Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Транспортные АТФазы в фоторецепторной клетке сетчатки

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Азимова, Армилла Микаил кызы

Список сокращений . . . стр.

Введение г«*».«««.*«*»»**."

Гл.1- Обзор литературы:

1.1* Общие сведения о структуре фоторедепторной клетки. • ••.•••.••••••• "

1.2« Транспортные АТФазы . . "

1.2.1. Краткие сведения о НаД-АТФазе* . "

1.2.2. Краткие сведения о Оа,Ыв -АТФазе . "

1.3. АТФазные системы и активное накопление иона кальция в фоторедепторной клетке . . . . "

1.3.1. Наличие АТФазных систем в фоторедепторной клетке.1 . . • . . "

1.3.2. Перемещение иона Са в фоторедепторной клетке, ; . . . . . . . . . . • "

Гл.2- Материал и методы исследования:

2.1.~Получение различных препаратов фоторедепторной клетки,их характеристика. • . . . . "

2.1.1. Выделение НСП и ВСП. . "

2.1.2. Получение разрушенных препаратов НСП . "

2.1.3. Получение везикул НСП и ВСЯ. . , . . * "

2.1.4. Характеристика полученных препаратов . "

2.2.0пределение активности На,К-, -, Са,Мё-,

Са-АТФаз и количества неорганического фосфата "

2.3.Определение активности К-зависимой уабаин-чувствительной п-нитрофенилфосфатазы. . "

2.4.Определение АТФ-зависимого накопления иона

Са . , . < . . . . . "

2.5.Индукция перекисного окисления липидов. . "

2.6.Использованные реактивы,препараты и приборы. . "

2.7.Статистическая обработка. •»••.•• . . "

Гл.З - Результаты исследований

3.1. Локализация На,К- и М& -АТФаз в фоторецепторной клетке палочки, ."

3.2. О латентной Иа,К-АТФазе наружных сегментов палочки сетчатки . "

3.2.1. Влияние разрушения структуры наружных сегментов(гипотоническим шоком) на иа,К-АТФазную активность, . . . "

3.2.2. Влияние люброла на На,К-АТФазу. . . "

3.3. Локализация Са,1%- и Са-зависимой АТФаз в фотореиепторной клетке. . "

3.4. АТФ-зависимое накопление Са в фотореи • - ' II ПЛ

- цепторнои клетке. . ^

3.5. Влияние освещения на Па,К- и Г^ -АТФазные активности фоторецепторнои клетки. . . . "

3.5.1. Фотоиндуцированные изменения активности АТФазных систем.' "

3.5.2. Возможные механизмы фотоиндупирован- . ных изменений ферментативном активности . "

Обсуждение ."

Выводы . "

Введение Диссертация по биологии, на тему "Транспортные АТФазы в фоторецепторной клетке сетчатки"

В основе функционирования фоторецепторных клеток сетчатки лежат ионные перемещения в наружных сегментах,в частности палочек, являющихся первичными акцепторами световых квантов и состоящих из стопки так называемых дисков,окруженных наружной мембраной. Распределение потенциалообразующих ионов в этих структурах носит своеобразный характер.Во внутридисковом пространстве ион На значительно преобладает над ионом К,т.е. состав среды подобен внеклеточной среде,в междисковом же пространстве соотношение ионов На и К типично для внутриклеточного состава( Etingof et ai.,1970;Берман и др.,1971).Следует полагать,что для поддержания градиента концентрации ионов на мембране диска необходима как обычно, на,К-АТФаза.Однако данные о наличии и уровне активности этой ферментной системы в НСП противоречивы.Имеются указания и об относительно высокой активности На,К-АТФазы в этих струк-турах(Собота и др.,1972; Hendriks et al .,1973; Frank et al., 1973)и о почти полном отсутствии фермента в них( Bownds, 1974; Берман,1975).Отдельные указания свидетельствуют о наличии в НСП латентной формы На,К-АТФазы,т.е.формы,выявляемой лишь после специальной обработки мембран(Собота,1973; Hemminki ,1974,1975а).

В результате поглощения кванта света зрительным пигментом родопсином,в случае палочки сетчатки, уменьшается На проницаемость наружной мембраны клетки и соответственно изменяется ее биоэлектрическая активность.Поскольку диски,в которых сосредоточен родопсин,пространственно отдалены от наружной мембраны, необходимы какие-то пути передачи сигнала с диска на наружную мембрану; Согласно одной из наиболее распространенных гипотез о механизме возбуждения фоторенепторной клетки, функцию медиатора, обеспечивающего передачу сигнала, выполняет ион кальция Hagins ,1972).Автор полагает,что как в случае с ионами На и о,

К,имеется градиент конпентраиии Ca*"" на мембране диска; его содержание существенно отличается во внутри- и междисковых пространствах. При освещении изменяется проницаемость мембраны диска и часть ионов из диска попадает в междисковое пространство. Эти ионы блокируют натриевые поры наружной мембраны,что приводит к гиперполяризаиии фотореиепторной клетки. р.

Считают,что поддержание градиента концентраций Ca на мембране диска и восстановление его содержания в фазу темновой адаптации обеспечивает Ca,Mg -АТФаза.Между тем наличие этого фермента в НСП не обнаружено( Ostwald and Heller ,1972; Bonting , 1976; Saek and Harries ,1977),но этими же авторами показано наличие в дисках Са-зависимой АТФазы,которая по-видимому,также может выполнять роль Са-насоса.Весьма противоречивы данные и об изменениях содержания иона кальция в НСП при ocBeuieiffiH(Bownds et al. 1971; Hendriks et al. ,1977; Smith, 1979; Шевченко и др., 1981) и о возможности его активного накопления в дисках( Neufeld, 1972;Hemrninki, , 1975в; Hendriks et al. ,1977; Sehnetkamp ,1979).

Рядом авторов отмечены фотоиндупированные изменения активности На,К-,Ca- , Mg -АТФаз в НСП( Scarpelli and Craig ,1963; Островский и Федорович,1965; Ostwald and Heller ,1972; Собота, 1973; Hemminki ,1975).Возможность таких изменений может рассматриваться как свидетельство локализации Па,К-АТФазы в НСП.Механизм изменений активности фермента при освещении не известен.

Учитывая трудности получения чистых фракций НСП,нельзя исключить,что в некоторых работах исследуемые препараты могли содержать примеси других мембранных фрагментов,что могло отражаться на получаемых результатах.

Таким образом,ряд центральных вопросов,касающихся транспортных АТФаз фоторецепторной клетки сетчатки,оставался к моменту настоящих исследований спорным и малоизученным. Основная цель настоящей работы состояла в изучении транспортных АТФаз,в частности их локализация в фоторецепторной клетке сетчатки. В связи с этой целью были поставлены следующие задачи:

1) решить вопрос о локализации ш,К- , Са,Мв Са-АТФаз в фоторецепторной клетке. Для этого нужно было получить различные по чистоте фракции НСП,а также фракции ВСП,оценить эти фракции по их маркерам(для НСП -родопсин, для ВСП-СЩГаза) и сравнить распределение маркеров по отдельным субфракциям с распределением в них транспортных АТФаз;

2)проверить наличие латентной формы Па,К-АТФазы в НСП и в случае отсутствия такой формы фермента,выяснить по возможности причину её выявления другими авторами.

3) изучить вопрос о наличии и локализации активного транспорр I та Са в фоторецепторной клетке,сопоставив эти данные с распределением в клетке Са,Мв -АТФазы;

4) выяснить возможный механизм фотоиндунированных изменений активности Жа,К-АТФазы в фоторецепторе.

Научная новизна определяется новыми подходами к изучению спорных вопросов о транспортных АТФазах фоторецепторной клетки. Эти подходы заключались в следующем:был проведен подробный сравнительный анализ чистоты получаемых фракций: с их ферментативной активностью,что позволяло более точно оценить наличие фермента в отдельных фракциях;было сопоставлено наличие фермента(Са, АТФазы) в отдельных фракциях с работой ионной помпы(Са-помпы) в них, что увеличивало степень достоверности исследований; на основе особенностей липидного состава фоторецепторыых мембран и роли их отдельных компонентов в регуляции активности ряда ферментов был проанализирован вопрос о причинах фотоивдуцированных изменений На,К-АТФазы; методические приемы,применяемые при работе с латентюй формой фермента,были тщательно проконтролированы для учета возможных ошибок.

В результате использования этих подходов удалось доказать, что На,К- , Ca,Mg - и Са-АТФазы в фоторецепторе локализованы в области ВСП.Эти ферменты в НСП не обнаружены.

В НСП отсутствует и латентная форма На,К-АТФазы¿полученные ранее положительные данные по этому,поводу(Hennainki ,1974,1975) объясняются различными методическими погрешностями.Показано,что в в области ВСП происходит АТФ-зависимое накопление иона калышя. Фотоиндуцированные изменения активности На,К-АТФазы в условиях in vitro объясняются усилением при освещении образования продуктов ПОЛ в НСП,которые подавляют активность фермента,сосредоточенного в ВСП. Оказалось,что эти изменения могут быть предотвращены при добавлении в среду шшубашш антиоксидантов.

Таким образом,полученные данные в целом показали,с одной стороны,крайне выраженную биохимическую специализацию ПМ фоторе-цепторной клетки( На,К-АТФаза локализована в области ВС, в области НС-отеутствует) и, с другой,выявили возможность взаимодействия меззду внутренним и наружным сегментами фоторецептора(регуляция активности На,К-АТФазы в ВСП при помощи ПОЛ из НСП).Кроме того,полученные факты поставили под сомнение один из основных постулатов " Са-гипотезы" возбуждения( Hagins ,1972) о наличии "Са-помпы" непосредственно в НСП.

Полученные результаты показали принцип распределения транспортных АТФаз в фоторецепторе сетчатки,что ваяно для расшифровки механизмов поддержания градиента концентраций в этой клетке и, соответственно, понимания основ их функционирования. Данные о биохимической гетерогенности наружной мембраны фоторецепторной кдетки перспективны для изучения в этом плане и других экстраклеточных ферментов с целью выявления, возможно, общих принципов их биохимической организации. Выяснение значимости продуктов ПОЛ в качестве возможных регуляторов активности Иа,К-АТФазы и роли ПОЛ как компонентов, обеспечивающих передачу сигнала из одной области клетки в другую, конкретизируют и расширяют наши представления о роли липидных компонентов мембран в норме.

В целом, результаты настоящей работы представляют интерес для специалистов, работающих как в области биохимии и биофизики рецепторных процессов, так и в области исследования структуры и функции мембран. Полученные факты могут быть использованы в соответствующих курсах лекиий.