Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние гормонов и факторов роста на половые и соматические клетки фолликулов яичников мышей в культуре

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Влияние гормонов и факторов роста на половые и соматические клетки фолликулов яичников мышей в культуре"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ

На правах рукописи УДК 612,433.65 611 013.1 618.111 576.8.083.1

ВОРОБЬЕВА Ольга Анатольевна

ВЛИЯНИЕ ГОРЛЮНОВ И ФАКТОРОВ РОСТА НА ПОЛОВЫЕ И СОМАТИЧЕСКИЕ КЛЕТКИ ФОЛЛИКУЛОВ ЯИЧНИКОВ МЫШЕЙ В КУЛЬТУРЕ

Специальность: 03.00.25 — Клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

САНКТ-ПЕТЕРБУРГ 1992

Работа выполнена в лаборатории раннего эмбриогенеза человека Научно-исследовательского института акушерства и гинекологии им. Д. О. Отта РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор А. И. Никитин.

Официальные оппоненты: кандидат биологических наук В. А. Плескач; доктор медицинских наук В. С. Баранов.

Ведущее учреждение — Санкт-Петербургский государственный университет. Биолого-почвенный факультет.

Защита состоится «Л&» 1992 г. в // часов на

заседании Специализированного совета Д.002.73.01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194064, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр., 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАН.

Автореферат разослан «

1992 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л. Н. Писарева

© Институт цитологии РАН.

- з -

ОБЩАЯ ХАРА1ГГЕРИСТИКА РАБОТЫ

. Актуальность проблемы. Выяснение механизмов регуляции репродуктивного процесса является актуальной проблемой биологии развития. При этом особую важность имеет изучение процессов пролиферации и дифференшгропки соматических клеток фолликулов яичников и межклеточных вза>1моде:1стви"! полових и соматических клеток,, в значительно;'! степени определяющих особенности роста и созревания ооцитов, а также приобретение способности последними к оплодотворению и дроблению.

. До последнего времени основное внимание при изучении механизмов, контролирующих фолликулогенез млекопитающих, уделялось факторам центрально.! регуляции - гонадотрогсинам: фолликулосткмулирущему гормону (ФСГ), лютеинчзирующему гормону (ЛГ) и пролактину. Недавно было показано, что соматические клетки фолликулов способны к синтезу и специфической рецепции не только стероидных гормонов, но и факторов роста: эпидермального (Э5Р), фактора роста фибробластов (£Р£), инсулиноподобных факторов роста (fflliP), трансформирующих типа Л и |2> ( JLT5P и f>Ti>Pl.

В настоящее время биологической роли факторов роста посвящено большое число исследования. Однако, несмотря на важность, проблемы, результаты многих работ по анализу действия факторов роста на соматические и половые клетки фолликулов яичников млекопитающих весьма противоречивы. Это может быть связано с использованием в качестве объектов половых клеток, находящихся на разных стадиях дифференци-ровки, применением различных методов культивирования, а также разнообразием использованных культуральных сред.

Исследование роли факторов роста, особенно во взаимодействии их с гонадотропинами, в регуляции роста и дифференцировки соматических и половых клеток фолликулов яичников осложняется также отсутствием удобных экспериментальных моделей для изучения влияния этих веществ на молекулярно клеточном уровне.

Изучение этих вопросов, кроме теоретического, имеет также и большое практическое значение, так как знание механизмов регуляции роста и дифференцировки половых и соматических клеток фолликулов яичников млекопитающих необходимо для оптимизации методов стимуляции фолликулогенеза в практике лечения бесплодия у человека, отработки более адекватных условия для проведения работ, связанных с оплодотворением in vitro ( стимуляции супвровуляции в'экспериментальной биологии и медицине, разработки новых методов репродуктивной технологии в животноводстве и т.п.

ОсчовчоН поим работы явилось изучение влияния гормонов и факторов роста на половые и соматические клетки фолликулов яичников млекопитающих в культуре.

Зм.ачч исследоматля: . .

1. Изучить особенности созревания ооцигов мвглеЯ, виделонних на ранних сроках гюслс введения животным гонадотропинов, в бессывороточной среда, а также реакции оэц-лтов на введение в среду пра паратов, влняйцнх на уровень iuV.lv в клетках.

2. Изучить влияние горбонос, и факторов роста на ооцитц, куль тивнруеже в фолликулах, й также ка изолированные комплексы ооцит -клетки кумулвса.

3. Исследовать особенности стероидогенеза яичников в культуре в период ре'лннцняцни меПоза в ооцитах под влияние:.: гормонов и спи--дермпльного фактора роста.

4. ¿Знчснпть особенности роста клонов клеток проангральной я кумулюсноИ гранулезп !.я.глвЯ под влиянием факторов роете, и гонадотра-пиноб в средах с различным содержанием сыворотки.

5. Исследовать особенности стероидогенеза клеток гранулезы при спонтанная и индуцированной дифференцнровке в культуре.

Научная ногизна исследований и личный вклад автора в разработку теш. Пп-зрже изучено влияние гонадотропшх гормонеа и пояипоп-тидн'лх факторов роста на рост и диффлренциропку полошх и соматичсс ких. клеток яичников даоса в ргшяпччше модельных системах.

Показано, что 01? в физиологических дозах индуцирует созревание ооци.тов, выделенных на ранних стадиях после введения гонадотропиноь животным, при культивировании фолликулов в среде без сыворотки, а также сникает б.ток меПоза,- ЕЫзЕанныЛ дибутирилциклнчесиш зденозин-моиофосфатом (дб цДМ5), ХГ индуцирует реинициацию ыейоза'в культуре фолликулов, но не влияет на клетки, мейоз у которых остановлен дб цА.'.!5. На основе полученных в работе результатов, а также данных литературы нами предложена гипотеза, согласно которой реикициация ыеЛоза является плеЯотропно регулируемым процессом, а'действие ЛГ на ооцнтц опосредовано системой ауто- и паракринных регуляторов созревания.

В работе вперЕые проанализированы особенности стероидогенеза яичников в культуре в период реинкциации мейоза в ооцктах под влиянием гормонов и Э£Р. Показано, что в этот период наблюдается ивыенение стероидогенеза. Под влиянием ЭФР происходит изменение соотношения секретируеыых стероидных гормонов в сторону зпачитель-

ного увеличения содержания тестостерона и прогестерона.

В работе предложен метод получения культуры малодифференцирован-них ие.ток гранулезы мьтаеЛ, реагирующих на введение в среду Э1Р, ЗРЗ и инсултга образованием клонов. 5СГ, ХГ и "Эквинекс" икгибировали рост малод'ф^еренцированних клеток гранулезы в условиях длительного культивирования. Кроме того, 5СГ блокировал Э£Р - стимулированный рост клеток.

Показано, что в клетках гранулезы мытаеК по мере культивирования увеличивается секреция прогестерона и снижается секреция эстрадиола. ДЗ цАМЗ индуцирует стероидную диф^грэнцировку этих клеток.

Разработка клеточных моделеЧ для изучения действия гормонов и факторов роста на половые я соматические клетки фолликулов личникоэ

статистическая обработка материалов исследован;»,?! и интерпретация полученных данных проведены автором самостоятельно. Радновдмуноло-гичаские исследования проведены с методической помодьв сотрудников отдела ондокринолсгии НИЛАГ АНН СССР.

Научная значимость работы евчзанп с результатами анализа действия гормонов ч факторов роста на клеточном уровне. Разработан!! клеточное модели, позволяющие исследовать действие гормонов 'и факторов роста на половые и соматические клетки фолликулов яичников в культуре.

Выявлены особенности реакции половых клеток на введение в среда кулътнвиролглия гормоноп и факторов роста. На основании полученных данных высказано предположение о некоторых молекулярных механизмах действия ЛГ при стимуляции созревания ооцитов млекопитающих.

Проанализирован характер стерондогенеза яичникоо в культуре в период ренницняцч,-! мгЧоза под действием гормэнои и Э1Р. Показана способность факторов роста стимулировать клонообразование культивируемых клеток гранулезы мдае.1. Исследованы особенности диффяренцировки клеток гранулезы в культуре. Полученные данные открывают перспективы для дальчеЛсего выяснения роли факторов роста в процессах фоляикуло-и гаметогенеза млекопитающих.

Практическая значимость исследования заключается в том, что полу ченные данные позволяют детализировать представление о существовании в фолликулах млекопитающих ауто- и паракринкых регуляторов процесса созревания ооцитов, пролиферации клеток гранулезы и стерондогенеза. Уточнение и конкретизация роли факторов роста на отдельных отапдх фолликулогенеза могут явиться основой для оптимизации методов стиму-^ ляции фолликулогенеэа и клинике, выработкя представления о возможной роли этих регуляторов в патологии репродуктивной функции и т.д.

На защиту выносятся следующие основные положения:

1. Культура комплексов ооцит - клетки кумулгаса, меЯотический процесс в которых заблокирован введением в среду культивирования препаратов, повшащих уровень цАМ£ в клетках, является удобной клеточной моделью для изучения действия гормонов и факторов роста на молекулярно-клеточном уровне.

2. Использование предложенной модели позволяет показать, что SiP является индуктором процесса реинициации меНэза при действии на комплексы ооцит-клетки кумулюса.

3. Культура фолликулов яичников мышеЯ, выделенных на ранних стадиях посла введения гонадотропинов животным, является адекватной экспериментальной системой для изучения действия полипептидных факторов роста на половые клетки млекопитающих.

4. 3iP иццуцирует созревание ооцитов в культуре фолликулов.

5. В культуре яичников неполовозрелых мышей в период индукции созревания ооцитов при действии ЗДР или ХГ происходит изменение соотношения секретируемых стероидных гормонов в сторону значительного увеличения содержания тестостерона и прогестерона.

6. Культура клеток преактрольной и кумулюсной гранулезы фояли-гкулов яичников реагирует образованием клонов на введение в среду

культивирования, полипептидных факторов роста. Гонадотропины инги-бируют этот процесс, ФСГ блокирует Э5Р - стимулированный рост клеток»

7. При длительном культивировании наблюдается процесс спонтанной и индуцированной дифференцировки клеток гранулезы, сопровождающийся усилением секреции прогестерона и снижением секреции острадиола.

Апробация и внедрение результатов работы в практику. Материалы диссертации доложены и обсуждены; на УН Всесоюзном совещании эмбриологов (Ленинград, 1986); на научной конференции "Гистогенез и регенерация" (Ленинград,1986); на Всесоюзном совещании "Биология клетки в культуре"(Ленинград,1907); на' III Всесоюзном съезде эццокринологов"(Ташквнт,1989); на научной конференции "Реактивность и регенерация"(Лзкикград,1990); на III Всесоюзной конференции по генетике и цитологии мейоза (Новосибирск,1990); на XIX научной сессии "Актуальные вопросы физиологии и патологии репродуктивной функции женщины"(Ленинград,1990).

Результаты работы используются в учебном процессе кафедры эмбриологии ЛГУ, кафедры медицинской генетики Ленинградского ГИДУВА им.С.М.Кирова, кафедры гистологии и эмбриологии Ленинградского педиатрического медицинского института. .•

Пй материалам работы подано б рационализаторских предложений.

Основные положения диссертационной работы отражены в 12 публикациях.

. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературных данных, описания материалов и использованных методой исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 137 страницах машинописи, иллюстрирован I таблиц»!! и 31 рисунком.. Список литературы содержит 150 источников.

СОДЕШШЕ РАБОТЫ Материалы и ¡летоды

В работе использованы неполовозрелые мыши - гибриды СВА/С57 Blnok Животных содержали в стандартных условиях вивария при дозированном освещении( свет с 8 до 20 ч). Для стййуляции фолли-кулогенеза производили инъекцию 5 MS препарата "Фоллигон" фирмы . "Invert" или "Эквинекс"-фирмы "Ayerst".

Для получения органной культуры фолликулоь яичники выделяли в стерильных условиях в чашках Петри в калли среды да®, забуфе-ренной hepes (рН-7,2). Под бинокуляром тонкими- вольфрамовыми

иглами выделяли фолликулы на миллипоровые фильтры фирмы l'Miilipore". Культивирование проводилось на границе раздела среда-воздух на металлических платформах в чашках Петри.

Культуру изолированных ооцитов получали при пунктировании крупных антралькых фолликулов. Полученные комплексы ооцит - клетки куму-лиса последовательно про!лгеали п нескольких каплях питательной сред!* . содержащей или не содержащей различные концентрации исследуемых веществ. Культивирование проводилось в 24-луночных платах фирмы "Flow Lab." ■ в COg- инкубаторе. Для культивирования ооцитов использ зовали среду без сыворотки, состоящую из комбинации сред ДШ1 я F-Io (I:I)(pH-7,2) с добавлением бычьего сывороточного, альбу-

мина (Змг/мд).

После культивирования комплексы ооцит- клетки кумуяюса переносили в теплый (37°С) гипотонический раствор 0,9$ цитрата натрия на 10 мин. Затем ооциты очищали от клеток кумуяюса механически или с помощью гиалуронидазы и переносили на предметное стекло. На подсыхающие ооциты наносили 2 3 капли холодного фиксатора, состоящего из смеси метанол - уксусная кислота в соотношении 3:1 (Tarkowgky, 1966). Препараты окрашивали красителем Гимза и определяли етадию

мейоза по критериям, предложенным Donahue (1968). Вьщеляли ,

следующие основные стадии: диплотена, стадия конденсации хромосом, ыетафаза 1, анафаза, телофаза, метафаза II,

В опытах по анализу динамики созревания ооцитов в культуре с целью синхронизации начала реинициации меПоэа выделение ооцитов из ' фолликулов производили в среду, содержанию ингибиторы спонтанного созревания: дб цАМЗ и теофиллин :, В дальнейшем клетки переносили в I мл среды без ингибиторов и культивировали в С02 инкубаторе. Ооциты фиксировали с интервалом 1 ч (с "О" по 19 ч).На каждый временной интервал проанализировано от 76 до 164 клеток.

Для анализа особенностей стероидогенеэа яичники вьщеляли и помещали в 1,5 мл среды,' содержащей гормоны и ЭОР. Культивирование осуществляли в течение 4 часов в COg- инкубаторе в плато (фирмы "Flew ЬаЪ." .

Клетки гранулезы получали из яичников мышей в возрасте 20-25 сут. Яичники.в стерильных условиях вьщеляли в капли питательной среды, в которую была добавлена фатальная сыворотка (10 %). Томкой вольфрамовой иглой прокалывали большие антральные фолликулы, в результате чего в среду вцделялись ооциты, окруженные клетками куму-люса, и небольшое количество фолликулярной жидкости, содержащей,по-видимому, клетки преантральной гранулезы. Таким способом из одного яичника удавалось получить около 100000 клеток гранулезы. Эти клетки переносили во флакон с указанной питательной средой, определяли концентрацию клеток в камере Горяева и добавляли во флакон питательную среду так, чтобы в 1,5 мл суспензии содержалось 1000 клеток. Суспензию клеток помещали в чашки Патри фирмы "^а1сог1" диаметром 3 см, последние помещали в C0j>- инкубатор. Через 18-20 ч после посева клеток, когда заканчивалось их прикрепление к поверхности плести- . ковых чашек, среду заменяли комбинацией сред ДОМ и р_ю с различным содержанием сыворотки (0} 0,1; I и 10%), а также вводили в среду гонадотропины, факторы роста и их комбинации в различных концентрациях. Гормоны и факторы роста в дальнейшем вводили в среду каждые 48 ч. На 14-е сутки роста культуры клетки фиксировали непосредственно в чашках 96%-кш этанолом и окрашивали в течение 10 мин красителем Гимза, промывали водой, высушивали и просчитывали число видимых клонов.

В Ъпдаах по изучению характера роста и стероидогенеэа в культурах с высокой плотностью посева производили смену среди канадце 2-3 дня. Клетки "снимали", с поверхности чашек смесью трипсина и. версена и просчитывали число клеток в камере Горяева,

Концентрации прогестерона, эстрздиола и тестостерона в среде . культивирования определяли радиоиммунологическим методом с использованием соответствующих антисывороток, предоставленных ВОЗ, и меченых трутнем стероидов производства фирмы "Amersham" (Англия).-с удельной активностью >0 ^i/ил. Рабочий титр антисывороток составляя 1:210 ООО. Для определения концентрации стероидов использовали 100 мкл среды. Стероиды экстрагировали 2 мл эфира в течение I мин. Посла разделения водно1? и органических фаз яфир выпаривали и стероиды растворяли в 500 мкл фосфатного буфера рН 7,4, добавляли меченый гормон и соответствующую антисыворотку. После инкубации в течение 18-24 час при 4°С свободный и связанны! антисывороткой стероид разделяли добавлением суспензии активированного угля, покрытого декст-раном. Радиоактивность связанного стероида определяли Ла жидкостном сцинтилляцнонном счетчике Rack I2i6(lkb Wallac, .Финляндия). Концентрацию стероидов определяли по калибровочным криЕым.

Опыты воспроизведены не менее 3 раз. Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием критерия Стьюдента (Уро'ах В.Ю.,19631.

Результаты и обсуждение I.Хронология спонтанного созревания

Ооциты-неполовозрелых мышей, развитие фолликулов у которых было синхронизировано введением экзогенных гонадотропинов сроком на 40-42 ч, находятся на стадии диплотены. Выделенные из фолликулов ооциты спонтанно возобновляют мейоз в культуре. Для изучения хронологии созревания ооцитов мышей были поставлены эксперименты по их культивированию в течение фиксированных интервалов времени: от I по 19 ч с последующим анализом распределения ооцитов по стадиям созревания. Полученные данные приведены ,. на рис.I.

За 18-19 ч 76,3-77,8$ клеток достигамт стадию метафаза II деления созревания, к этому времени на стадии метафаза 1 остается 18,5-21,8$ клеток. Стадия конденсации хромосом наблюдается с I по 4 ч культивирования. С 4 по 10 ч в культуре преобладают клетки, находя-, щиеся на стадии диакинез- метафаза I. Первые анафазы регистрируются к 8 ч культивирования. Максимальное их количество (10^1 наблюдается с 10 по II ч созревания в культуре. Ооциты на стадии телофазы появляются к 8 ч культивирования, а наибольшее их количество встречается" с II по 12 ч. Первые клетки на стадии метафазы П появляются через 9 ч созревания в культуре. Через 13-14 ч большая часть клеток уже

- ю-

Калмжгао хлетол

Рис. I. Распределение ооцитов по стадиям мейоза в различные сроки после начала культивирования. I - диплотена, 2 - стадия конденсации хромосом, 3 - метафаза 1,4- анафаза, п 5 - теяофаза, б - метафаза II.

находится на лтой стадии. Приведенные данные позволяют сделать вывод о том, что общая продолжительность созревания в использованной модельной системе соответствует продолжительности этого процесса в организме мышей.

II. Действие ингибиторов спонтанного созревания на ооциты.

Для анализа действия .стимуляторов созревания - гормонов и факторов роста - непосредственно на ооциты, окруженные клетками кумулюса, нами была разработана.модельная система, позволяющая продолжительное время обратимо ингибировать реинициацию мейоза в изолированных, клетках

С целью синхронизации фолликудогенеза мышам вводили препараты "Эквинекс" или "Фоллигон" сроком на 40-42 ч. Полученные ооциты выделяли и культивировали в течение 16-18 ч в среде, содержащей дб цАМФ в дозе^ 0,05; 0,1; 0,25 и 0,5 мМ. В дальнейшем анализировали действие этого ингибитора на процесс реииициации мейоза и на" процесс созревания ооцитов по появлению стадии метафазы II деления созревания в культуре. Дб цАМ1 в дозе 0,6 Ш эффективно ингибируе.т как реинициацию

А дш мд

Рис.2. Распределен!«;! ооцэтов по сттдяям !«Яоза после спонтанного созревания: I - контроль, 2 э среде с тчофилятоюн (10 мкг/мл) и дб цШ. (0,05 ?•;.(), 5 - в среде с 2СГ (100 мкг/мл).

меЯоза, так л прохождение соэреьтаяя до стадии МП. В дозе 0,2.5 мМ созревание клеток до стадии мчтафазь: II не происходит, клетки блокируются ira стадии диакинез петафаза I (Д<1). В дозе 0,1 мМ процесс реиинцнацнм ме.Чоза наблюдается у клеток. Однако лишь 10% из них » согревают до стадии мета'-азп II, а остальш» блокируются на проие'яу--точт« стадиях. Таким образам, поел" культивирования ооцитов в течение 16-13 ч р' среде с дб ц.-Ш в дозе 0,5 кМ наблюдается наиболее элективно» ингибированмэ спонтанного созревания.

Кроме дб ц/С'2 в качестве ингибитора реинициации мейоза использо вали теофиллнн. ¡Слетки выделяли из фолликулов в среду, содержанию 200 мкг/мл теофилляна, и кулътнпгфовалч в течение IG -18 ч в среде с различными концентрациями препарата - 10, 40 и 200 мкг/мл. При концентрации препарата 200 мкг/мл созревания не происходило и большая часть клеток (0IÍ) находилась на стадии диакинез- метафаза I. 3 среде с концентрация;! препарата 40 мкг/мл 10* к.тегок созревали, до нетафаэч II, а больэад -часть клеток (7oí) находилась на стадии д-акинез ■ метафаза I. При уменьшении концентрации теофнллнна до 10 мкг/мл 64« ооцнтоп созревали до стадии метафазы II, 22Й клеток находилось'на стадии днакинеэ метафаза I. Доля клеток на стадии дип-

лотены при созревании в среде с теофиллином не отличалась от контроля. Таким образом, при созревании в срода с тоофилликом в диапозоне , концентраций от 10 до 200'мкг/мл происходило ингибирование созревания до стадии метафазы II. Однако заблокировать реинициацию мойоза этим препаратом не удалось.

В дальнейшем мы исслодовали совместное дейст.вио субоптимальных в отношении способности ингибировать созревание концентраций тео-филлина и дб цАдМ^. На рис.2 представлены данные о .расдределении ооцитов по стадиям мейоза после созревания в среде с субоптимальными концентрациями дб цАМ5, теофиллина и их комбинации, а .также без добавок. Анализ результатов позволяет сделать вывод о том, что • сочетание субопхшальных .концентраций этих препаратов эффективно блокирует реинициацига мейоза и созревание ооцито.е.

В последующем мы пытались снять блокцрудацее мейоэ днйетвив . комбинации теофиллина и дб цАМ£ введением в чреду культивирования ХГ, Оказалось, что введение ХГ в дозе 10 и 100 нг/мл не оказывало воздействия на ооциты, завлокированные на стадии дипдотекы.

При исследовании чувствительности ооциуов, спонтакнр созревающих в культуре, к воздействию ФСГ (100 нг/мл) было показано, что число клеток, реинициирующих мейоэ, не отличалось от контрольного значения, однако, созревание до метафазы II ыейотического делениям оа 16-18 ч практически не происходило. Основная часть клеток находилась на стадии диакинэз - метафаза1.(рис,2). Ачало^ичное действие этого гормона было выявлено в культуре'созревающих ооцитов коров ■(Мамлеев P.C.,1931).

III. Влияние гормонов и факторов роста на протекание мейоза в культуре ооцитов мышей.

Поскольку, согласно данный литературы не только прогестерон, но и инсулин индуцирует созревание ооцитЬв амфибий, отправной точкой для данного раздела работы явилась попытка проанализировать действие факторов роста и инсулина на ооциты млекопитающих в культуре. Первоначально была отработана модельная система, позволяющая исследовать-действие различных веществ на фолликул - культура фолликулов яичников мышей.

При выделении фолликулов в культуру через 40-42 ч поеле введения животным гонадотропинов и последующем культивировании в течение 18-20*ч''в среде без дойаро;« лишь небольшая часть клеток (до 3%) возобновляла мейоэ, а созревание практически не наблюдалось. При увеличении продолжительности действия гормонов до 44-46 ч способ-

ность клеток спонтанно возобновлять меЯоз возрастала, и к 48-50 ч на диплотене оставалось всего 17-22% ооцитов. Таким образом, индукция созревания ооцитов умъией при нашей схеме стимуляции фоллику-логенеза происходит примерно через 48 ч после введения гонадотропи-нов. С целью получения синхронизированных на стадии диплотены ооцитов мы в дальнейшей работе использовали введение гонадотропинов за 40-42 ч до забоя животных.

Полученные таким способом ооциты обладали высокой чувствительностью к индуцирующему мейоу действию ЛГ. Так, введение в среду культивирования фолликулов ХГ в дозе 0,1 мкг/мл приводило к последующему созреванию до стадии метафазн II больше! части клеток (62±13,ь) через 18-20 ч. После культивирования ооцитов в фолликулах при введении в среду Э2Р в дозе I и 10 нг/мп такие наблюдалось созревание "ооцитов до стадии мета/фаза 11.

Стимулирующее мейоэ1 действие низких доз Э2Р (0,1 яг/мл) удается наблюдать лишь в среде без сыворотки. В среде с 10% сыворотки низкие дозы ЭХР оказывается малоэффективными. Применение комбинации препаратов Э1>Р и ХГ существенно не увеличивало числа созревающих клеток.

&Р2 во всем диапозоне примененных доз (0,1; I и 10 нг/мл) не вызывал реинициацига ме.Чоза в половых клетках.

Для изучения индуцирующего чейоз действия Э2Р мы использовали культуру' изолированных ооцитов, спонтанное созревание которых заблокировано введением в среду 0,25 дб цАМ5. Введение в среду с дб цАМ£ 10 нг/мл Э5Р индуцирует созревание половых клеток до стадии метафазы II.

Полученные результаты показывают, что Э£Р способен индуцировать возобновление мяЗоза в ооцитах, культивируем« в фолликулах, а также вызывать индукцию созреван/я изолированных ооцитов, мейоэ в которых заблокирован на стадии диплотены при введении в среду культивирования дб цАМЗ. Характер созревания клеток в фолликулах при действии Э^Р не отличается от созревания клеток, стимулированных ЛГ. Высокая чувствительность ооцитов к действию ХГ ч ЭЗР в наших опытах связана, по-видимому, с тем, что мы применили среду, не содержащую сыворотки, а также использовали для получения фолликулов ранние стадии фоллику-логенеза. Обычно же используемую схему стимуляции фолликулогенеза при введении животным сывороточных гонадотропинов за 48 ч до забора материала надо применять с осторожностью при изучении молекулярно-клеточных факторов, регулирующих индукция созревания, так как возобновление мейоза в фолликулах при этом наблюдается уже и без

Рис.3. Эндокринные и парикринние систем регуляции мотивирования и реинициации ие'Лоэа ооцитов млекопитаыцих (ад. - аденозин, гк. - гппоксантин, МИФ - мяйоэинду-цируюднй фактор).

введения в среду дополнительных стимуляторов.

Чувствительность клеток к воздействию ОСР была визе в среде без сыворотки. Ото, видимо, связано с тем, что в сыворотке могут содержаться факторы, кнгийнруюцие действие ЭйР на половые клетки. Одним из таких факторов может являться так как показано,

что а присутствии этого фактора мейодиццуцирующее деЯствио Э5Р ■ менее выражено ,( Тепе ег а1 ,1588). Другим возможным объясне-

нием является то, чго наличие гонадотропинов в сыворотке можвт уменьшать количество рецепторов к ЭЬР, как ого наблюдается в культу ре клеток гранулезы.

Итак, 34Р способен в малых концентрациях индуцировать стимуляцию мейоза в половых клетках при действии через фолликул, а также вызывать созревание изолированных ооцятов, заблокированных дб цАМФ. Эти с^Зства фактора роста могут иметь практическое значение, так как в настоящее время для анализа активности ЭФР в процессе его выделения и последующего использования фирмой "Сигма" (США) гтрименя ется культура первичных фибробластов человека. Использование культуры

половых клеток как модельной системы для определения активности фактора роста значительно ускоряет и упрощает лроцасс тестирования активности Э£Р.

В настоящее время наиболее убедительные) доказательства в возможном паракриннои' контроле созревания ооцитов получены для гонадо-троиин-рилчзинг гормона и гонэдокрннинов, Созревание, пинцированное этими препаратами, позволяет получить яйцеклетки, способные в последующем к оплодотворению и эмбриональному развитию.

Полученные нами результаты, а также дан.-ше литературу позволяют сделать предположение, что Э1Р может явиться одним из паракринг-ых стимуляторов созревания половых клеток, спосрадущих действие ЛГ на ооциты. Ото согласуется с наличием специфических рецепторов на клетках гранулезы, а такэд с доказательством синтеза Э*Р и 01Р-подоб гак белков соматическими клетками фолликулов п куяьтурз.

Данные литературы и результаты собственных исследования по обсуждаемому вопросу суммированы нами в виде схемы, представленной на рис.3. ¡Ьехдяеся в настоящее время экспериментальны"? данные позволяет сформулировать предположение о том, что р^нчнц^ацня мейоза у млекопитающих - плейотропно -регулируемый процесс. Стимуляция созревания ооцитов в фолликула метет являться результатом действия нескольких факторов, существующих в фолликулярной жидкости яреову-ллторного фолликула, активация которых пооле преопуляторного пика ЛГ осуществляется протеазами, секретируемыми фолликулярными клетками.1

и .Особенности стероидогонеза яичников микей в культуре при действии гормонов и факторов роста.

Как изкес'гно, наиболее важную роль в функцношфэпанпн янчнн.;1 и его взаимосвязях с центральными регулирующими механизмами нграпг стероидные гормо!Ш. Поэтому представляло интерес проанализировать характер изменения- стероидегунеза в яичниках мшгей при действии гормонов и Си<Р.

морфологические признаки индукции созревания при действии ХГ и Э*Р к 5 часу после начала индуцирующих воздействий в культуре фолликулов у:гз хорошо пграхены, поэтому был исследован характер изменения стероидогенеэа яичников в культуре при г-оздействии гормонов и Э1Р в течение 4 часов. На рис.4 представлены данные о характере секреции прогестерона яичниками мшей в процессе культивирования. Из анализа их видно, что секреция прогестерона увеличивается при , введении в среду гонадотропинов 5СГ и ХГ Н соотватСвенно 38,0-9,8

л

п-г 1 I 1 1 1 1 1 1

ЭФР <рсг ХГ

Рис.4 Гистограмма интенсивности секреции прогестерона культивируемыми яичниками мышей при различных

воздействиях

Ло оси абсцисс - характер воздействия.

По оси ординат - концентрация прогестерона (мМ)

и 56,7-12,4 нМ при значении контроля 7,6-3,4 нМ). Инсулин и Э1Р при совместном действии повышали секрецию этого стероида (26,4-5,9 аЧ). Введение в среду Э4Р и инсулина усиливало также и 5СГ-стимулиро-ванный синтез прогестерона. При птои максимальная стимуляция наблюда-: лась при совместном действии 2СГ, ХГ и ЭЗР (96 М), йСГ.ХГ.ЭДО и инсулина (86 нМ), а также инсулина и ФСГ (67 нМ).

Известно, что лвтеикизация фолликулов после эндогенного "выброса" гонадотропинов в организме сопровождается изменением соотношения основных типов стероидных гормонов в фолликулярной жидкости, поэтому.целесообразно'было проанализировать,каким образом соответствующие показатели изменяются и в калии условиях. Окггзалось, что значение Р/Е2 (прогестерон/эсградиол') при введении в среду"ХГ'. в 9 раз, а Э^Р - в 8 раз прершпло контрольное значение. Совместное действие Э1Р'и ХГ было аддитивным. При введении в среду, содержащую Э№, инсулина или ФСГ наблюдалось судзственное уменьшение величины Р/^. Аналогичное действия инсулин и ФСГ оказывали нд этот параметр и в присутствии ХГ. Величина Т/^ (тестостерон/:>страдиол) при действии Э5Р в 3-4 раза превышала контрольное значение. Введе -ние в среду ХГ-также приводило к увеличению этого параметра, а совместное действие Э5Р я ХГ являлось адцигивным. Таким образом, величины Т/Е2 и Р/Е2 сходным образом изменялись при действии Э2Р и ХГ, что проявлялось в среде при отсутствии инсулина н 4СГ.

Данные об увеличении секреции прогестерона яичниками в культуре под влияние« 2СГ и ХГ, а также усилении этого воздействия при введении в среду инсулина и Э5Р согласуются с результатами работ, выполненных на монослойных культурах гранулезы.Объяснить наблюдаемое уменьшение секреции эстрадиола в органной культуре яичников при действии Э^Р можно в свете данных литературы об ингибируюцем действии этого фактора роста на активность ферментов ароматизации в культура клеток гранулезы. Содержание стероидных гормонов в фолликулярной жидкости после преовуляторного выброса ЛГ изменяется так, что соотношение эстрадиол/прогестерон уменьшается в 10 раз. Сходное действие ХГ наблюдалось д в наших экспериментах.Таким образом, основные закономерности изменения характера стероидогенеза в организме в период "выброса" ЛГ и в культуре яичников после введения отого гормона в среду сходны.

Полученные намн данные позволяют сделать вывод о том, что в период индукции созревания при действии ХГ и ЭФР наблюдается изменение характера стероидогенеза. Под влиянием Э5Р происходит изменение соотношения основных типов стероидных гормонов в сторону значительного увеличения содержания тестостерона и прогестерона, аналогично тому, как ото происходит и при действии ХГ.

У. Влияние гормонов и факторов роста на пролифврациб культивируемнх клеток гранулезы мышей.

Для разработки клеточной модели, позволяющей исследовать действие факторов роста и гормонов в регуляции пролиферации клеток гранулезы, нами были использованы данные ЕПокзоп et а1 (1985) о том, что клетки преантральной и кумулюсной гранулезы являются стволовыми клетками фолликулов. В тоже время информации об особенностях пролиферации этих клеток в культуре в настоящее время еще нет.

На рис.5 представлены данные о характере образования клонов клетками преантральной и кумулюсной гранулезы мышей в среде с различ ним содержанием сыворотки при введении Э*Р и ФСГ. В среде с низким содержанием сыворотки Э*Р является митогеном для клеток гранулезы мышей. В среде с высоким содержанием сыворотки действие физиологических концентраций Э.'^Р (I и 10 нг/мл) не проявляется.

В последующей серии экспериментов исследовали действие ФРФ на пролиферацию культивируемых клеток гранулезы. Влияние этого фактора роста на эффективность клонообразования определялось его концентра-

Рис.5. Влияние Э1Р на Эффективность образования клонов клетками гранулезы мышей в среде с различим содержаниям сыворотки: I - контроль; 2,3 - 0ÍP в концентрации 1 и 10 нг/мл соответственно; 4 - КГ,

I мкг/мл и 3ÍP, 10 нг/мл Вертикальные отрезки - 95,m.ie доверительные иктерчялн средни с значений

цией в среде культивирования и содержанием сыворотки. ÍP5 в дозе менее 10 нг/мл не.стимулировал рост клеток. Максимальный эффект наблюдался при концентрации сыворотки 0,1; 0,5 и Ií и дозе ФР1 30 нг/мл. В среде с высоким содержанием сыворотки (10,í) действие flíPi не проявлялось. Таким образом, ФР5 в среде с низким содержанием сыворотки является эффективным рост стимулирующим фактором для культивируемых клеток гранулезы мышей.

Было исследовано также действие инсулина на эффективность кло нообразосання клетками гранулезы мъпей. Инсулин в дозе 0,1 и I ыкг/ мл увеличив« клонообразование в среде с различным содержанием сыворотки.

Препарат "Эквинекс", ХГ и КГ были использованы для изучения действия гонадотропинов на пролиферацию культивируемых клеток гра-нулезы мышеЛ. "Эквинекс" во всем диапозоне исследованных доз (0,1-10 мкг/мл) уменьшал эффективность клонообразования клеток. При втом наблюдалось и уменьшение размеров клонов по сравнению с контролем. Большие клоны (более 100 клегок' не появлялись в среде с "Эквинексом". Введение в среду культивирования ХГ в дозе 0,01; 0,1 и I мкг/мл также приводило к уменьшению эффективности клонообразования клетками гранулезы. Аналогичное действие оказывал и ЮГ в дозе I мкг/мл. Таким образом, в культуре клеток преантральной и кумулюсной гранулезы шшей "Эквинекс", КГ и ХГ пнгибируют кло нообразовачне.

Следует отметить, что в присутствии ФСГ ЭФР не стимулировал пролиферацию клеток гранулезы в культуре . Введение в среду культивирования ФСГ устраняло стимуляцию роста клеток под влиянием ФРФ. Таким образом, гонадотропины ингибировали клонообразование клеток гранулезы, а также стимуляцию роста клеток при действии ЭФР и ФРФ. Это объясняется, вероятно, способностью гормонов стимулировать стерог идную дифференцировку клеток, что приводит к потере чувствительности к пролиферативному действию факторов роста. Недавно показано, что гонадотропины обладают способностью ингибировать образование рецепторов к ЭФР на клетках гранулезы

Полученные в настоящей работе данные согласуются с результатами работ, в . которых показано, что действие факторов роста существенно зависит от содержания сыворотки в среде, Так, рТФР в среде с высоким, содержанием сыворотки ингибирует ЭФР - стимулированный рост клеток, а в среде с 0,1 и 0,25% сыворотки стимулирует действие ЭФР в культуре клеток гранулезы свиней ( МаУ а1 ,1988). Клетки гранулезы сви>

ней и человека в среде с 103» сыворотки также теряют способность к стимуляции роста при действии ЭФР, что связывают с потерей чувствите* льности рецепторов . к ЭФР при наличии большой концентрации стимулятора в среде

У1. Особенности стероидогенеза культивируемых клеток гранулезы мышей

В процесса фолликулогенеза под действием гонадотропинов в клетках гранулезы происходит индукция синтеза стероидных гормонов. В настоящей работе исследованы особенности стероидогенеза в субпопуляции клеток преантральной и /кумулюсной гранулезы мышей при длительном их культивировании, а также действие дб цАМФ на этот процесс.

Клетки гранулезы имеют низкий базальный уровень секреции прогес терона как в среде, не содержащей сыворотку, так и в среде с 10% сыворотки. К 12 дню культивирования наблюдается относительной увеличение секреции прогестерона. Интенсивность секреции этого стероида была выше в среде с 1($ сыворотки, что можно объяснить наличием в сыворотке стимулирующих факторов ( например, ИПФР и ГТ), а также дополнительных субстратов для синтеза прогестерона. Повышение сек— реции прогестерона по мере культивирования при отсутствии в среде индукторов , судя по литературным данным, можно объяснить способностью клеток к синтезу паракринных факторов, в частности, ИПФР, усиливающих стероидогенез клеток-

В последующем исследовали действие стимулятора синтеза стерои-

ш

р

к 1Я М U и I

* 10В «Я BI Ы М '

Рис. б. Гистограммы интенсивности секреции прогестерона культивируемыми клетками гранулеэы в среде-без сыворотки с --------------------------------- ' '" ■ А - на 3-ий день

различными концентрациями дб культивирования, Б - на 6 день культивир! оси абсцисс-концентрация до цАМЗ (kM), Iii нг/прогестерона/10* клеток

ования. По о оси ординат

дов дб цДМ5 в среде без сыворотки. На 3 день культивирования наблюдается увеличение синтеза прогестерона при воздействии дб цАМФ в дозе от 0,05 до I мМ (рис.6). Максимальная секреция стероида происходила при концентрации препарата 0,5 и I мМ. К'5 дню культиви • . рования максимальный стимулирующий эффект наблюдался при дозе 002 мМ. При концентрации дб цАМ5 0,5 и I М также наблюдалось некоторое повышение секреции прогестерона, однако, не столь существенное как на 3 день культивирования. Индукция секреции прогестерона при действии дб цАМ1 является обратимой. При росте клеток в среде с этим препаратом в течение 5 дней и при последующем росте в среде без стимулятора наблюдалось понижение сшсреции прогестерона до базаль-ного уровня. Таким образом, при культивировании в среде без сывороткл клетки обладают чувствительностью к стимулирующему синтез прогестерона действию- дб цАМ®,

Секреция эстрадиола в среде без:, сыворотки подчинялась иным закономерностям. По мере культивирования наблюдалось понижение секреции эстрадиола. Введение в среду культивирования дб цА1>5$ в дозе 0,025; 0,05:; 0,1 и 0,2 мМ ингибировало секрецию эстрадиола культивируемыми клетками. При концентрации препарата 0,5 я I мМ наблюдалось полное подавление секреции острадиола ужо на . 3 день. Таким образом, на фоне лютеинизации клеток грлнулезы, сопровождающейся увеличением секреции прогестерона, происходило

подавление секреции эсградиола, что может быть связано с отсутствием ЯСГ в среде культивирования. Введение ФСГ в Среду является необходимым условием поддержания активности ферментов ароматизации (Knecht »1 .,1983). Уменьшение секреции эстрадном можно объяснить и отсутствием в среде субстрата для.синтеза эстрогенов - андрогенов. В организме андрогены синтезируются клетками теки и затем попадают в клэткк гранулезы, где происходит их ароматизация в эстрогены. Skinner Osteen (1933) пришли к заключению о том, что

"когда активность ароматаэ в клетке велика и стимулируется гормонами, уровень синтеза прогестерона незначителен и ингибируется теми. же регулятортд/и воздействиями. Напротив, если уровень синтеза прогестерона значителен и является гормоночувствительным, то активность ароматаэ достаточно низка". Вывод авторов цитируемой работы о том, что в процессе культивирования происходит изменение дифференцировки клеток от эстроген- к прогестерон - секретирущим аналогичен получен ным нами результатам'.

Таким образом, на^и разработан метод получения субпопуляции клеток гранулезы фолликулов яичников милей, обладающих способностью к спонтанной и индуцированной лютеинизации в культуре. .Данная клеточная система может быть использована как удобная экспериментальная модель для изучения регуляции дифференцировки фолликулярных клеток яичников млекопитающих.

ВЫВОДЫ

1. При культивировании в среде без сыворотки хронология созревания ооцитов мышей,- выделенных на ранних сроках после введения гонадотропинов животным, соответствует временным параметрам созревания в организме.

2. Препараты, повышающие уровень цАМ2 - дб цАМЗ, теофиллин, 5СГ, индуцируют созревание ооцитов мкшей в кульууре.

3. Э2Р индуцирует созревание комплексов ооцит - клетки куму-люеа, реинициация мейоза у которых заблокирована дб цАМ5.

4. В культуре фолликулов яичников, ввделенных на ранних стадиях после введения гонадотропинов мышам, Э«Р как и ХГ стимулирует созревание ооцитов до стадии метафазы II.

5. В период индукции созревания ооцитов при действии ХГ или ЭФР происходит изменение соотношения секретируемых стероидных гормонов в сторону значительного увеличения содержания тестостерона и , прогестерона.

6. Полипептидные факторы роста и инсулин повышают эффективность

обраэования клонов клетками преантральной и кумулюсной гранулезы мышей. Гонадотропины в-условиях длительного культивирования ингиби-руют рост клеток гранулезы. ФСГ блокирует ЭФР - стимулированный рост клеток.

7. По мере культивирования гранулезы спонтанная и индуцированная дифференцировка клеток сопровождается усилением секреции прогестерона и снижением секреции эстрадиола.

Рационализаторские предложения:

1. Воробьева O.A. Пипетка для работы с культурой ооцитоа.// Рационализаторское предложение № 482/5 от 13.04.90.г.

2. Воробьева O.A. Тест-система для определения активности эпидермальнояо фактора роста.//Рационализаторское предложение № 45Ü/0 от 13.04.90 г.

3. Воробьева O.A. Способ оценки рост-стимулирующих свойств сыворотки.// Рационализаторское предложение № 484/7 от 1.11.60г.

4. Воробьева O.A. Метод оценки активности эпидермального фактора роста.//Рационализаторское предложение•№ 4Э0/3 от IЛ1.90 г.

5. Воробьева O.A., Куриленко Т.А..Никитин А.И. Способ получения культуры клеток гранулезы, реагирующих на действие эпидермального фактора роста.//Рационализаторское предложение № 479/2 от I.II. 90 г»

Список $абот, опубликованных по теме диссертации:

1. Воробьева O.A. Исследование регуляции ыейотического процесса в ооцитах млекопитающих в культуре.//Закономерности индивидуального развития живых организмов.~М. -.Наука,-1986.-С.69.

2. Воробьева O.A.,Свечникова Ф.А. Влияние гормонов и эпидермального фактора роста на созревание ооцитов в культуре.//Цитология.-1987.-Т.29.-С.1077,

3. Никитин А.И..Воробьева O.A. Факторы регуляции дифференци-ровки соматических клеток фолликулов яичников млекопитающих.// Цитология.-1987.-Т.30.-С.II55-II7I.

4. Воробьева O.A. Факторы роста - новые регуляторы репродукции.// Цитология.-1989.-Т.31.-С.II39-II57.

5. Воробьева O.A. Регуляция ингибирования и реинициации мейоза ооцитов млекопитающих.//Цитология.-1990.-Т.32.-С.422-441.

6. Воробьева O.A., Никитин А.И. Влияние гормоноз и факторов роста на протекание мейоза в ооцитах мышей в культуре.//Цитология.-1991.-Т.33.-С,42-49.

7. Никитин А.И., Воробьева O.A. Паракринныв регуляторы фоллику-ло- и гаметогенеза.//В книге¡Реактивность и регенерация структур' разных уровней организации.-Л.:1990.-С.46.

8. Никитин А.И., Китаев Э.М.,Воробьева O.A. Механизмы гормональной регуляции гаметогенеза в норме и при нарушениях репродуктивной функции женщины.// III Всесоюзный съезд эндокринологов.-Ташкент.-.I969.-C.74.

9. Воробьева O.A., Свечникова i.A., Никитин А.И.,Потин В.В. Стероидогенез яичников в культуре при действии гормонов и эпидер-1 мального фактора роста.// Архив анат. гистол. эмбриолог.-1990.~

Т. МО.-С.78-82.•

10. Воробьева O.A. Влияние гормонов и факторов роста на пролиферацию культивируемых клеток гранулезы мышей.// Цитология.-1990.-Т.32.-С.840-846.

11. Воробьева O.A. К вопросу о молекулярных механизмах стимуляции созревания ооцитов.// В книге'.Актуальные вопросы физиологии к патологии репродуктивной функции женщины.-Тезисы докладов XIX научной сессии.-Л.

12. Воробьева O.A. Цитологические механизмы регуляции ингибиро-вания и реинициации мейоза ооцитов млекопитающих.//Известия сибирского отделения АН СССР. Серия Биологические неуки. Новосибирск.-1990тВып.2.-с.36.