Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние ионизирующего излучения в малых дозах на некоторые соматические клетки человека и животных на разных этапах онтогенеза

ВАК РФ 03.00.01, Радиобиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние ионизирующего излучения в малых дозах на некоторые соматические клетки человека и животных на разных этапах онтогенеза"

г г в од

- 8 ОНТ 1996

АКАДЕМИЯ НА УК БЕЛАРУСИ ИНСТИТУТ РАДИОБИОЛОГИИ

УДК: 612.014.49 X 4:575.155]:575.16

НИКОЛАЕВИЧ Лариса Николаевна

ВЛИЯНИЕ ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ В МАЛЫХ ДОЗАХ НА НЕКОТОРЫЕ СОМАТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ ЧЕЛОВЕКА И ЖИВОТНЫХ НА РАЗНЫХ ЭТАПАХ ОНТОГЕНЕЗА

03.00,01 - Радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискани: ученой степям кандидата биологических наук

Минск-1996

Габота выполнена » Институто радиобиологии АН Беларуси

Научный руководитель:

доктор кеднцкискнх ьаук, профессор А. П. Аквросьев

Официальныз сппоненты:

доктор медицинских наук, профессор, чл. -корр. АМН России Г.И. Дазак

доктор био/.згнчссккх кеук, старший научн'-й сотрудник И.Б. Иоссэ

Оппонирующая организация;

Пинский госшрстаокный медицинский институт

-Защита состоится а 2С »1998 года в ¿у часов на заседании сопеть по еаците диссертаций Д 01.35.01. с Институте радиобиологии АН Беларуси (220600, г. Минск, ул.2эдинская, 2).

С диссертацией «огно ознакомиться б библиотеке Института радиобио/игин АН Беларуси.

Автореферат разослан * С*£•.Цу"^'*- 1898 года.

Ученый секретарь

ссьата по защите диссертаций.

кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема малых доз ионизирующих излучений (ИИ) является одной из важных в современной радиобиологии. Особую актуальность она приобрела в связи с аварией на Чернобыльской АЗС, в результате которой, как теперь известно, низкие мощности ионизирующей радиации превратились в постоянный фактор окружающей среды на огромных территориях Беларуси и сопредельных с ней государств. Это обстоятельство явилось основной причиной, привлекшей внимание многих исследователей к теоретическим и практическим аспектам хронического действия ИИ на живые системы. Вместе с тем решение проблемы оказалось наиболее трудной, прежде всего, в методическом отношении, а полученные в ходе еб разработки данные - противоречивыми (Korrл, 1986; Виленчик, 1991 и др).

В этом плане возникает необходимость более широкого привлечения комплексных методов исследования, в которые включаются как цитогенетические, так и клонапьные методы анализа соматических клеток человека и животных. Особо важное значение приобретают исследования состояния клеточных структур развивающегося организма в эмбриогенезе, как более чувствительного по сравнению с постнатальным онтогенезом (Лягинская, 1983; Палыга и др., 1984; Москалев, 1991; Румянцева, Наумчик, 1996; Konermann, 1982; Streffer, Molls, 1984; OECD, 1988; Lazjuk et al.. 1994 и др.).

Учитывая сказанное, нами проведены исследования действия радиационного фактора в развитии соматических эффектов в лимфоцитах и фибробластах человека и животных в пренатальном и постна-тальнои онтогенезе.

Связь работы с крупными научными программами. Настоящая работа является частью НИР Института радиобиологии АНБ, проводимых в соответствии с Госпрограммой по преодолению последствий катастрофы на Чернобыльской АЭС "Выяснить влияние радиоэкологической обстановки на биохимические, морфологические и физиологические изменения важнейших систем живых организмов. Дать оценку мо-лекулярно-генетических повреждений в условиях хронического действия радиоэкологических факторов" (1991 г., раздел 9.1.11).

Цель и задачи исследования. Цель работы - изучить влияние ИИ в малых дозах на характер и направленность процессов пролиферации и дифференцнровки, структурных изменений генетического аппарата в некоторых соматических клетках (лимфоциты, фибробласть) человека и аивотных на разных этапах онтогенеза.

- г -

Для достижения поставленной цели предусматривалось решить следующие задачи:

1. Провести анализ аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови взрослого и детского населения , проживающего в населенных пунктах Хойникского района Гомельской области.

2. Изучить особенности клонообразования в популяции фибробластов человека и животных в эмбрион? пьном, плодном и раннем постнатальном периодах развития в норме и после острого гамма-облучения in vitro (0,5; 1,0 и 2,0 Гр).

3. Изучить особенности реакции фибробластов 20-суточных плодов после однократного внешнего острого (0,5 и 2,0 Гр) и хронического (0. 45 Гр) гамма-облучения в эмбриогенезе (стационарное исследование).

4. Оценить влияние радиационного фактора на хромосомный аппарат, пролиферативный потенциал и процессы цитодифференцировки фибробластов 20-суточных плодов и новорожденных крысят, развивающихся внутриутробно в 10-км зоне аварии на ЧАЭС.

Научная новизна полученных результатов. Проведено комплексное исследование действия малых доз ИИ на хромосомный аппарат, процессы пролиферации и дифференцировкн некоторых соматических клеток на разных этапах пренатального и постнатального онтогенеза человека и белой крысы.

Автором разработаны и использованы в данной работе:

- модель клональной характеристики популяции нормальных Фибробластов крысы для оценки пролиферативного потенциала и степени дифференцировкн клеток на разных стадиях развития животного (пренатальная и ранняя постнатальная):

- метод культивирования эмбриональных фибробластов крысы для исследования хромосом;

Установлены видовые различия в структуре популяций фибробластов зародышей человека и белой крысы. По мере внутриутробного развития зародышей белой крысы в кожно-мышечной ткани накапливаются клетки с относительно высоким потенциалом деления (FII), а в ранней постнатальной жизни (новорожденные крысята 2-х суточного возраста) - увеличивается доля клеток с ограниченным потенциалом пролиферации (Fill).

Показано, что действие ИИ разных типов облучения в малых дозах (в экспериментальных моделях), а также сочетанное действие хронического облучения с факторами окружающей среды нарушают

структуру хромосом, изменяют процессы дифференцировки и пролифе-ратинзный потенциал клеток человека и животных в разные периоды онтогенеза. Наблюдаемые эффекты особенно выражены в лимфоцитах детского организма и фибробластах зародышей экспериментальных животных (белая крыса), развивающихся внутриутробно в зоне аварии на ЧАЭС.

Результаты исследований расширяют и углубляют представления

0 влиянии малых доз ИИ на генетический аппарат, пролиферативный потенциал и процессы дифференцировки соматических клеток на разных стадиях онтогенеза; они могут использоваться для прогнозирования состояния здоровья населения и его потомства.

Практическая значимость полученных результатов. На основании экспериментальных данных разработан "Способ анализа популяции фибробластов человека". Изобретение относится к биологии и может быть использовано для изучения клеточных основ (естественного и индуцированного) старения организма.

Изобретение "Способ анализа популяции фибробластов человека" (Патент H 2017818 от 15.08.1994 г.) внедрено в НИИ наследственных и врожденных заболеваний МЗ Беларуси с целью изучения наследственных аномалий развития органов и тканей у зародышей человека.

Результаты исследований являются предпосылкой для разработки новых методов биодозиметрии при хроническом облучении организма.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. У населения, проживающего на территории загрязненной радионуклидами (населенные пункты Хойникского района Гомельской эбласти Беларуси), в течении ряда лет наблюдается увеличение частоты встречаемости аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови. В спектре типов структурных нарушений хромосом отмечаются как возрастные, так и половые особенности.

2. Острое гамма-облучение популяций фибробластов зародышей человека in vitro (0,5; 1,0 и 2,0 Гр) и зародышей белой крысы на Э-о и S 5-е сутки их развития (0,5 и 2,0 Гр) приводит к нарушению 1роцесссв клеточного деления и дифференцировки, что проявляется з нарастании доли клеток с ограниченным потенциалом пролиферации (Фиброциты I и фиброциты II у человека; клеток Fill - у 20-су-гочных плодов крысы). Выявлены различия в частоте встречаемости

1 спектре типов аберраций хромосом фибробластов 20-суточных пло-юв в зависимости ог периода их внутриутробного развития и вели •

чины дозы. Они наиболее выражены при облучении в дозе 0,5 Гр на 15-е сутки внутриутробного развития, и 2,0 Гр - при облучении на 9-е сутки эмбриогенеза. Изменения в структуре хромосом обнаруживаются и у плодов второго поколения.

3. Хроническое действие ИИ в дозе 0,45 Гр в период прена-тального развития зародышей белой крысы вызывает структурные изменения хромосом и стимулирует эффективность клонирования кож-но-мышечных фибробластов 20-суточных п-юдов.

4. Радиоэкологическая обстановка, сложившаяся в 10-км зоне аварии на ЧАЭС, оказывает существенное влияние на внутриутробное развитие .20-суточных плодов и новорожденных крысят, вызывая регистрируемые изменения процессов пролиферации, дифференцировки и структуры хромосомного аппарата в фибробластах их кожно-мышечной ткани.

Личный вклад. Л.Н.Николаевич лично выполнена экспериментальная часть работы, проанализировано большое количество литературы по данному вопросу, сделаны научно обоснованные выводы, оформлена диссертационная работа. Научный руководитель диссертации д. м. н., профессор А. П. Амвросьев принимал участие в определении основной цели и задач исследования, а также в обсуждении результатов.

Апробация работы. Основные результаты работы были доложены на I Всесоюзном радиобиологическом съезде (Москва, 1989), пленуме "Радиобиологические аспекты генетики" и совещании "Генетические аспекты воздействия радиации на популяции и экосистемы в связи с аварией на ЧАЭС" (Пущино, 1990), Всесоюзной конференции "Актуальные проблемы радиобиологии и радиационной генетики" (Обнинск, 1990), II Всесоюзном съезде медицинских генетиков (Алма-Ата, 1990), Всесоюзной конференции "Радиобиологические последствия аварии на Чернобыльской АХ" (Минск, 1991), XI съезде анатомов, гистологов и эмбриологов (Смоленск, 1992), II Всероссийской конференции "Влияние антропогенных факторов на структуру преобразования органов, тканей, клеток человека и животных" (Саратов, 1993), международной конференции "Наука и медицина-Чернобылю" (Минск, 1993), белорусско-японском симпозиуме "Ближайшие и отдаленные последствия ядерных катастроф: Хиросима - Нагасаки и Чернобыль" (Минск, 1994), IV Международной конференции "Чернобыльская катастрофа: прогноз, профилактика, лечение и медикопси-хологическая реабилитация пострадавших" (Минск, 1995).

Спублмкеоаннпсть результатов лиссерташт. По теме диссертации опубликовано 22 работы, из них 7 статей, 14 тезисов и 1 патент на изобретение "Способ анализа популяции фибробластов чело-река".

Структура и объём работа. Диссертационная работа состоит из введения, общей характеристики работы, 7 глав, выводов и списка использованных источников. Работа изложена на 144 страницах машинописного текста, иллюстрирована 39 таблицами и 29 рисунками. Список использованных источников включает 254 названия, из которых 128 на русском, 3 белорусском и 123 английском языках. Обций объем рукописи составляет 183 страницы машинописного текста.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и «атолу нсслэдовашш Работа выполнена с использованием коьгаекса методов: культи-вирспЕНия соматических клеток, клонирования, анализа метафазннх хромосом, цитомсрфологического анализа клонов, омбриологическо-го, спетооптического, а такяе методов ыатеуатическсй статистики.

Облучение проводили в диапазоне ма?м:< доз - 0,05 - 0, 5 Гр. а тач~:е для сравнения выбраны дозы 1,0 и 2,0 Гр.

Эксперименты вьттолнени на беспородных крмсач ст??лнсго разее-¿егая. Подопытных самок (четырехмесячного пограста) з стадии зструса полсааивалн к сакцам и соотношении 3:1. Первый день бэ~ ременмссти определяли по наличнз сперматозоидов в вагинальных ::агка-<. Чгсть эти;< кивотных подвергалась однократному внешнему у-сблуче-нив с дозал 0,5 и 2,0 Гр на Э-е и 15-е сутки беременности на установке "ИГУР" (137Сз, ио^ность дозы 6,2 Р/мин), другая часто - хроническому облучению га установке» "Ггммарид" ( Сз, )-:луюсть дозы НО мР/час) а течение 19 суток (обг^л дога 0,45 Гр). Кроме того, специальная группа беременных самок была размерена в 10-км ьоио Ч/ЗС и находилась там в течение 19 суток (малость ¿ага гоума-наяучеимя -4,5 мР/час; доза - 0,05 Гр).

Материалом нсследосал;;я слуаилн кезно-ктачнио фкбробглсти з-редышей 9-н, 15-и, 20-и суточного возраста белой крысы к 2-су-течных нсвороздиаи'х крысят (всего 203). Изучалась тгкев культура вкбрнональннх фибробластов , выделенная из тканей 8-нздэль-¡:г:х заролгаей человека (всего 15 зародкзей) и лки$оцкты п<?рч$«»-рнчесгсой крови ля лай (54 взрослых н 34 детей).

Эффекты действия ИИ на соматические клетки развивающегося . организма животных изучали на стадии завершения внутриутробного развития зародыша (20-суточный плод) и у новорожденных крысят (2-е суток после рождения). Кроме того, мы исследовали зародышей второго поколения, родители которых били облучены однократно в дозе 0,5 Гр на 15-е сутки эмбриогенеза. Контрольные животные находились в условиях вивария. В каждом эксперименте брали 30 животных для контрольной и опытной групп.

С целью разработки способов оценки радиационного старения организма человека использовали культуру эмбриональных фибробластов как экспериментальную модель (Гринберг, 1988). Монослой-нув культуру в логарифмической фазе роста облучали на установке ЛМБ-гамма-1м (137 Сз, мощность дозы 40 Р/мин) в дозах 0,5; 1,0 и 2,0 Гр.

Для изучения процессов пролиферации и дифференцировки фибробластов, мы использовали модель клональной характеристики популяций фибробластов зародышей человека и белой крысы. Анализ клонов эмбриональных фибробластов человека проводили по С. М. Терехову (1984), а фибробластов зародышей и новорожденных крысят по J. Mollenhauer, К. Bayreuther (1986) в нашей модификации. Общее число проанализированных клеток в клонах составило 672108 фибробластов человека и 207092 - у зародышей белой крысы. Проли-феративный потенциал фибробластов оценивали по эффективности клонирования (ЭК), которую выражали в % как отношение числа колоний к числу посеянных клеток. Митотическую активность дочерних клеток в клонах изучали по размеру колоний, который выражали через число генераций одиночных клеток (log2 от числа клеток, составляющих колонию).

Препараты метафазных хромосом фибробластов зародышей белой крысы готовили по методу разработанному автором ( Николаевич и др., 1994). Методы анализа структурных аберраций и их классификация соответствовали общепринятым (Дыбан, Баранов, 1978; Захаров и др.,1982). Анализировали 50-100 метафаз от каждого зародыша и новорожденного животного (всего 7745), а также - 100-350 лимфоцитов периферической крови человека (без кариотипирования) (общее количество клеток - 20417).

Обследованное население было разделено на группы в зависимости от плотности загрязнения местности проживания радионуклидами цезия-137 и дозовой нагрузки: 1-я группа - 23 чел (5-15

Ки/кв. км; эффективная эквивалентная доза-60, 0 мЗв); 2-я группа-13 чел (15-20 Ки/кв.км; эффективная эквивалентная доза-80,0 мЗв).

В качестве контроля обследовали взрослое (18 чел) и детское (13 чел) население из г.Березино Минской области. Поглощенную дозу рассчитывали по трем цитогенетическим показателям (доле аберрантных клеток, общему числу аберраций хромосом на 100 клеток, сумме дицентриков и колец) на основе линейно-квадратической модели (Севанькаев, Насонов, 1979). Статистическую обработку полученных данных проводили на базе программного пакета РС - МАТ-ЛАБ для ЭВМ РС АТ. 386. Достоверность оценивали по критерию Сть-юдента на основании метода Монте-Карло (Соболь, 1978).

Структурные аномалии хромосом лимфоцитов периферической крови ладей, проздваюгцих на загрязненных радионуклидами территориях Хойникского района Гомельской области

Цитогенетическое обследование взрослого населения показало, что по мере увеличения плотности загрязнения территории цезием- 137 в среднем в 1.5 раза возрастает частота встречаемости аберрантных клеток и в 5-6 раз аберраций хромосомного типа (ди-центрические и кольцевые хромосомы) в их периферической крови (рис. 1).

Рис. 1.Аберрации хромосом в лимфоцитах взрослого населения.

Обозначения: ЕЯ аберрантные клетки; ВЭ - одиночные фрагменты; КЗ обмены хроматидного типа; ГГС - парные фрагменты; ЕЯ дицентрические хромосомы; £3 кольцевые хромосомы; •-РС0.05; "-Р<0.01

0 5 .15 15 .20 0;-137,

Контроль Хой( ¡икекий район Ки/кв км

Эффект действия ИИ сильнее проявился у лиц, проживающих на территории с плотностью загрязнения радионуклидами цезия-137 от 5 до 15 Ки/кв.км, у которых имеют место различия в характере распределения этого типа аномалий по сравнению с группой лиц. проживающих на территории с плотностью загрязнения изотопами це-зия-137 свыше 15 Ки/кв. км.

С увеличением возраста людей отмечается достоверное повышение частоты встречаемости аберрантных клеток и аберраций хромосомного типа (20-40 лет - 2,57% и 0,21%; 40-G5 лет - 3, 15Т и О, 61 соответственно).

Наряду с этим мы выявили статистически достовернее различия в спектре типов аберраций хромосом лимфоцитов периферической крови ненщин и мужчин . У женщин в возрасте 40-65 лет повышена частота встречаемости нарушений хромосомного типа (парные фрагменты - 1,22%; дицентрические и кольцевые хромосомы - 0,77%); в других возрастных группах (20-40- и 65-80 лет) - хроматидного типа (одиночные фрагменты - 1,69% и обмены - 1,01%) (Р^'0,05). У мужчин в возрасте от 40 до 65 лет отмечается увеличение в 2 раза уровня структурных нарушений в виде хроматидных фрагментов (1, 52%) (Р<0,05); дицентрические и кольцевые хромосомы у них составляют 0, 43%. У лиц в возрасте 20-40 лс:т, напротив, наблюдается снижение числа аберраций хроматндного типа (0,71%), ацентрических и кольцевых хромосом (0,26%, Р<0,05) и незначительное увеличение парных фрагментов (1,13%).

Подобные нарушения наиболее выражены у детей (рис. 2).

1S9Ü Г.

19S0 Г.

1S31 г.

2

65 X

Контроль

4

«о %

3

3%

Загрязнение Cs-137 от 5 до 15 Ки/кв.км

Рис. 2. Спектр аберраций хромосом (детское население).

Обозначения: 1 - днцентрики и кольца. 2 • парные Фрагменты; 3 - обмены хромашдного типа, 4 - одиночные фрагменты.

Число аберраций на клетку у них о 1,5 раза превышает контрольные показатели. В спектре типов аберраций преобладают парные фрагменты, дицентрическне и кольцевые хромосомы, которые в 1,5-3,0 раза превышают контроль. При повторном обследовании этих детей (1991 г.) доля дицентриков и колец значительно возрастает, что свидетельствует о постоянном действии радиационного Фактора.

Поглощенная доза, рассчитанная по цитогенетнческим показателям, в 2,5 раза превышает дозу полученную методами физической дозиметрии (Barkhudarov et al., 1906; Avetlsov ot al., 1963). Поскольку условия облучения d результате аварии на ЧАЭС существенно отличаются от тех, при которых были построены калибровочные кривые, использование последних для биологической дозиметрии возможно только с определенными поправками. Вместе с тем нами отмечена прямая зависимость мезду величиной поглощенной дозы и средней частотой встречаемости аберрантных клеток, в то время как для днцентриксв и колец подобной зависимости не екявлено.

С целью более углубленного анализа механизмов радиационного воздействия на клеточные структуры развивающегося организма нами изучены процессы дифференцировки, пролиферативной активности и состояние структуры хромосомного аппарата других соматических клеток, в частности фибробластов когда-мышечной -тигли з норме и п условиях их облучения в сравнительно небольших дозах.

Влияние ноиизирукпда излучетш на структуру и процессы цлтолиФфсращ!фовки зкбриоиалышх £нбробластоп человека Популяция фибробластов зародышей человека in vitro гетеро-генна и в клональных условиях формирует колонии, состоящие из (слеток различающихся морфологической характеристикой, степенью дифференцировки и митотической активностью. Малоклеточные колонии (II тип) состоят из фиброцитов I и фиброцитов II (клеток с ограниченным потенциалом деления), а многоклеточные (I тип колоний) - из фибробластов (клеток с высоким потенциалом пролиферации). Наличие смешанных клонов свидетельствует о дифференцировке фибробластов. Этот процесс следует в одном направлении: , верете-новидные клетки (фибрсбласты) с определенной частотой дифференцируются в парусовидные клетки (фиброциты I), последние, в cbod очередь, давт начало отростчатым клеткам (фиброцитам II).

Острое облучение первичной популяции фибробластов зародышей человека In vitro в дозах 0,5; 1,0 и 2,0 Гр нарушает процессы

пролиферации и цитодифференцировки клеток. При дозе 0,5 Гр наблюдается незначительное увеличение ЭК и только начиная с дозы 1,0 Гр пролиферативный потенциал фибробластов снижается (58,30% - контроль и 66,0%, 36,50%, i 9,40% соответствен-но)(Р<0,05). Этот эффект сохраняется и в поколении дочерних клеток, причем он более заметно проявляется в клетках на 5 сутки после их облучения, что свидетельствует о репродуктивной гибели 'клеток, составляющих популяцию дочерних фибробластов.

Выявлены изменения в соотношении типов клонов: доля колоний II типа возрастает (25,77% - контроль и 35,77%, 55,36%, 62,81% соответственно)(Р<0,01), а остальных - снижается (Р<0,05). Наблюдаемое изменение в соотношении разных форм клеток в клонах человека, по-видимому обусловлены как повышенной радиочувствительностью веретеновидных клеток, так и ускорением процессов их диф-ференцировки в фиброциты I и фиброциты II.

Установлено, что облучение в дозе 0,5 Гр по сравнению с дозами 1,0 и 2,0 Гр резко угнетает пролиферацию дочерних фиброцитов I (малоактивных (слеток), о чем свидетельствуют такие показатели как сникение количества клеток в клонах II типа и уменьшение числа клеточных генераций по сравнению с контролем.

По мере увеличения дозы (1,0 и 2,0 Гр) в первичной популяции фибробластов человека увеличивается субпопуляция клеток, в!итача«цнх фиброциты I к фиброциты II, которая особенно возрастает после облучения в дозе 1,0 Гр (Р<0,05).

Следовательно, накопление малоактивных клеток (фиброцитов I и фиброцитов II) после действия ИИ может быть одним из показателей радиационного старения клеточных популяций организма.

Роа.чц.чл сомйтичсс!шх «иштсх на облучение в ранние стадии онтогенеза белой крысы

Нами выявлены особенности реакции клеток на действие ИИ в эмбриогенезе экспериментальных животных. Прежде всего это касается процессов кпонообразования, пролиферации и цитодифференцировки кокно-мышечкых фибробластов зародышей белой крысы.

Установлено, что в норме популяция первичных эмбриональных фибробластов крысы состоит из клеток различающихся между codai по морфологическим характеристикам и пролиферативной активность! (клетки FI, FII и Fill). Наибольшим потенциалом деления, облада ют парусовидные клеши FII, которые формируют многоклеточные кг

- и -

лонии II типа и совершают большее количество генераций по сравнению с веретеновидными и плейоморфными фнбробластами (FI и Fill соответственно). Колонии, сформированные из клеток FI (I типа) и FUI (III типа) - мапокпеточные и состоят из клеток с ограниченным потенциалом пролиферации. Смешанные колонии включают все типы клеток и их наличие свидетельствует о динамичности процессов дифференцировки, происходящих в клоновых популяциях.

Обнаружено, что в норме по мере развития зародыша (на 9-е, 15-е и 20-е сутки) в кожно-мышечной ткани происходит накопление клеток с относительно высоким потенциалом деления (FII). В ранней постнатальной жизни у новорожденных крысят (2-е суток после рождения) - увеличивается доля клеток с ограниченным потенциалом пролиферации С F111).

Острое внешнее облучение в дозе 0,5 Гр на 9-е и 15-е сутки эмбриогенеза повышает пролиферативную активность (в 2 раза) и ускоряет процессы дифференцировки в популяции фибробластсв 20-суточных плодов крысы, что подтверждается увеличением числа колоний смешанного типа. Наблюдаемый эффект особенно выражен у плодов, облученных на 9-е сутки эмбриогенеза.

Выявлены различия в частоте встречаемости и спектре типов аберраций хромосом фибробластов 20-суточных плодов, облученных s дозе 0,5 Гр на 9-е и 15-е сутки их внутриутробного развития (рис. За, б).

4-

Рис. 3. Анализ аберраций хромосом о фибробластах плодов белой крысы посла острого облучения в дозе 0,5 Гр

Обозначения : а - плоды, облученные на 9-е сутки развития; б - плоды, облученные на 15-е сутки эмбриогенеза; в • плоды второго поколения. 1- аберрантные клетки; 2 - одиночные фрагменты; 3 - хроматидные обмены; 4 - парные Фрагменты; 5 - хромосомные обмены. ■ - Р < 0.05, *" - Р< 0 01

Рост аберраций хромосом отмечается и в клетках плодов второго поколения (4,67% и 1,00% соответственно) (рис.3 в).

При облучении в дозе 2,0 Гр частота встречаемости аберрантных клеток выше у плодов, облученных на 9-е сутки эмбриогенеза по сравнении с плодами, облученными на 15-е сутки развития (10,31% и 4,81% соответственно). 0 нарушении процессов клеточного деления в тканях развивающихся зародышей, облученных на 9-е и 15-е сутки эмбриогенеза, свидетельствует увеличение здесь количества гипо- и гипердиплоидных клеток.

Таким образам, наблюдаемые эффекты в реакции фибробластов 20-суточных плодов крысы после острого облучения находятся в зависимости от периода внутриутробного развития зародышей и величины дозы.

Реакция соматических клеток на хроническое облучение с стационарных условиях и при содержании животных о зон о аварии на ЧЛЭС

В условиях хронического облучения зародышей крысы в период их внутриутробного развития (доза 0,45 Гр) у 20-Суточных плодов в 1.5 раза повышается ЭК фибробластов. В спектре типов колонии в 1,5 раза снижается доля колоний III типа (Р<0,05); количество колоний I и II типов не изменяется. Отмечено увеличение количества смешанных колоний, что указывает на ускорение процессов дифференцировки в клоновых популяциях.

Количество клеток в клонах I, II и III типов возрастает, что свидетельствует о повышенной митотической активности дочерних фибробластов, находящихся в разной степени дифференцировки. Клетки FI, FII и Fill облученных зародышей проходят большее число генераций по сравнению с фибробластаыи зародышей контрольных животных. В кожно-мышечной ткани этих плодов накапливаются клетки с высоким потенциалом деления (FII) и в 2 раза снижается количество малоактивных клеток (Fill). Это очевидно способствует увеличению доли аберрантных клеток (4,5 раза) по сравнению с контрольными значениями (рис. 4 а).

У плодов и новорожденных крысят из зоны (доза 0,05 Гр) в 2-2,5 раза возрастает число аберрантных клеток (см. рис. 4 б,в). Встречаются дицентрические и кольцевые хромосомные структуры, которые отсутствуют у контрольных зародышей и у облученных в ус ловиях стационара.

2.5

1.5

С.5

SI

a

и

ц

1

Рис. 4. Аберрации хромосом в фиЗрсбг.аптах гглодзз ii .чозорсзкдэны?; крысят, разаигзагащихоя злутрмугробио а услссиях хронического облучения и в гззно аазрин на ЧАЗС. Обозначения: плоды (20-о сутки распития) гюсл-з хроничтс'сго обручения в дозч 0.45 Гр (а) ; плоды (б) и новорожденные к-рьспта (в), развивающиеся гренатально в 10 -км зонз ззгрии из ЧАЭС.1 - сберрантм. о клэтки; 2 - одиночныз фрагменты; 3 - хрематидныв обмени; 4 - гетнь-'о фрагменты; 5 -хромосомны» обмечи.' - Р< 0.05; " • Р < 0.01

Отмечается слецифп :ескся реакция клеток н^ ;лсйил облу-is-нил и в спектре типов колоний. У глодоп крысы из гони нрблэд^ет-ся увеличен!!» дели колоний III типа (26,49% и 15,31% ссотвэтс-твекно) и сокращение числа клонов II типа (41,23% и 54,94% соответственно) . У нс-гороздекчых крысят, напротив, возрастает г,оря колоний II типа (60,46'^ и 36,68л соответственно; Р<0, С5) и достоверно снимется количество колоний III типа (12,01% и 31,01% соответственно). Результаты анализа количества клеток в колониях фибробластов у плодов крысы, экспонированных в зоне аварии на ЧАЭС показали, что дочерние клетки FI и FIII (в противоположность с клетками FII) имеют повышенную пролиферативнув актив-• ность и проходят большее число генераций по сравнению с клетками контрольных плодов. У новорожденных крысят отсутствует субпопуляция клетск, образующих в клональных условиях колонии I "ипа. Количество клетск FII в клене снижается, в то вре»я как доля клеток Fill - возрастает по сравнению с контрольными значениями, а также изменяется число генерации дочерних фибробластов и з 1,5 раза снижается ЗК. Изменение кинетики дочерних фибробластов разных морфотипоп, способстзует увеличение о ксхно-мкшечной ткани

2

1

С

плодов доли клеток с ограниченным потенциалом пролиферации и накоплению у новорожденных крысят фибробластов с высоким потенциалом деления.

Таким образом, наблюдаемые эффекты свидетельствуют о наличии значительных изменений в геноме различных функциональных групп соматических клеток (лимфоциты крови, фибробласты кожно-мышечной ткани), возникающих после острого и хронического облучения в экспериментальных моделях и под действием факторов среды. Особенно эти эффекты выражены у плодов и новорожденных крысят, находящихся в период внутриутробного развития в зоне ЧАЭС.

выводы

1. У населения, проживающего на территориях с различной плотностью загрязнения радионуклидами цезия-137 отмечается увеличение частоты встречаемости аберрантных клеток в среднем в 1,5 раза по сравнении с относительно чистыми районами. Установлено достоверное увеличение числа дицентрических и кольцевых хромосом, которое сильнее выражено у людей 40-65-летнего возраста и детей. Данный эффект достоверно возрастает при увеличении плотности загрязнения территории радионуклидами цезия-137 и зависит от возрастных и половых особенностей обследованных контингентов.

2. Острое облучение популяции эмбриональных фибробластов человека (in vitro) в дозах 0,5; 1,0 и 2,0 Гр нарушает процессы их пролиферации и дифференцировки, способствует накоплению клеток с ограниченным потенциалом пролиферации (фиброциты I и фиброциты II)

Показано, что фибробласты (веретеновидные клетки с высокой митотической активностью) обладают повышенной радиочувствительностью, которая сохраняется в поколении дочерних клеток. Фиброциты I и фиброциты II менее радиочувствительны к действию ионизирующих излучений.

3. В популяции фибробластов кожно-мышечной ткани зародышей человека и белой крысы в норме отмечаются качественные различия. У крысы наибольшим потенциалом деления обладают клетки FII, формирующие в клональных условиях многоклеточные колонии II типа. Колонии I и III типов - ыалошюточные и состоят из клеток с ограниченные потенциалом пролиферации (FI и Fill соответственно).

А. Острое внешнее гамма-облучение в дозе 0,5 Гр на 9-е и 15-е сутки эмбриогенеза вызывает разнонаправленные эффекты в реакции фибробластов 20-суточных плодов крысы.

У плодов, облученных на стадии раннего органогенеза (9-е сутки) повышается митотическая активность фибробластов, увеличивается доля смешанных колоний и снижается количество аберрантных клеток; у плодов, облученных на стадии позднего органогенеза (15-е сутки) - также повышается эффективность клонирования фибробластов, но в спектре типов колоний возрастает число клонов, состоящих из малоактивных (слеток ; при этом' увеличивается и доля аберрантных клеток. В обоих случаях частота встречаемости клеток с дицентрическими и кольцевыми хромосомами повышается, изменяется соотношение анеуплоидных клеток. Аналогичные аберрации хромосом выявляются у плодов второго поколения.

5. В условиях хронического действия ионизирующих излучений в период внутриутробного развития зародышей крысы (доза 0,45 Гр) в популяции фибробластов 20-суточных плодов наблюдаются эффекты стимуляции: повышение их способности к клонированию, увеличение доли смешанных колоний, возрастание митотической активности дочерних клеток FI, FII, FIII, накопление фибробластов с высоким потенциалом пролиферации и повышение частоты встречаемости аберрантных клеток.

6. В популяции фибробластов 20-суточных плодов, находившихся в течение периода внутриутробного развития в 10-км зоне аварии на ЧАЗС, эффективность клонирования не изменяется; увеличение доли клонов, состоящих из малоактивных клеток FIII, повышение митотической активности дочерних клеток FI и FIII приводит к накоплению фибробластов с ограниченным потенциалом пролиферации. У новорожденных крысят, напротив, снижается эффективность клонирования клеток, в тканях накапливаются клетки с высоким потенциалом деления. И у плодов, и у новорожденных крысят из зоны возрастает частота встречаемости аберрантных и изменяется соотношение анеуплоидных клеток.

7. Наблюдаемые биологические эффекты свидетельствуют о мутагенности среды обитания. Методы оценки пролиферативного потенциала и степени дифференцировки фибробластов в комплексе с анализом аберраций хромосом других тканевых систем могут быть использованы при проведении биологической дозиметрии хронических воздействий ИИ для оценки состояния здоровья населения в динамике.

СПИШ РАБОТ, ОПУБЛ!П:ООА1ШЬЕ{ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Квитко 0.В., Жукова Л.Н., Николаевич Л.Н. Сравнительный анализ эпигенетической структуры популяции фибробластов человека и ыыши // Доклады АН БССР. - 1991. - Т.35, N П. - С. 1031-1033.

2. Роль эпигенетических процессов в наследственной изменчивости / 0. В. Квитко , Л. Н. Николаевич , Л. Н. Жукова и др. // Проблемы генетики: Сборник научных статей. - 1!н.: Навука i тэх-н1ка, 1994. - С. 216-233.

3. Николаевич Л. Н., Амвросьев А.П., Рогов Ю. И. Метод культивирования эмбриональных фибробластов крысы для исследования хромосом // Весц1 АН Беларус!, Сер. б1ял. навук. - 1994. - N 2. - С. 53-58.

4. Amvroslev А.P., Nikolaevich L.N. Radiobiological Effects of Light Ionizing Radiations In Sonatic Cells of Human and Ani-nals in Early Ontogenesis // Proc. of Belarus-Japan Symposium "Acute and Late Consequences of Nuclear Catastrophes: Hiroshi-es-fiagasaki aid Chernobyl". - Minsk:Tokyo, 1994. - P. 484-493.

b. Пат. 2017818 P4', 15(11 5 С 12 N 5/02, 5/00. Способ анализа популяции фибробластов челэзека / Кзитко 0. В. и Николаевич Л. Н. (Республика Беларусь). - N 4904835/13; Заявлено 21.09.90; Опубл. 15.08. G-i, Бал. filb.- 5 с.

6. Аквросьсс А.П., Николаевич Л. И. Цитогеметический мониторинг датского населения из регионов с различной радиоэкологическая обстановкой // Чарнобьшьская катастрофа: прогноз, профилак-т»са, лечение н иадикопсияологическая реабилитация пострадавших: Сб. »л?ер. ¿-ой Исгдународнзй конфер. - Мл.: Из-ьо Белорусского iffl^nvfa " Дз-JHi MapncoL-nr/, 1895.- С. 245-247.

7. Амсросьев А.П., Николаевич Л. Н. Влияние мутагенных факторов огфуаакцвй среда »¡а нгхладсгвегсюсть человека //Аотуапьные сыросы слиш<л па организм лучевой энергии (ионкзнруюцее и лазерное налучеиае): Сборник !;&у>-".!.ч:: трудоо. - Смоленск: С!,'ГА, 1895. - С. 17-23.

В. Дмзрсзсьев А. П., Николаевич Л. Н. Цитогенотическне эффекты радиациоачэго загрязиогяш в некоторых районах Гомельской области //Иехдунзролныг цодмцинские обзоры. - 1998.- Т. 3, N. 1. - С. 2S-32.

РЕЗЮМЕ

Николаевич Лариса Николаевна "Влияние ионизирующего излучения в палых дозах на некоторые соматические клетки человека и животных на разных этапах онтогенеза"

Ключевые слова: ионизирующее излучение, лимфоциты, фибробласты , хромосомные аберрации, пролиферация, дифференцировка, онтогенез.

Материалом исследования служили кожно-мьшечные фибробласты зародышей человека и белой крысы, а также лимфоциты периферической крови человека. В работе использовали методы культуры клеток, клонирования, анализ метафазных хромосом, цитоморфологичес-кий анализ клонов, эмбриологический, светооптический и статистический.

Цель работы - изучить влияние ионизирующих излучений (ИИ) в малых дозах на характер и направленность процессов пролиферации и дифференцировки, структурных изменений генетического аппарата в некоторых соматических клетках (лимфоциты, фибробласты) человека и животных на разных этапах онтогенеза.

Установлено, что у взрослого и детского населения, проживающего на территории Хойникского района Гомельской области в среднем в 1.5 раза возрастает частота встречаемости аберрантных лимфоцитов в периферической крови. В спектре типов аберраций вы-являвлены возрастные и половые особенности.

Показано, что действие разных типов гамма-облучения в малых дозах в экспериментальных моделях, а также хроническое действие радиоэкологических факторов в 10-км зоне аварии на ЧАХ, вызывают структурные нарушения хромосом, изменяют процессы дифференцировки и пролиферативного потенциала фибробластов человека и белой крысы в периоды пренатального и постнатального онтогенеза.

На основании экспериментальных данных предложены способы оценки пролиферативного потенциала и степени дифференцировки фибробластов человека и животных, которые могут использоваться в комплексе с анализом аберраций хромосом других тканевых систем при проведении биологической дозиметрии хронических воздействий ИИ на организм для оценки состояния здоровья населения и его потомства.

Область применения результатов - радиобиология, медицина, генетика и цитология.

РЭЗВМЕ

Н1калаев1ч Ларыса Шкалаеуна "Упльф 1ан1зувчага выпраыеньвшшя у малых дозах на некаторыя

саыатычныя клетк1 чалавека 1 хывёл на розных этапах антагенезу"

Ключавьи словы: 1ан1зуючае выпраменьванне, л1мфацыты, ф!браблас-ты, храыасомныя аберацы1, прап1ферацыя, дыферэнцыроука, антаге-нез.

Матэрыялам даследавання служил! скурна-мышачныя ф!брабласты зародкау чалавека 1 белага пацука, а таксама л!мфацыты перыфе-рычнай крав1 чалавека. У работе выкарыстоувал1ся метады культуры клетак, клан1равання, анал!з метафазных храмасом, цытамарфала-г1чны анал1з клонау, эыбрыялаг1чны, светааптычны 1 статыстычны.

Мзта работы - вывучыць уплыу !ашзуючых выпраменьванняу у малых дозах на характар 1 нак!раванасць працэсау прал!ферацы1 1 даферэнцыроук!,. зияненняу будовы генетычнага апарату у некаторых саматычных клетках (л!ифацыты, ф1брабласты) чалавека 1 жывел на розных этапах антагенезу.

Установлена, што у дарослага 1 дз1цячага насельшцтва, якое жыве на тэрыторы! Хойн!цкага района Гомельскай вобласц! у сярэд-н1и у 1,5 разы узрастае частата узн1кнення аберантных л1мфацытау у перыферычнай крыв!. У спектры тыпау аберацый выяулены узроста-выя 1 палавыя асабл!васц!.

Паказача, што дзеянне гаыа-апраменьвання розных тыпау у экспериментальных медалях, а таксама хран1чнае дзеянне радыеэка-лаг1чных фактарау у 10-ю.» зоне авары! на ЧАЭС, вызываюць структурный парушэнн! храмасом, змяняюць працэсы дыферэнцыроук! 1 прал1ферацыйнага патэнцыалу ф!брабластау чалавека 1 белага пацу-ка у перыяды прэнатальнага 1 ранняга пастнатальнага антагенезу.

На аснозе экспериментальных данных прапанаваны спосабы аценк1 прал1ферацыйнага патэнцыалу 1 ступен! дыферэнцыроук1 ф1б-рабластау чалавека 1 жывел, як!я могуць выкарыстоувацца у комплексе з анап!зам аберацый храмасом друг1х тканкавых с!стэм пры правядзенн1 б!ялаг1чнай даз1метры! хран1чных уздзеянняу 1ан1зую-чага выпраменьпання на арган1зм для ацэнк! стану здароуя насельшцтва 1 яго патомства.

Вобласць выкарыстання рэзультатау - радыеб1ялог1я, медыцы-на, генетика 1 цыталог!я.

SUMMARY

Nikolaevich Larisa Hikolaevna

"Effect of low-dose ionizing radiation on some somatic cells of man and animals at different ontogenesis stages"

Keywords: ionizing radiation, lymphocytes,.fibroblasts. chromosome aberrations, proliferation, differentiation, ontogenesis.

The musculocutaneous fibroblasts of human- and white rat embryos, as well as human peripheral blood lymphocytes were studied. The following methods were used; cell culturing, cloning, metaphase chromosome analysis, cytomorphological clone analysis, embryological, light-optical and statistical ones.

The goal of the research was to study the influence of low-dose ionizing radiation (IR) on the character and trend of proliferation and differentiation processes, structural changes in genetic apparatus in some somatic cells (lymphocytes, fibroblasts) of nan and animals at different ontogenesis stages.

It was revealed that in adults and children froa Khoiniki District of Gomel Ragion the occurrence frequency of aberrant lymphocytes in peripheral blood increased on the average 1,5 times. Age and se;: peculiarities were detected in the spectrum of aberration types.

The effect of different types of low-dose gamma-irradiation in experimental models and the chronic effect of radioecological factors in the 10-kn accident zone of the Chernobyl NPP were shown to cause structural chromosome damage and to change the processes of differentiation and proliferative potential of human and white rat fibroblasts during prenatal and postnatal ontogenesis.

On the basis of the experimental data were proposed the methods for estimating the proliferative potential and the differentiation rate of human- and animal fibroblasts that can be used in a combination with the chromosome aberration analysis of other tissue systems when conducting biological dosimetry of IR chronic effect on organism and estimating the health state of people and their progeny.

The results can be applied in radiobiology, medicine, genetics

and cytology.