Физико-химические и шапероноподобные свойства малого белка теплового шока Hsp22 человека

Казаков, Алексей Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Физико-химические и шапероноподобные свойства малого белка теплового шока Hsp22 человека
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Физико-химические и шапероноподобные свойства малого белка теплового шока Hsp22 человека"

□□3484453

На правах рукописи

КАЗАКОВ Алексей Сергеевич

Физико-химические и шапероноподобиые свойства малого белка теплового шока Нвр22 человека

Специальность 03.00.04 - биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 6 НОЯ 2009

Москва 2009

003484453

Работа выполнена в лаборатории молекулярной организации биологических структур Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН и на кафедре биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Д.И. Левицкий

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор В.И. Муронец

доктор физико-математических наук А.К. Цатурян

Ведущая организация:

Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН

Защита состоится «17» декабря 2009 года в _ часов на заседании

диссертационного совета Д 002.247.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора и кандидата наук при Учреждении Российской академии наук Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, д. 33, корп. 1.

Автореферат разослан «_» ноября 2009 года

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Малые белки теплового шока (sHsp) - это широко распространенное семейство белков стресса. Размеры мономеров малых белков теплового шока колеблются от 12 до 43 кДа. Все эти белки объединены в одну группу из-за наличия в их структуре высококонсервативного участка, который впервые был обнаружен в а-кристаллинах хрусталика глаза и получил название кристаллинового домена. Функционально, большинство sHsp in vitro обладают шапероноподобной активностью, т.е. способностью защищать белки, подвергающиеся денатурации в неблагоприятных условиях, от аморфной агрегации. In vivo sHsp вовлечены в большое количество разнообразных процессов, таких как усиление устойчивости к стрессам, регуляция динамики актиновых и промежуточных филаментов, ингибирование апоптоза, изменение текучести мембран и др.

В настоящее время у человека описано 10 классов малых белков теплового шока. Из них подробно изучены только осА- и аВ-кристаллины, а также малый белок теплового шока с молекулярной массой 27 кДа (Hsp27 или HspBl).

Сравнительно недавно появились первые сведения о малом белке теплового шока человека с кажущейся молекулярной массой 22 кДа (Hsp22, также обозначаемом как HspB8 или HI 1 киназа). Точечные мутации К141Е или K141N в Hsp22 коррелируют с развитием тяжелых нейропатий. Мутация Hsp22 по данному остатку гомологична мутации Hsp27 по 140 остатку, и в случае Hsp27 также приводит к развитию тяжелых наследственных заболеваний. В структуре Hsp27 есть еще несколько аминокислотных остатков, подверженных мутациям, и в их числе - остаток 136, гомологичный остатку 137 в Hsp22. Мутация этого остатка также сопровождается развитием тяжелых нейродегенеративных заболеваний. Высказывается предположение о том, что в структуре малых белков теплового шока есть своеобразные «горячие точки», мутации которых приводят к развитию врожденных заболеваний. Структура и свойства Hsp22 изучены недостаточно полно и поэтому до последнего времени не было сведений о том, как влияют мутации вблизи так называемых «горячих точек» на структуру и свойства Hsp22. Тем не менее, имеющиеся в литературе сведения позволяют предположить, что Hsp22 отличается по своей структуре от других малых белков теплового шока; было даже высказано предположение о том, что Hsp22 принадлежит к быстро растущему семейству белков с разупорядоченной третичной структурой (т.н. «intrinsically disordered proteins», ГОР). Все эти предположения требовали подтверждений. Вследствие этого, одной из главных целей данной работы стало подробное исследование физико-химических свойств Hsp22 (в частности, проверка предположения о его принадлежности к семейству ГОР). Другой не менее важной целью настоящей работы было исследование свойств Hsp22 с точечными заменами остатков лизина 137 и 141 (К137Е, К141Е и К137/141Е), расположенных в области, наиболее подверженной мутациям в других малых белках теплового шока.

Цель и задачи работы. Итак, целью данной работы было подробное исследование физико-химических свойств Hsp22, а также влияния точечных замен К137Е, К141Е и К137/141Е на структуру и свойства Hsp22. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:

1. Различными методами исследовать особенности вторичной, третичной и четвертичной структуры Hsp22, включая подробное изучение процесса его тепловой денатурации.

2. Изучить влияние точечных замен К137Е, К141Е и К137/141Е на структурные свойства и шапероноподобную активность Hsp22.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Получены доказательства того, что Hsp22 относится к семейству белков с разупорядоченной третичной структурой (ГОР). Тепловая денатурация Hsp22 протекает в виде непрерывного теплового перехода (т.н. "downhill unfolding").

2. В отличие от других малых белков теплового шока человека, исследованных к настоящему времени, Hsp22 не образует крупных олигомеров даже в условиях, близких к условиям теплового шока.

3. Точечные замены К137Е, К141Е и К137/141Е оказывают дестабилизирующее влияние на структуру Hsp22, что заметно отражается на его шапероноподобной активности.

Научная новизна. Впервые проведен детальный анализ структуры и свойств малого белка теплового шока Hsp22 человека. Получены убедительные доказательства наших предположений о том, что Hsp22, в отличие от всех исследованных к настоящему времени малых белков теплового шока, относится к семейству белков с разупорядоченной третичной структурой (ГОР). В работе был применен практически весь набор методов, позволяющих изучать изменения во вторичной и третичной структуре белка в процессе его тепловой денатурации. Оказалось, что разные методы, использованные для исследования тепловой денатурации Hsp22, дают разные результаты: они либо вообще не выявляют выраженных тепловых переходов, либо выявляют их, но при этом температура полуперехода может существенно варьировать в зависимости от используемого метода. Именно такой тип поведения был ранее предсказан при математическом моделировании процесса тепловой денатурации белков, демонстрирующих непрерывный переход ("downhill unfolding"), и наши данные являются одним из первых экспериментальных подтверждений этого предсказания. При исследованиях олигомерного состояния Hsp22 установлено, что он, в отличие от других малых белков теплового шока человека, не образует крупных олигомеров даже в условиях, близких к условиям теплового шока. Показано, что точечные замены К137Е, К141Е и К137/141Е оказывают

дестабилизирующее влияние на структуру Шр22 и снижают его шапероноподобную активность; именно этим, по-видимому, можно объяснить тот факт, что подобные мутации в малых белках теплового шока ассоциированы с развитием тяжелых нейродегенеративных заболеваний.

Научно-практическая значимость. Полученные данные расширяют и углубляют знания в области структуры и свойств малых белков теплового шока, а также представляют несомненную важность для исследования тех функций, которые Нзр22 осуществляет в клетке. Разработанные в процессе работы экспериментальные подходы -такие, например, как параллельное исследование температурных зависимостей различных параметров, измеряемых разными методами, могут использоваться (и уже успешно используются) для структурно-функциональных исследований других белков

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на XIII и XVI Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов 2006» (г. Москва, 2006) и «Ломоносов 2009» (г. Москва, 2009), на IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (г. Казань, 2009) и на 7-м Европейском Конгрессе Биофизического общества ЕВ5А2009 (Италия, г. Генуя, 2009, симпозиальный доклад).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ (3 статьи в рецензируемых журналах и 4 тезисов).

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (3 главы), описания материалов и методов исследования, изложения результатов (5 глав), их обсуждения (2 главы), выводов и списка цитируемой литературы (183 источника). Диссертация изложена на 145 страницах, содержит 57 рисунков и 7 таблиц.

Список использованных сокращений приведен на странице 25 автореферата.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Обзор литературы

В обзоре литературы рассматриваются известные к настоящему времени сведения о структуре и свойствах малых белков теплового шока (особое внимание уделяется при этом свойствам Н5р22), а также анализируются имеющиеся в литературе данные о белках с разупорядоченной третичной структурой (ГОР) и о белках, демонстрирующих непрерывные переходы в процессе тепловой денатурации.

Материалы и методы исследования

Рекомбинантные малые белки теплового шока — Hsp22 дикого типа (WT) и с точечными заменами остатков лизина 141, 137 или одновременно 141 и 137 на остатки глутатаминовой кислоты (К141Е, К137Е и К137/141Е, соответственно) экспрессировали в клетках E.coli линии BL21-DE3 и очищали методом гидрофобной хроматографии на Phenyl-Sepharose с последующей гель-хроматографией на Sephacryl SI00. Hsp27 дикого типа и Hsp27-3D (псевдофосфорилированный Hsp27 с точечными заменами S15D, S78D и S82D) были любезно предоставлены профессором Н.Б. Гусевым (кафедра биохимии Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова). Актин выделяли из ацетонового порошка скелетных мышц и очищали двумя циклами полимеризации-деполимеризации.

Спектры кругового дихроизма ОСШ в дальней ультрафиолетовой области регистрировали в интервале 198-252 нм на дихрографе Mark V, используя кюветы с длиной оптического пути 0,05 см. Спектры снимали 8-10 раз, усредняли и вычитали спектр буфера.

Трипсинолиз Hsp22 проводили в 20 мМ трис-ацетатном буфере, рН 7,6, содержащем 10 мМ NaCl и 30 мМ Р-меркаптоэтанол (Д-МЭ), при температуре 37°С. Весовое соотношение трипсина к Hsp22 составляло 1:12000. Реакцию начинали добавлением трипсина (ТРСК-трипсин, Sigma) и останавливали через 0, 5, 10, 15, 20, 40 или 60 мин, добавляя в инкубационную пробу PMSF до конечной концентрации 4,7 мМ. Полученные после трипсинолиза пробы анализировали с помощью электрофореза в 15 % SDS-ПААГ. Электрофореграммы сканировали и определяли интенсивность полосы интактного белка с помощью программы OneDscan, затем строили кривую убыли субстрата во времени.

Эксперименты по седиментационному анализу проводили на аналитической ультрацентрифуге «Весктап», модель Е, с использованием абсорбционной сканирующей системы. Через определенные промежутки времени после достижения скорости вращения ротора 56000 об/мин регистрировали распределение по длине ячейки вещества, поглощающего при 290 нм. Для определения коэффициента седиментации и коэффициента диффузии использовали программу SEDFIT (http://www.analyticalultracentrifugation.com), основанную на численном решении уравнения Ламма. Автор глубоко признателен д.б.н. Н.А. Чеботаревой за помощь при анализе результатов седиментационного анализа.

Для анализа гидрофобных свойств Hsp22 использовали гидрофобный зонд Bis-ANS. Свободный Bis-ANS в воде флуоресцирует очень слабо, но при связывании с гидрофобными участками белка квантовый выход флуоресценции Bis-ANS резко увеличивается и одновременно происходит коротковолновой сдвиг максимума флуоресценции. Все измерения проводили при 37°С в 50 мМ К-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 150 мМ NaCl и 2 мМ ДТТ. Флуоресценцию возбуждали светом с длиной волны 395 нм и регистрировали при фиксированной длине волны 500 нм.

Агрегацию роданазы индуцировали повышением температуры до 44°С. В кювете смешивали растворы роданазы, Hsp22 и ДТТ (до конечной концентрации 1 мМ), преинкубировали при 37°С и регистрировали прирост кажущейся оптической плотности при 360 нм на спектрофотометре при 44°С. Конечные концентрации Hsp22 дикого типа (или с заменами К141Е, К137Е и К137/141Е) в пробе варьировали от 0 до 0,24 мг/мл, конечная концентрация роданазы составляла 0,2 мг/мл.

Исследования температурных зависимостей параметров триптофановой флуоресценции проводили на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Vanan Inc.), оснащенном Пельтье-контролируемым кюветодержателем и термодатчиком. Исследования проводили при двух разных концентрациях белка - 0,1 и 0,6 мг/мл в 50 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 150 мМ NaCl и 5 мМ Р-МЭ. Длина волны возбуждения была равна 297нм (ширина щели 5 нм); записывали либо спектры флуоресценции в диапазоне от 300 до 400 нм (ширина щели 2.5 нм), либо изменения интенсивности флуоресценции при разных длинах волн (320 и 365 нм). При работе с высокими концентрациями Hsp22 проводили коррекцию на эффект внутреннего перепоглощения. Зависимость спектров флуоресценции от температуры снимали пошагово. Пробу нагревали до заданной температуры и прописывали 3 спектра, которые потом усредняли. В целом, шаги в 5°С осуществлялись за 5 мин, поэтому средняя скорость нагрева была постоянной и приблизительно равной 1°С/мин. Из данных зависимостей получали значение спектров флуоресценции и строили зависимость данного параметра от температуры. Для характеристики формы спектра применяли т.н. параметр А (отношение интенсивности флуоресценции при 320 нм к интенсивности флуоресценции при 365 нм) [Turoverov et al., 1976]. Учитывая, что оба эти параметра (А™* и параметр А) нелинейно зависят от доли завершенности перехода, мы использовали параметрическую кривую (зависимость флуоресценции на 320 нм от флуоресценции на 365 нм, температура в данном случае является варьирующим параметром) для последующего вычисления доли перехода Hsp22 из нативного состояния в денатурированное (а) и энтальпии Вант-Гоффа для такого теплового перехода. Значения а и энтальпии Вант-Гоффа рассчитывали по методу, предложенному Е.А. Пермяковым и Э.А. Бурштейном [Permyakov & Burstein, 1984].

Калориметрические исследования проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре ДАСМ-4М (Институт биологического приборостроения РАН, г. Пущино-на-Оке) с капиллярными платиновыми ячейками объемом 0,47 мл. Эксперименты проводили в 50 мМ Na-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 150 мМ NaCl и 5 мМ Р-МЭ. Препарат белка с концентрацией 0,6-1,2 мг/мл помещали в ячейку прибора и прогревали со скоростью 1°С в минуту от 10°С до 80°С при постоянном давлении 2,2 атм. Калориметрические измерения проводили двумя способами: стандартным, когда исследуемый белок помещен в опытную ячейку, а контрольный буфер - в ячейку сравнения, и модифицированным, когда тот же белок помещен в ячейку

сравнения, а буфер - в опытную ячейку. В результате во втором случае кривая теплопоглощения на термограмме оказывалась перевернутой, а все артефакты инструментальной базовой линии располагались в тех же местах, что и при стандартных измерениях. Далее из кривой, полученной стандартным образом, вычитали кривую, полученную модифицированным способом. Это позволяло избежать артефактов, вызываемых вычитанием инструментальной базовой линии, и удвоить соотношение сигнал/шум. Затем результирующую кривую делили на два для получения реального значения этого сигнала. Данные, полученные при первом прогреве, не учитывались, т.к. ß-МЭ проявлял значительный тепловой эффект при окислении находящейся в ячейке пробы кислородом. Последующие прогревы (вплоть до пяти) были идентичны друг другу. Абсолютную теплоемкость белка рассчитывали в мкДж К'1 г1. Теплоемкость полностью развернутого состояния Hsp22 рассчитывали, используя приближение, предложенное М. Хакелем с соавторами [Hackel et al., 1999]. Теплоемкость нативного состояние Hsp22 рассчитывали, используя значения теплоемкости ингибитора трипсина из поджелудочной железы крупного рогатого скота (BPTI) [Makhatadze & Privalov, 1995], пересчитанные на молекулярную массу Hsp22.

ИК-спектры записывали на FTIR-спектрофотометре Tensor27 (Bruker), оснащенном двумя разными приставками для записи ИК-спектров белков в водных растворах - BioATR II или Confocheck. Приставка Confocheck применялась для записи спектров при пропускании ИК света через образец, а приставка BioATR II - для записи спектров на поверхности кремниевого кристалла. Измерения проводили в 50 мМ Na-фосфатном буфере, pH 7,5, содержащем 150 мМ NaCl и 5 мМ ß-МЭ. ИК-спектры Hsp22 при 20°С были записаны на обеих приставках, а запись спектров при высоких температурах проводилась только на приставке BioATR II. Спектры с разрешением 4 см"1 снимали 500-1000 раз и усредняли. Автоматическая коррекция спектров на С02 и воду (как на жидкую воду, так и на пары воды) проводилась с помощью программы OPUS 6.0 (Bruker). Эту же программу использовали для разложения спектров на индивидуальные компоненты.

Флуоресценцию тиофлавина Т (ТИТ) возбуждали светом с длиной волны 440 нм (ширина щели 5 нм) и регистрировали значения интенсивности флуоресценции при 485 нм (ширина щели 5 нм). Образцы нагревали от 20°С до 85°С со скоростью 1°С/мин. Все эксперименты проводили на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Varían), оснащенном Пельтье-контролируемым юоветодержателем и термодатчиком. Исследования проводили при концентрации белка 0,1 мг/мл в 50 мМ Na-фосфатном буфере, pH 7,5, содержащем 150 мМ NaCl и 5 мМ ß-МЭ. Концентрация ThT составляла 20 мкМ.

Тепловые переходы белков анализировали по методу, предложенному Т.Д. Бушуевой с соавторами [Bushueva et al., 1978; 1980]. Все расчеты осуществляли, используя пакет программного обеспечения "MatLab R2006b" фирмы "The Math Works, Inc." (США).

Способность Hsp22 дикого типа (или с заменами К141Е, К137Е и К137/141Е)) предотвращать индуцированную нагреванием агрегацию актиновых филаментов (Р-актина) исследовали по методике, ранее успешно примененной для изучения шапероноподобной активности Hsp27 [Pivovarova et al., 2005; 2007]. Температурные зависимости агрегации F-актина регистрировали по приросту светорассеяния на спектрофлуориметре Сагу Eclipse (Vanan Inc.), оснащенном Пельтье-контролируемым кюветодержателем и термодатчиком, нагревая образец с постоянной скоростью 1°С в минуту от 30°С до 90°С при скрещенных монохроматорах и длине волны 350 нм. Ширина щелей возбуждающего и анализирующего монохроматоров составляла 2,5 и 1,5 нм, соответственно. Концентрации F-актина и Hsp22 в пробе составляли 0,1 мг/мл. Опыты проводили в 50 мМ Ыа-фосфатном буфере, рН 7,5, содержащем 150 мМ NaCl, 5 мМ Р-МЭ и 2 мМ MgCl2.

Основные результаты и их обсуждение

Изучение вторичной структуры №р22 методом спектроскопии кругового дихроизма.

Изучение спектра кругового дихроизма (КД) в дальней ультрафиолетовой области позволяет судить о вторичной структуре белка. Спектр КД для Шр22 характеризуется малым по амплитуде отрицательным максимумом при 205-208 нм (рис. 1). Такой спектр характерен для белков, содержащих в своей структуре значительное количество (3-складок и крайне незначительное количество а-спиралей.

Рис. 1. Спектры кругового дихроизма в дальней ультрафиолетовой области для Нхр22 дикого типа и его точечных мутантов. Концентрация НБр22 и его мутантов составляла 0,75 мг/мл. Обозначения: 1 - Шр22 дикого типа; 2 и 3 - Нзр22 с мутациями К137Е и К141Е, соответственно; 4 - двойной мутант Нвр22 с мутациями К137Е и К141Е.

Точечная замена К137Е мало влияет на вторичную структуру белка, в то время как

точечные замены К141Е и К137/141Е приводят к увеличению амплитуды отрицательного

максимума и его сдвигу в коротковолновую область спектра (рис. 1). Такое изменение

спектра КД может быть обусловлено тем, что указанные замены остатков приводят к

частичному разрушению имеющихся в структуре белка Р-складок и появлению

Длина волны, нм

значительных областей с неупорядоченной структурой. Для того, чтобы проверить это предположение, мы предприняли попытку предсказать вторичную структуру белка по данным КД в дальней ультрафиолетовой области. Для этой цели мы воспользовались пакетом программ СБРго, при этом в качестве реперов был использован набор белков, содержащих в своей структуре преимущественно Р-складки и неупорядоченные элементы. Результаты такого предсказания свидетельствуют о том, что все исследуемые точечные замены аминокислотных остатков не влияют на содержание а-спиралей (около 5%), при этом замены КЫШ и К137/141Е приводят к заметному уменьшению содержания (3-складок (с 37% до 32-33%) за счет повышения содержания неупорядоченных структур.

Изучение структуры Шр22 методом ограниченного протеолиза

Для того чтобы подтвердить предположение о том, что Нэр22 является мало упорядоченным белком, нами были проведены эксперименты по ограниченному трипсинолизу. Как правило, ограниченный протеолиз проводят при весовом отношении субстрат/фермент, составляющем 100-150/1. При использовании такого соотношения Нзр22/трипсин оказалось, что уже меньше, чем через 30 сек, в пробе не остается интактного Н5р22. Путем многократных разведений исходного раствора трипсина мы установили, что за кинетикой протеолиза №р22 можно следить только при добавлении исчезающе малых концентраций трипсина. Приемлемые результаты были получены только при весовом соотношении Н5р22/трипсин, составляющем 12000-14000/1. Столь необычно высокая чувствительность к протеолизу может быть следствием того, что Шр22 обладает мало упорядоченной структурой и вследствие этого все участки расщепления доступны для действия протеазы.

Рис. 2. Кинетика убыли зоны интактного №р22 дикого типа или с заменами аминокислотных остатков в ходе трипсинолиза. По оси абсцисс отложено время инкубации, по оси ординат - натуральный логарифм отношения интенсивности

электрофоретической полосы

интактного белка в момент времени инкубации к интенсивности полосы интактного белка в начальный момент времени. Обозначения: 1 - №р22 дикого типа; 2 и 3 - Н5р22 с заменами К141Е и К137Е, соответственно; 4 - Нзр22 с двойной заменой остатков К137/141Е.

Время, мин

Учитывая субстратную специфичность трипсина, расщепляющего полипептидную цепь белка вблизи остатков лизина и аргинина, можно было ожидать, что замены Lys 137 и Lys 141 на остатки глутаминовой кислоты будут сопровождаться уменьшением скорости протеолиза в силу уменьшения количества участков, доступных для действия фермента. Однако это предположение оказалось неверным. В ходе инкубации происходило сравнительно медленное уменьшение интенсивности зоны негидролизованного Hsp22 дикого типа и значительно более быстрое уменьшение интенсивности белковой зоны, соответствующей негидролизованному Hsp22 с любой из исследуемых замен; при этом Hsp22 с заменой К137/141Е оказался наименее устойчивым к протеолизу (рис. 2). Этот факт хорошо согласуется с данными спектроскопии КД, согласно которым именно этот белок является наименее упорядоченным.

Изучение четвертичной структуры Hsp22 методом седнментационного анализа

Для анализа олигомерной структуры Hsp22 мы применили метод аналитического ультрацентрифугирования. Эксперимент проводили при разных концентрациях белка, от 0,2 до 0,6 мг/мл. На рисунке 3 представлены распределения частиц Hsp22 по

коэффициентам седиментации. При низкой концентрации белка (0,2 мг/мл) наблюдается только один пик с коэффициентом седиментации около 2 S, для которого мы рассчитали фрикционное отношение (f/f0), равное ~1,7 (рис. ЗА).

Рис. 3. Седиментационный анализ Hsp22 при различных концентрациях белка: 0,2 мг/мл (А), 0,4 мг/мл (Б) и 0,6 мг/мл (В). Эксперименты проводили при 20°С при скорости вращения ротора 56000 об/мин. Приведены распределения

коэффициентов седиментации с (г). Для каждого пика указано значение его максимума в единицах Сведберга. На каждой панели приведены концентрация белка и значение фрикционного отношения

ту

2,0 S 0,2 мг/мл f/f0=l,7 A

2,1 S 0,4 мг/мл f/f0=l,7 Б

2,4 S 0,6 мг/мл f/f0=l,6 В

3,7 S 16,8 S 18,8 S

/ VA

5 10 15

Коэффициент седиментации s w (S)

Фрикционное отношение описывает форму белка и характеризует степень его гидратации; для мономерных глобулярных белков оно обычно составляет 1,2-1,3. Фрикционное отношение может увеличиваться, если белок обладает неупорядоченной структурой или если в растворе происходит быстрый обмен субъединиц. При полученном значении (1,6-1,7) молекулярная масса Шр22 равна 31 кДа - среднее значение между массами мономера и димера. Важно отметить, что анализ олигомерного состояния Н5р22, проведенный ранее методом гель-хроматографии, также указывал на то, что мономеры и димеры №р22 не разделяются и элюируются одним пиком [Кавакоу е( а1., 2007]. При малой концентрации белка (0,2 мг/мл) более крупных олигомеров не наблюдается (рис. ЗА). При повышении концентрации белка появляются более крупные олигомеры с коэффициентами седиментации -3,0-3,7 Б (рис. ЗБ,В). При значениях равных 1,6-1,7, молекулярная масса таких олигомеров оценивается в 60-70 кДа, из чего можно предположить, что данные пики соответствуют тримерам или тетрамерам Шр22. Кроме того, при данных концентрациях белка (0,4—0,6 мг/мл) появляются дополнительные, хотя и не слишком достоверные пики с коэффициентами седиментации выше 16 Б, соответствующие олигомерам более высокого порядка. Учитывая результаты экспериментов по гель-хроматографии и по химическому «сшиванию» олигомеров Шр22 диметилсуберимидатом [Кавакоу е1 а1., 2007], в которых также не было обнаружено никаких высокомолекулярных олигомеров, нельзя с уверенностью утверждать, что данные пики не являются погрешностью расчета. Так или иначе, мы не наблюдали на седиментограммах Шр22 хорошо выраженных пиков с коэффициентами седиментации в области 12-18 Б, характерных для крупных олигомеров, образуемых другими малыми белками теплового шока (например, Шр27 дикого типа), исследованных ранее методом седиментационного анализа. Это еще раз подтверждает высказанное ранее предположение о том, что Нзр22, в отличие от большинства других малых белков теплового шока, не способен к образованию крупных олигомеров.

Интересно отметить, что при повышении концентрации белка от 0,2 до 0,6 мг/мл значение коэффициента седиментации для максимума главного пика на распределениях с(я) заметно увеличивается - от 2,0 Б до 2,44 Б (рис. 3). При этом значения молекулярной массы Н$р22, рассчитанные при разных концентрациях белка с учетом фрикционного отношения, увеличиваются от 31 кДа при 0,2 мг/мл до 38,5 кДа при 0,6 мг/мл. Эти данные, полученные методом седиментационного анализа, очень хорошо коррелируют с результатами экспериментов, проведенных ранее методом гель-хроматографии [Кавакоу е! а1., 2007], в которых также было продемонстрировано заметное повышение молекулярной массы Шр22 (от 30 до ~37 кДа) при увеличении концентрации белка. Все это свидетельствует о том, что при повышении концентрации белка равновесие мономер-димер смещается в сторону образования димеров НБр22.

Мы исследовали седимеитационное поведение Нвр22 не только при 20°С, но и при 43°С, т.е. в условиях, приближенных к условиям теплового шока. При этом, однако, мы также не наблюдали олигомеров с коэффициентами седиментации выше 4 Б. Это свидетельствует о том, что Шр22, в отличие от большинства других малых белков теплового шока, не образует крупных олигомеров, причем не только при комнатной температуре, но и в условиях, приближенных к условиям теплового шока (при 43°С). При этом основная часть седиментирующего материала представлена в виде находящихся в равновесии мономеров и димеров, пики которых не разрешаются.

Исследование гидрофобных свойств Шр22 с помощью гидрофобного зонда

Считается, что малые белки теплового шока взаимодействуют со своими белками-субстратами за счет образования неспецифических гидрофобных контактов. В связи с этим, представлялось целесообразным исследовать гидрофобные свойства Шр22 (как белка дикого типа, так и №р22 с точечными заменами аминокислотных остатков) при помощи гидрофобного зонда В15-АК8.

Шр22 или Н$р27 титровали раствором В1з-АТМ8 (рис. 4). В этом случае происходит увеличение интенсивности флуоресценции, и полученные кривые могут быть обсчитаны

несколькими разными способами.

0-°* 1.5цМШр27

Рис. 4. Титрование Шр22 и №р27 В18-АЫ5. Концентрация белка составляла 1,5 рМ (в пересчете на мономер).

Применив несколько разных способов обсчета, мы пришли к выводу, что эти кривые титрования могут быть наилучшим образом описаны как сумма гиперболы и линейной зависимости. При этом гиперболическая часть кривой описывает связывание зонда с участками высокого сродства, а линейный участок кривой описывает слабое связывание зонда с неспецифическими участками связывания, обладающими низким сродством. Проанализируем связывание зонда только с участками высокого сродства. В этом случае оказывается, что максимальная флуоресценция, достигаемая при титровании Нвр27 В15-АК8, составляет 140-160 относительных единиц и полумаксимальная величина флуоресценции достигается при концентрации В1з-АК8,

В18-АНЗ, цМ

составляющей около 2 |хМ. В случае Нэр22 дикого типа или с заменой К141Е максимальная флуоресценция, достигаемая при титровании В1з-А№, составляет всего 4550 относительных единиц и при этом полумаксимальная флуоресценция достигается при концентрации ЕНз-АЫЗ, равной 5,0-5,3 цМ.

Завершая этот раздел, можно заключить, что оба исследованных препарата №р22 -как белок дикого типа, так и с заменой К141Е, обладают сходными гидрофобными свойствами. При этом прочность связывания В1$-АН8 с Н$р22 заметно меньше прочности его связывания с №р27. Это значит, что гидрофобность окружения В1з-А№, связанного с Нзр27, существенно больше гидрофобности окружения этого зонда, связанного с Шр22. Возможно, это связано с тем, что Нэр27 образует крупные олигомерные комплексы, мономеры которого имеют более стабильную структуру, чем мономеры или димеры

Измерение шапероноподобной активности с использованием роданазы в качестве

субстрата

Роданаза - термолабильный белок, который агрегирует даже при низких концентрациях. Агрегацию роданазы инициировали нагреванием образца до 44°С и регистрировали по приросту кажущейся оптической плотности при 360 нм. Как видно на рис. 5, при агрегации этого белка отсутствует лаг-период. Добавление Шр22 (как белка дикого типа, так и с заменами аминокислотных остатков) приводит к некоторому подавлению агрегации роданазы. Наиболее активным в предотвращении агрегации был Нэр22 дикого типа. Замены остатков 141 и 137 снижали шапероноподобную активность Нзр22, а при двойной замене К141/137Е наблюдалась почти полная ее потеря. Увеличение весового соотношения шаперонхубстрат от 1:8 до 1:2 не меняло общую картину и лишь усиливало подавление агрегации, а при соотношении, равном 1:1, шапероноподобная

Шр22.

0,25 0,20

1 2

активность всех исследованных препаратов Шр22 становилась сопоставимой.

О О

I 0,15

0,10 0,05 0,00

О 10 20 30 40 50 60

Время, мин

3,4

Рис. 5. Влияние №р22 дикого типа и с точечными заменами аминокислотных остатков на агрегацию роданазы в процессе инкубации при 44°С в отсутствие Н5р22 (кривая 1) и в присутствии Шр22 с двойной заменой К137/141Е (кривая 2), №р22 с заменами К141Е или К137Е (кривые 3 и 4), или №р22 дикого типа (кривая 5). Конечная концентрация роданазы во всех опытах составляла 0,22 мг/мл, а концентрация №р22-0,1 мг/мл.

Зависимость параметров триптофановой флуоресценции №р22 от температуры

Как было нами установлено методом тушения флуоресценции, три из четырех остатков триптофана в молекуле Шр22 доступны растворителю. Мы предполагаем, что единственный остаток, недоступный растворителю, находится в а-кристаллиновом домене молекулы. При комнатной температуре спектр Шр22 имеет выраженный максимум при 341 нм (см. рис. 6Б). На рисунке 6Б приведена зависимость спектров триптофановой флуоресценции Шр22 от температуры. Хорошо видно, что при повышении температуры с 20°С до 80°С наблюдается сдвиг максимума спектра в длинноволновую область приблизительно на 10 нм. Кроме того, наблюдается эффект температурного тушения, при котором снижается интенсивность флуоресценции. Для описания процесса тепловой денатурации, наблюдаемого по изменениям флуоресценции, обычно вводят поправку на температурное тушение [ВшЬиеуа е1.а1., 1980]. Однако в нашем случае такой способ оказался неприменим ввиду некоторых его особенностей. Поэтому для описания процесса

\У48 \У51 \Ь'60 \У96

тепловой денатурации Нзр22, регистрируемой по изменениям триптофановой флуоресценции, мы

использовали сугубо описательные

300

характеристики - такие, как т.н.

«параметр А» (соотношение

интенсивностей флуоресценции при 320 нм и 365 нм) [Тигоуегоу е1 а1., 1976], который описывает форму спектра триптофановой флуоресценции и положение его максимума.

Й 0.7

0.5

0.8

0.9

20 30 40 50 60 70 80 Температура, °С

320 340 360 380 Длина волны, нм

352

Рис. 6. А). Локализация четырех остатков триптофана в структуре Шр22. а-кристаллиновый домен закрашен серым, а вариабельный >1-концевой домен не закрашен. Б). Спектры триптофановой флуоресценции, полученные в процессе прогрева Шр22 с 20°С до 80°С (значения температур даны в квадратиках на каждом спектре). В). Температурные изменения флуоресценции Нэр22, измеренные по сдвигу максимума спектра

флуоресценции ()цпах) и значению параметра А=1з2о/1зб5- Белые и черные квадратики на кривой для параметра А соответствуют данным, полученным при разных концентрациях Нэр22 - 0,1 и 0,6 мг/мл, соответственно.

На рисунке 6В приведены графики зависимости параметра А и положения максимума спектра триптофановой флуоресценции Шр22 (>чмх) от температуры. Изменения обоих параметров хорошо коррелируют между собой и хорошо описываются Больцмановской кривой с точкой перегиба в районе 57°С. Отметим, что мы никак не ожидали обнаружить столь четкий температурный переход, учитывая, что Шр22 является, как мы предполагали, белком с сильно разупорядоченной третичной структурой.

Еще одним важным вопросом, на который следовало получить ответ, оставалось влияние концентрации белка на тепловую денатурацию Нвр22. Данные по аналитическому ультрацентрифугированию свидетельствуют об образовании более крупных олигомеров при повышении концентрации белка с 0,2 до 0,4-0,6 мг/мл (рис. 3). Поэтому мы провели специальный эксперимент, сравнив тепловую денатурацию Шр22, измеряемую по снижению параметра А, при разных концентрациях белка - 0,1 мг/мл и 0,6 мг/мл. Как видно, особых изменений в характере тепловой денатурации №р22 при этом не наблюдается: кривые, полученные при разных концентрациях белка, оказались

С использованием

параметрической зависимости нам

удалось рассчитать долю

денатурированного белка при

тепловой денатурации Шр22 (как

белка дикого типа, так и с заменами

аминокислотных остатков) (рис. 7).

При сопоставлении данных,

представленных на рисунках 6В и 7,

видно, что параметр А достаточно

хорошо описывает процесс

тепловой денатурации Нзр22.

„ ^ Температуры полуперехода,

Рис. 7. Температурные зависимости доли

денатурированного белка (а) для Шр22 дикого типа полученные с использованием

и с точечными заменами аминокислотных остатков. параметра А (рис. 6В) и при расчете

доли денатурированного белка а (рис. 7), составляют для белка дикого типа 56,8°С и 58°С, соответственно. Для №р22 с заменами К137Е и К141Е они составляли 50,8°С при обоих вариантах расчета. Для Шр22 с двойной заменой К137/141Е эти значения составляли 47,7°С при расчете с использованием параметра А и 47,2°С - при расчете доли денатурированного белка а. Расчет доли денатурированного белка (а) по флуоресцентным параметрам (рис. 7) позволяет также рассчитать энтальпию Вант-Гоффа для одностадийных тепловых переходов (с учетом того, что данный процесс был полностью обратимым). Нами были получены следующие

практически идентичны (рис. 6В).

1.0

0.8

о 0.6

о.

, 0.4

0.2

о 0.0

"—о— Нэр22 \УТ ГУ

—Нвр22 К137Е Л

-—О— Нэр22 К141Е //Г V

—Нэр22 К137/141Е Д г /

// /

у/ /

.ж

1 1

20 30 40 50 60 70

Температура, °С

значения энтальпии Вант-Гоффа (ДНуН): 150 кДж/моль для Hsp22 дикого типа, 130 и 135 кДж/моль для Hsp22 с заменами К137Е и К141Е, соответственно, и 121 кДж/моль для Hsp22 с двойной заменой К137/141Е. Были также рассчитаны значения энтропии AS: 0,45, 0,4, 0,41 и 0,38 кДж моль'1 К"1 для Hsp22 дикого типа и с заменами остатков К137Е, К141Е и К137/141Е, соответственно. Как видно из этих данных, точечные замены аминокислотных остатков не только приводят к снижению термостабильности белка, но еще и уменьшают число связей, стабилизирующих его нативную конформацию.

Исследование тепловой денатурации Шр22 методом ДСК

В предыдущем разделе мы описали результаты анализа тепловой денатурации №р22, регистрируемой по изменениям собственной триптофановой флуоресценции белка. Следует отметить, однако, что триптофановая флуоресценция способна выявлять изменения только в области локализации хромофоров (остатков триптофана), но вовсе не во всей молекуле белка. В то же время многие из полученных нами данных свидетельствуют о том, что Нэр22 не обладает компактной третичной структурой. Процесс денатурации, который мы наблюдали по изменениям триптофановой флуоресценции, отражает, скорее всего, разворачивание относительно небольшой части НБр22 (наиболее вероятно - части его а-кристаллинового домена), но не всей молекулы белка. Для анализа тепловой денатурации всей молекулы Шр22 мы применили интегральный подход, используя для этой цели метод дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК).

Рис. 8. Исследование тепловой денатурации Нвр22 методом ДСК. Кривая I - температурная зависимость удельной теплоемкости №р22, полученная экспериментальным

путем. Систематическая погрешность измерения удельной теплоемкости (Ср) не превышала ± 0,1 Дж г'1 К"1. Кривая 2 - теплоемкость, рассчитанная для глобулярного белка, имеющего стабильную компактную третичную структуру и такую же молекулярную массу, что и Шр22. Кривая 3 соответствует расчетной удельной теплоемкости №р22 в полностью развернутом состоянии.

Сразу отметим, что еще до начала нагрева (при температуре ниже 20°С) удельная теплоемкость Нэр22 намного ниже таковой, рассчитанной для глобулярного белка, имеющего стабильную компактную третичную структуру и такую же молекулярную

10 20 30 40 50 Б0 70 80 90

Температура, "С

массу, что и Шр22 (рис. 8). Это вполне согласуется с высказанными выше предположениями о том, что значительная часть молекулы №р22 находится в развернутом состоянии даже при комнатной температуре. При нагревании удельная теплоемкость №р22 заметно увеличивается, начиная с 27°С, и при температуре выше 80°С приближается к значениям Ср, рассчитанным для Нвр22 в полностью развернутом состоянии (рис. 8). Это говорит о том, что часть белка, сохранявшая при комнатной температуре свернутую третичную структуру, начинает плавиться с повышением температуры. При этом разворачивание происходит довольно плавно, без ярко выраженных кооперативных тепловых переходов. Подобный тип плавления был недавно описан для внутренне неупорядоченного апо-парвальбумина [Регтуакоу е1 а1., 2008] и искусственного мини-белка РЗО-Ьв [Бас^ е1 а1., 2009], исследованных методом ДСК. Следует отметить, однако, что в последнем случае тепловая денатурация белка начиналась с полностью свернутого состояния и заканчивалась полностью развернутым состоянием.

Итак, при исследованиях тепловой денатурации Шр22 методом ДСК мы не обнаружили на кривой ярко выраженного пика теплопоглощения. Тем не менее, на кривой ДСК все-таки наблюдается небольшой пик с максимумом в области 52-54°С (рис. 8). Эта температура несколько ниже, чем та температура полуперехода, которую удалось определить при изучении триптофановой флуоресценции Нвр22 (58°С), хотя и довольно близка к ней. Судя по всему, наблюдаемый на кривой ДСК небольшой пик соответствует плавлению некоторой части а-кристаллинового домена.

Важно отметить, что тепловая денатурация Шр22 не зависела от концентрации белка (в пределах 0,6-1,2 мг/мл) и была полностью обратима, т.к. кривые ДСК одной и той же пробы многократно воспроизводились без каких либо изменений в процессе повторных прогревов.

Изменения вторичной структуры Н$р22 в процессе тепловой денатурации

Судя по данным КД (данные не приведены), в ходе тепловой денатурации Нвр22 происходит некоторое перераспределение неупорядоченной и Р-складчатой структур, однако точно определить такие изменения метод КД не позволяет. Поэтому для определения изменений вторичной структуры НБр22 при его тепловой денатурации мы применили метод ИК спектроскопии с Фурье преобразованием (РТГО.), т.к. данный метод дает более надежную информацию, чем метод КД, для определения неупорядоченной и Р-складчатой структур.

На рисунке 9А представлены ИК-спектры Шр22 в области амида I, измеренные при различных температурах (20°С, 50°С и 70°С), а на рис. 9Б - их вторые производные. Повышение температуры приводит к значительным изменениям спектров, которое выражается в смещении максимума с 1637 к 1644 см*1 и появлению плеча в области 1660

см"1 (рис. 9А). Индивидуальные полосы поглощения мы определяли, используя вторые производные исходных ИК-спектров (рис. 9Б). Вне зависимости от температуры, мы обнаружили семь отрицательных пиков на вторых производных ИК-спектров, в области 1621, 1631, 1641, 1651, 1661 и 1681 см"1. Эти пики соответствуют а-спиралям, ß-складкам, неупорядоченным структурам и поворотам, как обозначено на рисунке 9Б. Разложение ИК-спектров на индивидуальные спектральные полосы было проведено с использованием программы OPUS 6.0 (Bruker). Полученные данные показывают, что при 20сС Hsp22 содержит около 33% ß-складок, 12% а-спиралей, 34% поворотов и 21% неупорядочнных структур. Эти расчеты хорошо коррелируют с данными, полученными ранее методом КД.

В соответствии с предсказаниями вторичной структуры, почти все ß-складки в Hsp22 локализованы в а-кристаллиновом домене, в то время как а-спирали расположены в N-концевой части молекулы.

Рис.9. ИК-спектры №р22, измеренные при разных температурах (20°С, 50°С и 70°С) и нормированные на максимум поглощения (А), и их вторые производные (Б). Кривые вторых производных смещены друг относительно друга по вертикальной оси (исключительно для лучшего их восприятия).

Повышение температуры до 50°С сопровождалось некоторым уменьшением

содержания а-спиралей и Р-складок и повышением количества неупорядоченных структур и поворотов. Дальнейшее повышение температуры до 70°С сопровождалось полным исчезновением а-спиралей (рис. 9Б) и снижением содержания р-складок в структуре Нзр22 с 33 до 18%; при этом содержание поворотов и неупорядоченных структур увеличилось до 45 и 37%, соответственно. Эти данные указывают на то, что тепловая денатурация Шр22

сопровождается уменьшением содержания упорядоченных структур и увеличением содержания неупорядоченных структур, причем основные изменения во вторичной структуре происходят при температурах выше 50°С.

Еще одним способом, использованным нами для исследования изменений во вторичной структуре Шр22 при его тепловой денатурации, было изучение температурной зависимости флуоресценции тиофлавина Т (ТЬТ) - флуоресцентного красителя, широко используемого для исследования амилоидных структур. Он обладает сложной

ароматической структурой, причем одна половина молекулы способна вращаться относительно другой. При этом выход флуоресценции ТЬТ остается низким. Попадая между двумя р-складками, ТЬТ

стабилизируется в плоской конформации, в результате чего имеет место резонанс между двумя частями молекулы и сильно повышается квантовый выход флуоресценции. Как было показано выше, вторичная структура №р22 Рис. 10. Температурная зависимость доли приблизительно на треть состоит из завершенности перехода, наблюдаемой по р. ок По мы предприняли изменениям флуоресценции тиофлавина Т в

процессе нагрева №р22 со скоростью 1°С/мин. попытку проследить процессы,

происходящие при тепловой денатурации Нзр22, исследуя температурные зависимости флуоресценции ТЬТ.

На рисунке 10 приведена температурная зависимость доли перехода (т.е. снижения содержания р-складок в Н5р22), полученная нами после обработки кривых температурной зависимости флуоресценции ТЬТ на одной длине волны (485 нм) методом, предложенным Т.Л. Бушуевой с соавторами [ВивЬиеуа е1.а1., 1980]. Кривая изменения флуоресценции ТЬТ оказалась довольно сложной. Видно, что это многостадийный процесс, который начинается с 22°С и заканчивается в области 70°С. Полупереход наблюдается при температуре 43-45°С, т.е. изменения в содержании Р-складок регистрируются в данном случае при значительно более низкой температуре, чем при измерениях методом БТт (рис. 9), при которых основные изменения в содержании р-складок наблюдались при температурах выше 50°С. Такое кажущееся противоречие в между данными БТЖ и флуоресценцией ТЬТ можно объяснить тем, что для стабилизации ТЬТ в конформации с повышенным выходом флуоресценции требуются довольно протяженные, стабильные и к тому же гидрофобные карманы, образованные р-складками. Эти требования довольно

Температура, "С

жесткие, вследствие чего мы и наблюдаем уменьшение доли удовлетворяющих таким условиям Р-структур, начиная с довольно низкой температуры. В случае же метода РТП1, регистрируется общее количество р-складок. При этом до 50°С наблюдается лишь некоторое перераспределение структур с уменьшением доли одних видов р-складок и увеличением других их видов (рис. 9Б).

Тепловая денатурация Шр22 и его шалероноподобная активность

Интересно было бы знать, как термостабильность Шр22 соотносится с его шапероноподобной активностью. Для этого мы исследовали температурные зависимости агрегации актиновых филаментов (Б-актина) в отсутствие и в присутствии №р22 (как белка дикого типа, так и с точечными заменами аминокислотных остатков). Результаты представлены на рис. 11 (для сравнения на этом рисунке приведена также кривая температурной зависимости агрегации Б-актина в присутствии Шр27-30).

Рис. 11. Температурные зависимости агрегации F-актина, вызываемой его тепловой денатурацией, в отсутствие (кривая 1) и в присутствии Hsp22 дикого типа (кривая 2) или с заменой К141Е (кривая 3), а также Hsp27-3D (кривая 4). Агрегацию регистрировали по приросту светорассеяния при 350 нм. Концентрации F-актина и sHsp составляли 0,1 мг/мл. Скорость прогрева - 1°С/мин.

В отсутствие малых белков теплового шока Р-актин агрегирует с температурой полуперехода около 62,5°С, а в присутствии Нэр22 дикого типа кривая агрегации сдвигается на 12,5°С в область более высоких температур (кривая 2 на рис. 11). Нвр22 с точечной заменой К141Е оказался менее эффективным - он сдвигал кривую агрегации Р-актина лишь на 8°С (кривая 3 на рис. 11; сходные эффекты были обнаружены и для Н$р22 с другими точечными заменами аминокислотных остатков). Наиболее эффективным оказался приведенный для сравнения Н5р27-30: в его присутствии кривая агрегации Р-актина сдвигается на 21,5°С (кривая 4 на рис. 11).

Таким образом, шапероноподобная активность малых белков теплового шока может коррелировать с их собственной термостабильностью. Нвр22 является намного менее эффективным в предотвращении агрегации Р-актина, чем более термостабильный Шр27-

3D, который демонстрирует при тепловой денатурации хорошо выраженный переход при ~70°С [Pivovarova et al., 2005], а точечные замены аминокислотных остатков, снижающие термостабильность Hsp22 (рис. 7), одновременно снижают и его шапероноподобную активность (рис. 11).

Hsp22 человека - белок с сильно разупорядоченной третичной структурой и непрерывным тепловым переходом

Предсказание вторичной структуры Hsp22 показывает, что данный белок практически не содержит а-спиралей и обогащен р-складками и неупорядоченными структурами. Hsp22 не способен образовывать одну из р-складок в а-кристаллиновом домене ф2-складку), т.к. в данном участке находится последовательность, запрещающая образование Р-структур (TPPPFP). Это может дестабилизировать а-кристаллиновый домен в целом. Более того, представляется вполне вероятным, что р2-складка играет важную роль в формировании межсубъединичных взаимодействий sHsp и, следовательно, отсутствие данной складки может препятствовать образованию стабильных димеров Hsp22. Кроме того, на С-конце Hsp22 отсутствует консервативный мотив I-X-(I/V), который, как предполагается, отвечает за образование крупных олигомеров.

Наши данные полностью подтверждают эти предположения. Во-первых, данные КД и ИК-спектроскопии четко говорят о низком содержании а-спиралей и большой доле Р-складчатой и неупорядоченной структур. Во-вторых, анализ олигомерного состояния Hsp22 показывает, что он практически не способен образовывать крупные олигомеры как при комнатной температуре, так и в условиях теплового шока.

В ходе работы нами были получены данные, свидетельствующие о том, что Hsp22 не обладает компактной третичной структурой при комнатной температуре. Так, Hsp22 демонстрирует очень высокую чувствительность к протеолизу. Кроме того, данные ДСК свидетельствуют о том, что уже при комнатной температуре молекула Hsp22 в значительной степени развернута, а ее тепловая денатурация происходит в очень широком температурном диапазоне и характеризуется отсутствием выраженного пика избыточного теплопоглощения (рис. 8).

Все эти данные в большей или меньшей степени свидетельствуют о том, что Hsp22 можно причислить к семейству белков с разупорядоченной третичной структурой ("intrinsically disordered proteins", ГОР). Довольно часто используемым критерием для причисления белка к семейству ГОР является биоинформационный анализ его первичной последовательности. Результаты такого анализа для Hsp22 приведены на рисунке 12. Как видно из этого рисунка, более половины молекулы Hsp22 по предсказанию является неупорядоченной. При этом, однако, результаты анализа температурных зависимостей

триптофановой флуоресценции №р22, свидетельствующие о наличии кооперативного теплового перехода (рис. 6В, 7), сильно противоречат всем остальным данным. Объяснить данный факт не так уж сложно. В молекуле Нзр22 содержится четыре остатка триптофана (\\Ч8, \¥51, \V6CI, W96). Из них только W9б находится в упорядоченной части белка (конкретно, в а-кристаллиновом домене), а остальные три остатка расположены либо в неупорядоченной части молекулы, либо на границе с ней (рис. 12). Анализ спектров триптофановой флуоресценции и тушения флуоресценции свидетельствует о том, что только один остаток триптофана полностью погружен внутрь белковой глобулы, а остальные остатки контактируют с растворителем. Поэтому мы предполагаем, что изменения, наблюдаемые при измерениях температурных зависимостей триптофановой флуоресценции, происходят только в относительно небольшой части молекулы Шр22 -скорее всего, в ее а-кристаллиновом домене, поблизости от остатка \У96.

Рис. 12. Предсказание вероятности

§0.5

ц §

0.3

/ЧК137 W

Av60 \ / \ К141 J

J V/W48 V J

W96\J

0 40 80 120 160 200

Номер аминокислотного остатка

степени структурной

резупорядоченности различных

областей в молекуле Hsp22, сделанное на основании анализа первичной последовательности Hsp22 при помощи программы RONN (http: //www. Strub i. ox. ас .uk/RON№. Горизонтальная линия 0.5 показывает границу для предсказанного разупорядоченного состояния: области, расположенные выше этой линии, являются по предсказанию разупорядоченными. Звездочками отмечены четыре остатка триптофана, а точками - остатки К137 и К141.

Итак, наши данные говорят о том, что Hsp22 является белком с разупорядоченной третичной структурой. Однако данные по тепловой денатурации Hsp22 можно рассмотреть и с другой точки зрения, а именно в свете недавно описанного поведения некоторых белков, демонстрирующих непрерывный переход в процессе их тепловой денатурации (т.н. "Downhill folding/unfolding"). Теория энергетического ландшафта предсказывает, что в некоторых случаях сворачивание белка может происходить без пересечения энергетического барьера. Характерной особенностью такого поведения является существование уникального термодинамического состояния, состоящего из совокупности конформаций, которые теряют структуру постепенно с уменьшением стабильности белка. В этом случае процесс сворачивания/разворачивания является некооперативным и кажущийся переход зависит от метода, которым изучают структурные свойства белка в процессе его денатурации. В соответствии с таким сценарием постепенного (downhill) сворачивания/разворачивания, разные методы, применяемые для исследования денатурации белка, дают разные характеристики теплового перехода. Похоже на то, что

именно это мы и наблюдаем в случае тепловой денатурации Hsp22. Данные ДСК показывают непрерывный переход без четко выраженного пика теплопоглощения (рис. 8); наблюдается лишь небольшой пик с полупереходом при 52-54°С. Температурные зависимости, полученные методом КД, также не выявили выраженного теплового перехода. В данном случае и ДСК, и КД являются интегральными методами, позволяющими анализировать тепловую денатурацию всей молекулы белка. Помимо этого, мы применили несколько методов, позволяющих нам наблюдать за денатурацией отдельных участков. Так, исследование процесса тепловой денатурации Hsp22 путем ; измерения флуоресцентных параметров показало четкий кооперативный переход (с полупереходом при 58°С) (рис. 6В, 7), для которого даже удалось рассчитать термодинамические параметры. Кроме того, данные анализа разрушения p-структур с применением ThT говорят о тепловом переходе с полупереходом при 44°С (рис. 10).

Таким образом, разные методы, используемые для исследования тепловой денатурации Hsp22, дают разные результаты: они либо вообще не выявляют выраженных тепловых переходов, либо выявляют их, но при этом температура полуперехода может существенно варьировать в зависимости от используемого метода. Именно такой тип поведения был ранее предсказан при математическом моделировании процесса тепловой денатурации белков, демонстрирующих непрерывный переход ("downhill unfolding"), и наши экспериментальные данные подтверждают это предсказание.

Следует добавить, что обе точки зрения, т.е. тепловая денатурация Hsp22 как белка семейства ГОР или как белка с непрерывным переходом, не противоречат друг другу. Анализ тепловой денатурации Hsp22 как белка семейства ГОР позволяет получать информацию о структурных особенностях этого белка, в то время как анализ денатурации Hsp22 как белка с непрерывным переходом позволяет подробно исследовать его термодинамические свойства.

Влияние точечных замен К137Е, К141Е и К137/141Е на структуру и функции

Hsp22 человека

Первичная структура а-кристаллинового домена sHsp человека очень консервативна. Так, Р5- и р7-складки, как и соединяющая их петля, имеют очень консервативную последовательность и, скорее всего, играют очень важную роль. Мутация только одного высококонсервативного положительно заряженного остатка в этой области (R116 у аА-кристаллина, R120 у аВ-кристаллина или К141 у Hsp22, находящихся в гомологичных позициях) коррелирует с развитием врожденной катаракты и/или наследственной десмин-зависимой моторной нейропатии и болезнью Шарко-Мари-Тута. В это же время мутации по остаткам R127, S135 и R136 в Hsp27 человека, также расположенных в этой области, связаны с наследственной дистальной моторной

нейропатией и болезнью Шарко-Мари-Тута. Все это объясняет, почему было так важно исследовать эффекты мутаций именно в данной части молекулы Нзр22.

Полученные нами данные наглядно свидетельствуют о том, что точечные замены К137Е и К141Е (и особенно - двойная замена К137/141Е) оказывают дестабилизирующее действие на молекулу Шр22: они снижают количество упорядоченных структур в Шр22 (рис. 1), увеличивают его чувствительность к протеолизу (рис. 2) и значительно снижают термостабильность Шр22 (рис. 6В, 7). Все это заметно отражается на его функциях: шапероноподобная активность Шр22 снижается при введении таких точечных замен (рис. 5, 11), причем ее снижение коррелирует со снижением термостабильности Шр22 (рис. 7). При этом важно отметить, что во всех случаях Нвр22 является менее эффективным в предотвращении агрегации различных белков-субстратов, чем Нзр27. Отчасти это можно объяснить тем, что он содержит меньше гидрофобных поверхностей, чем Шр27 (рис. 4).

Таким образом, точечные замены аминокислотных остатков в петле, соединяющей (35- и р7-складки, приводят, по-видимому, к повреждению структуры Шр22, что заметно отражается на его шапероноподобных функциях. Именно этим, видимо, можно объяснить тот факт, что мутации в этой области у различных вНвр (аА- кристаллин, аВ-кристаллин,

Нзр27 и НБр22) ассоциированы с тяжелыми наследственными заболеваниями человека.

***

В заключение хотелось бы отметить, что Нвр22 по многим параметрам сильно отличается от всех исследованных на сегодняшний день вНэр. Он неспособен образовывать крупные олигомеры, плавится некооперативно, а его шапероноподобная активность существенно ниже, чем у других вНвр. Скорее всего, это связано с целым рядом особенностей первичной структуры Шр22, отличающих его от других вНэр: у него отсутствует одна из р-складок в а-кристаллиновом домене и сильно нарушены консервативные последовательности в К- и С-концевых участках последовательности.

Список нспользованных сокращений:

ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия; (3-МЭ - р-меркаптоэтанол; ДТТ -дитиотрейтол; ИК - инфракрасная спектроскопия; КД - круговой дихроизм; ПААГ -полиакриламидный гель; НБр22 - малый белок теплового шока человека с кажущейся молекулярной массой 22 кДа; К137Е, К141Е и К137/141Е - точечные замены остатков лизина в Нэр22 на остатки глутаминовой кислоты; РТЖ - ИК-спектроскопия с Фурье преобразованием; РМБИ - фенилметилсульфонилфторид; ТРСК-трипсин - трипсин, обработанный ингибитором химотрипсина тозил-Ь-фенилаланин-хлорметил-кетоном; БОБ - додецилсульфат натрия; ТЬТ -тиофлавин Т.

Выводы

Проведено комплексное изучение физико-химических свойств малого белка теплового шока Шр22 человека с использованием методов флуоресценции, спектроскопии кругового дихроизма, дифференциальной сканирующей калориметрии, инфракрасной спектроскопии, аналитического ультрацентрифугирования, динамического светорассеяния, химического «сшивания» и ограниченного протеолиза трипсином. На основании полученных результатов были сделаны следующие выводы:

1) При исследованиях олигомерного состояния Нвр22 показано, что он существует в растворе в виде равновесной смеси мономеров, димеров и тетрамеров. При этом не обнаружено более крупных олигомеров, характерных для большинства других малых белков теплового шока человека, исследованных к настоящему времени.

2) Установлено, что более половины молекулы Шр22 обладает неупорядоченной третичной структурой, хотя некоторые, относительно небольшие участки молекулы являются более или менее упорядоченными.

3) Исследования процесса тепловой денатурации Нвр22 показали, что при использовании интегральных методов (дифференциальная сканирующая калориметрия, спектроскопия кругового дихроизма) Шр22 демонстрирует непрерывный тепловой переход, тогда как при исследовании температурных зависимостей триптофановой флуоресценции обнаружен четкий кооперативный переход, для которого были рассчитаны термодинамические параметры. Сделан вывод о том, что этот переход отражает локальную денатурацию небольшой, но достаточно хорошо упакованной части а-кристаллинового домена Шр22, содержащей остаток триптофана 96.

4) Точечные замены аминокислотных остатков К141Е и К137Е (и особенно двойная замена К141/137Е) оказывают дестабилизирующее влияние на структуру Шр22, что заметно отражается на его функциях: эти замены значительно снижают термостабильность Шр22 и приводят к уменьшению его шапероноподобной активности.

Работа выполнена при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Kim M.V., Kasakov A.S., Seit-Nebi A.S., Marston S.B., GusevN.B. (2006) Structure and properties of K141E mutant of small heat shock protein HSP22 (HspB8, HI 1) that is expressed in human neuromuscular disorders, Arch. Biochem. Biophys., v. 45, № 1, p. 32-41.

2. Kasakov A.S.. Bukach O.V., Seit-Nebi A.S., Marston S.B., Gusev N.B. (2007) Effect of mutations in the p5-137 loop on the structure and properties of human samll heat shock protein HSP22 (HspB8, HI 1), FEBS Journal, v. 274, № 21, p. 5628-5642.

3. Kazakov A.S.. Markov D.I., Gusev N.B. Levitsky D.I. (2009) Thermally induced structural changes of intrinsically disordered small heat shock protein Hsp22, Biophysical Chemistry, v. 145, № 2-3, p. 79-85

Тезисы докладов:

1. Казаков A.C. (2006) Некоторые свойства малого белка теплового шока с молекулярной массой 22 кДа (Hsp22) и его точечных мутантов К141Е, К137Е и К137/141Е. Тезисы докладов XIIIмеждународной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2006» (Москва, 12-15 апреля 2006 г.), с. 102-103.

2. Казаков А.С. (2009) Мутация Lysl41Glu (К141Е) дестабилизирует малый белок теплового inoKaHsp22 и снижает его шапероноподобную активность. Тезисы докладов XVIмеждународной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009» (Москва 13-18 апреля 2009 г.), с. 46-47.

3. Казаков А.С.. Марков Д.И., Гусев Н.Б., Левицкий Д.И. (2009) Особенности тепловой денатурации малого белка теплового шока Hsp22. Тезисы докладов IVРоссийского симпозиума «Белки и пептиды» (г. Казань, 23-27 июня 2009 г.) с. 167.

4. Kazakov A. S.. Markov D.I., Gusev N.B., Levitsky D.I. (2009) Thermal unfolding of small heat-shock protein Hsp22, Eur. Biophysics J., v. 38, Supplement 1, p. S209 (Abstracts of 7th EBSA European Biophysics Congress, Genova, Italy, 11-15 July 2009; oral presentation 0-665).

Отпечатано в типографии ООО «Ги оософт» г. Москва, Ленинский пр-т, г. Л А Тираж 100 экз. Подписано в печать 11.' * .09 Заказ № 3799

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Казаков, Алексей Сергеевич

Список сокращений

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Классификация белков теплового шока. Малые белки теплового шока.

1.2. Структура малых белков теплового шока

1.3. Шапероноподобная активность малых белков теплового шока

1.4. Общие сведения об Hsp

1.5. Роль малых белков теплового шока в наследственных заболеваниях

1. 6. Белки с разупорядочепной третичной структурой 31 1.7. Белки с непрерывным тепловым переходом

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2. Материалы и методы

2.1. Препаративные методы

2.1.1. Получение компетентных клеток

2.1.2. Экспрессия и выделение Hsp

2.1.3. Выделение актина из ацетонового порошка [Spudich and Watt, 1971].

2.1.4. Выделение изолированных головок миозина (субфрагмент 1 миозина, SI) ^ из глицениризированного препарата миозина.

2.2. Флуоресцентные методы исследования 52 2.2.1. Измерение спектров собственной триптофановой флуоресценции

2.2.2. Разложение спектров флуоресценции согласно модели дискретных состоянии

2.2.3. Динамическое тушение флуоресценции анионами Г. Определение доступности остатков триптофана тушителю.

2.2.4. Использование метода флуоресцентной спектроскопии для исследования связывания АТР с Hsp22.

2.2.5. Определение параметров связывания Bis-ANS с Hsp22 дикого типа и его ^ точечного мутанта К141Е

2.2.6. Исследование тепловой денатурации Hsp22 по флуоресцентным ^ параметрам

2.2.7. Исследование флуоресценции тиофлавина Т.

2.2.8. Исследование денатурации Hsp22 в присутствии мочевины.

2.3. Спектроскопия кругового дихроизма

2.4. Изучение вторичной структуры Hsp22 методом инфракрасной ^ спектроскопии с преобразованием Фурье (FTIR)

2.5. Изучение структуры белка методом ограниченного протеолиза

2.5.1. Сравнение устойчивости к протеолизу Hsp22 и его точечных мутантов

2.5.2. Влияние АТР на ограниченный протеолиз Hsp

2.6. Изучение четвертичной структуры Hsp22 и его точечных мутантов методом химического сшивания диметилсуберимидатом (ДМС) и глутаровым 67 альдегидом

2.7. Изучение четвертичной структуры Hsp22 методом аналитического ^^ ультрацентрифугирования

2.8. Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС)

2.9. Исследования термодинамических характеристик тепловой денатурации

2.10. Термо-гель анализ Hsp

2.11. Определение шапероноподобной активности Hsp22 и его мутантов

2.11.1. Определение шапероноподобной активности с инсулином

2.11.2. Определение шапероноподобной активности с роданазой

2.11.3. Определение шапероноподобной активности с F-актином

2.11.4. Определение шапероноподобной активности с S

2.12. SDS-Электрофорез в ПААГ

3. Результаты исследования

3.1. Некоторые физико-химические свойства Hsp22 и его точечных мутантов

3.1.1. Флуоресцентные свойства Hsp

3.1.2. Изучение вторичной структуры Hsp22 и его мутантов методом спектроскопии кругового дихроизма.

3.1.3. Изучение структуры Hsp22 и его точечных мутантов методом ограниченного протеолиза

3.2. Четвертичная структура Hsp22 и его точечных мутантов

3.2.1. Изучение четвертичной структуры Hsp22 с помощью химического сшивания диметилсуберимидатом

3.2.2. Изучение четвертичной структуры Hsp22 методом седиментационпого анализа

3.2.3. Изучение четвертичной структуры Hsp22 методом химического «сшивания» глутаровым альдегидом

3.2.4. Динамическое лазерное светорассеяние

3.3. Исследование гидрофобных свойств Hsp22 и его точечных мутантов с помощью гидрофобного зонда Bis-AJSS

3.4. Шапероноподобная активность Hsp22 и его точечных мутантов

3.4.1. Измерение шапероноподобной активности с использованием инсулина в ^ качестве субстрата

3.4.2. Измерение шапероноподобной активности с использованием роданазы в ^^ качестве субстрата

3.4.3. Измерение шапероноподобной активности с использованием субфрагмента 1 миозина в качестве субстрата

3.5. Особенности тепловой денатурации Hsp

3.5.1. Индуцированные температурой изменения триптофановой флуоресценции Hsp22 и его точечных мутантов

3.5.2. Исследование тепловой денатурации Hsp22 методом ДСК

3.5.3. Изменения вторичной структуры Hsp22 в процессе тепловой денатурации

3.5.4. Изменения гидрофобных свойств Hsp22 в процессе тепловой ^ денатурации

3.5.5. Тепловая денатурация Hsp22 и его шапероноподобная активность

4. Обсуждение результатов

4.1. Hsp22 - белок с сильно разупорядоченной третичной структурой

4.2. Влияние точечных мутаций К137Е, К141Е и К137/141Е на структуру и функции Hsp

Выводы

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химические и шапероноподобные свойства малого белка теплового шока Hsp22 человека"

Малые белки теплового шока (sHsp) - это широко распространенное семейство белков стресса. Размеры мономеров малых белков теплового шока колеблются от 12 до 43 кДа. Все эти белки объединены в одну группу из-за наличия в их структуре высоко консервативного участка, который впервые был обнаружен в а-кристаллинах хрусталика глаза и получил название кристаллинового домена.

Функционально, большинство sHsp in vitro обладают шапероноподобной активностью, т.е. способностью защищать белки, подвергающиеся денатурации в неблагоприятных условиях, от аморфной агрегации. In vivo sHsp вовлечены в большое количество разнообразных процессов, таких как усиление устойчивости к стрессам, регуляция динамики актиновых и промежуточных филаментов, ингибирование апоптоза, изменение текучести мембран и др.

В настоящее время у человека описано 10 малых белков теплового шока. Из них подробно изучены только аА- и аВ-кристаллины, а также малый белок теплового шока с молекулярной массой 27 кДа (Hsp27 или HspBl).

Сравнительно недавно появились первые сведения о малом белке теплового шока человека с кажущейся молекулярной массой 22 кДа (Hsp22, также обозначаемом как HspB8 или Н11 киназа). Точечные мутации К141Е или K141N в Hsp22 коррелируют с развитием тяжелых нейропатий. Мутация Hsp22 по данному остатку гомологична мутации Hsp27 по 140 остатку, и в случае Hsp27 также приводит к развитию тяжелых наследственных заболеваний. В структуре Hsp27 есть еще несколько аминокислотных остатков, подверженных мутациям, и в их числе - остаток 136. Мутация этого остатка также сопровождается развитием тяжелых нейродегенеративных заболеваний. Высказывается предположение о том, что в структуре малых белков теплового шока есть своеобразные «горячие точки», мутации которых приводят к развитию врожденных заболеваний. Структура и свойства Hsp22 изучены недостаточно полно и поэтому до последнего времени не было сведений о том, как влияют мутации вблизи так называемых «горячих точек» на структуру и свойства Hsp22. Тем не менее, имеющиеся в литературе сведения позволяют предположить, что Hsp22 отличается по своей структуре от других малых белков теплового шока; было даже высказано предположение о том, что Hsp22 принадлежит к быстро растущему семейству белков с разупорядоченной третичной структурой (т.н. "intrinsically disordered proteins", ГОР). Все эти предположения требовали подтверждений. Вследствие этого, одной из главных целей данной работы стало подробное исследование физико-химических свойств Hsp22 (в частности, проверка предположения о его принадлежности к семейству IDP). Другой не менее важной целью настоящей работы было исследование свойств трех мутантов Hsp22 с точечными заменами остатков 137 и 141 (К137Е, К141Е и К137/141Е), расположенных в области, наиболее подверженной мутациям в других малых белках теплового шока. В соответствии с этими целями были поставлены следующие задачи:

2. Изучить влияние точечных замен К137Е, К141Е и К137/141Е в молекуле Hsp22 на его структурные свойства и шапероноподобную активность.

Научная новизна и практическая значимость.

Впервые проведен детальный анализ структуры и свойств малого белка теплового шока Hsp22 человека. Получены убедительные доказательства наших предположений о том, что Hsp22, в отличие от всех исследованных к настоящему времени малых белков теплового шока, относится к семейству белков с разупорядоченной третичной структурой (IDP). В работе был применен практически весь набор методов, позволяющих изучать изменения во вторичной и третичной структуре белка в процессе его тепловой денатурации. Оказалось, что разные методы, использованные для исследования тепловой денатурации Hsp22, дают разные результаты: они либо вообще не выявляют выраженных тепловых переходов, либо выявляют их, но при этом температура полуперехода может существенно варьировать в зависимости от используемого метода. Именно такой тип поведения был ранее предсказан при математическом моделировании процесса тепловой денатурации белков, демонстрирующих непрерывный переход ("downhill unfolding"), и наши данные являются одним из первых экспериментальных подтверждений этого предсказания. При исследованиях олигомерного состояния Hsp22 установлено, что он, в отличие от других малых белков теплового шока человека, не образует крупных олигомеров даже в условиях, близких к условиям теплового шока. Показано, что точечные замены К137Е, К141Е и К137/141Е оказывают дестабилизирующее влияние на структуру Hsp22 и снижают его шапероноподобную активность; именно этим, по-видимому, можно объяснить тот факт, что подобные мутации в малых белках теплового шока ассоциированы с развитием тяжелых нейродегенеративных заболеваний.

Полученные данные расширяют и углубляют знания в области структуры и свойств малых белков теплового шока, а также представляют несомненную важность для исследования тех функций, которые Hsp22 осуществляет в клетке. Разработанные в процессе работы экспериментальные подходы - такие, например, как параллельное исследование температурных зависимостей различных параметров, измеряемых разными методами, могут использоваться (и уже успешно используются) для структурно-функциональных исследований других белков.

1. Обзор литературы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Казаков, Алексей Сергеевич

Выводы

Проведено комплексное изучение физико-химических свойств малого белка теплового шока Hsp22 человека с использованием методов флуоресценции, спектроскопии кругового дихроизма, дифференциальной сканирующей калориметрии, инфракрасной спектроскопии, аналитического ультрацентрифугирования, динамического светорассеяния, химического «сшивания» и ограниченного протеолиза трипсином. На основании полученных результатов были сделаны следующие выводы:

1) При исследованиях олигомерного состояния Hsp22 показано, что он существует в растворе в виде равновесной смеси мономеров, димеров и тетрамеров. При этом не обнаружено более крупных олигомеров, характерных для большинства других малых белков теплового шока человека, исследованных к настоящему времени.

2) Установлено, что более половины молекулы Hsp22 обладает неупорядоченной третичной структурой, хотя некоторые, относительно небольшие участки молекулы являются более или менее упорядоченными.

3) Исследования процесса тепловой денатурации Hsp22 показали, что при использовании интегральных методов (дифференциальная сканирующая калориметрия, спектроскопия кругового дихроизма) Hsp22 демонстрирует непрерывный тепловой переход, тогда как при исследовании температурных зависимостей триптофановой флуоресценции обнаружен четкий кооперативный переход, для которого были рассчитаны термодинамические параметры. Сделан вывод о том, что этот переход отражает локальную денатурацию небольшой, но достаточно хорошо упакованной части а-кристаллинового домена Hsp22, содержащей остаток триптофана 96.

4) Точечные замены аминокислотных остатков К141Е и К137Е (и особенно двойная замена К141/137Е) оказывают дестабилизирующее влияние на структуру Hsp22, что заметно отражается на его функциях: эти замены значительно снижают термостабильность Hsp22 и приводят к уменьшению его шапероноподобной активности.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Казаков, Алексей Сергеевич, Москва

1. Клюева А.В., Левчук Ю.Н., Набока Ю.Н. (2002) Фотон-корреляционная спектроскопия белков, Укр. биохим. журнал, т. 74, №5, с. 12—26.

2. Панасенко О.О., Ким М.В., Гусев Н.Б. (2003) Структура и свойства малых белков теплового шока. Успехи биологической химии т. 43, 59—98

3. Пермяков Е.А. Метод собственной люминесценции белка. Наука, Москва, 2003.

4. Пивоварова А.В. «Влияние малых белков теплового шока на тепловую агрегацию F-актина». Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук, Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, Москва, 2008 г.

5. Попов Е.М., Демин В.В., Шибанова Е.Д. «Проблема белка». Москва, 1996 г., т. 2. С. 418-421.

6. Финкельштейн А.В., Иванков Д.Н., Галзитская О.В. (2005) Предсказание скоростей и ядер сворачивания глобулярных белков на основе теории их самоорганизации. Успехи биологической химии, т. 45, С. 3-36.

7. Abulimiti A., Fu X., Gu, L., Feng X. and Chang Z. (2003). Mycobacterium tuberculosis Hspl6.3 nonamers are assembled and re-assembled via trimer and hexamer intermediates. J. Mol. Biol. 326, 1013-1023.

8. Agius M.A., Kirvan C.A., Schafer A.L., Gudipati E., Zhu S. (1999) High prevalence of anti- alpha-crystallin antibodies in multiple sclerosis: correlation with severity and activity of disease. Acta Neurol. Scand. 100, 139-147.

9. Andley U.P., Mathur S., Griest T.A. and Petrash J.M. (1996) Cloning, expression, and chaperone-like activity of human alphaA-crystallin. J. Biol. Chem. 271, 31973-31980.

10. Barth A, Zscherp C. (2002) What vibrations tell us about proteins. Q. Rev. Biophys. 35, 369-430.

11. Bera S., Thampi P., Cho W.J., Abraham E.C. (2002) A positive charge preservation at position 116 of alphaA-crystallin is critical for its structural and functional integrity. Biochemistry 41, 12421-12426.

12. Bhattacharyya J., and Sharma K.K. (2001) Conformational specificity of mini-aA-crystallin as a molecular chaperone. J. Peptide Res. 57, 428-434.

13. Bhattacharyya J., Padmanabha Udupa E. G., Wang J., and Sharma K.K. (2006) Mini-alphaB-crystallin: a functional element of alphaB-crystallin with chaperone-like activity. Biochemistry 45, 3069-3076

14. Bova M.P., Huang Q., Ding L., and Horwitz J. (2002) Subunit exchange, conformational stability, and chaperone-like function of the small heat shock protein 16.5 from Methanococcus jannaschii. J. Biol. Chem. 277, 38468-38475.

15. Bukach O.V., Seit-Nebi A.S., Marston S.B., and Gusev N.B. (2003) Some properties of human small heat shock protein Hsp20 (HspB6). Eur. J. Biochem. 271, 291-302.

16. Bukau B. and Horwich A.L. (1998) The Hsp70 and Hsp60 chaperone machines. Cell 92, 351-366.

17. Burstein E.A., Abornev S.M., and Reshetnyak Y.K. (2001a) Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. I. Decomposition algorithms. Biophys. J. 81, 1699-1709.

18. Burstein E.A., Abornev S.M., and Reshetnyak Y.K. (2001b) Decomposition of protein tryptophan fluorescence spectra into log-normal components. II. The statistical proof of discreteness of tryptophan classes in proteins. Biophys. J. 81, 1710-1734.

19. Bushueva T.L., Busel E.P., and Burstein E.A. (1978) Relationship of thermal quenching of protein fluorescence to intramolecular structural mobility. Biochim. Biophys. Acta 534, 141-152.

20. Bushueva T.L., Busel E.P., and Burstein E.A. (1980) Some regularities of dynamic accessibility of buried fluorescent residues to external quenchers in proteins. Arch. Biochem. Biophys. 204, 161-166.

21. Bryngelson J.D., Onuchic J.N., Socci N.D., and Wolynes P.G. (1995) Funnels, pathways, and the energy landscape of protein folding: a synthesis. Proteins 21, 167-195.

22. Carral S., Sivilotti M., Zobel A.T.C., Lambert H., and Landry J. (2005) HspB8, small heat shock protein mutated in human neuromuscular disorders, has in vivo chaperone activity in cultured cells. Human Mol. Gen. 141, 1659-1669.

23. Carra S., Brunsting J.F., Lambert H., Landry J., and Kampinga H.H. (2009) HspB8 participates in protein quality control by a non-chaperone-like mechanism that requires eIF2{alpha} phosphorylation. J. Biol. Chem. 284, 5523-5532.

24. Carver J.A., Esposito G., Schwedersky G., and Gaestel M. (1995) !H-NMR spectroscopy reveals that mouse Hsp25 has a flexible C-terminal extension of 18 amino acids. FEBS Lett. 369, 305-310.

25. Charpentier A.H., Bednarek A.K., Daniel R.L., Hawkins K.A., Laflin K.J., Gaddis S., MacLeod M.C., and Aldaz C.M. (2000) Effects of estrogen on global gene expression: identification of novel targets of estrogen action. Cancer Res. 60, 5977-5983.

26. Chavez Zobel A.T., Loranger A., Marceau N., Theriault J.R., Lambert H., and Landry J. (2003) Distinct chaperone mechanisms can delay the formation of aggresomes by the myopathy-causing R120G alphaB-crystallin mutant. Human Mol. Genet. 12, 1609-1620.

27. Chernik I.S., Panasenko O.O., Li Y., Marston S.B., and Gusev N.B. (2004) pH-induced changes of the structure of small heat shock proteins with molecular mass 24/27 kDa (HspBl). Biochem. Biophys. Res. Commun. 324,1199-1203.

28. Chowdary Т.К., Raman В., Ramakrishna Т., and Rao C.M. (2004) Mammalian Hsp22 is a heat-inducible small heat-shock protein with chaperone-like activity. Biochem. J. 381, 379-387.

29. Depre C., Hase M., Gaussin V., Zajac A., Wang L., Hittinger L., Ghaleh В., Yu X., Kudej R.K., Wagner Т., Sadoshima J., and Vatner, S. F. (2002) HI 1 kinase is a novel mediator of myocardial hypertrophy in vivo. Circ. Res. 91, 1007-1014.

30. Dill K.A., Shortle D. (1991) Denatured states of proteins. Annu. Rev. Biochem. 60, 795825.

31. Dragan A.I., Privalov P.L. (2002) Unfolding of a leucine zipper is not a simple two-state transition. J. Mol Biol. 321, 891-908.

32. Dudich I.V., Zav'yalov V.P., Pfeil W„ Gastel M., Zav'yalova G.A., Denesyuk A.I., Korpela T. (1995) Dimer structure as a minimum cooperative subunit of small heat-shock proteins. Biochim. Biophys. Acta. 125, 163-168.

33. Eaton WA. (1999) Searching for "downhill scenarios" in protein folding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 5897-5899.

34. Eifert С., Burgio M.R., Bennett P.M., Salerno J.C., Koretz J.F. (2005) N-terminal control of small heat shock protein oligomerization: Changes in aggregate size and chaperone-like function. Biochim. Biophys. Acta. 1748, 146-156.

35. Farnsworth P.N. and Singh K. (2000) Self-complementary motifs (SCM) in alphacrystallin small heat shock proteins. FEBSLett. 482, 175-179.

36. Feil I.K., Malfois M., Hendle J., van Der Zandt H., and Svergun D.I. (2001) A novel quaternary structure of the dimeric alpha-crystallin domain with chaperone-like activity. J. Bio.l Chem. 276, 12024-12029.

37. Feng X., Huang S., Fu X., Abulimiti A., and Chang Z. (2002) The reassembling process of the nonameric Mycobacterium tuberculosis small heat-shock protein Hspl6.3 occurs via a stepwise mechanism. Biochem. J. 363, 329-334.

38. Fonte V., Kapulkin V., Taft A., Fluet A., Friedman D., Link C.D. (2002) Interaction of intracellular beta amyloid peptide with chaperone proteins. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99, 9439-9444.

39. Franck E., Madsen O., van Rheede Т., Ricard G., Huynen M.A., de Jong W.W. (2004) Evolutionary diversity of Vertebrate small heat shock proteins. Mol. Evol. 59, 792-802.

40. Garcia-Mira M.M., Sadqi M., Fischer N., Sanchez-Ruiz J.M., and Munoz V. (2002) Experimental identification of downhill protein folding. Science 298, 2191-2195.

41. Gast K., Damaschun H., Eckert K., Schulze-Foster K., Maurer H.R., Mtiller-Frohne M., Zirwer D., Czarnecki J., and Damaschun G. (1995) Prothymosin a: A biologically active protein with random coil conformation. Biochemistry 34, 13211-13218.

42. Ghosh J.G., Estrada M.R. and Clark J.I. (2005) Interactive domains for chaperone activity in the small heat shock protein, human alphaB crystallin. Biochemistry 44, 14854-14869

43. Ghosh J.G., and Clark J.I. (2005) Insights into the domains required for dimerization and assembly of human alphaB crystallin. Protein Sci. 14, 684—695.

44. Gober M.D., Smith C.C., Ueda K., Toretsky J.A., Aurelian L. (2003) Forced expression of the Hll heat shock protein can be regulated by DNA methylation and trigger apoptosis in human cells. J. Biol. Chem. 278, 37600-37609.

45. Golitsina N.L., Shnyrov V.L., and Levitsky D.I. (1992) Thermal denaturation of the alkali light chain-20 kDa fragment complex obtained from myosin sub fragment 1. FEBS Lett. 303, 255-257.

46. Guo Z., and Cooper L.F. (2000) An N-terminal 33-amino-acid-deletion variant of hsp25 retains oligomerization and functional properties. Biochem. Biophys. Res. Commun. 270, 183-189.

47. Hackel M, Hinz H.J., Hedwig G.R. (1999) A new set of peptide-based group heat capacities for use in protein stability calculations. J. Mol. Biol. 291, 197-213.

48. Haley D.A., Horwitz J., and Stewart P.L. (1998) The small heat-shock protein, alphaB-crystallin, has a variable quaternary structure. J. Mol. Biol. 277, 27-35.

49. Hase M., Depre С., Vatner S.F. and Sadoshima J. (2005) Hll has dose-dependent and dual hypertrophic and proapoptotic functions in cardiac myocytes. Biochem. J. 388, 475483.

50. Haslbeck M. (2002) sHsps and their role in the chaperone network. Cell. Moll. Life Sci. 59, 1649-1657.

51. Haslbeck M., Ignatiou A., Saibil H., Helmich S., Frenzl E., Stromer Т., and Buchner J. (2004) A domain in the N-terminal part of Hsp26 is essential for chaperone function and oligomerization. J. Mol. Biol 343,445-455.

52. Haslbeck M., Walke S., Stromer Т., Ehrnsperger M., White H.E., Chen S., Saibil H.R., and Buchner J. (1999) Hsp26: a temperature-regulated chaperone. EMBO. J. 18, 67446751.

53. Haslbeck M., Franzmann Т., Weinfiirtner D., Buchner J. (2005) Some like it hot: the structure and function of small heat-shock proteins. Nature Struct. Mol. Biol. 10, 842846.

54. Haugland R.P. (1996) Handbook of fluorescent probes and research chemicals. Molecular Probes, 6 edition.

55. Head M.W., Corbin E., and Goldman J.E. (1993) Overexpression and abnormal modification of the stress proteins alpha B-crystallin and hsp27 in Alexander disease. Am. J. Pathol. 143, 1743-1753.

56. Hedges J.C., Dechert M.A., Yamboliev I.A., Martin J.L., Hickey E., Weber L.A., and Gerthoffer W.T. (1999) A role for p38(MAPK)/HSP27 pathway in smooth muscle cell migration. J. Biol. Chem. 274, 24211-24219.

57. Horwitz J., Huang Q. and Ding L. (2004) The native oligomeric organization of alphacrystallin, is it necessary for its chaperone function? Exp. Eye Res. 79, 817-821.

58. Hu Z„ Chen L., Zhang J., Li Т., Tang J., Xu N., Wang X. (2007) Structure, function, properties and role in neurological diseases and other diseases of sHsp22. J. Neurosci. Res. 85, 2071-2079

59. Irobi J., Van Impe K., Seeman P., Jordanova A., Direck I., Verpooten N., Michalik A., De Vriendt E., Jacobs A., Van Gerwen V., et al. (2004) Hot spot residue in small heat-shock protein 22 causes distal motor neuropathy. Nature Genetics 36, 597-601.

60. Ito H., Okamoto K., Nakayama H., Isobe Т., and Kato K. (1997) Phosphorylation of alphaB-crystallin in response to various types of stress. J. Biol. Chem. 272, 29934-29941.

61. Javid В., MacAry P.A., and Lehner P.J. (2007) Structure and function: heat shock proteins and adaptive immunity. J. Immunol. 179, 2035-40.

62. Kappe G., Franck E., Verschuure P., Boelens W.C., Leunissen J.A. and de Jong W.W. (2003) The human genome encodes 10 alpha-crystallin-related small heat shock proteins: HspBl-10. Cell Stress Chaperones 8, 53-61.

63. Kato K., Ito H., Kamei K., Inaguma Y., Iwamoto I., and Saga, S. (1998) Phosphorylation of alphaB-crystallin in mitotic cells and identification of enzymatic activities responsible for phosphorylation. J. Biol. Chem. 273, 28346-28354.

64. Kataoka M., Kuwajima K., Tokunaga F., and Goto Y. (1997) Structural characterization of the molten globule of alpha-lactalbumin by solution X-ray scattering. Protein Sci. 6, 422—430.

65. Kim M.V., Seit-Nebi A.S., Marston S.B. and Gusev N.B. (2004a) Some properties of human small heat shock protein Hsp22 (Hll or HspB8). Biochem. Biophys. Res.1. Commun. 315, 796-801.

66. Kim M.V., Seit-Nebi A.S. and Gusev N.B. (2004b) The problem of protein kinase activity of small heat shock protein Hsp22 (HI 1 or HspB8). Biochem. Biophys. Res. Commun. 325, 649652.

67. Kim M.V., Kasakov A.S., Seit-Nebi A.S., Marston S.B., Gusev N.B. (2006) Structure and properties of K141E mutant of small heat shock protein HSP22 (HspB8, HI 1) that is expressed in human neuromuscular disorders. Arch. Biochem. Biophys. 454. 32-41.

68. Kim K.K., Kim R., and Kim S.H. (1998) Crystal structure of a small heat-shock protein. Nature 394, 595-599.

69. Klemenz R., Frohli E., Steiger R.H., Schafer R., and Aoyama A. (1991) aB-crystallin is small heat shock protein. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 3652-3656.

70. Kokke B.P., Leroux M.R., Candido E.P., Boelens W.C., de Jong W.W. (1997) Caenorhabditis elegans small heat-shock proteins Hspl2.2 and Hspl2.3 form tetramers and have no chaperone-like activity. FEBSLett. 433, 228-232.

71. Kremneva E., Nikolaeva O., Maytum R., Arutyunyan A.M., Kleimenov S.Yu., Geeves M.A., and Levitsky D.I. (2006) Thermal unfolding of smooth muscle and nonmuscle tropomyosin a-homodimers with alternatively spliced exons. FEBS J. 272, 588-600.

72. Kumar L.V., Ramakrishna Т., Rao C.M. (1999) Structural and functional consequences of the mutation of a conserved arginine residue in alphaA-crystallin and alphaB-crystallins. J. Biol Chem. 274, 24137-24141.

73. Kumarapeli A.R., Wang,X. (2004) Genetic modification of heart: chaperones and the cytoskeleton. J. Mol. Cell Cardiol. 37, 1097-1109.

74. Laemmli U.K. (1970) Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature 227, 680-685.

75. Lambert H., Charette S.J., Bernier A.F., Guimond A., and Landry J. (1999) HSP27 multimerization mediated by phosphorylation-sensitive intermolecular interactions at the amino terminus. J. Biol. Chem. 274, 9378-9385.

76. Lebowitz J., Lewis M.S., Schuck P. (2002) Modem analytical ultracentrifugation in protein science: a tutorial review. Protein Sci. 11, 2067-2079.

77. Lelj-Garolla В & Mauk AG (2005) Self-association of a small heat shock protein. J. Mol. Biol. 345, 631-642.

78. Leroux M.R., Ma B.J., Batelier G., Melki R., and Candido E.P.M. (1997) Unique Structural Features of a Novel Class of Small Heat Shock Proteins. J. Biol. Chem. 272, 12847-12853.

79. Leroux M.R., Melki R., Gordon В., Batelier G., and Candido E.P. (1997) Structurefunction studies on small heat shock protein oligomeric assembly and interaction with unfolded polypeptides. J. Biol. Chem. 272, 24646-24656.

80. Liang J.J. (2000) Interaction between beta-amyloid and alpha B-crystallin. FEBS Lett. 484, 98-101.

81. Lindner R.A., Kapur A., and Carver J.A. (1997) The interaction of the molecular chaperone, alpha-crystallin, with molten globule states of bovine alpha-lactalbumin. J. Biol. Chem. 272, 27722-27729.

82. Litt M., Kramer P., LaMorticella D.M., Murphey W., Lovrien E.W., Weler R.G. (1998) Autosomal dominant congenital cataract associated with a missense mutation in the human alpha crystallin gene CRYAA. Human Mol. Genet. 7, 471-474.

83. Markov D.I., Pivovarova A.V., Chernik I.S., Gusev N.B., and Levitsky D.I. (2008) Small heat shock protein Hsp27 protects myosin SI from heat-induced aggregation, but not from thermal denaturation and ATPase inactivation. FEBS Lett. 582, 1407-1412.

84. Makhatadze G.I., Privalov P.L. (1990) Heat capacity of proteins. I. Partial molar heat capacity of individual amino acid residues in aqueous solution: hydration effect. J. Mol. Biol. 213, 375-384.

85. Makhatadze G.I., Medvedkin V.N., Privalov P.L. (1990) Partial molar volumes of polypeptides and their constituent groups in aqueous solution over a broad temperature range. Biopolymers 30, 1001-1010.

86. Makhatadze G.I., Privalov P.L., (1995) Energetics of protein structure. Adv. Protein Chem. 47, 307-425.

87. Markovich R.J., Pidgeon C. (1991) Introduction to Fourier transform infrared spectroscopy and applications in the pharmaceutical sciences. Pharm. Res. 8, 663-75.

88. Meador W.E., Means A.R., and Quiocho F.A. (1992) Target enzyme recognition by calmodulin: 2.4 A structure of a calmodulin-peptide complex. Science 257, 1251-1255.106.107.108.109.110.111.112.113,114,115,116117118119

89. Merrill A.R., Cohen F.S., and Cramer W.A. (1990) On the nature of the structural change of the colicin El channel peptide necessary for its translocation-competent state. Biochemistry 29, 5829-5836.

90. Morimoto R.I. (1998). Regulation of the heat shock transcriptional response: cross talk between a family of heat shock factors, molecular chaperones, and negative regulators. Gen. Dev. 12, 3788-3796.

91. Muchowski P.J., Hays L.G., Yates J.R., Clark G.I. (1999) ATP and the core "alpha-Crystallin" domain of the small heat-shock protein alphaB-crystallin. J. Biol. Chem. 274, 30190-30195.

92. Panasenko O.O., Seit Nebi A., Bukach O.V., Marston S.B., and Gusev N.B. (2002) Structure and properties of avian small heat shock protein with molecular weight 25 kDa. Biochim. Biophys. Acta 1601, 64-74.

93. Panasenko O.O., Kim M.V., Marston S.B., and Gusev N.B. (2003) Interaction of the small heat shock protein with molecular mass 25 kDa (hsp25) with actin. Eur. J. Biochem. 270, 892-901.

94. Pappu R.V., Srinivasan R., and Rose G.D. (2000) The Flory isolated-pair hypothesis is not valid for polypeptide chains: Implications for protein folding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97, 12565-12570.

95. Pivovarova A.V., Mikhailova V.V., Chernik I.S., Chebotareva N.A., Levitsky D.I., and

96. Gusev N.B. (2005) Effects of small heat shock proteins on the thermal denaturation andaggregation of F-actin. Biochem. Biophys. Res. Commun. 331, 1548-1553.

97. Pivovarova A.V., Chebotareva N.A., Chernik I.S., Gusev N.B., and Levitsky D.I. (2007)

98. Small heat shock protein Hsp27 prevents heat-induced aggregation of F-actin by formingsoluble complexes with denatured actin. FEBSJ. 274, 5937-5948.

99. Plater M.L., Goode D., and Crabbe M.J. (1996) Effects of site-directed mutations on thechaperone-like activity of alphaB-crystallin. J. Biol. Chem. 271, 28558-28566.

100. Privalov P.L. and Potekhin S.A. (1986) Scanning microcalorimetry in studyingtemperature-induced changes in proteins. Methods Enzyrnol. 131, 4-51.

101. Ptitsyn O.B. (1995) Molten globule and protein folding. Adv. Protein Chem. 47, 83-229.

102. Romero P., Obradovic Z., Kissinger C., Villafranca J.E, Garner E., Guilliot S., and

103. Dunker A.K. (1998). Thousands of proteins likely to have long disordered regions. Рас.

104. Symp. Biocomput. 3, 437-448.

105. Romero P., Obradovic Z., and Dunker A.K. (2001) Intelligent data analysis for protein disorder prediction. Artif. Intell. Rev. 14, 447-484.

106. Sabelko J, Ervin J, Gruebele M. (1999) Observation of strange kinetics in protein folding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96, 6031-6036.

107. Sadqi M., de Alba E., Perez-Jimenez R., Sanchez-Ruiz J.M., Munoz V. (2009) A designed protein as experimental model of primordial folding. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 106,4127-4132.

108. Santhoshkumar P. and Sharma K.K., (2001) Phe71 is essential for chaperone-like function in aA-crystallin. J. Biol. Chem. 276, 47094-47099.

109. Sharma K.K., Kumar R.S., Kumar G.S., and Quinn P.T. (2000) Synthesis and characterization of a peptide identified as a functional element in alphaA-crystallin. J. Biol. Chem. 275, 3767-3771.

110. Schwarz P.M., Liggins J.R., Luduena R.F. (1998) P-Tubulin isotypes purified from bovine brain have different relative stabilities. Biochemistry 37, 4687—4692.138.139.140.141.142.143.144.145.146.147,148.149150,151152

111. Schweers О., Schonbrunn Hanebeck E., Marx A., and Mandelkow E. (1994) Structural studies of tau protein and Alzheimer paired helical filaments show no evidence for beta-structure. J. Biol. Chem. 269, 24290-24297.

112. Solomaha E. and Palfrey H.C. (2005) Conformational changes in dynamin on GTP binding and oligomerization reported by intrinsic and extrinsic fluorescence. Biochem. J. 391, 601-611.

113. Sreelakshmi Y. and Sharma K.K. (2005) Recognition sequence 2 (residues 60-70) plays a role in oligomerization and exchange dynamics of aB-crystallin. Biochemistry 44, 1224512252.

114. Sreerama N. and Woody R. W. (2004) Computation and analysis of protein circular dichroism spectra. Methods Enzymol. 383, 318-51

115. Sreerama N., Woody R.W. (2000) Estimation of protein secondary structure from circular dichroism spectra: comparison of CONTIN, SELCON, and CDSSTR methods with an expanded reference set. Anal. Biochem. 287, 252-60.

116. Stamler R., Kappe G., Boelens W., and Slingsby C. (2005) Wrapping the alpha-crystallin domain fold in a chaperone assembly. J. Mol. Biol. 353, 68-79.

117. Studer S., Obrist M., Lentze N., and Narberhaus F. (2002) A critical motif for oligomerization and chaperone activity of bacterial alpha-heat shock proteins. Eur. J. Biochem. 269, 3578-3586.

118. Sudhakar K. and Fay P.J. (1996) Exposed hydrophobic sites in factor VIII and isolated subunits. J. Biol. Chem. Ill, 23015-23021.

119. Sun X., Fontaine J.-M., Rest J.S., Shelden E.A., Welsh M.J. (2004) Interaction of human Hsp22 (HspB8) with other small heat shock proteins. J. Biol. Chem. 279, 2394-2402.

120. Syme C.D., Blanch E.W., Holt C., Jakes R., Goedert M., Hecht L., Barron L.D. (2002) A Raman optical activity study of rheomorphism in caseins, synucleins and tau. Eur. J. Biochem. 269, 148-156

121. Taylor R.P. and Benjamin I.J. (2005) Small heat shock proteins: a new classification scheme in mammals. J. Mol. Cell Cardiol. 38, 433-444.

122. Theriault J.R., Lambert H., Chavez-Zobel A.T., Charest G., Lavigne P., and Landry J. (2004) Essential role of the NH2-terminal WD/EPF motif in the phosphorylation-activated protective function of mammalian Hsp27. J. Biol. Chem. 279, 23463-23471.

123. Tompa P. (2002) Intrinsically unstructured proteins. Trends in Biochem. Sci. 27, 527-533.

124. Turoverov K.K., Khaitlina S.Yu., Pinaev G.P. (1976) Ultra-violet fluorescence of actin. Determination of native actin content in actin preparations. FEBS Lett. 62, 4-7.

125. Turoverov K.K. and Kuznetsova I.M. (2003) Intrinsic fluorescence of actin, J. Fluoresc. 13,41-57.

126. Uversky V.N. and Ptitsyn O.B. (1996a) Further evidence on the equilibrium "pre-molten globule state": Four-state GdmCl-induced unfolding of carbonicanhydrase В at low temperature. J. Mol. Biol. 255, 215-228.

127. Uversky V.N., Winter S., and Lober G. (1996b) Use of fluorescence decay times of 8-ANS-protein complexes to study the conformational transitions in proteins which unfold through the molten globule state. Biophys. Chem. 60, 79-88.

128. Uversky V.N. (1997) Diversity of compact forms of denatured globular proteins. Protein Pept. Lett. 4, 355-367.

129. Uversky V.N., Gillespie J.R., and Fink A.L. (2000a) Why are "natively unfolded" proteins unstructured under the physiological conditions? Proteins Struct. Funct. Genet. 41,415-427.

130. Uversky V.N. Gillespie J.R., and Fink A.L. (2000c) Why are 'natively unfolded' proteins unstructured under physiologic conditions? Proteins 41, 415—427

131. Uversky V.N. (2002) Natively unfolded proteins: A point where biology waits for physics. Prot. Sci. 11, 739-756.

132. Wandingerl S.K., Richter K., and Buchner J. (2008) The Hsp90 chaperone machinery. J. Biol. Chem. 283, 18473-18477.

133. Wang K., Spector A. (1994) The chaperone activity, of bovine alpha crystalline. Interaction with other lens crystallins in native and denatured states. J. Biol. Chem. 269, 13601-13608.

134. Wang L., Zajac A., Hedhli N., and Depre C. (2004) Increased expression of Hll kinase stimulated glycogen synthesis in the heart. Mol. Cell Biochem. 265, 71-87.

135. Weast R. (1976-1977) Handbook of chemistry and physics, 57th edition, CRC Press, Cleveland.

136. Weeds A.G. and Taylor R.S. (1975) Separation of subfragment-1 isoenzymes from rabbit skeletal muscle myosin. Nature 257, 54-56.

137. Weinreb P.H., Zhen W., Poon A.W., Conway K.A., and Lansbury P.T., Jr. (1996) NACP, a protein implicated in Alzheimer's diseases and learning, is natively unfolded. Biochemistry 35, 13709-13715.

138. Williamson M.P. (1994) The structure and function of proline-rich regions in proteins. Biochem. J. 297, 249-260

139. Wright P.E. and Dyson H.J. (1999) Intrinsically unstructured proteins: Reassessing the protein structure-function paradigm. J. Mol. Biol. 293, 321-331.

140. Yang C, Trent S, Ionescu-Tiba V, Lan L, Shioda T, Sgroi D, Schmidt EV. (2006) Identification of cyclinDl and estrogen-regulated genes contributing to breast carcinogenesis and progression. Cancer Res. 66, 11649-11658.

141. Zwanzig R. (1995) Simple model of protein folding kinetics. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 9801-9804.1. БЛАГОДАРНОСТИ

142. Я искренне признателен своему научному руководителю доктору биологических наук, профессору Дмитрию Ивановичу Левицкому за внимательное, чуткое и доброжелательное руководство, а также плодотворное участие в моей судьбе.

143. Я благодарен своим коллегам и друзьям из Института биохимии им. А. Н. Баха РАН за неоценимую помощь в работе, поддержку и доброту.

144. Я благодарен моим родным и близким за моральную поддержку даже в самые смутные времена.

145. Данная работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ и Программы «Молекулярная и клеточная биология» Президиума РАН.

Информация о работе

Казаков, Алексей Сергеевич
кандидата биологических наук
Москва, 2009
ВАК 03.00.04

Диссертация

Физико-химические и шапероноподобные свойства малого белка теплового шока Hsp22 человека - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы