Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние фенольных соединений на ионные токи двигательного нервного окончания

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние фенольных соединений на ионные токи двигательного нервного окончания"

МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ КАЗАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

\ ' ■,,. Ка правах рукописи

СИТДИКОВА ГУЗЕЛЬ ФАРИТОВНА

ВЛИЯНИЕ ФЕНОЛЬНЫХ СОЕДИНЕНИЙ НА ИОННЫЕ ТОКИ ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕРВНОГО ОКОНЧАНИЯ

03. 00. 13 — физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

КАЗАНЬ 1895

Работа выполнена на кафедрах физиологии человека и животных Казанского государственного университета и нормальной физиологии Казанского медицинского университета.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Алатырев В. И.

заслуж. деятель науки РТ, доктор медицинских наук, профессор Зефиров А. Л.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Каталымов Л. Л.

доктор медицинских наук, профессор Полетаев Г. И.

Ведущее учреждение: Московский государственный университет им. М. В. Ломоносова

Защита состоится . 3/ « С'С/ .>'// _/995 г>

в - /4 _я час. на заседании диссертационного Совета К113.19.02 при Казанском государственном педагогическом университете по адресу: 420021, Казань, ул. Межлаука, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Казанского государственного педагогического университета

Автореферат разослан „ 29 - 3 1995 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, кандидат биологических наук, доцент

\

И. 111. Макалеев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. Исследование модуляции синап-тической передачи является одной из актуальных областей нейрофизиологии, так как позволяет выявить механизмы, определяющие эффективность работы синапса.

Модуляция синаптической передачи может осуществляться при участии гуморальных агентов, присутствующих в самом организме, в частности, медиаторов, гормонов и продуктов их метаболизма (Кирзон, Каменская, 1969; Гусева, Пушкарев, 1970; Полетаев, 1972, 1974; Матюшкин, 1980, 1989; Зефиров, Шакирьянова, 1993). Вызванная квантовая секреция медиатора чрезвычайно чувствительна к изменениям мембранного потенциала нервного окончания во время распространяющегося нервного импульса (Gage, 1967; Katz, Miledy, 1967; Kusano et al., 1967; Moigo, TheslefT, 1982; Van der Kloot, Molgo, 1994), следовательно, модулируя характеристики потенциала действия нервной терминали, можно регулировать функции синапса. Действие физиологически активных веществ может осуществляться путем изменения этих характеристик.

Феномен облегчающего эффекта катехоламинов (адреналина и норадреналина) на синаптическую передачу давно привлекает внимание исследователей. Впервые заметное увеличение работоспособности предварительно утомленного нервно-мышечного препарата при раздражении симпатического нерва было показано Ор-бели и Гинецинским (Орбели, 1923; Гинецинский, 1926). Изучению механизмов влияния катехоламинов на нервно-мышечную передачу были посвящены работы ряда исследователей (Jenkinson et al., 1968; Hidaka, Kuriyama, 1969; Кирзон, Каменская, 1969; Kuba, 1970; Полетаев, 1974; Bergman et al., 1981; Van der Kloot, Van der Moot, 1986; Wessler, Anschutz, 1988; Chen, Diyden, 1991; Zi, 1991), что послужило основанием для развития представлений об "адаптационно-трофической функции" симпатоадреналовой системы.

В то же время было обнаружено, что физиологической активностью обладают не только молекулы катехоламинов, но и их естественные метаболиты, относящиеся к классу фенольных соединений (Утевский, 1964, 1969; Матлина, Меньшиков, 1967; Полетаев, 1972, 1974; Халилов и др., 1993). В частности, было показано облегчающее действие фенолов на нервно-мышечную передачу в скелетных мышцах теплокровных и холоднокровных животных (Rothberger, 1902; Mogey, Young, 1949; Otsuka, Nonomura, 1963; Kuba, 1969; Blaber, Gallagcr, 1971; Полетаев, 1972, 1974; Флеров, 1977; Takashi, 1983; Koh-lclii, Takashi, 1985). Установлено, что фенол и его производные вызывают значительное усиление спонтан-

ного и вызванного освобождения медиатора путем воздействия на мембрану нервного окончания (Otsuka, Nonomura, 1963; Kuba, 1969; Blaber, Gallager, 1971; Полетаев, 1972, 1974; Anderson, Harvey, 1988; Халилов и др., 1993). Однако, пресинаптические механизмы модулирующего действия этих соединений остаются невыясненными. Не исследовано их влияние на элекгрогенез мембраны нервной терминали, неизвестны ионные механизмы облегчающего эффекта фенолов.

Изучение влияния фенолов на нервно-мышечную передачу представляет интерес еще и потому, что фенолы являются одними из наиболее опасных токсических веществ, содержащихся в стоках ряда производств (Грушко, 1982). Признаки отравления водных животных рядом фенольных соединений (состояние возбуждения и увеличение двигательной активности, переходящее в судороги и паралич) (Флеров, 1977; Лукьяненко, 1983; Лукьянов, Фролов, 1983) также свидетельствуют о нарушении синаптической передачи.

В связи с этим нам представлялось интересным изучить конкретные механизмы действия продуктов естественного метаболизма гормонов и медиаторов симлатоадреналовой системы на вызванную секрецию медиатора, а также механизмы нейротоксического действия экзогенных фенолов при отравлении организма.

Цель и задачи исследования. Целью работы было изучение пресинаптических механизмов влияния фенольных веществ на нервно-мышечные соединения холоднокровных и теплокровных животных.

В соответствий с этой целью были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать влияние группы фенольных соединений на спонтанную и вызванную квантовую секрецию медиатора.

2. Изучить влияние ряда фенольных веществ на электрические ответы в различных участках двигательного нервного окончания в нервно- мышечных соединениях кожно-грудинной мышцы лягушки и диафрагмальной мышцы мыши.

3. Исследовать тонкие механизмы действия фенолов на ионные токи двигательного нервного окончания лягушки.

Научная новизна. Исследовано действие ряда фенольных соединений (фенол, пирокатехин, гидрохинон, резорцин, орто-крезол, пирогаллол) на параметры ответа нервного окончания и секрецию медиатора в нервно-мышечном соединении лягушки. Установлено, что наибольшим ас|х|)сктом на пресинаптическое звено синлити-чсской передачи среди исследовавшихся фенолов обладает пирока-

а

техин, имеющий две гидроксильные группы в орто-положении. В работе впервые проведено детальное исследование действия пирокатехина на ионные токи двигательного нервного окончания лягушки. Установлено, что причиной усиления секреции медиатора под действием фенольных веществ является увеличение длительности потенциала действия нервного окончания вследствие затягивания потенциалзависимого калиевого тока, что приводит к усилению входа кальция в нервную терминаль. Получены новые данные о модулирующем влиянии фенолов на потенщхалзависимый калиевый ток мембраны нервной терминали. Показано, что и в нервно-мышечном соединении мыши пирокатехин также изменяет калиевый ток двигательной нервной терминали.

Положения, выносимые да защиту

1. В нервно-мышечном соединении лягушки фенольные вещества изменяют кинетику развития потенциалзависимого калиевого тока мембраны нервного окончания.

2. Изменение кинетики развития потенциалзависимого калиевого тока является главной причиной усиления вызванной секреции медиатора.

3. В ряду фенольиых соединений (фенол, пирокатехин, гидрохинон, резорцин, орто:крезол, пирогаллол) наибольшим облегчающим эффектом на вызванную секрецию медиатора обладает пирокатехин.

Научно-практическая ценность. Проведенное исследование имеет важное теоретическое1 значение. Полученные результаты позволяют сделать вывод о механизмах модулирующего влияния фе-нольных соединений на нервно-мышечную передачу. В работе показано, что пирокатехин и другие фенолы оказывают модулирующий эффект на работу потенциалзависимых калиевых каналов, что проясняет причины усиления секреции медиатора при действии фенолов. Выявлено наиболее эффективное соединение в ряду фенолов, что дает возможность анализа структуры молекулярных компонентов потенциалзависимых калиевых каналов, ответственных за их активацию, а также могут явиться основой для целенаправленного синтеза веществ, модулирующих работу ионных каналов нервного окончания и усиливающих синаптическую передачу. Эти соединения могут быть использованы для лечения некоторых заболеваний нервно-мышечного аппарата. Полученные экспериментальные данные расширяют представления о способах преси-наптичсской регуляции работы нервно-мышечного синапса, о ме-

ханизмах, лежащих в основе регуляции секреции медиатора из двигательного нервного окончания.

Результаты исследования имеют практическую ценность для физиологов, фармакологов и токсикологов при изучении влияния биологически активных и нейротоксических веществ на функции синапса.

Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Всесоюзном симпозиуме "Физиология медиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1991), на 1-ом съезде Физиологического общества России (Москва-Пущино, 1993), на Республиканской научной конференции физиологов, посвященной 95-летию со дня рождения М.В.Сергиевского (Самара, 1993), на заседаниях кафедры физиологии человека и животных Казанского государственного университета и Казанского педагогического университета (Казань, 1995).

Реализация результатов исследования. По материалам диссертации опубликовано 5 работ. Результаты исследований включены в лекционный курс по физиологии человека и животных, в спецкурс по физиологии возбудимых систем, молекулярной биологии для студентов Казанского государственного университета и в лекционный курс по нормальной физиологии для студентов Казанского государственного медицинского университета.

Структура ц объем диссертации. Диссертация объемом 107 страниц состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Список цитируемой литературы включает 218 названий, из них 46 отечественных и 172 иностранных авторов. Диссертация содержит 17 рисунков и 5 таблиц.

ОБЪЕКТ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проводили на нервно-мышечных препаратах кожно-грудинной мышцы лягушки Rana ridibunda в осенне-зимний период и диафрагмальной мышцы белых мышей.

Нервно-мышечный препарат выделяли и помещали в стеклянную ванночку с рабочим объемом 3 мл. Мышцу растягивали на 110-120% от первоначальной длины при помощи стальных крючков. Все эксперименты выполнены при постоянной наружной перфузии препарата со скоростью 5 мл/мин.

Для работы с холоднокровными животными использовали стандартный раствор Рингера следующего состава (в ммоль/л): NaCl-118.0; KCl-2,5; СаС12-1,8; NaHC03-2,4, температура -20°С, рН - 7,2-7,4. В экспериментах на мышах препарат перфузировали рас-

твором Кребса следующего состава (в ммоль/л): NaCl-154,0; КС1-5,0; NaH2P04-l,0; CaClr2,0; MgCl2-l,0; глюкоза-11, температура 22°С, рН - 7,2. До начала опыта раствор Кребса насыщали карбо-геном (02-95%, С02-5%) в течение 30-40 мин, а также аэрировали раствор во время эксперимента.

Для устранения потенциала действия (ПД) и сокращения мышечных волокон использовали раствор с пониженным содержанием ионов Са2+ (0,3-0,4 ммоль/л - для холоднокровных; 0,6-0,8 ммоль/л - для теплокровных) и повышенным содержанием ионов Mg2+ ( 2-4 ммоль/л для холоднокровных; 6-8 моль/л для теплокровных). В ряде опытов в раствор добавляли тубокурарин в концентрации 3x10-6 - 3x10-5 моль/л.

Электрические ответы нервного окончания и концевой пластинки отводили внеклеточно при помощи стеклянных микроэлектродов из стекла "Пирекс". Из-за маленького рабочего расстояния микроскопа (2 мм) вытянутый электрод изгибался нагреванием в двух местах. Микроэлектроды с внутренним диаметром кончика 13 мкм и сопротивлением 2-5 МОм заполняли раствором NaCl (2 моль/л).

Для визуализации поверхностно расположенных нервных окончаний и подведения к ним микроэлектродов использовали оптическую систему на базе поляризационно-интерференционного микроскопа "Биолар" (увеличение хЗОО, х400), позволяющего увидеть живые неокрашенные нервные терминали.

Раздражение двигательного нерва производили прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0,15-0,2 мс сверхпороговой амплитуды при помощи стимулятора ЭСЛ-2.

Для усиления биопотенциалов использовали двухканальный усилитель на интегральных микросхемах. После усиления сигналы усредняли и регистрировали с экрана осциллографа С1-83 с использованием автоматизированной системы на базе IBM РС-АТ286. Усредненные ответы (30-50 реализаций, интервал измерения 25 мкс) выводились на печать или анализировались с экрана компьютера.

Квантовый состав тока, концевой пластинки (ТКП) - m -определяли по формуле: rn= lnN/N|, где N - количество раздражений, Nt - количество раздражений, не вызвавших ТКП (Каменская, 1972).

Определяли следующие параметры ответа нервного окончания: длительности и амплитуды второй и третьей фаз ответа.

Экспериментальные данные обработаны общепринятыми ста-тистичсскими методами (Лакин, 1990). Для оценки достоверности различий использовали t-критсрий Стьюдента.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Модулирующее действие ряда Фенольных веществ на нервно-

мышечную передачу.

При исследовании ряда фенолов оказалось, что степень облегчающею эффекта на секрецию медиатора зависит от структурных особенностей веществ. Мы исследовали такие соединения, как фенол, пирокатехин, гидрохинон, резорцин, о-крезол, пирогаллол и коричную кислоту, различающиеся по качеству, количеству и расположению радикалов. Коричная или фгнилакриловая кислота, содержащая вместо гидроксильной группы акриловый радикал, служила в качестве контроля на гидроксильную группу. Все соединения исследовались в концентрации 0,1 ммоль/л. Усиление секреции медиатора под действием указанных соединений сопровождалось изменением параметров ответа нервного окончания, а именно, увеличением длительности ответа за счет удлинения 2-ой и 3-ей фаз, а также уменьшением амплитуды 3-ей фазы ответа.

Таблица. 1.

Эффект фенольных соединений и коричной кислоты на квантовый

состав ТКП

Исследуемые соединения Квантовый состав ТКП йзменени е квантового состава ТКП, % п

Норма Эффект

фенол 0,19+0,07 0,46±0,1 229*** ■ 9

пирокатехин 0,36±0,06 1,27+0,03 302*** 9

резорцин 0,27±0,03 0,82±0,0б 209*** 5

гидрохинон 0,26+0,05 0,58+0,03 170** 5

о-крезол 0,29±0,02 0,39±0,04 56** 5

пирогаллол 0,28±0,01 0,32+0,03 14 5

коричная кислота 0,31 ±0,03 0,33±0,02 6 5

Примечание: п - количество опытов,

*** - р<0,001; ** - р<0,01; *•- р<0,05.

Всс соединения исследовались в концентрации

0,1 ммоль/л

По эффективности влияния на квантовый состав ТКП и параметры ответа нервного окончания исследовавшиеся соединения распределились следующим образом: пирокатехин >фенол >резориин > гидрохинон>орто-крезол (табл.1).

Коричная кислота не вызывала изменения квантового состава ТКП и параметров ответа нервного окончания, что свидетельствует о необходимости наличия ОН--группы для проявления эффекта. Таким образом, увеличение секреции медиатора и длительности ответа нервного окончания зависят от наличия, количества и расположения гидроксильных групп. Наиболее эффективной структурной формулой в данном ряду соединений обладает пирокатехин, имеющий две ОН- - группы в орто-положении. Дальнейшее исследование ионных механизмов облегчающего действия фенолов проводили с использованием пирокатехина в концентрации 0,05 ммоль/л.

Действие пирокатехина на ионные токи в различных участках двигательного нервного окончания лягушки и мыши В различных участках нервной терминали лягушки амплитуда и форма внеклеточно регистрируемых сигналов неодинакова. В проксимальном отделе нервного окончания (5-30 мкм от последнего сегмента миелина) регистрируется трехфазный ответ, состоящий из первой и третьей положительных и второй отрицательной фаз. Первая положительная фаза представляет собой пассивный (емкостной) выходящий ток, генерируемый набегающим ПД, вторая отрицательная фаза ответа - входящий натриевый ток, третья фаза отражает выходящий калиевый ток, реполяризующий мембрану нервного окончания. При перемещении электрода в ди-стальном направлении наблюдается постепенное уменьшение третьей фазы ответа, тогда как негативная фаза расширяется и становится меньше. В центральном отделе нервной терминали регистрируется двухфазный ответ, а в конечных участках терминали он приобретает практически монофазную форму (МаПап, 1984; Зефиров, Халилов, 1987).

Анализ изменения параметров трехфазного ответа нервного окончания, регистрируемого в проксимальном участке нервной терминали, показал, что под действием пирокатехина в концентрации 0,05 ммоль/л через 10-15 мин перфузии длительность ответа, измеренная от начала первой фазы до конца третьей, увеличивалась до 144,7+10,8% (п=9, Р<0,001) по сравнению с нормой за счет расширения 2-ой и 3-ей фаз ответа нервного окончания (Рис.],а).

В нейтральном участке нервного окончания (двухфазный отпет) также наблюдали увеличение длительности ответа до

119±1б,9% по сравнению с нормой (п=5, р<0,01) (Рис.1,б), в самых конечных участках терминальной веточки (монофазный ответ) пирокатехин не изменял параметров ответа и квантового состава ТКП (Рис.1,в).

Рис.1. Влияние пирокатехина на ответы нервного окончания и секрецию медиатора в проксимальном (а), центральном (б) и ди-стальном (в) участках нервно-мышечного синапса лягушки. Эффект пирокатехина указан стрелками.

Исходя из известной идентификации ионных токов вдоль нервной терминали, предположили, что обнаруженные эффекты пирокатехина обусловлены его влиянием на калиевый компонент ионных токов мембраны нервного окончания. Уменьшения эффекта вещества по ходу нервной терминали, вероятно, связано с тем, что по ходу нервного окончания происходит уменьшение плотности калиевых каналов (Ма11аг1, 1984; Зефиров, Халилов, 1985). Установлено, что в проксимальном и центральном участках нервной терминали плотность калиевых каналов наибольшая. Отсюда следует, что эффект пирокатехина на целом синапсе связан, главным образом, с усилением секреции медиатора в его проксимальных и центральных участках.

Эффекты пирокатехина на ионные токи и квантовый состав ТКП развиваются одновременно и к 15 мин действия достигают максимального эффекта, поэтому можно считать, что увеличение длительности ответа нервного окончания является непосредственной причиной усиления секреции медиатора.

Для сравнения эффекта пирокатехина на ионные токи холоднокровных и теплокровных животных исследовали влияние пирокатехина на ионные токи двигательного нервного окончания мыши. Известно, что процессы генерации и распространения возбуж-

л

в

-А

81

дения в двигательных нервных терминалях теплокровных и холоднокровных животных существенно отличаются (Brigant, Mallart, 1982; Konishi, 1985; Зефиров, Халилов, 1985; Lindgren, Moore, 1989; Mallart, 1989).

Ответы нервного окончания отводились при локализации кончика микроэлектрода вблизи претерминального и терминального участков нервной терминала мыши. В претерминальной области регистрировали ответ, состоящий из одной положительной и двух отрицательных фаз (претерминальный ответ). В дистальной области терминали ответ нервного окончания состоял из двух положительных фаз (терминальный ответ). Положительная фаза претерминального ответа обусловлена пассивной деполяризацией, первая отрицательная фаза создается входящим натриевым током, вторая отрицательная фаза отражает калиевый ток. Терминальный ответ состоит из пассивного деполяризующего тока (первая положительная фаза) и реполяризующего калиевого (вторая положительная фаза) (Brigant, Mallart, 1982; Konishi, 1985). Опыты показали, что под действием пирокатехина происходит удлинение ответа и уменьшение амплитуды калиевой составляющей как в претерми-нальном, так и в терминальном участках нервного окончания, что позволяет сделать заключение о сходном механизме влияния пирокатехина на нервно-мышечную передачу холоднокровных и теплокровных животных путем изменения калиевой составляющей ионных токов нерйного окончания.

Эффект пирокатехина на ионные токи двигательного нервного окончания в присутствии специфических блокаторов калиевых каналов

Для выяснений канальных механизмов влияния пирокатехина регистрировали ответы в проксимальном участке нервного окончания лягушки, где ярко выражена третья фаза ответа. Известно, что третья фаза ответа нервного окончания отражает выходящий калиевый ток через кальцийактивируемые и потенциалзависимые калиевые каналы (Mallart, 1984; Зефиров и др., 1987). Была проведена серия опытов с использованием специфических блокаторов калиевых каналов. В условиях блокирования потенциалзависимых и кальцийактивируемых калиевых каналов тетраэтиламмонием (5 ммоль/л) пирокатехин не влиял на параметры ответа нервного окончания (Рис.2,а). Этот факт подтверждает калиевую природу тока, модифицируемого пирокатехином.

Для того, чтобы выяснить модуляция какого из двух типов калиевых токов приводит к увеличению длительности ответа нервного окончания под действием исследованного вещества, нами были проведены опыты с использованием специфического блокатора

потенциалзависимых калиевых каналов 4-аминопирндина. Обнаружилось, что в присутствии 4-аминопирвдина (0,1 ммоль/л) пирокатехин не оказывает влияния ни на форму ответа нервного окончания, ни на квантовый состав ТКП (Рис.2,б). Так, через 15 мин перфузии раствора, содержащего пирокатехин, длительность ответа нервного окончания составила 103+3,33% от нормы (п—7, р>0,05), а квантовый состав ТКП- - 108+11,32% от нормы (п=7, р>0,05). Недостоверные изменения квантового состава ТКП и длительности ответа нервного окончания свидетельствуют о том, что на фоне блокирования потенциалзависимых калиевых каналов 4-аминопириднном пирокатехин не влияет на ответ нервного окончания и ТКП. Представленные экспериментальные данные свиде-детельствуют, что эффект усиления освобождения медиатора, наблюдающийся в присутствии пирокатехина, опосредуется через по-тенциалзависимый калиевый ток мембраны нервного окончания.

Действие пирокатехина на ионные токи двигательного нервного окончания в бескальниевом растворе и в условиях блокирования кальциевого тока двухвалентными ионами Усиление освобождения медиатора и изменения параметров ответа нервного окончания могут быть связаны с прямым воздействием пирокатехина на кальциевый ток мембраны нервного окончания. Для проверки этого предположения были проведены серии опытов в бескальциевом растворе и на фоне блокаторов кальциевых каналов.

Для связывания ионизированного кальция использовали ЭДТА (этилендиаминтетраацетат), который добавляли в концентрации 1 ммоль/л в бескальциевый раствор, содержащий 4 ммоль/л ионов магния, и перфузировали препарат в течении часа до начала опыта. Эксперименты показали, что в данных условиях эффекты пирокатехина на длительность ответа нервного окончания и амплитуду его третьей фазы сохраняется. Так длительность ответа нервного окончания увеличивалась до 144+18% (п=5, р<0,01) по сравнению с нормой. Таким образом, оказалось, что эффект пирокатехина на ионные токи нервного окончания сохраняется и в бескальциевой среде.

На фоне подавления кальциевого тока ионами Мп2+(7 ммоль/л) и ионами Со2+ (5 ммоль/л) добавление пирокатехина приводило к удлинению во времени ответа нервного окончания и уменьшению амплитуды третьей фазы ответа (Рис.2,в). Следовательно, блокирование кальциевых каналов не устраняет эффекта пирокатехина на параметры ответа нервного окончания.

Таким образом, на основании полученных результатов можно утверждать, что эффект усиления секреции медиатора, вызываемый

пирокатехином, не связан с его воздействием на входящий кальциевый ток мембраны нервного окончания.

В исследовании влияния пирокатехина на ионные токи двигательного нервного окончания мыши было предположено, что пирокатехин подавляет потенциалзависимый калиевый ток мембраны нервного окончания (Andereon, Harvey, 1988), действуя подобно 4-аминопиридниу. Структурное сходство фенолов и 4-амииошфидина делает это предположение вполне вероятным (TaKashi, 1983; Koh-Ichi, Takashi, 1985; Andereon, Harvey, 1988). Однако, нами было показано, что в отсутствии калъцнйактивируемого калиевого тока ( бескальциевая среда или блокирования кальциевых каналов), эффект пирокатехина на длительность ответа нервного окончания сохраняется. В данной серии опытов третья фаза ответа нервного окончания обуславливается выходящим потен-циалзависимым калиевым током. Под действием пирокатехина происходит увеличение длительности и уменьшение амплитуды 3-ей фазы, но не ее подавление. Мы предполагаем, что механизм действия пирокатехина отличиется от блокирующего эффекта 4-аминопиридина на потенциалзависимый калиевый ток. Вероятно, пирокатехин модифицирует работу потенциалзависимых калиевых каналов, изменяя кинетику их активации.

Известно, что потенциалзависимый калиевый ток играет существенную роль в пресинаптической реполяризации, укорачивая временное течение входящего натриевого тога. Изменение кинетики работы потенциалзависимых калиевых каналов могло бы вызвать увеличение длительности входящего натриевого тока. Удлинение ответа нервного окончания ведет к усилению входящего кальциевого тока и, следовательно, к увеличению секреции медиатора.

Исследование влияния пирокатехина на отпеты нервного окончания в условиях угнетения активности анетнлхолин-зстеразы (АХЭ) и действие ацетилхолина (АХ) на Фоне пирокатехина

Существовала гипотеза, что облегчающий эффект фенольных соединений происходит благодаря их ацетилхолинэстеразному действию (Лукьянов, Фролов, 1983).

Поэтому нами были проведены эксперименты с ингибитором АХЭ прозерином (Зх1(Н ммоль/л), блокирующими специфическую и неспецифическую АХЭ. О степени угнетения АХЭ судили по удлинению времени полуспада миниатюрных токов концевой пластинки. Обнаружили, что в условиях угнетения АХЭ пирокатехин оказывал тот же эффект на ионные токи нервного окончания, что при интактной АХЭ (Рис.2,г). Под действием пирокатехина

в

Рис 2. Действие пирокатехина в концентрации 0,05 ммоль/л на ионные токи в проксимальном отделе нервной терминали. Эффект пирокатехина (указан стрелками) на ионные токи в присутствии тетраэтиламмония (а), 4-аминопиридина (б), блокаторов кальциевых каналов (в), в условиях ингибирования ацетилхолинэстеразы .прозсрином (г).

происходило удлинение ответа нервного окончания до 141,4+17,8% <н=8, р<0.01) по сравнению с нормой.

Таким образом, экспериментальные данные позволяют предположить, что увеличение секреции медиатора не связано с анти-

холинэстеразным эффектом пирокатехина, а модификация кинетики потенциалзависимого калиевого тока на опосредуется АХЭ си-наптической щели.

В исследованиях действия АХ на ионные токи двигательного нервного окончания было обнаружено, что АХ з концентрации 0,1-0,6 ммоль/л вызывает значительное увеличение 3-ей фазы ответа (Зефиров, Шакирьянова, 1992; 1993). Авторы предположили, что данный эффект обусловлен изменением кинетического поведения потенциалзависимых калиевых каналов - резким возрастанием времени активации каналов. Причем эффект АХ проявлялся лишь при наличии интактной АХЭ в синоптической щели (Зефиров, 1993; ааУгуапоуа ег а!., 1994).

Поскольку мы предполагаем модифицирующее влияние пирокатехина на потенциал зависимый калиевый ток, было интересно посмотреть проявляется ли эффект АХ на фоне действия пирокатехина. В норме АХ в концентрации 0,1 ммоль/л вызывал резкое увеличение 3-ей фазы через 3-5 мин после начала своего действия. Однако, на фоне действия пирокатехина эффект усиления 3-ей фазы при действии АХ не проявлялся.

Таким образом, можно предположить, что мишенью действия пирокатехина и АХ действительно является потенциалзависимый калиевый ток мембраны нервного окончания, однако, молекулярные механизмы их эффекта различны. Возможно, изменение кинетики потенциалзависимого калиевого тока обуславливается воздействием АХ и пирокатехина на различные структурные компоненты калиевого канала или систем, с ним связанных, так, что при действии одного вещества эффект второго уже не может проявиться. •

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, полученные в настоящем исследовании результаты свидетельствуют о том, что пирокатехин в концентрации 0,05 ммоль/л модифицирует кинетику развития потенциалзависимого калиевого тока двигательной нервной терминали лягушки, что приводит к увеличению длительности ответа нервного окончания и является главной причиной усиления вызванной секреции медиатора при действии фенольных соединений.

В синапсах мыши пирокатехин в той же концентрации увеличивает длительность ответа нервного окончания за счет изменения калиевых токов двигательной нервной терминали.

Действие пирокатехина отличается от модифицирующего влияния АХ на потенциалзависимый калиевый ток мембраны нервного окончания и не связано с АХЭ синаптической щели.

Для выявления зависимости между структурой вещества и степенью облегчающего эффекта на вызванную секрецию медиатора исследованы фенольные соединения различной структуры (фенол, пирокатехин, гидрохинон, резорцин, о-крезол, пирогаллол). Оказалось, что наибольшим эффектом на секрецию медиатора и изменение параметров ответа нервного окончания в данном ряду соединений обладает пирокатехин, имеющий две гидроксиль-ные группы в орто-положении.

Изменение кинетики развития потенциалзависимого калиевого тока и усиление секреции медиатора, по-видимому, лежит и в основе токсического эффекта фенолов. Резкое увеличение амлиту-ды ТКП может привести к появлению потенциалов действия и ритмической активности мышечного волокна, что соответствует внешним признакам фенольного отравления, а именно, увеличению двигательной активности, судорогам.

Таким образом, в основе усиления вызванной секреции медиатора фенольными соединениями лежит изменение кинетики развития потенциалзависимого калиевого тока мембраны нервного окончания, что является также и механизмом нейротоксического действия при острых отравлениях экзогенными фенолами.

ВЫВОДЫ

1. Облегчающее действие фенольных веществ на нервно-мышечную передачу у холоднокровных и теплокровных животных обусловлено усилением вызванной секреции медиатора за счет увеличения длительности электрического ответа двигательного нервного окончания.

2. Наибольшим эффектом на длительность ответа нервного окончания лягушки в ряду фенолов (пирокатехин, фенол, резорцин, гидрохинон, о-крезол, пирогаллол) обладает пирокатехин, наименьшим - о-крезол. Пирогаллол и коричная кислота не оказывают влияния на параметры ответа нервного окончания.

3. В нервно-мышечном соединении лягушки пирокатехин в концентрации 0,05 ммоль/л изменяет кинетику развития потенциалзависимого калиевого тока мембраны нервного окончания, что проявляется в увеличении длительности 2-ой и 3-ей фаз и уменьшении амплитуды 3-ей фазы ответа в проксимальном участке нервного окончания.

4. Увеличение длительности ответа нервного окончания не связано с влиянием пирокатехина на кальцийактивируемый калиевый ток.

5. Изменение кинетики развития потенциалзависимого калиевого тока под действием пирокатехина не зависит от наличия

калышя в среде и блокирования кальциевого тока ионами кобальта и марганца.

6. Эффект пирокатехина на потенциалзависимый калиевый ток не связан с ацетилхолииэстеразой синаптической щели.

7. В нервно-мышечном соединении мыши пирокатехин в концентрации 0,05 ммоль/л увеличивает длительность ответа нервного окончания за счет изменения калиевых токов двигательной нервной терминали.

8. Модифицирующее влияние фенолов на потенциалзависимый калиевый ток мембраны нервного окончания отличается от эффекта ацетилхолина, на фоне действия пирокатехина ацетилхо-лин не оказывает модулирующего эффекта на потенциалзависимый калиевый ток.

9. Модулирующее влияние на потенциалзависимый калиевый ток мембраны нервного окончания является главным механизмом усиления вызванной секреции медиатора фенольными соединениями.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Халилов И.А., Ситдикова Г.Ф. Исследование влияния фенола и пирокатехина на синаптическую передачу // Физиология медиаторов. Периферический синапс,- Тез. докл. Всесоюзн. симпозиума 11-13 июня 1991г., Казань. - 1991.- С.112.

2. Ситдикова Г.Ф., Халилов И.А., Алатырев В.И. К вопросу о механизме действия 4-аминопиридина // Тез. Республ. научной конференции физиологов, посвященной 95-летию со дня рожд. М.В.Сергиевского, Самара. - 1993. - С. 114-115.

3. Халилов И.А., Ситдикова Г.Ф., Зефиров АЛ. Влияние пирокатехина на нервно-мышечную передачу // Нейрофизиология. -

1993.-Т.1, N6,-С.405-408.

4. Ситдикова Г.Ф., Халилов И.А. Пресинаптические механизмы действия фенола и пирокатехина // Успехи физиол. наук. -.

1994. - т.25, вып.4, N4. - С.61.

5. Ситдикова Г.Ф., Халилов И.А., Зефиров А.Л. Влияние фенола на ионные токи двигательного нервного окончания лягушки //Физиологический журнал. - 1995. - ( в печати)

Подписано к печати 27/1Х-95

Тир.100_- _Зак.194-9Ь

Лаборатория офсетной печати Казанского госпедуниверситета 420015 г.Казань, ул.Пушкина,!.