Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние поверхностного заряда фосфолипидных мембран на устойчивость и строение мультислойных систем

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние поверхностного заряда фосфолипидных мембран на устойчивость и строение мультислойных систем"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ < им. М.В.ЛОМОНОСОВА

- а , .7 V

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

УДК-548.737 »

Сырых Алексей Геннадиевич

ВЛИЯНИЕ ПОВЕРХНОСТНОГО ЗАРЯДА ФОСФОЛИПИДНЫХ МЕМБРАН НА УСТОЙЧИВОСТЬ И СТРОЕНИЕ МУЛЬТИСЛОЙНЫХ СИСТЕМ

(03.00.02 - биофизика)

автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата физико-математических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в секторе биоэнергетики НИИ Физико-Химической Биологии имени А.Н.Белозерского Московского Государственного Университета им. М.В Ломоносова и в Лаборатории Нейтронной Физики Объединенного Института Ядерных Исследований (г.Дубна).

Научные руководители: доктор биологических наук, главный научный сотрудник, профессор Ягужикский Л.С., кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник Горделий В.И.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Берестовский Г.Н., доктор химических наук, профессор Василенко И.А.

Ведущая организация - Институт электрохимии им. А.Н.Фрумкина РАН.

Защита состоится "К" 1995 года в ^часов на заседании

специализированного совета К.053.05.68 по адресу: Москва, 119 899, Лениниские горы, Биологический факультет МГУ.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического Факультета МГУ.

Автореферат разослан " 1!>" Луу&Ц^ 1995 года.

! Ученый секгретарь специализированного совета, доктор био^-. I логических наук / ! /Х] • /(Б.А.Гуляев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Мембраны являются одной из основных клеточных структур у животных и растений, принимающей участие практически во всех аспектах клеточной активности. Рад мембран, таких как миелиновая мембрана нервов, мембраны тилакоидов, диски фоторецеггхороа в палочхах, аппарат Гольджи, представляют собой стопки мембран или мультислои с большим значением периода повторяемости ((3 > 15 нм). Стабильность таких мультислойных систем определяется балансом сил, действующих между поверхностями бислоев: отталкивания (расклинивающее давление двойных электрических слоев (ДЭС), взаимодействие гндратных оболочек полярных готов, силы энтропийного отталкивания) и притяжения (Ван-дер-Ваальсово взаимодействие).

Одна из наиболее часто встречающихся в природе систем, в которой взаимодействие мембран играет ключевую роль - это ткани многоклеточных организмов, существование которых определяется межмембранными контактами клеток. Показано, что присутствие электролита, адсорбция ионов на поверхности способны изменять фазовое состояние липидного бислоя, его гидратацию и менять характеристики упаковки липидов. Известен эффехт набухания мультислойных мембран ДПФХ в избытке воды под действием СаСЬ, ведущий к потере дальнего и ближнего порядков в положении мембран в мультислое. В этой связи исследование межмембранных взаимодействий имеет важное обшебиологическое значение.

Можно выделить два характерных диапазона межмембранных взаимодействий. На расстояниях более 2-3 нм в отталкивании заряженных мембран в электролите преобладают силы расклинивающего давления ДЭС. При сближении мембран на расстояние менее 2-3 нм в отталкивании доминируют силы, получившие название "сальватационных" или "гидратационных". До сих пор не существует единого мнения о природе сил отталкивания мембран на малых расстояниях.

Накопленные к настоящему времени электрохимические и структурные данные для липидных мембран позволяют провести экспериментальную проверку теорий, устанавливающих вклад собственных мембранных и привнесенных за счет адсорбции поверхностных зарядов в межмембранные взаимодействия.

Целью настоящей работы является изучение природы сил отталкивания межу лшшдными мембранами в мультислойных системах. Изучалось влияние поверхностных зарядов на устойчивость и структуру мультислойных фосфолипвдных систем с помощью методов дифракции нейтронов и рентгеновских лучей. В первой части работы проводится проверка применимости теории Дерягина-Ландау-Фервея-Овербека (ДЛФО) к описанию взаимодействия между фосфолипидными мембранами в мультислойных структурах на больших расстояниях > 2 нм. Величина поверхностного заряда варьировалась за счет адсорбции на поверхность мембраны ионов разной химической природы. Вторая часть работы посвящена проверке теории "гидратаыионных сил", согласно которой на поверхности в целом злсхтроней-тральной мембраны могут возникать корреляции в положении поверхностных зарядов, которые изменяют расклинивающее давление между мембранами на малых расстояниях < 2 нм. Существование таких корреляций предполагает частичную упорядоченность в положении полярных фрагментов молекул липида в плоскости бислоя. Исследования проводились на липосомах и ориентированных на подложке мультислоях.

Научная новизна. Впервые проведены расчеты межмебранных взаимодействий в мультислоях на основе теории ДЛФО, использующие экспериментально промеренные значения поверхностного потенциала. Показана применимость теории для описания взаимодействий в мультислойных липосомах на расстояниях > 2 км. Обнаружено, что эффект разрушения периодичности мультнслойной структуры при определенных концентрациях ионов имеет общий характер и наблюдается в присутствии катионов Са2*, органических катионов ряда локальных анестетиков и анионов СЮ4", БСГС.

Впервые, обнаружено, что "хаотролные" анионы СЮ/, SCN', I' индуцируют образование фазы со взаимным проникновением цепей (interdigitated), сопровождающееся снижением коэффициента гидратации.

Впервые определена локализация в профиле бислоя дейтериевон метки молекулы локального анестетика. Показано встраивание анестетика в липидный бислой.

Впервые определена толщина бислоя в составе монобислойных липосом в растворе.

Впервые показано отсутствие дальнего и, по-видимому, ближнего порядков для полярных фрагментов молекул липши в плоскости мембраны в жидкой, гель и кристаллических фазах.

Практическое значение. Полученные результаты важны для понимания фундаментальных проблем структуры и взаимодействия жидкокристаллических липкдных мембран. Описанный эффехт разрушения периодичности муттьтислойной структуры под действием ионов разной химической природы может быть использован в технике приготоапения липосом для практических применений.

Апробация работы. Основные результаты работы докладывались на Всесоюзной Научной Стуческой Конференции "Студент и научно-технический прогресс" (Новосибирск, 12-14 апреля, 1988), FEBS sattelite meeting "Molecular Dynamics in membranes" (Венгрия, Тихнари, 25-29 августа, 1990), IX международной конференции по поверхностным силам (Москва, 13-15 ноября, 1990), рабочих совещаниях "Исследование биологических и липидных мембран" (Дубна, май, 1989, 1990, 1991).

Публикации. По результатам диссертации опубликовано 7 работ. Объем работы. Диссертация состоит из введения, четырех птав, выводов, заключения и списка литературы. Работа изложена на 114 страницах, включает 37 рисунков и 8 таблий. Список литературы содержит 91 наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Во Введении обосновывается актуальность работы, сформулированы основные задачи исследования и дается краткое содержание работы по главам.

Глава 1 'Теория взаимодействия липионых бислоев в мультислойных системах" носит вводный характер. В ней изложены основные представления о структуре лишщных жидких кристаллов, силах, действующих между липидными бислоями в мультислойных липосонах. Приведены основные выводы из теории ДЛФО, современных теорий гидраталионного отталкивания и энтропийного механизма отталкивания бислоев.

Взаимодействия между мембранами традиционно описывались в рамках теории ДЛФО [1], где отталкивание есть расклинивающее давление двойных электрических слоев, а притяжение силы Ван-дер Ваальса.

Энергия расклинивающего давления ДЭС дается в теории Гуи-Чэпмена-Штерна для электролитов 1:1 и 1:2, при Т = 298'К как: Wi;i= 0.0482 [NaCl]'17 tanhJ[ T0(mV)/103] exp(-D/k>) Дж/м2,

Wi:2= 0.0211 [CaCij]"2 tanh:[24'oniV)/103] exp(-D/XD) Дж/м2 (1),

где концентрации [NaCl] и [СаСЩ даны в моль/литр, Ч'о - поверхностный потенциал, D - расстояние между взаимодействующими поверхностями, Яо -длина дебаевского экранирования. Приложение теории Лифшица к взаимодействию бислоев в мультислойных структурах дает выражение для Ван-дер-Ваальсовой энергии в виде:

WW.„„(D) = {^¿^-vk?} ^ (2)'

где Н - константа Гамакера, D - расстояние между взаимодействующими поверхностями, di - толщина биспоя. Оценки константы Гамакера для фосфолипдяых мембран составляют (3-7)* 10"21 Дж.

Известен эффект резкого "разбегания" мембран в мультислое дипальмитоилфосфатидилхолина (ДПФХ), ведущий к потере периодической структуры мультислоя, при добавлении в систему I мМ соли СаСЬ [2]. Использовние экспериментально промеренных значений ^-потенциала позволяет рассчитать энергию расклинивающего давления ДЭС по формуле (I). Комбинирование уравнений (1), (2) и энергии гидратапионного отталкивания позволяют расчитать полный энергетический потенциал взимодействия для мембран в составе мультислойной системы и описать изменения в структуре мультислоя при разных ионных концентрациях. Интересно было бы найти другие ионы, для которых возможно повторение аналогичного эффекта.

При сближении двух поверхностей на расстояние ближе 2-3 нм, возникает добавочный компонент взаимодействия, не укладывающийся в описание теории ДЛФО и получивший название сольватационных или пиратадионных сил. Гидратационные силы экспоненциально убывают с расстоянием О между бислоями:

Р = Р0 ехр(-0/л) (3),

где ?. - характерная длина спадания, именяющаяся в диапазоне 0.8 - 2.4 А. Величина отталкивания не зависит от ионной силы электролита, через который осуществлялось взаимодействие, от суммарного поверхностного заряда мембран, но специфично для каждого типа липида и варьируется для одного липида в зависимости от его фазового состояния.

Теории сольватационных сил, следуя подходу Марчелья [3], развивают модель, в которой полярная поверхность ориентирует соседний с ней слой воды, взаимодействие молекул воды распространяется с характерной длиной спадания и изменяет расклинивающее давление между мембранами на малых расстояниях. Хотя экспоненциальное спадание гндратационных сил, пропорциональность Ро квадрату поляризационного или гидратационного потенциала были описаны в рамках сольватационной модели длина спадания X оставалась свойством, присушим только воде, и не зависела от природы поверхности мембраны.

А.Корнышев и СЛенкин [4,5], рассматривая поверхность мембраны как неоднородную, в рамках формализма Марчелья получили зависимость гидратационной силы Р от корреляций в положении зарядов на поверхности в целом электронейтральной мембраны:

P/Tvs — Р +Р срг С f dQS(Q)

- om - + 4п J + Q1)"2] (4)l

гае D - расстояние между поверхностям мембран, Q аналогично вектору

рассеяния в обратном пространстве. Р bom был известным результатом

Марчелья, а Риьмв давало экспоненциально спадающую силу на малых

расстояниях. Корреляционая функция давалась, как

Sij(Q) - 1/2 <[пГ(г+Я) - n,-(r+R)j [Dj+(r) - п/(г)]> (5),

где гае п*(11)=2 SfR-R**) - поверхностная зарядовая плотность положи*

тельных и отрицательных групп. S|j(Q) может быть получена из структурных факторов в дифракционных измерениях.

Длина спадания к, к примеру, для двух одинаково упорядоченных поверхностей с константой решетки I а I, взаимодействующих через растворитель с корреляционной длиной , давалась как

. '. (6)

ч,

и отражала как структуру растворителя (£о), так и структуру поверхности (а).

Механизм, способный вызвать корреляции, описываемые Б./СЗ) может лежать в упорядочении в положении диполей, триметиламмониевых или фосфатных групп молекулы лилияа в плоскости бислоя. К примеру, большая упорядоченность в положении полярных голов в плоскости бислоя ведет к укорочению характерной длины спадания силы X. Теория объясняла различные значения гидратационных сил в мембранах ДПФХ в 3-х фазах (Ьа, Ьр- и ) благодаря различной степени упорядоченности в положении полярных голов. Эти выводы качественно совпадали с наблюдаемыми в эксперименте данными [б].

В главе, также, определены цоти и конкретные задачи исследования.

В Главе 2 "Материалы и методы", разделе 1 изложены основные положения дифракционной теории рентгеновских лучей и нейтронов и их приложение к изучению мембранных систем. Описаны подходы к решению фазовой проблемы в случаях дифракции нейтронов и рентгеновских лучей, построение профиля рассеивающей плотности мембраны, определение локализации селективно дейтерированных частей молекул методом разностного Фурье-синтеза для нейтронов.

В разделе 2 описаны способы приготовления образцов для структурных исследований - липосом ДПФХ и ориентированных на подложке мультислойных мембран. Описан химический синтез липида ],2-пальмигоил-зп-глицеро-З-фосфатидилхолина (ДПФХ) с селективно дейтерированными хсшиновой группой (ДПФХ-д9), углеводородной цепочкой в положении (ДПФХ-д31), и в положениях зп-1 и $п-2 (ДПФХ-д32). Схема синтеза приведена на рис.1.

0 0 0

сн,-он сн^сндра. сн,-ссся скросси Р0С.1

I ГПфИЛИН. бензол ] | 1

но-сн -яссо-сн -яосо-сн -

1 1 I

сн,- о - сн,- сц, сн-о-ет.-с^, см-он

© ©

I I

яоео-сн -яоео-сн

1 я .18

а,-о-р-о-сн-сн-^н, (д.д_»_ 0_ сн.-сн.-цсн,)!

о- <5-

ся,—ОСОй этаналшин ИХО-СН --

I 0

1 II СН,-О-Р-сн I

сг

Рис.1. Этапы химического синтеза 1,2-пальмитоил-5п-глицеро-3-фосфатидилхолина

Описана постановка рентгеновского и nein-ронного экспериментов. Нейтронные измерения проводились на дифрактометре ДН-2 и установке малоутаового рассеяни на импульсном реакторе ИБР-2 (ОИЯИ, Дубна).

В Главе 3 "Исследование взаимодействий бислоев на расстояниях более 2 нм. (Роль эффектов элехтростатихи в отталкивании бислоев)" исследуется влияние моновалентных анионов С104\ SCN", Г, Вг\ N'Oj', СГ, SOt2' в соли Na, составляющих серию Гофмейстера, двухвалентного катиона Са2+ и органических катионов ряда локальных анестетиков гептакаин-гидрохлоркяа и тетракаин-гидрохлорияа на параметры мультислоев ДПФХ. Основной зачен экспериментов было изучение зависимости периодов повторяемости мультислойных мембран ДПФХ при разных концентрациях ионов.

В разделе 1 проведены исследования в широком диапазоне концентраций анионов и катиона Са2<" от 0 до 1.5 М.

Обнаружены диапазоны концентраций ионов Са2* (1-10 мМ), С104" (10200 мМ), SCN" (100-200 мМ) при которых происходит разрушение периодичности мультислойных структур (рис.1, 2, 3). Здесь мулмиламеллярная фаза набухает в избытке воды, при этом теряется дальний и ближний порядок в упаковке бислоев друг относительно друга. При последующем увеличении концентрации ионов происходит восстановление мультислойной фазы с большим периодом повторяемости (>10 нм) и его последующим уменьшением за счет дебаевского экранирования до значений 6,3 нм для CaCh и 5,0 нм для NaClOa, NaSCN, Nal. Для Г обнаружено увеличение периода повторяемости до 10 нм, однако не ведущее к разрушению периодичности мультислоя.

Установлено, что соля NaNOj , NaBr. NaCl, NaSOi не оказывают существенного влияния на параметры мультислоя во всем изученном диапазоне концентраций

г

При мольном отношении липид/вода 12/1 были оценены структурные параметры мультислоя. Были оценены константа Гамакера и коэффициент гидратации Ро из условия рвновесия Рв-д-в= Pnup при высокой ионной силе (1.5 М) (Табл.1, 2).

í

10 100

Концентрация СзОг (мМ)

Рис.1. Зависимость периодов повторяемости ДПФХ от концентрации СаСЬ, экспериментальные значения в гель-фазе (Т=20°С), • - расчетные значения

а. в

о

с

Концентрация >*аСЮ< (мМ)

Рис.2. Зависимость периодов повторяемости ДПФХ от концентрации №004 в гель-фазе (Т=20°С) - • , в жидкой - фазе (Т=55 °С ) - о, к - расчетные значения для гель-фазы

Концентрация номов (мМ)

Рис.3. Зависимость периодов повторяемости ДПФХ от концентрации о NaSCN, • - Nal в гель-фазе (Т=20°С)

о .

О

О

о

о

Таблица 1. Период повторяемости (с1), толщина бислоя (ф), толщина водной прослойки ((!»,), площадь в плоскости мембраны, приходящаяся на молекулу ДПФХ (А) при мольном соотношении липид/вода 12/1 и при разных концентрациях солей в присутствии 6.65 мМ Трис-НС1

Соль, добавленная к липосомам Т. (°С) с1, нм ¿1 , нм (1», нм А, нм2

- 20 5.8 4.31 1.49 0.52

- 55 4.4 3.39 1.01 0.73

100 мМ СаС12 20 6.0 4.56 1.44 0.5

100 мМ СаС1г 55 4.6 3.55 1.05 0.7

1.5 М ЫаСЮ« 20 4.1 3.14 0.96 0.73

1.5 М ЫаСЮ* 55 4.6 3.57 1.03 0.69

1.5М №С10<+1 ООмМ СаСЬ 20 4.1 3.14 0.96 0.73

1.5М N3004 +100мМ СаСЬ 55 4.6 3.49 1.01 0.71

Таблица 2. Параметры мембранных структур и коэффициенты гидратации при мольном соотношении вода/липид 81/1 в присутствии 6.65 мМ Трис-НО

Саль, добавленная Т, (°С) с!». Ро.

к липосомам нм (Н/м2)

- 20 1.9 6.76* 103

- 55 3.28 97.7* 108

1.5 М ЫаСЮ4 20 1.56 1.02*108

1.5 М ИаСЮ* 55 2.33 4.99* 10®

1,5МНаСЮ4+100мМ СаС12 20 1.66 1.39*108

1.5МЫаСЮ4+100мМ СаС12 55 1.91 1.34*108

При расчете константы Гамакера Н использовались параметры гидрат-сил для гель-фазы Р0=Ю883 н/м", Х=0.2 мм и для жидкой фазы Ро=109" н/мг, Х=0.22 нм [6]. Вычисленное значение константы для липосом в отсутствии солей составило Н = Н^ +■ И^ = (3 + 3.58) * 10'21 Дж. При последующем вычислении Ро учитывалась полная экранировка электростатических взаимодействий (Н*=о) в электролите с высокой ионной сштон (1.5 М).

Из Табл. 1 и 2 видно, что 1.5 М МаСЮд снижает гидратацию липнянон мембраны, одновременно индуцируя образование в бислое фазы со взаимным проникновением цепей (¡пГегс^клсес!).

В раздате 2 определен диапазон концентраций (10-200 мМ) анестетгасоз гептакаина-пшрохдорида к тетракаина-гадрохлорида (Рис.4), при которых, также, происходит разрушение периодичности мультислойной структуры с ее последующем восстановлением.

Определено положение в бислое близкого по химической структуре аналога молекулы гелтахаина методом разностного Фурье-синтеза (Рис.5). В качестве образцов использовались, ориентированные на кварцевой подложке мультислойные мембраны ДПФХ в смеси с анестетиком и с его дейтерированным аналогом (мольное отношение лиотд/анестетик 1/1). Такое высокое мольное отношение было обусловлено необходимостью получения заметного изменения в рассеянии благодаря внесению дейтериевой метки. Дейтерированный аналог гептакаина содержал радикал ОСБз в положении 2 бензольного кольца вместо углеводородной цепочки в гептакаине.

Расчеты структурного фактора для дейтериевой метки, онованные на предположении« о наличии двух равновероятных мест ее локализации дали значения хо = 12.8 к и хо = 21.8 А относительно центра бислоя. Два положения метки могут быть объяснены тем, что при данных концентрациях часть молекул анестетика встраивается в бислой, а другая часть находится в водной фазе. Таким образом, показано встраивание анестетика в бислой.

I '

Я1.

11 ,01-01.

° а' -сх

Рис.4. Химические формулы локальных анестетиков: а) тетракаин-гцдрохлорид, 6) гептакаин-гидрхлорид, в) производное гептакаина с дейтериезой меткой

а) }

а

б)

» /л

' 1 Т. 22-С 1 У -

/ \ ' ч

/ «Д^л

• /■**■' чй [/ / **■

1 Л 1 / А /' Л /|

1 4 Л 7 Л // .....V

-21-20.11,-10-5 0 4 10 14 20 24

ч/а Расстояние от центра бнелоя

ё 5

г«-'

100 0 71 ИМ 021 000 -125 -0 50 -04

N ОР*С . IV п: 11 /

\ ♦ . «7 %.т. 22*с /

* шоп Г /

■ / » 1

> ее и'г'им» 1

А

/ /у^ \

/

\ \ / /

\ \ / /

/

5 -20 -15 -Ю -5 0 5

"1 Расстояние от центра бислоя

а 15 10 2!>

/11X1

Рис.5, а) Плотности амплитуд рассеяния нейтронов в направлении нормали к плоскости мембраны для бислоев ДПФХ+ дентерированный анестсгтик (штрих-пунктир) и ДПФХ+анестеггик (сплошная линия). Пунктиром показана разность двух распределений. Относительная влажность *Р= 97 % и температура Т =22°С

б)Профиль распределения воды в мембране (пунктир) и дейтериевой метки (сплошная линия). В последнем случае увеличение в 5 раз

В разделе 3 определена локализация триметиламмониевой группы молекул липида в составе монооислойных липосом в водной суспензии. Измерения проводились на установке малоуглового рассеяния нейтронов, характерная кривая малоуглового рассеяния привели а на рис.6. Целью измерений было определение радиуса инерции толщины мембраны из ДПФХ и ДПФХ-д9:

' ¡(р,(х)-р/х))йх ' ще р! рассеивающая плотность раствора, р,(х)' - средняя плотность рассеяния по толщине бислоя.

Измерения радиусов инерции для мембран из ДПФХ дало значение Яи(г=13.88±0.08 А, а для мембран из ДПФХ-д9 - ^=10.9110.08 А, что дает положение триметиламмониевой группы оносительно центра бислоя в хо = =25.9±0.3 А. Предположив, что температурное размытие метки дается распределением Гаусса р(х) - ехр(-(х-хо)2^2), и учитывая, что обычно для мембраны \*=1-3 А, имеем хо = 24.9+0.3 А, что с точностью экспериментальной ошибки совпадает с нейтронографическими данными.

5АЭ

V, Р20

и-ии»/-о.ов

уаи

-1.00

гч -» «о

а

*

-1М

►и

-в во

оо

го

О2 (А"г)

Рис.6. Кривая малоуглового рассеяния для 1%-ной суспензии монослойных липосом ДПФХ в Е^О

полученными ранее на мультислойных липшшых мембранах при 25% концентрации воды, что соответствует примерно 10 молекулам воды, приходящимся на молекулу липда. Тем самым показано, что вполне допустимо использовать структурные параметры, полученные на мембранах при малой гидратации, к мембранам, находящимся в избыточной гидратации.

В разделе 4 проведены расчеты равновесных межмебранных расстояний для мультислойных лнпосом ДПФХ при разных концентратах СаС^ и МаС104.

Использовались непосредственно измеренные С. Татуляном значения С,-потенциала для липосом ДПФХ при разных концентрациях СаСЬ [6] для подстановки вместо Ч^о, что позволило расчитать энергию расклинивающего давления ДЭС по формуле (1). Минимизация функционала для полной потенциальной энергии, состоящего из вкладов пшратационных сил в виде Why.ini = Р'Х'е"0, отталкивания ДЭС (1) и притяжения Ван-дер-Ваальса (2), позволяют определить наиболее вероятные расстояния между бислоями для данной концентрации ионов и данного значения поверхностного потенциала.

При расчетах использовались параметры гидрат-сил из [6] для гель-фазы Ро=103 " и/и2 и к = 0.2 им и для жидкой фазы Ро=109 99 н/м2 и Х=0.22 нм. Константа Гамахера, вычисленная в состоянии равновесия, была Н=б.58 * 10'21 Дж и состояла из двух вкладов Н = Н^о + Н,>о = 3 +■ 3.58 Дж [2]. При росте концентрации электролита учитывалась экранировка электростатических взаимодействий Н^.

На рис.8, приведены некоторые кривые потенциальной энергии взаимодействия бислоев через электролит СаСЬ разных концентраций. Расчитанные значения нанесены на график вместе с экспериментальными значениями на рис.1.

Ю.Л.Ермаковым проведены измерения ^-потенциала для липосом ДПФХ в присутствии различных концентраций ИаСЮд [8], что позволило провести аналогичные расчеты расстояний между бислоями для липосом

Рис.7. Кривые полной потенциальной энергии взаимодействия мембран ДПФХ в мультислое при разных концентрациях СаСЬ 1-5 мМ, 2 - 10 мМ, 3-25 мМ. 4 - 50 мМ, 5 - 75мМ, б - 100 мМ, 7 - 150 мМ, 8 - 200 мМ.

а)

б)

Д -'■■

Мсими^*""** рмтмим и. (|>м|

Рис.8.а) Изменения полной потенциальной энергии взаимодействия мембран ДПФХ в мультислоях при концентрации СаСЬ ЮмМ при разных значениях То в 1 - 5 мВ, 2 - 7 мВ, 3 - 8 мВ, 4 - 9 мВ

б) Изменения полной потенциальной энергии взаимодействия мембран ДПФХ в мультислоях при концентрации ¡ЧаСЮд ЮмМ при разных значениях То в 1 - 8 мВ, 2 - 9 мВ, 3 - 10 мВ, 4 - 15 мВ

ДПФХ, содержащих КаСЮл.Расчитанные значения нанесены на график вместе с экспериментальными значениями на рис.2.

На рис.9 приведены изменения в кривых потенциальной энергии взаимодействия для мембран через электролит 10 мМ СаСЬ н 50 мМ ЫаОСЦ при разных значениях поверхностного потенциала. Из положения "потенциальной ямы" видно, что при достижение поверхностным потенциалом значений в 10 мВ для данных концентраций ионов происхошгг скачкообразное увеличение равновесного межмембранного расстояния.

Для концентрации СаС1: в 10 мМ минимум потенциальной энергии достигается при 0=20 им и составляет 0.03 Дж/м2, или - 7.2 кТ/цм2 для Т=300° К. Такая "глубина потенциальной ямы" не достаточна для стабилизации периодичности мультислойной структуры и в упаковке мембран теряется даже ближний порядок, что ведет к возникновению диффузной дифракционной картины.

Таким образом видно, что эффект набухания мультислойных липосом ДПФХ под действием ионов Саг+ в избытке воды имеет общий характер и наблюдается в присутствии анионов СЮ/, ЭО^Г, а также органических гидрофобных катионов ряда локальных анестетиков. Разрушение периодичности мультислойной структуры мембран связано с таким ростом в отталкивании двойных электрических слоев, посте которого Ван-дер-Ваалъсово притяжение не способно стабилизировать структуру. При дальнейшем повышении концентрации ионов происходит восстановление периодичности мультислоя за счет дебаевсхого экранирования поверхностного потенциала. Применение теории ДЛФО для количественного описания структурных различий в мультислойных системах, вызванных изменением поверхностного потенциала мембран при добавлении ионов Саг+ и СЮ/ дает удовлетворительные результаты.

Представляется интересным то, что в областях межклеточного пространства содержатся высокие концентрации ионов Са2+ - до 5 мМ [82]. Это как раз тот диапазон концентраций, при которых происходит набухание

мембран ФХ в избытке воды. Можно предположить, что этот нон контролирует растояние между мембранами клеток в тканях многоклеточных организмов.

Полученные данные позволяют объяснить, почему упаковка мембран в реальных биологических мультислоях характеризуется только ближним порядком в расположении мембран. За счет межмембранного расстояния О > 10-15 нм силы не могут стабилизировать периодическую структуру, то есть обеспечить достаточно глубокий минимум потенциальной энергии, что приводит к значительным флуктуациям в О. При этом период повторяемости с1 изменяется от слоя к слою, флуктуируя около некоторого среднего значения, извлекаемого из брэгтовскон дифракции.

В Главе 4 "Исследование природы взаимодействий бислоев на расстояниях менее 2 нм. (Структурная организация мембранной поверхности)" описаны эксперименты по поиску дальнего и ближнего порядков в организации мембранной поверхности.

Проведено сравнение параметров ближнего порядка в упаковке в жидкой фазе яичного ФХ и ФЭ, которым соответствуют параметры гидрат-сил в жидкой фазе: ^Ро = 10.5 дин/см2, Х=2.1 А для ФХ и !о§Ро = 12.5 дин/см*, Х=1.2 А для ФЭ [5]. Согласно проверяемым теориям это может быть вызвано различиями в упорядоченности фосфатных групп в плоскости бислоя. Задачей экспериментов было сравнение параметров дифракционных пиков от углеводородных цепей мембран яичного ФХ и ФЭ (Рис.9).

Сравнение ингенсивностей рассеяния на углеводородных цепях для яичных ФХ и ФЭ в жидкой фазе не позволяет обнаружить значительных отличий в корреляционных функциях 5(0), которым должна быть пропорциональна интенсивность рассеяния 1(0) на цепях для этих двух липдов, и согласно проверяемой теории различия в Э(0) должны обеспечить различие в параметрах гидратации на два порядка величины (см. формулу 4).

Использование в экспериментах по нейтронной дифракции липида ДПФХ-д9 позволяет выделить вклад в интенсивность рассеяния, определяемый

корреляционной функцией положения Г^(СОэ) группы. Предположив, что цепочка $п-1 "отслеживает" положение фосфатной группы, использование липнда ДПФХ-д31 позволит выделить вклад в интенсивность, определяемый корреляционной функцией положения фосфатных групп. Липнды ДПФХ-д62 и ДПФХ могут быть использованы для сравнения.

Длина диполя РО*-?Г для ФХ составляет 4.710.2 А. Вектор ориентирован примерно параллельно (в пределах 30°) к плоскости мембраны. Таким образом наличие упорядоченности в положении фосфатных или тркмегил аммониевых групп должно давать увеличение шггенсивностн рассеяния в области -7-9 А при дифракции от ДПФХ-д9 и ДПФХ-д31.

На рис.10 приведены результаты нейтронной дифракции на мембранах в гель-фазе, состоящих из лнпидов ДПФХ с селективно дейтерарованными компонентами. Измерения проводились на нейтронном дифраггометре ДН-2. В качестве образцов использовались ориентированные на кварцевой подложке мультасяои мембран.

Пик в области 4.2 А соответствует дифракции на углеводородных цепях. Дифракционные картины не показывают никаких брэгговских пиков от полярных голов в области, где они ожидались бы (7-9 А). Интенсивность дифракции от углеводородных цепей для ДПФХ, ДПФХ-д31 и ДПФХ-дб2 отличалась ровно на интенсивность вкладов от добавочного рассеяния на дейтерии в цепочках.

Отсутствие дополнительных пиков рассеяния при дифракции на ДПФХ-д9 означает отсутствие упорядоченности в положении трнметиламмониевых групп. Эквивалентность по форме пиков дифракции на углеводородных цепях для ДЛФХ-д62, ДПФХ-д31 и ДПФХ означает, что положения цепочек $л-1 и 5П-2 эквивалентны и отсутствует упорядоченность в положении фосфатных групп. Таким образом, полученные данные для ДПФХ остатков в - фазе и Ьс - фазе свидетельствуют об отсутствии дальнего и ближнего порядков в положении холкновых групп. По-видимому, полярная область липидного бислоя выглядит более как аморфное вещество.

б)

с

о

Г/2п

Рис.9Дифрапшя на упкводородных цепях яичных ФХ (а) и ФЭ (б). Экспериментальные значения (точки) профитированы функциями

У =

7.5

1 + 50(х-1.4)'

. _ 1,4(х — 1.4) + 5.5 (ФХ) и у = —

Л*___1.94(Х-1.38) (ФЭ).

70(х —1.38)

Интенсивности рассеяния даны в относпельных единицах

5

о

б)

Х/МпЭ (А)

'"«» «-¿> №пв (А)

3

Ш1т9 (А)

¿о <00

ХЯзшО (X)

РисЛОДифракция нейтронов на мембранах ДПФХ в широкоутдовой области: а) ДПФХ-Д9, б) ДПФХ-Д62, в) ДПФХ. г) ДПФХ-д32. Ц- фаза, Т=20°С. Ч'=97%. Интенсивности рассеяния даны в относительных единицах

Выводы

1 .Показано, что описанный ранее эффект набухания иультислоев ДПФХ в избытке воды под действием катионов Са2\ имеет общий характер. Он наблюдается в присутствии анионов СЮ/, БСН\ а также органических гидрофобных катионов ряда локальных анестетиков.

2.Показана применимость теории ДЛФО для количественного описания структурных различий в мультислойных системах, вызванных изменением поверхностного потенциала мембран при добавлении ионов Са2+ и СЮ/.

Расчеты проведенные с использованием непосредственно измеренных значений поверхностного потенциала для мембран ДПФХ, содержащих СЮ/ и Са2+, показали, что при малых концентрациях ионов возникает такое расклинивающее давление ДЭС, при котором силы Ван-дер-Ваальса не способны стабилизировать периодичность мультислойной структуры. При дальнейшем повышении концентрации ионов происходит восстановление периодичности мультислоя за счет дебаевского экранирования поверхностного потенциала.

3.Показано, что галоидные анионы СГ, Вг", а также анионы N03' и Б042' не оказывают существенного воздействия на структуру мультислойных липосом ДПФХ в диапазоне концентраций от 0 до 1.5 М.

4.Впервые показано, "хаогропные" анионы СЮ/, 5СК\ Г в концентрациях около 1 М индуцируют в бислое ДПФХ образование фазы со взаимным проникновением цепей, сопровождающееся снижением коэффициента гидратации.

5.0пределена локализация в профиле бислоя дейтериевой метки молекулы локального анестетика; в частности, показано встраивание анестетика в липщшый бислой.

б.Впервые определена эффективная толщина бислоя в водной суспензии монобислонных липосом ДПФХ.

7.Прямые нектронографкческие исследования мулътислойиых мембран нз ДПФХ с селеггивно дектерированными компонентами, а также рентгеновская дифракция на углеводородных цепях яичных ФХ и ФЭ показали отсутствие дальнего и, по-видимому, ближнего порядков для полярных фрагментов молекул липкда в плоскости мембраны в жидкой, гель и кристаллической фазах. Тем самым было показано, что объяснение различий в гидратации в этих фазах в рамках сольватаиионной модели остается открытым.

Цитируемая литература

1. J.Israelasbvily, Intermolecular and surface forces, АР, 1992.

2.Y.Inoko, T.Yamaguchi, K-Furuya, T.Mitsui, Effects of cations on dipal-mitoylphosphatidylcholine/cholesterol/water systems, 1975, Biochim Biophys. Acta, 413, 24-32.

3.S.Marcelja, N.Radic, Repulsion interfaces due to boundary water, 1976, Chem.Phys.Lett., Vol. 42, number 1.

4.A.A.Komyshev, S.LcLkin, Fluctuation theory of hydration forces: the dramatic effect of inhomogeneous boundary conditions, 1989, Phys. Rew. A, 40, 6431.

5.S.Leikin, A.A.Kornyshev, Theory of hydration forces. Nonlocal electrostatic interaction of neutral surfaces, 1990, J.Chem.Phys. 92 (11).

6. R.P.Rand, V.A.Parsegian, Hydration forces between phospholipid biia-yers, 1989, Biochim. Biophys. Acta, 988, 351-376.

7.S.A.Tatulian, Binding of alkaline-earth metal cations and some anions to phosphatidylcholine liposomes, 1987, Eur. J.Biochem, 170. 413-420.

8.S.A.Tatulian, Yu.A.Ermakov, V.I.Gordeliy, A.E.Sokolova, A.G.Syrykh, Influence of calcium and some chaotropic anions on the interactions of dipal-mitoylphosphatidylcholine membranes, 1993, Biol.Mem., Vol.6(7), 983-100.

Основные результаты диссертации опубликованы в работах:

l.S.A.Tatulian, V.I.Gordeliy, A.E.Sokolova, A.G.Syrykh, A neutron diffraction study of the influence of ions on phospholipid membrane interactions, 1991, Biochin.Biophys.Acu, 1070, 143-151.

2.S.A.Tatulian, Yu.A.Ermakov, V.I.Gordeliy, A.E.Sokolova, A.G.Syrykh, Influence of calcium and some chaotropic anions on the interactions of dipalmitoylphosphatidylcholine membranes, 1993, Biol. Mem., Vol.6(7), 983-100.

3.П.Балгави, В.И.Горделий, А.Г.Сырых, Влияние локальных анестетиков: гептакаин-гидрохлорида и его производных на структуру мембран из 1,2-пальмитоил-Бп-ггащеро-З-фосфохолина, 1991, Сообщения ОИЯИ, 14-91-387.

4.V.I.Gordeliy, L.V.Golubchikova, A.Kuklin, A.G.Syrykh, A.Watts. The study of single model and biological membranes via small-angle neutron scattering, 1993, Prog.Colloid and Polymer Sci.,vol.93.

5.V.I.Gordeliy, K.Bartels, T.Hauss, G.Popadopoulos, A.G.Syrykh, A.Watts, Studies of hydration forces between membranes, 1994, Hahn-Meitner Institute, Experimental reports, Berlin.

6.В.И.Горделий, В.ИЛущиков, А.Г.Сырых, В.Г.Черезон, Применение рентгеновского дифрактометра "ДРОН" для исследования длиннопериодных структур, 1991, Сообщения ОИЯИ, 14-91-387 .

7.В.И.Горделин, А.Х.Исламов, А.Г.Сырых, Определение флуктуации периода повторяемости липидных и биологических мембран методом дифракции нейтронов по времени пролета, 1992, Биологические мембраны, том 9,п2.