Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Усовершенствование биотехнологических методов получения и сохранения семени домашних коз и их гибридов с сибирским козерогом

ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Усовершенствование биотехнологических методов получения и сохранения семени домашних коз и их гибридов с сибирским козерогом"

005012179 ВОЕВОДИН Владимир Александрович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ И СОХРАНЕНИЯ СЕМЕНИ ДОМАШНИХ КОЗ И ИХ ГИБРИДОВ С СИБИРСКИМ КОЗЕРОГОМ

03.01.06 - Биотехнология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 [.-іАР Ш

Дубровицы - 2012

\

Работа выполнена в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии.

доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН Багиров Вугар Алинияз оглы

Букаров Нурмагомед Гаджикулиевич,

доктор биологических наук, профессор ОАО «Московское» по племенной работе, начальник лаборатории иммуногенетической экспертизы

Ерохин Анатолий Сергеевич,

доктор биологических наук, профессор Всероссийский НИИ племенного дела, заведующий отделом биологии

воспроизведения сельскохозяйственных животных

ФГБОУ ВПО Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии имени К.И. Скрябина.

Защита диссертации состоится 2012 г., в 10 часов, на

заседании диссертационного совета Д 006.013.01 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: 142132, Московская область, Подольский район, п.Дубровицы, ВИЖ, тел./факс (4967) 65-11-01, www.vij.ru

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке института.

Автореферат разослан 44 ЦШШЗу'гш г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 006.013.01

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

/

С. В. Воробьева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Создание новых высокоэффективных форм сельскохозяйственных животных с использованием высокой адагггадионной способности дикой фауны является одной из важнейших задач сельскохозяйственной науки. В решении теоретических и прикладных вопросов конструирования новых селекционных форм животных главную роль играют исследования, которые включают комплекс мероприятий, связанных с сохранением и рациональным использованием генофонда [Багиров и др., 2009; Захаров-Гезехус И.А. и др., 2007; Насибов и др., 2010].

По данным ФА О, за последние десять лет общая численность коз выросла с 730 млн. до 868 млн. голов, их разводят во всех зонах проживания человека, что обусловлено высокой приспособленностью данного вида животных к различным условиям обитания и высокой резистентностью [Багиров и др., 2009]. В связи, с чем наблюдается всевозрастающий интерес к проблемам генетики рода Сарга.

Во второй половине XX века, в связи с открытием и разработкой методов глубокого замораживания гамет, стало возможным создание криобанков репродуктивных клеток животных. Длительное время работа в основном проводилась с эякулированным семенем. Однако эпидидимальное семя также является важным, а зачастую и единственным источником для криоконсервации генетического материала диких животных. Так как сперматозоиды могут длительное время сохраняться в хвосте придатка в неактивном состоянии, влияние продолжительности их пребывания в последнем на оплодотворяющую способность и другие биологические свойства представляют интерес для более подробного изучения.

Актуальной задачей является разработка новых методов получения эпидидимального семени, криопротективных сред, способствующих сохранению биологической полноценности эпидидимальных

сперматозоидов при криоконсервации.

Контролируемое воспроизводство редких и исчезающих видов животных возможно благодаря использованию замороженного эпидидимального семсни [Pukazhenti et al., 1999]; сперма может быть получена от самцов в их естественной среде обитания и заморожена для последующего осеменения самок, содержащихся в неволе [Bailey et al., 2003].

Цель и задачи исследований. Целью диссертационной работы является разработка биотехнологических методов получения, криоконсервации семени и сравнительная характеристика эпидидимальных и эякулированных сперматозоидов животных.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие -задачи:

-разработать новый метод прижизненного получения эпидидимального семени с помощью фистулы семяпровода;

-провести сравнительную оценку и изучение биологической полноценности, морфологических показателей свежеполученных,

охлажденных и замороженно-отгаянных эякулированных и эпидидимальных сперматозоидов;

-изучить оплодотворяющую способность сперматозоидов и результаты осеменения животных эпидидимальным и эякулированным семенем;

-разработать метод криоконсервации семени самцов рода Сарга;

-создать криобанк семени чистопородных и гибридных козлов-производителей;

-получить от осеменения замороженно-отгаянным эпидидимальным семенем гибридов сибирского козерога и зааненской козы разных генераций;

-изучить биологические характеристики гибридных самцов и самок;

Научная новизна. Разработан новый метод прижизненного получения эпвдидимального семени с помощью фистулы семяпровода. Впервые в сравнительном аспекте изучены биологические свойства эякулированного и прижизненно полученного эпидидимального семени от одного и того же животного. Дана сравнительная цитогенетическая характеристика видов рода Сарга и их гибридов. Установлено, что гибридные животные обладают нормальными репродуктивными качествами. Впервые получены гибриды второго поколения сибирского козерога и зааненских коз.

Практическая значимость. Разработаны новые методы получения и криоконсервации эпидидимального и эякулированного семени самцов рода Сарга. Создан криобанк семени гибридов сибирского козерога первого поколения и козлов-производителей зааненской и нубийской и оренбургской пород коз. Получены гибриды первогои второго поколения сибирского козерога и зааненской породы коз, с целью создания новых высокоэффективных селекционных форм животных.

Положения, выносимые на защиту:

-новые методы получения и криоконсервации эпидидимального и эякулированного семени животных, позволяющие получить высокую биологическую полноценность и оплодотворяющую способность;

- криоколлекция эпидидимального и эякулированного семени гибридов сибирского козерога первого поколения и козлов-производителей зааненской, нубийской и оренбургской пород;

-сравнительная цитогенетическая характеристика разных видов рода Сарга и гибридного потомства с применением прикладных компьютерных программ;

-получение гибридных животных второго поколения для создания новых высокоэффективных селекционных форм коз.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИ животноводства Россельхозакадемии (2008-2011гг.), на научных конференциях (Санкт-Петербург 2009, Дубровицы 2009, Москва 2010, Кострома 2011,).

Публикации результатов исследований. Опубликовано 11 научных работ в том числе, по теме диссертационной работы 7 из них 5 в журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, выводов, практических предложений, списка основных работ, опубликованных по теме исследований, списка использованной литературы. Материал изложен на 110 страницах компьютерного текста, содержит 8 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 184 источника, в т.ч. 170 - на иностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Работа выполнена в 2007-2011гг. в Центре биотехнологии и молекулярной диагностики ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии. Исследования выполнены по следующей схеме (рис.1). В экспериментах для получения семени от домашних козлов и их гибридов сибирским козерогом использовали только клинически здоровых животных в возрасте 12 месяцев и старше. Животных кормили в соответствии с нормами ВИЖ. Для получения семени использовали гибридных козлов первого поколения (п=2), второго поколения (п=3), чистопородных: зааненских (п=8), нубийских (п=4), оренбургских (п=3). Эякулированное семя получали методом электроэякуляции и на искусственную вагину, в которой создавались условия, необходимые для проявления рефлекса эякуляции (давление, температура и скольжение). Для получения спермы использовали электроэякулятор minitube Е-320. В экспериментах использовали цельное и отделенное от плазмы эякулированное семя. Определение количественных и качественных показателей образцов семени проводили с помощью компьютерного анализа спермы (computer-assisted semen analysis [CASA]): определение концентрации и подвижности сперматозоидов проводили с помощью программы Видеотест Зоосперм. Процент интактных (неповреждённых) акросом определяли методом дифференциального окрашивания (Diff Quick набор) - азур 2 и эозин, оценивая целостность акросом, окрашенных розовым цветом. Для разбавления эпидидимального семени в состав модифицированной лактоза, трис, лимонная кислота, глицерин среды дополнительно был включен бычий сывороточный альбумин (BSA). Образцы разбавляли одноступенчатым методом. После разбавления семя в течение 4 часов подвергали эквилибрации при температуре 2-4°С. Разбавленное семя замораживали в парах жидкого азота на фторопластовой пластине в течение 5 минут, затем фторопластовую пластину с гранулами погружали в жидкий азот, гранулы объёмом 0,25 мл переносили в алюминиевые тюбы и погружали в жидкий азот на хранение. Искусственное осеменения коз проводилось замороженно-оттаянными сперматозоидами визоцервикальным методом. Нами было осеменено 12 голов коз, из них 7 - зааненской породы и 5 гибриднов первого поколения. Получено 15 козлят второго поколения.

л

швщтш

Биотехнологические методы получения и криоконсервации семени самцов рода Сарга

Прижизненное получение эпидидимального семени (Катетеризацкиьсемяпровода)

Получение эякулированного семени ^ .....

Сравнительная оценка биологической полноценности сперматозоидов, полученных разными методами

Морфо-физиологический оценка и сперматозоидов

Комплексная оценка сперматозоидов с использованием CASA

Характеристика семени до и после криоконсервации

Лл

А»

Лш

Создание криобанка генетического материала рода Сарга

1 тт. Д11и

Искусственное осеменение коз замороженно-оттаянным семенем

Получения межвидовых гибридов разных генераций

Сравнительный цитогенетический анализ исходных видов и гибридов

Изучение биологических особенностей межвидовых гибридов

Рис. 1. Схема исследований

Для осеменения коз спермой, замороженной в гранулах, использовали специальный катетер для осеменения коз. Использовали зеркало с освещением.

Цитогенетические исследования выполнены на домашних козах и их гибридах с сибирским козерогом. Препараты хромосом получали из культуры лимфоцитов периферической крови по общепринятой схеме [Графодатский A.C., и др., 1988] с рядом внесенных модификаций [Кленовицкий П. М. и др., 2007].

Материал проведённых исследований обработан статистически с использованием стандартного пакета программ для персонального компьютера.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 3.1. Модификация криопротективной среды

Модификация глубокого замораживания эпидидимального семени рода Сарга состояла в создании криопротективной среды, пригодной для эпидидимального и эякулированного семени.

Состав криопротективной среды приведён в табл. 1 .

Таблица 1

Состав модифицированной среды для эпидидимальных и эякулированных сперматозоидов

Ингредиенты Химическая формула Количество вещества

Лактоза С12Н22ОЦ.Н2О 2,17 г

Лимонная кислота СбН807.Н20 1,52 г

Трис C4H11N03 2,74 г

Глицерин СзНзОз 2,0 мл

ДМСО QHeSO 2,5 мл

Вода диионизированная Н20 100 мл

BSA 0,5 г

Желток куриного яйца 10,0 мл

pH среды 7,05

Результаты исследований модиифицированной среды показали, что она обеспечивает оптимальные условия сохранения биологической полноценности замороженно-оттаянного эпидидимального и эякулированного семени рода Сарга.

3.2. Хирургическое получение эпидидимального семени.

Для разработки высокоэффективной технологии криоконсервации эпидидимального семени животных. С этой цели проводили исследования по прижизненному получению эпидидимального семени методом категоризации. Оригинальность данного исследования заключалась в том, что от одного и того же самца одновременно получали как эякулированное, так и эпидидимальное семя. В настоящей работе в качестве объекта эксперимента были использованы козлы-производители.

За 10 дней до катетеризации семяпровода были получены и криоконсервированы образцы эякулированного семени. Показатели качества свежеполученных и замороженно-оттаянных эякулированных сперматозоидов контрольных образцов приведены в таблице 2.

Таблица 2

Характеристика семени подопытных козлов перед катетеризацией

Показатели Свежеполученные сперматозоиды Замороженно- оттаянные сперматозоиды

Объём, мл 2,1±0,2 0,25

Концентрация, 106кл/мл 2266±185.8 220 ±12,6

Подвижность, % 83,8±2,9 33,3±1,2

Целостность акросом, % 95,4±2,8 65,5±2,3

Морфологически нормальных клеток, % 94,2±1,3 76,4±3,5

Как видно из таблицы 2, в предоперационный период показатели качества семени было в норме.

3.3.1 Катетеризация семяпровода.

Для эксперимента были отобраны козлы зааненской породы. Операцию проводили под общей анестезией. На коже сбоку от перегородки мошонки с краниальной стороны ближе к хвосту придатка скальпелем делали продольный разрез, достаточный для свободных хирургических манипуляций с семенником и семяпроводом. Под кожным разрезом делали разрез париетальной и висцеральной влагалищной оболочки, обеспечивающий доступ к семяпроводу. Семяпровод и головку эпидидимиса извлекали из хирургической раны. В просвет канала семяпровода вводили катетер (наружный диаметр 0,9 мм).

Катетер закрепляли швом, наложенным вокруг семяпровода, разрез влагалищной оболочки - непрерывным швом. Катетер выводили наружу через прокол на передней поверхности мошонки на уровне дорсальной части семенника.

Эпидидимальное семя получали, спустя не менее 14 дней после операции. При эякуляции сперму с секретами добавочных половых желёз собирали в искусственную вагину, а эпидидимальное содержимое через катетер в стерильные пробирки Ерепс1огГ (рис. 2).

2

Рис. 2. Катетеризация семяпровода а) схема, б) общий вид

Эпидидимальные сперматозоиды, полученные из семяпровода (vas deferens), разбавляли одноступенчатым методом криопротективной средой, помещали в холодильную камеру при t = 4°С для эквилибрации, затем замораживали в 0,25 мл гранулах на фторопластовой пластине и помещали в сосуды Дьюара с жидким азотом для длительного хранения.

Таблица 3

Характеристика сперматозоидов козлов, полученных через фистулу семяпровода, до криоконсервации

Параметры Показатели

Концентрация до разбавления, 109/мл 6780±237,5

Подвижность свежевзятого семени , % 71,2±2,1

Целостность акросом, % 90±1,9

Морфологически нормальных клеток, %* 84,3±3,7

Концентрация в дозе, 106/мл 61,6±4,1

Из таблицы 3 видно, что после операции качество свежеполученных сперматозоидов соответствовало норме.

После комплексной оценки свежеполученных сперматозоидов нами было проведено их замораживание в разных криопротективных средах. Результаты этих исследований приведены в таблице 4.

Таблица 4

Характеристика сперматозоидов козлов, полученных через фистулу семяпровода, после криоконсервации

Показатели Модифицированная среда Контрольная среда

Подвижность после оттаивания, % 45,2±1,7 37,1±2,3

Целостность акросом после оттаивания, % 77,6±2,1 67,8±1,9

Морфологически нормальных клеток, %* 89,4±3,2 85,3±1,4

Проведенные исследования показали, что качество сперматозоидов, замороженных в модифицированной среде, по всем показателям было выше, чем в контроле.

На следующем этапе исследования нами проведена сравнительная оценка эякулированного и эпидидимального семени, одновременно полученного от одного того же животного (таблица 5).

Таблица 5

Сравнительная характеристика эпидидимальных и эякулированных сперматозоидов до и после криоконсервации

Показатели Эякулированные сперматозоиды с плазмой семени Эпидидимальные сперматозоиды

Концентрация до разбавления, 106/мл 1760,8±110,1 6780±237,5

Подвижность свежеполученных сперматозоидов, % 83,8±2,8 71,2±2,1

Целостность акросом свежеполуч енных сперматозоидов, % 90,5±1,2 90±1,9

Морфологически нормальных клеток, % 94±2,4 84,3±3,7

Концентрация после разбавления, 10б/мл 300±12,2 61,6±4,1

Подвижность после оттаивания, % 12,4±1,1 37,1 ±2,3

Целостность акросом после оттаивания, % 73,8±2,6 67,8±1,9

Морфологически нормальных клеток после оттаивания, % 81,7±3,2 85,3±1,4

Результаты опыта показали, что в в эякулированном семени подвижность сперматозоидов была в три раза ниже, чем в эпидидимальном. Причиной тому является коагуляция яичного желтка под действием фермента(ЕУСЕ), вырабатываемого куперовой железой. ЕУСЕ действует как катализатор, который гидролизует лецитин яичного желтка в жирные кислоты и лизолецитин. Это приводит к гидролизу мембран сперматозоидов, и, как следствие, обуславливает акросомную реакцию и деконденсацию хроматина, что является губительным для сперматозоидов

3.4. Отделения плазмы семени козлов.

Для преодоления вредного взаимодействия семенной плазмы с яичным желтком сперму козлов рекомендуют отмывать буферными разбавителями.

Нами разработана методика отделения плазмы семени козлов с помощью мембранной фильтрации. Образцы свежеполученного семени объёмом 1-2,5 мл помещали в шприц и под плавным давлением поршня пропускали через мембрану фильтра Сашео25А8 с диаметром пор 0,45 мкм, задерживающую прохождение сперматозоидов. Оставшиеся на мембране фильтра сперматозоиды отмывали криопротективной средой, присоединяя шприц с разбавителем к обратной стороне фильтрующей насадки.

Таблица 6

Влияние отделения плазмы семени на качество эякулированных сперматозоидов козлов

Показатели Эякулированные сперматозоиды с плазмой семени Эякулированные сперматозоиды без плазмы семени

Концентрация до разбавления, 106/мл 1760,8±110,1 1535±240

Подвижность свежеполученных сперматозоидов, % 83,8±2,8 82,3±2,5

Целостность акросом свежеполученных сперматозоидов, % 90±1,2 91 ±2,4

Морфологически нормальных клеток, % 94,2±2,4 84,7±3,1

Концентрация после разбавления, 106/мл 300±12,2 310±12,5

Подвижность после оттаивания, % 12,4±1,1 39,5±1,3

Целостность акросом после оттаивания, % 65,5±2,3 73,8±2,6

Морфологически нормальных клеток после оттаивания, % 81±3,2 89±2,9

Полученные в результате фильтрации сперматозоиды эквилибрировали и замораживали в гранулах на фторопластовой пластине, результаты исследования приведены в таблице 6.

Как уже было сказано выше, показатели качества замороженно-оттаянных эякулированных сперматозоидов могут значительно снижаться в результате негативного взаимодействия секреции куперовых желёз козлов в плазме семени с некоторыми компонентами криопротективных сред (в частности, с желтком куриного яйца). Разработанный нами метод отделения плазмы эякулированного семени с помощью фильтрации через мембрану фильтра Сашео25А8 (задерживающую прохождение сперматозоидов) позволил повысить количество подвижность замороженно-оттаянных сперматозоидов на 27,1%, сохранность акросом эякулированных сперматозоидов на 8,3%, а количество морфологически нормальных клеток - на 8%.

Результаты сравнительного анализа сперматозоидов, полученных разными методами приведены на рис. 3.

шэякулят Ш эякулят +BSA Ш эякулят+отд Ш эпид mэпид+BSA

Рис. 3. Сравнительная характеристика подвижности замороженно-оттаянных эякулированных и эпидидимальных сперматозоидов козлов

Результаты исследований показали, что наибольшей подвижностью характеризовались эпидидимальные сперматозоиды, криоконсервированные в среде с добавлением В SA, на втором месте - эякулированные сперматозоиды, замороженные после отделения плазмы. Минимальная подвижность отмечена после замораживания эякулята в контрольной среде.

3.5. Создание криобанка семени козлов-производителей

На основе разработанных биотехнологических методов с целью сохранение генетических ресурсов рода Сарга и дальнейшего рационального использования генофонда коз нами были проведены эксперименты по получению и криоконсервации семени от козлов-производителей зааненской, нубийской, оренбургской пород, а также гибридов сибирского козерога и зааненских коз первого и второго поколения. Проведенные исследования позволили создать уникальный криобанк семени, характеристика помещенного в банк глубоко замороженного семени приведена в таблице 7.

Таблица 7

Криобанк семени козлов-производителей

Порода Кол-во доз Подвижность Сохранность акросом Подвижность после оттаивания Сохранность акросом после оттаивания

Зааненская 412 84,1± 2,7 95,5± 3,4 40,0± 1,1 65,4± 3,3

Оренбургская 337 71,8± 1,7 81,2± 2,2 33,6± 1,3 49,7± 0,9

Нубийская 270 80,3± 2,2 87,8± 2,9 38,2± 2,4 62,4± 2,5

Гибрид Fj 554 89,7± 1,2 98,3± 1,9 51,9± 0,9 68,5± 2,5

Гибрид F2 315 80,1± 1,9 98,4± 1,5 45,8± 1,4 67,1± 1,3

Результаты оценки семени с применением компьютерных технологии (CASA), показали, что биологическая полноценность сперматозоидов козлов-производителей всех генотипов соответствовала норме. Наиболее высокие показатели отмечены у гибридов F] и F2 что обусловлено эффектом гетерозиса.

3.6. Искусственное осеменение коз замороженно-оттаянным семенем

Для искусственного осеменения использовали генетический материал из созданного нами криобанка Замороженно-отгаянное семя гибридов сибирского козерога и зааненских коз первого поколения вводили в шейку матки коз зааненской породы через катетер для искусственного осеменения с помощью влагалищного зеркала с подсветкой. Осеменение проводили двукратно с интервалом 12 часов. В контрольную группу входили чистопородные козы зааненской породы. При проведении настоящих исследований было осеменено 12 голов коз, из них 7 - зааненской породы и 5 голов гибридных коз первого поколения. Получено 14 козлят зааненской породы и 12 гибридов второго поколения.

Установлено, что гибридные животные второго поколения превосходят своих аналогов по высоте в холке на 12,5%, в крестце на 13,6%, косой длине туловища 24,8%, по обхвату груди и глубине 11,2% и 21,7% соответственно, что объясняется действием гетерозиса.

Проведенные нами исследования свидетельствуют о перспективности использования криобанка семени козлов-производителей для сохранения и рационального использования генофонда разных видов коз и служит основой для создания новых высокоэффективных селекционных форм. На рисунке 4 показаны гибриды зааненской козы с сибирским козерогом.

Рис. 4. Гибридные козы Р2

Фертильность гибридных козлов и самок является доказательством филогенетической близости домашней козы и сибирского козерога. Существует несколько видов диких коз, способных давать плодовитое потомство с домашними сородичами. Согласно современным взглядам на филогенез в роде Сарга, только два из них - безоаровый козел (С. и

винторогий козел (С. (а1сопеп) являются непосредственными предками домашней козы. Однако, по мнению Мишарева С.С. [Мишарев С.С., 1963], у домашних коз нельзя отрицать наличие крови западно-кавказского (С. зеуеЛгхм) и дагестанского (С. суНпсЫсогшз) туров, а также сибирского козерога (С. 5)Ь1пса).

3.6. Цитогенетика гибридного потомства

В кариотипе домашней козы содержится 30 пар хромосом, число аутосомных плеч- №а составляет 58. Все аутосомы и Х-хромосома акроцентрические, У-хромосома - мелкий метацентрик. В результате проведенных нами исследований было установлено, что кариотип всех исследованных коз соответствовал видовой норме. На рисунке 5 приведен кариотип козла зааненской породы.

11 1 1Ш ни II 4

II ни ми II

И (3 и и II И 1» 1*

II 19 И II О II «1 24

II »# н п *» 1.

25 19 X V

Рис. 5. Кариотип козла зааненской породы

Сравнительный анализ кариотипов гибридных животных и домашней козы свидетельствует об их высоком сходстве. Хромосомы гибридов не имели визуальных отличий от хромосом домашней козы. Кариотип гибридного самца первого поколения показан на рис.6.

ИIIIII! (III

II II II И У и

II и Н н и и

5« н « н » II

I» п М II ** I,

Рис. 6. Кариотип гибридного самца первого поколения.

Точная идентификация хромосом у исходных видов и их гибридов, за исключением У-хромосомы, возможна лишь с применением дифференциальной окраски. Хромосомный набор всех гибридных козлят содержал 29 пар акроцентрических аутосом, образующих по своей величине плавно убывающий ряд, и две половые хромосомы. Фенотипический пол соответствовал генетическому, определенному по половым хромосомам. Результаты проведенных исследований свидетельствуют об отсутствии морфологических различий в системе аутосом и половых хромосом у сравниваемых видов и их гибридов.

Выводы.

1. Разработан новый метод прижизненного получения эпидидимальных сперматозоидов с использованием фистулы семяпровода, позволяющий одновременно получать и оценивать качество эпидидимального и эякулированного семени одного и того же самца.

2. Установлено, что эпидидимальные сперматозоиды козла, полученные методом катетеризации семяпровода, имеют высокую биологическую полноценность до и после криоконсервации. Подвижность, целостность акросом и количество морфологически нормальных клеток после оттаивания составили 45%, 75% 85%, соответственно. У эякулированных сперматозоидов подвижность, целостность акросом и количество морфологически нормальных клеток после оттаивания составили 33,4%, 65,6%, 78% соответственно.

3. Разработанная модифицированная среда позволяет повысить криоустойчивость как эпидидимальных, так и эякулированных сперматозоидов, подвижность эпидидимальных и эякулированных сперматозоидов увеличилась на 8% и 21%, а сохранность акросом - на 8% и 5,6% соответственно.

4. Разработанный метод отделения плазмы эякулированного семени козлов с помощью фильтрации через фильтр Cameo25AS с диаметром пор 45нм, позволяет повысить подвижность сперматозоидов, сохранность акросом и количество морфологически нормальных клеток в замороженно-отгаянном семени на 27,1%, 8,3% и 8% соответственно.

5. Создан уникальный криобанк семени заанеской, нубийской, оренбургской пород коз и гибридов сибирского козерога с зааненской породой, позволяющий рационально использовать генофонд домашних и диких коз при создании новых селекционных форм.

6. Кариотипирование животных исходных видов и гибридов с использованием компьютерных программ показали что, разные представители рода Сарга характеризуются высоким сходством хромосомного набора. Цитогенетический анализ всех обследованных животных показал соответствие их видовой норме.

7. Гибриды второго поколения превосходят своих аналогов по высоте в холке на 12,5%, в крестце на 13,6%, косой длине туловища 24,8%, по обхвату и глубине груди на 11,2% и21,7% соответственно.

Практические предложения.

1.В качестве альтернативного постмортальному методу получения эпидидимального семени животных рекомендуем использовать прижизненное получение эпидидимального семени с использованием фистулы семяпровода

2. Для повышения эффективности криоконсервации сперматозоидов козлов рекомендуем использовать модифицированную среду, улучшающую биологическую полноценность сперматозоидов.

3. Предлагаем для отделения плазмы семени козлов при криоконсервации в разбавителях, содержащих желток куриного яйца, использовать метод мембранной фильтрации.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации В изданиях, рекомендованных ВАК РФ:

1. Багиров, В.А. Сохранение и рациональное использование генофонда животных. / Багиров В.А., Насибов Ш.Н., Кленовицкий П.М., Лесин С.А., Воеводин В.А., Зиновьева H.A., Эрнст JI.K., Калашников В.В. .Солошенко В.А. // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. — 2009. № 2. — С. 37-40.

2. Насибов, Ш.Н. Криосохранение и рациональное использование генетических ресурсов овец и коз / Насибов Ш.Н., Иолчиев Б.С., Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Воеводин В.А., Зиновьева H.A. // Достижения науки и техники АПК. — 2010, № 9. — С. 50-51.

3. Насибов, Ш.Н. Методы получения и криоконсервации семени для сохранения генетических ресурсов животных / Насибов Ш.Н., Воеводин

B.А., Багиров В.А., Иолчиев Б.С., Кленовицкий П.М., Амиршоев Ф.С., Лесин

C.А. // Вестник Казанского государственного аграрного университета. —

2010,Т. 18, №4,—С. 139-141.

4. Иолчиев, Б.С. Создание гибридов домашней козы и сибирского козерога с использованием криоконсервированного эпидидимального семени / Иолчиев Б.С., Кленовицкий П.М., Багиров В.А., Воеводин В.А., Кононов В .П., Насибов Ш.Н. II Проблемы биологии продуктивных животных.—

2011.№ 1,—С. 29-31.

5. Nasibov Sh. N. Animal Gene Pool Preservation and Conservation I Nasibov Sh. N., Klenovitskii P. M., Lesin S. A., Voevodin V. A., Zinov'eva, N. A., Ernst L. K-, Kalashnikov V. V., Soloshenko V. A. // Russian Agricultural Sciences.-2009, Vol. 35. N2. — pp. 112 — 115.

В других изданиях:

6. Кленовицкий П.М. Биологические особенности гибридов домашней козы и сибирского козерога / Кленовицкий П.М., Насибов Ш.Н., Воеводин В.А., Иолчиев Б.С., Гусев И.В., Зиновьева H.A.. // 5-я международная научная конференция-школа Современные достижения и проблемы генетики и биотехнологии сельскохозяйственных животных «Био ТехЖ-2009» Дубровицы. — 2009. — С 38-42.

7. Багиров В.А. Сравнительный анализ сперматозоидов разных видов животных / Багиров В.А., Насибов Ш.Н., Кленовицкий П.М., Лесин С.А., Воеводин В.А., Зиновьева H.A., Эрнст Л.К. // Материалы международной конференции «Проблемы увеличения производства продуктов животноводства в России и пути их решения». — Дубровицы. — 2008. — С.353-356.

Издательство ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии Тел. (8-4967)65-13-18

(84967) 65-15-97_

Сдано в набор 20.02.2012. Подписано в печать 21.02.2012

Заказ Ха 10. Печ. л. 1,0. Тираж 120 экз._

Отпечатано в типографии ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Воеводин, Владимир Александрович, Дубровицы

61 12-3/1288

ГНУ ВСЕРОССИЙСКИЙ НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ИНСТИТУТ ЖИВОТНОВОДСТВА РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ (ГНУ ВИЖ РОССЕЛЬХОЗАКАДЕМИИ)

ВОЕВОДИН Владимир Александрович

УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МЕТОДОВ ПОЛУЧЕНИЯ И СОХРАНЕНИЯ СЕМЕНИ ДОМАШНИХ КОЗ И ИХ ГИБРИДОВ С СИБИРСКИМ КОЗЕРОГОМ

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Специальность: Биотехнология - 03.01.06

Научный руководитель: доктор биологических наук, член-корреспондент РАСХН Багиров В. А.

Дубровицы - 2012 г.

СОДЕРЖАНИЕ

1. ВВЕДЕНИЕ 4 1.1. Актуальность темы 4 1.2 Цель и задачи исследований 5

1.3. Научная новизна 6

1.4. Практическая значимость 6

1.5. Положения, выносимые на защиту 6 1.6 Апробация работы 7

1.7. Публикации результатов исследований 7

1.8. Структура и объем диссертации 7

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

2.1. Значение козоводства в мировом сельском хозяйстве 8

2.2. Систематика рода Сарга и роль гибридизации в козоводстве 9

2.3. Особенности репродукции коз 15

2.4. Получение и криоконсервации эякулированного семени козлов 17

2.5. Получение эпидидимального семени козлов 27

2.6. Методы полученйя эпидидимального семени 33

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 38

3.1. Получение эякулированного семени 38

3.2. Определение количественных и качественных показателей сперматозоидов 41

3.2.1. Определение подвижности сперматозоидов 41

3.2.2. Определение концентрации сперматозоидов в камере Маклера 41

3.2.3. Морфологическая целостность акросом 42

3.2.4. Оценка переживаемости сперматозоидов 44

3.3. Методика разбавления и криоконсервации сперматозоидов 44

3.4. Методика искусственного осеменения коз 45

3.5. Методика цитогенетического исследования 48

4. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ 51

4.1. Модификация криопротективных сред 51

4.2. Создание криобанка семени козлов производителей 53

4.3. Хирургическое получение эпидидимального семени 54

4.3.1 Катетеризация семяпровода 55

4.4. Отделение плазмы семени козлов 62

4.5. Сравнительная оценка различных методов получения и замораживания семени представителей рода Сарга 65

4.6. Результаты искусственного осеменения коз замороженно-оттаянными сперматозоидами и характеристика потомства 70

4.7. Цитогенетика гибридного потомства 76

5. ВЫВОДЫ 85

6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ 87

7. Список основных работ, опубликованных по теме диссертации 88

8. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 90

ВВЕДЕНИЕ

1.1. Актуальность темы.

Создание новых высокоэффективных форм сельскохозяйственных животных с использованием высокой адаптационной способности дикой фауны является одной из важнейших задач сельскохозяйственной науки. В решении теоретических и прикладных вопросов конструирования новых селекционных форм животных главную роль играют исследования, которые включают комплекс мероприятий, связанных с сохранением и рациональным использованием генофонда [Багиров В.А. и др., 2009; Захаров-Гезехус И.А. и др., 2007; Насибов Ш.Н. и др., 2010].

По данным ФАО, за последние десять лет общая численность коз выросла с 730 млн. до 868 млн. голов, их разводят во всех зонах проживания человека, что обусловлено высокой приспособленностью данного вида животных к различным условиям обитания и высокой резистентностью [Багиров В.А. и др., 2009]. В связи, с чем наблюдается всевозрастающий интерес к проблемам генетики рода Сарга.

Во второй половине XX века, в связи с открытием и разработкой методов глубокого замораживания гамет, стало возможным создание криобанков репродуктивных клеток животных. Длительное время работа в основном проводилась с эякулированным семенем. Однако эпидидимальное семя также является важным, а зачастую и единственным источником для криоконсервации генетического материала диких животных. Так как сперматозоиды могут длительное время сохраняться в хвосте придатка в неактивном состоянии, влияние продолжительности их пребывания в последнем на оплодотворяющую способность и другие биологические свойства представляют интерес для более подробного изучения.

Актуальной задачей является разработка новых методов получения эпидидимального семени, криопротективных сред, способствующих сохранению биологической полноценности эпидидимальных

сперматозоидов при криоконсервации.

Контролируемое воспроизводство редких и исчезающих видов животных возможно благодаря использованию замороженного эпидидимального семени [Pukazhenthi В. et al., 1999]; сперма может быть получена от самцов в их естественной среде обитания и заморожена для последующего осеменения самок, содержащихся в неволе [Bailey Е. et al., 2003].

1.2. Цель и задачи исследований.

Целью диссертационной работы является разработка биотехнологических методов получения, криоконсервации семени и сравнительная характеристика эпидидимальных и эякулированных сперматозоидов животных.

Для достижения цели были поставлены и решены следующие задачи:

-разработать новый метод ■ прижизненного получения эпидидимального семени с помощью фистулы семяпровода;

-провести сравнительную оценку и изучение биологической полноценности, морфологических показателей свежеполученных, охлажденных и замороженно-оттаянных эякулированных и эпидидимальных сперматозоидов;

-изучить оплодотворяющую способность сперматозоидов и результаты осеменения животных эпидидимальным и эякулированным семенем;

-разработать метод криоконсервации семени самцов рода Сарга;

-создать криобанк семени чистопородных и гибридных козлов-производителей;

-получить от осеменения замороженно-оттаянным эпидидимальным семенем гибридов сибирского козерога и зааненской козы разных генераций;

-изучить биологические характеристики гибридных самцов и самок;

1.3. Научная новизна.

Разработан новый метод прижизненного получения эпидидимального семени с помощью фистулы семяпровода. Впервые в сравнительном аспекте изучены биологические свойства эякулированного и прижизненно полученного эпидидимального семени от одного и того же животного. Дана сравнительная цитогенетическая характеристика видов рода Сарга и их гибридов. Установлено, что гибридные животные обладают нормальными репродуктивными качествами. Впервые получены гибриды второго поколения сибирского козерога и зааненских коз.

1.4. Практическая значимость.

Разработаны новые методы получения и криоконсервации эпидидимального и эякулированного семени самцов рода Сарга. Создан криобанк семени гибридов сибирского козерога первого поколения и козлов-производителей зааненской и нубийской и оренбургской пород коз. Получены гибриды первогои второго поколения сибирского козерога и зааненской породы коз, с целью создания новых высокоэффективных селекционных форм животных.

1.5. Положения, выносимые на защиту:

-новые методы получения и криоконсервации эпидидимального и эякулированного семени животных, позволяющие получить высокую биологическую полноценность и оплодотворяющую способность;

- криоколлекция эпидидимального и эякулированного семени гибридов сибирского козерога первого поколения и козлов-производителей зааненской, нубийской и оренбургской пород;

-сравнительная цитогенетическая характеристика разных видов рода Сарга и гибридного потомства с применением прикладных компьютерных программ;

-получение гибридных животных второго поколения для создания новых высокоэффективных селекционных форм коз.

1.6. Апробация работы.

Материалы диссертационной работы доложены и обсуждены на заседаниях ученого совета ГНУ ВНИИ животноводства Россельхозакадемии (2008-2011гг.), на научных конференциях (Санкт-Петербург 2009, Дубровицы 2009, Москва 2010, Кострома 2011,).

1.7. Публикации результатов исследований.

Опубликовано 11 научных работ в том числе, по теме диссертационной работы 7 из них 5 в журналах, рекомендуемых ВАК Российской Федерации.

1.8. Структура и объем диссертации.

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследований, результатов собственных исследований, выводов, практических предложений, списка основных работ, опубликованных по теме исследований, списка использованной литературы. Материал изложен на 110 страницах компьютерного текста, содержит 8 таблиц и 21 рисунок. Список литературы включает 184 источника, в т.ч. 170 - на иностранных языках.

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 2.1. Значение козоводства в мировом сельском хозяйстве.

Козоводство в последние годы динамично развивается во всем мире. По данным ФАО численность коз в мире с 2000 до 2010 года выросла с 730 млн. до 921 млн. голов (рис. 1). В России в последние годы так же наметился рост поголовья коз.

860 т 840 820 + 800 780 760 740 720 700 680 660

/

\

\

V

-+-

2.4 ^

2,35 2,3 2,25 2,2 2,15 2,1 2,05

2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 2007

годы

■•А 'В мире " в россии

Рис. 1 Динамика численности коз в России и в мире с 2000 по 2009 гг. (по данным ФАО).

В настоящее время в мире насчитывается до 500 различных пород коз, по разным данным количество пород коз в мире колеблется от 236 до 500 [Багиров В.А. и др., 2009]. Более 53% коз в мире относится к молочным и комбинированным молочно-мясным породам (рис. 2).

Породы

8,9

у

о с '/

18,6

0,3

■■ / /

и Шерстные

■ Молочные

■ Мясные в Пуховое «Мясо-шерстное в Шер стно-мясные

Мясо-шерсшо-молочное Молочно-мясное Парковое в Мясо-кожевьючное Шкуровое

Рис. 2 Доля коз разного направления продуктивности в мире.

На разных континентах структура распределения пород в зависимости от направления продуктивности существенно отличается. В Европе преобладают молочные породы коз - 66,4% и молочно-мясные - 15,9%. В Азии комбинированные породы составляют более 50% от всего поголовья разводимых коз. В Африканских странах разводят преимущественно мясные породы коз.

Козье молоко является ценным продуктом питания человека. Несмотря на то, что у нас в стране большой спрос на козье молоко, молочное козоводство находится в стадии формирования. В России имеется всего несколько крупных козоводческих хозяйств.

2.2. Систематика рода Сарга и роль гибридизации в козоводстве.

Предком домашних коз большинство исследователей считают саблерогого (безоарового) козла. Свое название безоары получили за инородные тела (минерализованные отложения остатков пищи), которые иногда находят в их желудках или кишечнике. Поскольку таким образованиям приписывались лечебные свойства, за этими животными активно охотились. Безоаров также называют бородатыми из-за густой и

длинной бороды. Ареал безоаровых коз охватывает горные районы Центральной Азии (Афганистан, Туркменистан, Иран), Кавказа, Закавказья, а также Малой Азии вплоть до греческих островов. Сейчас они сохранились только в неприступных районах и внесены в Международую Красную книгу как вид, которому угрожает вымирание.

Безоаровый горный козел по сравнению с другими представителями рода имеет небольшие размеры: длина тела — 120-160 см, высота — 70-100 см, масса — 35-40 кг (редко до 60 кг). Самки меньше самцов. У самцов средняя длина рогов 90-100 см, окружность у основания — 23-25 см, они имеют черную окраску, изогнутую саблеобразную форму, очень сильно сжаты с боков, на переднем узком ребре находятся редкие бугры. В отличие от самцов у самок рога короткие, без бугров на переднем ребре. Шерсть на спине и боках животных летом рыжевато-бурая, зимой — серовато-бурая, вдоль спины тянется черно-бурый ремень, на шее — такая же темная полоса, нижняя часть тела белая. Продолжительность жизни составляет 10-15 лет.

По данным литературы, еще одним из вероятных предков домашней козы можно считать мархура, или винторогого козла, обитающего в горах Пакистана, Афганистана, Северо-Западной Индии, Таджикистана и Киргизии. Название «мархур» происходит от персидского «мар» (змея) и «хур» (пожирающий). У винторогого козла рога плоские, направленные вверх и несколько назад. Каждый рог закручен штопорообразно (левый — вправо, правый — влево). Длина рогов у взрослых самцов может превышать 1,5 м, у самок рога короче. Длина тела мархура составляет 150-170 см, высота в холке у самцов — 85-100 см, живая масса — 80-120 кг. Голова тяжелая, слегка горбоносая. У самцов на нижней стороне шеи и груди длинная густая борода и подвес из беловатых волос. Как и безоаровый, винторогий козел занесен в Международную Красную книгу. Так как при обсуждении вопроса о происхождение домашних коз одним из признаков служат строение и форма рогов, лишь ряд исследователей называют мархура предком домашних коз, поскольку у них рога такого типа, который

представлен у мархура, встречаются крайне редко. По некоторым источникам, третьим предполагаемым предком домашних коз была так называемая первобытная коза приска — дикая европейская коза с рогами, которые по форме очень похожи на рога домашних коз. Этот вид вымерший. По мнению С.Н. Боголюбского [Боголюбский С.Н., 1959], имелось три центра одомашнивания коз: первый — в Передней и Средней Азии (безоары), второй — восточнее первого (мархуры) и третий — в Юго-Восточной Европе (первобытные козы). Однако есть мнение, что приска — не самостоятельный вымерший вид, а уже одомашненная форма безоаровой козы. Возможно, в формирование домашних коз участвовали и другие виды диких коз — сибирский козерог, кавказский тур, альпийский горный козел.

Вопрос о происхождении домашних коз окончательно не решен. Основными доводами при его обсуждении служили результаты изучения особенностей строения черепа, строение и форма рогов, а также возможность получения плодовитого потомства при скрещивании. На наш взгляд, наиболее убедительный аргумент — получение фертильных потомков при спаривании диких и домашних видов и результаты молекулярных исследований генома [Багиров В.А. и др., 2009].

Каменный козел является объектом спортивной охоты, отстрел

производится по лицензиям.

Сибирский горный козёл (Capra sibirica Pallas, 1776) - типичное горное животное, имеет обширный ареал, простирающийся от восточной части Восточного Саяна на Запад до Памира и Гималаев. Он занимает горы Тувы, Монголии, Алтая, горные массивы Средней Азии, Афганистана, Северного Пакистана и Индии. Среди представителей рода Сарга - самый многочисленный вид.

Сибирский козерог - самый крупный представитель рода козлов на невысоких и крепких ногах с длиной тела 140-165 см, высотой в холке 80-110 см, весом 100-130кг

Зимой окраска меха желтовато-белая с буроватым оттенком, вдоль спины тянется широкая коричневато-бурая полоса, борода и хвост черно-бурые. Борода у самцов длинная и занимает всю нижнюю часть головы, кроме подбородка. Летом окраска меха более темных тонов.

Среди горных козлов сибирский козел отличается и самыми большими рогами - до 147 см. Рога имеют серповидный загиб разной крутизны. На большей части длины они отчетливой трехгранной формы. Передняя грань, плоская и широкая, образует с двумя боковыми (наружной и внутренней) хорошо выраженные ребра. Поперечное сечение рога треугольной формы. Основанием треугольника служит передняя грань, а его вершина направлена назад и несколько закруглена. На передней грани расположены высокие бугры в форме поперечных валиков, которые доходят почти до конца рогов. Степень развития валиков подвержена широкой индивидуальной изменчивости. Каменные козлы - животные стадные, летом стада насчитывают до 40-50 голов, после окончания гона - до 100-150 голов.

Самцы собирают гаремы из 5-15 самок. Продолжительность беременности 170-180 дней. В мае - июне самки приносят по одному-два козленка. Козлята могут следовать за матерью в первые дни и обычно держатся около нее до рождения новых козлят.

Половозрелые самки приносят потомство в двух-трех-летнем возрасте. Продолжительность жизни 15-17 лет.

Обитая в скальных биотопах, горный козёл имеет островной характер распространения; присутствие его в том или ином месте зависит от наличия скальных массивов и не связано с высотой над уровнем моря. В целом диапазон его вертикального распространения находится в пределах от 500 до 5000 м над уровнем моря и выше.

Местообитания горного козла в меньшей степени затронуты хозяйственной деятельностью человека, он менее интенсивно конкурирует с домашними животными, поэтому его ареал, за редким исключением, сократился незначительно. Изменение его численности больше зависит от

климатических и других условий, особенно в северо-восточной части ареала, где он в отдельные годы страдает от многоснежья. Заметно уменьшается поголовье козла после эпизоотий саркоптоза, которые охватывают некоторые популяции в отдельные годы, особенно после неблагоприятных по климатическим условиям лет.

В связи с обитанием в хорошо защищенных биотопах он в меньшей степени страдает от хищников. Использование его как охотничьего объекта также связано с большими трудностями, в связи с чем численность во многих местах ещё значительна. Как охотничий объект горный козёл в основном использовался лишь местным населением, приспособленным к горным условиям и трудной охоте на него. В целом в прошлые годы всегда козла добывали в небольшом количестве. Местно