Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Влияние 3бета-(2-оксиэтокси)-замещенных стеролов на метаболизм холестерина в культивируемых гепатоцитах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Влияние 3бета-(2-оксиэтокси)-замещенных стеролов на метаболизм холестерина в культивируемых гепатоцитах"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК КАРДИОЛОГИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

"На правах рукописи МАЛЮГИН АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

ВЛИЯНИЕ 3£> -{ 2-ОКСИЗТОКСИ) -ЗАМЕШЕННЫХ СТЕРОЛОВ НА МЕТАБОЛИЗМ ХОЛЕЕТЕЕВДА В КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ГЕПАТОШГГАХ

03. Ю. 04. - Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1994 .

Работа выполнена в лаборатории культур клеток и тканей и груше химии липопротеинов Института Экспериментальной Кардиологии ■Кардиологического Научного Центра Российской Академии Медицинских Наук.

Научный руководитель:

кандидат химических наук А. Ю. Мишарин

Научный консультант:

кандидат медицинских наук Б. А Косых

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук В А, Шахов

кандидат химических наук К В. Проказ ова

Ведущая организация:

Научно-производственное объединение "Биотехнология" МЗ и МП РФ.

Защита состоится 28 декабря 1994 г. в 1Г~00 часов на заседании специализированного ученого совета К 001. 22.02 в Кардиологическом Научном Центре Российской Академии Медицинских Наук по адресу: 121552, Москва, 3-я Черепковская улица, д. 15-а.

С диссертацией можно ознакомиться Кардиологического Научного Центра РАМН.

в библиотеке

Автореферат разослан

А^--1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических

ХГ. И. Венгерова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

Актуальность дроблены. Влсокий уровень холестерина в организме является ваннейшим риск;-фактором в патогенезе атеросклероза. Ключевую роль в годдеркании гомэостаза холестерина играет печень. Гепатоциты синтезируют значительное количество холестерина, выводят из кровотока большую часть холестерина, контролируют транспорт холестерина в организме, синтезируя и модифицируя липопротеины крови и желчи. Внутриклеточный баланс и транспорт холестерина регулируется. Важнейшими эндогенными регуляторами метаболизма холестерина в клетке является оксистеролы - производные холестерина и ланостерина, в молекуле которых помимо ЗД -гидроксильной группы содергатся второй кислородсодержащий заместитель (окси-, кето-, или зпокси-группа).

Оксистеролы обладают широким спектром биологической активности: -они регулируют транскрипцию генов, влияют на активность, многих ферментов, контролируют деградацию и активность некоторых регулято-рных и транспортных белков клетки, модифицируют клёточные мембраны. Участие оксистеролов в биосинтезе и метаболизме холестерина интенсивно исследуется . Одной из первостепенных задач этих исследований являеася изучение метаболических, .регуляторных и транспортных процессов в кль-гкэ на молекулярном уровне. Другой важнейшей задачей является использование оксистеролов для направленного влияния на ■ перечисленньв выше процессы

Естественно, что структура молекулы определяет биологическую активность оксйстерола. В ряду синтетических оксистеролов найдены соединения, эффективно влияющие на активность многих ферментов биосинтеза и метаболизма холестерина в культивируемых клетках Синтезированы оксистеролы, обладающие гипохолестеринемичзскии эф|зктом. Поиск; новых структур в ряду оксистеролов, влияющих на метаболизм холестерина, и исследование механизмов действия этих соединений в культивируемых клетках в настоящее время широко проводится во всем мире.

Цель а задачи ксслвлования. В институте Экспериментальной Кардиологии КНИ проводггся поиск новых биологически активных соединений в ряду оксястеролов, фокусируя внимание: ка соединениях, влиявших на метаболизм холестерина. ■

Целью настоящей работы'является изучение влияния Зр-( 2-оксиэтокск) замещенных сгеролов на метаболизм холестерина -в культивируемых ге-патоцитах. • 4

Структуры исследованных в данной работе 3£>-(2-оксиэтокси)-стеролов (стерилцеллозольвов или стериловых простых зфиров зтиленгликоля) -представлены на рисунке.

Рис. I. Структуры исследованных стерилцеллозольвов. I -( 2-оксизтокси) -хо лест-5-ен; 11 Зр -(2-оксизтокси)-5, бсО-эпоксихолестан; iii зр -{2-оксиэтокси)-холестан-5<А,-тол; IV 2-оксиэтокси) -холест-5-ен-7/> -ол;

v ■ 3)> -(2-оксиэтокси)-холест-5-ен-7-он; vi Зр Ч 2-оксиэтокси) -5с</-холест-8( 14)-ен-15-он.

Соединения i. - .vi являются -оксиэтоки) -замещенными структу-

рными аналогами холестерина (I), оксистеролов - продуктов автоокисления холестерина (п - v) и бс^-холест^ЗД-ен-К-он-З^Ь-ола -известного ингибитора биосинтеза стеролов (VI).

Рабочей гипотезой диссертации явилось предположение, что биологическая активность стерилцеллозольвов зависит и от структуры стериново-го фрагмента, и от налетая неприродного 2-оксиэтокси заместителя.

3 работе в основном использована первичная культура гепатоцитов • сролика - наиболее адекватная клеточная модель для изучения метаболизма холестерина в печени и его регуляции под действием биологически активных и лекарственных средств. Часть экспериментов проведено-аа клетках гепатобластомы человека линии Hep G2 и фябробластах кожи человека. Для оценки нзксторых биологических эффектов и мзтаболиче- — ' зких особенностей стерилцеллозольвов проведены опыты in. vi на матах. и на крысах.

В задачи работы входило:

1. Сравнительное исследование холестерилцеллозольва I и холестерина: влияние на физические характеристики искусственных фосфолипидных мембран, распределение по органам и тканям крысы при внутривенном введении, связывание с гепато-цитами кролика в культуре и ЛХАТ-зависимое ацклированиэ этих сте ролов.

2. Изучение влияния стерилцеллозольвов на метаболизм холестерина в культивируемая клетках: 'скорость биосинтеза холестерина de novo, активность ОМГ-КоА редуктазы, активность ЛНП рецепторов и секрецию аполипопротеинэ Е

3. Оценка гипохолестерннешческого действия ^¡А 2-оксиэтокси) -ЭД- ' холест-8( 14) -ен-15-она при введении с кормом мышам.

Научная еозчзпэ работа В работе исследована биологическая активность новых синтетических оксистеролов - стерилцеллозольвов. Ранее было показано, что 3 -алкокси, 3 -ацилокси, и 3 -дезокси стеролы слабо ингибирунг биосинтез холестерина в культуре клеток или неактивны. Результаты настоящей работы доказывают, что в противоположность другим 3 -замещенным стеролам 3 -(2-оксиэтокси) замещенные стеролы эффективно влияет на метаболизм холестерина в культивируемых клетках. Среди исследованных стерилцеллозольвов найдены сильные ингибиторы биосинтеза холестерина в гелатоцитах кролика. Инги-

бирование биосинтеза холестерина соединением V оказалось видоспеци-фичным, ингибирование соединением vi видоспецифичности не показало. В работе продемонстрировано гипохолестеринемическое действие стерил-целлозольва ¥1, а также показано ингибирование активности ЖП рецепторов и секреции аполипопротеина В этим соединением в культуре клеток. Принципиально новым является факт актирования неприродной 2-оксиэтоксн группы холестерилцеллозольва I д_п у1 уо.

Теоретическое и практическое значение работы. Стерилцеллозольвы, близкие структурные аналоги стеролов, обязаны отличаться от соответствующих стеролов по метаболическим превращениям в клетке. В работе доказано, что стерилцеллозольвы i - vi влияют на метаболизм холестерина, однако, отличаются по биологической активности от соответствующих 3|Ь -гидроксистеролов. Это указывает на справедливость использованного подхода к конструированию новых биологически активных соединений в ряду оксистеролов.

Полученные в работе результаты служат основой для дальнейшего использования стерилцеллозольвов в-исследовании молекулярных механизмов регуляции внутриклеточного метаболизма и транспорта холестерина. Другим перспективным продолжением работы является исследование метаболических превращений стерилцеллозольвов в различных клеточных культурах. Обнаруженное гипохолестеринемическое действие 2>р -{2-оксиэтокси)-5о1/.-холест-8(14)-ен-15-она VI и найденные в работе различия между эффектами нового стерола VI и иззестного бЛ-холест-8(14)-ен-15-он-3/5>-ола служат основой для поиска новых соединений с гипохолестеринемической активностью в ряду З/Ь -замещенных 15-кетостеролов.

Апробация работа Результаты представлены на 61-м и 62-м конгрессах Европейского общества по изучению атеросклероза (Лиссабон, Португалия, 1992; Шрусалим, Израиль, 1993); 5-й международной конференции "Органическая химия в не дико-биологических исследованиях (КЕсез-5)" (Ассуа, Савойя, Франция, 1994), П-м международном конгрессе по атеросклерозу (Монреаль, Канада, 1994). Диссертация апробирована на ' межлабораторном семинаре ИЭК КНЦ РАМН.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из разделов: "Введение", "Литературный обзор", "Материалы и методы", "Рвзультэ-

тъР, "Обсуждение результатов", "Заключение", "Выводы", ]%бота изложена на страницах, содержит таблиц, иллюстрирована рисунками, список литературы включает источник.

ШЕЙШИ И МЕТОДЫ жслщрвиш.

Стерилцеллозольвы I - vi, их [%]- меченые производные, олеиловые эфиры стерилцеллозольвов получены по методам'(Мишарин, 1989; Беликов и др., 1992; Misharin et al., 1993; Misharin et a\., 1994). В. работе использованы химические реактивы полученные от фирм "sí groa", "Merck", "Serva",' "Bi о Rad", "Pharmacia". Культуральньв среды ПОлучены от фирм "Flow", "Costar". Пластиковая посуда для культивирования клеток от фирм Falcon", "Flow", "Costar", "Nunc". Радиоактивные изотопы получены от фирм "Amersham", "NEN" И "ИЗОТОП".

Липопротеины плазмы крови и культуральной среды выделяли ультрацентрифугированием ( i i n à g г е п, 1975), липопротеин-дефицитную сыворотку получали по методу (Goldstein et al., 1983), аполипопротеин AI выделяли по методу ( Минарин и др., 1985), комплексы аполипопротеин AI: фосфатидилхолия: стерол получали по методу (Jonas et al., I9SI).

-меченые ЛНП получали по методу (si 1 heimer et al., I9B3). Поли-слокные везакулы ДМФХ получали ультразвуковой обработай. Экстракции лшшдов из клеток и тканей проводили известны.®, методами (Fol с h et al., 1957; Bligh and Daer, 1959).

Спектры поглощения регистрировали на спектрофотометрах "Yanaco U0-2000" и "shinadzu", спектры ЭПР на приборе "Vari an Е 109". Аналити-чзское ультрацентрифугированне проводили-на приборе "Beckman Е".

Тонкослойную хроматографию ( ТСХ) проводили на пластиках с силикате лон фирмы "Msrck" градаций TLC и HPTLC. Высокоэффективную етд-костную хроматограф:® (ВЭНХ) проводили на приборе "Du Pont 8800" с использованием колонок 4X250 мм "Octadecyl Si, 5 un", фирмы "Serva" в изократическом решила или с. использованием программированного градиента.

Концентрацию белка-определяли по методу Лоурз (Lowry et al'. 1951), концентрацию фосфолипидов ПО ЛИГШДНОМу фос£ору (Vaskovsky et al.,

-61979), концентрации холестерина с использованием набора "Monotest cholesterin" фирмы "Boehringer Mannheim".

В работе использованы клеточные культуры; первичная культура гепато-цигов кролика, клетки гепатобласгош человека линии Hep е2, фибро-бласты кожи человека, первичная культура гладкомышечных клеток аорты кролика,- первичная культура эндотелия пупочной вены человека.

Скорости биосинтеза липидов и белков в культивируемых клетках оценивали по включению радиоактивного предшественника в соответствующую фракций Через 24 чэса после начала культивирования клетки помещали в среду, содержащую 10% эмбриональную телячьи сыворотку и стеролы в требуемых концентрациях. Клетки культивировали 3, 6, 24 часа. Затем культуральную среду меняли на бессывороточную, содержащую [14с]-уксусную кислоту, для определения скорости биосинтеза липидов, или содержащую [-^с]-лейцин для определения биосинтеза и секреции белхов. Апобелки липопротеинов (d>I. 0S3 т/т) из культу-ральной среда разделяли электрофорезом в градиентном (3-20%) поли-акрилаыидноы геле б растворе додецилсульфата натрия [laeml i, 1972]. Количество секретированного аполипопротеина оценивали по включению изотопа в аполипопротеин В (Mel in et al., 1984). Активность ОМГ-КоА редуктазы в клетках Hep„G2 измеряли по методу (Brown et al., 1978) С шдификацияш (Nagata et al., 1990). Активность ЛХАТ по методу (Chen and Albers, 1983). Активность ЛНП рецептора оценивали по захвату и деградации как в работе (Goldstein et al., 1983).

Опыты in-vivo проведены на самцах белых мышей лилии balb/c и на крысах породы "Вистар" 'с канкшированньм общим желчным протоком.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Ь Сравнительное исследование ,холестет»илделлозольва и холестерина.

Наличие 3 -экваториальной гидроксильной группы в молекуле холестерина, как известно, определяет уникальные свойства холестерина, как компонента биологических систем. В молекуле холестерилцеллозольва I полностью сохранен стериновый фрагмент, присутствует гидроксильная

группа, а наличие простой эфирной связи в 3 -положении обеспечивает устойчивость молекулы к ферментативному расщеплении. Холестерил-пеллозсльз I, впервые описанный в работе (Ahmad and Logani, 1975), по данным (t al а et al.,1985), изменяет флуоресценцию дафенилгекса-триена в фосйолшшдных бислоях и проницаемость фосфолшшдных везикул, подобно холестерину. Данных о биологической активности холе-стерилцедяозольва I до настоящей работы не имелось.

Мы исследовали влияние холестерина, холестерилцеллозольва I, а тзк-нь его гомологов (vii - Iх), различакщихся длиной углеводородной цепи в 3£>-(w- оксизлкокси) фрагменте, на физические характеристики йосшолшшдных бислойкых мембран.

riS6^

I, (п=2); VII, (п=4); VIII, (п=В);1х, (г.= 9). Характеристики соединений приведены в таблице I.

Таблица L Характеристика соединений i, vii - ix.

Соединение Т. пл. (°С) - (Г) (ТЖ-произв.) •ВЭ№ • СН30Н CH30R н2о

I 104 ' 504 12.2 32.2

vii 90-92 532 14.7 39.8

viii 84-85 564 16.8 52.0

ix 69-70 % — 20.2 62. 4

* условия КЭ2Х- хроштогоафическая подвиеность (объем выхода, мл) для холестерина ID. 6 и 27. 8 мл в метаноле и в смеси метанол: вода, (95: 5), соответственно.

Возмущащее действие соединений i, vii - ix на "структуру липидного бислоя лппосом из ДМФХбыло исследовано с помощью парамагнитного зонда - 5-доксилстеариновой кислоты. При 2СРс зключение соединений в липосош ДКФХ требовало около двух часов, о чем судили по изменениям спектров ЗП?._ Для оценки влияния стеролов на фазовые характеристики липосом ДМФХ, содержащих 20 мольных % исследуемого стеро-ла, з присутствии 2 мольных % 5-доксилстэариновой кислоты, в качест-

ве спектрального параметра, характеризующего структурные изменения ДМФХ, было выбрано расстояние между указанными на рис. 2(А) экстремумами -спектра ЭПР (2Атах). .Бее соединения снижали-значения температуры фазового перехода (Тс), расширяли интервал фазового перехода (Д.Т) и вызывали возрастание упорядоченности ацильных цепей ДМФХ при температуре выше Тс, подобно холестерину (рис. 2(Б)' и табл. 2). ' X

Рис. 2. Влияние зр -(иГ -гидроксиалкокси)-холест-5-енов на фазовый переход ДМФХ по данным спектров ЭПР 5-доксилстеарата. А -Экспериментальный спектр 5-доксилстеарата в липосо-мах дМФХ. Показан параметр сверхтонкого - расщепления

■ Б - Зависимость параметра 2Атх спектра ЭПР 5-доксил-стеарата от температуры в липосомах ДМФХ (I) ив ли-посома-х ДДФХ, содержащих .20 мольных % соединенияУ! I (2).

Таблица 2. Влияние соединений I,- VII-IX на фазовый переход ПОФХ.

Образец3

Д.Т,'

(±0С2)

ДМФХ

-"-/холестерин

-"-/ vii -"-/viii -"-/ IX

48.5

49.1 5й 7

51.4

49.5

50.2

2. 2+0. 2 2. 4±0. 7

8. 4+0. 5

9.-0+0. 4 5. 8+0.2 4.5+0. 2

21.7 20. 7 20.5

18.8 20.0 19,7

- при содержании стерола 20 мольных % ; 0 - параметр сверхтонкого расщепления 2Амах измерен при 30°С.

Стер'ол i и стекал vii вызывали наиболее сильные спектральные изменения, однако монотонной зависимости перечисленных параметров- от длины.оксиалкильной цепи не наблюдалось.

Лдя исследования особенностей поведения холестерилцеллозольва1 i л vivo, мы сравнили распределение [^н]-меченного стерола i и [ 4-^с] -холестерина по органам и тканям крысы с кашютгрованным желчным протоком при внутривенном введении.

О распределении соединения I (а) и холестерина судили по содержанию [3Н] и [14с], соответственно, спустя три часа после инъекции стери-нов в бедренную вену. Данные о распределении изотопов в изолированных органах, сыворотке крови и желчи представлены в таблице 3.

Таблица 3. Распределение радиоактивности в изолированных органах крыс с канюлировакным общим желчным протокомлерез три часа после внутривенного введения [4~1ЧС]-холестерина и С Нj -меченного соединения l(a) (в %'от введенной радиоактивности; И+S. D. для 5 животных в каждом эксперименте).

Образец [I4C] " [%]

Сердце 0. 3+0.1 0.1+0. 05

легкие 0. 8+0. 3 1.1+0. 5

Печень • 33.5+2.9 ' 23.9±3.7

Селезенка 2. 3+0. 7 II. 6+1. 3

Почки 1.1+0. 3 О. 3+0.1

Нелчь 18.1+I. 6 6. 8+0. 7

Сыворотка 19. 0+1. 2 14. 6+1. 7

Данные таблицы 3 указывают на значительное сходство в распределении соединения l(a) и холестерина: характеризуют эффективный захват I( а) клетками печени и выведение l(a) и/или его полярных метаболитов в составе желчк.

; ?

¡ i í I

: з ; i

п

Рис. 3. ТСХ радиоактивных экстрактов (неполярная фаза) сыворотки крови крысы в системе бензол: этилацетат (19:1). (Стрелками показана хромзтографическая подвижность соединений 1 (I) их (2).

Образцы сыворотки крови крыс, которым вводился стерол l(а), содержали два радиоактивных продукта (рис. 3). Наличие радиоактивного продукта с Rf 0, 60 в экстракте из сыворотки крови указывает на превращение i(a) в неполярныэ метаболиты. Хродатографическая подвижность нового радиоактивного продукта совпадала с цо'движностью синтетического 3fb -[2-(цис-октадец-9-еноилокси)-этокси-холест-5~ ена X (при проведении ТСХ в различных системах). .

По данным ТСХ, ВЭЖХ, 'дасс-спектроыетрии, химической деградации, а также сравнением с синтетическими стандартами, новый радиоактивный продукт бьш идентифицирован, как О-ацильное производное холестерил-целлозольва I. Таким образом в работе доказано, что холестерилцел-лозольв I метаболизирует in. vivo.' образуя аирокислье эфйры по гид- ' роксильной груше неприродного 2-оксиэтокси фрагмента.

Чтобы выяснить, возтжно ли образование ацильных производи* стерола 1 в плазме, в реакций, катализируемой лецитин: холестерин: ацилтран-сферазой (ЛХАТ), был поставлен опыт в модельной системе. Активность ■ и субстратная специфичность ЛХАТ исследовалась на мицеллярных комплексах, . приготовленных по известному методу (Jonas, 1991). Были получены два модельных субстрата: комплексы ano AL ГОФХ холестерин (юлярное соотношение компонентов I: 45: 6) и ano AI: ПОФХ: стерол I (молярное соотношение компонентов 1:38:4).

Для измерения скоростей ЛХАТ-зависимого ацилирования стеролов [^с]-холестерин вводился в комплексы ano AI: ПОФХ: холестерин и ano AI:ПОФХ: стерол I, а [^н] меченый стерол la вводился в комплекс ano AI: ПОФХ стерол I. Б качестве источника ЛХАТ- активности использовалась свежая плазма здорового донора. Скорость ацилирования радиоактивных стеролов в составе модельных субстратов измерялась по методу (Chen and Albers, 1982).

Достоверных отличий в скорости ацилирования [^с]-холастеpiraa в комплексах ano AI: ГОФХ: холестерин и ano AI: ПОФХ стерол I обнаружено не было (.кривые .1 и 2).. Кривая 3 показывает образование олеата XI в ЛХАТ-катализирумой переэтерификации (рис. 4).

Рис. 4. Кинетика ЛХАТ-зави-симого образования стерило-вых эфиров в присутствии модельных субстратов: I - образование [^с]-холе-стерилолеата в комплексе anoAI: ГОФХ: холестерин; 2- образование [-*-4с]-холе~ стерилолеата в комплексе ano AI: ГОФХ: холестерилцел-лозольв I;

3 - образование [Зн]-меченного X в комплексе ano AI: ГОФХ: холестерилцелло-зольв!.

ВРЕМ?.. ымк

Эффективность ацилирования стеро.71а 1а в 6-8 раз ниже, чем эффективность образования холестериновых эфиров. Образования стериловьк' эфиров в данном эксперименте не наблюдалось при нагревании плазмы (45°, 30 мин) пли обработки иодацетакидом, что доказывает участие ЖТ в это к процессе.

Из приведенных опытов ьижно заключить, что Зр> -(2-ок.сиэтокси) сте-рольг .могут ацнлирозаться в плазме крови, однако ацилирование стерил-целлозольвов не влияет, на скорость образования холестерпловых эфиров в плазме.

[Зн]-меченый холестерилцеллозольв 1(а) включался в культивируемые гепатоциты кролика. Связывание зависело от времени инкубации и достигало максимального значения через 2-3. часа (рис. 5(А)).

Рис. 5. Связывание холесте-рилцеллозольва I с гепато-цитами кролика в культуре. А. - Содержание холестерил-целлозольва I в клетках при различных временах инкубации (концентрация стерола в культуральной среде 1мкМ и 10ыкМ).

Б - Содержание холестерил-целлозольва I (I) и холестерина (2) в клетке после 4х часовой инкубации. (Представлены средние значения н+5. о. (п=3).

[СТЕРОЛ]юсг/мл

Включение холестерилцеллозольва I и холестерина в гепатоциты линейно возрастало с увеличением концентрации стерола (5 - 20 им) в культуралькой среде (рис. 5(Б)).

Как известно (Kandutsch and Chen, 1973), холестерин, добавленный в составе культуральной среды, не влияет на скорость биосинтеза холестерина de. novo в культивируемых,клетках млекопитаыцих. В отличие от холестерина, холестерилцеллозольв i ингибировал включение ацетата в холестерин в гепатоцитах кролика. Ингибирование биосинтеза холестерина наблюдалось при 24-часовой лреинкубацки и зависело от концентрации. Концентрация соединения I, вызывающая 50% ингиби-розание биосинтеза холестерина (159) составляла 5xI0~^ Е Среди аналогов холестерилцеллозольва i (соединения vil -ix), лишь сте-рол vil незначительно подавлял скорость включения [^С]-ацетата в холестерин в гепатоцитах кролика.

Поскольку холестерилцеллозольв I быстро связывался с клетками, но не влиял на синтез холестерина при 3 часовой преинкубации, moshq полагать, что ингибиоующкй эффект соединения I, обусловлен влиянием на внутриклеточные процессы.

Влияние стерилцеллозольвов (и = VI) на метаболизм

холестерина в культивируемых: клетках.

Следующим этапом работы было исследование влияния стерилцеллозоль-вов ii - vi на биосинтез холестерина в первичной культуре гепатоци-тов кролика. Соединения ii - v являются аналогами известных продуктов аутоокислэния холестерина (5, бо^-эпоксихолестан-ЗуЬ-ола, хо-лестан-З^Ь, 5о!/, бД-триола, 7 -кетохолестерина и 7Д-оксихолестери-на, соответственно), ингибирующих биосинтез холестерина во многих клеточных культурах; соединение vi - ЗЛ 2-оксиэтокси) аналог известного ингибитора биосинтеза стеролов 5«^-холест-8( 14) -ен-15-он-3^-ола (15-кетостерола).

Исследуемые соединения добавлялись к первичной культуре гепатоцитов кролика в различных концентрациях в составе культуралькой среды Через 3 часа культуральная среда заменялась" на свежую, содержащую [-^С] -ацетат и, спустя 3 часа измерялось включение радиоактивной метки во фракцию холестерина. Результаты влияния соединений 11 - VI на скорость биосинтеза холестерина представлены на рис. 6. Видно, что все соединения ингибировали скорость биосинтеза холестерина з зависимости от концентрации. Значения I5Q приведены в таблице 4.

Еис. 6. Влияние стершщеллозольвов ii-vii на скорость биосинтеза холестерина (13) и бежа (О) в первичной культуре гепатоцитов кролика. А - стерилцеллозольв П; Б - стерилцеллозольв iii; В - стерилцеллозольв IV; Г - стерилцеллозольв v; Д - стерилцеллозольв vi; (Представлены средние значения ЬдПСТЕРОЛА! . М) М+Б.О. (п=3)).

По оси ординат - включение радиоактивности {% от контроля). Контрольные значения (100%, в отсутствие соединений) составляли; Холестерин=142-700 распадов х мин-1Л2г клеточного бежа х час-^.; Белок=20б ООО распадов х мшТ^/мт клеточного бежа х час"^.

Габлица 4. Влияние стерилцеллозольвов II - VI на скорость биосинтеза холестерина в гепатоцитах кролика.

Концентрация, необходимая

Соединение для 50% ингибирования,

(l50>'"

Tl - 1.3+0.2 xIO-5

III 4. 5+0. 7 xlOi?

IV 2. 8+0. 4 xIO q

V , 5.5i0.7 xI0~f

VI I. 7+0. 3 xIO"6

Ни одно из соединений не снижало жизнеспособности клеток в условиях эксперимента, однако было замечено подавление синтеза общего клеточного бежа (рис. 6).' Среди соединений этой серии два кетостерола V и VI наиболее эффективно подавляли биосинтез холестерина. При этом k биосинтез бежа снижался незначительно в интервале концентраций стеролов: Ю~8 - 10~б М для соединения v и 1СГ7 - Ю-5 М для соединения VI.

Влияние соединений v и VI на скорость биосинтеза неполярных липидов исследовали также в клетках гепатобластомы человека Hep G2. Эта клеточная линия с успехом использована многими авторами при изучении эффектов оксистеролов и других регуляторов липидного обмена. Кроме того, на клетках гепатомы ранее были исследованы эффекты " родственных 3-оксистеролов (7-кетохолестерина и 15-кетостерола).

В наших опытах изучалось влияние соединений v и VI на скорость биосинтеза неполярных липидов: холестерина, жирных кислот, холестериновых эфиров и триглицеридов из [^С]-ацетата, а также на активность ОМГ-КоА редуктазь; ключевого фермента биосинтеза холестерина.

Стерилцеллозольв V, эффективно ингибирущий биосинтез холестерина в гепатоцитах кролика, не изменял скорость синтеза холестерина в клетках Hep G2 при концентрации н и достоверно стимулировал синтез холестерина при концентрации ТО-6 м. При этом заметно увеличивалось включение {-^с] в эфиры холестерина (рис. 7(A)). -

-16— Схершщеллозольв VI специфически ингибировал биосинтез холестерина в клетках Нер с2 без заметного влияния на биосинтез. жирных кислот и триглицеридов ( рис. 7(Б)).

Рис. 7. Влияние стерилцеллозоль-вов V (А) и VI (Б) на скорость биосинтеза липидов в клетках ге-патобластомы человека Нер с-2. Каждое значение представляет среднее четырех повторов в трех независимых экспериментах. (ХС-холестерин; ЭХ-холестерило-вые эфиры; ТГ-триглицериды; НК-жирные кислоты.)

Контрольные значения (100%, в отсутствие соединений) составляли; ХС=57 700; ЭХ=19 ООО,

Активность ОМГ-КЬА редуктазы в клетках Hep G2 не изменялась -в присутствии соединения V. Стерилцеллозольв VI подавлял активность фзр-■ кэнта е клетках Hep G-2 (рис. 8).

feK и в случае других оксистеролов, добавление стерола VI к клеточным экстрактам не изменяло активность 0МГ~КоА редуктазы. Влияние на активность ОМГ-КоА редуктазы проявлялось только при преинкубации клеток со стеролом. Сопоставление этих данных позволяет считать, что подавление биосинтеза холестерина обусловлено ингибированяем-ствролом VI активности ОМГ-КоА редуктазы

Рис. 8. Влияние стерилцелло-зользов v (I) я VI (2) на активность ОМГ-КоА редуктазы в клетках гепатобластомы человека Hep G-2. Каждое значение представляет среднее четырех повторов в трех t независимых экспериментах. Контрольные значения (100%, в отсутствие соединений) составляли: 18 900 распадов х [^-^с]-мевалонолакт-

она/ мг клеточного белка/ час.

Следует отметить, что концентрации стерилцеллозольва VI, необходимые для 50% подавления биосинтеза холестерина (150), в клетках гепатобластомы человека Hep G2 и первичной культуре гепатоцитов кролика различались на порядок. Олеат стерилцеллозольва XI не влиял на активность ОМГ-КоА редуктазы и не ингибировал синтез холестерина в клетках Hep G2 в интервале концентраций от 10""'' до М.

Согласно современным представлениям, решающую роль в регуляции метаболизма холестерина в культивируемых клетках играет активность ОМГ-КоА редуктазы и активность ЛШ рецепторов (8rown and Goldstein, 1985). Поэтому мы провели опыты по оценке влияния стерилцеллозольва vi на активность ЛИП рецепторов. "Эксперименты проведены на куль-

туре фибробластов кожи человека; параллельно исследовался эффект 5с</~холест-8(14)-ен-15-он-ЗуЁ>-ола (15-кетостерола). Активность ЛНП рецепторов оценивали по связыванию и захвату ^251-ЛНП (Goldstein et al., 1983). Оба соединения ингибировали связывание -^Ч-Ш! в зависимости от концентрации (рис. 9). Значения l5q составляли 0, вхКГЧ", для стеридцеллозольва VI и 0, гхКГ^М для 15-кетостерола.

loo

50

-8 .7

lg (iстерола) . н)

Рис. 9. Подавление рецептор-зависимого захвата ^1-ЛНП фибробластами кожи человека в присутствии кетостеролов. Контрольные значения (100%, в отсутствие соединений) составляли 830+115 нг/иг клеточного белка.

1 - стерилцеллозольв VI;

2 - 15-кетостерол;

В таблице 5 представлены результаты влияния стеридцеллозольва vi, 15-кетостерола на секрецию аполипопротеина В в первичной культуре гепатоцитов кролика.

Таблица 5. Влияние 3£> -(2-гидроксиэтокси)-5«^-холест~8(14)-ен-15-она (I) и -гидрокси~5«0-холест-8(14)-ек-15-она на секрецию аполипопротеина В в первичной культуре гепатоцитов кролика.

Условия инкубации

,Апо В „

(имп кин/кг белка х10~")

% от контроля

В отсутствии соединений 28. 0+0.3

3 -(2-гижюксиэтоксц) -5

-холест-8( j.4) -ен-15-он П. 4±0.1

3 v-гидрокси-5

-холест-8( 14) -ен-15-он 9. 4+0. 2

100

40.7

33.6

Р < 0, 05; достоверность отличий по сравнению с контролем.

¡оличество секротированного аполипопротеина оценивали по включению »адиоактивномеченной аминокислоты в аполипопротеин В (Hei in et al., !987).

I стерилцеллозольв vi и 15-кетостерол, в концентрации 2.5 тМ, инги--¡ировали (на 60 - 70 %) секрецию- аполипопротеина В в первичной :ультуре гепатоцитов кролика.

Толученные результаты показывают, что стерилцеллозольв VI эффектив-ю влияет на биосинтез холестерина, активность ЛН31 рецептора и сек- ' зецию аполипопротеина В в культивируемых клетках, в частности, в слетках печени. Все перечисленные параметры важны для регуляции ме-:аболизма холестерина la "ivo.

Зг. Опенка гипохолестеринемического действия зр> -(2-оксиэтокси) -

5 с!/-холест-в( 14) -еп-15-она при введении с коргазц шдяан.

\ак известно, среди большой группы оксистеролов, ингибирузсщих акти-зность.01,1ГТКЬА редуктазы в. культуре клеток, лишь несколько соедин-зний обладают гипохолестеринемическим действием. Гипохолестеринеми-зеский эффект показан для некоторых 15-замещенных стеролов, в частности для 15-кетостерола при добавлении в корм грызунам и приматам [Schгoepfer ег а!., 1984).

В задачи данной работы входила оценка гипохолестеринемического действия соединения VI. Эксперимент проводили на мышах линии ЗА1В/с.

Животные были разделены на две группы. Контрольная группа - 10 мышей (средний вес тела 18. 9+0. 7) со свободным доступом к стандартной диете в течение 10 дней.

Экспериментальная группа - 10 мышей (средний вес 19.0+0.7) со свободным доступом к стандартной диете, содержаний 0.1% стерола VI в течение 10 дней.

Вес тела животных контролировали ежедневно. Уровень холестерина в сыворотке крови каждого животного определяли на десятый день. Выделенные из пулированной сызоротки (2 пула по 5 образцов для каждой группы животных) ЛНП и ЛВП характеризовали аналитическим

ультрацентрифугированием и анализировали на содержание холестерина и белка. Результаты представлены б табл. 6.

Таблица 6. 'Эффекты стерилцеллозольва vi in vivo.

Параметр Контрольная группа Экспе риме нта льная группа

Вес животного (r+s. E.H. ) 21.2+0. 8(п=10) 21.8+0. 7(п=10)

Холестерин сыворотки (мгДООыл+s. С. и.) 119. 0±4( п=10) 90. 0+5(п=10)*

Холестерин ЛЩыг/ГООмл) 32( пул, п=5) 28(пул,п=5) 22(иул,п=5) 18(пул,п=5)

Белок ЛНП (мгДООмл) 56(пул, п=5) 56(пул, п=5) 40(пул, п^5) 30(пул,п=5)

* - р < 0,05;. достоверность отличий в сравнении с контрольной группой.

' Из таблицы видно, что стерол VI вызывал снижение уровня общего холестерина плазмы на 26% без заметного влияния на вес экспериментальных животных. Уровни холестерина и бежа ЛНП в экспериментальной группе были снижены по сравнению с контрольной. Уровни холестерина "ЛНП в контрольной'« экспериментальной группах достоверно не разли-■ чались.

Сравнивая полученные результаты с опубликованными данными о гипохо-лестеринемическом действии 15-кетостерола при введении кьсам с кормом (Schroepfer et al., 1981), следует отметить различия в эффектах этих двух соединений. Снижение уровня холестерина сыворотки под . действием стерола VI было значительно слабее (26% снижение при содержании в корж 0,1% стерола VI) по сравнении с эффектом 15-кето-стерола (67% снижение при содержании в корж 0,2% 15-кетостерола). Однако, стерол VI, в противоположность 15-кетостеролу, не приводил к потере веса животных экспериментальной группы. Эксперименты ir¡ vivo показали, что стерилцеллозольв vi снижает уровень ЛНП (холестерин и белок ЛНП) б плазме мышей экспериментальной группы. Наиболее вероятной причиной снижения уровня ЛШ1 при введении с кормом соединения VI мы считаем подавление секреции ano В содержащих липо-протеинов. .

ЗАКЖИЕНИЕ

В результата проведенных исследований показано, что химическая модификация молекулы стерола (холестерина или оксистерола), состоящая' во введении 2-оксиэтокси заместителя, приводит к соединениям, сох ранялшпл структурное сходство с молекулой соответствующего З^-гил-роксксодер:шшего стерола и влияхщим на метаболизм холестерина. Исследованные в данной работе стерилцеллозольвы ингибировали биосинтез холестерина de novo в культивируемых гепатоцитах. Ингибитор-ная способность зависит от стуктуры стериновой части молекулы. Наличие в молекуле стерилцеллозольвов неприродного 2-оксиэтскси заместителя влияет на метаболизм, биологическую активность и- видоспе-цифячность эффекта стерилцеллозольвов по сравнению с родственными Ър -гидрокси стеролаш. Приведенньв в диссертации результаты показывают перспективность применения исследованных стерилцеллозольвов и родственны^ -замещенных стеролов в исследовании внутриклеточного метаболизма и транспорта холестерина. Сравнительное исследование метаболизма стерилцеллозольва v и 7-кетостерола, а также стерилцел-лозольЕа vi и 15-кетостерола в различных клеточных культурах, несомненно является полезным в изучении специфичности регуляторных процессов и роли оксистеролов. Найдекый в работе гипохолестеринеми-ческий эффект стерола vi указывает на перспективность поиска новых регуляторов метаболизма холестерина in vivo в ряду 3f> -замещенных оксистеролов и их синтетических аналогов.

вьюоды

L Холестерилцеллозольв I, -(2-оксиэток.си) -холест-5-ен, при включении в фосфолипидные бислои изменяет физические характеристики липидов, при внутривенном введении распределяется то органам и тканям ч крысы аналогично холестерину, способен образовывать in vivo авдльные производные, ингибирует биосинтез - холестерина в гепатоцитах кролика при 24-часовой преиккубации.

2. Стершщеллозольвы: -3£> -(2-оксиэтокси)-5, бсб-эпоксихолестан, 3^ -(2-оксиэтокси) -холестан-5,6 с^диол; 32-окскзтокси) -

• холест-5-ен-7у5>-ол; Sjb-(2-оксиэтокси)-холест-5~ен-7-он; 3/>~ (2-окскэтокси)-5<^-холест-8(14)-ен-15-он пнгибирукт биосинтез , - холестерина в первичной культуре гепатоцитов кролика. йнгиби-рование зависит .от концентрации, значения 1эд.для.стерилцелло-. зольвов находятся в интервале концентраций от 10~® до И

3. 3£ Ч2-оксиэтокси) -5<^-хо лест-8( 14)ев-15-он ингибирует активность ОМГ-КоА редуктазы, снижает активность ЛИТ рецептора и ингибирует биосинтез аполшюпротеина В в культивируемых клетках; обладает гипохолестеринемаческой активностью, снижает уровень холестерина плазмы, уровень холестерина и белка ЛНП, при введении с кормом мышам.

Список публикаций по тега диссертации.

1. Mambeti saeva Е., Kosykh V., Misharin A., Malugin'A., Kosenkov" E-, Podrez Repin V. Action of 5<^-chol est-8(I4)-еп-ЗД-ol -I5-one an cholesterol metabolism in cultured rabbit hepato-sytes. / 1992, Abstract of 59th EAS meeting, Lisbon, p. 72.

2. Malugin A., Mambetisaeva E., Fuki I., Kosenkov E., Kosykh V., Misharin A. Effect of chol est-eiL^-en-S^-ol-I5-one on apo В secretion and receptor-dependent IDL uptake by cultured rabbit hepatosytes. / 1993, Abstract of 62nd EAS Congress, Jerusalem, Israel, September 5-6.

3. Мамбетисаева Э. Т., Косых В. А., Мишарин А.Ю., Малюгин А.Вл Косенков Е И., Подрез Е. А., Репин Е С. Влияние 5с^-холест-8(14)-ен-3£> -ол-15-она на метаболизм холестерина в культивируемых гепатоцитах кролика. - Биохимия, 1993, т. 58, р. 261-267.

4. Misharin A. Yu., Malugin A.V., Stei nschnei der A.Ya., Kosykh V. A., Novikov O.K. Steri 1 cell osol ves new inhibitors of cholesterol biosynthesis in rabbit hepatocytes. / 1993, Med. Chera. Res., 3: 451-458. . ..

5. Misharin A. Yu., Malugin A. V. , Kosykh V. A., Alqueir C., Chanus-sot F. , Lafont H. Sreryl cell osol ves. Chemical synthesis and affect on cholesterol metabolism in cultured liver cells. / Abstract of RECOB-5, Assois, France, 1994, p. 106.

6. Misharin A. Yu., Malugin A. V., Abramov V. V., Stei nschnei der A.Ya., Kosykh V. A., Medvedeva N. V., Morozkin A. D. ЗД-(2-Ну~ drox.yetoxy)-5oU-chol est-8(I4)-en-I5-one inhibits cholesterol biosynthesis in rabbit hepatocytes and causes hypochol estero-lemic effect in mice.// 1994, Med. Chen. Res., v. 4, p. 189195.

7. Malugin A. V., Medvedeva N. V., Abramov V. V., Misharin A.Yu. Hypochol esterol eni с potency of 3ji-(2-hydroxyethoxy)-substi tuted oxysterols.//Atherosclerosis - 1994, v. 109, p. 197.

Подписано к печати 4 У 11 Отпечатано на ротапринте в йорыат бумаги 30x42/4 Производственном конбнвате ОбьенЗ^п-х ■ Литературного фонла зак. ¿4л Ткр. 100