Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Видовая диагностика и определение напряженности иммунитета при эймериозе кур

ВАК РФ 03.00.19, Паразитология

Автореферат диссертации по теме "Видовая диагностика и определение напряженности иммунитета при эймериозе кур"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ВЕТЕРИНАРНАЯ АКАДЕМИЯ имени К. И. СКРЯБИНА

На правах рукописи

мунтяну

Александр Иванович

ВИДОВАЯ ДИАГНОСТИКА И ОПРЕДЕЛЕНИЕ НАПРЯЖЕННОСТИ ИММУНИТЕТА ПРИ ЭЙМЕРИОЗЕ КУР

Специальность: 03.00.19 — Паразитология АВТОРЕФЕРАТ

1991

Работа выполнена во Всесоюзном научно-исследовательском ветеринарном институте птицеводства и Ленинградском научно-исследовательском институте эпидемиологии и микробиологии им. Пастера.

Научные руководители: кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Кириллов А. И.; кандидат химических наук, старший научный сотрудник Вербов В. Н.

Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наух, профессор Тимофеев Б. А.; кандидат биологических наук, доцент Евплов Н. Н.

Ведущая организация — Витебский ордена «Знак Почета» ветеринарный институт нм. Октябрьской революции.

:волюции. /н

Ц11ПГЛ РППРТ я ТС"

Защита диссертации состоится « 7 7» ш^п^^^ > 1992 г. в « » часов на заседании Специализированного совета К 120.36.05 по защите диссертаций на соискание ученой степени кандидата наук в Московской ордена Трудового Красного Знамени ветеринарной академии им. К. И. Скрябина по адресу: 109472, Москва, ул. Академика Скрябина, д. 23, тел. 377-93-83.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке академии.

Автореферат разослан ч. ^ ■» ЯЛ^Х?!^*^ 199^ г.

Ученый секретарь /У/

Специализированного совета Су^^ср Федосеева Т. Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОЩ

Актуальность проблема. Эймериозы наносят большой экономический ущерб птицеводству, который складывается из потерь продуктивности, отхода птицы, дополнительных затрат на корма и медикаменты. У переболевших эймериозом кур-несушек уменьшается яйценоскость на 10-80 %, задерживается яйцекладка. Экономические потери в птицеводстве яичного направления, при пересчете на I млрд.птиц, достигают 230 млн.руб. Ущерб мясной продуктивности составляет по 270 г на бройлера, выход цыплят первой категории снижается до 20 %, затраты корма на 5-15 % (Крылов, 1980; Илюшечкин с соавт., 1981; Парре, 1985; Ruff , 1976; Long , 1982). Кроме этого, эймериозы создают благоприятный фон для развития вторичных инфекций (Лавре-нов, Чурсина, 1981; Поживил, 1983; Baba et al. , 1987).

Наиболее эффективным и рентабельным методом борьбы с эймерио-зами считается подавление развития паразитов в организме хозяина, путем применения антвдокцидийных препаратов, а также иммунизации птиц. В настоящее время в птицехозяйствах страны все большее применение находит метод иммунохимиопрофилактики кокцидиозов кур. Наряду с этим отсутствует возможность объективно и быстро осуществлять контроль за формированием поствакцинального иммунитета при данном заболевании. Следует также отметить, что существующие методы лабораторной диагностика эймериоза (обнаружение различных стадий паразита в слизистой оболочке кишечника и помете, определение вида) являются трудоемкими, длительными в проведении. В тоже время, в зарубежной и отечественной литература имеются сообщения о все возрастающей роли в диагностике инфекционных и паразитарных болезней животных и птиц иммуноферментного метода (ЙФМ), обладающего высокой специфичностью и чувствительностью (Marquardt, 1986; Onaga et al. , 1989). Придавая важное значение данному вопросу Государственный Комитет СССР по науке и технике в 1983 году принял постановление № 6 "О расширении научно-исследовательских работ в области создания диагностических препаратов и оборудования для иммуноферментного анализа и их применение в медицине, сельском хозяйства, промышленности и научных исследованиях".

Поэтому разработка современных, высокочувствительных и ускоренных методов лабораторной диагностики и контроля напряженности иммунитета птицепоголовья при эймериозах кур является актуальной и имеет .большое научное и практическое значение.

Цель и задачи работы. Учитывая экономические потери наносимые эймериозами птицеводству и важность в связи с этим разработки средств и методов борьбы при этом заболевании, мы поставили своей целью разработать ускоренный метод видовой диагностики и оценки поствакцинального иммунитета при эймериозе кур с помощью ША. В соответствии с поставленной целью в задачи наших исследований., входило:

1. Обосновать эффективность применения ИФМ для определения специфичных антител к эймериям в сыворотка крови цыплят.

2. Отработать методику постановки ИФМ при выявлении сывороточ-■ ных антиэймерийных иммуноглобулинов.

3. Изучить диагностическую ценность ИФМ для серологической идентификации различных видов эймерий кур и при контроле поствакцинального иммунитета.

• 4. Апробировать ИФМ в производственных условиях при применении мЛода имщнохимиопрофилактики кокцидиозов кур.

Научная новизна. Разработан способ получения эймерийных анти' генов для видоспецифической серодиагностики эймериозов кур. Сущ' ность способа составила содержание заявки на изобретение t (JS 65964/20 от 23.09.91.). Отработана схема получения видоспецифи-ческих, высокоактивных сывороток к трем видам эймерий: Eimeria

tenella , Eimeria acervulina , Eimeria maxima. Показана принципиальная возможность проведения видовой диагностики и оценки напряженности поствакцинального антиэймерийного иммунитета с помощью непрямого варианта иммуноферментного метода. Установлена положительная корреляционная связь.между титром специфических сыво- 1 роточных антител и резистентностью к контрольному заражению на примере возбудителя Е. tenella.

Практическая ценность. Оптимизированы условия получения основных компонентов иммуноферментной тест-системы (антиген для сорбции, положительный и отрицательный контроля, иммунопероксидазный конъю-гат). Обоснованы иммуно-химические и физико-химические критерии определяющие чувствительность, специфичность и воспроизводимость исследований. Апробация тест-система в производственных условиях

показала перспективность применения данного метода при массовых серологических исследованиях с целью определения напряженности антикокцидийного иммунитета. Простота постановки И® позволяет считать целесообразным внедрение его в широкую производственную практику.

Апробация работы. Основные положения диссертации доложены, обсуждены и одобрены на научно-производственной конференции молодых ученых и специалистов "Ветеринарные проблемы птицеводства" (Ленинград-Ломоносов, 1990), на Методических и Ученом советах Всесоюзного научно-исследовательского ветеринарного института птицеводства.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 работы,' в которых изложено основное ее содержание.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 146 страницах машинописного текста и включает в себя введение, обзор литературы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы и приложение. Диссертация иллюстрирована 7 рисунками и 18 таблицами. Библиографический указатель включает 249 источников литературы, в том числе 164 иностранных автора.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалы и методы исследований

В лабораторных опытах использовали цыплят кросса "Бройлер-6". Производственные исследования проводили на Ломоносовской птицефабрике (Ленинградская обл.) и в условиях Рыбницкого ППС им.60-летия СССР (Молдавская ССР).

В качестве экспериментального материала использовали 10-12-цневных цыплят, выращенных в условиях исключающих спонтанное' инва-зирование эймэрияма. Копрологические исследования проводили согласно ГОСТ 255383-62 с внесенным в него изменением JS I от 01.01.88. "Животные сельскохозяйственные. Методы лабораторной диагностики кокцидиоза".

В экспериментальных опытах использовали штаммы эймерий.кур [ Е. tenelle , Е. acervulina , Е. maxima ),

юлученные в отделе паразитологии ВНИВИП. Стерильные ооцисты эйме->ий получали по методу G. liagenbach (1966) с незначительными [зменениями. .

Эймерийныа антигены получали из стерильных спорулированных ооциет "чистых" видов кокцидий по измененной и дополненной мето-' дике Н. Onega et al., (1986).

Положительные контрольные сыворотки к эймориям получали на 15-дневных цыплятах путем двухкратной иммунизации с интервалом 14 дней "чистыми" видами эймерий. В работе таете использовались сыворотки крови экспериментально иммунизированных культурой кокцидий цыплят. При проверке специфичности иммуноферментной тест-системы применялись иммунные референс-сыворотки к возбудителям болезней кур (кьюкаслской болезни, инфекционного бронхита, гриппа птиц, колибактериоза и сальмонеллеза кур), а также нормальные сыворотки крови кур, кролика, барана и гусей.

Специфические иммуноглобулины выделяли сульфатным методом ( Campbell et al . , 1970) из кроличьей антикуриной сыворотки, производства ЛенНИЫВС с титром в реакции преципитации 1:16.

Иммуноферментные конъюгаты получали методом периодатного окисления ( Wilson , Hakane , 1978).

Постановку иммуноферментной реакции осуществляли в объеме 0,1 мл в лунках полистироловых планшетов для иммуноферментного анализа.

Статистическую обработку результатов исследований проводили с использованием методов вариационной статистики и корреляционного анализа (Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Приготовление эйметайных антигенов

Анализ литературных источников советских и зарубежных авторов позволил заключить, что при эймериозах кур важную роль в защитных реакциях макроорганизма.играют гуморальные факторы. Для определения специфичных антител при данном заболевании более приемлемым является иммуноферментный метод, в частности его непрямой вариант. Вместе с тем, следует отметить, что при разработке атого метода важными моментами являются:

а) решение иммуно-химических задач - получение высокоактивного антигена, специфического конъюгата и иммунной сыворотки;

б) решение физико-химиче.ских задач - отработка параметров постановки самой иммуноф.фментной реакции.

Для получения антигенов эймерий использовали стерильные спо-рулированные оодисты Е. tenella , Е. acervulina, Е. maxima, которые подвергали разрушению. Для этих целей использовали ультразвук различной амплитуды. Контроль эффективности разрушения паразитов осуществляли при просмотре обрабатываемой суспензии эймерий в световом микроскопе при увеличения в 100 раз. Озвучивание прово-. дали при охлаждении на ледяной бане. Сравнивание 'различных режимов озвучивания ооцист одной и той же суспензии (частота 15 кГц, мощность 150 Вт, экспозиция 15 мин, амплитуда волны 5-25 мот) показало, что оптимальным вариантом для эймерий всех трех видов является режим обработки при амплитуде волны 15 г-рм. При этом происходит практически полное разрушение ооцист (табл.1). Использование ультразвука более высокой амплитуды не эффективно и вызывает чрезмерное нагревание суспензии, что'может повлечь за собой денатурацию белка.

Таблица I

Влияние амплитуды волны ультразвука на степень разрушения ооцист

Амплитуда ультразвука (мкм)

Концентрация ооцист (г.иш/мл)

Е. tenella 9,7

£. maxima 6,5

acervulina^ 13

5

Ю 15 20 25

частичное

частичное

полное

полное

полное

частичное частичное полное полное полноэ

частичное частичное полное полное полное

Полученный таким образом гомогенизат эймерий осветляли центрифугированием при 15 тыс.об/мин в течение 20 мин при температуре 4 °С. Супернатант использовали в качестве антигена. При постановки шмуноферментной реакции, на примере антигена Е. tenella с ИММУННЫМИ сыворотками к Е. тах!та , Д. асегти11па

была выявлена кросс-реактивность; что доказывает наличие у этих видов общих антигенных детерминант.

il. JenJcirs , J. Urne (1987) доказали, что не все антигены, спорозоитов и мерозоитов эймерий обладают иммуногенностью. В этой связи, с целью разделения ультразвукового гомогенизата ооцист и получение активных антигенных фракций, нами был использован метод высоко-эффективной жидкостной гель-хроматографии высокого давления. Полученные после хроматографирования фракции анализировали на антигенную активность и видовую специфичность в 1Ш, с использованием видоспецифических антисывороток к е. teneiia Е. acervulina , ь. maxima * • Для определения молекулярного веса антигенов применяли белковые," молекулярно-массовые стандарты s-200 ( sigma США). На основании проведенных исследований установлено, что полученные фракции имели молекулярный вес в диапазоне 1-200 кД, при этом максимум антигенной активности приходился на фракции с мол.весом от 100 до 200 кД. Для этих же фракций был характерен и максимум видовой специфичности. Активные видоспеци-фичные фракции концентрировали и использовали в качестве антигенов для дальнейших исследований.

Получение специфических антиэймерийных сывороток и конъюгата Для получения специфических моносывороток, иммунных к трем используемым в нашей работе видам эймерий, цыплят 15-дневного возраста дважды иммунизировали "чистыми" видами эймерий с нарастающими дозами. Интервал между иммунизациями составлял 14 дней. При постановке ИйМ с сыворотками, полученными от цыплят в различные сроки иммунизации, установлено нарастание титров специфических антител вплоть до 35 дня спустя первой инокуляции. Уровень сывороточных иммуноглобулинов в этот период был максимальным для как-дого из трех видов эймерий.

Конъюгат получали на основе пероксидазы хрена и тлобулановой фракции, выделенной 2-х кратным .высаливанием 40 % раствором сульфата аммония из коммерческой кроличьей антикуриной сыворотки. Им-муноферментные препараты характеризовали путем определения оптимального рабочего разведения и по общепринятой величине R2, Для исследований отбирали фракции со значениями 0,3-0,6. При определении рабочего разведения проводился контроль значений » — работа выполнена в соавторстве с В.Н. Вербовым - оказывал науч' но-методическую помощь, А.И.Артюховым, E.H.Горбачёвым - оказывали техническую помощь.

оптической плотности (ОП^дд) продуктов иммуноферментной реакции положительного и отрицательного контролей и их отношение. Разведение кон^югата соответствующее 8,0 глкг/мл по белку и 2,8 мкг/мл па ферменту, было оптимальным. При этом отмечались максимальные значения положительного контроля о минимальными отрицательного.

Полученные компоненты иммуноферментной реакции для удобства . дальнейших исследований были лиофилизированы и собраны в диагностическую тест-систему.

Специфичность, чувствительность и выявляомость исследований.

Важными параметрами любой диагностической тест-системы являются специфичность, чувствительность и выявляемость исследований. В этой связи наш было проведено изучение специфичности используемого в тест-системе антигена £.' tenella . Оцен-

ку этого критерия осуществляли при постановке аюдуноферментной реакции с различными рефереис-сыворотками к возбудителям болезней кур. В частности: с монорецепторной "Н"-агглютишфующ9й саль-монеллеэной сывороткой; "0"-колнагглютинирующай сывороткой; иммунной сывороткой к вирусу гриппа птиц; иммунной сывороткой к вирусам болезни Ньюкасла и инфекционного бронхита птиц. При постановке реакции были получены отрицательные результаты, что доказывает специфичность используемого антигена.

Оцежу чувствительности и ваявляемости проводили на 20-дневных цыплятах. Иммунизацию цыплят проводили индивидуально суспензией спорулированнкх ооцист Е. teIзella в дозе 1500 на голову. Для выявления антител у цыплят брали кровь на 3, 5, 7, 14 и 21 сутки после иммунизации. При этом было определено, что уже на 7 день специфичные иммуноглобулины удалось обнаружить у 13 цыплят, что составляет 26 % от общего количества исследованных проб. В дальнейшем процент положительно реагирующих сывороток увеличивался а через три надели у всех подопытных цыплят обнаруживались специфичные антитела (табл.2).

Таблица 2

Результаты выявления антител к Е. ЪепеПа в сыворотках крови экспериментально иммунизированных цыплят

Сроки после иммунизации (дни)

Всего иссле- Выявлено довано проб положительных

Процент положительных

3 5 7

14 21

50 50 50 50 50

О О 13

45 50

26 90

100

О О

Анализ полученных результатов свидетельствует о возможности проведения видовой экспресс-диагностики эймериозов кур посредством серологических исследований в И®. Особенности твердофазного МЛ позволяют в короткие сроки проводить обследование большого количества птиц на предмет изучения видового состава паразитирующих у них эймерий. Полученные при э-том результаты будут важны при определении целесообразности применения тех или иных видов паразитов для иммунизации цыплят конкретного хозяйства.

Изучение кинетики накопления сывороточных иммуноглобулинов.

Разработав иммуноферментную тест-систему на основе непрямого варианта, мы поставили перед собой задачу изучить кинетику накопления специфичных к Е. ЪепеИа сывороточных антител, в зависимости от имцунизирующей дозы. В опытах использовали 20-дневных цыплят. Иммунизацию проводили 2-х кратно с интервалом в 4 недели (рис.1). Иммунизирующая доза для цыплят первой и второй груш соответственно составляла 500 и .2000 спорулированныз{ ооциет на голову. При повторной иммунизации 5000 и 20000 ооциет.

Анализ полученных данных позволил выявить достоверное различие между содержанием антител в сыворотке крови цыплят первой и второй групп (Р<0,05), при этом отмечена прямая зависимость между количеством введенных ооциет и накоплением специфичных иммуноглобулинов.

I on «»о , .

i V ■

1,4

0,8 0,6 0,4 Qi

7

H 21 2B 33 42

Рис.1. Кинотика накопления сывороточных иммуноглобулинов в зависимости от введенной дозы эймеряй.

Ось абсцисс - дни после иммунизации.

■ Ось ординат - значения ОП^.

Максимальный уровень антител после однократной инокуляции отмечался на 21 день, причем повторная иммунизация вызывала более выраженный гуморальный ответ.

Оценка напряженности поствакцинального иммунитета Как известно, напряженность иммунитета при эймериозах находится в прямой зависимости от дозы иммунизации (Бейер, 1962; Пашкин, 1964; Long , 1984; Liilehoj , 1988). В этой связи просматривается определенная зависимость между иммунизирующей дозой( накоплением специфичных сывороточных антител и формированием иммунитета к соответствующему виду эймерий. Данная взаимосвязь указывает на возможность определения-напряженности иммунитета посредством оценки гуморального ответа птиц при иммунизации.

Целью наших дальнейших исследований явилось определение гуморального поствакцинального ответа цыплят, при котором обеспечивается достаточная резистентность организма к возбудителю при контрольном заражении.

Для проведения опытов использовали цыплят 10-дневного возраста, которых иммунизировали культурой'кокцидий. Через 3 недели после иммунизации получали сыворотку для постановки И®1. В этот же день у птиц определяли массу тела и заражали ооцистами БЛепеПв в дозе ЛД50 (53 тыс.). На протяжении 10 дней после контрольного заражения за цыплятами велось наблюдение, при этом отмечалось удовлетворительное состояние птицы. Клинические признаки эймериоза ' не проявлялись. По истечению указанного срока у цыплят вновь определяли массу тола.

Анализ полученных результатов позволил определить, что средняя арифметичесгсая величина единиц ОП^дд исследованных сывороток составляет 0,75. Коэффициент вариации указанных показателей равнялся 19 %. Наряду с этим оценивался коэффициент корреляции рангов, ранжированных попарно значений 011490 и показателей прироста массы тела, зараженных дозой ЛДд0 птиц. На основании проведенных расчетов опродолено, что коэффициент корреляции рангов составляет 0,77, при Р <0,05. Следовательно, с вероятностью Р ь-0,95 можно утверждать, что между приростом массы тела цыплят и значениями 0^490 исследованных в И®М сывороток, существует положительная корреляционная связь.-

Таким образом, оценка напряженности поствакцинального иммунитета может осуществляться путем сравнения исследуемых в иммунофер-ментной реакции сывороток с положительным стандартом =0,75 единиц ®490* Яви 'этом положительными (иммунными) считаются пробы сывороток, величина экстинвди которых в ШЛ равна или превосходит значения ОП^дд положительного стандарта. Оценка результатов может проводиться как инструментально, так и визуально. При визуальном учете продукт ишуноферментной реакции исследуемых проб в разведении 1:100 (если считать их имцунными) должен окрашиваться от желтого до коричневого цветов.

Определение иамунного статуса птштоголовья в условиях; птицахозяйств

Учитывая диагностическую ценность и высокую информативность серологических методов направленных на выявление специфических антител ми сочли необходимым апробировать разработанную тест-систему при оценке напряженности поствакцинального иммунитета в условиях атицехозяйств.

На Ломоносовской птицефабрике (Ленинградская обл.) цыплят 12-дневного возраста иммунизировали культурой кокццдий, состоящей из спорулпровашшх ооцист трох видов: ь. teneiia , е. maxima,

Е. acervulina . Культуру давали с кормом. Начиная с 8-го дня после иммунизации в течение 12 дней птица получала корм с антикокцидийним препаратом (ампролплюс), не препятствующим выработке иммунитета к эймериям. Полученные сыворотки перед исследованием разводили 1:100. (табл.3).

Таблица 3

Результаты, экспрэсс-диагностшш напряженности поствакцнналыюго иммунитета к Е. teneiia

Сроки после Всего нсследо- Выявлено В процентном

иммунизации вано проб иммунных отношении

(дни)

14 5р 28 56

21 50 ' 42 • 84

28 50 50 100

35 50 50 100

. 42 50 50 100

Представленные в таблице данные показывают, что при исследовании сывороток через 2 недели после иммунизации количество иммунных проб составило 56 %. Через 3 недели этот показатель был равен 84 % и к 4-недельному сроку все исследуемые сыворотки бшш иммунными. При постановке реакции с сыворотками, полученными от стариевозраст-ной- птицы (45-52-дневные), интенсивность иммуноферментной реакции была значительно выше, чем с сывороткам!! цыплят 25-дневного возраста. Выявленные различия объясняются реинвазией птицепоголовья из внешней среды, за счет которой происходит постоянное поддерживание иммунного состояния кур в отношении эймэрий. Этим определяется важность контроля напряженности иммунитета при данном заболевании именно в-первые 2-3 недели поствакщшалького периода. Так, при апробировании тест-системы в условиях Рыбницкого ППС (Молдавская ССР) спустя 2 недели

после применения культуры кокцидий, количество иммунных проб, в зависимости от птичника, колебалось в пределах 54-60 Через 3 недели эти показатели составляли уже от 85 до 100 %.

На протяжении всего периода выращивания (120 дней) птицепого-ловье как опытной, так и контрольной (не иммунизированной) групп обследовалось на предмет выявления ь. tenella инвазии (клиническое состояние, наличие специфичных поражений слепых отростков кишечника • при паталогоанатомическом вскрытии). Кроме этого учитывались такие показатели как сохранность, среднесуточный прирост, затраты корма на I ц продукции, выход деловой молодки. При этом установлено, что за весь период выращивания ремонтного молодняка количество павших цыплят составило: в опытной группе - 1528 голов (3,4 %), клинической картины и специфических поражений слепых отростков кишечника, характерных для Е. tenella инвазии не отмечалось; в контрольной группе - X4I9 голов (4,65 %), в том числе от цекального эймериоза 99 голов, что составляет 7 % от общего количества пашей птицы.

Полученные результата доказывают эффективность использования тест-системы при экспресс-диагностике напряженности иммунитета кур к эймериям (на примере Ь. tenella ). Применение для постановки ИОД видоспецифичных 'эймерийлых антигенов позволяет в короткий срок (4-6 ч) Дать предварительный ответ о инвазированиа птицепоголовья конкретного хозяйства тем или иным видом эймерий. Возможность автоматизации процесса постановки реакции и инструментального учета позволяют объективно оценивать результаты исследований.

Таким образом, анализ представленных материалов показывает, что ИШ является удобным, высокочувствительным способом выявления специфических' антител к эймериям. При этом сроки контроля формирования антикокцидийного иммунитета, а также идентификации видов эймерий значительно сокращаются - это позволяет надеяться, что в будущем ИМ найдет широкое практическое применение.

выводы •

I, Эффективным методом получения антигенных фракций эймерий кур является обработка спорулированных ооциет ультразвуком при режиме озвучивания с частотой 15 Kltt, амплитудой. 15 мкм в течение 15 мин.

. 2. Введение дополнительного этапа фракционирования ультразвукового гомогенизата ооцист эймерий при помощи высокоэффективной жидкостной галь-хроматографяи высокого давления позволяет получить высокоактивные видоспецифичные антигены с мол.массой от 100 до 200 кД.

3. Отработана схема иммунизации цыплят для получения положительных контрольных сывороток К Е^епеНь, В.асегчиПпа, Е.аах1та.

4. Антикуркная кроличья коммерческая сыворотка, с титром в реакции преципитации 1:16 пригодна для создания высокоактивного иммун опер оке ида з но го коныогата, стабильного при хранении в лиофи-лизированном состоянии.

5. Разработана диагностическая тест-система, позволяющая выявлять специфические сывороточные антитела к Б.гелеНа

на 7-е сутки после иммунизации, максимальный уровень которых отмечается на 21 день.

6. Оптимизированы условия наработки основных компонентов иммуноферментной тест-систеш (антиген для сорбции, положительный и отрицательный контроли, иммуноцероксидазный конъюгат), а также обоснованы иммуно-химическиа и физико-химические критерии определяющие чувствительность, специфичность и воспроизводимость исследований.

7. Применение видоспецифичных эймерийных антигенов при постановке ИФМ позволяет в короткий срок (4-6 ч) дать предварительный ответ о инвазировании птицепоголовъя тем или иным видом эймерий.

8. Использование диагностической тест-системы на основе твердофазного ИФМ дает возможность объективно и быстро осуществлять контроль за формированием поствакцинального иммунитета кур к

К. tenella.

СВЕДЕНИЯ О ПРАКТИЧЕСКОМ ИСПОЛЬЗОВАНИИ ПОЛУЧЕННЫХ АВТОРОМ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Разработана методика получения видоспецифичных антигенов эймерий кур, пригодных для проведения видовой диагностики эймерио-зов с помощью твердофазного иммуноферментного метода. Сущность методики составила содержание заявки на изобретение.

2. На основании положительных результатов лабораторно-комис-сионных испытаний тест-системы, проведенных в условиях отдела паразитологии ВНИВИП, диагностические наборы были апробированы в пти-

цехозяйствах Ленинградской области и Молдавской ССР. Полученные при этом данные использовались при составлении информационного листка.

РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ИСПОЛЬЗОВАНИИ НАУЧНЫХ ВЫВОДОВ

1. Результаты полученные при оптимизации условий наработки основных компонентов иммуноферментной тест-системы, а также обоснования иммуно-химических и физико-химических критериев, определяющих чувствительность, специфичность и воспроизводимость исследований, рекомендуется использовать как нормативные характеристики при изготовлении и контроле диагностических препаратов. •

2. На основании данных лабораторных и производственных испытаний тест-системы, рекомендуется осуществлять серологический контроль напряжённости поствакцинального антйэймерийного иммунитета кур с целью корректировки 'профилактических мероприятий при данном заболевании. .

СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОЛУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Мунтяну А.И, Применение непрямого твердофазного иммунофер-ментного метода для оценки напряжённости иммунитета у доплят при эймериозе вызванном E.tenella // Тез.докл.научно-производственной конференции молодых учёных и специалистов / Ветеринарные проблемы птицеводства. .- Ленинград-Ломоносов; 1990. С.бб-87.

2, Мунтяну А.И., Вербов В.Н..Кириллов А.И. Тест-система диагностическая иммуноферментная для выявления антител к возбудителю эймериоза кур / Информ.листок, Ш 236-91 / Ленинградский центр научно-технической информации, 19Э1. 2 с.