Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Зависимость каталитической активности фосфолипазы D от физико-химического состояния субстратной фазы

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Зависимость каталитической активности фосфолипазы D от физико-химического состояния субстратной фазы"

РГб од

1 о ДПР 1393

1 -1 АКАДЕМИЯ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ И БИОФИЗИКИ

На правах рукописи

ЗИЯТДИНОВА Римма Уанифовна

ЗАВИСИМОСТЬ КАТАЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ ФОСФОЛИПАЗЫ Б ОТ ФИВИКО-ХИМИЧЕС'КОГО СОСТОЯНИЯ СУБСТРАТНОЙ ФАЗЫ. •

Специальность 03.00.02 - биофизика

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ташкент - 1993.

Работа выполнена на кафедре биофизики и биотехнологии Ташкентского Государственного университета

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущая организация:

доктор биологических наук, профессор Рахишв KU. доктор биологических наук, ■Туйчибаев Ы. У.

кандидат биологических наук,

Ыздьяров DL Р.

Институт биоорганической химии им. A.C. Садыкова АН ?У.

Защита состоится " iО " 1993 года в

Щ часов на васедании Специализированного Совета Д 015.01.21 при Институте физиологии и биофизики АН Республики Узбекистан по адресу: 700095, Ташкент, ул. Ниязова, 1.

С диссертацией ыожно ознакомиться в библиотеке Института Физиологии и биофизики АН Республики Узбекистан.

Автореферат разослан " 7 ? " 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного Совета

I ^

доктор биологических наук КРАСИЛЬНИКОВ О. В.

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность теш. Исследования последних десятилетий показал!, что обязательными компонентами всех без исключения биологических мембран являются эндогенные (или мембранные) фосфолипа-зы. Известно, что эти ферменты являются тонкими регуляторами функционального состояния мембран. Зто связано с тем, что изменение фосфолипидного состава, которое происходит под действием фосфолипаз, влечет 8а собой структурные перестройки в липидном остове мембраны, что, в свою очередь, приводит к изменению функциональных параметров мембраны (например, проницаемость мембраны, степень сопряженности и т. п.). Одним из важнейших не решенных до сих пор вопросов является вопрос о регуляции активности самих фосфолипаз. Почему эндогенные фссфолипаеы не "съедают" мембрану, в которой они локализованы? Почему происходит реэкая активация фосфолипаз в ответ на действие различных агонистов: гормонов, фэрболовых эфиров, пуриновых нуклеотидов и др. ? Почему происходит их стимуляция при различных видах патологии? Предполагается, что решающую роль в регуляции активности эндогенных фосфолипаз играет структурная организация и физико-химическое состояние липидного окружения в мембране.

В настоящее время можно считать установленным, что в мембране помимо бислоя фосфолипиды могут образовывать агрегаты различной структуры (нормальные и обращенные мицеллы, обращенную гексагональную фазу). Эти агрегаты, по-видимому, по-разному подвержены действию фосфолипаэ. Поэтому изменение структурной организации мембран ( например, появление в ней небислойных участков) может оказывать воздействие на эндогенные фосфолипавы. О другой сторона, активация мембранных фосфолипаз, как отмечалось выше, приводит к изменению структуры мембран, в частности, к появлению в них небислойных участков.

Принятые сокращения: ФЛ-и - фосфолипаза и, ПАВ - поверхностно-активные вещества,' СЕ-На - додецилсульфат натрия, ЦТАЬ - це- . тилтриметиламмоний бромистый, АОТ - аэрозоль ОТ (натриевая соль ди-(2-этил)-дигексилового эфира сульфоянтарной кислоты), ФХ -фосфатидилхолин, ®ЗА - фосфатидилэтаноламин, ФК - фосфатидная кислота, лФК - лизофосфатидная кислота, 50 - фосфатидилсерин, © - фосфатидилинозит, Дь®Х - димиристоилфосфатидилхолин, ДЬЯК -димистоилфосфатидная кислота

Таким образок, в клетке имеется тонкий механизм взаимной регуляции каталитической активности липолитических ферментов и структуры мембран. В связи с этим представляется весьма важным вопрос о зависимости каталитической активности фосфолипаз от структурного физико-химического состояния фосфолипидного окружения в мембране. Изучение этой зависимости непосредственно на биомембранах, как правило, трудно реализовать из-за сложного строения живой материи и одновременного протекания множества взаимосвязанных метаболических процессов. Поэтов для решения данной проблемы более приемлема искусственные системы с известной структурной организацией, моделирующие различные фосфолипидные агрегаты, существующие в биологических мембранах.

Одним из компонентов липолитической системы является ФЛ-Б, катализирующая реакции гидролиза фосфолипидов с образованием ФК и водорастворимых оснований, а также реакции трансалкилирования, то есть замещения спиртовой группы в полярной части молекул фосфолипидов. До настоящего времени были изучены физико-химические свойства ФЛ-Б, кроме того фермент использовался в качестве "инструмента" при исследовании функций биомембран и для изучения закономерностей гетерогенного катализа. Сизиодогическая роль ФЛ-0 в функционировании различных органелл и клетки в целом, а также возможные пути регуляции функциональной активности этого фермента практически не изучены. Настоящая работа посвящена изучению ФЛ-Э в системах с разной структурной и физико-химической организацией субстрата.

Настоящая работа представляет собой часть фундаментальных исследований, проводимых на кафедре биофизики биологического факультета ТашГУ по теме: "Принципы функционирования биологических мембран и механизмы действия ыембраноактивных соединений" -(Госрегистрация N01890060178)..

Яель и задачи исследования. Основной целью диссертационной работы было изучение гидролитической и трансферазной активностей ФЛ-Б в зависимости от структурного состояния субстратной фазы.

Для достижения указанной цели в работе были поставлены конкретные задачи, решение которых выносится на защиту:

1. Изучение действия ФЛ-Б на субстраты с бислойной организацией (озвученные липосомы, мультислойные ламеллы, биологические мембраны).

. 2. Изучение активности ФЛ-Б в смешанных мицеллах детергента и фосфолипида.

3. Изучение действия №0 в системах на основе ПАВ - вода -органический растворитель.

4. Изучение скорости гидролиза субстрате. ФЛ-Б в зависимости от фазового состояния субстрата "гель - жидкий кристалл".

Научная новизна работы. В диссертационной .работе показана зависимость активности ФЛ-0 от тили организации субстрата: наибольшая активность фермента набладается в составе обращенных мицелл, наименьшая - при взаимодействии с бислоями. При изучении активности ФЛ-Б.в составе смешанных мицелл детергента и ФХ показано, что активность фермента зависит от соотношения детергента и фосфолипида, которое определяет тип и размер агрегатов.

В работе были использованы тройные системы ПАВ - вода - органический растворитель для моделирования структурной организации лшидного окружения ФЛ-Б. В том числе, впервые обнаружена каталитическая активность ФЛ-Б в гидратированных обращенных мицеллах ПАВ в органическом растворителе.. Изучена зависимость скорости гидролиза ФХ ФЛ-Б от степени гидратации ПАЕ

При изучении активности ФЛ-Б в зависимости от фаэового состояния "гель - жидкий кристалл" впервые установлено, что в точке фагового перехода активность фермента значительно выше, чем при гидролизе субстрата, находящегося в жидко-кристаллическом состоянии.

Научная и практическая значимость. Проведенные исследования дают описание закономерностей гидролиза фосфолипидов ФЛ-Б в системах с различной организацией субстрата. Принимая во внимание реалистичность данных систем как моделей фрагментов биомембран, результаты работы могут иметь важное значение в понимании механизма регуляции мембранных фосфолипаз структурой биомембран и структурными перестройками в них.

. Цри изучении особенностей трансферазной активности ФЛ-В разработан способ получения фосфолипидов, который может найти применение в медицине, фармакологии, косметологии и пищевой промышленности.

Разработанные методические подходы определения активности ФЛ-Б в системах с различной организацией субстратной фазы могут найти применение в практических учебных занятиях на кафедрах би-

■ - 6-

офизики, биотехнологии и биохимии. ■

Апробация работа Основные результаты работы были доложены на следующих международных и всесоюзных конференциях: на IV конференции биохимиков Средней Азии и Казахстана (Ашхабад, 1986), на VI и YII Всесоюзных симпозиумах, по Инженерной знзимологии (Вильнюс, 1988, Москва, 1991), на X Объединенном симпозиуме биохимических обществ СССР - ГДР (Ташкент, 1989), на Международной школе молодых ученых "Современный ассиметрический синтез. Биокатализ в органическом синтезе" (Алушта, Крым, 1991), на объединенном заседанйи кафедр биофизики, биохимии и биотехнологии биологического факультете ТашГУ (19Я2), на семинаре Института физиолог ш и биофизики АН Республики Узбекистан (1992).

Публикации. Ш материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем работы. Диссертационная работа представляет собой рукопись, изложенную на 181.стр. ыатшописного текста, включает 18 таблиц, 28 рисунков, а также список цитированной литературы из 245 наименований. Диссертационная работа состоит из введения,, обзора литературы/' экспериментальной части, содержащей описание материалов и методов, используемых в работе, результатов и их обсуждения (в 5 частях), заключения, выводов и списка цитируемой литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ.

Материалы и методы. В работе использовалась ФЛ-D, выделенная из корнеплода среднеазиатской редьки Raphanus sativus. Суммарные фосфолипиды из яичного 'желтка и хроматографически чистый ФХ получали из желтка куриных яиц по методу Синглетона и сотр. (1965) и хранили при -12°С в хлороформе. Озвученные ли-посомы и мультиламеллярные дисперсии готовили по стандартным методикам. В качестве ПАВ были использованы DS-Na. ("Colnbrook", Англия), тритон Х-100 ("Merck", ФРГ). ЦТАБ и АОТ ("Serva", ФРГ).

Определение активности проводили ло продуктам фепментативно-. го гидролиза и трансалкшшрования, которые обнаруживали с поморю микр^-ТСХ. Белок определяли при 280 нм и по методу Лоури (1951). Митохондрии выделяли из Печени крыс по общепринятой методике. Экстракции фосфолипидов проводили методом Блай-Дайера (1959). Фосфодипйдшй cóefай определяли методом микро-ТСХ. В ка-

лориметрических исследованиях бьши использованы синтетические фосфолипиды ДШХ и Д®К фирмы "Sigma", США. Калориметрические измерения липидных смесей ДЫФХ+ДШК проводили на дифференциальном сканирующем микрокалориметре ДАСЫ-4. Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программного пакета Statgraflcs 2.1. Ошибка измерений составляла не более 8%. Результаты и их обсуждение.

1. Действие ФЛ-D на субстраты с бислойной организацией.

Основным типом организации фосфолипидов в биомембранах является бислой. Известно, что бислойная организация является плохим субстратом для большинства фосфолипаз. В настоящей работе в качестве субстрата с бислойной организацией были использованы озвученные липосомы, многослойные мультиламеллярные дисперсии и биологические мембраны митохондрий. Как видно из таблицы.1, скорость гидролиза этих субстратов во всех случаях оказалось очень низкой.

Таблица 1. Скорость гидролиза субстрата с бислойной организацией ФЛ-D.

Состояние субстрата . Скорость гидролиза, ед. /мин мг

Биологические мембраны 0.25

(митохондрии)

Мультиламеллярные дис- 0.28

персии 0.44

Озвученные липосомы

Самая низкая скорость гидролиза наблюдается при действии фермента на фосфолипиды мембран митохондрий, при этом наблюдалось снижение содержание главных фосфолипидов (ФХ и ФЭА на 28 и 50%, соответственно), увеличение Ж и лФК - продуктов гидролитического действия ФЛ-Б в 3 раза, а также ФС и ФИ - продуктов трансферазного действия ФЛ-Б в 2,6 и 3 раза, соответственно. Используя метод анализа сумм было показано, что накопление продуктов гидролитического действия связано со снижением содержания <ЮА, а накопление продуктов трансферазной реакции - с убылью ФХ. В мультиламеллярных дисперсиях скорость гидролиза прагаически такая же, как и с митохондриями. Обработка мультиламеллярных дисперсий ультразвуком приводит к некоторому увеличешао скорости

гидролиза Это может бьггь связано с увеличением площади поверхности субстрата за счет образования более мелких бислойных ли-посом.

2. Особенности гидролиза ФХ'ФЛ-0 в присутствии детергентов.

В связи с тем, что в биомеыбранах при накоплении природных детергентов (например, лизоФХ) возможно образование структур типа нормальных смешанных мицелл детергента и фосфолипйда в воде, нами были использованы такие системы в качестве моделей для изу-' чения ФЛ-0. Способность детергентов увеличивать скорость гидролиза фосфолипидов под действием ФЛ-Б была описана уже давно. Эту способность объясняют увеличением общей поверхности субстратной фазы в результате образования смешанных мицелл. При этом достигается большая доступность субстрата для фосфолипазы: Известно, что наибольшим активирующим эффектом обладают детергенты анионной природы: ЮБ-Иа, ФК, моноцетилфосфорная кислота и др. Относительно неионных и катионных детергентов в литературе нет однозначного, ответа В связи с этим нами было изучено действие ФЛ-Б в мицеллах, ■ полученных содобилизацией ФХ различными детергентами: ББ-Ыа, тритоном Х-100 и ЦТАБ. . Как показано на рисунке 1 все используемые детергенты увеличивают скорость гидролиза фосфолипидов.

Рис 1. Эффекты различных детергентов на скорость . гидролиза ФХ ФЛ-О. Конце-, нтрация кальция - активирующая в каждом случае: в системе с ОБ-Иа - 20 мМ, тритоном Х-100 - 5 мМ, с ЦТАБ - 2. 5 мМ, рН 5. 6, температура 40°С.

Наибольший эффект.оказывает ЕБ-Ма. Менее выраженные эффекты оказывают тритон Х-100 и ЦТАБ, хотя в литературе отмечалось. что они не способны инициировать реакцию гидролиза, эффект детергентов зависит от концентрации ионов кальция в реакционной среде. Известно, что фосфолипазы являются кальций-зависимыми ферментами. При этом роль кальция заключается в выполнении им как каталитических функций: создание фернент-субстратного комплекса, конформационные изменения молекулы фермента за счет взаимодействия с ионами; так и некаталитических: нейтрализация избыточного отрицательного заряда на поверхности субстратных мицелл, модификация поверхности субстратной фазы на границе раздела фаз. Нами было показано,что для активации ФЛ-Б анионным детергентом -ОБ-Ма требуются высокие концентрации кальция ( до 20 мМ и выше) (таблица 2). Ш-видимому, значительные концентрации кальция в данном случае необходимы для тушения избыточного отрицательного заряда на поверхности смешанных мицелл ФХ и анионного детергента. В системе с тритоном Х-100 активирующая концентрация меньше и составляет 5 мМ, 1 в системе с ЦТАБ кальций оказывает ингиби-рувдий эффект, связанный,, по-видимому, с увеличением избыточного положительного заряда на поверхности смешанных мицелл.

Таблица 2. Совместный эффект ионов кальция и детергентов на активность ФЛ-Б.

Реакционная среда, рН 5,6, температура 40°С Активность,

детергент,ыМ CaCL2, мМ ед. /мг. мин

- 20 1.40

DS-Na 2.5 - . 0.20

2.5 20 13.80

- 5 0.50

Тритон 3flOO 2.5 - 1.87

2.5 5 5.93

- 2.5 0.40

ЦТАБ 2.5 - Л. 90

2.5 2.5 3. 20

Активность ФЛ-й в смешанных мицеллах зависит от соотношения детергента и субстрата (А), поскольку именно оно определяет такие параметры как тип, размер агрегата, поверхностную концентрацию субстрата в образующихся агрегатах. Известно, что при малых А ФХ организован преимущественно в ламеллы. Дальнейшее увеличение А приводит к насыщению поверхностного слоя ламьлл детергентом, и далее, к образованию смешанных мицелл. На рисунке 2 показаны поверхность и плотность распределения скоростей гидролиза ФХ ФЛ-Б в зависимости от параметра А . Видно, что максимальная активность ФЛ-Б наблюдается в довольно узком диапазоне А . Области максимумов соответствуют ламеллярной фазе (пик и тепая область в правой части рисунка) и смешанным мицеллам (пик и темная область в левой части рисунка). Аналогичная картина наблюдалась для двух других детергентов, с той лишь разницей, что расположение этих областей в каждой системе несколько различается. Известно, что смешанные мицеллы для Е£-На и тритона Х-100 образуется при А -2. В этой области ^ определяет размер мицелл. Чем больше детергента, тем меньше размер мицелл. С увеличением А >2 происходит увеличение скорости гидролиза Это связано с тем, что уменьшается размер мицелл, а следовательно, увеличивается общая площадь поверхности мицелл. При определенном соотношении достигается максимум активности ( для ЕБ-Иа - 3.75, для тритона Х-100 и ЦТАБ - 5). Дальнейшее увеличение Л приводит к уменьшению скорости гидролиза, так как при этом уменьшается поверхностная концентрация-субстрата в мицелле, уменьшается размер самих мицелл, формируются "чистые" мицеллы детергента, образование которых может приводить к снижению "эффективной" концентрации фермента, участвующего непосредственно в расщеплении ФХ, за счет связгчания молекул фермента с поверхностью де-тергентных мицелл.

Как уже отмечалось, ламеллярная организа'да является плохим субстратом для фосфолипаэы, по сравнению с мицеллярной. В отсутствии детергента ламел^ч практически не подвергается гидролизу. Однако добавление детергента к ламеллярным агрегатам приводит к и" интенсивному гидролизу: значения абсолютных значений активностей ФЛ-Б в правой и левой частях (рисунок 2) сравнимы ивжду собой. Ксти!'... ранее исследования ФЛ-Б с детергентами проводились иыэнно в этой области. С увеличением детергента про-

ФХ

К

к к

в.

к

:и9-Ыа,

10 88ЙМ8 •'■'

¿г

9 Ш ¡¡ЯШ*:"

в т гая

№ ■■■■аЯ:::: ■■

О ВВ

7 В НИ ■■•' й?!]<! !1П

6 га ВВ -.■.:■:■ ■■■:■: шни«!;*п[аяяе

& вага :::: ¿ййййгг^^акзиашгаи;^

ш те

5 ©ЙШЙИЕВЗЯЯИИ

«ИйНН'!^ ияг^вгага&гая®!

4 ■¿гэга ст кшишимей

яаигаиия

3 «я«» ^Ша^шй-Ешйшыаав

013 ч

2 - ^^чЯ'.гавкгпм

1 Ей 1 | ь, ¡«^сшавв

ш Ш» У*-':: ?? г?;!:! !'Ш йашййивнв

0 : ¡'II......... ■У. '.гV. л? \\ л- V.V \\

41.33 39.03 36.74 34.44

32.15

29.05

27.55

25.26

22.96

20.67

10.37

16.07

13.78

11.4а

9.18

6.69

4.59

2.30

7Л

3 9 10

Рис.2 Поверхность (А) и плотность (Б) распределения скоростей гидролиза ФХ ФЛ-й в зависимости от соотношения ФХ и Б в -Ыа.

исходит его внедрение ь поверхностный слой лаыелл, образование в нем дефектов, которые способствуют связыванию ФЛ-О с поверхностью ламелл и активному гидролизу ФХ.

3. Активность ФЛ-й в тройной системе ПАВ-вода-органический растворитель.

В настоящей работе предложено использовать в качестве системы, моделирующей мембранное окружение ферментов тройные коллоидные системы ПАВ-вода-органический растворитель. Такие системы обладают тем примечательным свойством, что в зависимости от соотношения компонентов в них образуются агрегаты ПАК- сферические ассоциаты типа обращенных мицелл при низких, концентрациях воды (меньше 1%) и слоистые ламеллярные структуры при высоком содержании воды (выше 1%), где между'монослоями фосфолипида поочередно располагаются слои воды и органического растворителя. Использование таких систем позволяет изучить каталитическую активность ФЛ-П, вьюченную в агрегаты ПАВ различной структуры и формы и, следовательно, исследовать влияние липидного окружения фермента на его каталитическую активность. Дня проведения ферментативных реакций использовались системы ФХ-А0Т-вода-бен8ол, ФХ-вода-бензол или гексан. На рисунке 3 показано влияние фазовых переходов в данных системах на каталитическую активность ФЛ-О. Как следует из этого рисунка, фермент способен функционировать как в среде обращенных мицелл, так и в системе с ламеллярной упаковкой молекул ПАВ и ФХ. Однако, скорости гидролиза в этих системах различаются почти на порядок. Наибольшая скорость гидролиза ФХ наблюдается, когда ФЛ-О встроена во внутреннюю полость обращенной мицеллы (30-40 гд./мин на мг белка), в то время как в ламеллярной фазе она составляет 4-8 ед. /мин на мг белка. Кроме того, в пределах одного и того же фазового состояния субстрата-' каталитическая активность фермента зависит от содержания воды в системе. Видно, что зависимость активности как в обращенных мицеллах, так и в ламеллярной фазе от содержания воды имеет коло-колообразный вид. То есть имеется оптимальная концентрация воды для проявления максимальной активности ФЛ-О. Из литературы известно, что количество воды в таких системах определяет размер агрегатов: в обращенных мицеллах - диаметр водной полости мицел-

- ю -

Рис. 3 Регуляция структурой ПАВ активности ФЛ-Г>в тройных системах ПАВ-вода-органический растворитель: а) ¿Х-вода-бензол ; б) ^Х-вода-гексан ; в) АОТ-вода-бензол. АрА2 - активности ' Щ1-1> зЬ2 и Р - фазах, соответственно. Вертикальные заштрихованные линии - границы фазовых областей, молекула Фермента.

. - 14 -

лы, а в ламеллярной фазе - расстояние ыедду слоями.

Необходимо отметить, что активность ФЛ-Б в обращенных мицеллах обнаружена нами впервые. Причем активность ее значительно выше, чем во всех других изученных системах. Изученные, свойства ФЛ-Б в обращенных мицеллах сильно отличаются от известных ее свойств в водной среде: ■ рН оптимум в обращенных мицеллах составляет 7.6, а в водной - 5.6. Активность фермента в обращенных мицеллах проявляется и в отсутствии ионов кальция, активирующая концентрация кальция в системе 2Х-А0Т-вода-бензол - 1 мМ. Регулирующим фактором каталитической активности ФЛ-0 в системе обращенных мицелл является размер мицелл й, соответственно, размеры их внутренней полости, которые зависят от степени гидратации ПАВ. Зависимость активности от.степени гидратации имеет колоко-лообразный вид (рисунок 4), полоиение оптимума зависит от природу ПАВ и органического растворителя: для обращенных мицелл ФХ и АОТ в бензоле оптимальная степень гидратации 15, для обращенных мицелл ФХ в бензоле - 22, в гексане - 15..

Рис. 4. Зависимость скорости ферментативного гидролиза ФХ ФЛ-Б в обращенных мицеллах от степени "гидратации ФХ в бензоле (кривая 1), ФХ в гексане (кривая 2), ФХ и АОТ в бензоле (кривая 3).

Обнаружение каталитической активности ФЛ-Б в обращенных мицеллах имеет важное значение потому, что небислойные участки типа обращенных чицелл обнаружены практически во всех мембранах. Причем, чем активнее мембрана функционирует, тем больше обнаруживается в ней неСЖс .ойных участков. Очевидно, ФЛ-0 осуществляя гидролиз фосфолипидов с образованием ФК индуцирует образование небиелойных участков типа обрапрнных мицелл в биомембране. В то

же время активность самой фосфолипазы зависит, как было показано нами, от структурного состояния окружающих липидов.

4. Регуляция активности ФЛ-Б фазовым состоянием бислоя.

Переход мембранных липидов иэ жидко-кристаллической фазы в гелевую и наоборот оказывает большое влияние на мембраносвязан-ные процессы и функционирование мембранных ферментов. В настоящей работе была изучена активность ФЛ-Б в точке основного фазо• вого перехода в различных системах фосфолипидов. Результаты приведены в таблице 3. Видно, что при температуре, соответствующей температуре основного фазового перехода, наблюдается значительное увеличение активности ФЛ-Б.

Таблица 3. Сравнение активности ФЛ-Б в точке основного фазового перехода и при температуре 37°С в различных системах фосфолипидов.

¡[система Активность фосфолипазы Б Изменение, раз

при Ь-37°С в точке Тп.

рН 7.5 ДОХ 0.58 2.15 +3.7

ДОХ+СаС12 0. 53 0.52 -0.9

дох+дш 0.60 4.14 +7.0

ДОХ+ДШ+СаС12 0.52 1.15 +2.2

рН 5.6 дох 0.34 а 86 +11.3

ДОХ+СаС12 0.53 2.16 +4.1

ДОХ+ДОК 0.28 4.01 +14.6

ДОХ+ДОК+СаС1г 0.23 0.77 +3.3 |

Наибольшее увеличение активности наблюдается при добавлении к ДОХ 5 мол. % ДОК: увеличение при рН 7.5 составляет 7 раз, при рН 5.6 - 14.6 раз. Во всех случаях добавление к водным дисперсиям ионов кальция приводит к уменьшению активности ФЛ-Б как в точке фазового перехода, так и в жидко-кристаллической фа-

ге. Аналогичные данные были получены для фосфолипаБЫ А2 из различных источников. Такое увеличение активности фосфолипаз в точке основного фазового перехода.может объясняться тем. что при этой температуре наблюдается максимальное связывание фермента с субстратом. Это связывание зависит от присутствия обоих продуктов гидролиза. А поскольку при фазовом переходе, как известно, увеличивается проницаемость мембран для водорастворимых соединений, в частности, для холина, следовательно, при переходе "гель-жидкий кристалл" в мембране присутствуют оба продукта гидролиза, что в свою очередь, приводит к увеличению связывания фермента с бислоем, а значит, и увеличению скорости гидролиза фосфолипидов фосфолипазой. Связывание фермента с бислоем при температурах выше и ниже температуры фазового перехода незначительно из-за перераспределения этих продуктов и, как следствие, - низкая скорость гидролиза.

5. Трансферазная активность ФЛ-Б и ее зависимость от структурного состояния субстратной фаза

Помимо гидролитической реакции ФЛ-В катализирует в присутствии спиртов реакцию трансалкилирования. Ранее вопрос о зависимости трансферазной активности ФЛ-В от структурного состояния субстрата практически не изучался. В настоящей работе была изучена трансферазная активность ФЛ-В в следующих модельных системах: слоистые ламеллярные структуры, озвученные липосомы, биологические мембраны, нормальные мицеллы. Результаты приведены в таблице 4. Как видно из таблицы, аналогично гидролитической активности минимальна" скорость трансферазной реакции наблюдается при действии фермента на субстрат с бислойной организацией: ламеллярные структуры, липосомы и биологические мембраны. Максимальная активность ФЛ-В в трансферазной реакции наблюдается в смешанных мицеллах детергента и ФХ (активность ФЛ-В на 1-2 порядка выше). Трансферазная активность ФЛ-В в обращенных мицеллах не изучалась.

Таблица 4. ' Зависимость, трансферазной активности ФЛ-Б от структурной организации субстратной фазы.

Состояние субстрата Образование новых фосфолипидов (ед.. РЬ /ыг. мин)

. ФМ © ФИ

Многослойные ламеллы (водно-органические смеси диэтилового эфира - ФХ . 0.08 0.03 0.06.

Монолаыел-лярные везикулы (озвученные липосомы) 0.54 0,08

Биологические мембраны (фосфолшш-ды митохондрий) 0.186 0.160 0.06

Смешанные мицеллы ЕБИа и ФХ 2.9 5.7 - 2.6

Анализируя полученные данные- можно заключить»что определяющим фактором в проявлении каталитической активности ФЛ-0 является не химическая природа субстрата, а структурная организация надмолекулярных ансамблей фосфолипидбв. Так, бислои разного состава: митохондрии, липосомы из яичного ФХ, ламеллы из синтетического ФХ подвергаются гидролизу примерно с одинаковой скоростью. С другой стороны, один и тот же субстрат (яичный ФХ), организованный в бислойные липосомы, в обращенные ламеллы, нормальные и обращенные мицеллы, проявляют совершенно различную подверженность к гидролитическому и трансфэ разному действию ФЛ-Б.

Таким образом, важным фактором в проявлении каталитической активности ФЛ-0 является тип, структурам' размеры агрегатов, образуемых молекулами субстрата Скорость гидролиза возрастает

в следующем направлении: бислой —> обращенные ламеллы ---> нормальные мицеллы —> обращенные мицеллы (таблица 5). Это, го-видимому, , связано с тем, что в этом же направлении Таблица 5. Зависимость гидролитической активности ФЛ-0 от структурного состояния субстратной фазы.

Состояние субстрата Организация субстрата Состав субстрата . Скорость гидролиза субстрата

Биологические мембраны Бислой Фосфолшшды . мембран ил 0.25

Ыультчла - меллярные дисперсии Бислой Тп гель-жидкий кристалл 4.01

жидкие муль-тислои (37° С). 0.28

Шноламел- лярные везикулы ' Бислой'

Озвученные ли-посомы 0.44

Смотанные . мицеллы детергента Ыицеллы БШ-ФХ 13.80

Тритон-ФХ 5.90

ЦТАБ-ФХ 3.20

Тройные системы ПАВ-вода-органический растворитель Б-фаза (ламеллы, бислой) ЛОТ-вода-бензол 4.20

ФХ-вода-бензол 5.80

ФХ-вода-гексан 8.50

Ь2-фаза (010 АОТ-вода-бенвол 30.00

ФХ-вода-бензол 36.00

ФХ-вода-гексан 44.00

возрастает общая площадь поверхности субстрата В. кавдом из ука-■ ванных типов агрегатов также имеется оптимальная структура и размер надмолекулярных комплексо* субстрата, определяемые соотношением компонентов систем. Кроме общей поверхности субстрата для активност-" ФЛ-0 важная роль принадлежит дефектам в упаковке. Принимая во внимали,, что все изученные типы агрегатов реально существуют во фрагментах биомембран, можно заключить, что в клетке может иметь место регуляция активности эндогенных фосфо-липаз структурной организацией мембран.

- 19 -ВЫВОДЫ.

1. Показано, что скорость гидролиза субстрата с бислойной организацией: мультислойные лаыеллы, озвученные липосомы, биологические мембраны митохондрий фосфолипазой Б низка. Появление дефектов в бислое при добавлении детергента и увеличение площади поверхности субстрата в водно-органических смесях приводит к увеличению скорости гидролиза (в 9 - 15 раз), но не скорости трансфэразной реакции.

2. Установлено, что активность фосфолипазы О в смешанных мицеллах детергента и ФХ в воде в качестве субстрата значительно выше (в 30 - 40 раз), чем при гидролизе бислоев, и в наибольшей степени зависит от типа и размеров агрегатов. Активирующая роль кальция зависит от природы используемого детергента.

3. Впервые обнаружена каталитическая активность фосфолипазы 0-'в гидратированных обращенных мицеллах ПАВ в органическом растворителе, причем эта активность существенно превышает наблюдаемую активность в традиционно используемых системах (на 2 порядка, чем в смешанных мицеллах). Установлено, что важным условием является размер образующихся мицелл, который определяется степенью гидратации и зависит от природы ПАВ: для ФХ в бензоле оптимальная степень гидратации - 22, для АОТ - 15.

4. Впервые показано, что активность фосфолипазы Б в значительной степени зависит от фазового состояния субстрата "гель -жидкий кристалл". Установлено, что в точке фазового перехода активность выше (в 3 - 14 рйэа), чем при гидролизе субстрата, находящегося в жидко-крис1адлическом состоянии.

5. Установлено, что определяющим фактором в проявлении каталитической активности фосфолипазы 0 является не химическая природа субстрата, а его организация. Так, субстрат с бислойной организацией независимо от химического состава (митохондрии, липосомы из яичного ФХ, ламеллы из синтетического ФХ) подвергаются гидролизу с одинаково низкой скоростью. С другой стороны, скорость гидролиза одного и того же субстрата ( ФХ ), организованного в бислой, нормальные мицеллы и обращенные мицеллы, различна ( 0.28; 13.8; 44.0 ед./мин на мг белка, соответственно).

- 20 -

РАБОТЫ, ОПУБЛИКОВАННЫЕ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Рахимов Ы. К, Зиятдинова P. X, Горбатая 0. Е Поведение фосфолипаз А2 и D в обращенных мицеллах// IV конференция биохимиков Средней Азии и Казахстана: Тезисы докладов. - Ашхабад, 1986. - С. 36-37.

2. Рахимов М. Ы., Валиханов Ы. Е, . Абдуллаева Ы. Ы., Бабаев Ы. У., Зиятдинова P. X. Неизвестный путь превращения инозита в прорастающих семенах хлопчатника// Узб. биол. журн. - 1987. -N1. - С. 7-9.

3. Рахимов Ы. LL , Зиятдинова P. X Фосфолипаза D в обращенных мицеллах// Узб. биол. журн. - 1988. - N1. - С. 3-6.

4. Зиятдинова P. X Активность фосфолипазы D в модельных системах// VI Всесоюзный симпозиум по Инженерной энзимологии: Тезисы докладов. - Вильнюс, 1988. - С. 73.

5. Рахимов Ы. Ы, Горбатая 0. Е , Зиятдинова P. X , Адматов К. Т. Регуляция липид-зависимых функций и фосфолипидного состава митохондрий эндогенной липолитической системой// X Объединенный симпозиум биохимических обществ СССР-ГДР: Тезисы докладов. -Москва, 1989. - С. 63.

6. Рахимов М. IL , Зиятдинова P. X Способ получения фосфолипи-дов// а. св. N1472042. 'Опубл. БИ N14. - 1989.

7. Зиятдинова P. X Регуляция активности фосфолипазы D структурой субстратной фазы// VII Всесоюзный симпозиум по Инженерной энзимологии: Тезисы докладов. - ЬЬсква, 1991. - С. 59-60.

8. Положительное решение на выдачу ав. свид. по заявке N4920186/13. Способ получения фосфолипазы D/ Рахимов М. М., Зиятдинова P. X , Игамназаров Р. Е - 1991 г.

9. Ziyatdinova R.H. Regulation of activity of phospholipase D by the structure of a substrate phase // Blochem. Biothech. Elect. Express Data. Russian Blochem. & Biotech. - 1991. - v. 1. - N2/3. - P. 103.

The dependence of the catalytic activity of phospholipase D on physical-chemical.condition of substrate phase.

In the present study the hydrolytic and transferase activities of phospholipase D in the- systenc? with different substrate organization, have been investigated. The- low hydrolyses rate of substrate with the bilayer organization (sonicated liposomes, multilayer-irailtilamellar. dispersions, biological membranes (mitochondria) by phospholipase D was discovered. The features of hydroiyse of phosphatidylcholine by phospholipase D incorporated into the mixed micelles which were obtained by solubilization of phospholipid by means of different detergents (SDS,. triton X-100, CTMB) was-studied. It was shorn, that '"he hydrolyses rate in systems concerned were regulated by surface concentrations of substrate in the micellar systens. For the first tin» the phospholipase D activity in hydrated reversed micelles of AOT and phosphatidylcholine in benzene was shown. It had been shown that the phospholipase D features in this system differed from its known features in . water media. The dependence phospholipase D activity on the phase conditions of substrate was studied. The increase of the phospholipase D activity at the point of phase transition was demonstrated.

Ve made the conclusion, that the regulation of phospholipase D was realized on the supermolecular level and depends irore on organization and at least on chemical nature of substrate.

• ■ -22-

Д-фосфолила з а си каталитик активлигининг субстрат• фазасининг физика-кимиёвий ^олати орасидаги ббглгоушк.'

Таадим етилаётган ишвда Д-фосфолипазасининг -гадролитик ва траксфераза активлигини з,ар 331л' турдаги ва физика-киыёвий полати х,ар х,ил болтан субстратларда текширалган. КУш-к;ават тузилшшга вга б$лган субстратлар (липосомалар, биркатлам ыультиламеллар дисперсиялар, биологик мембраналар (митохондриялар)) гидролизи фосфолипазаси Д таъсирида'секин кечиши к^рсатилган. Ш-ЛБ, тритон Х-100 ва ЦТАБ ёрдамида ' фосфатидилхолинда олинган ' аралаш миделлаларнинг гидролизидаш фар^пари Урганилган. Улардаги гидролиз тезлиги субстратникг мицелла юзасидаги концентрациясига боглшуг'ги курсатилган. Д-фосфолипаза ферментининг активлиги биринчи бор мицеллаларнинг АОТ ва фосфатидилхолин бензолдаги тескари гидролланган болида кУрсатилган.' Ц-фосфолипазанинг субстратна фазовий х,олатига боглщлиги "гелъ-суюклик кристалл"да Урганилган. Асосий . фазовий ' Узгариш нуктасида ферментнинг сезиларш? даражада активлигини ошиши кррсатилган.

Хулоса килиб шуни айтиш ыумкинки, Д-фосфалипазанинг активлигини боищарилиши устки молекуляр даражада руй берити Еа куп жга,атдан субстрат к;ай даражада уюшганилигига ва камрок холда кимиёвий табиатига богливдир.

Подписано в печать 24.02.УЗ г. Зпка^^^^Ти^аж ЮС экз._ Отпечатано на ротапринте СПКБ. 700170.г.Ташкент,Володарского,26.