Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние предшественника оксида азота (NO) L-аргинита на поведение белых крыс
ВАК РФ 03.00.13, Физиология
Автореферат диссертации по теме "Влияние предшественника оксида азота (NO) L-аргинита на поведение белых крыс"
МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В. ЛОМОНОСОВА Биологический факультет
На правах рукописи
од од
САВЕЛЬЕВА Катерина Владимировна
ВЛИЯНИЕ ПРЕДШЕСТВЕННИКА ОКСИДА АЗОТА (N0) -Ь-АРГИНИНА НА ПОВЕДЕНИЕ БЕЛЫХ КРЫС
03. 00.13 - физиология человека и животных
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических паук
Москва -1998
Работа выполнена на кафедре физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова (зав. кафедрой - академик РАМН И.П. Лшмарин).
Научный руководитель:
доктор биологических наук, профессор A.A. Каменский Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, чл.-корр. РАМН К.С.Раевский доктор биологических наук, З.А.Зорнна
Ведущее учреждение: Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН.
Защита состоится 25 мая 1998 г. в 15 часов на заседании Специализированного Ученого Совета Д.053.05.35. Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова по адресу: 119899, Москва, Воробьевы горы, МГУ, Биологический факультет.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.
Автореферат разослан 22 апреля 1998 г.
Ученый секретарь Специализированного Совета,
кандидат биологических наук
ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Известными регуляторами физиологических функций организма млекопитающих являются аминокислоты и их производные, к которым относятся многие медиаторы центральной и периферической нервной системы, например, глицин, глутамат, ГАМК, но-радреналин, серотонин, дофамин и др.
Одной из таких аминокислот является аргинин. Его физиологические эффекты и, в частности, воздействие на функции центральной нервной системы, изучены очень фрагментарно. Практически отсутствуют работы, в которых исследуется действие аргинина на поведение животных. Между гем, в 1987 году было показано совершенно новое свойство L-аргинина как физиологически активного вещества. Он оказался эндогенным источником оксида азота (NO), который является важнейшей сигнальной молекулой в оргштзме человека и животных (Moneada S., 1992; Реутов В.П. и др., 1997). Кроме того, нельзя исключить, что аргинин обладает и собственной биологической активностью, не связанной с биосинтезом N0.
В настоящее время в медицине широко применяются препараты, действие которых связано с выделением NO или блокированием его синтеза. Особенно распространены лекарства-доноры NO, которые применяются при коррекции сердечно-сосудистых расстройств. Также доказано участие N0 в генезе различных нервнодегенеративных заболеваний и предприняты попытки их коррекции при помощи препаратов, влияющих m синтез N0.
Таким образом, можно с полной уверенностью утверждать, что исследование влияния L-аргинина на некоторые функции центральной 1ервной системы является актуальным с точки зрения понимания как фундаментальных основ деятельности мозга, так и практического приме-4ения в клинической практике.
Целью исследования является изучение нейротропных эффектов эн-югенного предшественника NO - L-аргинина - и анализ механизмов вы-шленных эффектов с целью определения возможной роли NO в их генезе.
Задачи исследования. В нашу задачу входило изучение влияния пе-юрального введения различных доз L-аргинина на поведение белых срыс:
1. Изучить характер воздействия различных доз L-аргинина и его функциональных антагонистов на спонтанное поведение крыс.
2. Изучить характер воздействия различных доз L-аргинина и его функциональных антагонистов на ориентировочно-исследовательское поведение и тревожность.
3. Изучить характер воздействия различных доз Ь-аргинина и его функциональных антагонистов на обучение экспериментальных животных с положительным и отрицательным подкреплением.
4. Исследовать анальгетическую активность Ь-аргинина в различных дозах.
5. Определить уровень содержания оксида азота (N0) в различных структурах мозга крыс после введения исследуемых доз Ь-аргинина.
6. Исследовать влияние Ь-аргинина на показатели системной гемодинамики крыс.
7. Сделать заключение о возможных механизмах воздействия Ь-аргинина на поведение животных.
Научная новизна. Впервые систематически и комплексно исследовано воздействие ряда доз Ь-аргинина на различные формы поведения белых крыс. Впервые использован пероральный способ введения, как наиболее естественный для аминокислот путь попадания в организм. Особое значение имеет корректный выбор доз аминокислоты, так как аргинин постоянно поступает в организм крысы с пищей.
Показано, что Ь-аргинин в диапазоне доз от 50 до 500 мг/кг приводит к усилению ориентировочно-исследовательского поведения, ухудшению обучения с положительным подкреплением, снижению болевой чувствительности и другим изменениям в поведении.
Доказано, что выявленные изменения являются следствием увеличения концентрации N0 в головном мозге крыс в результате введения Ь-аргинина. Сделано заключение о том, что изменения в поведении не являются следствием воздействия Ь-аргинина на сердечно-сосудистую систему, а связаны с дополнительным образованием N0 в коре больших полушарий мозга крыс.
Теоретическая и практическая значимость работы. Теоретическая значимость работы заключается в том, что впервые систематически исследовано воздействие Ь-аргинина на механизмы центральной нервной системы, участвующие в регуляции различных форм поведения, и сделано заключение, что в основе эффектов Ь-аргинина лежит его свойство образовывать N0. Впервые получены дшшые о возможности получения значимых изменений поведения под действием Ь-аргинина, вводимого в дозах, не намного превышающих количество этой аминокислоты в суточном рационе крыс. Полученные данные желательно учитывать при клиническом использовании лекарств-доноров N0, например, кард-иотропных средств. Тот факт, что функциональные антагонисты Ь-аргинина - блокаторы синтеза N0 - также оказывают воздействие на по-
ведение животных, открывает возможности для поиска и разработки новых средств для коррекции нервнодегенератавпых расстройств.
Апробация работы. Результаты работы были изложены на международной научной конференции "Традиционная медицина и питание" (Мо-:ква, 1994), на 1-ом Европейском Фармакологическом конгрессе (Милан,
1995), на 1-ом съезде Российского научного общества фармакологов [Волгоград, 1995), на 1-ом конгрессе Немецкого Общества Нейронаук [Берлин, 1996), на 6-ом международном съезде Европейского Общества 10 изучению фармакологического воздействия на поведение (Кальяри,
1996), на 27-й и 28-й конференции Международного общества изучения товедения (Канкун, 1996 и Сан Диего, 1997), на 1-ом Российском конгрес-;е по патофизиологии (Москва, 1996), на 2-ом съезде Европейской Ассоциации Нейронаук (Страсбург, 1996), на 6-ом Международном конгрессе 10 биологической психиатрии (Ницца, 1997), на 6-ом съезде Международной Ассоциации по Нейротоксикологии (Венгрия, 1997), на XXXIII Интернациональном конгрессе физиологических наук (Санкт-Петербург,
1997) и на 2-ой Финско-Русской зимней физиологической школе (Фин-тяндия, 1998). Диссертация была апробирована на заседании кафедры физиологии человека и животных Биологического факультета МГУ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит 13 введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и лиска литературы. Работа изложена на 181 страницах, содержит 31 ри-:унок и 34 таблицы. Список цитированной литературы включает 232 источника.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Работа выполнена на взрослых самцах нелинейных белых крыс весом 180-230 г. Всего в работе использовано 1933 крысы. В экспериментах по 1зучению поведения животных применяли следующие препараты: L-фгинин гидрохлорид (L-Arg, Reanal); D-аргинин гидрохлорид (D-Arg, Icanal); метиловый эфир NG-HiiTpo-L-aprinnina (L-NAME, Sigma); NG-ппро-Ь-аргинин (L-NA, Sigma), налоксон (Serva).
В экспериментах по определению концентрации NO в различных отделах мозга крыс после введения L-Arg применяли следующие реагенты: щэтилдитиокарбамат (ДЭТК, Sigma); цитрат натрия; железо сернокислое ¡акисное (FeS04x7H20).
В экспериментах по изучению сердечно-сосудистых эффектов L-Arg грименяли следующие препараты: гепарин (Roche); кетамин (Sigma).
Применяли два способа введения препаратов. L-Arg и D-Arg вводили перорально в объеме 3.2 мл/кг веса животного. Блокаторы синтеза NO и другие реагенты вводили внутрибрюшинно в объеме 1 мл/кг веса животного.
Для оценки спонтанного поведения животных мы использовали ак-тометр "Opto-Varimex" ("Columbus Instruments", США), тест "открытое поле" и приподнятый крестообразный лабиринт (X-maze).
Для оценки способности животных к обучению использовали следующие модели обучения:
1) выработка условного пищедобывательного рефлекса на место в сложном лабиринте с множественными отсеками и в Т-образном лабиринте.
2) выработка условного рефлекса пассивного избегания (УРПИ).
Для определения болевой чувствительности животных использовали метод "отдергивания хвоста" (tail flick) и метод "горячая пластина" ("Ugo Basile", Италия).
В работе также исследовали другие параметры физиологического состояния организма животных: статическую физическую выносливость (тест "вертикальная сетка"), способность к координации движений и сохранению равновесия в условиях вызванной двигательной активности (тест "вращающийся стержень"), определение уровня пищевой мотивации.
Кроме того, определяли содержание N0 в различных структурах мозга методом ЭПР (Ванин А.Ф. и др., 1984) и действие L-аргинина на показатели системной гемодинамики крыс (Родионов И.М. и др., 1995).
При обработке результатов использовали стандартные методы статистического анализа. При сравнении характеристик массивов применяли как параметрические (Стыодента, Фишера), так и непараметрические (Виякоксона, Манна-Уитни и др.) критерии. Названные операции осуществляли с помощью пакетов статистических программ "Statgraf", "Statis-tica" и "Stadia".
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В нашем исследовании удалось показать, что пероралыюе введение L-аргинина в дозах 50, 100 и 250 мг/кг вызывает многочисленные изменения в поведении белых крыс. С самого начала работы мы предположили, что эффекты L-аргинина связаны с тем, что он является эндогенным предшественником NO. Уже на первом этапе работы анализ полученных данных при помощи блокаторов синтеза NO из L-аргинина и его неактивного стереоизомера - D-аргинина - показал, что действие L-Arg, действительно связано с дополнительным образованием NO в организме.
1. Влияние L-арпптна и его функциональных антагонистов на двига-гельнуго активность и ориентировочно-исследовательское поведите фЫС.
Показано, что при введении L-Arg за 10 минут до тестирования к достоверному увеличению как горизонтальной компоненты двигательной активности, так и вертикальной приводило только введение L-Arg в дозах 250 и 500 мг/кг (рис.1).
!500 !000 500 ООО 500 О
L-аргинин (per os)
*
Л, *
ш
А
'///.
ш
W ■ i
контроль 250 мг/кг 500 мг/кг
М-нитро-1_-аргинин (i.p.)
1-5
6-10
2000 1500 1000 500 0
JL
'Ш
Ш/:
Ш
контроль 0.5 мг/кг 5 мг/кг
1-5
6-10
* - р<0.05; ** - р<0.01
Рис.1 Влияние введения L-аргинина и №-нитро-Ь-аргинина за 10 мин до тестирования в приборе "Opto-Varimex" на горизонтальную двигательную активность крыс.
Данное увеличение было наиболее выражено в течение первых пяти минут регистрации. Блокатор NO-синтазы - N-ifflTpo-L-apnnmn (L-NA) в дозах 0.5 и 5 мг/кг- оказывал на двигательную активность крыс противоположное по сравнению с L-аргинином действие. Он вызывал снижение горизонтальной двигательной активности как в течение первых пяти ми-¡£ут, так и по сумме всех 10 минут регистрации.
При введении исследуемых веществ за 30 минут до тестирования введение L-Arg в дозах 50, 100 и 250 мг/кг приводило к достоверному уве-
личеншо вертикальной двигательной активности по сумме всех 15 минут регистрации (рис.2). Введение блокатора синтеза оксида азота - метилового эфира нитроаргинина (L-NAME) в дозе 10 мг/кг приводило к достоверному снижению как горизонтальной, так и вертикальной двигательной активности животных. D-Arg не оказывал влияния на двигательную активность крыс.
►д
а
80 70 60
а so
<и
К 40
-с
X «
О
и
о >>
30 20 10
I
i
г>
/
Рис.2. Влияние введения различных доз Ь-аргинина и метилового эфира №-нитро-Ь-аргишша за 30 мин до тестирования в приборе "ОрЮ-Уапшех" на вертикальную двигательную активность крыс.
контроль 50 мг/кг 100 мг/кг
250 мг/кг L-NAME
* - р<0.05; # - р<0.001
Проведение однофак-торного дисперсионного анализа (ANOVA) показало, что зависимость доза-эффект при введении L-Arg достоверна для вертикального компонента двигательной активности крыс.
На основании полученных данных можно заключить, что введение L-Arg в дозах 50, 100 и 250 мг/кг приводит к усилению ориентировочно-исследовательской реакции и повышению двигательной активности крыс. При этом блокаторы синтеза NO из L-аргинина - L-NA и L-NAME - наоборот снижают двигательную активность животных, а D-Arg, не являющийся источником NO, не оказывает влияния на ее параметры.
При анализе литературных данных мы не нашли работ, в которых исследовалось бы прямое влияние L-Arg и его аналогов на ориентировочно-исследовательское поведение и двигательную активность крыс. Однако существует ряд данных, подтверждающих участие NO в процессах, регулирующих ориентировочно-исследовательскую реакцию. В част-
яости, ингибитор 1ЧО-синтазы, вводимый в желудочек мозга, подавляет реакцию пробуждения в ответ на звуковое раздражение О^еМа й а1., 1993). Следовательно, N0 может быть одним из факторов, необходимых гцся поддержания бодрствующего состояния и регуляции ориентировочно-исследовательской реакции.
Зарегистрированное нами увеличение двигательной активности может быть связано либо с неспецифическим активирующим действием Ь-Агя, либо с его направленным действием на ориентировочно-исследовательское поведение.
Для того, чтобы разделить эти компоненты поведения, мы провели :ерию экспериментов по предварительному угашеншо ориентировочно-исследовательского поведения и тревожности при попадании животных в новую экспериментальную среду. Для этого мы адаптировали животных [с экспериментальной камере прибора "Опто-Варимекс" в течение 3 дней.
Как видно из рисунка 3, в результате процесса угашения ориентаро-зочно-исследовательской реакции к 3-му дню в общей группе животных наблюдалось снижение горизонтальной двигательной активности на 40%. Вертикальная двигательная активность снизилась на 60% по сравнению с 1-м днем.
горизонтальная активность вертикальная активность
40 т-
100
¡00
юо
00
о
5 10 15 20 25 30
5 10 15 20 25 30
Рис.3. Динамика двигательной активности в процессе угашения ориенти-эовочно-исследовательской реакции при адаптации животных к экспериментальной камере прибора "Ор1о-Уапшех".
На 4-й день вещества вводили за 30 минут до тестирования крыс в "Опто-Варимексе". Значимые отличия от контрольной группы наблюдались только в течение 1-5 минут регистрации (рис.4). Введение Ь-А^ в дозе 100 мг/кг приводило к увеличению горизонтальной активности. 0-Аг£ не приводил к изменениям в двигательной активности крыс. Введение Ь-ЫАМЕ в дозе 10 мг/кг вызывало снижение и горизонтальной, и вертикальной двигательной активности. Введение Ь-А^ через 5 минут после Ь-КАМЕ приводило к частичной компенсации вызываемого блокатором снижения двигательной активности, в результате чего показатели двигательной активности в данной группе не отличались от контрольных.
горизшггальная активность
вертикальная активность
2000
1500
1000
500
[— ] контроль
Ь-А^ (100 мг/кг) Г77УЛ О-А^ (100 мг/кг)
Г7-Т7-1 ЫЧАМЕ (10 мг/кг) ШД L-NAME+L-Aгg
Рис.4. Действие различных препаратов, влияющих на синтез N0, на двигательную активность крыс с предварительно угашенной ориентировочно-исследовательской реакцией в течение первых пяти минут регистрации.
Таким образом, у животных с предварительно угашенным ориентировочно-исследовательским поведением стимуляторный эффект Ь-Аг§ все равно проявляется. Это подтверждает наше предположение о том, что Ь-А^ может целенаправленно усиливать ориентировочно-исследовательское поведение, так как именно в первые минуты эксперимента данный тип поведения преобладает.
Для дополнительной проверки этого предположения и изучения ориентировочно-исследовательского поведения использовали тест "открытое поле". В данной серии экспериментов нами подтверждено, что L-Arg направленно усиливает ориентировочно-исследовательское поведение, о чем свидетельствует увеличение пробега и стоек и снижение интенсивно-сга груминга и количества дефекаций под действием L-Arg.
2. Влияние L-аргинина на тревожность животных.
Приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) является одной из
моделей изучения тревожности и страха на крысах (Dawson G.R. et al., 1995).
Показано, что введение L-Arg за 30 минут до тестирования в дозе 50 мг/кг не оказывало действия на показатели поведения крыс в ПКЛ. L-Arg в дозе 100 мг/кг вызывал наибольшее количество изменений в поведении крыс: агажение времени, проведенного на свету, увеличение числа переходов через центр арены, увеличение высовываний из открытых концов лабиринта и увеличение интенсивности груминга. L-Arg в дозе 250 мг/кг вызывал значимое снижение количества высовываний из открытых рукавов лабиринта.
Таким образом, при введении за 30 минут L-Arg в дозе 100 мг/кг происходит с одной стороны усиление ОИР, что выражается в увеличении количества переходов и высовываний, а с другой стороны - усиление тревожности, что выражается в снижении времени пребывания на свету и увеличении интенсивности груминга. В случае введения L-Arg в дозе 250 мг/кг снижение количества высовываний служит косвенным показателем усиления пассивно-оборонительной реакции.
3. Влияние L-аргинина и на обучение животных с положительным и
отрицательным подкреплением.
В связи с наличием многочисленных литературных данных об ухудшении обучения под действием блокаторов NO-синтазы, мы провели отдельную серию экспериментов по обучению крыс.
I. Обучение в сложном и Т-образном лабиринте.
Показано, что L-Arg в дозах 50 и 100 мг/кг при введении как после сеанса обучения, так и за 30 минут до него приводит к ухудшению выработки пищедобывательного рефлекса на место (рис.5). Данное ухудшение выражается, в основном, в снижении количества выполненных реакций (КВР), начиная с 3-го дня обучения. Введение L-Arg в дозе 250 мг/кг после сеанса обучения приводит к ухудшению обучения, что выражается в снижении КВР, а также в увеличении количества ошибок в результате усиления ориентировочно-исследовательской реакции в сложном лаби-
ринте. При введении до сеанса обучения Ь-А^ в дозе 250 мг/кг практически не влияет на обучение крыс.
сложный лабиринт введение сразу после сеанса обучения
Т-образный лабиринт введение за 30 минут до сеанса обучения
дни обучения
—•— контроль --•а--- 50 мг/кг
100 мг/кг >— 250 мг/кг
Рис.5. Влияние различных доз Ъ-аргинина на количество выполненных реакций при обучении крыс с положительным подкреплением.
В группах, получавших Ь-А^, количество хорошо обучившихся животных меньше, чем в контроле. Кроме того, если в контрольной группе навык вырабатывается у животных как с исходно высоким, так и исходно низким количеством выполненных реакций, то в опытных группах животные с исходно низким показателем практически не обучаются.
Через неделю после обучения нами проверялась степень сохранности пшцедобывательного навыка у крыс. Показано, что Ь-А^ во всех использованных дозах практически не влияет на данный показатель.
Чтобы подтвердить свое предположение о том, что выявленные эффекты Ь-Аг£ связаны с дополнительным синтезом N0, в следующей серии экспериментов по обучению мы вводили крысам блокатор синтеза N0 - Ь-КАМЕ в дозе 10 мг/кг за 35 мин до сеанса обучения, а также проводили его совместное введение с Ь-А^ в дозе 100 мг/кг. Блокатор вво-
пили за 5 минут до введения L-Arg и ещё через 30 минут начинали сеанс обучения.
Показано, что введение одного L-NAME до сеанса обучения приводило только к значимому снижению КВР в 1-й день обучения (рис.6). Введение L-NAME за 5 минут до L-Arg не предотвращало, а даже усиливало вызываемое L-аргинином ухудшение обучения.
В другой серии экспериментов животным вводили L-NAME в дозе 10 мг/кг или D-Arg в дозе 100 мг/кг после сеанса обучения.
А. Введение веществ до сеанса обучения
Б. Введение веществ сразу после сеанса обучения
дошобучения
—в— контроль —L-NAME --•-- L-NAME+L-Arg -о- L-Arg
—и— контроль —г- L-NAME -о- D-Arg
р<0.05; ** - р<0.01; # - р<0.001
4
Рис.6. Влияние L-аргинина и его аналогов при введении за 30 минут до гаи сразу после сеанса обучения на количество выполненных реакций в Т-|бразном лабиринте.
Показано, что D-Arg в дозе 100 мг/кг практически не оказывал лияния на процесс обучения (рис.6). Введение L-NAME сразу после сенса обучения приводило к значимому увеличению КВР уже на 2-й день
эксперимента. На 3-й день обучения у всех крыс данной группы КВР равнялось 5. Таким образом, введение L-NAME после сеанса обучения способствует выработке условного рефлекса с пищевым подкреплением.
На основании полученных нами данных можно заключить, что L-Arg в дозах 50 и 100 мг/кг при введении за 30 минут до сеанса обучения препятствует выработке условного рефлекса на место с пищевым подкреплением. L-Arg во всех исследованных дозах ухудшает выработку навыка при введении сразу после сеансов обучения, а также не влияет на степень сохранности ранее выработанного навыка. Увеличите ориентировочно-исследовательской реакции, зарегистрированное в других тестах, также может отрицательно влиять на выработку навыка. Таким образом, ухудшение обучения под действием L-Arg скорее всего связано как с торможением процесса консолидации, так и с усилением ориентировочно-исследовательского поведения на последних этапах обучения.
В связи с наличием литературных данных о влиянии NO и веществ, участвующих в его метаболизме, на пищевое поведение животных, можно было бы предположить, что ухудшение обучения крыс под действием L-Arg является следствием снижения пищевой мотивации после введения данной аминокислоты (Choi et al., 1995; Yamada et al., 1996). Однако, нами показано, что введение различных доз L-Arg не оказывает влияния на уровень пищевой мотивации.
II. Выработка условного рефлекса пассивного избегания.
Поскольку механизмы обучения в тестах с положительным и отрицательным подкреплением различаются, в следующей серии экспериментов нам было интересно исследовать действие L-Arg на процесс обучения с отрицательным подкреплением.
В данном эксперименте L-Arg вводили за 30 минут до сеанса обучения животных в камере УРПИ и регистрировали латентный период перехода из светлого отсека камеры в темный (ЛП1). При тестировании через неделю также регистрировали латентный период (ЛП2).
Введение L-Arg в дозе 50 мг/кг не приводило к изменениям в ЛП2. Введение L-Arg в дозе 100 мг/кг, которая наиболее сильно ухудшала обучение с пищевым подкреплением, также не оказывало влияния на выработку УРПИ. D-Arg в дозе 100 мг/кг также не вызывал изменений в обучении животных. Введение L-Arg в дозе 250 мг/кг приводило к значимому увеличению латентного периода перехода из светлого отсека в темный при повторном тестировании крыс. Количество обучившихся животных в данной группе составило 73% от общей величины группы, в то время как в контроле - всего 46% от величины группы (р<0,01).
Возможным механизмом описанных выше эффектов L-Arg на обучение является его воздействие на мотивационные составляющие пове-цсния. Скорость выработки навыка в лабиринте с пищевым подкреплением, как известно, определяется соотношением двух мотиваций: пище-цобывательной и пассивно-оборонительной. В случае доминирования последней наблюдается снижение активности животных и замедление обучения. Устойчивое доминирование тпцедобывательной мотивации вызывает ускорение выработки навыка.
Из полученных нами данных следует, что ухудшение обучения с положительным подкреплением под действием L-Arg скорее всего связано с усилением тревожности и ОИР, которое выражается в увеличении количества ошибок, стоек и др. показателей спонтанного поведения.
Совсем другие процессы определяют поведение крыс при выработке навыков с болевым подкреплением. В тесте УРПИ переход в темный этсек животное совершает под влиянием не только исследовательского поведения, но и врожденного предпочтения темных участков про-лранства (Буреш и др., 1991). В отличие от условного пищедобыватель-ного рефлекса, при выработке УРПИ пассивно-оборонительная мотивация является доминирующей: именно она запускает программу соответствующего поведенческого акта. Усиление данной мотивации приводит к улучшению обучения, то есть к уменьшению числа животных, перешедших при повторной посадке в темный отсек, что и наблюдалось в случае введения 250 мг/кг L-Arg. Таким образом, можно предположить, что улучшение выработки УРПИ после введения 250 мг/кг L-Arg обу-:ловлено усилением оборонительной мотивации и страха перед новой обстановкой. Эти данные совпадают с полученными в серии экспериментов в приподнятом крестообразном лабиринте.
Данные, полученные в приподнятом крестообразном лабиринте, показывают, что L-Arg в дозе 100 мг/кг усиливает и тревожность, и ориентировочно-исследовательское поведение. Поэтому такой баланс приводит к тому, что данная доза не влияет на выработку условного рефлекса пассивного избегания.
4. Влияние L-аргинина на болевую чувствительность крыс.
В связи с тем, что в литературе существуют данные о том, что некоторые блокаторы NO-синтазы обладают анальгетическим действием, следующая часть данной работы была посвящена изучению влияния L-\rg на болевую чувствительность крыс.
Нами показано, что введение L-Arg в дозах 50 и 100 мг/кг приводит < снижению болевой чувствительности крыс в тесте "отдергивания хвоста", а D-Arg не влияет на болевую чувствительность. Эффект зависит от исходной болевой чувствительности крыс.
Из рисунка 7 видно, что при введении Ь-А^ в дозе 50 мг/кг анальгезия возникает за счет крыс с исходно низкой болевой чувствительностью
50 мг/кг
100 мг/кг
о
-5
120
£ го
ф
Ь 6
с;
"О о х 3 га
ё 0 о ' ч
-6 -9
20
-1—
40
-1 ' ,-
60 80
время, мин
100 12
Рис.7. Влияние Ь-аргинина на болевую чувствительность крыс с исходно высокой —•— и исходно низкой болевой чувствительностью. * - р < 0.05; ** - р < 0.01; # -р < 0.001.
и пик действия приходится на 40 минут после введения. В случае введения 100 мг/кг анальгезия быстрее развивается у крыс с исходно низкой болевой чувствительностью (значимые изменения через 20 минут после введения). У крыс с исходно высокой болевой чувствительностью снижение времени реакции возникает позже (через 50 минут после введения), но сохраняется значительно дольше (последняя достоверная точка - 120 минут после введения).
Ь-ЫАМЕ в дозе 10 мг/кг обладает кратковременным анальгетичс-ским действием, регистрируемым через 20-40 минут после инъекции (рис.8). При совместном введении Ь-А^ и блокатора синтеза N0 зареги-
стрировано взаимное ослабление эффектов. Через 30-40 минут после введения веществ, когда развиваются анальгетические эффекты как Ь-
NAME, так и Ь-А^, значимые изменения в группе с совместным введением отсутствуют.
время после введения, мин
Рис. 8. Влияние Ь-аргинина в дозе 100 мг/кг, Ь-ЫАМЕ в дозе 10 мг/кг и их совместного введения на болевую чувствительность крыс в тесте "отдергивания хвоста". По вертикальной оси отложено изменение латентного периода отдергивания хвоста по сравнению с фоновыми значениями. • *- р<0.05.
Можно предположить, что как повышение концентрации N0 после введения Ь-Агд, так и снижение его концентрации после введения блокатора синтеза N0 вызывает анальгезию. При совместном введении данных веществ уровень N0 меняется незначительно и, гаким образом, отличий от контроля не наблюдается.
В тесте "горячая пластина" Ь-Аг§ в дозах 50 и 250 мг/кг также вызывал анальгезию.
Чтобы проверить связаны ли анальгетические эффекты Ь-Агд с дей-лвисм на опиатные рецепторы, мы вводили крысам налоксон, известный как неизбирательный блокатор опиатных рецепторов, в дозе 1 мг/кг.
Показано, что введение одного налоксона не вызывает значимых изменений в болевой чувствительности крыс (рис.9). Введение налоксона за 5 минут до введения Ь-Агд в дозе 50 мг/кг не подавляет вызываемого Ь-аргинином снижения болевой чувствительности.
—•— контроль • о 1_-Агд
1_-ЫАМЕ -V- 1_-МАМЕ+1_-Агд
Рис.9. Влияние Ь-аргинина в дозе 50 мг/кг, налоксона в дозе 1 мг/кг и их совместного введения на болевую чувствительность крыс в тесте "горячая пластина". * - р<0.05.
Известно, что налоксон связывается с несколькими типами опиатных рецепторов, хотя более высокое сродство он имеет к опиатным рецепторам ц-типа. Так как Ь-аргинин проявляет анальге-тическую активность и на фоне действия налоксона, можно предположить, что его действие опосредуется не через опиоидергическую систему, по крайней мере не через ц-опиатные рецепторы.
5. Определение содержания N0 в структурах мозга.
Так как нами было зарегистрировано изменение ряда параметров поведения крыс после введения L-Aтg в дозах 50, 100 и 250 мг/кг, то на следующем этапе работы было логично доказать, что его эффекты могут быть связаны с дополнительным синтезом N0.
Измерения концентрации N0 проводили методом ЭПР в трех отделах головного мозга белых крыс: коре больших полушарий, подкорковых структурах (которые включали промежуточный и средний мозг) и мозжечке. Введение препаратов, забой животных и подготовка проб проводились нами самостоятельно. Регистрация спектров ЭПР и количественное определение концентрации N0 в мозге производились в институте химической физики РАН в лаборатории проф. Ванина.
Было показано, что через 30 мин после введения L-AIg в дозах 50, 100 и 250 мг/кг происходит достоверное увеличение концентрации N0 в коре больших полушарий мозга крыс (рис.10).
-5 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 И
налЬ-А^ время, мин
- Ь-Агд —- налоксон налоксон+Ь-А^
введение Ь-Ащ за 30 минут до декапнта1цш
введение Ь-Агд за 60 мипут до декапитации
контроль гм*™ 50 мг/кг - ■• ■ 100 мг/кг ^ет 250 мг/кг
Рис.10. Концентрация NO-ДЭTK комплексов (нмоль/г влажной ткани мозга) в коре больших полушарий мозга крыс в % от контрольных значений.
В подкорковых структурах и мозжечке достоверных отличий не обнаружено. Через 1 час после введения Ь-А^ в дозах 50 и 250 мг/кг зарегистрировано снижение содержания N0 в коре по сравнению с контролем (рис.10). Это снижение возможно объясняется тем, что синтез N0 может регулироваться самим образующимся N0 по механизму обратной связи.
6. Влияние Ь-аргинина на показатели системной гемодинамики крыс.
В связи с тем, что существует множество данных о влиянии N0 на тонус сосудов и кровяное давление, на следующем этапе данной работы перед нами стояла цель выяснить не являются ли зарегистрированные нами изменения в поведении животных следствием периферических эффектов N0.
Показано, что Ь-А^ только в дозе 250 мг/кг оказывал выраженное действие на показатели системной гемодинамики крыс, а именно приводил к снижению артериального давления и частоты сердечных сокращений, которые значимо отличались от контрольных значений практически в течение всего времени регистрации.
Таким образом, для проявления поведенческих эффектов Ь-аргинина достаточно меньших доз, чем для воздействия на сердечно-сосудистую
систему. Возможно, в основе действия L-аргинина на поведение и его действия на сердечно-сосудистую систему лежат различные механизмы.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Известно, что NO в физиологических концентрациях является необходимым фактором нормального функционирования центральной нервной системы, в частности, процессов, лежащих в основе обучения (Zorumski et al., 1993; Bannerman et al., 1994), поддержания бодрствующего состояния (Bagetta et al., 1993) и др. С другой стороны, на основании наших данных мы можем заключить, что полученное другими авторами в экспериментах in vitro цитотоксическое действие избыточных количеств NO на клетки мозга (Dawson et al., 1991; Snyder, 1992), может быть причиной нарушения различных форм поведения.
С этим предположением согласуются полученные нами данные. Показано, что в реализации таких сложных форм поведения как обучение и ориентировочно-исследовательское поведение основная роль принадлежит коре больших полушарий (Воронин, 1990). Таким образом, повышение содержания N0 именно в коре больших полушарий, по-видимому, является причиной выявленных изменений в поведении животных (усиление ОИР, нарушение выработки пшцедобывательного рефлекса на место и др.).
Зарегистрированное нами после введения L-Arg увеличение ОИР возникает именно в тот период, когда уровень NO в коре больших полушарий повышен. И уже через час после введения L-Arg, когда уровень N0 снижается, мы не наблюдаем значимых изменений в ориентировочно-исследовательском поведении крыс.
Также известно, что NO является нейромедиатором в процессах синаптической пластичности в мозжечке (Shibuki and Okada, 1991; Crepel et al., 1990) - структуре, специфически вовлеченной в реализацию моторных программ. Но, как показали наши исследования, уровень N0 в мозжечке не изменялся после введения L-Arg и повышался только в коре головного мозга. Эти данные лишний раз подтверждают, что L-Arg действует не на спонтанную двигательную активность, которая реализуется преимущественно на уровне мозжечка, а на более сложные формы поведения (в частности, ОИР), в регуляции которых ведущую роль играет кора больших полушарий головного мозга.
Что касается воздействия L-Arg на обучение, можно предположить, что образующийся в избытке N0 вызывает повреждение клеток и, таким образом, происходит снижение синаптической пластичности. В результате крысы, которым вводили NO, обучаются хуже, чем контрольные. Наиболее сильные нарушения в обучении животных мы наблюдаем в последний день обучения. Этот факт хорошо согласуется с тем, что в нервных
слетках цитотокеическое действие N0 имеет место после длительной активации конститутивной NO-синтазы. В норме такая ситуация является деключительной, так как нейрональная NO-синтаза синтезирует, как фавило, лишь небольшие количества NO, выполняющие чисто физиоло-тгаеские, регуляторные функции (Марков, 1996). Тот факт, что D-Arg не шияет на ОИР и обучение крыс, подкрепляет предположение о том, что к вменениям в поведении приводит именно синтезируемый из L-Arg оксид изота.
Влияние L-аргинина на показатели гемодинамики крыс, по-видимому, I большей степени связано с выделением N0 из сосудистого эндотелия, а :акже с его возможным действием на периферическую нервную систему. Данное предположение подтверждается тем, что после введения разных доз ^-аргинина мы наблюдаем одинаковое увеличение уровня NO в мозге фыс. Однако на показатели системной гемодинамики действует только таксимальная доза.
Полученные нами данные показывают, что избыточные количества ^-аргинина, как предшественника NO, оказывают ряд неблагоприятных ффектов на поведение белых крыс. В связи с тем, что в настоящее время i клинике начали применять препараты, действие которых связано с выделением N0 или блокированием NO-синтазы, важно учитывать тот [)акт, что действие этих препаратов далеко не однозначно. Особенно это :асается распространенных лекарств-доноров NO, которые применяются фи коррекции сердечно-сосудистых расстройств.
ВЫВОДЫ
1. Введение L-аргинина в диапазоне доз от 50 до 500 мг/кг приво-(ит к усилению ориентировочно-исследовательского поведения, что вы-)ажается в увеличении горизонтальной и вертикальной двигательной активности белых крыс. Блокаторы синтеза NO - N-Hmpo-L-аргииип (L->{А) и метиловый эфир N-Hmpo-L-apnnniHa (L-NAME) оказывают про--ивоположное действие на ориентировочно-исследовательскую реакцию. Эффекты L-аргинина не развиваются на фоне действия блокатора синтеза ■Ю - L-нитроаргинина.
2. Введение L-аргинина в дозе 100 мг/кг приводит к увеличению ревожности, а введение L-аргинина в дозе 250 мг/кг усиливает проявле-П1я пассивно-оборонительного поведения у крыс.
3. L-аргинин в дозах 50 и 100 мг/кг оказывает угнетающее юздействие на выработку условного пищедобывательного рефлекса в ложном и Т-образном лабиринтах. При этом L-аргинин не влияет на гищевую мотивацию животных.
4. L-аргинин в дозах 50, 100 и 250 мг/кг снижает болевую чувствительность крыс. Этот эффект носит экстраопиатный характер, так как не блокируется предварительным введением налоксона.
5. Введение L-аргинина в дозах 50, 100 и 250 мг/кг приводит к практически одинаковому увеличению уровня NO в коре больших полушарий крыс через 30 минут после введения. Через 1 час после введения L-Arg в дозах 50 и 250 мг/кг зарегистрировано снижение содержания NO в коре. В мозжечке и подкорковых структурах, включающих промежуточный и средний мозг, уровень NO практически не изменялся.
6. L-аргинин вызывает снижение артериального давления и частоты сердечных сокращений только в дозе 250 мг/кг. Этот факт позволяет предположить, что для проявления поведенческих эффектов NO требуются меньшие дозы L-аргинина, чем для воздействия на сердечнососудистую систему.
7. Полученные данные позволяют заключить, что пероралънос введение L-аргинина приводит к целому ряду значительных изменений в поведении крыс, в основе которых лежит возрастание уровня NO в некоторых отделах мозга.
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Каменский A.A., Савельева К.В., Сарычева Н.Ю., Дубынин В.А. Исследование влияния нитроаргинина на двигательную активность белых крыс // В книге "Биология, экология, биотехнология и почвоведение". Издательство Московского университета, 1994. - с.47-53.
2. Савельева К.В., Дубынин В.А., Каменский A.A. Нейротропная активность перорально вводимого L-аргинина // Материалы I международного научного конгресса "Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты". - Москва, 1994. - с.297.
3. Дубынин В.А., Федюшина С.С., Стрюков С.Н., Савельева К.В., Каменский A.A., Ашмарин И.П. Эффекты L-аргинина и его функционального антагониста N-Hrnpo-L-apramnia на поведение // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1995. -NIL- с.465-468.
4. Савельева К.В., Каменский A.A. Анальгетическая активность L-аргинина // Сб. тезисов 1-го Съезда Российского научного общества фармакологов. - Волгоград, 1995. - с.366.
5. Kamensky A.A., Savelieva K.V. The influence of NO precursor - L-arginine - on white rat behaviour // Abstract book of the First European Congress of Pharmacology. - Milan, Italy. - 1995. - p.58.
6. Савельева K.B., Каменский AA, Ашмарин И.П. Избыток пищевого аргинина тормозит выработку пшцедобывательного навыка у белых крыс II Журнал ВНД им. И.П.Павлова. - 1996. - т.46. - вып.2. - с.301-308.
7. Savelieva K.V., Mikoyan V.D., Vanin A.F., Kamensky A.A. The influence of L-arginine injected per os on the brain NO concentration and locomotor activity in white rats // Abstracts of the I Коп§геЯ der Neurowissenschaftli-chen Gesellschaft. - Berlin, Germany. - 1996. - p.193.
8. Savelieva K.V., Tarasova O.S., Mikoyan V.D., Vanin A.F., Kamensky A.A. Elevation of brain nitric oxide impairs learning in rats // Behavioural Pharmacology. - 1996. - V.7, suppl. 1. - p. 100.
9. Savelieva K.V., Sebentsova E.A., Kamensky A.A., Ashmarin I.P. Effects of nitric oxide precursor - L-arginine - on learning in rats with positive and negative reinforcement // Abstracts of the International Behavioral Neuroscience Society. - Cancun, Mexico. - 1996. - V.5. - p.52.
10. Савельева K.B., Микоян В.Д., Ванин А.Ф., Каменский А.А., Ашма-рин И.П. Повышенные дозы пищевого L-аргинина приводят к нарушениям поведения у белых крыс // Тезисы докладов Первого Российского Конгресса по патофизиологии с международным участием. -Москва, 1996.-c.25.
11. Sebentsova Е.А., Savelieva K.V., Kamensky А.А., Ashmarin I.P. L-arginine possesses analgesic activity // European Journal of Neuroscience. -1996. - Suppl.9. - p.96.
12. Kamensky A.A., Savelieva K.V., Sarycheva N.Yu., Dubinin V.A. L-arginine does not eliminate the decrease in locomotor activity of albino rats caused by N-nitro-L-arginine // Program "Universities of Russia". - Biology. - 1996.-p.7-B.
13. Savelieva K.V., Kamensky A.A. Nitric oxide precursor - L-arginine - increases exploratory behaviour in habituated rats // Abstracts of the International Behavioral Neuroscience Society. - San Diego, USA. - 1997. - V.6. -p.42.
14. Savelieva K.V., Kamensky A.A. Oral administration of nitric oxide precursor - L-arginine - impairs learning ability in rats // Abstracts of the 6th World Congress of Biological Psychiatry. - Nice, France. - 1997. - P. 14-140.
15. Savelieva K.V., Kamensky A.A. Some behavioural disorders caused by L-arginine and its analogues // Abstracts of the 6th Meeting of the International Neurotoxicology Association. - Szeged, Hungary. - 1997. - p.94.
16. Savelieva K.V., Vanin A.F., Tarasova O.S., Kamensky A.A. Physiological effects of L-arginine // Abstracts of ХХХШ International Congress of Physiological Sciences. - St. Petersburg, Russia. - 1997. - P087.17.
17. Савельева K.B., Себенцова E.A., Микоян В.Д., Ванин А.Ф., Каменский A.A. Предшественник оксида азота - L-арпшин - снижает болевую чувствительность крыс при пероральном введении // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1997. - том 124, N11. -с.498-501.
- Савельева, Катерина Владимировна
- кандидата биологических наук
- Москва, 1998
- ВАК 03.00.13
- Половые и видовые особенности NO-зависимых механизмов регуляции деятельности почек
- Влияние электромагнитного облучения терагерцового диапазона на частотах молекулярного спектра излучения и поглощения оксида азота150,176 - 150,664 ггц на морфофункциональные изменения микроциркуляции
- Половой диморфизм в реакции гликопротеидных рецепторов эритроцитов и тромбоцитов на электромагнитное облучение терагерцового диапазона на частотах молекулярного спектра излучения и поглощения оксида а
- Электромагнитные волны терагерцевого диапазона на частотах молекулярного спектра оксида азота 150,176-150,664 ГГц в коррекции экспериментальных гемодинамических изменений
- Изменение содержания оксида азота в тканях крыс при гипокинезии различной длительности