.1.12] является одним из ферментов гликолиза и катализирует реакцию окислительного фосфорилирования глицеральдегид-3-фосфата, сопряженную с восстановлением NAD+. В организме человека и других видов млекопитающих глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа представлена двумя тканеспецифическими изоферментами: соматическим (GAPD) и сперматозоидным (GAPDS). Их последовательности идентичны друг другу приблизительно на 70%. Помимо генов, кодирующих GAPD и GAPDS, в геномах млекопитающих присутствует большое количество псевдогенов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ (Li et al. 2004; Liu et al. 2009).

Соматический изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы - хорошо изученный белок, который присутствует в клетках в очень высоких концентрациях. Его содержание может достигать 10% от общего количества цитоплазматических белков (Cori et al. 1945). Исследования, проведенные в течение последних двух десятилетий, позволили установить, что GAPD является многофункциональным белком и вовлечена в большое количество негликолитических процессов (Sirover 1999; Sirover 2005; Seidler 2013с).

Сперматозоидный изофермент глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы локализован в области цитоплазмы жгутика сперматозоида и, в отличие от соматического изофермента, прикреплен к цитоскелету (Fenderson et al. 1988; Eddy et al. 1991; Westhoff & Kamp 1997; Bunch et al. 1998; Welch et al. 2000; Krisfalusi et al. 2006). Его взаимодействие с цитоскелетными белками опосредовано особым N-концевым полипролиновым доменом (Westhoff & Кашр 1997; Щуцкая et al. 2008). По-видимому, функция GAPDS заключается в снабжении АТР моторного белка жгутика сперматозоида - динеина. Нарушения экспрессии GAPDS приводят к возникновению серьезных нарушений подвижности сперматозоидов, как правило, являющихся причиной бесплодия (Miki etal. 2004).

Прочная связь между GAPDS и цитоскелетными белками препятствует выделению сперматозоидного изофермента и существенно усложняет его экспериментальное изучение. К моменту начала работы над диссертацией было опубликовано лишь одно исследование, посвященное выделению GAPDS. Используемая методика заключалась в проведении частичного протеолиза полипептидной цепи GAPDS (Westhoff & Kamp 1997).

Полипролиновый домен, будучи связанным с белками цитоскелета, оставался в нерастворимой фракции, а С-концевой фрагмент, обладающий энзиматической активностью, переходил в раствор. Данная методика позволяла получать лишь небольшие количества GAPDS, которых, однако, оказалось достаточно для измерения удельной энзиматической активности. Полученное значение отличались от соответствующего значения, определенного для соматического изофермента.

Биоинформатический анализ последовательностей глицеральдегид-3-

фосфатдегидрогеназ млекопитающих позволил выдвинуть предположение о том, что для GAPDS не свойственно участие в негликолитических процессах (Куравский & Муронец 2007). Также было показано, что GAPDS могла бы играть некоторую роль в развитии раковых опухолей (Hoek et al. 2008) и болезни Альцгеймера [Bertram et al. 2007; Wang et al. 2012).

Изучение GAPDS представляет огромный интерес как с точки зрения фундаментальной науки, так и с точки зрения перспектив практического применения полученных результатов. За время работы над диссертацией было опубликовано не менее 9 работ, посвященных этому белку (включая 5 работ, выполненных в нашей лаборатории). Соматический и сперматозоидный изоферменты глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ являются хорошей моделью для исследования функциональной дивергенции и тканеспецифической специализации дуплицированных генов, особенно в контексте лавинообразного роста объемов геномных и транскриптомных данных за последние годы. GAPDS также представляет собой достаточно актуальный объект для экспериментального изучения, так как играет важную роль в обеспечении подвижности сперматозоидов и, следовательно, фертильности. Воздействие на GAPDS может найти практическое применение, связанное как с лечением бесплодия, так и с контрацепцией. Кроме того, определенный интерес представляют исследования экспрессии GAPDS в соматических тканях при различных патологических состояниях (в первую очередь, в клетках меланом и при болезни Альцгеймера). Результаты этих исследований могут позволить лучше понять причины возникновения этих состояний и послужить основой для разработки новых средств диагностики и лечения.

Целью настоящей работы являлось изучение эволюции сперматозоидного и соматического изоферментов глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека, получение растворимого и энзиматически активного препарата GAPDS, изучение его

физико-химических свойств, а также исследование экспрессии САРБ5 при различных заболеваниях. В соответствии с целью работы были поставлены следующие задачи:

• анализ филогении генов, кодирующих глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы вторичноротых животных;

• оценка изменений давления естественного отбора, воздействующего на гены глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ, в ходе их эволюции;

• изучение процесса специализации САРББ в спермоспецифический белок;

• получение бактерий-продуцентов САРББ и разработка методики выделения энзиматически активного препарата этого белка;

• исследование физико-химических свойств выделенного белка и его сравнение с соматическим изоферментом;

• получение поликлональных антител, которые могли бы быть использованы для детекции вАРОБ в сперматозоидах и других клетках человеческого организма;

• выявление САРОБ в соматических клетках при различных патологиях и исследование возможной роли ее экспрессии.

2. Обзор литературы

2.1. Соматический изофермент глицеральдегид-3-

фосфатдегидрогеназы

История изучения соматического изофермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы уходит к первой половине предыдущего столетия. Исследования его каталитического механизма легли в основу современной энзимологии (Seidler 2013а), а сам белок стал одним из классических модельных объектов в работах, посвященным кооперативным переходам в олигомерных ферментах (Conway & Koshland 1968).

Соматический изофермент обычно обозначается как GAPD или GAPDH. Он кодируется геном GAPDH (Ensembl: ENSG00000111640), расположенным на 12-й хромосоме. Длина транскрибируемого участка гена составляет 4445 п.н.1, из которых 1875 п.н. приходится на 9 экзонов. Аминокислотная последовательность GAPD имеет протяженность 335 а.о., а ее молекулярная масса составляет 36,0 кДа. Молекула фермента построена из четырех идентичных субъединиц (рис. 1), связанных между собой нековалентно. По данным рентгеноструктурного анализа, каждая субъединица состоит из двух доменов: NAD-связывающего (4-152) и каталитического (157-314). Ключевой остаток активного центра С152 приходится на междоменный линкерный участок.

1 Длина наиболее протяженного транскрипта.

Рис. 1. Модель трехмерной структуры тетрамера (А) и отдельной субъединицы (Б) соматического изофермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы человека [РОВ: 1и80- Показаны элементы вторичной структуры белка.

NAD-связывающий домен имеет типичную для нуклеотид-связывающих белков структуру Rossmann fold. В основе структуры каталитического домена лежит антипараллельный (3-лист, сосотоящий из девяти (3-тяжей. Характерный участок этого домена, расположенный в области геометрического центра тетрамера (182-203), носит название S-петли. Молекула кофермента располагается в полости, образованной NAD-связывающим доменом, S-петлей каталитического домена той же субъединицы и S-петлей одной из соседних субъединиц. Вблизи сайта связывания никотинамидного кольца NAD+ находится активный центр фермента (Buehner et al. 1973; Mercer et al. 1976; Seidler 2013a).

Реакцию, катализируемую GAPD, можно представить как сумму двух процессов: окисление альдегидной груп