Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние субстанции Р на синаптическую передачу

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Влияние субстанции Р на синаптическую передачу"

КАЗАНСКИЙ ОРДЕНА.ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ

На правах рукописи ОЩЕПКОВА СОФЬЯ ФАРИТОВНА

ВЛИЯНИЕ СУБСТАНЦИИ Р НА СИНАПТИЧЕСКУЮ ПЕРЕДАЧУ

03.00.13 - физиология человека и животных

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени . кандидата биологических наук

КАЗАНЬ 1992

Работа выполнена е Казанском ордена Ленина и о|>!>чт '1 руцоиого Красного Знамени государственном ушторонтоте им. В, И. Ульянова-Л о нина.

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Зефиров Л.Н., доктор медицинских наук, профессор Зефиров А.Л.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор Дубипей П.В., доктор биологических наук, щюфессор Габдрахманов Р.Ш.

Ведущие учреждение: Московский государственный у нивпрситет .

Дуайта состоится • Л5 "фе^гЛ&иН 1982 г. в — часов на заседании специализированного теоретического Сонета У, 113.19.02 Казанского ордена Трудового Красного Знамени государственного педагогического института (420021, г.Казань, уа.М.Межлаука, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке:- Казанского педагогического института.

Автореферат разослан " "сЛ1802 г.

Ученый секретарь опепиалнзировшшого. Совета, канд.бпоа.наук

И.Ш.Маканеев

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность___исследования;. Многочисленные исследования

передатчиков нервных импульсов и их рецепторов показали, что с классическими медиаторами тесно связаны и взаимодействуют регуляторные пептиды lEkblad et al,, 1986, Boarder, 1889, Dartfai ei al., 1988). Одним из актуальных вопросов, связанных с проблемой нейропептидов, является выяснение их функциональной роли и механизмов действия на передачу сигнала в синапсах. Среди пептидов наиболее длительную историю изучения имеет вещество Р - пептид из семейства тахикининов. Доказано, что субстанция Р является медиатором в центральной и периферической нервной системе [Dun ei al., 1982, Katayama et al., 1978, Murase et al., 1984, Otsuka et al., 1987]. Однако полагают, что именно модуляторное, а не медиаторное действиэ нейропептидов составляет основу их влияния на вегетативные функции, психофизиологические процессы и поведение CKow et al., 19383. Отсюда понятен повышенный интерес к модулирующим эффектам вещества Р в центральных и периферических синапсах. Данные литературы неоднозначно раскрывают модулирующее действие субстанции Р на синаятическую передачу. Показано, что вещество Р усиливает освобождение ацетилхолина в синапсах миентерального сплетения морской свинки, скелетной шшцы цыпленка, крысы, лягушки CAkasu et al., 1986, Wali, 1985,• Yau et al.. 1986). E то r.e время имеются данные, указывавшее на подавление секреции медиатора в нервно-мышечном соединении холоднокровных при действии субстанции Р CSteinaoker, П771. В экспериментах по изучению модулирующего влияния данного пептида на поетсинаптическу» мембрану выявлены два противоположных эффекта : подавление и облегчение десенситизации холинорецепторов в клетках симпатического ганглия, феохромоцитомы PC 12, в хроыаффинных клетках и в концевой пластинке скелетной мышцы лягушки [Akasu, 1983, 1984, 1986, 1988, Boyd et al., 1984, Clapham et al., 1987]. При этом не изучено действие субстанции Р на десенситизации к постсинаптическу» потенциацию, развивавшееся при ритмической стимуляции двигательного нерва. Удобной моделью для исследования модулирующих эффектов биологически активны; веществ иг холинергическуп синаптическую передачу является

нервно-шшечное соединение, на котором можно досконально проанализировать тонкие механизмы влияния субстанции Р на пре- и постсинаптические структуры.

ШЗЬ-И.зглача.исслеаования,. Целью данной работы являлось изучение механизмов пре- и постсинаптического модулирующего влияния субстанции Р в синапсах теплокровных и холоднокровных животных при использовании нервно-мышечного соединения как модели холинергического синапса.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи :

1. Исследовать пресинаптическое действие вещества Р на интегральные ионные токи двигательного нервного окончания и секрецию медиатора з нервно-мшечном синапсе холоднокровных и теплокровных животных.

2. Изучить постсинаптическое влияние субстанции Р на амплитудно-временные характеристики миниатюрных токов концевой пластинки СМТКГО и ТКП при ритмической стимуляции двигательного нерва в нервно-мышечном соединении лягушки.

3. Провести поиск рецепторов для вещества Р в плазматических мембрг-ах мигечных волокон диафрагмы мши.

ШННс>я_новизна;_ Исследовано влияние субстанции Р на ионные токи двигательного нервного окончания и. секреции медиатора в нервно-мшечном соединении лягушки и мыши. Показано, что одним из механизмов увеличения секреции, медиатора на фоне действия вещества Р является уменьшение кальций-активируемого калиевого тока и расширение потенциала действия нервного окончания, что приводит к усилению входа ионов кальция в пресинаптическое окончание. Установлено, что эффекты вещества Р на ионные токи двигательного нервного окончания и секрецию медиатора идентичны в синапсах. холоднокровных и теплокровных .животных и имеют место при низком уровне квантовой секреции ацетилхолина. Исследовано действие субстанции Р на токи концевой пластинки в ходе ритмической активности сигапса, т.е. в условиях, близких к естественным. Показано, что вещество Р в низких концентрациях усиливает постсинаптическую потенциацию. При увеличении концентрации пептида- происходит снижение чувствительности постсинаптической мембраны к медиатору, т.е. развитие десекситизации. Постсинаптическиэ эффекты субстанции Р в ходе ритмической активности синапса выявляются при высоком уровне квантовой секреции медиатора. Впервые проведен поиск рецепторов для вецества Р в мембранах мышечных волокон

диафрагмы мыши. Не обнаружено специфического связывания %-субстанции Р с плазматическими мембранами мышечного волокна диафрагмы мыши, что служит доказательством отсутствия рецепторов для вещества Р в постсинаптической мембране нервно-мышечного соединения.

1. Субстанция Р оказывает пре- и постсинаптическое модулирующее действие на передачу возбуждения в нервно-мышечном соединении теплокровных и холоднокровных животных.

2. В мембранах мышечных волокон диафрагмы мыши не обнаружено рецепторов чля вещества Р.

_ВзУЗН9гЯВа!£1аН§СЕаа_иевдд51ь1. Результаты работы позволяет сделать вывод, что субстанция Р оказывает существенное модулирующее влияние на передачу возбуждения в нервно-мышечном соединении. Полученные экспериментальные данные помогут глубже понять функцию вещества Р в холинергических синапсах центральной и периферической нервной системы. Пре- и постсинаптические модулирующие эффекты субстанции Р определяется концентрацией пептида, условиями функционирования синапса (ионный состав среды, активность ацетилхолинэстеразы, частота стимуляции) и могут быть противоположными по функциональному значении, что служит доказательством многокомпонентного влияния вещества Р на передачу возбуждения в холинергических синапсах. Способность вещества Р в малых дозах оказывать значительное влияние на нервно-мыше.чнуп передачу дает основание рассматривать данный пептид как потенциальное фармакологическое средство, действие которого направлено на сохранение эффективности синаптичесхой колинергической передачи.

&ШейЭйия_ваботы.. Основные результаты диссертации положены на 3 Всесоюзном симпозиуме "Ионные каналы в дологических мембранах" (Кара-Д.яг, 1990), V Всесоюзной сонференции "Физиология и биохимия ыедиаторных процессов" 'Москва, 1990), на Всесоюзном симпозиуме "Физиология «едиаторов. Периферический синапс" (Казань, 1991), III !сесоюзной конференции по нейронаукам СКиев, 1990), на гаучных заседаниях Татарского отделения Всесоюзного жзиологического общества им. И.П.Павлова (Казань, 1991), .афедры физиологии человека -д животных КГУ (Казань, 1991) к :афедры анатомии, физиологии и охраны труда человека КГЖ

СКазаиь, 1992).

,Реализащя_Еезудьтатоа_й2саей2йаиид1. По материалам . диссертации опубликовано 5 работ. Данные исследований включены в лекционный курс по нормальной физиологии для студентов Казанского государственного университета и Казанского государственного медицинского института.

_СтвУК12Еа_и_объей_аисе§ехаиаа^ Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, результатов исследования и их odcyздания, заключения, выводов и указателя литературы. Работа изложена на 107 страницах, иллюстрирована 10 рисунками и 5 таблицами Указатель литературы вклсчает 220 работ, из них - 189 иностранных авторов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 1.ЭЯЕКТРОФИЭИОЛОГЙЧЕСКИЕ МЕТОДЫ.

Эксперименты проводили на изолированных нервно-мышечных препаратах портняжной и кохно-грудянной мышц лягушек С Rana ridibunda и Rana temporaria) в осенне-зимний период и на нервно-мышечных препаратах диафрагмы белых лабораторных мышей. Эксперименты выполняли в условиях непрерывной перфузии нервно-мышечного препарата со скоростью 5-10 мл/мин. Стандартный раствор Рингера для холоднокровных имел следующий ионный состав Св мколь/л) : ÍJaCl-115,0, KCl-2,5, CaClg-1,8, NaHC03-2,4, pH поддерживали на уровне 7,2-7,4. Для устранения потенциалов действия СПД) и сокращений мышечных волокон использовали: а) метод поперечного рассечения мышечных волокон; б) раствор Рингера с пониженной концентрацией ионов Са2+ (0,4 ммоль/л) и повышенным содержанием ионов Мзг+ С2 ммоль/л); в) раствор Рингера с d-тубокурарином (2,10~^иаль/л) В экспериментах на теплокровных животных использовали раствор Рингера-Кребса следующего состава Св ммоль/л) : NaCl-137,0, KCl-5,0, СаС12-2,0, MgCl2-l,0. NaHC03 -24,0, NaHgPO^ - 1,0, глюкоза -11,0, pH=7,2-7,3. Сокращения мышцы предотвращали добавлением магния (6 :шоль/л) при пониженном содержании кальция СО,6 ммоль/л). За 40-50 шнут до начала и во время экспериментов Шффузиониый раствор аэрировали карбогеноы ; 5%-CC^D. Все; эксперименты проводили при

температуре 20-22°С. Двигательный нерв раздражали прямоугольными электрическими импульсами длительностью 0,1-0,3 ла. Применячи зледуюадае виды стимуляции : 1)ритмическое раздражение с частотой 0,5-1 кмл/с. 2)ларное

раидракение с интервалом ЮОмс; 3) пачка импульсов с частотой 10/с. Использовали следующие методы регистрации синаптических сигналов: 1)внеклеточное отведение одним микроэлектродом; 2)внутриклеточное отведение в условиях двухэлектродной фиксации мембранного потенциала. Накопление к последующий анализ МТКП и ТКП производили с помощью автоматизированной системы на ¿азе накопителя сигналов Ф-36 и миниЭВМ ДЗ-28. Рассчитывали следующие параметры синаптических сигналов : амплитуда сигналов, постоянная времени спада т (которая рассчитывалась аппроксимацией зкепонентой по методу наименьших квадратов спада сигналов на участке 80-20% максимальной амплитуды), период полуспада, латентный период, синаптическая задержка. При низком уровне вызванной секреции медиатора квантовый состав (и) определяли по формуле :

где - общее количество раздражений нерва, г^

количество выпадений ТКП С Del Kastillo, Katz, 1954, Hubbard et ai., 1969, Куффлер, Николе, 1979). При высоком уровне вызванной секреции медиатора квантовый состав рассчитывали по

формуле : й_ашлитуда ТКП

амплитуда МТКП

2. РАДИОЯИГАНДНЫЙ МЕТОД. В экспериментах по определению связывания ® Н-субстанции Р с мембранами мышечных волокон использовали диафрагмаяьные шшцы, выделенные у 10 лабораторных белых »алией. Биологический материал и используемые растворы во время работа содержали в кюветах со льдом. Стандартный буферный раствор имел следувшдай состав в ммоль/л : ТРИС HCl - 50, KCl -50, CaClg - 2, MgCl2 - 1, NaCl - 120; pH=7,4. Гомогенизации предварительно измельченной мышцы производили при помощи гомогенизатора типа "тефлон-стекло" (соотношение ткань:буфер - 1:203 с интервалами для охлаждения. Гомогенат центрифугировали при 20 000 G в течение 45 минут (t=4° С). Полученный осадок ресуспендировали в 0,32 M растворе сахарозы и центрифугировали 10 минут при 800 G Ct=4°C). Супернатант вновь центрифугировали. 45 минут при 20000 G (t=4o0< Образовавшийся при атом осадок триада прем; то лл:: t»

ресуспендировали в стандартном буфере. - Наличие плазматических мембран в гомогенате проверяли с помощью электронного микроскопа JEM-100 при инструментальном увеличении х 12000. Содержание белка в пробе определяли по методу Lowry С1951). Проба для выявления связывания ® Н-субстандии Р с изолированными мембранами мышечных клеток имела объем 250 мкл и содержала 25 мкл ^-субстанции Р, 25 мкл стандартного буфера ТРИС НС1 или 25 мкл немеченого пептида и 200 мкл гомогената Смембран). Инкубацию проб проводили в водяной бане и завершали добавлением в пробирки 2 мл холодного буфера. Мембраны отделяги от инкубационной смеси путем фильтрования через стекловолокнистые фильтры СWhatman, GF/B или GF/C), которые после высушивания под вакуумом помещали во флаконы на 20 мл. Определение радиоактивности мембран, осажденных на фильтрах, осуществляли с использованием толуолового сцинтиллятора СРР0-4г, РОР0Р-О,2г, толуол до 1л) при помощи-счетчика MARK II. Экстракция радиоактивности фильтров длилась 24 часа. Время просчета каждого флакона составляло 120 секунд. Результат счета выражали в имп/мин.

3, СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ДАННЫХ. Во всех сериях экспериментов вычисляли . среднюю арифметическую, дисперсию и стандартную ошибку средней. Для определения достоверности средних значений как двух несвязанных совокупностей и совокупностей с попарно-связанными вариантами использовали Т - критерий Стьюдента. При оценке двух эмпирических совокупностей считали максимально доступным 5% уровень значимости. Различия между совокупностями считали достоверными, если Р<0.05.

_ЕЕЗУЖАТЫ_ШСЛЕ5ОВАШЙ_И_Ж_ОБСШЕЩЕ

1. ВЛИЯНИЕ СУБСТАНЦИИ Р-НА ИОННЫЕ ТОКИ ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕРВНОГО ОКОНЧАНИЯ И СЕКРЕЦИЙ МЕДИАТОРА.

В экспериментах с внеклеточным отведением синаптических сигналов при раздраконим двигательного нерва с частотой 0,5-1 имп/с регистрировали интегральные ионные токи нервного окончания и следующий за ними. вызванный постсинаптический ответ - ток концевой пластинки СТКГО. Для устранения ПД и сокращений мышечных волокон использовали раствор Рингера с пониженной концентрацией конов Са2+ СО,4 ммоль/л) и познц'гнным содержанием ионов fíg^+ (2 ммоль/л). Во всех экспериментах (п=5) субстанция Р в концентрации 10~® моль/л

значктельно усиливала секреции медиатора, что выражалось в увеличении усредненной амплитуды ТКП примерно в 2 раза и квантового состава ТКП с 0.369 до 3,219. Максимальный эффект развивался на 45-60 минуте пссле добавления пептида в перфузионный раствор. Для выяснения механизма стимулирующего действия субстанции Р на секрецию медиатора анализировали влияние вещества Р на прэсинапткческно ионные токи. В норме внеклеточно регистрируемый пресинаптический ответ проксимального участка нервной терминали шел выраженную трехфазную форму и состоял из первого и третьего положительных, второго отрицательного компонентов. Первая положительная фаза является" пассивным деполяризующим током, генерируемым набегающим ПД, вторая отрицательная фаза отражает входящий натриевый ток, а третья положительная -обусловлена калиевыми токами [Mallart, 1985, Зефиров и соавт., 1984, 1985]. Вещество Р в концентрации 1*10~6моль/л резко уменьшает поздний выходящий ток (третья положительная фаза) и расширяет пресинаптический ответ. Через 60 минут после добавления пептида в перфузионный раствор амплитуда позднего выходящего тока уменьшалась до 26,7+14,3% , а длительность суммарного ответа нервного окончания увеличивалась на 63+11,2% (п=5, Р(0,05) по сравнению с контролем, принятым за 100%. При этом минимальная синаптическая' задержка Свремя между максимумом входящего натриевого тока нервного окончания и началом постсинаптичёского ответа) увеличивалась на 62,7 + 19,3% (п=5, Р<0,05). Поскольку третья положительная фаза пресинаптического сигнала обусловлена суммой

потэнциалозависимого и Са-активируемого калиевых токов [Зефиров и соавт., 1984, 19831, возникает вопрос : на какой калиевый ток оказывает модулирующее влияние субстанция Р? Для выяснения этого мы провели эксперименты, используя специфический блокатор потенщ'алооависимых калиевых каналов 4-аминопиридин (4-АП). На фоне 4-АП в концентрации 0,2-0,4 ммоль/л все описанные выше эффекты субстанции Р сохранялись : третья положительная фаза уменьшалась до 29,2*17,3% (п=4, Р<0,05), длительность суммарного тока увеличивалась на 73,3*18,7% (п=4, Р<0,С5), синаптическая задержка удлинялась на 65,4 ± 17,4% (п=4, Р<0,05), амплитуда постеинапткч.оского ответа возрастала до 225,6 ? 22,9% (п=6, Р<0,01). Необходимо ответить, что в двух из нести окспорамзнта:: с 4-ЛЯ !,j

субстанции Р С! • 10~®моль/л) происходило полное исчезновение третьей положительной фазы. Отсюда можно сделать вывод, что венество Р подавляет или уменьшает Са-зависимый калиевый ток. Кальций-активируемый калиевый ток является своеобразным естественным ограничителем входящего кальциевого тока и препятствует длительному поступлению ионов Са в аксоплазму нервного окончания во время генерации ПД [Glavinovic , 1987 ; . Hallart , 1985 ; Зефиров и соавт., 1984, 1983]. Ионный механизм (вводящий натриевый и выходящий калиевый токи) определяет амплитуду и длительность распространяющегося ГЩ, т.е. параметры деполяризации мембраны и, следовательно, поступление кальция в пресиналтическое окончание. Вход ионов кальция инициирует слияние везикул с мембраной и секрецию ацетилхолина в нервно-мышечном синапсе. Уменьшение амплитуды Са-зависимого калиевого тока и расширение суммарного пресинаптического ответа нервного окончания на фоне субстанции Р приводят к увеличению : 1)длительности ПД; 2]величины входящего кальциевого тока, и тем самым, к усилению секреции медиатора.

Приведенный выше экспериментальный материал был получен в условиях низкого содержания ионов Са2+ (0,4 ммоль/л) в перфузионном растворе Рингера. При высокой концентрации ионов Са С 1,8 ммоль/'л) на фоне субстанции Р С1» 10~6моль/л) ни в одном из опытов Сп-4, d-тубокурарин в концентрации 2;10"^ моль/л или рассеченный препарат, 4-АП в концентрации 0,4 шоль/л) не было выявлено изменений Са-активируемого калиевого тока и амплитуды ТКП. Очевидно, пресинаптические модулируввде эффекты вещества Р имеют место лишь при пониженном содержании Сг?+ в перфузионном растворе, т.е. являются кальций-зависимыми.

Аналогичные результаты были получены в экспериментах на на нервно-мышечном препарате диафрагмы мыши Сраствор Рингера-Кребса, содержащий 0,6 ммоль/л CaCl g и 6,0 ммольхл ИдС123. Амплитуда ТКП при действии вещества Р С1-10"°моль/л) повышалась на 60,4ilS,5% в претершшальноы (п-2, Р<0,05) и на 46,0±12,7% в терминальном Сп=3, Р<0,053 участках нервного окончания, а квантовый состав увеличивался в 2-3 раза. Длительность суммарного ионного тока возрастала в среднем на 23У.-ЗС'/;, по сравнению с контролем, принятым за 100%. На фоне субстанции Р амплитуда треть>й положительной фазы уменьшалась кз 70,0tl3,2% ь претержяальком Сп=2, Р<0,05) и до 5Q,4±li,9%

в терминальном Сп=3, Р<0,053 отделах двигательного нервного окончания. Эти изменения сопровождались удлинением синаптической задержки соответственно на 20,148,6% и 24,3*10,8% . Таким образом, субстанция Р в нервно-мышечном синапсе теплокровных так же удлиняет фазу реполяриэации ПД нервного окончания и, тем самым, увеличивает вхадяций кальциевый ток и секрецию медиатора.

2. ПОСТСИИАГГШЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ СУБСТАНЦИИ Р В НЕРВНО-МЫШЕЧНОМ СИНАПСЕ ЛЯГУШКИ.

Поскольку естественной формой функционирования синаптических структур является передача ритмических серий импульсов, особый интерес представляет влияние субстанции Р на следовые процессы в постсинаптической мембране нервно-мышечного соединения, возникаюоде при ритмической стимуляции двигательного нерва, - постсинаптическую потенциацип СПСП) и десенситизацот (ДСЗ [Feliz et al., 1980, Magazanik et al., 1989, Magleby et al., 1981, Гиииатуллин и соавт., 1S861. Вероятность накопления АХ возрастает при ингибировании ацетялхояинэстеразы САХЭ) и зависит от квантового состава токов концевой пластинки (ТКП) [Гиниатуллин и соавт., 1985; Magleby et al., 19311, поэтому большую часть опытов по изучение влияния субстанции Р на Т1(П мы проводили с применением ингибитора АХЭ прозерина (3-10~6 моль/л) и при . сохранении высокого (близкого к физиологическому) квантового состава ТКП. Блокирование потенциалов действия и • сокращений мышечных волокон осуществляли с помощь» поперечного рассечения m. sartor ius лягушки. R. ridlbunda. Внутриклеточное отведение МТКП и ТКП, восникающих при раздражении двигательного нерва с частотой 1-10 имп/с, осуществляли в условиях двухэлектродной фиксации мембранного потенциала. Субстанцию Р добавляли в перфуэионннй раствор в следующих концентрациях: 5-10"7, 1-10 , 5-10"6 ноль/я.

,2.1.ВЛИЯНИЕ СУБСТАНЦИИ Р НА МТКП И МНОГОКВАНТОВЬЕ ТКП.

Субстанция Р не влияла на амплитуду и длительность МТКП и не меняла потенциалоэависимость постоянной времени спада МТКП (гмткп'' ® контрольных экспериментах при фиксации мембранного потенциала на уровне -70 мВ амплитуда МТКП составила 2,5±0Д нА •, спад был экспоненциальный с постоянной времени спада гмтш~ 1 - 26iO, 09 мс Сп=7). На фоне действия субстанции р ь концентрации !• 10"6моль/л амплитуда МТКП составила ?. 7*3,2

нЛ, а х>[ТКП= l,30t0,07 мс Сп=3, Р>0,05). Коэффициент "Н" Свеличина сдвига мембранного потенциала, необходимая для увеличения i^j, в е раз) составил 108tll Сп=6-число клеток) в контроле и 102 ± 8 Сп=3;Р>0,03) после действия пептида. По-видимому, субстанция Р не' оказывает существенного каналоблокирующего эффекта на ацетилхоликактивируемыв ионные каналы, что согласуется с данными литературы [Akasu et. al., 1983], На фоне ингибированной АХЭ при фиксации мембранного потенциала на уровне -70 мВ средняя амплитуда МТКП составляла 5,0*0,4нА, а х ткп ~ 3,7*0,2 мс Сп=12). Добавление в перфузионный раствор субстанции Р (1- моль/л) не вызывало достоверных изменений амплитудно-временных характеристик МТКП: t^jj =3,5*0,2мс Cn=U; Р>0,05), амплитуда МТКП составила 4,4±0, ЗнА Сп=11; Р>0,06). Средняя амплитуда многоквантовых ТКП в контроле при стимуляции двигательного нерва с частотой 1 раз в минуту составила 317*29нА (п=41), постоянная времени спада ТКП т _vn=8,1*0, бмс Сп=41). Введение

i ftUy с

субстанции P в концентрациях 5-10 , 1•10 и 5*10 иопь^п не вызывало достоверных изменений амплитуды ТКП. При использовании субстанции Р в концентрации 5 • 10~®моль/л наблюдалось ускорение спада многоквантовых ТКП - ттеп составила 5,3 '* 0,8мс Сп=9; Р<0,05). На фоне пептида в концентрациях

5 • 1(Г7 - 1 • 1(Га моль/я эффект на хгкп был недостоверен : соответствующие показатели составили 6,6±1,0мс Сп=5; Р>0,05) и 6,4±1,1мс (n=9; Р>0,05). v

2.2. ВЛИЯНИЕ СУБСТАНЦИИ.Р-НА ДИНАМИКУ АМШШТУД ТКП ПРИ РИТМИЧЕСКОЙ СТИМУЛЯЦИИ. '

Исследование модулирующего действия субстанции Р на динамику амплитуд ТКП проводили при стимуляции двигательного нерва с частотой 10 Гц на фоне ингибированной АХЭ. В контрольных экспериментах Сп=34) наблюдалось небольшое Сна 8-10%) снижение амплитуды последовательных ТКП. При введении субстанции Р в концентрациях 5-10 ~7и 1*10 "6моль/л заметных изменений динамики амплитуд ТКП не наблюдалось. С увеличением концентрации : пептида до 5• 10~®моль/л депрессия ТКП в ритмическом ряду усиливалась: амплитуда тринадцатого ТКП составила 78,0±3,0% Сп=7;Р<0,05) по сравнению с амплитудой первого сигнала, принятой за 100%. Для выяснения вопроса, является ли депрессия амплитуд ТКП в ритмическом ряду пре-юш постсинаптической, анализировали ее зависимость от мембранного потенциала, т.к. известно, что ДС, показателем

которой является падение ашлитуды и укорочение ТКЛ, усиливается при гиперполяризации [Migazanik el al., 1970]. Оказалось, что при изменении потенциала фиксации мембраны с ИЗО до 30 мв депрессия амплитуд ТКП в присутствии субстанции Г значительно уменьшалась , что свидетельствовало о постсинаптической природе данного эффекта.

2.3. ВЛИЯНИЕ СУБСТАНЦИИ Р НА ДИНАМИКУ гткп В ХОДЕ

РИТМИЧЕСКОЕ! АКТИВНОСТИ СИНАПСА.

Для оценка развития ПСП анализировали изменения т^кп в ритмическом ряду ТКП. В контрольных эксперимента:: (п=34) наблюдали прогрессирующее увеличение тгкп с 1 по 3-5 ответы с последущей стабилизацией на уровне, составляющем около 130% по отношению к длительности первого сигнала, принятой за 100% Таким образом, ПСП в контроле составила 30%. После введения субстанции Р в концентрации 5'моль/л отмечалось усиление ПСП . В этом случае достигала 206% к 7 сигналу и далее сохранялась примерно на этом же уровне Сп=8, Р<0,01). Повышение концентрации субстанции Р в перфузионном растворе до 1*1моль/л так же привело к усиленно ПСП по сравнению с контролем, хотя при этом максимальная степень замедления ТКП в ходе ритмической стимуляции составляла около 150% (п=7; Р<0,05). Дальнейшее увеличение концентрации субстанции Р до 5-•10"6моль/л привело к качественным изменениям динамики т ткп в ходе ритмической активности: наблюдалось первоначальное усиление ПСП с 1 по 6 ответы Сна 57%), с последующим падением хТК11 до 111 % к тринадцатому ТКП Сп=18; Р<0,05)

2.4. ЭФФЕКТ СУБСТАНЦИИ Р НА ТКП В УСЛОВИЯХ ПАРНОЙ ■„. ' СТИМУЛЯЦИИ ДВИГАТЕЛЬНОГО НЕРВА.

Более точно оценить ПСП можно в условиях парной стимуляции двигательного нерва. При этом ПСП проявляется в замедлении спада второго ТКП в паре при интервалах между стимулами, превышающими длительность одиночного ТКП tMagazanlk et al., 19841. В наших исследованиях выраженность ПСП в контроле при интервале ЮОмс меаду ТКП составила 23-4% Сп=ЗЭ. Через 20 минут после введения субстанции Р в концентрации 1-10"®моль/л ПСП в этих же синапсах усилилась и составила 43i6% Сп=3, Р<0,05) без заметных изменений амплитуды ТКП (197±37кА в контроле Сп=3) и 178±41нА после вещества Р Сп=3, Р>0,05)3.

Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что субстанция Р модулирует процесс генерглгш

ритмических серий ТКП в холинергическах синапсах., В низких концентрациях субстанция Р способствовала замедление спада ТКП в ритмическом ряду, а при увеличении концентрации этого пептида начинала проявляться депрессия ■ амплитуд последовательных ТКП. Возникает вопрос: связаны ли эти эффекты с воздействием на постсинзптическую мембрану или же это результат изменений в работе секреторного аппарата нервного окончания?

Ранее было показано, что субстанция Р способна воздействовать как на пресинаптическое 1Ака5и, 1988, БЬе1паскег, 197/3, так и на постсинаптяческое САкаБи, 1984, С1арЬат е1 а1., 1984} звено холинергвческой синаптической передачи. Данные о действии этого агента на секрецию медиатора противоречивы: есть сведения как о депрессорном £Б1е1пас1сег, 1977], так и облегчающем [АкаБи, 19861 эффекте субстанции Р. Однако, в наших экспериментах не обнаружено заметного действия этого пептида, на уровень вызванной секреции медиатора, так как амплитуда МТКП и ТКП при действии субс^кции Р в диапазоне концентраций 5-10~7- 5-10"® моль/л достоверно не изменялась. Против пресинаптических механизмов увеличения гГкп в ритмическом ряду свидетельствовало н то, что динамика амплитуд ТКП при стимуляции нерва с частотой 10 Гц в присутствии вещества Р в концентрации 5-10~7 - 1 • моль/л совпадала с контрольной. Следовательно, увеличение •сткп в ритмическом ряду," наблюдающееся в присутствии субстанции Р, не связано со снижением или повышением квантового состава ТКП, а имеет постсинаптическую природу. Это жэ подтвердили эксперименты, в которых ПСП исследовалась в условиях парной стимуляции нерва : усиление ПСП также не сопровождалось изменением амплитуды первого ТКП в паре. Увеличение при ритмической стимуляции, т.е. усиление

ПСП, объяснялось сохранением в межимпульсном интервале молекул АХ, связанных с непроводящей формой НХР [ Мадагап1к е1 а!., 19891. Очевидно, субстанция ? в концентрации 5-Ю-7 моль/я способствует образовании или сохранению таких комплексов АХ с НХР, что приводит к большему, чем в контроле, нарастанию тткп в ритмическом ряду, т.е. усилению ПСП.

Повышение концентрации этого пептида до 5-1СГ6 моль/л . ослабляет прирост \.кп, который после достижения максимума к 7 сигналу сменяется последующим снижением этого показателя. При этом наблюдается углубление дзлрэссии амплитуд ТКП, что

можно расценить как усиление ДС - уменьшение чувствительности постсинаптической мембраны к медиатору [Magleby et al. , 1981; Гиниатуллин и соавт., 1985]. О постсинаптической природе этой депрессии свидетельствовала ее зависимость от мембранного потенциала. Развитие ДС при действии субстанции Р (5-•Ю^моль/л) подтверждалась и ускорением спада одиночных ТКП в присутствии этого пептида на фоне ингибированной АХЭ, что совпадает с действием других агентов, ускоряющих развитие ДС tGiniatullin et al., 1989). Способность субстанции Р ускорять ДС ранее была показана рядом авторов разными методами на разных объектах [Akasu et al., 1984; Boyd et al., 19873. По-видимому, при действии высоких концентраций пептида ДС преобладает над ПСП, что проявляется в ослаблении прироста тТ1Ш и депрессии амплитуд ТКП в ритмическом ряду.

Таким образом, субстанция Р обладает способностью модулировать следовые процессы в постсинаптической мембране холинергического синапса. В низких концентрациях вещество Р усиливает ПСП, которая способна повысить эффективность синаптической передачи, а при повышении концентрации данного пептида этот эффект сменяется противоположным по функциональному значению процессом - снижением чувствительности постсинаптической мембраны к медиатору, т.е. ДС.

3; ПОИСК РЕЦЕПТОРОВ ДЛЯ СУБСТАНЦИИ Р В МЕМБРАНАХ МЫШЕЧНЫХ ВОЛОКОН - ДИАФРАГМЫ ИИ,

Первым этапом поиска мембранных рецепторов субстанции Р являлось определение равновесной константы связывания пептида с предполагаемыми рецепторами, которая определяется как отношение констант скоростей диссоциации и ассоциации [Сергеев и соавт., 1987). Для определения константы скорости ассоциации субстанцию Р CAmershan, 40 Ci/mmoD инкубировали с фракцией плазматических мембран диафрагмальной мышцы мышей. Связывание меченой субстанции Р с мембранами мтвечньпс клеток достигало равновесного уровня на 160 минуте инкубации С3Н-субстанция Р - 100 нмоль, ^°Синкубации = 25 °С, содержание белка в пробе 180. мкг) и составляло 12897,8*486,9 умллпт. 1Ь литературы известно, что при наличии рецепторов равновесие связывания пептидов наступает на 20-40 минуте инкубации CCockram et al., 19891. Поэтому для пы-ыш;>Н1<я чувствительности системы к выбора ' оптимального реаянг связывания использовали сяедуюаае рекомендуемые яхчь'л

слособы (Ткачева и соавт., 1983, Чард , 1981) :

а) снижали концентрацию меченого лиганда с 200 до 25 нмоль;

б) уменьшали количество мембранного белка (связывающего реагента) в пробе с 320 до'80 мкг;

в) изменяли время (3-240 минут) и температуру инкубации (20°С, 25°С, 37°С) npod;

г) изменяли последовательность добавления реагентов.

В наших экспериментах вышеуказанные способы заметных изменений в процесс связывания не внесли. Для определения константы скорости диссоциации мы допустили, что на 180 минуте инкубации наступало равновесие системы, добавляли немеченую субстанцию Р (Serva) в высокой концентрации С5-•10"®моль/л) и инкубировали с различными интервалами времени , добиваясь диссоциации предполагаемого комплекса "пептид-рецептор". Радиоактивность мембран на 120-180 минуте инкубации проб составляла 11831 ¿501,7 имп/мин, что свидетельствовало об отсутствии диссоциации меченого лиганда из мест связывания.

Предположив, что комплекс пептида с рецептором может быть необратимым, мы пытались выявить специфическое связывание, используя неравновесный метод анализа [Ткачева с соавт., 1983]. Для этого в 2 серии пробирок помешали следующее реагенты : 25 мкл буфера ТРИС НС1 (серия общего связывания) или 25 мхл немеченого пептида С5 • 1(5"^ моль/л) (серия кеспецифического связывания), 25 мкл "^Н-субстанции Р (поскольку связывание необратимо, меченый лиганд добавляли после немеченого пептида) и 200 мкл гомогената, содержащего 160 мкг белка. Пробы инкубировали в водяной бане при 25° С в течение 90 минут. Количество специфически связанной радиоактивности представляет собой разницу между общим связыванием (радиоактивностью, связавшейся с препаратом мембран при наличии в инкубационной смеси только меченого лиганда) и неспецифическим связыванием (радиоактивностью,, связавшейся в присутствии избыточного количества немеченого пептида) [Сергеев и соавт., 1987]. Специфическое связывание лиганда с рецепторами допито составлять 55-70% от уровня, общего связывания. В наших исследованиях величина специфического связывания ^ ü-субстанции Р с мембранами мышечных волокон была равна 1560 имп/мин (СРЮ при точности счета в проделай - 200 шд ш. , что составляло 30% от уровня общего (5184,5-152,8 ммп/шн.) связывания, т.е. ко достигало

необходимых значений (55-70%). Для утверждения наличия функциональных рецепторов необходимо выполнение ряда критериев и требований CLaduron , 1984, Molinoff, 1991), а именно:

1) стереоспецифичность;

2) насыщаемость;

3) обратимость;

4) высокое сродство Свысокоаффинность);

5) специфичность;

6) корреляция между сродством лиганда к данному рецептору in vitro и фармакологической активностью его in vivo;

7) места специфического связывания должны соответствовать предполагаемой локализации рецепторов.

Поскольку связывание Н-субстанции Р с мембранами мышечных клеток не зависело от t°C .инкубации, концентрации мембранного протеина и меченого пептида, не было быстрым, обратимым и высокоаффинным, то нет достаточных оснований утверждать, что места связывания вещества Р являются рецепторами.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ Проведенные исследования показали, что нейропептид субстанция Р оказывает выраженное пре- и постсинаптическое модулирующее действие на передачу возбуждения .в холинергических синапсах. Механизм модулирующего влияния исследуемого пептида определяется его концентрацией и условиями функционирования синапса. При низком уровне секреции ацетилхолина вещество Р в малых концентрациях уменьшает кальций-активируемый калиевый ток и увеличивает длительность потенциала действия двигательного нервного окончания. Это приводит к увеличению деполяризации пресинаптической мембраны,, входящего кальциевого тока и, в конечном ¡;тоге, к усилению секреции медиатора. При высоком уровне освобождения ацетилхолина пресинаптических эффектов субстанции Р не выявлено. Вероятно, пресинаптическое модулирующее влияние субстанции Р направлено на сохранение полноценной синаптической . передачи в условиях, когда поступление ионов кальция в нервную терминаль и выброс медиатора недостаточны для генерации надпорогового ТКП. Установлено, что вещество Р оказывает постсинаптическое модулирующее действие в ходе ритмической активности синапса : в кп-хих концентрациях данный пептид усиливает ПСП, а г,

ьысоких концентрациях - способствует развитии ДС холинорецепторов, тем самым оказывая стимулирующее или ингибирующее влияние на передач1/ возбуждения . При этом модуляция проведения ритмических серий импульсов на постсинаптическом уровне осуществляется не через пептидергические рецепторы для субстанции Р. Полученные данные о пре- и постсинаптическом модулирующем действий субстанции Р на передачу возбуждения в нервно-мышечном соединении позволяют по-новому раскрыть функцию данного пептида в регуляции активности холинергкческих синапсов.

ВЫВОДЫ

1. При низком уровне секреции медиатора субстанция Р. в концентрации 1 • 1(Г6 моль/л повышает, вызванное освобождение ацетилхолина в нервно-мышечном соединении холоднокровных и теплокровных животных.

2. Одним из механизмов усиления секреции медиатора на фоне действия вещества Р (1* 16"® моль/л) является уменьшение кальций-актизируемого калиевого тока . и расширение потенциала действия двигательного нервного окончания, что приводит к увеличению входящего кальциевого тока.

3. Субстанция Р (1 • 10~® моль/л) , не оказывает каналоблокирующего действия на ацетилхолинактивируемые ионные каналы, т.к. не влияет на амплитуду, длительность МТКП и потенциалозависимость постоянной времени спада МТКП.

4. При высоком (близком к физиологическому) уровне секреции медиатора вещество Р в концентрации 5 ;НГ7 - 1'КГ®. моль/л усиливает постсинаптическую потенциацию, которая повышает эффективность синаптической передачи.

5. Увеличение концентрации субстанции Р до 5-1СГ® моль/л приводит к развитию противоположного по функциональному значению процесса в постсинаптической мембране. - усилению десенситизации холинорецелторов.

6. . Радмолигандныи методом в мембранах, мышечных волокон диафрагш мыши не обнаружено рецепторов для вещества Р, что позволяет исключить взаимодействие субстанции Р- с постсинаптическими пептидергическими рецепторами как возможный механизм модуляции постсинаптической потенциации и. десенситизации.

С1ШС0К РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Гиниатуллин Р. А., Зефиров А. Л., Магаэаник Л.Г., Ощепкова С.Ф. Постсинаптические эффекты субстанции Р в нервно-мышечном синапсе лягушки // Нейрофизиология. - 1991. - Т.23, N 4. -С.436-441,

2. Гиниатуллин P.A., Зефиров А.Л., Ощепкова С.Ф., Хазипов Р. Н. Субстанция Р модулирует постсинаптическую потенциацию и десенситизацип,. вызванную эндогенным ацетилхолином // Физиология и биохимия медиаторных процессов : Тез. докл. V Всесоюзн. конф. - И., 1990. - С.73.

3. Зефиров А. Л., Ощепкова С, Ф., Халилов И. А. Влияние субстанции Р па ионные токи двигательного нервного окончания и секрецию медиатора // Ионные каналы в биологических мембранах : Тез. докл. Всесоюзн. Симп. - Кара-Даг, 1990. -С. 27.

4. Зефиров А.Л., Халилов И. А., Ощепкова С. Ф. Пептидергическая регуляция кальций-активируемых калиевых каналов двигательного нервного окончания /V Тез. докл. III Всесоюзн. конф. по нейронаукан. - Киев, 1990. 7 С.24-25.

5. Ощепкова С.Ф. Определение связывания субстанции Р и ангиотензина II с мембранами мышечных волокон диафрагмы мыши /✓ Физиология медиаторов. Периферический синапс : Тез. докл. Всесоюзн. симп. - Казань, 1991. - С.79.