Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Роль холестерина в процессах синаптической пластичности, нейродегенерации и развитии болезни Альцгеймера

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Кудинова, Наталья Владимировна

ГЛАВА 1.

ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность работы.

1.2. Цель и задачи исследования.

1.3.Положения, выносимые на защиту.

1 АНаучная новизна работы.

1.5. Научно-практическая значимость работы.

ГЛАВА 2.

СОВРЕМЕННЫЕ ПРЕДСТАВЛЕНИЯ О ХОЛЕСТЕРИНЕ И ЕГО РОЛИ В НЕЙРОДЕГЕНЕРАТИВНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ).

2.1. ХОЛЕСТЕРИН И ЕГО ОБМЕН В ЖИВОТНОМ ОРГАНИЗМЕ.

2.1.1. Краткие сведения о химии холестерина.

2.1.2. Особенности распределения холестерина в животном организме.

2.2. ХОЛЕСТЕРИН В СТРУКТУРЕ КЛЕТОЧНЫХ МЕМБРАН.

2.2.1. Холестерин в строении клеточной мембраны.

2.2.2.Микродомены в плазматической мембране.

2.2.1.1 .Клатрин-окаймленные ямки.

2.2.1.2. Кавеолы.

2.3. ГОМЕОСТАЗ ХОЛЕСТЕРИНА В КЛЕТКЕ.

2.3.1. Захват холестерина.

2.3.2. Синтез холестерина.

2.3.3. Регулирование биосинтеза холестерина.

2.3.4. Транспорт холестерина из клетки.

2.3.5.Холестерин модулирует внутриклеточный липидный транспорт.

2.4. ХОЛЕСТЕРИН В ТКАНИ МОЗГА.

2.4.1. Дибаланс холестерина и болезни центральной нервной системы.

2.5.ЭЛЕКТРОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ СРЕЗОВ МОЗГА

СИНАПТИЧЕСКАЯ ПЛАСТИЧНОСТЬ И ДЛИТЕЛЬНАЯ ПОТЕНЦИАЦИЯ.

2.6.МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИЗНАКИ БОЛЕЗНИ АЛЫДГЕЙМЕРА.

2.6.1. Амилоид бета. Формирование амилоидных бляшек.

2.6.2. Белок тау. Образование нейрофибриллярных клубков.

ГЛАВА 3.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ.

3.1.ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ХОЛЕСТЕРИНА В СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ.

3.1.1. Материалы.

3.1.2. Животные.

3.1.3. Методы.

3.1.3.1. Приготовление срезов гиппокампа.

3.1.3.2.Регистрация длительной потендиации.

3.1.3.3.Эксперименты с акцепторами холестерина.

3.1.3.4. Иммуногистохимический анализ срезов.

3.1.3.5. Обработка электрофизиологических данных и статистический анализ.

3.2. ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ПИЩЕВОГО ХОЛЕСТЕРИНА НА СИНАПТИЧЕСКУЮ ПЛАСТИЧНОСТЬ И ФОРМИРОВАНИЕ АМИЛОИДНЫХ БЛЯШЕК В МОЗГЕ.

3.2.1 .Материалы.

3.2.2.Животны е.

3.2.3.Метод ы.

3.3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АМИЛОИДНЫХ БЛЯШЕК НА ДИСФУНКЦИЮ НЕЙРОНОВ.

3.3.1 .Материалы.

3.3.2. Животные.

3.3.3. Методы.

З.З.ЗЛ.Иммуногистохимический анализ и окраска Конго красным срезов гиппокампа.

3.3.3.2.Экстракция амилоида из срезов гиппокампа.

3.3.3. 3.Статистическая обработка данных.

3.4. ВЛИЯНИЕ АМИЛОИДА БЕТА НА МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ.

3.4.1. Материалы.

3.4.2.Клеточные культуры.

3.4.3.Первичная культура нейрональных клеток.

3.4.4. Методы.

3.4.4.1. Метаболическое мечение.

3.4.4.2.In vivo эксперименты.

3.4.4.3. Экстракция липидов.

3.4.4.4.Эксперименты по изучению синтезах в срезах гиппокампа.

3.4.4.5.Авторадиографический анализ срезов гиппокампа.

3.4.4.6.Эксперименты по изучению проникновения амилоида в клетки.

3.4.4.7.Статистический анализ.

ГЛАВА 4.

РЕЗУЛЬТАТЫ.

4.1.ИЗУЧЕНИЕ РОЛИ ХОЛЕСТЕРИНА В СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ.

4.1.1. Экспериментальный дизайн системы для инкубации срезов гиппокампа.

4.1.2.Биохимический и гистохимический анализ выброса холестерина из срезов гиппокампа.

4.1.3.Изучение синаптической пластичности срезов гиппокампа при уменьшении уровня внутриклеточного холестерина.

4.1.4. Снижение уровня холестерина в клетках гиппокампа вызывает их дегенерацию.

4.2. ПОВЫШЕННОЕ СОДЕРЖАНИЕ ХОЛЕСТЕРИНА В ПИЩЕ ПРИВОДИТ К НАРУШЕНИЮ СИНАПТИЧЕСКОЙ ПЛАСТИЧНОСТИ И ОТЛОЖЕНИЮ АМИЛОИДА р В ВИДЕ БЛЯШЕК В МОЗГЕ.

4.2.1.Употребление с пищей повышенного содержания холестерина приводит к отложению амилоида р в мозге крыс.

4.2.2.Нарушение длительной потенциации в гиппокампе крыс, употреблявших пищу с повышенным содержанием холестерина.

4.2.3. Пищевой холестерин усиливает синтез собственного холестерина в мозге.

4.3. ИЗУЧЕНИЕ ВЛИЯНИЯ АМИЛОИДНЫХ БЛЯШЕК НА ДИСФУНКЦИЮ НЕЙРОНОВ.

4.3.1. Старые животные.:.

4.3.1.1 .Иммуногистохимический анализ с антителами против амилоида бета. 104 4.3.1.2.0краска на амилодные фибриллы Конго красным.

4.3.2. Взрослые животные.

4.3.2.1.Иммуноблот анализ гиппокампа взрослых животных с антителами против Ар.

4.3.3. Сравнительный анализ электрофизиологии срезов гиппокампа старых и взрослых животных.

4.4.ВЛИЯНИЕ АМИЛОИДА БЕТА НА МЕТАБОЛИЗМ ЛИПИДОВ.

4.4.1.Исследование локализации амилоида бета в клетке.

4.4.2. Влияние амилоида бета на синтез липидов в клетках нейрональной природы.

4.4.3.Влияние амилоида бета на синтез липидов в мозге и печени зародышей в условиях нормы и ишемии in vivo.Ill

4.4.4.Влияние амилоида бета на синтез липидов в гиппокампе.

ГЛАВА 5.

РИСУНКИ.

ГЛАВА 6.

ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Список сокращений

А(3-амилоид бета

АМПА рецепторы- рецепторы для а-амино-3-гидрокси-5-метил-4-изоксазол-пропионовой кислоты БА- болезнь Альцгеймера

ВПСП-вызванные постсинаптические потенциалы

ГЭБ-гематоэнцефалический барьер

ГМК-КоА- (3-гидрокси-р-метил глутарил коэнзимА

ОР1- гликозилфосфатидил инозитол

ДП-длительная потенциация

ДД-длительная депрессия

СаМКП- а-кальций- кальмодулин-зависимая протеин киназа ЛП-липопротеины

ЛПОНП-липопротеины очень низкой плотности ЛПНП- липопротеины низкой плотности ЛПВП- липопротеины высокой плотности ЛПОВП- липопротеины очень высокой плотности ЛХАТ- лецитин-холестерин-ацил-трансфераза МАПК-митогенактивированная протеин киназа МЦД-метил-(3-циклодекстрины

НМДА рецепторы-рецепторы для К-метил-Э-аспартата

МОБ- фактор роста нейронов

НЭХС- неэтерифицированный холестерин

ОЗВР-оксистерин связывающий белок

ПБА- предшественник бета амилоида

ПК-протеин киназа

РНБ- парнозакрученные филаменты рА(3- растворимая форма амилоида бета СМЖ-спинномозговая жидкость

ЗКЕВРя-стерол регуляторный элемент связующих белков 8САР- расщепляющий активирующий белок БИЕВР 8Я-В1 - рецептор для липопротеинов высокой плотности ФЛ-фосфолипиды ХС-холестерин

ЦНС-центральная нервная система

ЭХС-эфиры холестерина

ЭПР- эндоплазматический ретикулум

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

В последние годы в медико-биологической науке возростает интерес к проблеме взаимосвязи холестерина и болезни Альцгеймера (БА). В значительной степени такой интерес можно объяснить многогранностью проблемы, которая, выходя за рамки клинической, все больше становится проблемой современной биохимии, биофизики и молекулярной биологии, объединяющих в себе сложные фундаментальные и прикладные знания биологии и медицины.

Болезнь Альцгеймера относится к группе патологий старческого возраста и является четвертой причиной смертности в большинстве развитых стран после сердечно-сосудистых и раковых заболеваний. Основными морфобиологическими характеристиками болезни являются внеклеточные отложения белка-амилоида бета (АР) и наличие нейрофибриллярных клубков внутри нейронов, обусловленных избыточным фосфорилированием белка тау, в норме ассоциированого с микротрубочками.

В течение длительного времени в научной литературе существовало мнение, что главной причиной болезни Альцгеймера служит отложение в мозге А(3. Считалось, что этот белок, состоящий из 39-43 аминокислотных остатков является исключительно патологическим продуктом своего предшественника- трансмембранного гликопротеина, ген которого локализован на 21 хромосоме. Однако, в 1992 году А|3 был обнаружен в плазме крови и спиномозговой жидкости, а также в культуральных средах многих клеточных линий в растворенной, неагрегированной форме (1-6). Стало ясно, что Ар является нормальным белком организма. Более того, автором было показано, что в плазме и спиномозговой жидкости Ар циркулирует в ассоциации с липопротеинами высокой плотности (4-7). Это было подтверждено и другими научными группами (8,9). Возник вопрос, что, возможно, как и многие другие апобелки, А(3 имеет функции, связанные с обменом липидов. Некоторые из таких функций были обнаружены автором, в частности, ингибирование лецетин-холестерин-ацил-трансферазы (ЛХАТ), ключевого фермента в процессе обратного транспорта холестерина, и ингибирование синтезов липидов в культуре клеток печени (10, 11). Дальнейшее изучение роли А(3 в метаболизме липидов являлось одним из направлений данной работы.

Однако, следует отметить, что причина аггегирования и полимеризации А(3, приводящая к нейродегенерации при болезни

Альцгеймера остается неясной. Возможно, что такие изменения являются компенсаторным ответом на другие патологические процессы.

Одной из таких возможных причин болезни является нарушение обмена липидов, приводящее к полимеризации амилоида бета. Так, все больше научных доказательств свидетельствуют в пользу взаимосвязи между обменом холестерина и болезнью Альцгеймера. Несколько лет назад, в начале 90-х, было показано, что наличие гомозиготной е4/е4 аллели АроЕ, основного апобелка в транспорте холестерина, является фактором риска БА (12, 13). Также, у больных БА обнаружены ряд нарушений, связанные с обменом холестерина. В частности, у больных была выявлена активация процесса транспорта холестерина из мозга, основанная на превращении холестерина в 248-гидрохолестерин (14). Холестерин также накапливается в амилоидных бляшках больных БА и амилоидоподобных бляшках трансгенных ПБА мышей (15). Было показано также, что у кроликов и трансгенных мышей, употребляющих пищу с повышенным содержанием холестерина, происходит формирование амилоидоподобных бляшек в мозге (16,17). Недавние исследования показали, что статины, ингибиторы основного фермента синтеза холестерина, З-гидрокси-З-метилглутарил- коэнзим А редуктазы, снижают риск деменции и болезни Альцгеймера (18-20). Таким образом, прослеживается достаточно четкая взаимосвязь обмена холестерина и БА. Одной из задач настоящего исследования было выявление возможных патогенетических взаимотношений нарушения гомеостаза холестерина и процессов нейродегенерации.

Функции холестерина очень разнообразны, однако не все из них изучены до конца. Особенно, это касается ткани мозга. Очень многое в нейробиологии холестерина еще предстоит выяснить. Так, например, до сих пор не выяснена роль холестерина в функции нейронов. Следует подчеркнуть, что мозг содержит почти четверть всего холестерина организма, при этом он составляет только 2% от всей массы тела. Такое соотношение позволяет сделать предположение об исключительной важности холестерина в работе нейронов. Ранее было показано, что под действием холестерина изменяется внутриклеточный транспорт синаптических везикул (21), активность Ка-К+-АТФазы (22), аденилатциклазы (23), ацетилхолиновых, никотиновых и родопсиновых рецепторов (24, 25), кальциего гомеостаза (26). Однако функция холестерина и фосфолипидов (двух основных липидных компонентов мембран) в процессах памяти изучена мало. Одним из направлений настоящего исследования было выяснение роли холестерина в нейротрансмиссии и синаптической пластичности, важных параметров процессов памяти.