Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние процессов перекисного окисления липидов на качестве препарата иммуноглобулина при его получении и хранении

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние процессов перекисного окисления липидов на качестве препарата иммуноглобулина при его получении и хранении"

МИНИСТЕРСТВО ВЫСШЕГО и СРЕДНЕГО СПЕЦИАЛЬНОГО ОБРАЗОВАНИЯ РСФСР РОСТОВСКИЙ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

Специализированный сонет К 063.52.09 по биологическим наукам

На правах рукописи

ДМИТРИЕВА Нина Александровна

УДК 577.1 +578.088+615.375.017+612.123

ВЛИЯНИЕ ПРОЦЕССОВ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛИПИДОВ НА КАЧЕСТВО ПРЕПАРАТА ИММУНОГЛОБУЛИНА ПРИ ЕГО ПОЛУЧЕНИИ И ХРАНЕНИИ

03.00.04-0иохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ростов-на-Дону 1990

Работа выполнена в Ростовской научно-исследовательсксм институте эпидемиологии, микробиологии, паразитологии и гигиены.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Шепелзв А.П.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Кричевская A.A.

доктор медицинских наук, профессор Поверенный AM.

Ведущая организация: 2-й Московский Ордена Ленина государственный медицинский институт им. Н .ИЛирогова

Защита состоится " J " tctCfidd 1990 г. в часов

на заседании специализированного совета к 063.52.09 в Ростовском Ордена Трудового Красного Знамени государственна»! университете (3445ц, г.ростов-на-Дону, ул.Энгельса, 105).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Ростовского государственного университета.

Автореферат разослан " " 1-СС&Ы 1990 г.

Ученый секретарь специализированного совета к.б.н.

Колобова Г.Д.

- 3 -- ' ОБЩАЯ ХАРШЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Липиды, присутствующие в препаратах иммуноглобулинов, во многом определяют показатели их качест-ш, в частности, опалесценцию растворов и стабильность препаратов при хранении (Киселева и др.,1980; Кускова и др.,1978,1980; 1ванова,1980). Однако превращения, происходящие с липидами при юлучении и хранении препаратов крови, изучены недостаточно. Установлено, что от уровня холестерина в исходном сырье зависит уюпкование - явление, связанное с агрегацией белковых молекул Михеева и др.,1980). В то на время при хранении коммерческих срепаратов иммуноглобулинов наблюдается нарастание уровня мало-ювого даальдегяда (ВДА) - одного из продуктов перекисного окис-1ения лилвдов (Благородов и др., 1981).

Перекисное окисление является универсальным механизмом взаимодействия кислорода со многими органическими субстратами, в том теле с липидаш (Владимиров, Арчаков,1972). Внедрение' кислорода в молекулу окисляемого субстрата и дальнейшие превращения ин-'ермедиатов приводят к образованию реакционноспособных продук-•ов, которые вызывают превращения других классов соединений -¡елков, нуклеиновых кислот, углеводов и пр.

Существует определенная взаимосвязь между перезшсныиокисле-[ием липидов и деструкцией белков. Комплексы белков с липидами, гадвергнутыми- окислению, легче атакуются протеолитическими ферритами (Ыор1а в1, ,1974; ?Ив1е1 et аХ. ,1984). Одновре-¡енно с распадом слошжх молекул идет процесс их агрегации,вызы-1аешй ЩА - "активным сшивающим агентом" (Р1е£сЬег а1., 973). Значительную роль при этом играют сульфгидрильные груп-и, участвующие также в восстановлении ионов железа при перегоном окислении (Владимиров, Арчаков,1972; Ь^Svstaa ,1986).

Имеются данные о взаимосвязи шаду содержанием сульфгкдргльных груш в препаратах иммуноглобулинов и стабильностью препаратов при хранении (Шмакотина, Макаревич,19?4). Сведения о влиянии перекисного окисления лшвдов на качество препаратов иммуноглобулинов при шх получении практически отсутствуют. Есть основания предполагать, что деградация белковых молекул- в растворах иммуноглобулинов находится в определенной взаимосвязи с перекяс-ным окислением липидев, предав с твувдим изменениям конформацйи белков на стадиях технологического процесса. Решение этой проблеют необходимо для оптимизации технологического процесса, а также для прогноза качества препаратов с целью установления сроков их хранения. £ то же время выяснение влияния перекисного окисления липвдов на качество препаратов необходимо для изучения возможности антиокислительной стабилизации сырья а готового препарата.

Цель исследования. Целью работы являлось изучение особенностей перекисного окисления липидов в процессе получения и хранения препаратов иммуноглобулинов, доказательство денатурирующего действия некоторых продуктов перекжсного'' окисления, а так-&е теоретическое обоснование и экспериментальное подтверждение возможности повышения качества препарата путем ингибировакия перекисных процессов антиоксядантами.

Для достижения цели были поставлены следующие ?адачй:

1. установление зависимости между качеством препаратов иммуноглобулинов и факторами, определявши интенсивность перекисных процессов в сырье в полученном из него препарате (количеством субстратов окисления,' уровнем некоторых прооксидантов,антиокислительной активностью);

2. поиск ингибиторов перекисного окисления и изучение их влияния на качнстьо лрицяратоь;

- 5 -

3. повышение качества препаратов путем введения стабилвзато-ров-антиоксидантов на уязвимом технологическом этапе.

Основные положения, выносимые на защиту: ,

1. В сиворотка крови, в процессе ее технологической обработки при получении иммуноглобулинов, а также при хранении готовых препаратов протекают процессы перекисного окисления липидов.

2. Продукты перекисного окисления липидов денатурируют белковые молекулы и ухудшают физико-химические свойства и стабильность препаратов иммуноглобулинов.

3. Введение синтетических ингибиторов перекисного окисления на отдельных стадиях технологического процесса повышает качество препаратов иммуноглобулинов.

4. Разработанный тест антиокислительной способности позволяет оценивать качество сырья и прогнозировать качество препаратов иммуноглобулинов.

Научная новизна работы. Впервые установлено, что при получении и хранении коммерческих препаратов иммуноглобулинов протекают перекисные процессы, сопрово¡вдающиеся убылью субстратов окисления - ненасыщенных липидов (преимущественно моно- и диеновых кирных кислот), изменением соотношения восстановленной и окисленной форм железа и нарастанием содержания продуктов перекисного окисления, в том числе их комплексов с белками. Эти процессы в значительной степени обусловлена качеством исходного сырья,в частности, его антиокислительной способностью. Показано, что активация перекисного окисления в сырье приводит к ухудшению качества изготавливаемого из данного сырья препарата без потери его специфической антительной активности.

Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы состоит в выяснении некоторых механизмов

денатурации иммуноглобулинов в растворах при хранении. Показана ведущая роль гидроксилышх радикалов в ухудшении качества препаратов иммуноглобулинов. Высказано предположение о различной устойчивости фрагментов молекулы иммуноглобулина к действию свободных радикалов и о роли некоторых жирных кислот в обеспечении хонформации молекулы иммуноглобулина.

Практическая значимость работы определяется разработанным критерием оценки качества сырья по его антиокислительной способности- (АОС). Оформлены и направлены в ПНЦ методические рекомендации "Прогноз качества сывороточного сырья и препарата иммуноглобулина на основе критериев перекисного окисления липидов". Достигнуто улучшение качества препарата иммуноглобулина путем введения в сырье антиоксиданта - диметилсульфоксида (ДМСО) в оптимальной концентраций 0,5 % (объемн.). Способ стабилизации сывороточного сырья защищен заявкой на изобретение (Л 4442471 от 28.06.1988 г.).

Дсгообапия работы. Материалы диссертации доложены на научно-производственных семинарах и конференциях РИЭМНГ (19Вб-1989г.г.), на П Всесоюзной конференции "Еиоаятиоксидант*** (Москва, 14-16 мая 1986 г.), на IX Всесоюзной конференции по газовой хроматографии (Куйбышев,25-29 мая 198? г.), на заседании Ростовского отделения Биохимического общества (Ростов, 31 марта 1988 г.), на

т

П Международной конференции "Регуляция свободнорадикалЬных реакций" (Болгария, Варна, 6-10 сентября 1989 г.), а также на заседании Ученого Совета РЙЭМЕГ (27 сентября 1988 г.) и заседании кафедры биохимии ИТ (13 .апреля 1990 г.)

Публикация результатов' исследования. По теме диссертации опубликовано II работ.

Структура- работу. Диссертация изложена на 204 стр. машинописного текста и состоит из введения, двух глав обзора литера-

_ 7 - •

уры, описания постановки эксперимента и методов исследования, езультатов собственных исследований, обсуждения и выводов.Ра-ота содержит 47 таблиц, 25 рисунков и 21 при/о^ение. Список т-ературн включает 280 наименований, в том числе 158 зарубежных сточняков.

ПОСТАНОВКА ЭКСПЕРИМЕНТА И МЕТОДУ ИССЛЕДОВАНИЯ

В экспериментах использовано сывороточное сырье различного роисхоадения (донорское, плацентарное и абортное) и пблученные з наго в производственных и лабораторных условиях прэпараты ммуноглобулинов. Препарата получали методом спиртового фракцио-ироваяия на холоду согласно производственному регламенту № 131-79 контролировали в соответствии с требованиями ТУ 42.14 S 113-77. роме того, в сырье и препаратах определяли содержание общих ла-вдов по методу V/oodman, ïrice(I972), состав липздов по классам помощью тонкослойной хроматографии в собственной модификации а.с. }¡ 991304), спектр жирных кислот методом газо-кидкостной роматографии жх метиловых эфзров, содержание гемоглобина геми-лобшщианидным методом, содерваниз двух- и трехвалентного келе-а роданадным методой с использованием собственной модификации, ктивность каталазы иодомэтричэским методом (Бабенко, Гойнацкий, 976), активность церулоплазмина и суммарную пероксидазную ак-ивность с использованием бензидин-гваяколового реактива (Баку-вД981)„ антиокисллтельную способность (АОС) по методу Тимир-улагова и Селезнева (1981) в собственной модификации ж уровень ЦА в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой.

Сырье анализировали непосредственно после взятия пробы из peí* ктора; препарата, полученные в производственных условиях„ -по эре m выпуска я по истечении срока годности (2 года). Лабора-орные препараты оценивали на различных технологических этапах:

- 8 -

после разведения паста гамма-глобулина, после ляофильно?'- сушки, после стерилизующей фильтрации и после термического старения (выстаивание в течение месяца при 37 - 0,5 °С).

Кроме перечисленных выше показателей, в препаратах определяли такке молекулярные параметры (содержание агрегатов и фрагаен-тов) методом' гель-фильтрации в тонком слое сефадекса 6 -200 (Никитина и др.,1975), содержание сульфгидрильных групп (Фоломеев, 1981), отдельных клавсов иммуноглобулинов (Чернохвостова а др., 1975),' уровень некоторых антител (анти- J- -стафилолизннов), интенсивность 'хемклшнвесцекции, содержание вшффовых -оснований по

t ■ -

их специфической флуоресценции и аятиокислительную активность (АОА) по методу Благородова и др. (1986).

Для выяснения роли перекисного окисления липидов проводили активацию перекисных процессов системами, генерирующими свободные радикалы: системой Фентона и перманганатной системой. Активирующие реагенты вводили в сырье или готовые препараты в виде концентрированных растворов. Ислользовали такке активацию пере-кисного окисления солями железа и меди.

Для уточнения роли субстратов окисления приводили очистку сывороточного сырья от липидов, используя обработку сорбентами на основе кремниевой кислоты: силикагелем и аэросилами. При обработке использовали метод Stephan (1977). Качество сывороточного сырья контролировали до и после обработки сорбентами.

Ингибированиа переписного окисления липидов в сырье проводили с использованием синтетических антиоксидантов ионола, бензойной кислоты и дасо.

При изучении активации* и ингибирования перекисных процессов использовали партию сывороточного сырья объемом 10-15 литров, которую делшш на 5-7 порций. Одну из порций считали контроль-

- 9 - •

гай и на подвергали никакой обработке, остальные обрабатывали г целью активации или ингибировакия перекисного окисления. В саждой партии сырья были одновременно закладки 9 активированным I ингибированным перекисным окислением. Каждый вариант опыта ювторяли не менее двух раз.

Оценку влияния стимуляции или ингибировакия пврекясных про-?ессов проводили как по показателям качества сырья, так и гто подателям качества готовых препаратбв, основным из которых счи-•али стабильность физико-химических свойств препаратов при тер-шческом старении.

Статистическую обработку полученных результатов проводили [а микро-ЭВМ МС 1103 с помощью пакета прикладных программ (фет-:ов,1982; Епан-чиков, Цветков, 1988).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИСОВДОВАНШ И ИХ ОБСУЗЩНИЕ

Перакисное окисление липидов регулируется в сыворотка крови азличными факторами, в том числе уровнем субстратов, про- и ан-иоксидантов. В таблице I представлены результаты анализа сыво-оточного сырья в зависимости от его происхввдения.

Донорское сырье отличалось более низким содержанием проокси-антов (гемоглобина, двух- и трехвалентного железа) и МДА, а акхе пониженной активностью пероксидазы, в том числе и церуло-лазмина. В то же время, несмотря на одинаковое с плацентарным ырьем содераание липвдов, антиокислительная способность донор-кого сырья значительно вше, чем у остальных видов, что в целом озволило охарактеризовать донорское сырье как наиболее стабиль-ое в отношении перекисвого окисления лшшдов. Абортное сырье тлнчалось более высоким содержанием проохсидантов, что в соче-ании с более высоким уровнем ВДА. свидетельствует об интенсивом протекании в нем перекисних процессов. С 1987 года абортное

Таблица I

Характеристика различных видов сывороточного сырья

Вид сырья Общие Гемоглобин Ре2*, ?е2+/?е3+ СНА, АЦП,- АОС, ■ИДА.

г/л г/л кг/л мг/л Е " Е усл'.ед. , Е

Донорское 5,3- 1.5* 1,4* Н8 ОбН 0,46^ 0,31* 25,0* 0,04±

. 0,43 0,19 0,22 0,02 0,02 1,9 0,01

Плацентарное 5,4± 3.1** 1.7* 0,29-* разброс - 0,6Б- 0,49±* 15,9±* 0,06-

(в»Ю) 0,62 0,50 0,16 0,09 0,09 0,08 1,42 0,01

Абортное 3,6±* 6,7± * 0,6±* О.бЬ * ' 1,1±* 0,72-* 0,52** 15,8±* 0,101*

(п=5) 0,16 0,57 • 0,23 0,13 0,34 •0,03 0,07 0,91 0,02

«

- различия е донорским сырьем достоверны

- II - •

сырье исключено из источников сырья для производства препаратов иммуноглобулинов в связи с наличием в ней большого числа биологически активных примесей.

В плацентарном сырье обнаружено более высокое по сравнению с донорским содержание эфкров холестерина (27,5-1,85 и 22,7 -1,52 % соответственно; ^ =2,57). Индекс насыщенности, т.е. от- . ношение суммарного относительного содержания насыщенных и ненасыщенных жирных кислот, в донорском' сырье составлял 0,85-1,03, в плацентарном сырье колебался в более широком интервале от 0,45 до 1,03.

Таким образом, выбор плацентарного сывороточного сырья в качестве основного объекта изучения был обусловлен его повышенной нестабильностью в отношении перекисного окисления по сравнению о донорским сырьем.

При стимуляции перекисного окисления лжядов в сырье системой Фентона (ищрокскльными радикалами) наблюдали снижение содержания общих липидов в 1,5-2 раза и нарастание уровня МДА на 100 и более процентов. При этом АОС сырья возрастала более,чем в 3 раза, что свидетельствовало об участии легкоокисляеиых суб-зтратов в происходящих процессах. Данные подтверждались анализом жирнокислотного спектра сырья: при активации перекисного жисления наблюдали увеличение индекса насыщенности. Одновремэн-?о в 4 раза уменьшалось соотношение восстановленной и окислений форм железа.

Качество препаратов, полученных из сырья с активированным шрекисным окислением, было хуже, чем качество контрольных пре-харатов. Это выражалось в увеличении опалесцвнцаи белковых раст-зоров в 2-4 раза, нарастании цветности и степени глубокой фрагментации, что сопровождалось также увеличением количества суль-идргльнад груш п свидетельствовало о нестабильности препаратов

- 12 -из активированного сывороточного сырья. В таких препаратах обнаруживали значительное содержание агрегированного белка, в 2 раза превышавшее его количество в контрольном препарате. Еирко-кислотный спектр препаратов из сырья со стимулированным гидро-ксильными радикалами перекисным окислением изменялся незначительно. ." .'

Не обнаружено достоверных отличий в содержании иммуноглобулинов в, А, М между контрольными препаратами и препаратами изсы-рья со стимулированным шрекисным окислением. Не изменялся так-

I

т уровень специфических (антитоксических и противовирусных) ан-татед. .

При термическом старении в препаратах из сырья со стимулированным перекисным окислением более выражение нарастала опалес-ценция, что связано с выпадением осадка нестабильных липид-бел-ковых-комплексов, в формировании которого, по-видимому, принимало участие трехвалентное явлэзо. При этом уменьшалось содержание сульфгидрйльных групп, участвующих в реакциях восстановления трехвалентного железа.

В контрольных препаратах при термическом озарении интенсивность хемилшинесценцш снижалась, в то время, как в препаратах т сырья со стимулированным перекисши окислением нарастала. Очевидно, в данных препаратах из активированного сырья продолжалось развитие свободнорадикалышх процессов, сопровождающееся деградацией белков.

Близкие результата были получены при активации яерекисного окисления в сырье супероксидаыми радикалами (пврманганатная система). В сырье не отмечали значительных изменений изученных показателей; однако активность каталазы и церулоплазмина снижалась, Одновременно несколько возрастал уровень ИЩА. В сяактро .

- 13 -

жирных кислот наблюдали снижение относительного содержания моно-еновых жирных кислот.

Свеке полученные препараты из сырья, активированного супероксидными радикалами, были близки по качеству с контрольными препаратами, однако в них наблюдали повышенное содержание липидов, железа и сульфгидрильных групп, что свидетельствовало о нестабильности препаратов. Эти данные подтверждались при анализе препаратов после термического старения: опале сценция растворов и степень глубокой фрагментации белков нарастала в 5 раз, в то время, как в контрольном препарате всего в 1,5-2 раза. Иммуно-электрофорез показал расщепление дуги преципитации гамма-глобулина после термического старения препаратов из сырья со стимулированным перекисши окислением.

При изучении стимуляции перекисного окисления в сыворотке перманганатной системой было установлено, что возрастание уровня МДА. коррелирует с содержанием общих липидов в сыворотке (г = +0,98 для.донорского сырья и +0,75 дая плацентарного). Однако в сыворотках различного происхождения одному и тому же содержанию общих липидов соответствовало различное увеличение уровня МДА после стимуляции. По-видимому, это связано с влиянием многих факторов, учесть вклад каждого из которых достаточно трудно. В связи с этим мы ввели интегральный показатель ДОС, используя для характеристики сырья величину, обратную приросту уровня МДА (I/ д Е). В производственных условиях показано, что показатель АОС можно использовать для оценки качества сывороточного сырья и прогноза качества препарата иммуноглобулина. Возрастание АОС более 25-30 условных единиц в плацентарном сырье может свидетельствовать об активации перекисннх процессов в сырье гидроксильными радикалами, что приводит к значительному ухудшвт-ншо качества препаратов, изготовленных из такого сырья.

- 14 -

Установлено, что изменения, аналогичные изменениям при стимуляции перекисного окисления Л1Шидов, происходят при попадании в сырье ионов железа и меди в низких концентрациях М).При

этом в сырье возрастает уровень ЩА, особенно при введении солей трехвалентного железа и меди. В этих же случаях наиболее резко ухудшалось качество препаратов, что выражалось в увеличении ' опалесценции белковых растворов и снижении степени глубокой фрагментации. Наблюдали нарастание агрегации белков при уменьшения содержания фрагментов при гель-фильтрации в тонком слое се-фадекса.

Изменения жнрнокислотных спектров липидов в препаратах, изготовленных из сырья с добавками солей железа и меди, были аналогичны данным, полученным при анализе препаратов из сырья с активированным перекисным окислением.

При термическом старении в препаратах значительно нарастала опалесценхщя и степень глубокой фрагментации в то время, как в контрольных препаратах степень фрагментации снижалась.

Таким образом, попадание в сывороточное сырье ионов металлов переменной валентности приводит к стимуляции перекисных процессов в сырье и ухудшает качество полученных из него препаратов.

При изучении показателей перекисного окисления лшшдов на отдельных технологических этапах было установлено, что на стадии Ац в части производственных закладок происходит снигание величины АОС с 12,5*0,61 до 7,7*0,32 условию: единиц, что вз связано с изменникам содержания общих липцдов на данной стадии. Очевидно, при спиртовом осаждении малые концентрации спирта снижают устойчивость сыворотс-чшх лшщдов к окислению, что юает приводить к активации порзтгеошхх цроцрссов и ухудониз качества препаратов иммуноглобулинов.

. - 15 -

На последующих стадиях спиртового фракционирования происходит удаление значительной части лилидов, в связи с чем величина АОС полуфабрикатов резко возрастает и анализ ее изменений затруднен. Содержание общих липвдов на последующих этапах (лво-фильная сушка, фильтрация) колеблется незначительно и снижается после выстаивания и термического старения препаратов.

Исходный уровень МДА в препаратах обусловлен, по-видимому, особенностями сырья и ведения спиртового фракционирования, поскольку на остальных технологических этапах содержание ЭДА снижалось за счет его удаления с денатурированными белками. Параллельно нарастало содержание ¡цифровых оснований, что подтверждало участие МДА в реакциях с белками.

Полученные- результаты подтвердили имеющиеся в литературе данные о значительном влиянии лпофидизации на качество препаратов иммуноглобулинов и показали, что именно на этом этапе происходит вовлечение белков в реакции с продуктами перекисного окисления лапидов.

При хранении препаратов иммуноглобулинов перекисные процессы продолжаются, хотя протекают менео интенсивно. В таблице 2 представлены результаты анализа некоторых показателей перекисного окисления свежеполучонных препаратов и препаратов с истекшим сроком годности з зависимости от вида сырья.

Обнаружено, что свэнеполучешше препараты иммуноглобулинов из разных видов сырья не имеют достоверных различий в содержании трехвалентного железа, суммарной пероксидазной активности, активности церулоплазшша к уровня МДА. В то же время препараты из разных видов сырья после хранения существенно отличаются друг от друга по ряду показателей перекисного окисления, что свидетельствует о разной интенсивности перекисных процессов.

С;^ . ;што*ьная характеристика препаратов иммуноглобулинов из разных видов сырья в зависимости от' срока их хранения

Таблица 2

Вид сырья

Срок хранения

Общие

ЛКШ1ДЫ,

г/л

t?H, рмоль. кя

Ре общ. от/л

Ре2+, мг/л

Рэ^, мг/л

Ре2+/

Ре

3+

СПА А1ГП МПА ^ФФОВИ

' АЦ11' ЫДА' основания, ЕВЕ усл.ед./ г лип.

JL

■к

о р<

о

и

3

_2_

СВ8К8-

SS)

более двух лат . (ifalO)

_3_

0,56± 0,014

0,18± 0,001

_5_

1,84* 0,830,26 0,15

1,50* 1,57± 0,146 0,132

_6_

_7_

_8_

10

II

12

0,49± 0,34^

0,13 0,07

I,09± 0,49±

0,079 0,059

1,5± 0,056± 0,036± 0,059± 12,5±

0,34 0,002 0,002 0,002 0,99

2,2- 0,084- 0.047* 0,163* 63,4*

0,15 0,009 0,009 0,015 14,78

свеже-получ, (п=21)

более двух лег , (п=10)

0,82* 0,017

1,78* 1,19± 0,23 0,212

0,21* 1,24* 1,11* 0,001 0,107 0,23

0,66* 0,47* 0,2* 0,068* 0,042*0,060* 5,0* £

0,164 0,086 0,05 0,07 0,004 0,005 0,36 (

0,12- 0,82* 0,2* 0,078* 0,035* 0,146* 18,7*

0,037 0,155 0,09 0,007 0,008 0,010 3,14

2_3_4 5 6

свез»- 0,43* 2,07* 1,4* 0,9*

(Ж* °'004 °'36 °»П 0'П

0,31* 2,49* 1,82* 0,77*

лет , 0,003 0,09 0,19 0,21 (п=8)

Цродолжение таблицы 2

7 8 9 10_Ц_

0,5* 1,9* 0,066* 0,041* 0,058* 0,08 0,35 0,004 0,004 0,008

1,05* 0,84* 0,102* 0,071* 0,188* 0,103 0,28 0,014 0,017 0,014

- 18 -

протекающих после изготовления препаратов. Учитывая имещиеся в литературе данные и полученные результаты, можно предположить, что процесси перекисного окисления в препаратах иммуноглобулинов в основном носят неферментативный характер.

Наиболее стабильными при хранении являются донорские препараты, однако в них при хранении наблюдается значительное нарастание содержания шиффовых оснований, что свидетельствует о более активном вовлечении белков донорских препаратов в реакции с пе-реокисленкыш лилидами. В донорских препаратах наблюдали также максимальное снижение интенсивности хемилюминесценции при хранении. В то ей время в плацентарных препаратах содержание общих лпшдов снижалось в 4 раза, что связано с выпадением части липи-дов в осадок вместе с денатурированными белками, а также с утилизацией лпнидов в перекисных процессах.

Установлено, что при хранении происходит изменение состава липадов препаратов, в частности, появляется дополнительная фракция в зоне эфиров холестерина с Rf =0,80-0,86 для донорских иммуноглобулинов и 0,91-0,95 для плацентарных и абортных. В препаратах с истекшим сроком годности значительно чаще обнаруживали фракцию свободного холестерина ( Rf =0,18-0,19), который,по имэюэдшся в литературе данным, подвергается дестабилизации в растворах гамма-глобулина (Кобозев,1972; Тарасова,1972; Catain-;роо1аз, Meyer ,1971) и ухудшает качества препаратов (Михеева и соавт.,1980). ' '*

Изменения, происходящие в жирнокислотноы спектре препаратов при хранении, направлены в сторону увеличения относительного со-дерглния ненасыщенных, в первую очередь диеновых жирных кислот. Относительное содержание полиненасыщенных жирных кислот при хранении остается практически неизменным. Среди ненасыщенных жир-

ных кислот ведущее место занимают олеиновая (Сдо^) и линолевая етслота» содержание которых при хранении препаратов снижается, обеспечивая возрастание индекса насыщенности.

Обнаружено также, что при хранении коммерческих препаратов происходит изменение соотношения восстановленной и окисленной форм железа: в препаратах из плацентарного и абортного сырья воэ растает содержание трехвалентного железа, в донорских в основном двухвалентного. Возможно, это связано с активацией оачслтел,т-восстановительных процессов в плацентарных и абортных препаратах и высвобождением железа из прочных комплексов в донорских препаратах.

При стимуляции перекисного окисления в препаратах иммуноглобулинов системами, генерирующими супероксидные и гидроксильные радикалы, были обнаружены изменения, близкие происходящим при хранении препаратов. Так, наблвдали нарастание опалесценции и цветности растворов белка. В то же время при стимуляции окисления в готовых препаратах не удалось добиться увеличения уровня МДА, что свидетельствует, очевидно, о его быстрой утилизации в реакциях с белками. Сохранение специфической антительной активности после стимуляции перекисного окисления в готовых препаратах связано „ по-видимому, с устойчивостью иммуноглобулиновой молекулы или ее антигенсвдзывапцих участков к атаке свободными радикалами. Антиокислительная способность препаратов превышает 100 условных единиц, что объясняется как низким содержанием липидов в препаратах иммуноглобулинов, так и структурной защищенностью липидов в составе комплексов с белками.

Удаление части липидов из сырья с помощью сорбентов на основе кремнезема не приводит к значительному улучшению качества препаратов иммуноглобулинов. Результаты анализа препарата,, полученного из сырья, обработанного аэросилом тле, свидетельству*)?;

- 20 -

о его повышенной склонности к агрегации, особенно при термическом старении. При этом наблюдается снижение уровня МДА почти в 3 раза и увеличение содержания шиффовых оснований, особенно выраженное на этапах лиофильной сушки и термического старения.

Введение синтетических антиоксидантов в сывороточное сырье по-разному влияет на качество препаратов независимо от ингиби-рования перекисных процессов в сывороточном сырье. Показано,что наиболее целесообразно введение в сырье водорастворимых антиоксидантов, в частности, диметилсульфоксида в оптимальной концент- ; рации 0,5 % (объемн.). Стабилизация сырья актиоксиданташ приводит к повышению антиокислительной способности и снижению уровня МДА. Однако, в отличие от ионола и бензойной кислоты, только введение диметилсульфоксида (ДМСО) сопровождалось улучшением качества препаратов: уменьшением их опалесценции, цветности и по- . вышением стабильности препаратов при термическом старении. Количество шиффовых оснований в препаратах из сырья, стабилизированного ДМСО, на всех технологических этапах (лиоф^лизация,. фильт- , рация) и после термического старения было ниже, чем в контрольных препаратах.

В целом проведенные эксперименты показали,:что перекисное окисление липидс® играет существенную роль в ухудшении качества препаратов иммуноглобулинов при их получении и хранении. Активация перекисных процессов происходит, скорее всего, в сывороточном сырье и на ранних стадиях спиртового фракционирования, нэгдд имеется достаточное количество ненасыщенных липидов - субстратов окисления, причем для активации достаточно попадания в . сырье прооксидантов - ионов железа и меди. В качестве окислителя способен выступать атмосферный кислород. Перекисные.процессы в сырье и на ранних этапах спиртового фракционирования развиваются интенсивно, что позволяет охарактеризовать эту фазу

. - 21 -

переписного окисления как быструю.

Деструкция белков, развивающаяся после лиофильной сушки, фильтрации и выстаивания, в меньшей степени связана с активацией перекисных процессов, и основную роль при этом играют вторичные продукты перекисного окисления, в частности МДА, реагирующие с белками. Переклсное окисление, происходящее при хранении препаратов, можно охарактеризовать как медленную фазу. Интенсивность перекисного окисления снижена, скорее всего, вследствие значительного уменьшения количества субстратов. Дестабилизации препаратов при хранении способствует высвобоадение холестерина из его эфиров, возможно, вследствие перекианой модификации последних.

ВЫВОДЫ

1. В сывороточном сырье, поступающем на производство иммуноглобулинов, протекают процессы перекисного окисления липидов, наиболее интенсивные в абортном и плацентарном сырье.

2. Активация перекисных процессов в сывороточно сырье сопровождается ухудшением качества выпускаемых препаратов.

3. Этапы лиофильной сушки я фильтрации являются наиболее уязвимыми в отношении перекисного окисления этапами технологического процесса в связи с активным вовлечением белков в реакции

с продуктами окисления лилидов и попаданием в препарат ионов металлов переменной валентности, активирующих перекисныа процессы.

4. Ингибирование перекисных процессов в сырье с помощью некоторых синтетических антиоксидантов приводит к улучшению качества препаратов имцунсглобулинов. В качестве стабилизатора сырья предложен фармакологический препарат диметилсульфоксид

в концентрации 0,5 £ (обьемн.).

-225. Удаление большей часта лиладов ю сырья с помощью сорбентов не исключает возможности протекания перекисиы£ процессов и ухудшения 2;ачесгва препаратов.

€. Для оценки устойчивости липидов сырья к окислению разработан критерий ангаокислительной способности (АОС), пригодный для оценки качества сырья и прогноза качества препаратов иммуноглобулинов.

ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЛИКОВАНЫ СЛЕДУЮЩИЕ РАБОТУ:

1. Благородов С.Г., Дмитриева H.A. Способ определения микроколичеств лиладов. A.c. » 991304 от 21.09.1982 г.

2. Благородов С.Г., Шепелев А.П., Федорова Т.А., ЛМитриева H.A. Определение антиокислительной активности сывороточного сырья и препаратов иммуноглобулина. /Лат-лы Всес. симп., посвящ. 60-летао Тбилисского НИИВС. - Тбилиси, 1984. - С.437-439.

3. Дмитриева H.A., Благородов С.Г., Шепелев АЛ. и др. Влияние антлсксадантов ва некоторые физико-химические показатели качества препаратов иммуноглобулинов }Тез. докл. П Всес.к©нф."Био-ан та оксид анты" (14-16 мая 1986 г.) .- М.,1986. - T.I. -C.I35-I36.

4. Благородов С.Г., Шепелев АЛ., Свечникова Л.В. и лр. ftipe-деление малонового диальдегида и уровня дез эмалирования препаратов иммуноглобулинов /Инфор*. письмо, утвервд. ГУНИИ в КНИ МЗ РСФСР от 24.06.1986 г.

5. Шепелев А.П., ДОнтриева ИЛ., Черсасов А.У., Краснов В.П. Изучение жирнокислотаого состава Препаратов иммуноглобулинов с пдаощьв метода газо-жядкостиой хрсыатографии /Тез. докл. К Всес. конф. по газовой хрсыатографии (25-29 мая 1987 т.). - Куйбдаев, 1987. - С.266-267.

6. Шепелев А.П., Благородов С.Г., Федорова Т.А. г др. Влияние антибиотиков на физико-химические свойства иммуноглобулина чело-

века //Актуальные вопроси иммунологии и иммунопатологии. - Ростов-на-Дону, 1988. - С.102-103.

7. Дмитриева Н.А., Шепелев А.П., Члагородов С.Г. и др. Пере-кисное окисление липидов в препаратах иммуноглобулинов при иг «ранении //Известия СК1Щ HI!. - 1988. - № 4. - C.IXB-I2I.

8. Дмитриева Н.А., Шепелев А.П., Альперович Д .В.и др. Антиокислительная способность сывороточного сырья и ее влияние на качество препаратов иммуноглобулинов //Известия СКНЦ ВШ. - 1989. -й I. - С.118-121.

9. Shepelev А.P., Dmitrieva N.A.., Polyakov V.LI. et al. The effect of free radicals upon immunoglobulin structure and activity. // Int. Conf. "Regulation of free radical reactions (Biomedical aspects). - Varna (Bulg.9. - 1989. - N 165.

10. Влагородов С .Г., Шепелев А.П., Дмитриева TI.A. и др. Ста-Зилизация физико-химических свойств препаратов иммуноглобулинов 1ри хранении //ИМмунобиол. препараты. Сб.научн.тр. - К., 1989.3.38-43.

11. Дмитриева Н.А., Шепелев А.П., Конюхова Н.А. и др. Прогноз качества npedapaTOB иммуноглобулинов //Иммунобиол. препараты. Сб. заучн. тр. -М., 1989. - С.43-47.

ПК 78246. Подписано к печати 24.04.90 г. Объем I п.л. Тирах 100. Заказ 639. Офсетная печать ГКП ПГО "Южгеология"