Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Цитогенетическая характеристика вирусопродуцирующих В- и Т-лимфоидных клеточных линий приматов

ВАК РФ 03.00.25, Гистология, цитология, клеточная биология

Автореферат диссертации по теме "Цитогенетическая характеристика вирусопродуцирующих В- и Т-лимфоидных клеточных линий приматов"

%

ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

ОД

На правах рукописи УДК 576. 316. 2: 578. 247

АРАВИАШВИЛИ Дареджан Эстатовяа

ОНТОГЕНЕТИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ВИРУСПРОДУЦИРУЩИХ В- И Т-ЛИМЗОИДНЫХ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ ПРИМАТОВ

03. 00. 25. - клеточная биология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург - 1995

Работа выполнена в лаборатории вирусологии опухоле] Института экспериментальной патологии и терапии, Сухуми^ в лаборатории иммунологии и онковирусологии Институт; медицинской приматологии РАМН и лаборатории морфологи] клетки Института цитологии РАЕ

Научные руководители: кандидат биологических наук С. Е. Мамаева доктор медицинских наук КЗ. Агрба

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

К С. Баранов

кандидат биологических наук Т. М. Гринчук

Ведущее учреждение: Научно-исследовательский институт онкологии им. проф. Е Е Петрова МЗ РФ.

Защита состоится

в часов на заседании Диссертационного совета Д. 002. 73. 01 при Институте цитологии РАН по адресу: 194054, Санкт-Петербург, Тихорецкий пр. , 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии РАЕ

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор биологических наук Л. Е Писарева

(с) - Институт цитологии РАН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Исследование этиологии лейкозов « лкмфом у человека, диагностика и лечение этих заболеваний актуальней яроблемои современного здравоохранения. £ • •тем аспекте, лимфеидные клеточные линии находят шрокое применение для решения теоретических и практических вопросов онкологии, вирусологии. гематологии, иммунологии и питогенетики. Культуры лимфоидных клеток служат молельными системами для изучения роли генетических факторов и хромосомных нарушений в возникновении, развитии и злокачественной прогрессии гемобластозов.

В Сухумском институте экспериментальной патологии и терапии на новой модели вирусиндуцированного гемобластоза у обезьян проводились многолетние исследования, направленные на изучение предполагаемой вирусной природы гемобластозов человека и обезьян, а также роли и специфики структурных хромосомных перестроек в происхождении и патогенезе вирус-индуцированных лейкозов и лимфом. От обезьян Сухумского стада больных лимфомой и от клинически здоровых серопозитивных жвотных, была выведена серия постоянных лимфоидных линий и создана уникальная коллекция В- и Т-лимфоидных клеточных культур павиана гамадрила и макаки бурого, продуцирующих лимфотропные герпесвирусы и ретровирус типа С. Для выяснения связи E3V-вируса с онкогематологической патологией региона Черноморского побережья, были получены также вируспродуциру-ющие В-лимфоидные клеточные культуры человека. К началу наших исследований эта коллекция клеточных линий практически не была изучена онтогенетически, не произведена детальная карио-типическая характеристика линий с целью использования их в качестве модельной системы для исследования гемобластозов.

В доступной нам литературе имеется большое число работ, посвященных цитогенетическим характеристикам продуцирующих EBV лимфоидных клеточных линий человека. В то же время сообщения о цитогенетических исследованиях клеточных линий обезьян, особенно продуцирующих онкогенные вирусы, крайне ограни-

чены. В связи с этим представляется актуальным сравнительное изучение цитогенетических особенностей постоянных лимфоидных клеточных линий приматов различного видового и тканевого происхождения, имеющих опухолевый и/или неопухолевый фенотипы.

Кроме того, клеточные линии в процессе длительного культивирования in vitro могут изменять или терять свои характеристики, что обусловливает необходимость детального изучения кариотипических особенностей клеточной популяции лимфоидных культур обезьян на разных этапах их становления и длительного культивирования для выявления взаимосвязи кариотипических характеристик линий с их фенотипическими, иммунологическими и другими характеристиками.

В настоящее время с помощью хромосомного картирования установлена полная гомология по генетическому материалу между хромосомами человека и макаки, также имеется достаточное количество данных по клеточным генам, локализованным в районах хромосом человека, вовлеченных в неслучайные хромосомные преобразования в лимфоидных клеточных линиях. Глубокое сравнительное цитогенетическое исследование большой выборки постоянных лимфоидных клеточных линий человека и обезьян различного происхождения при их длительном культивировании in vitro с привлечением для анализа молекулярных данных позволит выявить общие для них кариотипические особенности и тем самым представляет теоретический и практический интерес.

Цели и задачи исследования.

Целью наших исследований являлось сравнительное изучение цитогенетических особенностей вируспродуцирующих В- и Т-лимфоидных линий обезьян и человека, а также характера хромосомной изменчивости этих линий в условиях длительного культивирования in vitro.

Для достижения указанной цели последовательно решались следующие задачи:

1. Усовершенствование метода культивирования лимфоцитов периферической крови обезьян, с целью повышения митотической активности клеток, используемых для приготовления "банка"

образцов нормальных хромосом павиана гамадрила и макаки

бурого.

2. Сравнительный цитсгенетический анализ вируспродуцирующих В- и Т-лимфоидных линий павиана гамадрила, макаки бурого и человека с помощью G-, С- и Ag- методов дифференциального окрашивания хромосом и различных приемов кариотипирования.

3. Выявление характерных количественных и структурных хромосомных изменений в лимфоидных линиях обезьян и человека.

4. Проведение дифференцирования лимфоидных клеточных линий приматов на линии опухолевого и неопухолевого происхождения с помощью цитогенетического критерия.

5. Сравнительно0 изучение особенностей карлотилической изменчивости вируспродуцирующих В- и Т-лимфоидных линий клеток обезьян и человека в процессе их становления и длительного культивирования.

Научная новизна работы.

Впервые проведен детальный анализ кариотипов вируспроду-цирующих В- и Т-лимфоидных - СПГ-5, СПГ-б, ЛУГ-4, El-1, Е9-1, Е5-1, ЕПЛ-11, СПГ-7( Т), СПГ-8(Т), ЛУПГ-5(Т) клеточных линий

павиана гамадрила. В-лимфоидных - МАЛ-1. МБ-20 клеточных линий макаки бурого и В-лимфоидных - ЧСЛ-1, 2, 3, 4. 5, 8. 9 клеточных линий человека с использованием методов дифференциального окрашивания и различных приемов кариотипирования.

В результате сравнительного изучения 19-ти линий впервые показано сходство характера численных и структурных преобразований хромосом в лимфоидных линиях обезьян и человека при длительном культивировании их in vitro. Установлено, что в лимфоидных линиях обезьян структурные преобразования предпочтительно претерпевают хромосомы, гомологичные хромосомам, вовлекаемым в специфические и характерные структурные перестройки в лимфоидных линиях человека

Выявлены особенности кариотипической изменчивости клеток лимфоидных линий приматов неопухолевого и опухолевого происхождения е процессе их длительного культивирования.

Практическая значимость исследований. Полученные карио-

типические характеристики В- и Т-лимфоидных клеточных линий обезьян и человека являются надежным параметром для идентификации линий и послужили основой для паспортизации Сухумской коллекции В- и Т-лимфоидных культур клеток приматов.

Установленное сходство кариотипических характеристик исследованных линий клеток обезьян и человека дает возможность эффективного использования лимфоидных линий обезьян в качестве адекватной человеку биологической модели (тест-культур) для разработки лечебно-профилактических и диагностических препаратов.

Лимфоидные суспензионные линии клеток обезьян - ЕПЛ-11 и МБ-20 паспортизованы и депонированы во Всероссийскую коллекцию клеточных культур; им присвоены номера: ВСЩП) - 292Д и ВСЩП) - 152Д. Клеточная линия ЕПЛ-11 (штамм) защищена авторским свидетельством N 1640159, заявка N 4696707/13, приоритет изобретения 14 апреля 1989.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на Всесоюзной конференции "Биология клетки в культуре" (Ленинград, 1987, 1992), на Всесоюзной конференции "Вопросы медицинской приматологии. Наиболее перспективное использование обезьян в медицине и биологии" (Сухуми, 1987), на 2 Всесоюзной конференции "Геном человека-91", (Переславль-Залесский, 1991), на XV конгрессе Международного приматологического общества (Джакарта, Индонезия, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 работ.

Объем работа Диссертация изложена на страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов и списка литературы содержащего ¿у? публикаций. Материалы диссертации иллюстрированы ¿¿' рисунками и /з" таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Получение культур лимфоцитов крови обезьян с еысокой митотической активностью проводили с помошью стандартного лсдумикрсметода (Захаров и др., 1982), г модификации автора. 2 качестве митогенов использовали фитогемаггляпшин (FHA, Difco М), конканавалин А (СопА) и 12-0-тетрадеканоилфорбол-1.?-ацетат (ТРА) в количестве 15-20 мкг каздсго из них на 1 мл ростовой среды RPMI-1640, содержащей 15% скворотга з:.йрисна коров. Клетки периферической крови обезьян культивировали ь течение 72 и 96 часов при 37°С.

ц няо'рпашдй riqísl-wcl litttj гт^ттт, р ороиы nni/t tttíw-ív^ltttltrv

< Н ¡р- Р. /уг._ и 21-1 ^f-" 4 Г.-ГТ7Т Л А 7 rf -"-jj Tin ir

фоидных [СПГ-7( T), СПГ-8(Т), ЛУПГ-5(Т)] линий павиана гамадрила; две В-лимфоидных линии макаки бурого ГМАЛ-1, KÍB-20J и семь В-лимфоидных линий человека [ЧСЛ-1, 2, 3, 4, 5, 8, 9]. Все линии получены из Сухумской коллекции клеточных культур.

В- и Т-лимфоидные линии павиана гамадрила были получены из гемопоетических тканей животных, больных гемобластозами. Линии СПГ-5. СПГ-6, ЛУГ-4 выведены путем спонтанной трансформации лимфоцитов в процессе культивирования. Культуры клеток Ei-1, £9-1 и Е5-1 установлены субклонированием линии ЛУГ-4. Линия ВИЛ-11 получена путем трансформации лимфоцитов кроеи клинически здорового серонегативного павиана вирусом ГВП. В-лимфоидные линии макаки бурого МАЛ-1 и МБ-20 получены из лимфоцитов клинически здоровых серопозитивных животных путем стимуляции митсгеном ФГА. Т-лимфоидные линии павиана гамадрила СПГ-7(Т), СПГ-8(Т), ЛУПГ-5(Т) были получены от павианов с Т-клеточными лимфомами при культивировании лимфоцитов в присутствии человеческого рекомбинантного интерлейкина-2.

В-лимфоидные линии человека были выведены способом спонтанной трансформации лимфоцитов в процессе культивирования. Линии ЧСЛ-1, ЧСЛ-8 и ЧСЛ-9 получены от пациентов с диагнозом лимфогранулематоз, линии ЧСЛ-2, ЧСЛ-4 и ЧСЛ-5 - ст пациентов с острым миелэбластным лейкозом, линия ЧСЛ-3 - от больного раком легкого, при лейкемической реакции.

В-клеточные линии павиана гамадрила содержали В-лимфо-тропный герпес вирус павиана (ГВП), а В-клеточные линии макаки бурого - герпес вирус макаки бурого (ГВМА). Все В- и Т-клеточные линии обезьян являлись продуцентами ретровируса типа С - STLV-1. В-клеточные линии человека содержали вирус Епстайна-Барра (EBV).

Клеточные линии культивировали в среде RPMI-1640, содержащей 15% сыворотки эмбрионов коров, L-глютамин (ЗООмг/мл) и антибиотики. В ростовую среду Т-клеточных линий дополнительно добавляли HEPES, 0,005 М 2-меркаптоэтанола, человеческий ре-комбинантный интерлейкин-2 в конечной концентрации 100 ед/ш (Агрба, 1988).

Препараты метафазных хромосом готовили по общепринятой методике (Мамаева, 1988). Гипотоническую обработку проводили смесью 0,56% раствора хлористого калия и 1Z раствора цитрата натрия (1:1). Фиксацию хромосом осуществляли в 3-х сменах смеси метанол - ледяная уксусная кислота (3:1). Окрашивание хромосом проводили несколькими способами. Для рутинного окрашивания хромосом использовали 1Z раствор красителя Гимза (Merk) на фосфатном буфере (pH - 6,8). Дифференциальное окрашивание хромосом на G-диски выполняли по методу, описанному Мамаевой с соавторами (Демин, Мамаева, 1993). Окрашивание хромосом на С-диски осуществляли по методу Самнера (Sumner, 1972), в модификации Леликовой и Цветковой (Леликова, Дветко-ва, 1976). Активные ядрышковые организаторы хромосом выявляли по методу Гудпасча и Блума (Goodpasture, Bloom, 1975).

Для определения модального класса хромосом и интервала изменчивости числа хромосом анализировали 100 рутиннс окрашенных метафазных пластинок, которые имели цитоплазму. Долю полиплоидных клеток подсчитывали в 1000 метафазных пластинок. Полный кариотипический анализ линий, идентификацик маркерных хромосом проводили согласно методу, разработанному Мамаевой (Мамаева, 1984, 1988, 1995).

"Банк" образцов нормальных хромосом обезьян и человека приготавливали из 18 фотоотпечатков G-окрашенных хромосом

разной степени конденсации, полученных из культур лимфоцитов

крови здоровых доноров. Хромосомы обезьян идентифицировали согласно номенклатуре, предложенной Дутриле с соавторами

. Dutr:iiaux et а!.. 1984.!. а хромосомы человека - согласно Международной номенклатуре для хромосом человека iiSCN,1985).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для усовершенствования метода культивирования лимфоцитов периферической крови низших обезьян с целью повышения митоти-ческсй активности клеток было апробировано культизирозанк& клеток крови с использованием различных митогенов и их комби-хацлй. ^¡итстическал активность ¡теток крсьи, стимулииованных РИА, была невысокой (0,38%). Митоген СопА увеличивал количество митотических клеток в культуре до 1,5%. Наиболее эффективным оказалось культивирование клеток в присутствии одновременно двух митогенов СопА и ТРА (1,9%). Однако, морфологическая структура хромосом в таких культурах клеток ухудшалась. Наилучшая для цитогенетического анализа морфология метафазных хромосом отмечалась при культивировании клеток крови с митогеном СопА. Независимо от вида митогена, митоти-ческая активность клеток возрастала на 0,1-0,3% при увеличении длительности культивирования клеток с 72 до 96 часов.

Сравнительный кариотипический анализ и Т-лимфоидных линий обезьян и человека на разных этапах их становления и длительного культивирования нч vitro. Выло проведено детальное кариологическое изучение 19 клеточных линий приматов из Сухумской коллекции клеточных культур.

Количественная оценка хромосом лимфоидных линий приматов включала определение модального класса хромосом, его процентного содержания, интервала изменчивости по числу хромосом и уровня полиплоидии. Клеточные линии исследовались на разных пассажах. Результаты, представленные в табл. 1, 2, 3, 4, свидетельствуют о сохранении во всех линиях модального класса в пределах диплоидного набора хромосом ; 2п=42 у обезьян и 2п=46 у человека:, за исключением одной клеточной линии макаки бу-

poro МБ-20, где модальное число хромосом было гилердиплоидным I2г>45). Интервал изменчивости числа хромосом ограничивался 2-7 хромосомами. Содержание полиплоидных клеток, как правило тетраплоидов, варьировало в разных популяциях от 2,5% до 32%, а клеточные линии - ЧСЛ-1 человека и ЛУГ-4 павиана гамадрила полностью полиплоидизировались к 132 и 128 пассажу, соответственно. Эти результаты совпадают с данными других авторов, которые показали, что для клеточных линий характерна небольшая гетерогенность по числу хромосом, а возрастающий уровень полиплоидии клеток свидетельствует о том, что процесс становления линий продолжается до 100-150 пассажей (Chen et al., 1983; Мамаева, 1984, 1995).

Анализ дифференциально окрашенных кариотипов В-лимфоид-ных линий человека. Результаты представлены в табл. 1. Линии клеток ЧСЛ-2, 3, 5, 8, 9, исследованные на ранних пассажах (б-Збй) имели нормальный кариотип, 2п=4б. Изначально нормальная диплоидная линия ЧСЛ-1 в процессе длительного культивирования полиплоидизировалась до тетраплоидного уровня путем простого удвоения диплоидного кариотипа. Клеточная линия ЧСЛ-4 - единственная линия, которая через несколько недель культивирования содержала 2 типа клонов: доминирующий - с нормальным кариотипом (80%) и патологический - с псевдодиплоидным кариотипом с 2 маркерными хромосомами (20%), который в процессе культивирования линии вытеснил полностью нормальный клон клеток.

В установившемся при длительном культивировании аномальном кариотипе линии ЧСЛ-4, во вторичные структурные перестройки были вовлечены хромосомы 2 и 12. Структурные изменения этих хромосом носят неслучайный характер. В делегированной хромосоме 2 разрыв произошел по локусу р12, сайту локализации генов легких цепей иммуноглобулинов. Это является специфическим событием при В-клеточных неоплазиях (Nilsson, 1979). При транслокации хромосомы 12 точка разрыва затрагивала локус р13 - сайт локализации онкогена c-ki-ras (HGV 11, 1991). Экспрессия этого онкогена в результате данных

хромосомных нарушений может характеризовать особенности злокачественной трансформации клеток ЧСЛ-4.

Известно, что лимфоидные линии, установленные из неопу-хслевых клеток опухолевого материала обычно имеют стабильный нормальный кариотип на ранних этапах культивирования, а свойство клеточной гетерогенности приобретается ими в процессе культивирования (Shade et al. , 1980; Steel et al. , 1980). В то же время, в кариотипах клеточных линий, выведенных из опухолевых клеток, выявляются те же специфические структурные изменения хромосом, которые были характерны для исходной популяции in vivo (Nilsson, 1979).

Поскольку исследованные нами клеточные линии человека, полученные от пациентов с'различными формами гемобластозов, на ранних пассажах культивирования имели только нормальный, или доминирующий нормальный кариотип, то можно сделать заключение о неопухолевом происхождении этих линий.

В настоящее время показана полная идентичность рисунков дифференциального окрашивания хромосом родов Papio и Macaca (Stanyon, 1988). В то же время Винбергом с соавторами (Wienberg et al. , 1992) с помощью метода CISS гибридизации была установлена точная гомология по генетическому материалу между всеми хромосомами человека и макаки. Эти данные послужили основанием при сравнительном хромосомном анализе лимфоидных линий обезьян и человека.

Анализ дифференциально окрашенных кариотипов В- и Т-лимфоидных линий павиана гамадрила. Результаты представлены в табл. 2 и 3. Исследованные нами В- и Т-лимфоидные линии обезьян были получены разными способами. Из клеток гемопоети-ческой ткани павианов гамадрилов, больных гемобластозом, установлены В-лимфоидные линии клеток СПГ-5. СПГ-6 и ЛУГ-4; Т-лимфоидные линии СПГ-7(Т), СПГ-8(Т) и ЛУПГ-5(Т) получены от павианов с Т-клеточными лимфомами. Цитогенетический анализ этих линий установил, что линии СПГ-5, СПГ-6, СПГ-7(Т) и ЛУПГ-о(Т) на ранних этапах культивирования имели клетки только с нормальным кариогипом, а в линии СПГ-В(Т) клетки с

Таблица 1. Характеристика кариотипов В-лимфоидных линий человека

1 1 Модальное 1 Полиплои-|

I Линия Пас- ное число Кариотип дия кле- |

саж хромосом ток, % |

IЧСЛ-1 7 46 46,ХУ ни |

63 46 »» 2,5 |

132 92 92,ХХУУ 100 |

1ЧСЛ-2 19 46 46, XX 2,4 |

39 46 (1 ни |

1ЧСЛ-3 18 46 46, ХУ ни |

32 46 и 2,5 |

| ЧСЛ- 4 26 46 46, ХУ, шу( 16) И 2,3 |

аномальный (а)

92 46 »» 2,8 |

130 46 аномальный (а) ни |

| ЧСЛ- 5 6 46 46, ХУ 2,0 |

34 46 2,4 |

1ЧСЛ-8 10 46 46, XX 2,3 |

36 46 И 2,5 |

| ЧСЛ- 9 | 6 46 46,XX 3,9 I 1

а) 46.ХУ, с!е1(2)(р12) ,с1ег(12)

1(2; 12) С р! 1-12; р13), 1пу(16) ни - не изучено

ормальным кариотипом доминировали (60%). Таким образом, эти анные свидетельствует о происхождении этих линий из еопухолевых клеток опухолевого материала.

Цитогенетический анализ клеточных линий ЛУПГ-о(Т) и ПГ-8(Т) проведен только на ранних этапах культивирования, отличие от клеточной линии ЛУПГ-5(Т), кариотип клеток кото-ой представлен только нормальным диплоидным кариотипом, в инии клеток СПГ-8(Т) через несколько недель культивирования ыявлено два типа кариотипов - нормальный и псевдодиплоидный экстракопией транслоцированной хромосомы 7 и делециями ромосом 13 и 14. В клеточной линии СПГ-7(Т) также выявлен ормальный кариотип на ранних этапах культивирования (43 пае-аж), а к 87 пассажу произошло полное замещение исходных кле-ок с нормальным кариотипом клетками с псевдодиплоидным ариотипом с структурно измененными хромосомами 1, 2, 13, 14 X. Подобная эволюция кариотипа наблюдалась в выше описанной -лимфоидной линии человека ЧСЛ-4. Кроме того, наибольшее нимание привлекает характерное для линий СПГ-7 и 8(Т) вовле-ение в структурные перестройки хромосом 13 и 14, гомологич-ых по генетическому материалу длинному и короткому плечу ромосомы 2 человека. Структурные перестройки этой хромосомы влявтся специфичными для Т-клеточных неоплазий человека.

Таким образом, в В- и Т-лимфоидных линиях павиана еопухолевого происхождения наблюдается сходство характера волюция кариотипов в процессе их становления и длительного ультивирования с лимфоидными клеточными линиями человека.

Особый интерес представляет В-лимфоидная линия павиана амадрила - ЛУГ-4. Все клетки этой линии изначально имели севдодиплоидный кариотип со структурными хромосомными ерестройками, который не изменялся до 128 пассажа (рис.1), убклоны этой линии - Е1-1, Е9-1, Е5-1, сохраняли специфичный ля исходной линии ЛУГ-4 хромосомный маркер - 17р+.

\f A i Ü «k • il 2 » « II M t% M2 3 "(i" -Jbt 4 5 -a-«-

i 7 8 » 10

W ti 12 ir 13 irtr и IS

-it- it Í!" MI 17 18 19 -IIV 30 xV

Рис.1. Кариотип клеток линии ЛУГ-4, 2п-42, XY, 2 маркерные хромосомы.

Таким образом, результаты цитогенетического изученю клеточной линии ЛУГ-4 позволяют нам сделать заключение оС опухолевом происхождении этой линии. Эти выводы согласуются с результатами исследований В-лимфоидных линий человека злокачественного происхождения. Было показано, что кариотипы тагаи линий изначально моноклональны и содержат характерные дл! каждого типа лейкоза или лимфомы структурные хромосомные перестройки (Nilsson, 1979; Bernheim, 1983; Ohkubo, 1985; Caligaris-Capio, 1987).

Структурная хромосомная перестройка в линии ЛУГ-4 -t(3;17), по-видимому, являлась специфической структурно! перестройкой в исходном материале in vivo. Хромосомы 3 и 11 павиана гомологичны хромосомам 3 и 17 человека.

Поскольку, В-лимфоидные линии обезьян очень слабо изучены цитогенетически и почти не картированы уникальные гены, прежде всего онкогены, то трудно делать выводы о специфичности для лимфом у обезьян, обнаруженного в ЛУГ-4 хромосомно* перестройки. В тоже время, различные районы, как хромосомы 3, так и хромосомы 17 часто вовлекаются в структурные перестройки при гемобластозах человека, а также во вторичные структурные хромосомные перестройки в длительно культивируемых В-лимфоидных линиях человека (Nilsson, 1979; Shade et al., 1980; Steel et al., 1980; Sandberg, 1986).

Путем трансформации лимфотропным вирусом ГВП лимфоцитов

здорового павиана гамадрила, получена клеточная линия ЕПЛ-11, е которой на 17 пассаже выявлено 2 клона клеток - с нормальным кариотипэм (60%) и псевдозиплоидным Г 40"). Кариотип патологического клона содержал две маркерные хромосомы: с!ег(17) и с1е1(20). Хромосома 20 павиана гомологична хромосоме 18 человека.

Как мы уже упоминали выше, хромосома 17 человека является одной из наиболее часто вовлекаемых в структурные перестройки хромосом в длительно культивируемых В-лимфоидных линиях человека. Однако, этого нельзя сказать о хромосоме 18 человека. Можно предположить, что вовлечение хромосомы 20 павиана в структурную перестройку является характерной особенностью кариотипа линии ВИЛ-11.

Анализ дифференциально окрашенных кариотипов В-лимфоидных линий макаки бурого. Результаты представлены в табл. 4. Клеточные линии МАЛ-1 и МБ-20 являются В-лимфобластоидными линиями. В линии МАЛ-1 в процессе культивирования нарастала кариотипическая нестабильность клеток. На начальных этапах культивирования линии (10 пассаж) в пределах модального класса хромосом были выявлены клетки с нормальным кариотипом -42,XX; к 26 пассажу появились единичные клетки со структурными хромосомными перестройками, а к 166 пассажу 100% клеток имели псевдодиплоидный кариотип с 8 маркерными хромосомами.

Поскольку кариотип этой линии имел большое число сложных структурно перестроенных хромосом, то для выявления и идентификации маркерных хромосом и редких структурных перестроек хромосом приготавливалась таблица рядов идентичных маркерных хромосом. С помощью "банка" нормальных хромосом макаки установлено происхождение маркерных хромосом : М1 - с1ег(1), М2 -:1ег(ЗЦМЗ - с!ег(5), М4 -с!ег(5), М5 - с!ег(11), Кб - с!ег(4), № - с!ег(1б), М8 - с!ег(17). Появление небольшого числа редких структурных перестроек хромосом сопровождалось утратой отдельных нормальных хромосом. Это свидетельствует о сбалан-:ированности суммарного хромосомного состава клеток МАЛ-1.

Таблица 2. Характеристика кариотипов В-лимфоидных линий павиана гамадрила

1 I Линия 1 I Пассаж 1 1 1 1 Модальное I число хро-I хромосом 1 | Кариотип Полиплоидия, %

1СПГ-5 1 | 20 | 29 1 1 42 I 1« |42,ХУ 1 11 4,7 4,7

1СПГ-6 1 | 10 1 1 42 142, XX 5,9

I ЛУГ-4 1 1 1 8 1 I 22 1128 1 1 42 | «1 1 84 i42.XY.deK3) (4Ьег),с!ег( 17) |ЦЗ;17)(4Ьег^ег) 1 " I84.XX.YY, 1с1етх2 ни 14,4 100,0

1 1Е1-1 * 1 | 40 1 1 1 42 |42,ХУ,с1е1(3)(4Ьег) ,<3ег(17) |ЦЗ;17)^ег^ег) 13,2

1Е9-1 * 1 | 27 1 1 1 42 142, ХУ, с!е1( 3) (я1ег), <1ег( 17) |Ц 3;17)(яЬег;р1ег) 25,6 ни

1Е5-1 * 1 | 23 1 | 90 1 1 1 42 1 " |42,ХУ,с1е1(3)№ег),с1ег(17) |tCЗ;17)(qter;pteг) 142. ХУ. бе 1 (3) (425). с!ег( 17) |ЦЗ;17)(4Ьег;рЬег) ни 27,2

1ВПЛ-11 1 1 | 17 1 I 36 1 1 42 { »» ) 142. XX/42, XX, с!ег(17П(17; |20) (414:411), бе1(20)(411) 1 .1 • 19,0 26,9

* линии Е1-1, Е9-1 и Е5-1 получены в результате субклонирования исходной линии ЛУГ-4; ни - не изучено

Таблица 3. Характеристика кариотипов Т-лимфоидных

линий павиана гамадрила

гл:н;;я Пассаж [Модальное ¡число хро-|хромосом 1 1 I Кариотип 1 1 1 ••• 1 [Полип-I ¡лои- I !дия, %| 1 |

ТГ-7(Т) 43 87 1 42 1 |42,XX ! 42, XX, с!ег( 1) , с!ег(2), |с!ег(13), с1еп14), йег(Х) 1 1 1 ! 13,0 | 1 ни 1 1 ! 1 |

ТГ-8(.Т) 36 ( 42 1 |42,ХУ/42,ХУ, аеп7)Ц7;Х) |(рЬег), с1е 1(13)^21), Ие1(14)(ч16) 1 1 1 1 11.8 | 1 1 1 1 1 |

гТЕГ-5( Т) 56 1 42 1 |42,ХХ | 1 1 1 17,0 | 1 1

I - не изучено

Таблица 4. Характеристика кариотипов Е-лимфсидных линий макаки бурого

1 | 1 |Модаль- 1 : 1 ! 1 Полиплои-|

.Линия [Пас- ное чис- 1 Кариотип | дия кле- |

1 1 саж |ло хро- ! 1 ток, 7, |

1 мосом 1 1 1 1

1 1МАЛ-1 | 10 1 42 1 [ I 42,XX | 4,2 |

1 1 Ц66 1 " 1 42,XX,М1 - М8 | 1 | 32,6 |

1МБ-20 | 36 | 45 1 1 142,т 45,XI, +2, +8, +15/| 6,8 |

! 145, ХУ, +2, +8, +с1ег( 15) |

1 1 5; 15) (а21; рЪег) |

I 76 1 " 1 1 1 11.0 I I

Цитогенетический анализ хромосом линии МБ-20, выявил клона клеток: первый - с нормальным кариотилом - 42, XX и клона с аномальным кариотипом - 45, XX, в одном из них был экстракопированы хромосомы 2, 8 и 15, а другой имел дополни тельно транслокацию хромосомы 15. В процессе культивировали в линии сохранялись те же самые клоны, лишь незначительн менялось их процентное соотношение: на 36-м пассаже оно со ставляло 30, 50 и 20%%, а на 76-м пассаже - 20, 50 и 30%%.

Линия МБ-20 была единственной среди исследованных нам линий обезьян, в которой обнаружено экстракопирование отдель ных хромосом. В этой линии клоны с экстракопированными хромо сомами постепенно вытесняли нормальный клон. Можно предполо жить, что аномальные клоны, при дальнейшем культивировали могут полностью вытеснить нормальный клон клеток. Из литера туры известна только одна В-лимфоидная линия павиана гамадри ла, в которой обнаружена трисомия по хромосоме 15 (Масек Benyesh-Melnik, 1972). В нашем же случае, помимо трисомии п хромосоме 15, наблюдалась трисомия по хромосомам 2 и 8. Хро мосомы 2, 8 и 15 макаки гомологичны по генному материал следующим хромосомам человека: хромосома 2 макаки - 7 и 2 человека, 8-8 человека, 15-9 человека. В длительно куль тивируемых В-лимфоидных клеточных линиях человека, наиболе часто выявляется трисомия по 3, 7, 8, 9, 12 и 21 хромосома (Nilsson, 1979; Shade et al. , 1980; Steel et al., 1980) Экстракопирование 7-й хромосомы - первое по частоте событи в В-лимфоидных линиях человека, особенно при длительном и культивировании. Не редко в этих клеточных линиях выявляете и трисомия по 8 хромосоме. Селективное преимущество клеток экстракопированными хромосомами, по-видимому, связано с уве личением дозы определенных генов, локализованных в этих хро мосомах. Например, в хромосоме 7 это могут быть ген рецепто ра эпидермального ростового фактора, протоонкоген с-МЕТ, ге множественной лекарственной устойчивости, а в хромосоме 8 с-туе онкоген и другие. Можно предположить, что увеличени числа копий гомологичных по генному материалу хромосом мака

1, способствует повышению пролиферативного потенциала содер-

iiiKX их клеток и тем самым обеспечивает им селективное преимущество в культуре. Кроме того, в этой линии второй патоло-гческий клон клеток помимо трисомии имел структурную перетопку хромосомы 15. Направление эволюции кариотипов клонов :нии 155-20 позволяет предположить, что именно клон, содержа-1й помимо экстракопий отдельных хромосом и структурную хро->сомную перестройку будет доминирующим и может вытеснить ¡а других клона в процессе длительного культивирования.

£ проанализированных лимфоидных линиях обезьян и челове-I, нами обнаружена также тенденция к полиплоидизации клеток процессе длительного культивирования их in vitro. Так. в шии клеток МАЛ-1 в процессе культивирования доля тетрапло-шых клеток достигала 32,6% на 166 пассаже, а в линии клеток 1Л-11, уже на относительно раннем этапе культивирования (36 юсаж), был установлен высокий процент тетраплоидных клеток 26,9%. В то же время линии ЧСЛ-1 и ЛУГ-4 к 130 пассажу шюстью полиплоидизировались до тетраплоидного уровня. В Уклоне Е5-1 доля тетраплоидных клеток также была высокой '.2Z (90 пассаж). Как установлено Мамаевой (Мамаева, 1995), :липлоидизация клеточных линий е процессе культивирования >жет служить одним из способов компенсации клеточной линией 'нетических дефектов и адаптации к условиям культивирования.

Почти все исследованные нами В- и Т-лимфоидные клеточные шии имели неопухолевое происхождение. Примерно в половине 1 них возникали клеточные клоны со структурными хромосомными ■рестройками уже на ранних этапах или в процессе их длительно культивирования, независимо от того были они получены от льных или здоровых доноров. Кроме того, клон со структурны; хромосомными перестройками постеренно вытеснял клон клеток нормальным кариотипом. При этом не наблюдалось значительной 1риотипической эволюции установившегося клона со структурны-[ хромосомными перестройками при продолжительном культивиро-1нии линии, что является характерной особенностью лимфоидных кточных линий (Nilsson, 1979; Steel et al. , 1980). По-види-

мому, возникшие структурные перестройки хромосом изменял пролиферативный статус клеток и создавали им селективны! преимущества.

В структурные хромосомные перестройки в лимфоидных лини ях обезьян вовлекались преимущественно теломерные и центро мерные районы 1,2, 3, 4, 5, 7, 11, 15, 16 и X, особенн часто теломерные районы обоих плеч хромосомы 17, а такж длинные плечи хромосом 13 и 14. Можно предположить, чт> обнаруженные нами вторичные хромосомные перестройки в карио типах в процессе длительного культивирования лимфоидных лини: обезьян носят не случайный характер. Но поскольку в настоящее время отсутствуют данные о точной локализации на хромосома обезьян генов, связанных с пролиферацией и дифференцировко клеток, то трудно предположить каков генный механизм эти хромосомных преобразований. Дальнейшие молекулярно-цитогене тические исследования лимфоидных линий обезьян позволя решить эти вопросы.

ВЫВОДЫ

1. При усовершенствовании метода культивирования лимфо цитов периферической крови низших обезьян установлено, чт оптимальная для цитогенетического анализа митотическая актив ность лимфоцитов крови и наилучшая морфология хромосом дости гается при культивировании клеток с митогеном конканавалин

в течение 96 часов.

2. Впервые составлен "банк" образцов нормальных хромосо павиана гамадрила и макаки бурого.

3. Впервые проведен детальный цитогенетический анали 12-ти В- и Т-лимфоидных клеточных линий павиана гамадрила макаки бурого, продуцирующих лимфотропные онкогенные вирус и ретровирус типа С.

4. Проведен детальный анализ 7-ми вируспродуцирующи В-лимфоидных линий человека.

5. С помощью цитогенетического критерия впервые проведе но дифференцирование исследованных В- и Т- лимфоидных лини

5езьян и человека на линии неопухолевого и опухолевого

зоисхождения. Единственная линия опухолевого происхождения /Г-4 имела изначально псевдодиплоидный кариотип.

5. Сравнительный цктсгенетический анализ лимфоидных ли-i:s. обезьян и человека выявил сходство характера кариоткпк-?сксй изменчивости этих линий в процессе становления и длинного культивирования in vitro, заключающееся в пслиплои-изашш клеток до тетраплоидного уровня, а также экстракопи-эьакии и вовлечении во вторичные структурные перестройки ромзсоы, имеющих гомологичный генетический материал.

7. Установлено, что длительное культивирование in vitro -.ЛЪшИНСТВа Бируспродушрувших лимфсидних линий приматов эопухолевого происхождения сопровождается появлением клона леток со структурными хромосомными перестройками, который, ак правило, сохраняет селективные преимущества

8. На основании детального кариологического исследования оказано, что лимфоидные линии обезьян могут служить адекват-эй лимфоидным линиям человека моделью для медико-биологичес-

исследований.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Агрба Б. 3. , Тимановекая Б. Б. , Новожилов С. В. , Инджия Б. , Аравиашвили Д. Э. , Онишук Ф. Д. Получение и характеристи-

i постоянных лимфсидных суспензионных культур клеток прима/ / Мат. конф. "Биология клетки в культуре". Л. Цитология. 1987. - Т. 29. - N9. - С. 1071.

2. Аравиашвили Д. Э. , Мамаева С. Е. , Максимова И. JL , «иановская В. В. , Агрба В. 3. Характеристика постоянных шфоидных суспензионных линий человека // Мат. конф. Биология клетки в культуре". JL Цитология. - 1987. -29. - N9. - С. 1073.

3. Агрба В. 3. , Тимановекая В. В. , Иванов М. Т. , завиашвили Д. Э. , Чикобава М. Г. , Новожилов С. R , Онищук Ф. Д. тыт получения постоянных лимфоидных суспензионных культур :еток приматов, продуцирующих В-лимфотропные вирусы герпеса

Вестник АМН СССР. М. - 1987. - N10. - С. 75-78.

4. Аравиашвшш Д. Э. , Цвиленева Е Е , Мамаева С. Е Цитогенетическая характеристика лимфоидной суспензионно постоянной клеточной культуры ЛУГ-4 // Мат. Всесоюз. конф "Вопросы медицинской приматологии. Наиболее перспективно использование обезьян в медицине и биологии". Сухуми. - 1987

- С. 159-160.

5. Агрба В. 3., Тимановская В. В. , Аравиашвили Д. Э. Какубава В. Е Создание коллекции постоянных лимфоидных куль тур клеток человека // Тез. докл. 2 Всесоюз. конф. "Гено человека- 91". Переславль-Залесский. - 1991. - С. 4-5.

6. Агрба В. 3. , Тимановская Е Е , Какубава В. В. Аравиашвили Д. Э. , Инджия JL Е , Чикобава М. Г., Гурцевич В. Э. Павлиш 0. А. Получение вирус-продуцирующей линии СПГ-7(Т) и клеток селезенки павиана гамадрила со злокачественно лимфомой // Экспериментальная онкология. Киев. - 1993. - N4

- Т. 15. - С. 38-40.

7. Аравиашвили Д. Э., Мамаева С. Е. Цитогенетическа характеристика постоянных Т-клеточных линий обезьян // Тез докл. конф. "Биология клетки в культуре". С. -Петербург Цитология. - 1993. - Т. 34. - N9. - С. 49.

8. Аравиашвили Д. Э., Агрба В. 3. , Тимановская Е Е Цвиленева Е Е , Мамаева С. Е. Цитогенетическая характеристик В-лимфобластоидных клеточных линий человека // Цитология. 1994. - Т. 36. - N7. - С. 696-699.

9. Аравиашвили Д. Э., Агрба Е 3., Тимановская Е Е Цвиленева Е Е , Мамаева С. Е. Цитогенетическая характеристик В-лимфоидных линий павианов гамадрилов (Papio hamadryas) макаков бурых (Масаса arctoides) // Цитология. - 1994

- Т. 36. - N7. - С. 701-707.

10. Agrba V. , Timanovskaya V. , Kakubava V. , Indzhii L. , Araviashvili D. , Chikobava M. , Lapin B. Establishmen and characteristics of an interleukin-2-dependent STLV-1 producing lymphoid cell line, SPH-7(T), obtained from Papi hamadryas with malignant lymphoma // In Vitro Cell Dev. Biol

- 1994. - Vol. 30A. - P. 637-639.

11. Araviashvili D. E. , Agrba V.Z. , Mamaeva S. E. Cytogenetic characteristics of B-lymphoid cell lines of p. hamadryas and M. arctoides // Abst. of the XVth Congress of

the International Primatological Society, Jakarta, Indonesia. - 1994. - P. 56.

«писано к печати 03.11.95. Заказ !Л СПГУ. 199034. Санкт-Петербург,

Ш Тираж 100 Объем 1,25 п.л. наб. Макарова,б.