Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние перекисного окисления липидов в липопротеинах крови на перенос холестерина между липопротеинами и клетками

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Влияние перекисного окисления липидов в липопротеинах крови на перенос холестерина между липопротеинами и клетками"

Л ^ •.

МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИ! ИНСТИТУТ ШЗИКО-ХИМИЧЕСКОЙ МЕДИЦИНЫ

На правах рукописи УДК 577.334:577.352.38

ВАХРУШЕВА Татьяна Валентиновна

ВЛИЯНИЕ ПЕРЕКИСНОГО ОКИСЛЕНИЯ ЛШЩДОВ В ЛИПОПРОТЕКНАХ КРОВИ НА ПЕРЕНОС ХОЛЕСТЕРИНА КЕЯДУ ЛШЮПРОТЕИШШИ И КЛЕТКАМИ

Специальность 03.00.02 - биофизика

Автореферат диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1992

Работа выполнена в лаборатории биофизических основ патологии научно-исследовательском институте физико-химической медицины России.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Азизова O.A.

Официальные оппоненты: доктор физико-математических наук, профессор Рууге Э.К.; доктор биологических наук, профессор Потапенко А.Я.

Ведущая организация: биологический факультет Московского государственного университета им. М.В.Ломоносова

Защита диссертации состоится'"-^" cjc^sS-fi^ 1992 г. в /Учасов на заседании специализированного ученого совета Д.084.66.01 при институте физико-химической медицины МЗ России по адресу: 119828, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1-а

С диссертацией мокло ознакомиться в библиотеке института физико-химической медицины МЗ России.

Автореферат разослан * ce^F^^-j 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Мурина N

v.'-.,., .. i

шсок сокращений: ЗПР - электронный парамагнитный резонанс; ПОЛ -фекисное окисление липидов; ЛОНП, ЛШГ и ЛВП - липопротеины очень 13коЯ, низкой и высокой плотности; ТБК - 2-тиобарбитуровая кисло-э; МДА - малоновый даальдегид; ХС/йЛ - мольное отношение холесте-ш/фосфолипиды. - ■ i

— J ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ Актуальность темы. Важнейшим признаком атеросклероза является резмерное накопление липидов, преимущественно холестерина и его фиров, в макрофагах, гладкомышечных клетках сосудов, а также в орменных элементах крови. Важная роль в регулировании содержания олестерина в клетках принадлежит липопрогеинам плазмы, являющимся сновной транспортной формой липидов в крови. Однако механизм отло-ения холестерина внутри клеток как результат юс взаимодействия с ипопротеинами остается неясным. Первоначальная гипотеза, объясняйся патологическое накопление холестерина в клетках нарушением ли-идного обмена вследствие изменения соотношения концентраций атеро-енных и антиатерогенных липопротеинов, оказалась недостаточной, .к. атеросклероз может наблюдаться и при нормальном уровне липо-ротеинов в крови. Согласно другой теории атерогенеза - перекисной 'еории - главенствующая роль в этиологии и патогенезе атеросклероза гринадлежит нарушениям в регуляции ПОЛ, что и приводит к активации 1тих процессов, наблюдаемой при атеросклерозе. Вопрос о связи между гсилением процессов ПОЛ при этом заболевании и накоплением холесте-)ина в клетках полностью не выяснен.

Важными для понимания механизма отложения холестерина в клет-сах можно считать работы, в которых показано, что in vitro рецеп-горный эндоцитоз ЛНП, модифицированных определенным образом, приво-шт к аккумуляции холестерша в макрофагах. Мы полагаем, что среди [акторов, ответственных за модификацию липопротеинов In vivo, важ-1ая роль принадлежит активации ПОЛ. Большинство работ посвящено оучению рецепторного взаимодействия модифицированных ЛНП с макрофагами. Однако роль модификации липопротеинов, возникающей в результате ПОЛ, в рецептор-неопосредованном переносе холестерина между липопротеинами и клетками оставалась до сих пор вне поля исследований, хотя этот процесс может быть важным не только для клеток, имеющих рецепторы для липопротеинов, но тем более для клеток, не имеющих таковых.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение особенностей структурной организации поверхностного протеоли-пидного слоя окисленных ЛНП и выяснение того, как влияют изменения

физико-химических свойств липопротеинов (ЛНП и ЛВП), возникавши цри их автоокислении, на рецептор-неопосредованный перенос холесте рина между ними и клетками. Основные задачи исследования:

1. с помощью метода спиновых меток и зондов изучить структурные иг менения в поверхностном протеолипидном слое ЛНП в зависимости с степени ПОЛ;

2. выяснить, какие изменения в переносе холестерина между ЛНП и мс ноцитами (при физиологических концентрациях ЛНП) происходят вслед ствие модификации ЛНП, вызванной ПОЛ;

3. на примере эритроцитов как клеток, не имеющих рецепторов да липопротеинов, изучить зависимость рецептор-неопосредованного обме на холестерина между плазматической мембраной и липопротеинами (Л1 и ЛВП) от степени их окисления;

4. выяснить роль продуктов окисления холестерина в изменении холе< терин-донорной способности ЛНП;

5. сравнить холестерин-донорную способность ЛНП (и соответствен] холестерин-акцепторную способность ЛВП) в случае инкубации эритр< цитов с липопротеинами, выделенными из крови здоровых доноров и м< дифицированными с помощью автоокисления, со случаем инкубации к® ток с липопротеинами, выделенными из крови больных ишемической öi лезнью сердца (ИБС);

6. исследовать у больных ИБС зависимость между содержанием проду тов ПОЛ в общей фракции атерогенных липопротеинов (ЛНП+ЛОНП) и о держанием холестерина в эритроцитах;

7. в свете поисков возможно;! причины появления окисленных липопр теинов in vivo исследовать взаимосвязь между окислением липопроте нов и активацией моноцитов и нейтрофилов.

Научная новизна. Применение серии нирнокислотных зондов с п рамагнитными группировками, располагающимися в л1шидном моносл липопротеинов на различной глубине от поверхности частицы, позвсл ло провести систематическое исследование структурных изменений поверхностном слое ЛНП при относительно малых степенях окислен как более вероятных in vivo.

Впервые проведены эксперименты по инкубации моноцитов с авт окисленными ЛНП при концентрациях липопротеинов, намного превыша щих необходимые для насыщения рецепторов как для нативных, так "модифицированных ЛНП. Они позволили выявить усиление прямого, т. не сопровоздакщегося эндоцитозом липопротеиновых частиц, перехс молекул холестерина из ЛНП в клетки макрофагального типа вследстЕ модификации ЛНП, вызванной ПОЛ.

Влияние ПОЛ в липопротеинах разных классов на прямой перенос 1лестерина между ними и плазматической мембраной клеток было под-Юно изучено на примере эритроцитов, и впервые продемонстрировано :иление холестерин-донорной способности ЛШ и ослабление холесте-и-акцепторной способности ЛВП в результате ПОЛ при автоокислении.

Выявлена еще одна из потенциальных ролей холестерина в атеро-¡незе, заключающаяся в том-, что присутствие продуктов окисления шестерина в ЛНП мокет способствовать накоплению холестерина в гетках.

Впервые показана способность окисленных липопротекнов вызывать :тивацию моноцитов и нейтрофилов.

Практическое значение работы. Результаты данной работы вносят слад в развитие теории атерогенеза и разработку средств профилак-ши и лечещя этого заболевания.

Апробация, работы. Результаты, работы были представлены на: IV :есоюзной конференции по патологии клетки (Москва, 1987), Конфе-!нции научно-координационного совещания стран - членов СЭВ и СФРЮ йгофизика мембран. Прикладные аспекты" (Москва, 1987), VI Мекдуна-)Дном симпозиуме по ЭПР-спектроскопии в биохимии, молекулярной юлогии и медицине (Чехословакия, 1988), Международной конференции ) нитроксияьным: радикалам (Новосибирск, 1989). IV Всесоюзном съез-! патофизиологов (Кишинев, Т989), VII и VIII Всесоюзных конферен-1ях "Магнитный резонанс в биологии и медицине" (Звенигород, 1989 и >90), 5-ом Совещании Международного общества по исследованию сво-)дных радикалов (США, 1990), Учредительной конференции Международно общества патофизиологов (Москва. 1991). Кроме того, результаты ¡следований обсуждались на научных конференциях НИИ ФХМ МЗ РСФСР.

Публикация-. По материалам диссертации опубликовано 18 работ.

Структура* и сбъеи диссертации. Диссертация состоит из введе-ш, обзора литературы, методической части, описания результатов ¡следования (7 глав), обсуждения и выводов. Библиографический ука-¡тель содержит 238' наименований. В диссертации содержится 36 ри-гнков и 13- таблиц-.

СОДБИШШЕ ДИССЕРТАЦИЙ

Обзор' литература'. Обзор состоит из следующих частей: роль ЛНП накоплении холестерина в клетках при атеросклерозе, активация эоцессов ПОЛ при этом- заболевании, изменение физико-химичес.-их юйств ЛНП" в результате ПОЛ и отношение окисленных ЛНП к образовано "пенистых" клеток. В первой части освещены способы переноса хо-

лестерина между ЛНП и клетками и проведен анализ существующей гип тезы о роли модифицированных ЛНП в образовании "пенистых" клето] Далее.в сжатой форме обобщены многочисленные экспериментальные да] ные, подтверждающие активацию процессов ПОЛ при развитии атеросюи роза. В третьей части подробно описаны особенности строения ЛНП изменения, которые происходят в результате ПОЛ в липидном соста: ЛНП и в структуре их белкового компонента. И, наконец, рассмотре; литературные данные о возможном участии окисленных ЛНП в образов нии "пенистых" клеток из макрофагов. Обоснована постановка зада данной диссертационной работы.

Материалы и методы исследования. Липопротеины выделяли из с воротки крови препаративным центрифугированием по методу Lindgr (1975). Моноциты получали на основе методик, изложенных в рабо Хейфец с соавт. (1973), внеся в них некоторые изменения. Нейтрофи выделяли согласно методике, предложенной Boyum (1968).

. Автоокисление липопротешов или липидов,' экстрагированных липопротеинов, проводили при 37°С с доступом воздуха в течение 4 ч. Окисление холестерина осуществляли с помощью УФ-облучения, к описано в работе Smith с соавт. (19б'7).

Для исследования структуры поверхностного протеолипидного сл ЛНП использовали метод спиновых зондов и меток, а также явление т тения собственной флуоресценции триптофанилов нитроксильными гру пами зондов. Спектры ЭПР записывали на радиоспектрометре "Varian-(США), спектры флуоресценции - на флуориметре "Hitachi MPF-3" (Яг Ш1Я).

Содержание продуктов ПОЛ в образцах определяли по тесту с ТЁ выражая содержание ТБК-активных продуктов через эквивалентное koj чество МДА (Uchlyama С со'.ВТ., 1978).

Выделение моноцитами или нейтрофилами активных форм кислорс регистрировали методом лшинолзависимой хемилюминесценции на juon нометре "1КВ-1251" (Швеция). Количество внеклеточного суперокс! оценивали спетрофотометрически по восстановлешш цитохрома с.

Результаты исследований и их обсуждение.

Глава 1.Исследоваше методом спиновых зондов структурных изменений в протеолипидном слое ЛНП в зависимости от степени перекисного окисления липидов.

Для изучения структурных изменений, вызываемых ПОЛ в ЛНП (ш более атерогешюм классе липопротеинов), была использована се] кирнокислотных спиновых зондов с нитроксильной группой в разном ] ложении вдоль углеводородной цепи.

Из зависимости времени корреляции вращений г для зонда 1 (сн3-(сн2)15-+ы-^~н-о) от количества продуктов ПОЛ в образце ЛНП (рис.1) видно, что'развитие процессов ПОЛ приводило к постепенному уменьшению частоты вращательного движения нитроксильной группы, располагающейся в ЛЕШ вблизи поверхности раздела липид-вода. Результаты, полученные с помощью зондов 2-4 (5-, 12- и 16-доксилстеаршовые кислоты), суммированы на рис.2 в виде зависимостей параметра упорядоченности э и параметра гидрофобности 1г от положения нитроксильного фрагмента на углеводородной цепи зондов. Видно, что окисление липидов в ЛНП сопровождалось возрастанием Э для зондов 2 и 3. При этом наибольшее изменение Б, вызванное ПОЛ, наблюдалось в случае зонда з, парамагнитный фрагмент которого оказывается в ЛНП примерно на уровне расположения двойных связей, которые являются мишенью для ПОЛ. Не было зарегистрировано достоверного изменения ни упорядоченности жирнокислотных цепей на уровне 16-го с-атома зондов (зонд 4, рис.га) ; ни полярности в микроокру-кении нитроксильных групп зонда 4 (рис.26), ни вращательной подвижности этих групп. Установленные нами изменения вит свидетельствуют о том, что в результате ПОЛ в ЛНП снижается подвижность полярных "головок" фосфолипидов и участков их ацильных цепей, расположенных по крайней мере до глубины, соответствующей 12-ому с-атому углеводородной цепи зондов, т.е. 1,5-1,7 нм от поверхности раздела липид-вода. Этот эффект проявлялся уже при малых степенях окисления ЛНП и увеличивался по мере развития этого процесса. При относительно больших степенях ПОЛ в ЛНП (превышающих 5-6 мкмоль МДА/г фосфолипидов) наблюдалось увеличение полярности (уменьшение ь) в этих ке областях липидной фазы, что может быть связано с накоплением полярных продуктов ПОЛ и проникновением в липидную фазу полярных веществ, например, молекул воды.

Результаты изучения распределения спин-меченного андростана между липидной фазой ЛНП и водной средой показали, что в ЛНП количество мест связывания для гидрофобных молекул этого зонда уменьшается в результате ПОЛ. Можно полагать, что ПОЛ в ЛНП сопровождается уменьшением эффективного объема гидрофобных доменов в липидной фазе, что может способствовать выходу молекул холестерина из ЛНП.

Изучение спектров ЭПР (рис.3) малеимидных спиновых меток, связавшихся с белком ЛНП. показало, что в результате ПОЛ, с одной стороны, увеличивалась подвижность "сильно" иммобилизованных меток (уменьшалось расстояние 2ТМ между внешними экстремумами спектральной компоненты, соответствующей "сильно" иммобилизованным меткам)

4.2 -

4.0 -

С) з.а -

я

ь 3.6 -

3.4 -

3.2 -

3.0 -

Степень окисление ЛНП, шшол* ЫДА / г фосфолкшхдов

Рис.1. Пшинжа ПОЛ в ЛНП на время асоррелсдш вращениА г для спискового аоыда 1, встроенного в шшждный монослой ЛНП при 37* С.

0.7

0.5

0.3 -

0.1

10

15

Ь

3.0 2.5 2.0 1.5 1.0 0.5

~Е ' ' ' 10 ' ' ' 15 Положение нитроксипной группы

Рис.2. Профшхл "квкоств (а) и полярности (б) поверхностного

тшидного ыонослоя ЛИП. охвслеклых до разной степени (о - 1.4, □ - 3.3, • - в.г, ■ - в.З шсмош. ВДА/г ФЛ ЛНП).

ее

64

в 2

во

10 Гс

1.0

N <

0.8

0.6

0.4

j , ъ , j -

Степень окисления ЛНП, ъасиспь МДА / г фосфолгоотдоэ

Рис.3. Вливни© ПОЛ а ЛНП на параметр и 2Т| к bi/bj в спектрах ЭПР иалездгсянод сшсяовоЙ метка, связанной о ЛНП, сра 37 С.

0.4 •

% * 0.3

0.20.1 -0.0

вонд 4

s /V

lo 'го ' зо Jo ¡о иыоль/нл

РисЧ. Тушенке белковой флуоресценции ЛНП спиновьш эондом 4 в оОраэцзх ЯИП, окисленных до разной степени (о - 0.59, л - 1.00, о - 8.27, * - 9.89 uíuojn МДА/r ЛНП).

и. с другой стороны, уменьшалась доля таких меток, а доля "слаоо' иммобилизованных меток возрастала (уменьшалось отношение Ь^/Ь^ амплитуд сигналов "сильно" и "слабо" иммобилизованных меток). Результаты по тушению флуоресценции триптофановых остатков нитроксилылм группами зондов 2-4 в нативных и окисленных ЛНП, показали, что ] результате ПОЛ происходило уменьшение эффективности тушения флуоресценции триптофанилов лишь в случае использования зонда 4. Результаты по тушению флуоресценции триптофанилов этими зондами встроившимися в нативные ЛШ1 и ЛНП, окисленные до разной степени представлены на рис.4 в виде графиков в координатах Штерна-Фольмер (Р ИР- интенсивность флуоресценции соответственно в отсутствие присутствии тушителя; на оси абсцисс концентрация зонда в кювете) Одной из причин этого может быть отдаление триптофановых остатко от нитроксильных груш, расположенных на уровне 1б-го с-атома угле водородной цепи зондов (2,0-2,2 нм от поверхности раздела лишц вода). Наши данные о некоторых изменениях, происходящих в белковь молекулах ЛНП в результате ПОЛ, согласуются с известными фактами нарушении белок-липидных взаимодействий, деградации белка и частив ном выходе его молекул из липидной фазы наружу при ПОЛ. Интересш результатом этой серии экспериментов является то, что изученные х< рактеристики флуоресценции и подвижности белковых молекул монотош возрастали с увеличением содержания продуктов ПОЛ в ЛНП.

Глава 2. Рецептор-неопосредованный перенос холестерина между окисленными ЛНП и моноцитами.

Моноциты являются предшественниками большинства клеток, форм рующих липидные пятна на стенках кровеносных сосудов при атероскл розе. Они содержат небольшое число рецепторов для нативных и ыод фицированных ЛНП, которые оказываются насыщенными при ислользова ных нами физиологических концентрациях липопротеинов. Тем сам создаются условия для изучения нерецепторного взаимодействия эт клеток с ЛНП. В результате инкубации свежевыделенных моноцитов нативными и окисленными ЛНП содержание холестерина в клетках уве! чивалось соответственно на 99,6±12,4% и 166,2±23,5% по сравнению таковым в клетках, инкубированных без ЛНП. В то же время увеличеь содержания фосфолилидов в моноцитах было примерно одинаког (18,з±8,1% и 16,016,1%). Расчеты показали, что в случае использо! Яшя неокисленных ЛНП практически весь холестерин попадал в клетю результате эндоцитоза ЛНП. Напротив, в случае окисленных ЛНП пе] нос примерно половины холестерина из ЛНП в моноциты не сопровожд< ся поглощением частиц ЛНП, что приводило к увеличению значе]

С/ФЛ в моноцитах после инкубации с окисленными ЛНП по сравнению с тим отношением в клетках, инкубированных с натившми ЛНП. Апало-ичные результаты были получены, когда вместо свежевыделенных моно-итов использовались моноциты, предварительно культивированные в ечение 65 ч.

Поскольку во время инкубации моноцитов с ЛНП не наблюдалось зменения содержания продуктов ПОЛ в пробах (по-видимому, благодаря рисутствгао сыворотки в инкубационной среде), то можно полагать, то причиной усиления не опосредованного эндоцитозом переноса холе-терина из ЛНП в клетки была модификация ЛНП во время предваритель-:ого автоокисления, а не активация процессов ПОЛ в ходе совместной нкубации моноцитов и ЛНП.

Глава 3. Влияние перекисного окисления липидов в ЛНП на

перенос холестерина между липопротеинами и эритроцитам!.

Поскольку модификация ЛНП под влиянием ПОЛ приводила к аккуму-[яции холестерина в моноцитах в результате усиления переноса холес-'ерина из ЛНП в клетки, не сопровождающегося эндоцитозом ЛНП, то югично было продолжить данное исследование на эритроцитах, кото-)ые, как известно, не имеют рецепторов для липопротеинов и практи-гески не осуществляют нерецепторный эндоцитоз.

В присутствии нативных ЛНП в эритроцитах увеличивалось содер-¡ание холестерина при неизменном содержании фосфолипидов. Увеличе-ше концентрации холестерина в плазматической мембране в результате ппсубации эритроцитов с ЛНП было подтверждено и данными, полученными с помощью спиновых зондов г и 4. Зарегистрированное нами возрастание значений параметров бит для зондов 2 и 4 в эритроцитарной иембране вследствие инкубации клеток с ЛНП согласуется с известным свойством холестерина уменьшать подвижность жирнокислотных цепей в Зиомембранах при физиологической температуре. Присутствие окислен-шх ЛНП вызывало большее накопление холестерина в клетках, чем присутствие неокисленных. что совпадает с результатами гл.2. При этом тем сильнее были окислены ЛНП до инкубации, тем больше холестерина зни отдавали эритроцитам в ходе совместной инкубации. Содержание же фосфолипидов в клетках достоверно не изменялось (рис.5).

Вагао отметить, что содеркание продуктов ПОЛ в пробах не изменялось достоверно как в отсутствие ЛНП (0,56±0,06 и 0,64*0,05 мкМ ИДА до и после инкубации), так и в их присутствии (о,79±о,о° и э,64±0,08 мкМ ТаЩА до и после инкубации). Вероятно, это связано с гем, что эритроциты имеют эффективную антиоккслительную ферментативную систему. В этой ситуации неудивительно и то, что добавление

лень ox.sc • МДА / г

1-Г

-телеки ЛНП. фдефолжхщдо*

Ржс.б, Иеиевевне содержании холестерина (&) в фосфолнпидов (б) а эритроцитах в результате инкубации (з ч. 37* С) с ШШ, предварит ельно окисленными до равной степени.

"—г——■—I—■—»

Степень окжелевже ЛВП* ютмопь ЦДЛ / г фосфолипждс®

Рнс.в. Изменение содержанка холестерина (а) а фосфолипждов (б) в эритроцитах в результате инкубация (5 ч, 37* С) с /ШПж. предварительно окисленными до раэноД степени.

I

I

!

а

Степень окислении ЛВП», шшша ЫДА / г фосфэлжхлдоа

Рао.7. Изменение содержания холестерина (а) в фосфолипадсв (б) в аситрояптех в результате инкубация (5 ч. 37* С) с ЛВПа. предварительно окхслеиэдши до разной степени.

Содеркашм продуктов ПОЛ в (Л01Ш+ЯЙП). мхмоль ИДА/г фосфолишадов

Рис.8. Зависимость кевду степенью ПОЛ в

общей фрахцдя (ЛОНП + ШШ) и кольта отношением холестерин/фософолгошды (ХС/ФЛ) в эритроцитах больных ИВ С.

ионола (ю-5 М) не влияло достоверно на значение ХС/ФЛ в эритроцитах при их инкубации с ЛНП (0,86±0,04 в присутствии и о,84±о,оэ в отсутствие ионола).

Полученные данные позволяют заключить, что одним из последствий активации ПОЛ в ЛНП является усиление их холестерин-донорной способности в процессе обмена холестерина между ЛНП и плазматической мембраной клеток, происходящем без участия рецепторов и не сопровождающемся эндоцитозом. Причем усиление холестерин-донорной способности ЛНП происходит постепенно по мере увеличения такой характеристики процесса ПОЛ, как количество ТБК-активных продуктов в образце ЛНП.

Глава 4. Исследование роли продуктов окисления холестерина в изменении холестерин-донорной способности ЛНП на примере модельных систем.

С целью выяснения механизма прямого (не сопровождающегося эндоцитозом ЛНП) переноса холестерина из ЛНП в плазматическую мембрану мы инкубировали эритроциты с липидными частицами, моделирующими свойства липидной фазы ЛНП. В отличие от результатов инкубации эритроцитов с нативными и окисленными ЛНП не наблюдалось достоверного изменения содержания холестерина и фосфолипидов в эритроцитах после их инкубации с частицами, образованными как из неокисленных, так и окисленных лшшдов, предварительно экстрагированных из ЛНП. Важное отличие ЛНП от липидных частиц состоит в том, что последние не содержат бежа. Можно предположить, что белок ЛНП играет существенную роль в реализации холестерш-донорных свойств ЛНП даже в условиях нерецепторного взаимодействия ЛНП с клетками.

Известны атерогенные свойства продуктов окисления холестерина и их способность активно вмешиваться в процесс внутриклеточного метаболизма холестерина. Каково влияние оксипроизводных холестерина, которые могут, как известно, образовываться в липопротеинах при ПОЛ, на процесс переноса холестерина между липопротеинами и плазматической мембраной? Для ответа на этот вопрос мы провели серию экспериментов с частицами из лнпидов, экстрагированных из ЛНП и обогащенных холестерином либо препаратом, содержащим наряду с неокислен-ным холестерином продукты его окисления. Введение дополнительного количества холестерина в липидше частицы привело к тому, что при их инкубации с эритроцитами осуществлялось увеличение содержания холестерина в клетках. Увеличение же содержания фосфолипидов происходило в меньшей степени, что вызывало возрастание значения ХС/ФЛ (табл.1). Причем этот эффект был выражен сильнее, если в липидных

частицах присутствовали оксипроизводные холестерина. Одним из объяснений этого феномена могло быть то, что переход молекул окисленного холестерина протекает быстрее вследствие лучшей растворимости в воде по сравнению с растворимостью неокисленного холестерина. Однако расчеты показали, что лишь небольшая часть холестерина (примерно 25%), поступившего из липидных частиц в эритроциты, могла являться продуктами его окисления. По-видимому, влияние продуктов окисления холестерина заключалось в облегчении перехода неокисленного холестерина в плазматическую мембрану.

Табл.1.Содержание холестерина (ХС) и фосфолипидов (ФЛ) в эритроцитах после инкубации в отсутствие и присутствии частиц, сформированных из липидов ЛНП и обогащенных неокисленным или окисленным (ок) холестерином.

Объекты, инкубированные ХС, ФЛ, ХС/ФЛ,

с эритроцитами мкг в пробе мкг в пробе моль/моль

- 180±10 370±10 0,98±0,0Э

Липидные частицы 170±10 350±10 0,98+0,03

Липидные частицы+ХС 240±10 Э90±20 1,22+0,05

Липидные частицы+ХС зю±ю 460±30 1,33±0,05

Для дополнительной проверки этого предположения мы провели эксперименты с частицами, отличающимися от предыдущих по липидному составу. Они были сформированы из трипальмитина, фосфэтидилхолина и холестерина (или окисленного холестерина), взятых в соотношении 1:2:3 по массе. Инкубация эритроцитов с лихшдными частицами, содержащими неокисленный холестерин, сопровождалась переносам холестерина из частиц в клетки, содержание фосфолипидов в которых при этом достоверно не изменялось (табл.2). Инкубация эритроцитов с ли-пидными частицами, содержащими окисленный холестерин, приводила к еще большему накоплению холестерина в клетках и к возрастанию значения ХС/ФЛ в клетках, несмотря на перенос части фосфолипидов из частиц в клетки. Расчеты показали, что так же, как в предыдущем случае, значительная часть стероида, перенесенного в эритроциты, относилась к неокисленному холестерину. Это подтверкдает наше предположение о влиянии оксипроизводных холестерина на перенос этого стероида между ЛНП и клеточной мембраной.

Табл.2.Содержание холестерина (ХС) и фосфолипидов (ФЛ) в эритроцитах после инкубации в отсутствие и присутствии частиц, сформированных из трипальмитина, фосфатидилхолина и холестерина (или окисленного (ок) холестерина) в отношении 1:2:3 (по массе)

Объекты, инкубированные с эритроцитами

ХС, мкг в пробе

Частицы, содержащие ХС Частицы, содержащие ХС0Й

240+10 280±25 360±10

ФЛ, мкг в пробе

490±35 490±40 520+10

ХС/ФЛ моль/моль

0,99±0,0б 1,15±0,05 1,3840,02

Глава 5. Вжяние перекисного окисления липидов в ЛВП на перенос холестерина между липопротеинами и эритроцитами.

Поскольку модификация ЛНП, вызванная ПОЛ, приводит к изменению их холестерин-донорных свойств, есть основания полагать, что аналогичная модификация ЛВП приведет к изменению их холестерин-акцепторных свойств. С целью проверки этого предположения мы провели эксперименты по инкубации эритроцитов с ЛВГ^ и ЛВП^, являющимися основными подклассами ЛВП.

После инкубации эритроцитов с ЛВГ^ содержание холестерина в клетках оказалось меньшим, чем в эритроцитах, инкубированных без липопротеинов. Этот эффект был еще более значительным в случае инкубации клеток с ЛВП^. Поскольку при этом содержание фосфолипидов в эритроцитах не изменялось, то инкубации эритроцитов с ЛВГ^ или ЛВП3 сопутствовало уменьшение значения ХС/ФЛ в клетках. То, что ЛВП удаляли холестерин из мембраны, было подтверждено и нашими экспериментами со спиновыми зондами 2 и 4. Было показано, что значения параметров з и 1 для зондов в эритроцитарной мембране уменьшались вследствие инкубации клеток с ЛВ^ или ЛВП^. Это свидетельствует об увеличении подвижности кирнокислотных цепей и уменьшении вязкости мембраны - явлениях, которые, как известно, могут вызываться уменьшением концентрации холестерина в биомембране при физиологической температуре.

При выяснении влияния ПОЛ на акцепторные свойства ЛВП мы инкубировали эритроциты с ЛВГ^ или ЛВП3, предварительно автоокисленными до разной степени. Оказалось, что ЛВ^ теряли способность акцептировать холестерин из эритроцитарной мембраны уже при малых степенях окисления (рис.6). Что касается ЛВП3> то их холестерин-акцепторная способность ухудшалась по мере увеличения степени окисления, однако во всех исследованных случаях они акцептировали некоторое количест-

во холестерина из клеток (рис.7). На содержание фосфолипидов в эритроцитах присутствие окисленных ЛВП в среде инкубации не влияло.

Измерение количества ТБК-активных продуктов в инкубационной смеси до и после инкубации ЛВП с эритроцитами в отсутствие и присутствии ионола показало, что в ходе инкубации не происходило активации процессов ПОЛ. Таким образом, можно считать, что результаты по изменению содержания холестерина в эритроцитах после совместной инкубации клеток с ЛВП определялись степенью их модификации в результате предварительного окисления. Итак, изменения в структуре липопротеинов, вызванные ПОЛ, уменьшают, хотя и в разной степени, способность JEIIg и ЛВП^ акцептировать холестерин из плазматической мембраны.

Глава 6. Исследование связи между накоплением холестерина в клетках и процессами перекисного окисления лшшдов в крови при атеросклерозе.

Имеют ж отношение полученные нами данные о роли ПОЛ-индуцированной модификации липопротеинов в накоплении холестерина в клетках к явлениям, наблюдаемым в организме при атеросклерозе? Для ответа на этот вопрос мы сравнили свойства автоокисленных липопротеинов, выделенных из крови здоровых доноров, со свойствами липопротеинов, выделенных из крови больных ИБС, в отношении переноса холестерина между ними и эритроцитами.

• Изменение содержания фосфолипидов в эритроцитах после инкубации с различными липопротеинами было одинаковым. В результате инкубации клеток с нативными ЛНП здоровых доноров содержание холестерина в эритроцитах увеличивалось на 11,4±3,4Ж. В случае инкубации как с ЛНП больных пациентов, так и с ЛНП, окисленными in vitro, оно возрастало на большую величину (на 33,8±10,5% и на 27.2±4,2%, соответственно). ЛВГЬ, и ЛВПЭ из крови здоровых доноров акцептировали холестерин из эритроцитов, уменьшая его количество в клетках соответственно на 19,2+8,1% и на 26,2±7,4%. Холестерин-акцепторная способность как окисленных ЛВП^ и ЛВП3 из крови здоровых людей, так и липопротеинов, выделенных из крови больных ИБС, была значительно понижена. Уменьшение содержания холестерина в клетках в результате инкубации с этими липопротеинами составляло: ЭИ±2,1% (ЛВЕ^) и 6,2±3,3% (ДВП3) в случае больных ИБО и 2,2±2,1% (ЛШ^) и 4,5±1,8% (ЛВПЭ) в случае окисленных липопротеинов из крови здоровых доноров. При этом во всех случаях холестерин-акцепторная способность ЛВП3.0ыла более сильной, чем у ЛВП^. Полученные результаты позволяют заключить, что ИБС сопровождается усилением холестерин-донорной

способности ЛШ и уменьшением холестерин-акцепторной способности ЛВПЭ и ЛВГЦ. Оба указанных явления должны способствовать накоплению холестерина в клетках.

Зарегистрированное нами сходство в изменении холестерин-транспортных свойств литапротеинов при ИБС и при автоокислении дает основание полагать, что по крайней мере одной из существенных причин аккумуляции холестерина в клетках может являться модификация липопротеинов в результате активации ПОЛ. Дополнительным фактом, говорящим в пользу этой идеи, служит и корреляция между значением ХС/ФЛ в эритроцитах больных ИБС и концентрацией продуктов ПОЛ в общей фракции атерогенных липопротеинов (ЛОНП+ЛНП) (рис.8). При этом, исходя из результатов предыдущих глав, можно считать, что изменение значения ХС/ФЛ в эритроцитах отражает изменение содержания холестерина.

Глава.7. Активация моноцитов и нейтрофилов - одна из

возможны! причин модификации липопротеинов ln vivo.

Известно, что целый ряд клеток крови и сосудистой стенки, в особенности фагоциты, являются потенциальными источниками различных активных форм кислорода, которые могут участвовать в реакциях инициирования цепей свободнорадикального окисления липидов. Способны ли активированные моноциты и нейтрофилы вызывать ПОЛ в липопротеи-нах и какой в свою очередь ¡может быть роль липопротеинов в активации этих клеток?

С помощью методов люминолзавнсимай хемилюминесценции и спек-трофотометрического определения супероксидных радикалов Og по восстановлению цитохрома о мы .показали, что ЛШ, модифицированные в результате ПОЛ, в отличие от нативных, способны активировать моноциты, что сопровождается секрецией клетками, в частности, Этот факт согласуется с результатами дальнейших экспериментов. В пробах, где присутствовали монощган без ЛНП, количество продуктов ПОЛ не изменялось во время инкубации. ЛШ, инкубируемые без клеток, окислялись, что регистрировалось по увеличению содержания ТБК-активных продуктов в пробах после .инкубации по сравнению с исходным уровнем. Если же ЛШ и моноциты инкубировались совместно (в отсутствие сыворотки в отличие от экспериментов, 'описанных в гл.2), то накопление продуктов ПОЛ в пробах значительно превышало сумму их количеств в пробах, в которых инкубировались отдельно моноциты и ЛШ. При этом в случае, когда инкубация не проводилась , тлела место аддитивность этих значений (рис.9). 'Можно предположить, что при инкубации моноцитов с ЛШ последние по мере окисления активировали клетки, вызы-

вая секрецию активных форм кислорода, что способствовало дальнейшей интенсификации процессов ПОЛ. При этом чем окисленнее изначально были ЛНП, тем больший прирост содержания продуктов ПОЛ регистрировался после их инкубации с моноцитами.

Для выяснения механизма реакций, приводящих к образованию про дуктов ПОЛ, в среду инкубации ЛНП с моноцитами добавлялись различные вещества, способные препятствовать развитию ПОЛ. Маннитол (50 мМ) не влиял на результаты инкубации моноцитов с ЛНП, и, следовательно, мокно полагать, что "он-радикалы в данной системе не играли существенной роли в окислении липидов. Каталаза (зоо ед/мл), супер-оксидцисмутаза (СОД) (60 ед/мл), десферриоксамин В (20 мкМ), ЭДТА (10 мкМ) и ионол (50 мкМ) достоверно снижали накопление ТБК-активных продуктов на 88, 67, 38, 52 и 47%, соответственно. Ингиби-руюцее влияние этих агентов говорит об участии Н^, и ионов металлов переменной валентности в свободнорадикальных процессах окисления, происходящих при инкубации ЛНП с моноцитами.

ТБК-ажтивные продукты (ИДА, ихМ)

0.05 0.04 0.03 0 02

0.01 О

1УЛЧ до кнкубацнц 1 1 после инкубации

Рис.9.Накопление продуктов ПОЛ (мкМ ММ) в пробах при инкубации 13,5 ч, 37 СД ЛНП и моноцитов. Количество моноцитов - 3*1о5, концентрация ЛНП -0,25 мг фосфолипидов/мл.

. Аналогичные исследования мы провели с кейтрофиламя. Окисленнь ЛНП и ЛВП в отличие от нативных активировали нейтрофилы, что регис

трировалось по увеличению люминолзависимой хемиилюминесценции клеток после добавления этих липопротеинов в кювету. Как и в случае моноцитов, при инкубации ЛНП с нейтрофилами в пробах накапливалось продуктов ПОЛ значительно больше, чем этого можно было ожидать, исходя из предположения об отсутствии взаимного влияния ЛНП и нейтро-филов в период инкубации. Добавление маннитола в инкубационную среду не приводило к достоверному уменьшению содержания ТБК-активных продуктов в пробах. Каталаза, СОД, десферриоксамин В и ЭДТА уменьшали накопление ТБК-активных продуктов в пробах на 65, 47, 41 и 65%, соответственно. Эти результаты похожи на те, что были получены в экспериментах по инкубации ЛНП с моноцитами. Ионол же полностью предотвращал развитие ПОЛ в системе, содержащей нейтрофилы и • ЛНП.

Таким образом, In vitro пероксидация липидов в ЛНП, опосредованная активированными нейтрофилами и моноцитами, происходит по свободнорадикальгому механизму с участием-ol, Н202 и ионов металлов переменной валентности (вероятно, Fe2+, Си ). Можно полагать, что одной из возможных причин свободнорадикальной модификации липопротеинов является активация таких клеток, как нейтрофилы и моноциты. Интересным результатом нашей работы является тот факт, что модифицированные в процессе ПОЛ липопротеины, в свою очередь, могут оказаться причиной активации нейтрофилов и моноцитов, тем самым усугубляя развитие процессов ПОЛ.

вывода

1. С помощью метода спиновых зондов и меток показано, что по мере развития процессов ПОЛ в ЛНП происходят изменения в поверхностном протеолипидном слое, выражающиеся в (а) уменьшении подвижности полярных "головок" фосфолипидов и тех участков их ацильных цепей, которые расположены на глубине по крайней мере до 1,5-1,7 нм от поверхности раздела липид-вода; (б) увеличении полярности в этих ке областях липидной фазы; (в) уменьшении количества мест связывания для спин-мечещгаго андростана; (г) увеличении подвижности аминокислотных остатков, связанных с малеимидными спиновыми метками, и ослаблении тушения флуоресценции триптофанилов нитроксильными группами зондов, расположенными на глубине 2,0-2,2 нм от поверхности 'раздела липид-вода.

2. Показано, что в результате инкубации моноцитов с ЛНП, модифицированными под влиянием ПОЛ, происходит не опосредованное эндоцито-зом накопление холестерина в клетках.

3. Показано, что по мере развития процессов ПОЛ в липопротеинах усиливается способность ЛНП отдавать холестерин эритроцитам, и, наоборот, уменьшается способность ЛВГ^ и ЛВП^ забирать холестерин из плазматической мембраны эритроцитов, причем JIBI^ теряют холестерин-акцепторную способность при меньшей степени окисления, чем ЛВП^.

4. Получены данные, позволяющие предположить, что присутствие продуктов окисления холестерина в ЛНП может усиливать накопление холестерина в эритроцитах при взаимодействии с окисленными ЛНП, причем не столько за счет перехода оксипроизводных холестерина в плазматическую меамбрану, а, вероятно, благодаря их свойству облегчать выход неокисленного холестерина из ЛНП.

5. Показано.что при ИБС так ке, как и при ПОЛ in vitro, имеет место усиление холестерин-донорной способности ЛНП и уменьшение холестерин-акцепторной способности ЛВГ^ и ЛВП3, что, по-видимому, способствует аккумуляции холестерта в клетках при этом заболевании.

6. Продемонстрировано, что у больных ИБС содержание холестерина в эритроцитах коррелирует с содержанием продуктов ПОЛ во фракции ате-рогенных липопротеинов (ЛНП+ЛОШ).

7. Показано, что ЛНП и ЛВП, модифицированнные под влиянием ПОЛ, в отличие от нативных способны активировать моноциты и нейтрофилы, что, в свою очередь, вызывает в липопротеинах " усиление процессов ПОЛ, которые, как установлено, протекают в данном случае с участием супероксидных радикалов, перекиси водорода и ионов металлов переменной валентности.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Панасенко О.Ы., Вахрушева (Вольнова) Т.В., Азизова O.A., Епади-миров Ю.А. Перекисное окисление липидов влияет на перенос холестерина между лшопротеинами низкой плотности и биомембранаш // Биологические мембраны, 1937, т.4, J6 8, с.875-881.

2. Панасенко О.М., Вахрушева (Вольнова) Т.В., Азизова O.A., Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов влияет на перенос холестерина между липопротеинами высокой плотности и биомембранами // Биологические мембраны, 19S7, Т.4, й 12, С. 1319-1324.

3. Панасенко О.М., Вахрушева (Вольнова) Т.В., Азизова O.A. Перекисное окисление липидов - фактор, способствующий накоплению холестерина в клетках при атеросклерозе. IV Всесоюзная конференция по патологии клетки. 25-27 ноября 1987, Москва. Тезисы докладов. Москва,, Т987. с.

4. Вахрушева (ВольнозаУ Т.В., Панасенко О.М, Азизова О.А, Владими-

ров Ю.А. Окисленные производные холестерина способствуют переносу стероида между модельными липопротеинами и биологическш.ш мембранами // Биологические мембраны, 1988, т.5, $ б, с.635-642.

5. Панасенко О.М., Вахрушева (Вольнова) Т.В., Азизова О.А, Владимиров Ю.А. Изучение методом спиновых зондов изменений структуры на различной глубине липопротеинов низкой плотности после их перокси-дации // Биологические мембраны, 1988, т.5, $ 11. с.1186-1191.

6. Панасенко О.М., Вахрушева (Вольнова) Т.В., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Перекисное окисление липидов - фактор, способствующий накоплению холестерина в метках при атерогенеза // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины, 1988, т.106, й 9, с.277-280.

7. Панасенко O.U., Вахрушева (Вольнова) Т.В., Азизова О.А., Владимиров Ю.А. Нарушение структуры липопротеинов крови человека при пэ-рекисном окислении липидов. Роль в атерогенезе. VII Всесоюзная конференция "Магнитный резонанс в биологии и медицины". Май 1989, Звенигород. Тезисы устных сообщений и стендовых докладов. Черноголовка, 1989, С.197-198.

8. Azizova О.A., Panasenko О.М., Vakhrusheva (Vol'nova) B.V., 71a-dimirov Yu.A. Free radioal lipid oxidation affects oholesterol transfer between lipoproteins and erythrocytes // Free Radical Biology & Medicine, 1989, v.7, No.3, p. 251-257.

9. Панасенко O.M., Вахрушева (Вольнова) Т.В., Азизова О.А. Роль свободнорадикальной модификации липопротеинов в крови в аккумуляции холестерина в клетках при атеросклерозе. В кн.: "Нарушение механизмов регуляции и их коррекция. Тезисы IV Всесоюзного съезда патофизиологов, 3-6 октября, 1989, Кишинев." ЫЗ СССР, Москва, 1989, т.2, с.552.

10.Vakhrusheva (Vol'nova) T.V., Panasenlco O.U., Azizova О.А. The use of lipid spin probes to study lipid peroxidation effect on the structure of human serum lipoproteins and liposomes. International conference on nitroxide radicals. September 18-23, 1989, Novosibirsk, USSR. Abstracts, p.42.

11 .Fanasenko 0..M., Vakhrusheva (Vol'nova) T.V., Azizova O.A. The use of fatty acids with imidazolinyl nitroxyl fragment for comparative studies of surface structure of lipoproteins and biological membranes. International conference on nitroxide radlcala. September 18-23, 1989, Novosibirsk, USSR. Abstracts, p.41. 12.Панасенко O.M., Вахрушева (Вольнова) Т.В. Восстановление ионами Ге2+ спинового зонда в липопротеинах крови человека. Влияние переписного окисления липидое. VIII Всесоюзная конференция "Магнитный

резонанс в биологии и медицине". Май 1990, Звенигород. Тезисы устных сообщений и стендовых докладов. Черноголовка, 1990, с.101.

13.Вахрушева (Вольнова) Т.В., Панасенко О.М, Заречнева Н.В., Азизо-ва О.А., Владимиров Ю.А. Перекисная модификация липопротеинов низкой плотности приводит к рецептор-независимой аккумуляции холестерина в моноцитах человека // Биологические мембраны, 1990, т.7. й 2, с. 141-148.

14.Vladimirov Yu., Vakhrusheva (Vol"пота) Т., Panasenko О., Azizova О. Free radical modification of lipoproteins and cholesterol accumulation in cells upon atherosclerosis // Free Radical Biology & Medicine, 1990, v.9, Suppl.1, p.73.

15.Panasenko O.M., Vakhrusheva (Vol'nova) T.V., Azizova O.A., Vla-dimirov Yu.A. Lipid peroxidation of low density lipoproteins and non-receptor mediated accuaulation of cholesterol in blood cells. The role in atherogenesis. In: Proceedings International Society for Pathophysiology I. Abstracts. Suomen Graafiset Palvelut Oy Ltd., Kuopio, Finland, 1991. p.235.

16.Azizova 0.A., Panasenko O.M., Vakhrusheva (Vol'nova) T.V. The role of lipid peroxidation in oholeeterol accumulation in cells under atherosclerosis. In: Proceedings International Society for Pathophysiology I. Abotraots. Suomen Graafiset 'Palvelut Oy Ltd., Kuopio, Finland,1991, p.224-225.

17.Panasenko О.И., Vakhrusheva (Vol'nova) T.V., Azizova O.A., Vla-dimirov Yu.A. Free radical modification of lipoproteins and oholeeterol accumulation in cello upon atherosclerosis // Free Radioal Biology & Medicine, 1991, v.10, No.2, p.137-143.

18.Панасенко O.M., Вахрушева (Вольнова) T.B., Владимиров Ю.А. Пере-кисное окисление липидов ускоряет взаимодействие Fe2+ с акцепторами электрона, локализованными в липидной фазе липопротеинов крови человека // Биологические мембраны, 1991, т.5, с.532-538.