Влияние фосфорилирования на структуру и шапероноподобную активность малого белка теплового шока человека Hsp22

Шеметов, Антон Александрович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Влияние фосфорилирования на структуру и шапероноподобную активность малого белка теплового шока человека Hsp22
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние фосфорилирования на структуру и шапероноподобную активность малого белка теплового шока человека Hsp22"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ имени М.В. ЛОМОНОСОВА

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

Шеметов Антон Александрович

ВЛИЯНИЕ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ НА СТРУКТУРУ И ШАПЕРОНОПОДОБНУЮ АКТИВНОСТЬ МАЛОГО БЕЖА ТЕПЛОВОГО ШОКА ЧЕЛОВЕКА Няр22

03.01.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2019

Москва 2010 г.

004614168

Работа выполнена на кафедре биохимии биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Научный руководитель: доктор биологических наук

профессор Н.Б. Гусев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

профессор Д.И. Левицкий

Ведущая организация:

кандидат биологических наук в.н.с. A.B. Воротников

Институт экспериментальной кардиологии Федерального государственного учреждения «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Защита диссертации состоится 6 декабря 2010 г. в 15 часов 30 минут на заседании диссертационного совета Д.501.001.71 при Московском Государственном Университете имени М.В. Ломоносова по адресу 119991, Москва, Ленинские горы, д.1, стр. 12, биологический факультет Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова, аудитория ББА.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета Московского Государственного Университета имени М.В. Ломоносова.

Автореферат разослан 28 октября 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

М.В. Медведева

РЕШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Малые белки теплового шока (small heat shock proteins, sHsp) - широко распространенная группа белков с молекулярной массой мономера от 12 до 43 кДа (8, 21). Отличительной чертой всех белков этого семейства является наличие в их структуре так называемого а-кристаллинового домена, состоящего из 80-90 аминокислотных остатков и получившего свое название от белка а-кристаллина, в составе которого он был впервые обнаружен. sHsp склонны к образованию крупных олигомерных комплексов, размер которых может достигать 600-700 кДа (16). Все члены семейства обладают так называемой шапероноподобиой активностью, т.е. способны связывать частично денатурированные белки, препятствуя их дальнейшей агрегации (8). Помимо этого малые белки теплового шока могут участвовать в регуляции протеолитической деградации денатурированных белков (7), тем самым защищая клетку от накопления агрегатов поврежденных белков. Кроме того, считается, что sHsp могут участвовать в регуляции сократительного аппарата и цитоскелета, клеточной подвижности, а также в защите клетки от окислительного стресса, регуляции процессов пролиферации и апоптоза (1). Функционирование малых белков теплового шока может регулироваться разными способами, в частности, путем фосфорилирования, катализируемого различными протеинкиназами. Фосфорилирование может влиять на олигомерное состояние sHsp (1), их взаимодействие с белками-партнерами (4) и шапероноподобную активность (8).

В настоящее время в геноме человека найдено 10 генов, кодирующих малые белки теплового шока, и свойства некоторых представителей этого семейства белков (аА- и аВ-кристаллины, Hsp27) достаточно подробно изучены. Сравнительно недавно описанный белок Hsp22 (HspB8, Н11 киназа, продукт гена E2IG1) на начальных этапах исследования относили к классу протеинкиназ (19), однако позднее было показано наличие в его структуре а-кристаллинового домена (2) и отсутствие протеинкиназной активности (12). Данные двумерного электрофореза свидетельствуют о том, что в клетках млекопитающих Hsp22, который является типичным представителем семейства малых белков теплового шока, может находиться в фосфорилированном состоянии (2). В условиях in vivo в разных тканях фосфорилированию могут подвергаться остатки Ser24 и Thr/Ser87 Hsp22 (3, 6).

Список сокращений: цАМФ - циклический аденозинмонофосфат; ГА - глутаровый альдегид; ДМС - диметилсуберимидат; ДСН - додецилсульфат натрия; ДТТ - дитиотрейтол; МЭ - Р-меркаптоэтанол; ПААГ - полиакриламидный гель; ПКА - цАМФ-зависимая протеинкиназа; ФМСФ - фенилметилсульфанилфторид; ЭДТА - этилендиаминтетраацетат; ERK1 (Extracellular signal-Regulated Kinase 1) - киназа, активируемая внеклеточными сигналами; TLCK - N-тозил-Ь-лизин гидрохлорид хлорметилкетона; wt - белок дикого типа.

Протсинкиназы, участвующие в фосфорилировании Hsp22, остаются не установленными, однако обнаружено, что несколько протеинкиназ (протеинкиназа С, казеинкиназа второго типа и ERK1 киназа) способны фосфорилировать Hsp22 в условиях in vitro (2). Кроме того, анализ первичной структуры Hsp22, проведенный с использованием программы NetPhos 2.0, свидетельствует о том, что в структуре этого белка есть остатки (Ser24 и Ser57), расположенные в последовательностях, узнаваемых и фосфорилируемых протеинкиназой А. Таким образом, к настоящему моменту накоплено большое количество экспериментальных и теоретических данных, свидетельствующих о том, что Hsp22 может подвергаться фосфорилированию. В то же время в литературе нет данных о том, каким образом фосфорилирование влияет на структуру и свойства этого белка.

Цель и задачи работы. Целью данной работы был анализ влияния фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на структуру и свойства Hsp22. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Изучить процесс фосфорилирования Hsp22 под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы и протеинкиназы ERK.1.

2. При помощи различных методов исследовать влияние фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование на вторичную, третичную и четвертичную структуру Hsp22.

3. Изучить влияние фосфорилирования на шапероноподобную активность Hsp22.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Обнаружено, что в условиях in vitro цАМФ-зависимая протеинкиназа может фосфорилировать Ser57, а протеинкиназа ERK1 способна фосфорилировать Ser24, Ser27 и Thr87 Hsp22. При этом по данным литературы остатки Ser24 и Thr87 могут быть фосфорилированы в условиях in vivo.

2. Фосфорилирование (или точечные мутации, имитирующие фосфорилирование) влияют на различные уровни структурной организации и стабилизируют димеры Hsp22 при низкой концентрации белка.

3. Фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) влияют на шапероноподобную активность Hsp22.

Научная новизна и практическая ценность работы. Проанализирован процесс фосфорилирования Hsp22 под действием двух протеинкиназ. Установлено, что цАМФ-зависимая протеинкиназа в условиях in vitro фосфорилирует Ser57 Hsp22. Протеинкиназа ERK1 в условиях in vitro фосфорилирует остатки Ser24, Ser27 и Thr87, при этом остатки Ser24 и Thr87 могут находиться в фосфорилированном состоянии в условиях in vivo. Данные

спектроскопии кругового дихроизма свидетельствуют о том, что значительная часть структуры Н$р22 неупорядочена, при этом разведение приводит к дальнейшему разупорядочиванию структуры белка. Этот эффект может быть связан с происходящей при разведении диссоциацией димеров Шр22. Используя методы гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования, установили, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) увеличивают вероятность образования димеров Нэр22. Фосфорилирование (или мутации, имитирующее фосфорилирование) остатков, расположенных в М-концевой части №р22 (8ег24, 8ег27, 8ег57), уменьшают шапероноподобную активность №р22, в то время как фосфорилирование ТЬг87, расположенного в центральной части белка, приводит к увеличению шапероноподобной активности №р22. Таким образом, установлено, что фосфорилирование влияет на структуру и шапероноподобную активность Нвр22. Полученные экспериментальные данные позволяют приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования Н$р22, что особенно важно, учитывая существенную роль, которая отводится Нзр22 в регуляции процессов протеолиза, пролиферации и апоптоза, а также тот факт, что точечные мутации Шр22 коррелируют с развитием некоторых нейродегенеративных заболеваний.

Апробация работы. Результаты работы были доложены на заседании, кафедры биохимии биологического факультета МГУ; на 33-м и на 35-м Конгрессах Федерации Европейских Биохимических Обществ в Афинах (2008 г.) и в Гетеборге (2010 г.); на 10-м Форуме Молодых Ученых Федерации Европейских Биохимических Обществ в Гетеборге (2010 г.); на Второй международной конференции по стрессу в Будапеште (2007 г.); на Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» в 2007 и 2010 годах (Москва).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, включая 3 статьи и 5 тезисов сообщений.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 111 страницах печатного текста, иллюстрирована 38 рисунками и 2 таблицами. Список цитированной литературы содержит 171 наименование.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Обзоп литературы

В обзоре литературы приведены данные о структуре и свойствах малых белков теплового шока и в частности №р22. Особое внимание уделено фосфорилированию малых

белков теплового шока и его влиянию на структуру, свойства и шапероноподобную активность этих белков.

Материалы н методы

Рекомбинантный малый белок теплового шока Hsp22 дикого типа (wild type, wt) и его точечные мутанты, имитирующие фосфорилирование (S24D, S27D, S57D, T87D, S24,57D, S24D/T87D), экспрессировали в клетках E.coli штамм BL21(DE3). Плазмиды, содержащие кДНК Hsp22 дикого типа, а также всех мугантных форм, кроме S24D/T87D, были любезно предоставлены к.б.н. A.C. Сейт-Неби. Плазмида pET23b-HSP22S24D/T87D была получена нами путем комбинации фрагментов ДНК, содержащих замены S24D и T87D. Процедура очистки белка включала фракционирование бактериального лизата сульфатом аммония, гидрофобную хроматографию на колонке High-Trap Phenyl-Sepharose и гель-фильтрацию на колонке Sephacryl SI00 или Superdex 200. Такая процедура выделения обеспечивает получение высокоочищенных препаратов Hsp22 дикого типа и его точечных мутантов, имитирующих фосфорилирование.

Фосфорилирование нАМФ-зависимой протеинкиназой проводили в буфере Ф1 (20 тМ фосфат, 20 шМ Трис, pH 7.5, 7.5 mM MgCl2, 2 шМ ДТТ, 0.1 тМ ФМСФ) в присутствии 0.15 шМ АТФ, содержащей [у-32Р]-АТФ. В инкубационную среду, содержащую Hsp22 или его точечные мутанты (S24D, S57D или S24,57D) в концентрации 0.7 мг/мл, вносили 2 ед. протеинкиназы A (Sigma) и инкубировали различное время при 37°С. Через определенные промежутки времени аликвоту инкубационной среды наносили на фильтры Whatman ЗММ и после отмывания в 10% растворе трихлоруксусной кислоты и высушивания определяли радиоактивность на сцинтилляционном счетчике RackBeta 1214 (LKB). О кинетике протекания реакции судили по включению радиоактивного фосфата в состав белка. Пробы, отобранные до и после реакции фосфорилирования, подвергали нативному электрофорезу по методу Шауба и Перри (18). Окрашенные гели высушивали, сканировали и подвергали авторадиографии.

Фосфорилирование протеинкиназой ERK1 проводили в буфере Ф2 (20 mM HEPES, pH 7.5, 25 тМ фосфоглицерата натрия, 20 mM MgCh, 2 тМ ДТТ) в присутствии 0.15 тМ АТФ, содержащей [у-32Р]-АТФ. Препарат ERK1 предварительно активировали, инкубируя его с конститутивно активной киназой МЕК в присутствии 0.15 тМ АТФ в течение 60 мин при 37°С. Автор благодарен к.б.н. A.B. Воротникову за любезно предоставленные препараты протеинкиназ. Фосфорилирование Hsp22 и его мутантов (S24D, S27D, T87D, S24D/T87D)

начинали путем добавления активированного препарата ERK1. Включение радиоактивного фосфата в препараты белка анализировали так же, как это описано в предыдущем разделе.

Химотрипсинолиз Hsp22 и его мутантов проводили в буфере Н (20 шМ трис/ацетат, рН 7.6, 10 mM NaCl, 30 шМ р-МЭ) при 37°С. Весовое соотношение Н8р22:химотрипсин составляло 2400:1. Реакцию начинали добавлением химотрипсина (TLCK-химотрипсин, Sigma) и останавливали добавлением ФМСФ до конечной концентрации 9 шМ через 0, 5, 10, 15, 20, 40 и 60 минут. Состав полученных проб анализировали при помощи электрофореза в 15% ПААГ в присутствии ДСН (13). Электрофореграммы сканировали и определяли зависимость интенсивности полосы интактного белка (вычисленной с помощью программы MatLab) от времени инкубации.

Химическое «сшивание» проводили с использованием двух «сшивающих» реагентов - диметилсуберимидата ШМС1 и глутарового альдегида (TAY Hsp22 и его мутанты, имитирующие фосфорилирование под действием протеинкиназы А, инкубировали в 0.2 М триэтаноламин-HCl, рН 8.0, содержащем 30 mM МЭ и 6 тМ ДМС, в течение 60 минут. Реакцию останавливали добавлением 4-кратного ДСН-буфера для образцов. Анализ белкового состава проб проводили методами электрофореза в присутствии - ДСН на гомогенном (15%) или градиентом (7-20%) полиакриламидном геле. К белку дикого типа и его мутантам, имитирующим фосфорилирование под действием ERK1, растворенным в буфере Г (15 шМ HEPES, рН 7.5, 100 mM NaCl, 1 шМ ЭДТА, 0.1 шМ ФМСФ, 30 шМ ДТТ) добавляли глутаровый альдегид (конечная концентрация которого колебалась в интервале от 0.006% до 0.07%) и инкубировали 15 - 30 минут при 37°С. Реакцию останавливали добавлением 4-кратного ДСН-буфера для образцов. Анализ белкового состава проб проводили методами электрофореза в присутствии ДСН на гомогенном (12.5%) или градиентном (5-20%) полиакриламидном геле.

Спектроскопию кругового дихроизма ГКД) в дальней ультрафиолетовой области проводили в интервале 195-260 им на дихрографе Chirascan (Applied Photophysics Inc.) при различных концентрациях Hsp22 дикого типа, его мутантов, имитирующих фосфорилирование, или Hsp22, фосфорилированного протеинкиназой А или ERK1 киназой. Все измерения проводили в буфере С (50 мМ фосфат, рН 7.5, 150 мМ NaCl, 2 гаМ ДТТ) при концентрации белка, варьирующей от 0.3 до 2.5 мг/мл, при 25°С в кювете с оптическим путем 0.02 см. Каждый спектр регистрировали пять раз, полученные данные усредняли и вычитали спектр контрольной пробы, не содержащей белка. Автор глубоко благодарен к.б.н. А.В. Пивоваровой за помощь в проведении экспериментов по круговому дихроизму.

Флуоресцентная спектроскопия. Измерение флуоресценции белковых проб проводили в буфере С (50 шМ фосфат, рН 7.5, 150 mM NaCl, 2 mM ДТТ) на спектрофлуориметре Hitachi F3000 (в случае мутаций, имитирующих фосфорилирование ПКА) или Сагу Eclipse (Varían), оснащенном Пельтье-контролируемым юоветодержателем и термодатчиком (в случае мутаций, имитирующих фосфорилирование ERK1). Флуоресценцию белковых образцов (концентрация белка 0.06 мг/мл, определена спектрофотометрически) возбуждали светом с длиной волны 295 нм (ширина щели монохроматора 5 нм для Hitachi, 2.5 нм для Сагу Eclipse), регистрацию флуоресценции проводили в интервале длин волн 300-400 нм (ширина щели монохроматора 1.5 нм). Для мутантов, имитирующих фосфорилирование протеинкиназой ERK1, регистрировали температурную зависимость триптофановой флуоресценции. Для этого пробы нагревали с постоянной скоростью 1°С/мин и регистрировали спектр флуоресценции. По полученным данным строили параметрическую кривую (зависимость флуоресценции при 320 нм от флуоресценции при 365 нм, температура в данном случае является варьирующим параметром) для вычисления доли перехода Hsp22 из нативного в денатурированное состояние (17).

Четвертичную структуру Hsp22 дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, анализировали методом гель-фильтрации, проводимой на колонке Superdex 75 HR 10/30 на хроматографе ACTA FPLC (Pharmacia). Хроматографию проводили в 20 шМ трис/ацетатном буфере, рН 7.6, содержащем 150 шМ NaCl, 0.1 mM ЭДТА, 15 mM МЭ и 0.1 шМ ФМСФ. Образец (150 мкл), содержащий разные количества белка (10-200 мкг), наносили на колонку через петлю (500 мкл), и проводили хроматографию при скорости элюции 0.5 мл/мин. Колонку калибровали, используя бычий сывороточный альбумин (68 кДа), овальбумин (43 кДа), химотрипсиноген (25 кДа) и РНКазу (13.7 кДа) в качестве стандартов.

Аналитическое ультрацентрифугирование образцов Hsp22 при различной концентрации белка (от 0.2 до 1.0 мг/мл) проводили на ультрацентрифуге Beckman, модель Е. После достижения ротором скорости 48000 об/мин каждые 1.5 минуты регистрировали распределение белка (поглощение при 280 нм) по длине ячейки. Эксперименты проводили при фиксированной температуре 22°С. Для расчета коэффициента седиментации использовали уравнение Ламма. Для анализа получаемых седиментограмм использовали программу SEDFIT (www.analyticalultracentriiiigation.com). Автор выражает глубокую признательность сотруднику НИИ ФХБ им. А.Н. Белозерского П.В. Калмыкову за неоценимую помощь в проведении экспериментов.

Шаперонную активность Hsp22 и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, определяли по способности анализируемых белков предотвращать агрегацию модельных белков-субстратов - инсулина и роданазы. В кювете спектрофотометра смешивали растворы инсулина (конечная концентрация 0.2 мг/мл) и Hsp22 (конечная концентрация 0-0.4 мг/мл), пробу преинкубировали 10 мин при 37°С и инициировали агрегацию инсулина добавлением ДТТ до конечной концентрации 20 тМ. Агрегацию роданазы инициировали нагреванием пробы до 44°С. В отдельной пробе смешивали роданазу (конечная концентрация 0.15 мг/мл) и Hsp22 (конечная концентрация 0-0.15 мг/мл) и преикубировали 10 мин при 37°С. Затем пробы переносили в кювету спектрофотометра, термостатируемую при 44°С. За агрегацией белка следили по увеличению оптической плотности при 360 нм на спектрофотометре Ultrospec 3100 Pro (Amersham Biosciences).

Основные результаты и их обсуждение Фосфорилирование Шр22 под действием цАМФ-зависимой протеипкиназы

Анализ первичной структуры №р22 с помощью программы КегРЬоэ 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos) позволил выявить в структуре белка два участка (5ег24 и 8ег57), имеющих консенсусную последовательность ЯХБ, узнаваемую и фосфорилируемую цАМФ-зависимой протеинкиназой. В связи с этим мы предположили, что

Нзр22 может выступать в качестве субстрата для цАМФ-зависимой протеинкиназы.

Действительно, оказалось, что инкубация Нзр22 дикого типа с каталитической субъединицей цАМФ-зависимой протеинкиназы

сопровождается включением около 0.8 моль фосфата на моль белка (рис. 1А). Введение точечной мутации $240, предотвращающей

время, мин

0 40

{) 40

ы ¡щцр fjpjp

0 40 О 40

S24D S57D

0 40 0 40

Ц Рис.1. Фосфорилирование Нвр22 и его мутантов 0 40 цАМФ-зависимой протеинкиназой. А. Кинетика л с7п ФосФ°РилиРования Нзр22 дикого типа и его 5240, »¿4,Э/и 8570 и §24,570 мутантов. Б. Скан геля после 0 40 нативного электрофореза образцов Шр22 и его мутантов до (0) и после (40) инкубации в течение 40 мин с цАМФ-зависимой протеинкиназой.

Ь, Фосфорилирование сопровождается увеличением электрофоретической подвижности. В. Радиоавтограф геля, представленного на панели Б.

фосфорилирование Ser24, не сопровождается изменением скорости или степени фосфорилирования Hsp22 (рис. 1А). В то же время введение точечной мутации S57D (блокирующей фосфорилирование Ser57) или двойной мутации S24.57D (блокирующей фосфорилирование как по Ser24, так и по Ser57) практически полностью ингибировало фосфорилирование Hsp22 цАМФ-зависимой протеинкиназой (рис.1 А).

Образцы Hsp22 и его мутантов до и после инкубации с протеинкиназой А подвергали электрофорезу в полиакриламидном геле в нативных условиях (рис.1 Б), и полученные гели подвергали радиоавтографии (рис.Ш). Как видно, инкубация в присутствии цАМФ-зависимой протеинкиназы сопровождается связанным с фосфорилированием увеличением электрофоретической подвижности белка дикого типа и его S24D мутанта (рис.1 Б). В то же время инкубация мутантов S57D и S24.57D с протеинкиназой А не приводит к изменению электрофоретической подвижности (рис.1Б). Кроме того, данные радиоавтографии (рисЛВ) свидетельствуют о том, что цАМФ-зависимая протеинкиназа способна переносить радиоактивный фосфат только на белок дикого типа и его S24D мутант, но практически не способна фосфорилировать мутанты S57D или S24,57D. Представленные данные свидетельствуют о том, что Ser57 является участком, преимущественно фосфорилируемым цАМФ-зависимой протеинкиназой в структуре Hsp22.

Фосфорилирование Hsp22 под действием киназы ERK1

Протеинкиназа ERK1 является так называемой Рго-направленной протеинкиназой и преимущественно фосфорилирует остатки серина и треонина в консенсусных последовательностях (S/T)P, PXX(S/T)P и PX(S/T)P (15). В структуре Hsp22 есть несколько участков, с первичной структурой частично или полностью соответствующей консенсусной последовательности, узнаваемой протеинкиназой ERK1. Бенндорф и соавт. (2) постулировали, что остатки Ser27 и Thr87 фосфорилируются протеинкиназой ERK1 in vitro.

Действительно, длительная инкубация Hsp22 дикого типа в присутствии протеинкиназы ERK1 сопровождается включением более чем 1.5-1.7 моль фосфата на моль белка дикого типа. Для того, чтобы определить, какие остатки фосфорилируются протеинкиназой ERK1 мы получили точечные мутанты S24D, S27D, T87D, S24D/T87D и S27D/T87D и проанализировали кинетику их фосфорилирования при добавлении протеинкиназы ERK1. Мутации S24D и S27D приводят лишь к сравнительно небольшим изменениям скорости и степени фосфорилирования Hsp22 (рис.2А). Мутация T87D приводит к примерно двукратному уменьшению скорости и степени фосфорилирования (рис.2А). Наконец, двойная мутация S24D/T87D (рис.2А) или двойная мутация S27D/T87D (данные не

представлены) приводят к очень значительному, хотя и не совсем полному ингибированию фосфорилирования Hsp22.

Представленные данные

свидетельствуют о следующем. Во-первых, остаток Thr87 наиболее эффективно фосфорилируется ERK1 в структуре Hsp22. Во-вторых, протеинкиназа ERK.1 с меньшей скоростью и эффективностью может фосфорилировать как Ser24, так и Ser27. При этом фосфорилирование любого из этих двух остатков, по всей видимости, ингибирует фосфорилирование второго остатка. Именно поэтому степень фосфорилирования Hsp22, как правило, не превышает 2 моль фосфата на моль белка. Следует заметить, что первичная структура вблизи остатка Ser24 (RDSZ4P) в большей степени соответствует консенсусной последовательности, узнаваемой ERK1 киназой, чем первичная структура вблизи остатка Ser27 (PLS"SR). Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о том, что в структуре Hsp22 есть три потенциальных участка, которые могут При этом важно отметить, что два из трех выявленных нами остатков (Ser24 и Thr/Ser87) могут находиться в фосфорилированном состоянии и в условиях ш vivo (6,20).

Влияние фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на вторичную структуру Hsp22

Для изучения вторичной структуры Hsp22 использовался метод спектроскопии кругового дихроизма (КД) в дальней ультрафиолетовой области. Спектр КД белка дикого типа имеет отрицательный максимум при 203-205 нм, что характерно для белков, имеющих в своем составе значительную долю (3-складок и неупорядоченных структур и хорошо

га »

-S 0,5

S 0,0

vrt_j

s24d ^j—--s27d

t t87r

--*s24!vrs7d

О 40 £0

время, мин

О 90 wt

О 90

0 90 S24D

0 90

0 90 S27D

0 90

0 90 T87D

0 90

0 90 S24D.T87D

0 90

Рис.2. Фосфорилирование Нвр22 и его мутантов протеинкиназой ЕКК1. А.

Кинетика фосфорилирования Нэр22 дикого типа и его мутантов Б24В, Б27В, Т87Э и Б240,Т870 протеинкиназой ЕЯК1. Б. Скан геля после нативного электрофореза препаратов Нзр22 и его мутантов до (0)и после 90-минутной инкубации (90) с ЕМС1 киназой. В. Радиоавтограф геля, представленного на панели Б.

фосфорилироваться ERK.1 киназой in vitro.

согласуется с ранее опубликованными данными, свидетельствующими о том, что Hsp22 относится к группе внутренне неупорядоченных белков (intrinsically disordered proteins) (9, 10). Пытаясь более подробно проанализировать вторичную структуру Hsp22, мы регистрировали спектры КД при различных концентрациях белка. Оказалось, что при высокой концентрации белка дикого типа (2.5 мг/мл) амплитуда отрицательного максимума при 203205 нм составляет около -4000 град*см2/дмоль (рис.ЗА). Разведение сопровождается сначала довольно незначительным увеличением амплитуды этого максимума до -5000-5500

град*см2/дмоль (концентрация белка 0.7-1.3 мг/мл). В то же время дальнейшее разведение до 0.3 мг/мл приводит к очень значительному увеличению отрицательного максимума до -8000-8500 град*см2/дмоль (рис.ЗА). Количественный анализ спектров КД белков, содержащих в своем составе значительную долю Р-складок и неупорядоченных структур, довольно усложнен, но качественно увеличение

амплитуды при 203-205 нм, происходящее при разведении

■вооо

О .2000

г, ^000

гз

Р" -SOOO

\А ' ' Л-v У" V > / » / V Б \ Xv / V/'

V г" ^ у / /' Ч /' г v .>v 4« У / / 'ч /

Е \ -у V ■/■''" / /

200 210 220 230 240 250 260200 210 220 230 240 250 260

длина волны (нм) длина волны (нм)

Рис. 3 Спектры кругового дихроизма Н$р22 дикого типа (А), белка дикого типа, может быть

его мутантов Б240 (Б), Т87Р (В), Нзр22 дикого типа, свя_но с уменьшением яопи . . ,., , . , ^вязани с уменьшением доли

фосфорилированного ЕКК1 (степень фосфорилирования около

2 моль на моль белка) (Г), Б570 мутанта (Д), а также Нзр22 упорядоченных и увеличением дикого типа, фосфорилированного цАМФ-зависимой

протеинкиназой (степень фосфорилирования 1 моль фосфата на Д°ли неупорядоченных

моль белка) (Е). Концентрация белка составляла 2.5 (сплошная структур в составе белка, линия), 1.3 (штриховая линия), 0.7 (пунктирная линия) или 0.3

мг/мл (штрих-пунктирная линия). Зависимость удельной

молярной эллиптичности от концентрации белка может свидетельствовать о том, что при разведении происходит диссоциация олигомеров №р22 и образующиеся в ходе диссоциации мономеры имеют менее упорядоченную структуру, чем мономеры в составе олигомеров, формирующихся при высокой концентрации белка.

Спектры КД в240 и Б570 мутантов НБр22 мало отличаются от спектров КД белка дикого типа (рис.3, Б и Д, соответственно). При высоких концентрациях белка амплитуда отрицательного максимума при 203-205 нм составляет около -4000 град*см2/дмоль и по мере разведения увеличивается до -6500-7000 град*см2/дмоль, что несколько меньше величины -8000-8500 град*см2/дмоль, характерной для белка дикого типа. Спектры КД для мутанта Т870 отличаются тем, что разведение от 2.5 до 0.7 мг/мл сопровождается очень незначительным изменением амплитуды максимума при 203-205 нм, в то время как разведение до 0.3 мг/мл приводит к резкому увеличению этого максимума до -10000 град*см2/дмоль, что существенно больше аналогичной величины, полученной для белка дикого типа или его Э240 мутанта (рис.ЗВ). Таким образом, при разведении спектры КД мутантов в240 и Т87Б, имитирующих фосфорилирование, изменяются также как и спектры КД белка дикого типа. Однако при низкой концентрации белка амплитуда отрицательного максимума при 203-205 нм для мутанта 8240 меньше, а для мутанта Т87Б больше, чем для белка дикого типа. Спектры КД №р22, фосфорилированного протеинкиназой ЕЫК1 (степень фосфорилирования около 2 моль фосфора на моль белка) мало отличались от спектров КД нефосфорилированного белка дикого типа, как при высокой, так и при низкой концентрации белка (рис.ЗГ). Это может быть связано с тем, что изменения спектров КД, вызванные фосфорилирование Зег24 противоположны изменениям спектра, вызываемым фосфорилированием ТЬг87. Спектры КД №р22, фосфорилированного цАМФ-зависимой протеинкиназой (степень фосфорилирования -1 моль фосфора на моль белка), мало отличались от спектров КД белка дикого типа по форме. Однако разведение фосфорилированного белка от 2.5 до 0.7 мг/мл сопровождается очень незначительными изменениями амплитуды отрицательного максимума при 203-205 нм (рис.ЗЕ) и лишь разведение до 0.3 мг/мл приводит к заметному увеличению указанного отрицательного максимума. Суммируя представленные результаты, можно заключить, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) приводит к тому, что изменения амплитуды спектра КД при 203-205 нм происходят либо при более низких концентрациях белка (например, мутанты Т87Б или белок, фосфорилированный цАМФ-зависимой протеинкиназой), либо к тому, что разведение сопровождается меньшими изменениями амплитуды пика при указанных длинах волн (например, мутанты Э240 или 8570).

Таким образом, в ходе наших экспериментов было установлено, что в ходе разведения происходит изменение молярной эллиптичности Нзр22, что, по всей видимости, обусловлено диссоциацией олигомеров этого белка. Фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) не влияют на спектры КД при высокой концентрации белка, но могут

влиять либо на процесс диссоциации, либо на вторичную структуру мономеров (или малых олигомеров) образующихся в ходе диссоциации крупных олигомеров №р22.

Влияние фосфорилирования на третичную структуру №р22

Нэр22 человека содержит в своей структуре четыре остатка триптофана, три из которых (Тгр 48, 51 и 69) расположены в Ы-концевой части молекулы, в непосредственной близости от потенциально фосфорилируемых участков. По этой причине можно предположить, что фосфорилирование или мутации, имитирующие фосфорилирование, могут влиять на собственную триптофановую флуоресценцию исследуемого белка.

Оказалось, что фосфорилирование как цАМФ-зависимой протеинкиназой, так и протеинкиназой Е11К1 приводят к изменениям флуоресцентных свойств №р22. При этом интенсивность флуоресценции №р22, фосфорилированного цАМФ-зависимой протеинкиназой, или точечного мутанта 8570 примерно на 20% больше интенсивности флуоресценции белка дикого типа. Мутации 8240 или 824,570 сопровождаются примерно 30% увеличением флуоресценции 11эр22. Это может быть обусловлено изменением микроокружения остатков триптофана в ^

молекуле мутированного или фосфорилированного зоо зго 340 зво эго лоо

длина волны (нм)

' Рис.4. Спектры флуоресценции Шр22

В случае фосфорилирования №р22 дикого ™0па а также его 5240'

Б270 и Т870 мутантов, имитирующих

протеинкиназой Е11К1 мутации Э270 и Т870 фосфорилирование. приводят к значительному увеличению интенсивности флуоресценции - до 80% - по сравнению с белком дикого типа (рис.4). Мутация Б240 также приводит к росту интенсивности флуоресценции (на 30%). Представленные данные свидетельствуют о том, что мутации, имитирующие фосфорилирование, меняют микроокружение остатков триптофана в молекуле №р22.

Используя метод флуоресцентной спектроскопии, мы исследовали также процесс тепловой денатурации Нэр22 и влияние фосфорилирования или мутаций, имитирующих фосфорилирование на тепловую денатурацию этого белка. Нагревание от 20°С до 80°С сопровождается уменьшением амплитуды флуоресценции и сдвигом максимума флуоресценции на 10 нм в длинноволновую область спектра. Строя параметрическую зависимость в координатах интенсивность флуоресценции при 320 нм от интенсивности флуоресценции при 365 нм при разной температуре мы могли определить параметр а,

характеризующий переход от иативиого к денатурированному состоянию белка. Строя зависимость а от температуры, мы смогли определить температуру полуперехода от нативного к денатурированному состоянию. Температура полуперехода составила 54°С и оставалась неизменной как для точечных мутаций, имитирующих фосфорилирование (8240, Т870, 8270, 8270/Т87Б) так и для НБр22, фосфорилированного протеинкиназой ЕЮС1. Таким образом, фосфорилирование не влияет на параметры тепловой денатурации Нзр22.

В качестве другого подхода, позволяющего получить сведения о структуре белка, мы использовали метод ограниченного протеолиза. При использовании трипсина в качестве протеазы мы не обнаружили различий в скорости протеолиза белка дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование. Возможно, это связано с тем, что как уже отмечалось, №р22 относится к группе внутренне неупорядоченных белков, которые очень чувствительны к протеолизу. В нашем случае даже при соотношении Н$р22/трипсин, равном 12000/1 скорость протеолиза была очень высокой, что не позволяло выявить небольших изменений структуры, вызываемых фосфорилированием, или мутациями, имитирующими фосфорилирование.

Скорость протеолиза под действием химотрипсина оказалась ниже, чем в случае трипсина, и это позволило использовать химотрипсин для исследования структуры Н$р22. Химотрипсинолиз Шр22 сопровождается накоплением пептидов с кажущимися молекулярными массами 24, 23.5, и 21.8 кДа, при этом точечные мутации или фосфорилирование не влияют на состав пептидов, образующихся в ходе ограниченного протеолиза. Мутирование остатков, расположенных в М-концевой части белка (8240, 8270) не влияло на скорость химотрипсинолиза, в то время как мутирование Т870 существенно замедляло процесс химотрипсинолиза. В то же время двойные мутанты Нэр22 (824,570 и 8240/Т870) так же как белок, фосфорилированный протеинкиназой ЕЯК1, обладали повышенной чувствительностью к химотрипсинолизу. Таким образом, фосфорилирование остатков, расположенных в центральной части белка или комбинированное фосфорилирование остатков, расположенных в И-концевой (8ег24, 8ег27) и центральной части (ТЬг87) влияют на структуру, вследствие чего изменяется устойчивость Нзр22 к ограниченному протеолизу.

Влняние фосфорилирования на четвертичную структуру 11чр22

До последнего времени в литературе не было единого мнения о четвертичной структуре Н$р22. Ранние исследования (5, 12) свидетельствовали о том, при гель-фильтрации №р22 элюируется с кажущейся молекулярной массой 36-38 кДа, в то время как при

белой дикого типа 3570

ЕПК1*фосфорилированный белок 3240

3240, ТВ7Р

ультрацентрифугировании в градиенте плотности молекулярная масса №р22 составляет 21.6 кДа, что хорошо согласуется с расчетной молекулярной массой этого белка (5). На основе этих данных было высказано предположение о том, что №р22 имеет структуру рыхлого или сильно асимметричного мономера, и это заключение зафиксировано в настоящее время в базе данных итркЛ (С?9ШУ1). В то же время при двумерном электрофорезе экстракта клеток удается выявить зоны, соответствующие как мономерам, так и димерам №р22 (2), Нвр22 легко подвергается химическому «сшиванию» с образованием димеров и более крупных олигомеров (11), а объем элюции при гель-фильтрации зависит от концентрации наносимого образца белка (9). Представленные данные свидетельствуют о том, что различные условия могут влиять на олигомерное состояние №р22. Для анализа олигомерного состояния и исследования влияния фосфорилирования на четвертичную структуру Шр22 мы использовали методы гель-фильтрации, химического «сшивания» и аналитического ультрацентрифугирования.

При гель-фильтрации №р22 дикого типа на колонке Эирег(1ех 75 объем элюции

зависит от количества белка, наносимого на колонку, при этом уменьшение количества белка

сопровождается увеличением объема элюции

с 11.20 до 11.55 мл, что соответствует

уменьшению кажущейся молекулярной

массы с 36-38 кДа до 31-33 кДа.

Аналогичные изменения объема элюции

наблюдались для мутантов Нзр22,

имитирующих фосфорилирование, или для

препаратов белка, фосфорилированных 20 40 60 80 100 Количество Нвр22, наносимого на колонку, мкг протеинкиназой ЕЮч. 1 (рис.5). Уменьшение

Рис. 5. Зависимость объемов элюции Шр22 кажущейся молекулярной массы, вызванное дикого типа, его мутантов, имитирующих

фосфорилирование, и Шр22, уменьшением количества белка, нанесенного

фосфорнлироваиного протеинкиназой ЕКК1 от на колонку> было менее ВЫражено для количества белка, наносимого на колонку

8ирсг(1ех 75 при гель-фильтрации. Представлены мутантов, имитирующих фосфорилирование, средние значения объемов элюции, полученные не

менее чем в двух независимых экспериментах, в и Д™ №Р22> фосфорилированного ЕЮС1 которых разброс измеряемых объемов элюции, как кина3ой, чем для белка дикого типа, правило, не превышает 0.05 мл.

Наибольшие изменения в объеме элюции наблюдались при нанесении минимальных количеств белка, когда разница в объемах элюции для белка дикого типа и его мутантов, имитирующих фосфорилирование, достигала 0.35 мл (рис.5), что соответствует изменению кажущейся молекулярной массы на 3-5 кДа.

Представленные данные могут означать, что разведение сопровождается диссоциацией олигомеров №р22, при этом фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) либо уменьшают вероятность диссоциации олигомеров НБр22, либо влияют на структуру и гидродинамические свойства как мономеров, так и олигомеров №р22.

Для проверки гипотезы о влиянии фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на олигомерное состояние Н5р22 нами был использован метод химического «сшивания». Обработка Шр22 дикого типа диметилсуберимидатом сопровождается уменьшением интенсивности полосы с кажущейся молекулярной массой 2527 кДа, соответствующей мономеру Шр22, и появлению новой полосы с кажущейся молекулярной массой около 50 кДа, соответствующей димеру Шр22. Мы проводили «сшивание» диметилсуберимидатом при разных концентрациях белка. Оказалось, что при высоких концентрациях белка (0.4-1.6 мг/мл) эффективность «сшивания» белка дикого типа, его мутантов, имитирующих фосфорилирование под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы (8240, 8570, 824,570), была практически одинаковой. В то же время при низких концентрациях белка (0.08 мг/мл) вероятность «сшивания» псевдофосфорилированных мутантов была выше эффективности «сшивания» белка дикого типа. Представленные данные свидетельствуют в пользу того, что фосфорилирование или мутации, имитирующие фосфорилирование, препятствуют диссоциации димеров при низкой концентрации белка и поэтому увеличивают вероятность «сшивания» Шр22 под действием диметилсуберимидата.

Помимо диметилсуберимидата мы использовали глутаровый альдегид в качестве «сшивающего» химического реагента для исследования влияния фосфорилирования на четвертичную структуру Шр22. При использовании сравнительно высокой концентрации глутарового альдегида (0.07%) мы не выявили существенных изменений в вероятности «сшивания» мономеров как белка дикого типа, так и его мутантов, имитирующих фосфорилирование под действием ЕКК.1 киназы (8240, Б270, Т870 или 8240/Т870) ни при высокой (1.12 мг/мл), ни при низкой (0.14 мг/мл) концентрации белка. В то же время при использовании низких концентраций глутарового альдегида (0.006-0.012%) оказалось, что мутация Т870, а также двойная мутация 8240/Т870 или фосфорилирование под действием ЕИС.1 киназы значительно уменьшают вероятность образования внутримолекулярных «сшивок» №р22. Кроме того, двойная мутация 8240/Г870 или фосфорилирование ЕЯК1 киназой уменьшают вероятность образования «сшитых» димеров №р22. Полученные методом химического «сшивания» данные убедительно свидетельствуют о том, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) оказывают

существенное влияние на структуру как димеров, так и мономеров №р22. К сожалению, вероятность «сшивания» зависит от большого количества различных факторов, таких как реакционная способность и взаимное расположение «сшиваемых» остатков, размер и гибкость «сшивающего» агента, а также его способность проникать вглубь структуры белка. Все это затрудняет однозначную интерпретацию результатов, получаемых методом химического «сшивания».

В поисках более прямого подхода

И 0.«

¡1 I■

; 1 л

В д

м ;;

-Л

¡1

и ¡|

Коэффициент седиментации (Э)

Коэффициент седиментации (Э) Рис.6. Аналитическое ультрацентрифугирование препаратов Н$р22 дикого типа (А), его мутантов, имитирующих фосфорилирование (Б), Т870 (В), 5240,Т870 (Г) и Нэр22, фосфорилированного протеинкиназой ЕШС1 (степень фосфорилирования ~2 моль фосфата на моль белка) (Д). Опыты проводили при концентрациях белка, равных 0.2 мг/мл (сплошная линия), 0.5 мг/мл (штриховая линия) или 1.0 мг/мл (штрих-пунктирная линия)

для исследования четвертичной структуры \lsp22 мы обратились к методу аналитического

ультрацентрифугирования. Оказалось, что при низкой и средней концентрации (0.2-0.5 мг/мл) белок дикого типа осаждается с коэффициентом седиментации 1.61.8 э. Эта величина существенно меньше максимально возможной величины 2.62 в, характерной для мономера №р22 с молекулярной массой 21.6 кДа. Соотношение максимально возможного и измеренного коэффициентов

седиментации (2.62/1.6=1.6) дает значение фрикционного

соотношения. Принимая во внимание, что в вычисленное фрикционное отношение входит

член, зависящий от гидратации и член, определяющий форму молекулы (14), можно определить фрикционное отношение, отражающее форму молекулы и равное в данном случае 1.45, что соответствует асимметричной молекуле в форме эллипсоида вращения с соотношением осей а/Ь, равным 5. Таким образом, при ультрацентрифугировании при низкой концентрации белка дикого типа №р22 преимущественно представлен в виде мономера с коэффициентом седиментации около 1.7 в и фрикционным отношением около 1.6, что соответствует частице с молекулярной массой 21.6 кДа, хорошо согласующееся с

теоретически рассчитанной молекулярной массой мономера Нзр22. Повышение концентрации белка дикого типа сопровождается появлением частиц с коэффициентом седиментации около 3 а также появлением небольшого количества частиц с коэффициентами седиментации более 6 б. Частицы с коэффициентом седиментации 3 э, по всей видимости, соответствуют димерам, а частицы с коэффициентами седиментации более 6 в - олигомерам Нзр22 (рис.бА).

Седиментационный анализ препаратов белка, имитирующих фосфорилирование, а также препаратов №р22, фосфорилированных протеинкиназой ЕЯК1, показал, что в этом случае удается обнаружить частицы с коэффициентами седиментации, равными 1.5-1.7 5, 2.52.7 э и более 4 б, т.е. частицы, существенно не отличающиеся по коэффициентам седиментации от соответствующих компонентов, выявленных при седиментации белка дикого типа. Однако, если в случае белка дикого типа при всех исследованных концентрациях большая часть белка седиментировалась с коэффициентом седиментации меньше 2 б и только незначительная часть белка имела коэффициент седиментации около 3 в, то в случае мутантов, имитирующих фосфорилирование, или №р22, фосфорилированного протеинкиназой ЕЮС1, повышение концентрации белка от 0.2 до 0.5 мг/мл сопровождалось появлением пика с коэффициентом седиментации более 2.5 в, а при концентрации белка 1.0 мг/мл пик с коэффициентом седиментации менее 2 э почти полностью исчезал, и появлялся пик (или пики) с коэффициентом седиментации более 2.5 э (рис.6). Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными методами гель-фильтрации, и свидетельствуют о том, что мутации, имитирующие фосфорилирование, или фосфорилирование под действием протеинкиназы ЕЯК1 способствуют сдвигу равновесия между мономерами и димерами в сторону формирования димеров Нзр22.

Влияние фосфорилнрования на шапероноподобную активность №р22

Способность предотвращать агрегацию денатурированных белков (так называемая шапероноподобная активность) является одной из наиболее важных характеристик малых белков теплового шока. В связи с этим представлялось целесообразным исследовать влияние фосфорилирования или мутаций, имитирующих фосфорилирование, на шапероноподобную активность №р22. Мы использовали два модельных белка-субстрата - инсулин и роданазу -для измерения шапероноподобной активности Шр22. Восстановление дисульфидных связей в молекуле инсулина приводит к агрегации В-цепи, что после небольшого лаг-периода сопровождается увеличением светорассеяния или увеличением оптической плотности инкубируемой пробы. Добавление №р22 замедляет или предотвращает агрегацию В-цепи инсулина и таким образом уменьшает светорассеяние или оптическую плотность при 360 нм.

10 20 30 время, мин

Рис.7. Шапероноподобная активность П$р22 с инсулином в качестве модельного субстрата. Агрегацию изолированного инсулина (0.2 мг/мл) (кривая 1) или инсулина в присутствии нефосфорилированного Нзр22 (кривая 2); Нэр22, фосфорилированного цАМФ-зависимой протеинкиназой (степень фосфорилирования ~1 моль фосфата на моль белка) (кривая 3); Н$р22,

фосфорилированного протеинкиназой ЕЮС1 (степень фосфорилирования -1.5 моль фосфата на моль белка) (кривая 4) и Т870 мутанта Шр22 (кривая 5) индуцировали добавлением избытка дитиотрейтола и регистрировали по увеличению оптической плотности при 360 нм. Концентрация Нзр22 составляла 0.1 мг/мл (панель А) или 0.2 мг/мл (панель Б).

При весовом отношении инсулин/Н5р22, равном 2/1, белок дикого типа удлиняет лаг-период и замедляет агрегацию инсулина (рис.7А, кривая 2). Нзр22, фосфорилированный цАМФ-зависимой

протеинкиназой обладает менее выраженной шапероноподобной активностью и кривая агрегации в присутствии Н8р22, фосфорилированного цАМФ-зависимой

протеинкиназой, практически не отличается от кривой агрегации изолированного инсулина (рис.7А, кривая 3), а шапероноподобная активность белка, фосфорилированного протеинкиназой ЕКК1, практически не отличается от соответствующей активности нефосфорилированного белка дикого типа (рис.7А, кривая 4). Любопытно отметить, что наибольшей шапероноподобной активностью обладал мутант Т870, который даже при малых концентрациях эффективно ингибировал агрегацию инсулина (рис.7А, кривая 5).

Отмеченные закономерности

становятся более наглядными при повышении

концентрации Нзр22 в пробе. При весовом соотношении инсулин/Шр22, равном 1/1, все исследуемые препараты Нэр22 ингибируют агрегацию инсулина, при этом эффективность шапероноподобной активности увеличивается в ряду Н5р22, фосфорилированный цАМФ-зависимой протеинкиназой (фосфорилированный по остатку Эег57) < Нзр22, фосфорилированный ЕШС1 < нефосфорилированный белок дикого типа < мутант Т870, имитирующий фосфорилирование под действием ЕЛК1 протеинкиназы (рис.7Б). В отдельных экспериментах мы исследовали шапероноподобную активность 8570 мутанта, и показали, что его эффективность сопоставима с активностью Нзр22, фосфорилированного цАМФ-зависимой протеинкиназой, и меньше соответствующей активности нефосфорилированного

белка дикого типа. Таким образом, мутация или фосфорилирование 8ег57 приводит к

уменьшению шаперонной активности №р22.

Интерпретация результатов, полученных при анализе влияния фосфорилирования

Шр22 под действием ЕМС1 киназы, оказывается более сложной. Мутанты Э240 и Б270

обладают шапероноподобной активностью меньшей, чем соответствующая активность

нефосфорилированного белка дикого типа (данные не представлены), в то время как мутант

Т870 обладает шапероноподобной активностью большей, чем нефосфорилированный белок

дикого типа (рис.7). Вероятно, именно вследствие этого шапероноподобная активность белка,

фосфорилированного ЕИС1 по остаткам 8ег24, 8ег27 и ТЬг87 оказывается сопоставимой или

меньшей, чем соответствующая активность нефосфорилированного белка дикого типа.

В качестве второго модельного белка-субстрата для измерения шапероноподобной

активности была использована роданаза, фермент, отличающийся высокой

термолабильностью и начинающий

денатурировать и агрегировать при 44°С. При

весовом соотношении роданаза/Н$р22, равном

2/1, нефосфорилированный белок дикого типа

практически полностью предотвращает

агрегацию субстрата (рис. 8А, кривая 2). Столь

же эффективен в ингибировании агрегации

роданазы мутант Т87Б, имитирующий

фосфорилирование по одному из участков,

узнаваемых ЕЮС1 киназой (рис.8А, кривая 5).

В тоже время мутант 8570, имитирующий

20 30 40 50 60 фосфорилирование под действием цАМФ-время, мин

Рис.8. Шапероноподобная активность Н*р22 с зависимой протеинкиназы (рис.8А, кривая 4), и

роданазой в качестве модельного субстрата. Нэр22, фосфорилированный цАМФ-зависимой Термоиндуцированную агрегацию

изолированной роданазы (0.15 мг/мл) (кривая 1) протеинкиназой (данные не представлены)

или агрегацию роданазы в присутствии , - с -

. . ^ тг I-./' <14 гт л-, обладают наименьшем шапероноподобной

нефосфорилированного шр22 (кривая 2); Н$р22, г

фосфорилированного протеинкиназой Е11К1 активностью. Низкая шапероноподобная

(степень фосфорилирования ~1.5 моль фосфата

на моль белка) (кривая 3); 5570 (кривая 4) и активность, сопоставимая с активностью Э570

Т870 (кривая 5) мутантов Нзр22 регистрировали нта> 6ыла характерной и для точечных по увеличению оптинескои плотности при 340

0.075 мутантов 8240 и 8270 (данные не

а о

нм. Концентрация Hsp22, составляла мг/мл (панель А) или 0.150 мг/мл (панель Б).

представлены). Hsp22, фосфорилированный

ЕЯК1 киназой, обладал шаперонной активностью, большей, чем мутанты Э570 или 8240 (8270), но меньшей, чем нефосфорилированный №р22 дикого типа (рис.8А, кривая 3).

При весовом соотношении роданаза/Нзр22, равном 1/1 (рис.8Б), были выявлены аналогичные закономерности. Шапероноподобная активность возрастала в ряду 8570 мутант < Н8р22, фосфорилированный протеинкиназой ЕЯК1 < нефосфорилированный белок дикого типа = мутант Т870. Эти данные хорошо согласуются с результатами, полученными с использованием инсулина в качестве субстрата, и свидетельствуют о том, что фосфорилирование под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы или мутация 8570 уменьшают шапероноподобную активность Нэр22. Фосфорилирование 8ег24/8ег27 (или мутации 8240 и Э270) также уменьшают шапероноподобную активность Шр22. В то же время мутация Т870 приводит к увеличению шапероноподобной активности. Вследствие этого фосфорилирование под действием протеинкиназы Е11К1, когда модификации могут подвергаться как остатки 8ег24/8ег27, так и ТЬг87 незначительно уменьшает шапероноподобную активность Нзр22.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Установлено, что цАМФ-зависимая протеинкиназа фосфорилирует 8ег57, а протеинкиназа Е11К1 - Эег24, 8ег27 и ТЬг87 в структуре Нзр22. Белок дикого типа представлен в виде равновесной смеси мономеров и димеров и вследствие этого разведение сопровождается смещением равновесия в сторону мономеров, обладающих менее упорядоченной вторичной структурой. Фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) влияют на равновесие между димерами и мономерами Нэр22. Использование методов флуоресцентной спектроскопии, ограниченного протеолиза, химического «сшивания», гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования позволило показать, что мутации, имитирующие фосфорилирование, или фосфорилирование под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы или киназы Е11К1 сопровождаются изменениями третичной и четвертичной структуры №р22. Мутации, имитирующие фосфорилирование остатков, расположенных в Ы-концевой части белка (8ег24, Эег27 или 8ег57) приводят к уменьшению шапероноподобной активности Нзр22. В то время как мутация (и возможно, фосфорилирование) ТЬг87, расположенного в центральной части, сопровождается значительными изменениями структуры и увеличением шапероноподобной активности Н$р22. Таким образом, фосфорилирование влияет на структуру Шр22 и его способность взаимодействовать с различными белками-субстратами.

выводы

1. Обнаружено, что в условиях in vitro цАМФ-зависимая протеинкиназа способна фосфорилировать Ser57 Hsp22.

2. Установлено, что протеинкиназа ERK1 способна фосфорилировать Ser24, Ser27 и Thr87 Hsp22 in vitro, поэтому ERK1 может быть тем ферментом, который фосфорилирует Hsp22 в условиях in vivo.

3. Выявлено изменение спектров кругового дихроизма, происходящее при уменьшении концентрации белка, что может быть связано с диссоциацией олигомеров и дестабилизацией структуры освобождающихся мономеров.

4. Мутации, имитирующие фосфорилирование, а также фосфорилирование влияют на вторичную и третичную структуру Hsp22, что отражается в изменении собственной триптофановой флуоресценции и чувствительности к протеолизу.

5. Данные гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования свидетельствуют о том, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) способствует ассоциации мономеров Hsp22.

6. Фосфорилирование (или мутирование) расположенных в N-конце остатков Ser24, Ser27 и Ser57 уменьшает шапероноподобную активность Hsp22, в то время как мутирование расположенного в центральной части молекулы Thr87 увеличивает шапероноподобную активность Hsp22.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в реиензируемых журналах

Шеметов, А.А., Сейт-Неби, А.С., Букач, О.В., Гусев, Н.Б. (2008) «Фосфорилирование сАМР-зависимой протеинкиназой влияет на структуру и ингибирует шапероноподобную активность малого белка теплового шока Hsp22 человека». Биохимия. 73(2): 247-257

Shemetov, A. A., Seit-Nebi, A.S., Gusev, N.B. (2008). "Structure, properties, and functions of the human small heat-shock protein HSP22 (HspB8, HI 1, E2IG1): a critical review." J. Neurosci. Res. 86(2): 264-269.

Статья в коллективной могографии

Shemetov, А.А., Mymrikov, E.V., Seit-Nebi, A.S., Gusev, N.B. (2010) "Structure, properties and miltiple functions of human small heat shock protien HspB8 (Hsp22, НИ protein kinase or E2IG1)". In "Handbook of Molecular Chaperones: Roles, Structures and Mechanisms" (Durante, P. and Colucci L. Eds.). Nova Science Publishers, NY, pp. 333-352.

Тезисы докладов

Шеметов, А.А. (2007) «Фосфорилирование малого белка теплового шока Hsp22 человека (HspB8, Hll, E2IG1) сАМР-зависимой протеинкиназой». Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2007», с.39, Москва.

Шеметов, А.А. (2010) «Фосфорилирование малого белка теплового шока человека HspB8 влияет на его структуру и шапероноподобную активность». Тезисы докладов Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010», с.68-69, Москва.

Shemetov, А.А., Chemik, I.S., Seit-Nebi, A.S., Gusev, N.B. (2007) "Phosphorylation of human small heat shock protein HSP22 by cAMP-dependent protein kinase" Book of Abstracts of 2"d World conference of Stress, pp22-23, Budapest.

Shemetov, A.A., Seit-Nebi, A.S., Bukach, O.V., Gusev, N.B. (2008) "Phosphorylation of human small heat shock protein HSP22 by cAMP-dependent protein kinase in vitro". FEBS J., 275 (si), p. 196, Book of Abstracts of 33rd FEBS Congress & 1 l,h 1UBMB Conference, Athens.

Shemetov, A.A., Seit-Nebi, A.S., Gusev, N.B. (2010) "Phosphorylation of human small heat shock protein HspB8 by ERK1 affects its structure and chaperone-like activity". FEBS J., 277 (si), p. 300, Book of Abstracts of 35th FEBS Congress, Gothenburg.

Данное исследование проводилось при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований.

СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ

1. Arrigo АР, Simon S, Gibert В, Kretz-Remy С, Nivon М, Czekalla A, Guillet D, Moulin M, Diaz-Latoud С, and Vicart P. Hsp27 (HspBl) and alphaB-crystallin (HspB5) as therapeutic targets. FEBS Lett 581: 3665-3674, 2007.

2. Benndorf R, Sun X, Gilmont RR, Biederman KJ, Molloy MP, Goodmurphy CW, Cheng II, Andrews PC, and Welsh MJ. HSP22, a new member of the small heat shock protein superfamily, interacts with mimic of phosphorylated HSP27 ((3D)HSP27). J Biol Chem 276: 2675326761,2001.

3. Cantin GT, Yi VV, Lu B, Park SK, Xu T, Lcc JD, and Yates JR, 3rd. Combining protein-based IMAC, peptide-based IMAC, and MudPIT for efficient phosphoproteomic analysis. J Proteome Res1\ 1346-1351,2008.

4. Chernik IS, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Small heat shock protein Hsp20 (HspB6) as a partner of 14-3-3gamma. Mol Cell Biochem 295: 9-17, 2007.

5. Chowdary TK, Raman B, Ramakrishna T, and Rao CM. Mammalian Hsp22 is a heat-inducible small heat-shock protein with chaperone-like activity. Biochem J 381: 379-387,2004.

6. Dephoure N, Zhou C, Villen J, Beausoleil SA, Bakalarski CE, Elledge SJ, and Gygi SP. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad Sei USA 105: 10762-10767, 2008.

7. Fuchs M, Poirier DJ, Seguin SJ, Lambert H, Carra S, Charette SJ, and Landry J. Identification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem J 425: 245-255,2010.

8. Haslbeck M, Franzmann T, YVeinfurtner D, and Buchner J. Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins. Nat Struct Mol Biol 12: 842-846,2005.

9. Kasakov AS, Bukach OV, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Guscv NB. Effect of mutations in the beta5-beta7 loop on the structure and properties of human small heat shock protein HSP22 (HspB8, Hll). Febs J274: 5628-5642,2007.

10. Kazakov AS, Markov DI, Gusev NB, and Levitsky DI. Thermally induced structural changes of intrinsically disordered small heat shock protein Hsp22. Biophys Chem 145: 79-85, 2009.

11. Kim MV, Kasakov AS, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Structure and properties of K141E mutant of small heat shock protein HSP22 (HspB8, HI 1) that is expressed in human neuromuscular disorders. Arch Biochem Biophys 454: 32-41,2006.

12. Kim MV, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Some properties of human small heat shock protein Hsp22(Hll orHspB8). Biochem Biophys Res Commun3\5: 796-801,2004.

13. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685, 1970.

14. Lebowitz J, Lewis MS, and Schuck P. Modern analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sei 11: 2067-2079, 2002.

15. Lehr S, Kotzka J, Avci H, Sickmann A, Meyer HE, Herkner A, and Muller-Wieland D.

Identification of major ERK-related phosphorylation sites in Gabi. Biochemistry 43: 12133-12140, 2004.

16. McHaourab HS, Godar JA, and Stewart PL. Structure and mechanism of protein stability sensors: chaperone activity of small heat shock proteins. Biochemistry 48: 3828-3837, 2009.

17. Permyakov EA, and Burstein EA. Some aspects of studies of thermal transitions in proteins by means of their intrinsic fluorescence. Biophys Chem 19: 265-271, 1984.

18. Schaub MC, and Perry SV. The relaxing protein system of striated muscle. Resolution of the troponin complex into inhibitory and calcium ion-sensitizing factors and their relationship to tropomyosin. Biochem J 115: 993-1004, 1969.

19. Smith CC, Yu YX, Kulka M, and Aurelian L. A novel human gene similar to the protein kinase (PK) coding domain of the large subunit of herpes simplex virus type 2 ribonucleotide reductase (ICP10) codes for a serine-threonine PK and is expressed in melanoma cells. J Biol Chem 275: 25690-25699,2000.

20. Villen J, Beausoleil SA, Gerber SA, and Gygi SP. Large-scale phosphorylation analysis of mouse liver. Proc Natl Acad Sei USA 104: 1488-1493,2007.

21. Vos MJ, Ilageman J, Carra S, and Kampinga IUI. Structural and functional diversities between members of the human HSPB, HSPH, HSPA, and DNAJ chaperone families. Biochemistry 47: 7001-7011,2008.

Для заметок

Заказ№ 158-а/10/10 Подписано в печать 21.10.2010 Тираж 100 экз. Усл. п.л. 1,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30 www.cfr.ru; e-maihinfo@cfr.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Шеметов, Антон Александрович

Список использованных сокращений.

Введение.

I. Обзор литературы.

1. Структура малых белков теплового шока.

Суперсемейство вНэр.

Структура мономеров малых белков теплового шока.

Олигомерная структура малых белков теплового шока.

Образование гетероолигомерных комплексов малыми белками теплового шока.

2. Функции малых белков теплового шока.

2.1. Шаперонная активность.

2.1.1. Взаимодействие малых белков теплового шока с белками-субстратами.

2.1.2. Взаимодействие вНэр с шаперонной системой клетки.

2.2. Участие малых белков теплового шока в протеолитической деградации частично денатурированных белков.

2.3. Участие малых белков теплового шока в апоптозе и канцерогенезе.

3. Регуляция активности малых белков теплового шока.

II. Материалы и методы.

Препаративные методы.

1.1. Экспрессия генов точечных мутантов рекомбинантного Нзр22.

1.2. Получение компетентных клеток.

Получение клеток, компетентных для химической трансформации.

Получение клеток, компетентных для электропорации.

1.3. Выделение рекомбинантного Нзр22.

2. Фосфорилирование НБр22 и его точечных мутантов под действием цАМФ-зависимой протеинкиназой.

3. Фосфорилирование Нзр22 и его точечных мутантов под действием протеинкиназы ЕЫК1.

4. Флуоресцентная спектроскопия.

5. Спектроскопия кругового дихроизма.

6. Метод ограниченного протеолиза.

7. Аналитическое ультрацентрифугирование.

8. Гель-фильтрация.

9. Химическое «сшивание» при помощи диметилсуберимидата.

10. Химическое «сшивание» при помощи глутарового альдегида.

11. Определение шаперонной активности.

11.1. Определение шаперонной активности с инсулином.

11.2. Определение шаперонной активности с роданазой.

Аналитические методы.

Электрофорез в полиакриламидном геле.

ЗБЗ-электрофорез.

Электрофорез в нативных условиях.

Изоэлектрофокусирование.

Окрашивание полиакриламидных гелей серебром.

Авторадиография.

Спектрофотометрическое определение концентрации белка.

III. Результаты и обсуждение.

1. Экспрессия генов рекомбинантного Нэр22 в клетках Е.соН.

2. Выделение рекомбинантного №р22.

3. Фосфорилирование Шр22 и его точечных мутантов под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы.

4. Фосфорилирование Нвр22 и его точечных мутантов под действием протеинкиназы ЕЯК1.

5. Влияние фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на структуру Нзр22.

5.1. Влияние фосфорилирования и мутаций, имитирующих фосфорилирование, на вторичную структуру Нзр22.

5.2. Влияние фосфорилирования на третичную структуру Нвр22.

5.2.1. Изучение собственной триптофановой флуоресценции.

5.2.2. Ограниченный протеолиз.

5.3. Влияние фосфорилирования на четвертичную структуру Нэр22.

5.3.1. Химическое «сшивание» при помощи диметилсуберимидата и глутарового альдегида.

5.3.2. Гель-фильтрация.

5.3.3. Аналитическое ультрацентрифугирование.

6. Шапероноподобная активность Нзр22.

6.1. Шапероноподобная активность Нзр22 с использованием инсулина в качестве модельного белка-субстрата.

6.2. Шапероноподобная активность с использованием роданазы в качестве модельного белка-субстрата.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Влияние фосфорилирования на структуру и шапероноподобную активность малого белка теплового шока человека Hsp22"

Малые белки теплового шока (small heat shock proteins, sHsp) - широко распространенная группа белков с молекулярной массой мономера от 12 до 43 кДа. Отличительной чертой всех белков этого семейства является наличие в их структуре так называемого а-кристаллинового домена, состоящего из 80-90 аминокислотных остатков и получившего свое название от белка а-кристаллина, в составе которого он был впервые обнаружен. sHsp склонны к образованию крупных олигомерных комплексов, размер которых может достигать 600-700 кДа.

Все члены семейства обладают так называемой шапероноподобной активностью, т.е. способны связывать частично денатурированные белки, препятствуя их дальнейшей агрегации. Помимо этого малые белки теплового шока могут участвовать в регуляции протеолитической деградации денатурированных белков, тем самым защищая клетку от накопления агрегатов поврежденных белков. Кроме того, считается, что sHsp могут участвовать в регуляции сократительного аппарата и цитоскелета, клеточной подвижности, а также в защите клетки от окислительного стресса, регуляции процессов пролиферации и апоптоза. Функционирование малых белков теплового шока может регулироваться разными способами, в частности, путем фосфорилирования, катализируемого различными протеинкиназами. Фосфорилирование может влиять на олигомерное состояние sHsp, их взаимодействие с белками-партнерами и шапероноподобную активность.

В настоящее время в геноме человека найдено 10 генов, кодирующих малые белки теплового шока, и свойства некоторых представителей этого семейства белков (аА- и аВ-кристаллины, Hsp27) достаточно подробно изучены. Сравнительно недавно описанный белок Hsp22 (HspB8, HI 1 киназа, продукт гена E2IG1) на начальных этапах исследования относили к классу протеинкиназ, однако позднее было показано наличие в его структуре а-кристаллинового домена и отсутствие протеинкиназной активности. Данные двумерного электрофореза свидетельствуют о том, что в клетках млекопитающих Hsp22, который является типичным представителем семейства малых белков теплового шока, может находиться в фосфорилированном состоянии. В условиях in vivo в разных тканях фосфорилированию могут подвергаться остатки Ser24 и Thr/Ser87 Hsp22.

Помимо этого несколько протеинкиназ (протеинкиназа С, казеинкиназа второго типа и ERK1 киназа) способны фосфорилировать Hsp22 в условиях in vitro. Кроме того, анализ первичной структуры Hsp22, проведенный с использованием программы NetPhos 2.0, свидетельствует о том, что в структуре этого белка есть остатки (Ser24 и Ser57), расположенные в последовательностях, узнаваемых и фосфорилируемых протеинкиназой А. Таким образом, к настоящему моменту накоплено большое количество экспериментальных и теоретических данных, свидетельствующих о том, что Hsp22 может подвергаться фосфорилирования). В то же время в литературе нет данных о том, каким образом фосфорилирование влияет на структуру и свойства этого белка. В связи с этим главной целью нашей работы являлось исследование влияние фосфорилирования на физико-химические свойства Hsp22, а также на его шапероноподобную активность.

Научная новизна и.практическая ценность работы. Проанализирован процесс фосфорилирования Hsp22 под действием двух протеинкиназ. Установлено, что цАМФ-зависимая протеинкиназа в условиях in vitro фосфорилирует Ser57 Hsp22. Протеинкиназа ERK1 в условиях in vitro фосфорилирует остатки Ser24, Ser27 и Thr87, при этом остатки Ser24 и Thr87 могут находиться в фосфорилированном состоянии в условиях in vivo. Данные спектроскопии кругового дихроизма свидетельствуют о том, что значительная часть структуры Hsp22 неупорядочсна, при этом разведение приводит к дальнейшему разупорядочиванию структуры белка. Этот эффект может быть связан с происходящей при разведении диссоциацией димеров Hsp22. Используя методы гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования, установили, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) увеличивают вероятность образования димеров Hsp22. Фосфорилирование (или мутации, имитирующее фосфорилирование) остатков, расположенных в N-концевой части Hsp22 (Ser24, Ser27, Ser57), уменьшают шапероноподобную активность Hsp22, в то время как фосфорилирование Thr87, расположенного в центральной части белка, приводит к увеличению шапероноподобной активности Hsp22. Таким образом, установлено, что фосфорилирование влияет на структуру и шапероноподобную активность Hsp22. Полученные экспериментальные данные позволяют приблизиться к пониманию молекулярных механизмов функционирования Hsp22, что особенно важно, учитывая существенную роль, которая отводится Hsp22 в регуляции процессов протеолиза, пролиферации и апоптоза, а также тот факт, что точечные мутации Hsp22 коррелируют с развитием некоторых нейродегенеративных заболеваний.

I. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Шеметов, Антон Александрович

Выводы

1. Обнаружено, что в условиях in vitro цАМФ-зависимая протеинкиназа способна фосфорилировать Ser57 Hsp22.

5. Данные гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования свидтельствуют о том, что фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) способствуют ассоциации мономеров Hsp22.

Заключение

Установлено, что цАМФ-зависимая протеинкиназа фосфорилирует 8ег57, а протеинкиназа ЕШС1 8ег24, 8ег27 и Т1зг87 в структуре Нзр22. Белок дикого типа представлен в виде равновесной смеси мономеров и димеров. Вследствие этого разведение сопровождается смещением равновесия в сторону мономеров, обладающих менее упорядоченной вторичной структурой. Фосфорилирование (или мутации, имитирующие фосфорилирование) влияют на равновесие между димерами и мономерами Шр22. Использование методов флуоресцентной спектроскопии, ограниченного протеолиза, химического «сшивания», гель-фильтрации и аналитического ультрацентрифугирования позволило показать, что мутации, имитирующие фосфорилирование, или фосфорилирование под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы или киназы ЕККЛ сопровождаются изменениями третичной и четвертичной структуры Ызр22. Мутации, имитирующие фосфорилирование остатков, расположенных в Ы-концевой части белка (8ег24, 8ег27 или 8ег57), приводят к уменьшению шапероноподобной активности Нзр22. В то время как мутация (и возможно, фосфорилирование) ТЬг87, расположенного в центральной части белка, сопровождается значительными изменениями структуры и увеличением шапероноподобной активности Нзр22. Таким образом, фосфорилирование влияет на структуру Нзр22 и его способность взаимодействовать с различными белками-субстратами.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Шеметов, Антон Александрович, Москва

1. Aquilina JA, Benesch JL, Bateman OA, Slingsby C, and Robinson CV.

2. Polydispersity of a mammalian chaperone: mass spectrometry reveals the population of oligomers in alphaB-crystallin. Proc Natl Acad Sci USA 100: 10611-10616, 2003.

3. Aquilina JA, Beiiesch JL, Ding LL, Yaron O; Horwitz J, and Robinson CV. Phosphorylation of alphaB-crystallin alters chaperone function through loss of dimeric substructure. J Biol Cheni 279: 28675-28680, 2004.

4. Aquilina JA, and Watt SJ. The N-terminal domain of alphaB-crystallin is protected from proteolysis by bound substrate. Biochem Biophys Res Commim 353: 1115-1120, 2007.

5. Arndt V, Dick N, Tawo R, Dreiseidler M, Wenzel D, Hesse M, Furst DO, Saftig P, Saint R, FJeischmann BK, Hoch M, and Hohfeld J. Chaperone-assisted selective autophagy is essential for muscle maintenance. Carr Biol 20: 143-148, 2010.

6. Assimakopoulou M, Sotiropoulou-Bonikou G, Maraziotis T, and Varakis I.

7. Prognostic significance of Hsp-27 in astrocytic brain tumors: an immunohistochemical study. Anticancer Res 17: 2677-2682, 1997.

8. Badri KR, Modem S, Gerard HC, Khan Bagchi M, Hudson AP, and Reddy TR.

9. Regulation of Sam68 activity by small heat shock protein 22. J Cell Biochem 99: 1353-1362, 2006.

10. Bagneris C, Batetnan OA, Naylor CE, Cronin N, Boelens WC, Keep NH, and? Slingsby C. Crystal structures of alpha-crystallin domain dimers of alphaB-crystallin and Hsp20. JMolBiol 392: 1242-1252, 2009.

11. Baranova EV, Beblen S, Gusev NB, and Strelkov SV. The taming of small heat-shock proteins: crystallization of the alpha-crystallin domain from human Hsp27. Acta Crystallogr Sect F Struct Biol Cryst Commim 65: 1277-1281, 2009.

12. Beall A, Bagwell D, Woodrum D, Stoming ТА, Kato K, Suzuki A, Rasinussen H, and Brophy CM. The small heat shock-related protein, HSP20, is phosphorylated on serine 16 during cyclic nucleotide-dependent relaxation. J Biol Chem 21 A: 11344-11351, 1999.

13. Bellyei S, Szigeti A, Pozsgai E, Boronkai A, Gomori E, Hocsak E, Farkas R, Sumegi B, and Gallyas F, Jr. Preventing apoptotic cell death by a novel small heat shock protein. Eur J Cell Biol 86: 161-171,2007.

14. Benesch JL, Aybiib M, Robinson CV, and Aquilina JA. Small heat shock protein activity is regulated by variable oligomeric substructure. J Biol Chem 283: 28513-28517, 2008.

15. Berengian AR, Btfva MP, and Mchaourab HS. Structure and function of the conserved domain in alphaA-crystaliin. Site-directed spin labeling identifies a beta-strand located near a subunit interface. Biochemistry 36: 9951-9957, 1997.

16. Bhattacharyya J, PadmanabhaUdupa EG, Wang J, and Sharma KK. Mini-alphaB-crystallin: a functional element of alphaB-crystallin with chaperone-like activity. Biochemistry 45: 3069-3076, 2006.

17. Bolhuis S, and Richter-Landsberg C. Effect of proteasome inhibition by MG-132 on HSP27 oligomerization, phosphorylation, and aggresome formation in the OLN-93 oligodendroglia cell line. JNeurochem 2010.

18. Bova MP, Ding LL, Horwitz J, and Fung BK. Subunit exchange of alphaA-crystallin. J Biol Chem 272: 29511 -29517, 1997.

19. Bova MP, Huang Q, Ding L, and Horwitz J. Subunit Exchange, Conformational Stability, and Chaperone-like Function of the Small Heat Shock Protein 16.5 from Methanococcus jannaschii. J Biol Chem 277: 38468-38475, 2002.

20. Brophy CM, Lamb S, and Graham A. The small heat shock-related protein-20 is an actin-associated protein. J Vase Surg 29: 326-333, 1999.

21. Bruey JM, Ducasse C, Bonniaud P, Ravagnan L, Susin SA, Diaz-Latoud C, Gurbuxani S, Arrigo AP, Kroemer G, Solary E, and Garrido C. Hsp27 negatively regulates cell death by interacting with cytochrome c. Nat Cell Biol 2: 645-652, 2000.

22. Bukach OV, Glukhova AE, Seit-Nebi AS, and Gusev NB. Heterooligomeric complexes formed by human small heat shock pioteins HspBl (Hsp27) and HspB6 (Hsp20). Biochim BiophysActa 1794: 486-495, 2009.

23. Bukach OV, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Ear J Biochem 271: 291-302, 2004.

24. Cantin GT, Yi W, Lu B, Park SK, Xu T, Lee JD, and Yates JR, 3rd. Combining protein-based IMAC, peptide-based IMAC, and MudPIT for efficient phosphoproteomic analysis. JProteome Res 7: 1346-1351, 2008.

25. Carra S. The stress-inducible HspB8-Bag3 complex induces the eIF2alpha kinase pathway: implications for protein quality control and viral factory degradation? Autophagy 5: 428-429, 2009.

26. Carra S, Brunsting JF, Lambert H, Landry J, and Kampinga HH. HspB8 participates in protein quality control by a non-chaperone-hke mechanism that lequires eIF2 {alpha} phosphorylation. J Biol Chem 284: 5523-5532, 2009.

27. Carra S, Seguin SJ, and Landry J. HspB8 and Bag3: a new chaperone complex targeting misfolded proteins to macroautophagy. Autophagy 4: 237-239, 2008.

28. Carra S, Sivilotti M, Chavez ZobeLAT, Lambert H, and Landry J. HspB8, a small heat shock protein mutated in human neuromuscular disorders, has in vivo chaperone activity in cultured cells. Hum Mol Genet 14: 1659-1669, 2005.

29. Chabaud S, Lambert H, Sasseville AM, Lavoie H, Guilbault C, Massie B, Landry J, and Langelier Y. The. R1 subunit of herpes simplex virus ribonucleotide reductase has chaperone-like activity similar to Hsp27. FEBSLett 545: 213-218, 2003.

30. Charpentier AH, Bednarek AK, Daniel RL, Hawkins KA, Laflin KJ,- Gaddis S, MacLeod MC, and Aldaz CM. Effects of estrogen on global gene expression: identification of novel targets of estrogen action. Cancer Res 60: 5977-5983, 2000.

31. Ghauhan^ D, Li G, Shringarpure R, Podar K, Ohtake Y, Hideshima T, and Anderson KG. Blockade of Hsp27 overcomes Bortezomib/proteasome inhibitor PS-341 resistance in lymphoma cells. Cancer Res 63: 6174-6177, 2003.

32. Chavez Zobel AT, Loranger A, Marceau N, Theriault JR, Lambert H, and Landry

33. J. Distinct chaperone mechanisms can delay the formation of aggresomes by the myopathy-causing R120G alphaB-crystallin mutant. Hum Mol Genet 12: 1609-1620, 2003.

34. Chen J, Feige MJ, Franzmann TM, Bepperling A, and Buchner J.' Regions outside the alpha-crystallin domain of the small heat shock protein Hsp26 are required for its dimerization. J Mol Biol 398: 122-131,2010.

35. Chowdary TK, Raman B, Ramakrishna T, and Rao CM: Mammalian Hsp22 is a heat-inducible small heat-shock protein with chaperone-like activity. Biochem J 381: 379-387, 2004.

36. Chu G, Egnaczyk GF, Zhao W, Jo SH, Fan GC, Maggio JE, Xiao RP, and Kranias

37. EG. Phosphoproteome analysis of cardiomyocytes subjected to beta-adrenergic stimulation: identification and characterization of a cardiac heat shock protein p20. Circ Res 94: 184-193, 2004.

38. Ciocca DR, and Calderwood SK. Heat shock proteins in cancer: diagnostic, prognostic, predictive, and treatment implications. Cell Stress Chaperones 10: 86-103, 2005.

39. Clark JI, and Huang QL. Modulation of the chaperone-like activity of bovine alpha-crystallin. Proc Natl Acad Sci USA 93: 15185-15189, 1996.

40. Claxton DP, Zou P, and McHaourab HS. Structure and orientation of T4 lysozyme bound to the small heat shock protein alpha-crystallin. J Mol Biol 375: 1026-1039, 2008.

41. Crippa V, Carra S, Rusmini P, Sau D, Bolzoni E, Bendotti C, De Biasi S, and Poletti A. A role of small heat shock protein B8 (HspB8) in the autophagic removal of misfolded proteins responsible for neurodegenerative diseases. Antopliagy 6: 2010.

42. Das KP, Petrash JM, and Surewicz WK. Conformational properties of substrate proteins bound to a molecular chaperone alpha-crystallin. J Biol Chem 271: 10449-10452, 1996.

43. Dephoure N, Zhou C, Villen J, Beausoleil SA, Bakalarski CE, Elledge SJ, and Gygi

44. SP. A quantitative atlas of mitotic phosphorylation. Proc Natl Acad Sci USA 105: 1076210767, 2008.

45. Depre C, Hase M, Gaussin V, Zajac A, Wang L, Hittinger L, Ghaleh B, Yu X, Kudej RK, Wagner T, Sadoshima J, and Vatner SF. Hll kinase is a novel mediator of myocardial hypertrophy in vivo. Circ Res 91: 1007-1014, 2002.

46. Depre C, Kim SJ, John AS, Huang Y, Rimoldi OE, Pepper JR, Dreyfus GD, Gaussin V, Pennell DJ, Vatner DE, Camici PG, and Vatner SF. Program of cell survival underlying human and experimental hibernating myocardium. Circ Res 95: 433-440, 2004.

47. Depre C, Tomlinson JE, Kudej RK, Gaussin V, Thompson E, Kim SJ, Vatner DE, Topper JN, and Vatner SF. Gene program for cardiac cell survival induced by transient ischemia in conscious pigs. Proc Natl Acad Sci USA 98: 9336-9341, 2001.

48. Dreiza CM, Komalavilas P, Furnish EJ, Flynn CR, Sheller, MR, Smoke CC, Lopes LB, and Brophy CM. The small heat shock protein, HSPB6, in muscle function and disease. Cell Stress Chaperones 15: 1-11, 2010.

49. Ehrnsperger M, Graber S, GaestelsM, and Buchner J. Binding of non-native protein to Hsp25 during heat shock creates a reservoir of folding intermediates for reactivation. EMBO J 16: 221-229,1997.

50. Fan>GC, Chu G, and KraniasEG. Hsp20 and its cardioprotection. Trends Cardiovasc Med 15: 138-141,2005.

51. Fan GC, Chu?G, Mitton B, Song Q, Yuan Q, and Kranias EG. Small heat-shock protein Hsp20 phosphorylation inhibits beta-agonist-induced cardiac apoptosis. Circ Res 94: 1474-1482, 2004.

52. Fan GC, Ren X, Qian >J, Yuan Q, Nicolaou P, Wang Y, Jones WK, Chu G, and Kranias' EG. Novel cardioprotective role of a small heat-shock protein, Hsp20, against ischemia/reperfusioninjury. Circulation 111: 1792-1799, 2005.

53. Fan GC, Yuan Q, Song G, Wang Y, Chen G, Qian J; Zhou X, Lee YJ, Ashraf M, and Kranias EG. Small heat-shock protein Hsp20 attenuates beta-agonist-mediated cardiac remodeling through apoptosis signal-regulating kinase 1. Circ Res 99: 1233-1242, 2006.

54. Fan GC, Zhou X, Wang X, Song G, Qian J, Nicolaou P, Chen G, Ren X, and Kranias EG. Heat shock protein 20 interacting with phosphorylated Akt reduces doxorubicin-triggered oxidative stress and cardiotoxicity. Circ Res 103: 1270-1279, 2008.

55. Fontaine JM, Sun X, Benndorf R, and Welsh MJ. Interactions of HSP22 (HSPB8) with HSP20, alphaB-crystallin, and HSPB3. Biochem Biophys Res Commun 337: 1006-1011, 2005.

56. Fontaine JM, Sun X, Hoppe AD, Simon S, Vicart P, Welsh MJ, and Benndorf R.

57. Abnormal small heat shock protein interactions involving neuropathy-associated HSP22 (HSPB8) mutants. Faseb J 20: 2168-2170, 2006.

58. Fontanella B, Birolo L, Infusini G, Cirulli C, Marzullo L, Pucci P, Turco MC, and Tosco A. The co-chaperone BAG3 interacts with the cytosolic chaperonin CCT: new hints for actin folding. Int J Biochem Cell Biol 42: 641-650, 2010.

59. Fuchs M, Poirier DJ, Seguin SJ, Lambert H, Carra S, Charette SJ, and Landry J.1.entification of the key structural motifs involved in HspB8/HspB6-Bag3 interaction. Biochem /425: 245-255, 2010.

60. Furnish EJ, Brophy CM, Harris VA, Macomson S, Winger J, Head GA, and Shaver

61. EG. Treatment with transducible phosphopeptide analogues of the small heat shock-related protein, HSP20, after experimental subarachnoid hemorrhage: prevention and reversal of delayed decreases in cerebral perfusion. JNeurosurg 112: 631-639, 2010.

62. Gaestel M, Schroder W, Benndorf R, Lippmann C, Buchner K, Hucho F, Erdmann VA, and Bielka H. Identification of the phosphorylation sites of the murine small heat shock protein hsp25. J Biol Chem 266: 14721-14724, 1991.

63. Ghosh JG, and Clark JI. Insights into the domains required for dimerization and assembly of human alphaB crystallin. Protein Sci 14: 684-695, 2005.

64. Ghosh JG, Estrada MR, and Clark JI. Interactive domains for chaperone activity in the small heat shock protein, human alphaB crystallin. BiochemisUy 44: 14854-14869, 2005.

65. Ghosh JG, Estrada MR, and Clark JI. Structure-based analysis of the beta8 interactive sequence of human alphaB crystallin. Biochemistry 45: 9878-9886, 2006.

66. Ghosh JG, Estrada MR, Houck SA, and Clark JI. The function of the beta3 interactive domain in the small heat shock protein and molecular chaperone, human alphaB crystallin. Cell Stress Chaperones 11: 187-197,2006.

67. Gober MD, Smith CC, Ueda K, Toretsky JA, and Aurelian L. Forced expression of the HI 1 heat shock protein can be regulated by DNA methylation and trigger apoptosis in human cells. J Biol Chem 278: 37600-37609, 2003.

68. Gober MD, Wales SQ, and Aurelian ,L. Herpes simplex virus type 2 encodes a heat shock protein homologue with apoptosis regulatory functions. Front Biosci 10: 2788-2803, 2005.

69. Gonzalez FA, Radenf DL, and'Davis RJ: Identification of substrate recognition determinants for human ERK1 and ERK2 protein kinases. J Biol Chem 266: 22159-22163, 1991.

70. Halaby DM, and Mornon JP. The immunoglobulin superfamily: an insight on its tissular, species, and functional diversity. JMolEvol 46: 389-400, 1998.

71. Hase M, Depre C, Vainer SF, andSadoshima J. Hll has dose-dependent and dual hypertrophic and proapoptotic functions in cardiac myocytes. Biochem J388: 475-483,2005.

72. Haslbeck M. sHsps and their role in the chaperone network. Cell Mol Life Sci 59: 16491657, 2002.

73. Haslbeck M; Ignatiou A, Saibil H, Helmich S, Frenzl E, Stromer T, and Buchner J.'

74. A domain in the N-terminal part of Hsp26 is essential for chaperone function and oligomerization. J Mol Biol 343: 445-455, 2004.

75. Haslbeck M, Walke S, Stromer T, Ehrnsperger M, White HE, Chen S, Saibil HR, and Buchner J. Hsp26: a temperature-regulated chaperone. EMBO J18: 6744-6751, 1999.

76. Havasi A, Li Z, Wang Z, Martin JL, Botla V, Ruchalski K, Schwartz JH, and Borkan SC. Hsp27 inhibits Bax activation and apoptosis via a phosphatidylinositol 3-kinase-dependent mechanism. J Biol Chem 283: 12305-12313, 2008.

77. Hayes D, Napoli V, Mazurkie A, Stafford WF, and Graceffa P. Phosphorylation dependence of hsp27 multimeric size and molecular chaperone function. J Biol Chem 284: 18801-18807, 2009.

78. Hedhli N, Wang L, Wang Q, Rashed E, Tian Y, Sui X, Madura K, and Depre C.

79. Proteasome activation during cardiac hypertrophy by the chaperone Hll Kinase/Hsp22. Cardiovasc Res 77: 497-505, 2008.

80. Horwitz J, Bova MP, Ding LL, Haley DA, and Stewart PL. Lens alpha-crystallin: function and structure. Eve 13 ( Pt 3b): 403-408, 1999.

81. Horwitz J, Huang QL, Ding L, and Bova MP. Lens alpha-crystallin: chaperone-like properties. Methods Enzymol 290: 365-383, 1998.

82. Hu Z, Yang B, Lu W, Zhou W, Zeng L, Li T, and Wang X. HSPB2/MKBP, a novel and unique member of the small heat-shock protein family. J Neurosci Res 86: 2125-2133, 2008.

83. Huang Q, Ye J, Chen W, Wang L, Lin W, Lin J, and Lin X. Heat shock protein 27 is over-expressed in tumor tissues and increased in sera of patients with gastric adenocarcinoma. Clin Chem Lab Med48: 263-269, 2010.

84. Ito H, Kamei K, Iwamoto I, lnaguina Y, Nohara D, and Kato K. Phosphorylation-induced change of the oligomerization state of alpha B- crystallin. J Biol Chem 276: 5346-5352, 2001.

85. Jakob U, Gaestel M, Engel K, and Buchner J. Small heat shock proteins are molecular chaperones. J Biol Chem 268: 1517-1520, 1993.

86. Jaya N, Garcia V, and Vierling E. Substrate binding site flexibility of the small heat shock protein molecular chaperones. Proc Natl Acad Sci U SA 106: 15604-15609, 2009.

87. Kampinga HH, Hageman J, Vos MJ, Kubota H, Tanguay RM, Bruford EA, Cheetham ME, Chen B, and Hightower LE. Guidelines for the nomenclature of the human heat shock proteins. Cell Stress Chaperones 14: 105-111, 2009.

88. Kappe G, Boelens WC, and de Jong WW. Why proteins without an alpha-crystallin domain should not be included in the human small heat shock protein family HSPB. Cell Sti ess Chaperones 2009.

89. Kappe G, Franck E, Verschuure P, Boelens WC, Leunissen JA, and de Jong WW.

90. The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones 8: 53-61, 2003.

91. Kasakov AS, Bukach OV, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Effect of mutations in the beta5-beta7 loop on the structure and properties of human small heat shock protein HSP22 (HspB8, Hll). FehsJllA: 5628-5642, 2007.

92. Kato K, Goto S, Inaguma Y, Hasegawa K, Morishita R, and Asano T. Purification and characterization of a 20-kDa protein that is highly homologous to alpha B crystallin. J Biol Chem 269: 15302-15309, 1994.

93. Kato K, Ito IT, Kamei K, Inaguma Y, Iwamoto I, and Saga S. Phosphorylation of alphaB-crystallin in mitotic cells and identification of enzymatic activities responsible for phosphoiylation. J Biol Chem 273: 28346-28354, 1998.

94. Kazakov AS, Markov DI, Gusev NB, and Levitsky DI. Thermally induced structural changes of intrinsically disordered small heat shock protein Hsp22. Biophys Chem 145: 79-85, 2009.

95. Kim KK, Kim R, and Kim SH. Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature 394: 595-599, 1998.

96. Kim MV, Kasakov AS, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Structure and properties of K141E mutant of small heat shock protein HSP22 (HspB8, Hll) that is expressed in human neuromuscular disorders. Arch Biochem Biophys 454: 32-41, 2006.

97. Kim MV, Seit-Nebi AS, and Gusev NB. The problem of protein kinase activity of small heat shock protein Hsp22 (HI 1 or HspB8). Biochem Biophys Res Commiin 325: 649-652, 2004.

98. Kim MV, Seit-Nebi AS, Marston SB, and Gusev NB. Some properties of human small heat shock protein Hsp22 (HI 1 or HspB8). Biochem Biophys Res Comnnm 315: 796-801, 2004.

99. Kiss AJ, Mirarefi AY, Ramakrishnan S, Zukoski CF, Devries AL, and Cheng CH. Cold-stable eye lens crystallins of the Antarctic nototheniid toothfish Dissostichus mawsoni Norman. J Exp Biol 207: 4633-4649, 2004.

100. Kostenko S, and Moens U. Heat shock protein 27 phosphorylation: kinases, phosphatases, functions and pathology. Cell Mol Life Sci 66: 3289-3307, 2009.

101. Kumar A, and Singh S. Interaction of chaperone alpha-crystallin with unfolded state of alpha-amylase: Implications for reconstitution of the active enzyme. Int J Biol Macromol 45: 493-498, 2009.

102. Kumar MS, Koteiche HA, Claxton DP, and McHaourab HS. Disulfide cross-links in the interaction of a cataract-linked alphaA-crystallin mutant with betaBl-crystallin. FEBS Lett 583: 175-179,2009.

103. Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227: 680-685, 1970.

104. Lambert H, Charette SJ, Bernier AF, Guimond A, and Landry J. HSP27 multimerization mediated by phosphorylation-sensitive intermolecular interactions at the amino terminus. J Biol Chem 274: 9378-9385, 1999.

105. Landry J, Lambert H, Zhou M, Lavoie JN, Hickey E, Weber LA, and Anderson

106. CW. Human HSP27 is phosphorylated at serines 78 and 82 by heat shock and mitogen-activated kinases that recognize the same amino acid motif as S6 kinase II. J Biol Chem 267: 794-803, 1992.

107. Laskovvska E, Matuszewska E, and Kuczynska-Wisnik D. Small heat shock proteins and protein-misfolding diseases. Ctirr Pharm Biotechnol 11: 146-157, 2010.

108. Latham JC, Stein RA, Bornhop DJ, and McHaourab HS. Free-solution label-free detection of alpha-crystallin chaperone interactions by back-scattering interferometry. Anal ChemU: 1865-1871,2009.

109. Lee GJ, Roseman AM, Saibil HR, and Vierling E. A small heat shock protein stably binds heat-denatured model substrates and can maintain a substrate in a folding-competent state. EMBOJX6: 659-671, 1997.

110. Lehr S, Kotzka J, Avci H,'Sickmann A, Meyer HE, Herkner A, and MuIIer-Wieland"

111. D. Identification of major ERK-related phosphorylation sites in Gabl. Biochemistry 43: 1213312140, 2004.

112. Lelj-Garolla B, and Mauk AG. Self-association and chaperone activity of Hsp27 are thermally activated. J Biol Chem 281: 8169-8174, 2006.

113. Leroux MR, Ma BJ, Batelier G, Melki R, and Candido EP. Unique structural features of a novel class of small heat shock proteins. J Biol Chem 272: 12847-12853, 1997.

114. Leroux MR, Melki R, Gordon B, Batelier G, and Candido EP. Structure-function studies on small heat shock protein oligomeric assembly and interaction with unfolded polypeptides. J Biol Chem 272: 24646-24656, 1997.

115. Lindner RA, Kapur A, and Carver JA. The interaction of the molecular chaperone, alpha-crystallin, with molten globule states of bovine alpha-lactalbumin. J Biol Chem 272: 27722-27729, 1997.

116. Lindner RA, Kapur A, Mariani M, Titmuss SJ, and Carver JA. Structural alterations of alpha-crystallin during its chaperone action. Eur J Biochem 258: 170-183, 1998.

117. Lindner RA, Treweek TM, and Carver JA. The molecular chaperone alpha-crystallin is in kinetic competition with aggregation to stabilize a monomelic molten-globule form of alpha- lactalbumin. Biochem J 354: 79-87,2001.

118. Mao YW, Liu JP, Xiang H, and Li DW. Human alphaA- and alphaB-crystallins bind to Bax and Bcl-X(S) to sequester their translocation during staurosporine-induced apoptosis. Cell Death Differ 11: 512-526, 2004.

119. Markov DI, Pivovarova AV, Chernik IS, Gusev NB, and Levitsky DI. Small heat shock protein Hsp27 protects myosin SI from heat-induced aggregation, but not from thermal denaturation and ATPasc inactivation. FEBSLett 582: 1407-1412, 2008.

120. McColIum AK, Casagrande G, and Kohn EC. Caught in the middle: the role of Bag3 in disease. Biochem J425: el-3, 2010.

121. McHaourab HS, Godar JA, and Stewart PL. Structure and mechanism of protein stability sensors: chaperone activity of small heat shock proteins. Biochemistry 48: 3828-3837, 2009.

122. Muchowski PJ, Hays LG, Yates JR, 3rd, and» Clark JI. ATP and the core "alpha-Crystallin" domain of the small heat-shock protein alphaB-crystallin. J Biol Chem 274: 3019030195, 1999.

123. Mymrikov EV, Bukach OV, Seit-Nebi AS, and Gusev NB. The pivotal role of the beta 7 strand in the intersubunit contacts of different human small heat shock proteins. Cell Stress Chaperones 15: 365-377, 2010.

124. Panasenko OO, Seit Nebi A, Bukach OV, Marston SB, and Gusev NB. Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim Biophys Acta 1601:64-74, 2002.

125. Paul C, Manero F, Gonin S, Kretz-Remy C, Virot S, and Arrigo AP. Hsp27 as a negative regulator of cytochrome C release. Mol Cell Biol 22: 816-834, 2002.

126. Permyakov EA, and Burstein EA. Some aspects of studies of thermal transitions in proteins by means of their intrinsic fluorescence. Biophys Chem 19: 265-271, 1984.

127. Peschek J, Braun N, Franzmann TM, Georgalis Y, Haslbeck M, Weinkauf S, and Buchner J. The eye lens chaperone alpha-crystallin forms defined globular assemblies. Proc Natl Acad Sci U S A 106: 13272-13277,2009.

128. Pipkin W, Johnson JA, Creazzo TL, Burch J, Komalavilas P, and Brophy C.1.calization, macromolecular associations, and function of the small heat shock-related protein HSP20 in rat heart. Circulation 107: 469-476, 2003.

129. Raman B, Ramakrishna T, and Rao CM. Rapid refolding studies on the chaperone-like alpha-crystallin. Effect of alpha-crystallin on refolding of beta- and gamma-crystallins. J Biol Chem 270: 19888-19892, 1995.

130. Reddy GB, Das KP, Petrash JM, and Surewicz WK. Temperature-dependent chaperone activity and structural properties of human alphaA- and alphaB-crystallins. J Biol Chem 275: 4565-4570, 2000.

131. Santhoshkumar P, and Sharma KK. Analysis of alpha-crystallin chaperone function using restriction enzymes and citrate synthase. Mol Vis 7: 172-177, 2001.

132. Schaub MC, and Perry SV. The relaxing protein system of striated muscle. Resolution of the troponin complex into inhibitory and calcium ion-sensitizing factors and their relationship to tropomyosin. BiochemJ 115: 993-1004, 1969.

133. Scopes RK. Measurement of protein by spectrophotometry at 205 nm. Anal Biochem 59: 277-282, 1974.

134. Sharma KK, Kaur H, and Kester K. Functional elements in molecular chaperone alpha-crystallin: identification of binding sites in alpha B-crystallin. Biochem Biophys Res Commun 239: 217-222, 1997.

135. Sharma KK, Kumar GS, Murphy AS, and Kester K. Identification of l,l'-bi(4-anilino)naphthalene-5,5'-disulfonic acid binding sequences in alpha-crystallin. J Biol Chem 273: 15474-15478, 1998.

136. Sharma KK, Kumar RS, Kumar GS, and Quinn PT. Synthesis and characterization of a peptide identified as a functional element in alphaA-crystallin. J Biol Chem 275: 3767-3771, 2000.

137. Sreerama N, and Woody RW. Computation and analysis of protein circular dichroism spectra. Methods Enzymol 3 83: 318-351, 2004.

138. Stamler R, Kappe G, Boelens W, and; Slingsby C. Wrapping the alpha-crystallin domain fold in a chaperone assembly. JMol Biol 353: 68-79, 2005.

139. Stetler RA, Gao Y, Signore AP, Cao G, and'Chen J. HSP27: mechanisms of cellular protection against neuronal injury. Curr Mol Med 9: 863-872,2009.

140. Sun X, Fontaine JM, BartI I, Behnam B, Welsh MJ, and Benndorf R. Induction of Hsp22 (HspB8) by estrogen and the metalloestrogen cadmium in estrogen receptor-positive breast cancer cells. Cell Stress Chaperones 12: 307-319, 2007.

141. Sun X, Fontaine JM, Rest JS, Shelden EA, Welsh MJ, and Benndorf R. Interaction of human HSP22 (HSPB8) with other small heat shock proteins. J Biol Chem 279: 2394-2402, 2004.

142. Sun X, Welsh MJ, and Benndorf R. Conformational changes resulting from pseudophosphorylation of mammalian small heat shock proteins—a two-hybrid study. Cell Stress Chaperones 11: 61-70, 2006.

143. Takayama S, and Reed JC. Molecular chaperone targeting and regulation by BAG family proteins. Nat Cell Biol 3: E237-241, 2001.

144. Taylor RP, and Benjamin IJ. Small heat shock proteins: a new classification scheme in mammals. J Mol Cell Cardiol 38: 433-444, 2005.

145. Tessier DJ, Komalavilas P, Panitch A, Joshi L, and Brophy CM. The small heat shock protein (HSP) 20 is dynamically associated with the actin cross-linking protein actinin. J Surg Res 111: 152-157,2003.

146. Theriault JR, Lambert H, Chavez-Zobel AT, Charest G, Lavigne P, and Landry J.

147. Essential role of the NH2-terminal WD/EPF motif in the phosphorylation-activated protective function of mammalian Hsp27. J Biol Chem 279: 23463-23471, 2004.

148. Trent S, Yang C, Li C, Lynch M, and Schmidt EV. Heat shock protein B8, a cyclin-dependent kinase-independent cyclin D1 target gene, contributes to its effects on radiation sensitivity. Cancer Res 67: 10774-10781, 2007.

149. Treweek TM, Rekas A, Lindner RA, Walker MJ, Aquilina JA, Robinson CV, Horwitz J, Der Perng M, Quinlan RA, and Carver JA. R120G alphaB-crystallin promotes the unfolding of reduced alpha-lactalbumin and is inherently unstable. Febs J 272: 711-724, 2005.

150. Trigon S, Serizawa H, Conaway JW, Conaway RC, Jackson SP, and1 Mo range M. Characterization of the residues phosphorylated in vitro by different C-terminal domain kinases. J Biol Chem 273: 6769-6775, 1998.

151. Veinger L, Diamant S, Buchner J; and Goloubinoff P: The small heat-shock protein IbpB from Escherichia coli stabilizes stress-denatured proteins for subsequent refolding by a multichaperone network. J Biol Chem 273: 11032-11037, 1998.

152. Villen J, Beausoleil SA, Gerber SA, and Gygi SP. Large-scale phosphorylation analysis of mouse liver. Proc Natl Acad Sci USA 104: 1488-1493, 2007.

153. Wang L, Zajac A, Hedhli N, and Depre C. Increased expression of Hll kinase stimulates glycogen synthesis in the heart. Mol Cell Biochem 265: 71-78, 2004.

154. Wang X, Zingarelli B, O'Connor M, Zhang P, Adeyemo A, Kranias EG, Wang Y, and Fan GC. Overexpression of Hsp20 prevents endotoxin-induced myocardial dysfunction and apoptosis via inhibition of NF-kappaB activation. J Mol Cell Cardiol 47: 382-390, 2009.

155. Wilhelmus MM, Boelens WC, Otte-Holler I, Kamps B, de Waal RM, and Verbeek MM. Small heat shock proteins inhibit amyloid-beta protein aggregation and cerebrovascular amyloid-beta protein toxicity. Brain Res 1089: 67-78, 2006.

156. Wilhelmus MM, Otte-Holler I, Wesseling P, de Waal RM, Boelens WC, and Verbeek MM. Specific association of small heat shock proteins with the pathological hallmarks of Alzheimer's disease brains. Neuropathol Appl Neurobiol 32: 119-130, 2006.

157. Ким MB. Структура и свойства малого белка теплового шока Hsp22 и его точечного мутанта, эксперссируемого при дистальной моторной нейропатии II типа. In: Кафедра биохимии. Москва: МГУ им. М.В. Ломоносова, 2005.

158. Микулин ВП. Фопгографический рецептурный справочник. Москва: Искусство, 1963.

Информация о работе

Шеметов, Антон Александрович
кандидата биологических наук
Москва, 2010
ВАК 03.01.04

Диссертация

Влияние фосфорилирования на структуру и шапероноподобную активность малого белка теплового шока человека Hsp22 - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы