Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние каротиноидов на обмен холестерина в клетках человека in vitro

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Малахова, Майя Владимировна, Москва

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РФ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ФИЗИКО-ХИМИЧЕО СОЙ

МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи УДК 577.119.3

Малахова Майя Владимировна

Влияние каротиноидов на обмен холестерина

в клетках человека in vitro

03.00.04 - Биохимия

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: Доктор медицинских наук Профессор Халилов Э.М.

Научный консультант-Кандидат биологических наук Орлова В.Ф.

Москва, 1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Введение........................................................................................................4

Глава 1. Обзор литературы..........................................................................7

1.1. Каротиноиды -многофункциональные соединения...............7

1.2. Метаболизм каротиноидов в организме..................................8

1.3. Биологическая активность каротиноидов.............................12

1.3.1. Аятиоксидантное действие каротиноидов............................12

1.3.2. Антиканцерогенное действие каротиноидов........................15

1.3.3. Каротиноиды и сердечно-сосудистые заболевания..............16

1.3.4. Каротиноиды и обмен холестерина......................................17

1.4. Окисленные производные р-каротина..................................20

1.5. Клеточные культуры - экспериментальные модели

для изучения каротиноидов...................................................24

1.6. Способы солюбилизации каротиноидов................................27

Глава 2. Материалы и методы исследования............................................33

Глава 3. Результаты и обсуждение собственных исследований..............43

3.1. Исследование свойств различных форм солюбилизации каротиноидов...............................................43

3.1.1. Липосомальная форма каротиноидов....................................43

3.1.2. Водорастворимая форма каротиноидов, стабилизированная Проксанолом-268...................................50

3.2. Изучение влияния каротиноидов на содержание и биосинтез холестерина в клетках культуры..........................57

3.3. Изучение окисленных производных р-каротина..................62

3.3.1. Биологическая активность продуктов

автоокисления р-каротина.....................................................62

3.3.2. Выделение, характеристика и биологическая активность продуктов, образующихся в результате окисления р-каротина с радикальным инициатором..............................69

3.3.3. Идентификация билогически активных продуктов окисления Р-каротина.............................................................80

Глава 4 Заключение....................................................................................83

Выводы..............................................................................................86

Список литературы...........................................................................87

Список сокращений.

А1ВМ- азо-бис-изобутиронитрил

ВЭЖХ- высокоэффективная жидкостная хроматография

ЛВП - липопротеины высокой плотности

ЛНП - липопротеины низкой плотности

ЛОНП липопротеины очень низкой плотности

ЛПС - липосомы

ПАВ- поверхностно-активные вещества

ПОЛ - перекисное окисление липидов СФ-метрия - спектрофотометрия

ТГФ- тетрагидрофуран

ТСХ - тонкослойная хроматография

ФЛ - фосфолипиды

ФХ - фосфатидилхолин

ХС - холестерин

ЭТС- эмбриональная телячья сыворотка

УЗ- ультразвук

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования.

Каротиноиды - природные пигменты, изопреноидной природы, которые синтезируются растениями [Бриттон, 1986] и микроорганизмами [Феофилова, 1974]. В организме человека и животных каротиноиды не синтезируются de novo, а поступают с растительной пищей. Ранее в исследованиях биологической роли каротиноидов в организме человека и животных доминировала «провитаминная концепция», согласно которой эти пигменты рассматривались как предшественники витамина А [Goodwin, 1952, Goodwin, 1980]. В последние годы изучение каротиноидов позволило сформулировать концепцию об их биологических невитаминных функциях в организме человека и животных [Olson, 1989]. Опубликованы результаты исследований, демонстрирующие роль каротиноидов в регуляции иммунного ответа [Bendich, 1989], в уменьшении риска онкологических заболеваний [Albanes et al., 1995], увеличении устойчивости к. радиации [Беляев с соавт., 1992], профилактике заболеваний сердечно-сосудистой системы [Gaziano et al., 1992].

Антиатерогенное действие каротиноидов установлено в ряде эпидемиологических исследований [Eicholzer et al, 1992; Gey et al., 1993]. Данный эффект принято связывать с их антиоксидантными свойствами и, прежде всего, с защитой ЛНП от окисления свободными радикалами [Jialal et al., 1991]. Известно, что окисление Л HIT является важным фактором в патогенезе атеросклероза [Лопухин и др., 1983]. Исследования последних лет указывают на возможность существования других механизмов антиатерогенного действия каротиноидов. В ряде работ показано, что высокое содержание р~каротина в диете снижает степень поражения сосудов, но при этом не защищает ЛНП от окисления [Shaish et al., 1995]. Появились данные о влиянии изопреноидных продуктов на активность ОМГ-КоА-редуктазы - ключевого фермента биосинтеза холестерина в животных клетках [Brown & Goldstein, 1980]. Недавно было показано, что |3-каротин ингибирует экспрессию ОМГ-КоА-редуктазы в печени крыс по пост-транскрипционному механизму, снижая трансляцию м-РНК фермента [Moreno et al., 1995], одновременно снижая содержание холестерина в ЛНП [Elson & Qureshi, 1995]. Эти данные подтверждают предположение о непосредственном влиянии каротиноидов на обмен холестерина в животных клетках.

Изучение биологической активности каротиноидов имеет ряд трудностей, обусловленных строением молекулы этих веществ. В основе структуры этих углеводородов лежит полиеновая цепь сопряженных двойных связей, которая определяет два важных химических свойства молекулы каротиноида : гидрсфобность и реакционноспособность. Из-за

высокой гидрофобности каротиноиды практически нерастворимы в воде, что сильно затрудняет их исследование как в системе in vitro, так и in vivo.

Поэтому по-прежнему актуальны исследования, позволяющие выявить метод солюбилизации каротиноидов, который можно не только использовать для исследования биологических функций каротиноидов в системе in vitro, но и рекомендовать этот метод для создания лекарственного препарата для последующего применения в диетологии и медицине.

Другое очень существенное свойство каротиноидов - высокая реакционноспособность. Они очень чувствительны к действию света, воздуха, температуры, при этом каротиноиды разрушаются и образуются их окисленные производные. В организме человека и животных в процессе антиоксидантной защиты каротиноиды взаимодействуют со свободными радикалами также с образованием продуктов окисления. Часть продуктов, образующихся в результате этих процессов, была идентифицирована [Handelman et al., 1991; Kennedy & Liebler, 1992], однако, биологическая активность этих веществ исследована не была. Также было показано, что, подвергаясь в организме человека и животных действию ферментов диоксигеназ, провитаминные каротиноиды могут расщепляться не только по центральной связи с образованием ретиналя, но и по другим двойным связям с образованием апо-р-каротиналей [Wang et al., 1991]. Ферменты, осуществляющие окислительное расщепление каротиноидов, найдены в цитозоле клеток кишечника, печени и почек различных животных [Колотилова и Глушанков, 1976].

На основании вышеизложенного мы предположили, что антиатерогенное действие каротиноидов может быть связано не только с их антиоксидантным эффектом на ЛНП, но и с собственной биологической

активностью каротиноидов, а также, образующихся в организме, продуктов

их

Окисления.

Цели и задачи исследования.

Целью данной работы являлось выяснение механизма влияния каротиноидов на метаболизм холестерина в культивируемых клетках человека. В работе решались следующие конкретные задачи:

1. Оценить адекватность использования различных способов введения каротиноидов в клеточную культуру для исследования биологических функций каротиноидов.

2. Изучить влияние Р-каротина и ликопина на содержание и биосинтез холестерина в клетках культуры.

3. Разработать метод выделения производных р-каротина из смеси продуктов, образующихся в результате автоокисления Р-каротина.

4. Изучить влияние окисленных производных Р-каротина на биосинтез холестерина и пролиферацию клеток культуры.

Научная новизна работы

Решение поставленных задач позволило показать, что способ солюбилизации каротиноидов с помощью Проксанола-286 позволяет получать коллоидные дисперсии каротиноидов, которые нетоксичны и обеспечивают высокий уровень включения каротиноида в клетки культуры. Впервые было обнаружено, что коллоидные дисперсии ликопина и (3-каротина, стабилизированные Проксанолом-286, снижают содержание и синтез холестерина в клетках культуры. Впервые было показано, что окисленные производные Р-каротина, относящиеся к апо-Р-каротиналям, ингибируют биосинтез холестерина в системе in vitro, и их биологическая активность определяется наличием в молекуле карбонильной группы.

Научная и практическая ценность.

Полученные данные позволяют детализировать механизм влияния каротиноидов на обмен холестерина в клетках человека, показывая роль ликопина, p-каротина и его окисленных производных как ингибиторов синтеза холестерина в культивируемых клетках. Метод солюбилизации каротиноидов с использованием Проксанола-286 позволяет получать нетоксичный препарат с концентрацией каротиноида 0,5-0,6%, являясь достаточно простым методически и легко воспроизводимым. Результаты тестирования препаратов каротиноидов позволяют рекомендовать данный метод для применения в медицинской промышленности и сельском хозяйстве. Разработан метод выделения окисленных производных Р-каротина. Данные об ингибировании синтеза холестерина окисленными производными Р-каротина - апо-Р-каротиналям и - могут являться предпосылкой для разработки новых фармакологических препаратов для профилактики и лечения больных атеросклерозом.

1. Литературный обзор.

1.1. Каротиноиды - многофункциональные соединения.

Каротиноиды привлекают внимание исследователей с тех пор, как они были впервые выделены Wackenroder в 1831 году из моркови [Wackenroder, 1831], а затем М.С.Цвет, используя созданный им метод хроматографии, установил множественность каротинов и ксантофилов и ввел обобщающее их понятие каротиноиды [Цвет, 1910].

Долгие годы знания об их структуре, стереохимии и синтезе заметно обгоняли изучение как их биологических функций в животных клетках, так и основные пути их обмена.

В исследованиях биологической роли каротиноидов доминировала провитаминная теория, согласно которой эти пигменты в организме человека и животных рассматривались как предшественники витамина А [Goodwin, 1952, Goodwin, 1980, Krinsky, 1991]. Однако, сейчас обнаружено множество других биологических свойств каротиноидов, показанных как в модельных экспериментах, так и в эпидемиологических исследованиях.

Установлено, что использование диеты, обогащенной каротиноидами, способствует [Olson, 1989]:

- укреплению иммунной системы, особенно при стрессовых перегрузках или при иммунодефицитах,

- уменьшению риска онкологических заболеваний,

- увеличению устойчивости к радиации,

- уменьшению риска атеросклероза,

- уменьшению риска таких заболеваний как катаракта и сахарный диабет.

На современном этапе уже не возникает сомнений в их исключительной многофункциональности, обусловленной особенностями строения. Согласно Гудвину [Гудвин, 1954], каротиноидами являются пигменты алифатического или алициклического строения, состоящие из изопреновых остатков, соединенных таким образом, что две ближайшие к центру молекулы метальные группы находятся в положении 1:6, тогда как все другие боковые группы стоят в положении 1:5, а серия сопряженных двойных связей составляет хромофорную систему каротиноидов. Применение современных методов исследования структуры веществ значительно расширило представление о каротиноидах. Были подробно изучены типы концевых групп каротиноидов и обнаружен новый класс арил-каротиноидов, имеющих ароматические кольца в качестве концевых групп. Установлено также, что, помимо полиеновых связей, в основной цепи могут иметься алленовые и ацетиленовые связи [Zechmeister, 1962].

Строение концевых групп каротиноидов [Карнаухов, 1988].

17 1Д

16 г м б

Р

t7_

2 Г

зКч

fr is

19 20 I , , v , 7 I? (Г к «> 5 /?'

'ft 8 10 12 М Л5-' I/J /Г|£ 7

»3

17 К

R

Z0' 19'

I

R' <П7 17' 16'

XJi

- is'

у

X

1.2. Метаболизм каротиноидов в органшзме.

Всасывание.

Поступающие с пищей каротиноиды эмульгируются желчными кислотами внутри тонкого кишечника. Соли желчных кислот играют основную роль как в абсорбции каротиноидов, так и .в их последующем превращении в витамин A [Olson, 1996]. Кроме солюбшшзирующего эффекта, желчные соли могут также играть важную роль но включении каротиноидов в клетки кишечника [El-Gorab, 1975]. Прием Iшюхолестеринемических агентов, относящихся к iруине секвестраптов желчных кислот, например, холестипола, приводит к снижению концентрации общих каротиноидов в сыворотке крови на 30% [Probstfield et al., 1985]. Авторы считают, что снижение концентрации каротиноидов в сыворотке при приеме холестипола обусловлено снижением всасывания каротиноидов в кишечнике из-за связывания желчных кислот.

Всасывание каротиноидов, представленных в виде коммерческих гранул или в масле, более эффективно, чем. в составе таких продуктов, как морковь, брокколи или томатный сок. Количество всосавшихся каротиноидов возрастает в 3-4 раза, если они употребляются к составе жирной нищи. Вшеп с соавт. определили, что при дозе 15 мг (:V-каротина, представленного в виде водной дисперсии ("llofman La .Roche"), абсорбировалось 15% каротина в отсутствии нищи и 47% в присутствии жирной нищи [Воwen et al., 1993].

Для наиболее важных с точки зрения диеты каротиноидов проводили измерение "^концентрации в плазме после приема определенной дозы каротиноида в различной форме. После поглощения определенных доз [3-каротина (12-30 мг) как в виде специальных капсул, так и в составе овощей, концентрация Р-каротина в плазме крови увеличивалась в 2-4 раза у большинства испытуемых и достигала максимума на второй день, а затем медленно снижалась [Broun et al., 1979, Bowen et al., 1993]. Более продолжительное исследование показало, что прием в течение 2 месяцев 20мг в день p-каротина вызывает примерно 10-кратное увеличение уровня каротиноида в крови : с 0,53+0,32мкМ до 4,99+2,47мкМ. Возвращение к исходному уровню Р-каротина в крови (0,61+0,15мкМ) было зафиксировано только через 12 недель [Albanes et al., 1992]. Лишенная каротиноидов диета вызывает незначительное снижение концентрации каротиноидов в крови. Предполагают, что существуют механизмы компенсаторной мобилизации каротиноидов из тканей, однако, они пока не изучены [Bendich & Olson, 1989].

Кинетика всасывания одного из известных апо-каротиналей (Р-аио-81-каротиналя) и еще двух модельных каротиноидов (этил-р-апо-8-каротиноата и 4,4-диметокси-р-каротина) была исследована in vivo в опытах на добровольцах. После однократного употребления дозы 100 цмоль каротиноида в составе орехового масла у испытуемых исследовали кровь в течение 50 дней. Максимальная концентрация этих каротиноидов в крови достигалась через 5-11 часов, 16 часов и 27 часов соответственно [Zeng et al., 1992]. Zeng и Olson считают, что абсорбция и скорость плазменного клиренса различных каротиноидов в организме человека заметно отличается.

Транспорт.

Основная часть поглощаемых каротиноидов метаболизируется клетками тонкого кишечника. Неметаболизированные каротиноиды через мукозные клетки тонкого кишечника включаются в хил омикроны и поступают в лимфу. Хиломикроны очень быстро разрушаются липопротеин-липазой внутри кровотока и продукты распада хиломикронов удаляются печенью и другими тканями.

Основными переносчиками каротиноидов в плазме являются ЛНП, но они также представлены и в других липопротеидах. Соотношение общих каротиноидов в плазме примерно 14%, 55% и 31% между ЛОНП, ЛНП и ЛВП [Clevidence & Bierri, 1993]. Углеводородные каротиноиды такие, как каротины и ликопин в основном локализованы в ЛНП, тогда как ксантофилы, например, лютеин или зеаксантин, преимущественно обнаружены в ЛВП [Clevidence & Bierri, 1993, Cornwell et al., 1962]. Таким

образом, распределение каротиноидов в липопрогеинах плазмы во многом подобно распределению ХС.

Каротиноиды найдены не только в плазме, но и в других тканях организма. Основным местом депонирования каротиноидов являются жировая ткань (80-85%) и печень (8-12%) [Olson, 1989]. В наибольшей концентрации они присутствуют в желтом теле (бОмкг/г) и надпочечниках (20мкг/г), тогда как в печени и жировой ткани их концентрация только 10мкг/г.

В сыворотке обычно содержится примерно 1% от общего количества каротиноидов организма, что составляет примерно 0,4-1,5мкг/мл (0,8-8 мкМ). Основные идентифицированные в человеческой плазме каротиноиды - это а- и p-каротин, ликопин, лютеин и криптоксантин [Packers, 1989]. В меньших концентрациях присутствуют зеаксантин и другие ксантофилы и полиены, такие как фитофлюен и фитоен. Используя ВЭЖХ в сыворотке крови, определяют до 18 каротиноидов и еще 20 присутствуют в следовых количествах. Р-Каротин составляет 15-30% всех сывороточных каротиноидов.

Основные каротиноиды, найденные