Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ТРАНСФОРМАЦИЯ НАФТАЛИНА И ДИМЕТИЛНАФТАЛИНОВ БАКТЕРИЯМИ РОДА PSEUDOMONAS

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ТРАНСФОРМАЦИЯ НАФТАЛИНА И ДИМЕТИЛНАФТАЛИНОВ БАКТЕРИЯМИ РОДА PSEUDOMONAS"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ШСТЙТТТ ИИКРОШШОПИ

На правах рукописи

Старовойтов Иван Иванович

ТРАНСФОРМАЦИЯ НАФТАЛИНА И ДШЕТИДНАФТАЛШОВ БАКТЕРИЯМИ РОДА РЗЕШЮМОТАБ

( микробиология - 03,00.07 > ( Диссертация написана на русвком языке >

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1975

| Ы(ижог.сао11 I ¡ л. {

Работа выполнена б Институте биохимии а физиологии микроорганизмов АН СССР

Научный руководитель: член-корреспондент АН СССР, профессор

Г.К.СКРЯБИН

Официальные оппоненты: доктор биологических наук« профессор

Е.Л.ИГБАН доктор химических наук, профессор Н.Н.СУВОРОВ

Диссертация направлена на официальный отзыв во Всесоюзный научно-исследовательский институт биосинтеза белковых веществ.

Автореферат разослан "У/" _ 1975 г.

Защита состоится "4/" _1975 г. в 12 час.ЗОк

на заседании Ученого совета Института микробиологии АН СССР ( Москва, В-312, Профсоюзная улица, ?а ).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

• /

микробиологии АН СССР,

Ученый секретарь Совета ст.науш.сотр., канд.биол.наук

Л.Сен'^^ сий, Л.К.ОСШЩКАЯ

ВВЕДЕНИЕ

Способность микроорганизмов окислять ароматические соединения (Зила отмечена рядом авторов еще в начале вашего столетия ( Emmerling, AMer balden, Х903; Stormer, 1908). Однако проблема микробиологического окисления этих соединений до сих пор находится в центра вникания исследователей. Это объясняется» о одной стороны, теоретический интересом, связанным о пониманием механизмов микробного разложения стабильных в химической отношения ароматических структур, а с другой - вопросами практического характера, касающимися защиты окру жа щей среды и использования ароматических соединений в народной хозяйстве.

Известно, что биосинтез ароматических соединений, осуществляемый растениями» веда; к выключению углерода из биологического круговорота вследствие образования различных циклических структур от простых фенолог до сложных полимеров подобно лкгаяау, устойчивых к действии фиг s ко-хмки чес ких факторов окру юз щей среда. В свою очередь, почвенные ыикроорганизмы играют ведучус роль в природном углеродное цикле, гак как цикробвая деградация арэиа-тических соединений приводит к высвобождению углерода из кольцевых структур и, такам образом, к вовлечению его вновь в биологический круговорот. Среди ароматических структур» возникающих а процессе биогенеза» микробный катаболизм волициклических соединений наименее изучен,

В последнее время в природный круговорот углерода кроме кольцевых структур биологического происхождения вовлекается значительное количество ароматичеоких соединений» попадающих в биосферу в виде отходов промышленности и в качестве химических средств завиты растений. Многие из этих соединений» включая и полициклические углеводороды, являются физиологически активными и, следовательно» возможная аккумуляция их в биосфере представляет серьезную опасность для живых существ. Необходимо отметить» что микробный катаболиаи абиогенных ароматических соединений может приводить как к их детоксикации (Alexander» 1955), так и возникновению продуктов с большей биологической активностью»чем исходные вещества { Uebieke, 1974). Этим обусловливается необходимость исследования путей микробиологического окисления названных соединений.

Важный иоментой, определяющий подход к изучению вопросов микробиологического окисления ароматических соединений, является потребность современной промышленности и медицины в этик веществах. В частности, в различных областях народного хозяйства нашли или 11017т найти применение соединения нафталинового ряда. Так, диок-симетиднафтвлшщ и нафталиндикарбоновые киолотьг могут быть использованы в качества мономеров для получения ценных полимеров (Уап<авпивг££', 1966, Уапйезтоег!* еъ .а1*,1972), Имеются также сообщения о применении производных яафталинкарбоновых кислот в медицина при лечении сосудистых заболеваний ( ЗайвЪу et а1,, 1972> а в качестве антишгазшшшх веществ (ЗЫвеЬагц ей яг., 1971)*

Однако практическое-использование этих соединений г настоящее время ограничено трудностями их получения химический путем.

Микроорганизмы, как известно, способно осуществлятьспецифические энзиматические превращения (трансформации) различных субстратов. В,этой связи, представляется перспективной возможность использования микроорганизмов о целью получения ценных в практическом отношении соединений путей микробиологической трансформации ароматических веществ.

В соответствии с изложенным, были определены следующие задачи настоящего исследования:

1. Изучение способности представителей почвенной микрофлоры использовать нафталин в качестве источника углерода и энергии;

2. Изучение путей микробиологической трансформации нафталина и диметилнафталинов;

3. Исследование возможности получения соединений, имеющих практическую ценность, путем микробиологической трансформации нафталина и диметилнафталинов.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Вначале сСектами исследования были почвенные микроорганизмы ий различных таксономических групп: бактерии, дрожжи, грибы, акти-номицеты. Источниками выделения их являлись образцы зональных почв европейской части ССС? и почвенные образцы о территории коксохимических заводов (КХЗ), отобранные в пестах, подверженных действию

нафталина. Выделение микроорганизмов проводили также из образцов нефтеносных почв, взятых в районе Баку,

Микроорганизмы выделяли методом посева из разведений почвенной суспензии. Для выделения использовали следующие агаризованные среды: мясо-пептонный агар, среду Чапека для бактерий и актино-мицетов, ореду Чапека для грибов, сусло-агар, крахмало-аммиачный агар.

Способность выделенных культур использовать нафталин в качестве единственного источника углерода изучали'на жидкой среде Стравинского и Стоуна ( Strawtneki, stone, 1954).

В дальнейшей в качестве объекта исследований служили бактерии рода Paeudomonas, выделенные из различных почв. В сравнительных целях в работа использовали также музейные штаммы бактерий этого рода, полученные из лаборатории'коллекционных культур Института биохимии и физиологии микроорганизмов и кафедры биологии почв МГУ, Коллекции музейных культур содержала 64 штамма, представляющих

II видов рода Pee'Jdomonas, в частности; Ps.fluorescene, Ре. aeruginosa, Pa.putida, Ps,maltophila, Ps.cobaerena, Ps.stuteerl, Ps.fragi, Ps.orallB, Fs.aureofacieaa, Ps.aurantlca, Pa.leraonnieг1.

Таксономическое положение выделенных псавдомонад устанавливали лб определителю Берджи ( Breed et al.f 1957) и в соответствии о методическими разработками Стениера с соавторами ( stealer et al., 1966).

Изучение влияния металлов на процесс микробиологического окисления нафталина проводили путей исключения из среды I соответствующих элементов. Состав среды I ( в %): к^нро^-. l,Oj FHjPO^-

0,1; NaU03-0,3; KgS04*7H20 -5*10~3t PeS04*7H20 -5'10"3! CaCl^SHgO -5'10~3j CH304*5H20 - 8*10"4; H^B04-4M0~5I KnSO^'HgO - 3*10~3i нафталин - 1,0. В работе использовали соли классификации ОСЧ и тридистилдированную воду. Дополнительную очистку среды от следов металлов осуществляли по методу Варинга и Веркмана ( Waring, «terknuui, 1943).

Адсорбцию продуктов окисления нафталина из культуральной жидкости проводили с ломощью анион-обменной смолы та-45. Подготовку анионита и элюцию адсорбированных продуктов выполняли согласно Раймонду с соавторами ( Raymond et al., 1969).

Манометрические исследования проводили в аппарате Еарбурга при 30° со стандартной методике ( Умбрейт и др.,1951). В каждый сосудик вносили по 2 ил бактериальной суспензии (1,5 иг белка/ил) и 0,2 м11 субстрата.

Трансформацию диметилнафталинов (ДИН) осуществляли с помощью отмытых клеток бактерий в фосфатной буфера 1/15 К рН 8,5. Культуры выращивали на агаризованной среде I пли на среде Чапека.

Продукты микробиологической трансформации нафталина и Д№ выделяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с снликагелем ( ** 311иГо1п ШГ в рааличных системах раство-

рителей. Для обнаружения веществ хроиатограммы просматривали под улътрахемископом с А щах = 254 вм.

Продукты трансформации идентифицировали о помощью УФ-, ИК-, ПНР-спектроскопии и масс-спектрометрии.

Научение путей трансформации ДШ проводили методом последовательного окисления продуктов трансформации этих соединений отмытыми клетками или бесклеточными экстрактами. В последней случае реакционная смесь оодержала 3 ыл бесклеточного вкстракха (18 иг белка/мл), 10 ык11 окисляемого субстрата, 20 ык11 КМ) или наш и 300 ыки фосфатного буфера рН 8,5. Окисленные продукты выделяли о помощью ТСХ,

Количество продуктов трансформации ДМН и концентрацию генти-зиновой киолоты определяли спектрофотометрически по величинам оптической плотности в максимумах поглощения.

Содержание салициловой кислоты в культуральной жидкости определяли колориметрически ( ЗпвИ е* а!., 1953).

Активность катехол 1,2- и катехол 2,3- оксигеназ определяли спектрофотометрически ( ^еамша, 1966» "еевтапп, 1969).

Бвсклеточный экстракт получали путем продавливания клеток на прессе Хьюэа с паадвдуюмм центрифугированием суспензии при

16 ООО в .

Белок определяла ПО Лоури ( Ьотсу вг а!,, 1953)*

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИИ

ВЫДЕЛЕНИЕ НАФТАЛИНОКИСЛЙВДЙХ БАКТЕРИЙ И ИХ ИДЕНТИФИКАЦИЯ

Микробиологический авалив 40 образцов зональных почв европейской части СССР показал« что бактерии, дрожжи, грибы и автино-мнцеты, выделенные из этих почв, не используют нафталин л качеот-ве источника углерода. Из 9 основных типов почв было выделено и проанализировано 1424 штамма микроорганизмов различных таксономических групп, среди которых 965 втаммов составляли ¿яуоресцн-румцие бактерии.

Анализ € почвенных образцов о территории коксохимических заводов, а такие 4 образцов нефтеносных почв позволил установить наличие в них нафталинокисляючих микроорганизмов.

Изучение способности 313 культур, выделенных .из почвенных образцов с территории коксохимических заводов и образцов нефтеносных почв, использовать нафталин в качестве источника углерода показало, что такой способность)) обладали лишь представители флуоресцирующей группы бактерий. Аналогичные результаты были получены при выделении нафталинокисляющих микроорганизмов из этих же образцов почв методом накопительной культуры.

Количество флуоресцирующих бактерий, использующих нафталин, составляло в средней 70-75 % от общего числа.бактерий этой группы в почвенных образцах КХЗ. В образцах нефтеносных почв содержание нафталинокисляющих бактерий не превышало 13-16 % от общей численности флуоресцирующих бактерий.

В результате идентификации 119 активных штаммов флуоресцирующих бактерий было обнаружено, что все культуры представляют

собой подвижные неспороносные палочки, движение которых осуществляется с помощью жгутиков. Все культуры имеют гранотрицательную реакцию и используют нитратную и аммонийную формы азота. Исследуемые штаммы обладают положительной оксидазной реакцией и не накапливают в клетках поли- £ -окоимасляную кислоту. На средах, предложенных Кинг" " с соавторами ( е*. а!., 1954).культуры продуцируют флуоресцирующие пигменты.

Наличие перечисленных признаков позволило отнести выделенные культуры согласно определителю Бердки, а также в соответствии с классификацией Стениера с соавторами к роду Pseudomonas.

Изучение культуральных, морфологических и фиsнолого—биохими— ческих свойств выделенных культур дало возможность определить 2 штаuiia как Priudomonaa aeruginosa, 30 я?аммов-*Рв .flucreecene и 87 штаммов - Ра, putIda.

Полученные данные позволят; считать, что на фт али н оки с лв ющая способность бактерий рода Pseudomonas, выделенных из почвенных образцов с территории коксохимических заводов и образцов нефтеносных почв, связана с наличной селективных факторов, под действием которых осуществляется отбор нафталииокислящих микроорганизмов в естественных условиях. Такими селективными факторами могут быть нафталин и близкие по структуре соединения, содержащиеся в почвенных образцах коксохимических заводов и нефтяных месторождений ( Доналдсон, 1963).

Отсутствие нафталииокислящих микроорганизмов в образцах зональных почв, по-видимому, обусловлено тел, что в этих почвах де присутствует указанный фактор отбора.

ТРАНСФОРМАЦИЯ НАФТАЛИНА БАКТЕРИЯМИ РОДА F3EUD0M0HAS

Дивергенция путей катаболизма *

Изучение характера окисления нафталина выделенными бактериями позволило разделить исследуемые культуры на две группы. Штаммы первой группы <85 щт) продуцировали в культуральную жидкость при рооте на нафталине салициловую кислоту.

Катаболизм нафталина бактериями второй группы (34 шт) приводил к аккумуляции в среде двух соединений - салициловой и генти-зиновой кислот.

В обеих группах были представители различных видов бактерий рода Pseudomonas, что может свидетельствовать о птаммовом характере обнаруженного различая.

Г °2

рп 02

Рис. I. Окисление ряда

соединений ОТМЫТЫМИ КЛЄІ' ками бактерий 1-ой (а) и

П-ой (б) групп:

I- бенэалышровиноград-пая кислота ■2- I,2-диоксинафталин

3- салициловая кислота

4- пирокатехин

5- эндогенное

6-гентмзивовая кислота

7-мэлеилпировивоградная кислота

(минуты)

Исследование путей натаболиама нафталина катодом последила' тельной индукции ( stanier, 1947) показало, что культуры -грушш I. окисляли без лаг-периода I,2-диоксинафталин, бенэальпируват, салициловую кислоту и пирокатехин (рис. I а). Следовательно, катаболизм нафталине представителями этой группы бактерий<п рот q ita е т ПО известному njIH ( Daries, Evens, 19б4).

Результаты манометрических опытов с отлитыми клетками бактерий группы (I позволили установить, ЧТО культуры этой группы псевдоионах, выращенные на нафталине, также окислявт без лаг-периода 1,2-диоксинафталин, бензалълируват и салициловую кислоту (рис. I б). Это свидетельствует о том, что окисление нафталина до салициловой кислоты и в этом случае протекает согласно общепринятой схемы ( Davieэ , Evans, 19б4).

Представители второй группы псевдомонад в отличие от бактерий пергой группы не окисляют пирокатехин (рис. I б). В опытах с цельши клетками бактерий группы П, выращенными на среде I о нафталином или с салициловой «молотой, не удалось обнаружить активности катехол 1,2- и иатеход 2,3- оксигеназ. Аналогичные результаты были получены в опытах с бесклеточными экстрактами из этих культур* Эти данные не позволяют рассматривать пирокатехин s качестве промежуточного продукта.окисления нафталина бактериями второй группы. Следовательно, окисление нафталина культурами группы П начиная со. стадии салициловой кислоти проходит другим путем, минуя пирокатехин.

При окислении салициловой кислоты суспензией отмытых клеток бактерий этой группы в реакционной смеси была обнаружена гентизиновая кислота. Кроме того отмытые клетки и бесклеточные экстракты всех 34 штаммов бактерий группы П в отличие от культур первой группы окисляли без лаг-иеряода гентизиновую кислоту (рис. I а,б). На основании этих данных был сделан вывод, что бактерии группы П осуществляют окисление салицилата через гентизиновую кислоту.

В свою очередь, интенсивное окисление малеилпировиноградной кислоты культурами второй группы, внращенными на среде I с геніизи-натоц (рис. I б), указывает на то, что катаболизм гентизинової! кислоты в данном случае протекает по известной схеме ( Lack, 1959; Sugiyama et al.,1960).

Полученные нами экспериментальные данные позволяют предложить г'.ледувдую схему катаболизма нафталина бактерия«» группы П;

СО

нафталин

1,2-дигидро-1,2-диоксянафталин

ОН

1,2-днокси-нафталин

^ ОН

у-сот

ЦИС-О-ОКСИ-

бенэаль-пируват

О

сом

СОСОШ

ОН

Ыалеилпиро-

внноградная кислота

О^сно О-соон но^^-

-Ш

-сосйГ

Салициловый альдегид

НООС

салициловая кислота

СОСООН н00е^СН

НС ^ ХОШ

Фумарил-пируват

Фумаровая кислота

гентизиновая кислота

СН, I 5 СО I

+ СОСН

Пировино-градная кислота

Отличие выявленного нами пути катаболизма нафталина от общеизвестной схемы заключается в наличии альтернативного пути окисления салициловой кислоты, протекавшего через гентизиновую кислоту и исключающего возможность образования пирокатехина в качестве промежуточного продукта.

ВЛИЯНИЕ УСЛОВИЙ СРКДЫ НА ТРАНСФОРМАЦІЮ НАФТАЛИНА БАКТЕРИЯМИ 1-ой и П-ой ГРУПП

Влияние начальной концентрации субстрата

Изучение влияния исходной концентрации нафталина на содержание окисленных продуктов в культурадьной жидкости показало, что варьирование начальной концентрации окисляемого субстрата в пределах 0,1-1*0 % приводит к непропорциональному изменению содержания салициловой и гентизиновой кислот ( табл. I). В вариантах о I г/л нафталина в культуральной жидкости обнаруживались лишь следы окисленных продуктор.

Таблица I. Влияние начальной концентрации нафталина на содержание окисленных продуктов, аккумулируемых в культуральной жидкости

Нафталин Продукты окисления нафталина в точках максимальной концентрации

г/л Бактерии 1-ой группы Салициловая кислота Бактерии"П-ой группы Гентизиновая и салициловая кислоты

• г/л г-- % г/л %

I 5 10 15

следы следы

1,5 30 2,5; 0,1 50; 2

6,0 60 6,5; 0,5 65; 5

6,0 10 6,5; • 0,5 43,3; 3,3

Максимальное накопление окисленных продуктов наблюдалось в опытах с1% нафталина. Дальнейшее увеличение исходной концентрации нафталина до 1,5 % ( 15 г/л) не влияло на содержание салициловой и гентизиновой кислот.

Адсорбция продуктов трансформации нафталина ионообменной смолов

Вопросы адсорбции микроорганизмов или продуктов их жизнедеятельности различными адсорбентами нашли широкое освеяевне в литературе (Звягинцев, 1973). В микробиологической практике широко используются новообменные смолы, зачастую позволяющие осуществлять регуляцию ферментативных процессов. Роль ионообменных смол при этом может быть различной: регулирование рН, дозируемое введение субстратов, удаление из среды токсичных для микроорганизмов Продуктов ( Raymond et al.f 1969).

Изучение возможности удаления из культуральной жидкости продуктов трансформации нафталина путем адсорбции их на конообменнике показало, что салициловая и гентизивовая киолоты хорошо адсорбируются на анионообменной смоле Амберлит IB -45.

При этом содержание салициловой кислоты в опытах о культурами группы I возрастало с 6,0 г/л ( без смолы) до 9,2 г/я (со смолой).

В аналогичных условиях с бактериями второй группы наблюдалось увеличение выхода гентиэиновой кислоты с 6,5 г/л до 10 г/л. Учиты-* вая присутствие салициловой кислоты в этом случае общее содержание окисленных продуктов возрастало о 7 г/л ( без смолы) до II г/л ( в опытах со смолой). ...

Следовательно, адсорбция салициловой в гентигиновой кислот анионообменной смолой предотвращает возможность их дальнейшего окисления микроорганизмами. Вследствие этого возрастает выход как салициловой, так и гентиэиновой кислот.

Влияние металлов

Известно, что ключевые ферменты, участвующие в катаболизме ароматических соединений, являются метадлоэнзимами ( Hayaiehl , 1974). Показано также влияние различных металлов на ход окислительных превращений ароматических субстратов, осуществляемых микроорганизмами ( (Jurphy, stone, 1955). Нами исследовалась роль

Саг+, Kg2+, Нп2т, в5+, сиг+ и Рвг+ в процессе трансформации нафталина представителями обеих групп лсевдоыонад.

При этом было обнаружена, что отсутствие в среде Са в 2,53,0 раза снижало содержание продуктов трансформации нафталина. При удалении из среды Не содержание салицилата и гентиаината уменьшалось соответственно в 1*5 и 1,2 раза. Отсутствие в ореде Мп существенно не влияло на количество аккумулируемых продуктов.

Изучение влияния в и Си на процесс окисления нафталина бактериями группы I показало, что оба эти элемента в определенных концентрациях способствуют анкумуляции салицилата в культуральной жидкости. В частности, введение в среду В и Си в концентрации 0,1 иг % приводило к двукратному увеличению содержания салицилата. Однако увеличение концентрации этих элементов в ореде до;',1 мг % вызывало снижение количества аккумулируемого салицилата в 1,6 раза.

Отсутствие в и Си в ореде не оказывало существенного влияния на аг'зумуляцип гентизиновой кислоты в процессе трансформации нафталина бактериями второй группы. Вместе с тем, наличие этих элементов в среде в концентрации выше 0,1 мг % также приводило к заметному снижение оодержания гептизиновой кислоты в культуральиоИ жадное ти.

При удалении 7« отсутствовал рост культур из обеих групп на среде о нафталином. При атом в культуральной жидкости не было обнаружено каких-либо продуктов окисления нафталина.

Эти результаты противоречат данным Мэрфи и Стоуна ( МигрЪу , 8*опа, 1955), показавшим что при отсутствии Рег+ окисление нафталина Рвеийошопае ер. идет до 1,2-нафтохннона. Авторы осуществляли трансформацию нафталина в среде, приготовленной на дистиллированной воде. Дополнительная очистка среды от Рв2+отсутствовала.

Проведение трансформации нафталина с помощьв бактерий обеих групп в аналогичных условиях вызывало окрашивание культуральной жидкости в оранжево-красный цвет. Рост культур при атом отсутствовал. Вещество, ответственное за окрашивание ореды, было выделено нами и идентифицировано как 1,2-нафтохинон.

Следовательно, можно считать, что наличие следовых количеств Рег* в среде, обусловливает частичное окисление нафталина до 1,2-нафтохинона. Однако тщательная очистка среды от приводит к

полной остановке реакций ферментативного окисления нафталина.

5 овете современных представлений о свойствах некоторых оксн-геназ, как железозависимых ферментах { НауаАвЫ» 1974), полученные данные можно объяснить отсутствием нафталинокоигеяазяой актив-нооти при удалении ■ из среды.

Влияние рН

Изучение влияния рН среды на процесс окисления нафталина бактериями обеих групп показало зависимость трансформация от этого фактора.

Максимальное содержание салициловой (6 г/л) и гентизиновой (6,5 г/л) кислот наблюдалось в интервале рН 6,5-7,5.

Снижение рН среды ниже 5,0 полностью подавляло процесо окисления нафталина бактериями обеих групп.

В условиях периодического культивирования процесс трансформации цафталина сопровождается пониканием рН среды ниже оптимальной области, вследствие накопления в кулыуральной жидкости кислых продуктов.

Изучение возможности регулирования рН с помощью стандартных буферных систем (0,241 трис~НС1, 1/15 М фосфатный буфер) показало, что буферная емкость этих систем недостаточна для стабилизации рН в оптимальной области. *

Наиболее удавл©творительные результаты были получены при использовании фосфатного буфера, в котором отношение Яа^нро^ :КН£?0^ составляло 10:1. При атом рУ кулыуральной жидкости в период максимальной аккумуляции салицилата и гентиэината находилась в пределах ) 7,0-6,5.

Влияние источников азота

Исследование влияния форм азота на процесс окисления нафталина бактериями обеих групп показало большую эффективность нитратных форы по сравнению о аммонийными. Содержание продуктов трансформации нафталина в куль-?уральной жидкости с нитратами в 2,0-2,5 раза превышало их концентрацию в опытах о аммонийными формами азота.

При использовании В качестве источника азота мочевины крона снижения выхода окисленных продуктов наблюдалось значительное увеличение С в 5-6 pas) лаг-фазы, Кроме того, ряд штаммов совершенно не испольэовали мочевину, как источник азота.

ТРАНСФОРМАЦИЯ ДОДІЕТИЛНАФТАШОВ

Известно, что существует десять изомеров диматшшафталинов (ДМН), отличающихся положением СН^-групп в нафталиновом ядре ' (Доналнсон. 1963).

Данные, полученные нами, показали, что лишь три изомера ДМН (1,2-; 1,3- и 2,3-) могут служить источниками углерода для исследуемых нафталинокиоляющих бактерий. При этой величина оптической плотности нм) культур в стационарной фаге роста на 3 ми

этих субстратах была почти в 6 раз ниже по сравнению с ростом на нафталине.

Музейные штаммы бактерий рода Paeudomoiwa, не расту awe на нафталине, не использовали ни один из ДМН в качества источника углерода.

Работами ряда исследователей на примерах трансформации стероидов ( Dodeoa at al., I960; Коган и др., 1965), бензондных соединений ( ТаЪак at al^, 1964) показано влияние структуры траасфорин- . руемого субстрата на характер и направление процессов трансформации. Исследования такого рода имеют большое значение. Они поеволяют перейти в теоретическим построениям, объединяющим тот большой экспериментальный материал, который накопился в настоящее время в области микробиологической трансформации различных соединений. ДМН, представляющие собой изомеры, отличающиеся положением СНд-групп в нафталиновом ядре, являются удобными моделями для подобных наследований.

Ранее было установлено ( Raymond et al., 1967), что при трансформации ДМН Носатdie coralline происходит окисление одной СН3- " групп в' р -положении. ДМН с иетилъныуи группами в =с -положении при этом не подвергались окислению. В этой работе впервые было показано влияние особенностей структуры ДМН на атакуемость микро-

организмами соответствующих изомеров. Однако до сих пор нет ясности, какую роль играет положение заместителей в нафталиновом ядре на направленность ферментативных реакций, о помощью которых осуществляется трансформация ДМН.

В свои очередь построение гипотез, проливавших свет на »тот вопрос, невозможно без изучение путей трансформации ДНИ,

В этой связи нами было предпринято исследование последовательностей окислительных превращений ДЫН с метильными группами в различных положениях. Этой работе предшествовало изучение продуктов трансформации ДШ о целью идентификации их методами УФ-, ИК-, Ш!Р-опектроскошш и маос-спектроыетрии.

А. Пути трансформации ДНИ о СН^-группамн в ы, -положении

Трансформация 1,8-ДЦИ

В качестве продуктов микробиологической трансфор-ациии Х^--ДШ были выделены и идентифицированы следующие соединения! 1-метил--8-окоимехилнафталин (I), 1-метил-8-нафтойная кислота (П)( 1,8--диоксиметиднафталин (И), 1,8-нафталид (1У) и ангидрид 1,8-нафта-линдикарбоновой' кислоты (У). Эти же соединения образуются при окислении!,8-ДМН в течение Ю часов бесклеточными экстрактами из нафталикокисляющих бактерий рода Рееийопопав. При сокращении времени ферментативной реакции до 2-х часов в реакционной смесх был обнаружен лишь продукт I.

Использование соединения I в качестве исходного субстрата для ферментативного окисления приводило к образованно всех остальных продуктов. Следовательно, первым продуктом трансформации 1,8-ДИН является Х-метил-8-оксиметилнафталин.

При использовании в качестве исходного субстрата соединения П в реакционной смеси, содержащей бсзклеточный экстракт или отмытые клетки, не удалось обнаружить продуктов его дальнейшего окисления. Аналогичные результаты были получены при использовании соединений. 1У и У в качестве исходных субстратов для ферментативных реакций.

Окисление соединения И приводило к образованию продуктов 1У

и у.

На основании этих данных нами предлагается следующая схема Агробиологического окислення I,8-ДМН:

н3Ссн3 нш2с сн5 ноос снз

1,8- ДИН

г

нон^з СН2Ш

JJ

ш

нон^з соон

U і

"ноос соон"

й2<ґ Vо

ІУ

о / \ сьс с»о

■to

На этой схеме в скобках указаны продукты, которые нами не была выделены. Однако, согласно химическим представлениям, выделение продуктов ІУ и У свидетельствует о том, что эти соединения образуются из соответствующих кислот. Известно (Weeks et al., 1970), что циклизация зтих кислот легко проходит при подкиолении среды. Вероятно, такая реакция имеет место в процессе выделения продуктов трансформации методом ТСХ в условиях низкой рН.

Трансформация 1,4-ДМН

При окислении 1,4-ДОН отмытыми клетками или бесклеточными экстрактами были выделены и идентифицированы следующие соединения:

І-метил-4-оксиметнлнафталин (УІ), І-метил-4-вафтойвая кислота (711)« 1,4-двоксиметилнафталин (УШ) и І-оксимеіил-4-нафїоИная киолота (IX)

Последовательное использование гтих соединений к качестве исходных субстратов для ферментативных реакций показало, что окисление продукта УІ приводит к образовании всех остальных продуктов* Иг продукта УШ образуется только одно соединение - IX. Соединения УП и IX не подвергается дальнейвему окислению.

Согласно этим данным трансформацию 1,4-ДМИ можно представить - виде следующей схемы:

сн3

сф-

сн3

1,4-ДИН

УВ IX

Трансформация I,5-ДМН

В тшчестве продуктов трансформации 1,5-ДШ были идентифицированы такие соединения, как Х-мвтил-5-нафтойная кислота (X), 1-оксиметил-5-нафтоЙнан ккслота (XI) и I,5-нафталиндиу;арбоновая киолота (ХП).

При окислении продукта XI бесклеточыымн экстрактами и отмытыми клетками образуется соединение ХП, которое (как и соединенна X ) не подвергается дальнейшему окислению.

С учетом в*я* данных к по аналогам о результатами, получению» при изучении последовательностей окисления 1,8- а 1,4-ДНН, схему траноформацяш 1,5-ДИН косно представить следующим образом:

Б. Пут» трансформации ДИ с СН3-гру1шами в р -но по ганки

Трансформация 2,6-ДМН

В результате идентификации продуктов трансформаций 2,6-ДШ было установлено наличие следующих соединений: б-метил-2-нафтойной кислоты (ХШ), 6-оксииетил-2-нафтаЙно8 кислоты (XIX) и 2,6-вафталяп-дикарбояовой кислоты (ХУ). Ферментативное окисление продукта Х1У приводило в образованию соединения ХУ. Продукты ХШ и XX не подвергались дальнейвему окислению,

В этом случае, также как и при окислении 1,5-ДШ в реакционной омеси не удалось обнаружить и этил-оде ии е тялнафтад ия и дяокси-метилнафталин. По-видииому, это связано с особенностями структуры обоих изомеров, обусловливающими быстротечность ферментативных реакций при окислении указанных промежуточных продуктов.

Следовательно, схему микробиологической трансформации 2,6-ДМН можно яредсташть следующий образом;

соон

2,6-ДШ

XIII

ООН

СОСИ

££Г

CHgOH

ноя2с

нон2о

XIV

IT

Трансформация 2,3-ДМЯ

В качества продуктов трансформации 2,3-ДМН были выделены и идентифицированы два основных соединения: З-метил-2-нафтойная кислота (ХЛ) и ^,5-ДИметил-2-оксибензойная кислота (ХУЛ).

Кроме этих продуктов на хроматограммах было обнаружено несколько пятен, свидетельствующих о наличии других окисленных производных 2,3-ДМН. Однако, чрезвычайно низкое содержание этих продуктов. в реакционной смеси не позволило нам идентифицировать их.

В опытах с отмытыми клетками и бесклеточными экстрактами соединения ХУХ и ХУЛ не подвергались дальнейшему окислению.-

Соединение ХУ1 квляегся продуктом микробиологического окисления одной СН3-грушш в молекуле 2,3-ДМН. Наличие соединения ХУЛ ("диметилсалициловой" кисеты) в качестве продукта трансформации 2,3-ДМН- свидетельствует о существовании второгс пути "окисления этого изомера, протекающего с разрывом незамещенного кольца нафталинового ядра.

С другой емгерош, образование "диметилсалициловой" кислоты в процессе трансформации 2,3-ДМН дает основание считать, что расщеп-

- гг -

ленив незамещенного кольца это^о изомер происходит аналогично тому, как это имеет ыесто при микробиологическом окислении нафталина ( Етгапа, 196^) И монометилнафталинов ( Тгессвп!, Ваве1, 1962).

С учетом этих данных окисление 2,3-ДИН можно представить г виде следуввей схемы:

ХУЛ

Пути трансформации ДЇШ с СН5-грунпами в об - и Ь -положениях

Трансформация 1,6-ДМН

Идентификация продуктов трансформации 1,6-ДМН поэвелила установить наличие следующих соединений: б-иетил-1-оксиметилнафталива (ЛУІЯ), в-метил-1-иафтойной кислоты ^ХІХ), I,6-диокспцетилнафталина ()Ц} и б-оксииатил-Г-нафтойн^й кислоты (XXI).

и результате окисления соединении ХУШ имело цесто образование продуктов XIX, XX и XXI. Окисление продукта XX приводило к образовали соединения XXI. Продукты XIX и XXI не подвергались дальиеб-

ЧІІГМ.У I) К'і О Я »3111110.

Эти даини« позволила нрпдогаьить слкдуювдш схему трансформации 1,6-ДМИ:

СЫ3 СН20Н соси

н,с

XVIII

XIX

сн2он coos

XX XXI

Трансформация 1»7-ДШ

В результата анализа продуктов трансформации 1,7-ДЦИ били идентифицированы следующие соединения: 7-иетил-1-оксиметилнафталин (ХКП), 7-метил-1~нафтоЙная кислота (IXHi), 1-метил-7-оксиметил-иаф'*адин (ХХ1У) и 1-ыетил-7-нафтоЙная кислота (ХХУ).

Последовательное окисление продуктов ХХП и ХХ1У приводило к образованию соответственно соединений ХХШ и ХХУ, которые не подвергались дальнейшему ферментативному окислению.

Согласно полученный данным можно считать, .что микробиологическое окисление 1,7-ДШ! протекает по следующей схеме:

Н3С

СН3 СН20Н ссюн

-об — "5C-oi

1,7-ДМН

I t

.ш

ххы

нш2с

са,

сн3

10°ХЙ

ХХ1У XXI

Особенность» этой схемы является отсутствие в ней стадии образования диоксиметилнафталина и оксиметилнафтойньа кислот.

Трасфораадия 1,2-ДМН

Следующие соединения были идентифицирован^ как продукты трансформации 1,2-ДИН: 2-метил-1-оксиметилнафталин (ХОТ), 2-метил-1-яафтойная кислота {КПП), 1,2-диоксиметилдафталин (ХХУШ), 2-окси-метил-1-нафтойная кислота (XXIX), 2-окси-5,б-диыегид-бекзойнан кислота (XXX) и 2-оксм-3*4-дим8тилбензоЙвая кислота (XXXI).

Последовательное окисление этих соединений показало, что продукт ХХУ1 окисляется с образованием продуктов ХХУП-2Х1Х. В результате окиоления соединения ХХУШ образуется только одни продукт: XXIX.

Соединения ХХУП, XXIX, XXX и XXXI не подвергались дальнейшему окислению.

Как видно из этих данных, окисление продуктов трансформации 1,2-ДМН, содержащих нафталиновое ядро, приводит к последовательности, характерной для трансформации ряда других изомеров: 1,4-

и 1,6-ДШ.

С другой стороны, идентификация соединений XXX и XXXI в качестве продуктов микробиологической трансформации 1,2-ДМН свидетельствует о расщеплении незамещенного кольца нафталинового ядра.

- гъ -

Известно ( Гіауіев, Вуаав, 1964), что при катаболизме нафталина карбоксильная группа салициловой кислоты образуется из четвертого углеродного атома нафталинового ядра. При этом начальная атака на молекулу нафталина происходит по связи 1-2.

С учетом этих данных, а также исходя из того факта, что в качестве продуктов трансформации 1,2-ДМН образуются соединения XXX и ХХХХ, представляющие собой изомеры "диметилсалициловых" кислот, отличающиеся положением СООН-группы в ароматическом кольце, "окно считать, что первичная атака на незамещенное кольцо 1,2-ДМН в одном случае идет по связи 5-6, а в другом - по связи 7-8. В результате,в первом случае образуется 1,2-диметил-5,6-диоксинафталин, который подвергается расщеплению с образованием, в конечном итоге, соединения'XXX В случае гидроксилирования незамещенного кольца I,2-ДШ по связи ?-в должно иметь место образование 1,2-диметил-7,8-

дкоксииафталйна, дальнейший катаболизм которого приводит к появлению в реакционной смеси продукта XXXI.

Следовательно, схему микробиологической трансформации 1,2-ДМН можно представить следующим образом:

ч

ОН

XXX

\

\

ч

XXXI

Трансформация 1,3-ДМН

В процессе трансформации 1,3-ДШ в реакционной смеси накапливается два продукта: 2-окси-3,5-диметилбензоЙная кислота (ХХХП) а лактов 2-окси-4-иетвл-б-оксиметилбензойная кислоты (ХХХШ).

Оба соединения не подвергаются дальнейшему окислению отмытыми клетками или бесклеточныии экстрактами.

Принимая во внимание характер расщепления нафталинового ядра { ВаУ1ей, Етапв, 1964) и наличие соединения ХХХП в качестве продукта окисления исходного субстрата, можно считать, что гидроксилиро-вание незамещенного кольца 1,3-ДМН в атом случае идет по связи 7-8 о образованием 1,3-днметия-7,8-диоксинафталина. В свою очередь, катаболизм последнего соединения приводит к образованию продукта ХХХП.

С. другой стороны, исходя из химических представлений (Ва1а-еиЬгатап1уап, 1966) следует признать, что образование лактона ХХХШ возможно лишь при наличии в о-положении ароматического кольца групп

-С00Н и сн2ш.

Очевидно, что окоиметильная группа в данном случае получается в результате ферментативного огчсления СН^группы ( в 6-ом положении) 2-окси-4,6~димепглбензойной кислоты.

В свою очередь, образование 2-окси-4,6-динетилбенэоЬной кислоты в результате трансформации 1,3-ДМН дает основание считать, что начальное гидроксилированяе незамещенного кольца исходного субстрата идет по связи 5-6.

Следовательно, схема трансформации 1,3-ДОН должна включать в себя два альтернативних пути:

СН,

1,3-дан

он сн

сн,

HOOG.

сн,

»A

ВООС-^^-СН,

хххп

'"Г44!

ВО

ВШ20 ROOC

Vi;

L

о- сн,

I I 2

HO^-^CHj xxxffl'

Таким образом, изучение путей трансформации ДШ показало о одной стороны, наличие общих моментов, связанных с окислением СН^-групп, а с другой - отличительных особенностей в схемах окисления этих соединений.

Обнаруженные различив путей трансформации дин трудно объяснить лишь Л. - или уй -положением СН^-групп в нафталиновом ядре, как это было сделано Раймондом о соавторами ( Каутоа<1 в* а1., 1964).

Нави исследования показали, что пути трансформации изомеров с .СНз-группами в <с - или р -положениях могут бьиь аналогичны. Примером этого может служить окисление 1,5- и 2,6-ДИШ.

Кроме того, трансформация ДШ, имеющих CHj-группы одновременно В o¿ - И yi -положениях может протекать подобно окислению oí - или -замещенных изомеров. Иллюстрацией этому могут быть схемы трансформации 1,6- и 1,4-ДМН, или 1,6- и 2,6-ДШ.

С другой стороны, гомологичные изоьеры ( имеющие СН^-группы в оС - или р -положениях) могут иметь различные пути микробиологического окисления. Одним из таких примеров является трансформация 2,6- и 2,3-ДМН-изоыеров, содержащих СН^-группы в -положениях.

Принимая во внимание тот факт, что глубокому окислению, протекающему с расщеплением нафталинового ядра, подвергаются лишь те изомеры, которые имеют незамещенное кольцо <2,3-; 1,2- и 1,3--ДЫН), можно было бы предположить наличие в этом определенной связи.

Однако из этого "правила" выпадает пример трансформации 1,4-ДМН. Этот изомер содержит также незамещенное кольцо, но окисление его протекает без расщепления нафталинового ядра.

Известно ( Pallan», Pullman, 1955), что ферментативное дигидроксилирование нафталинового ядра осуществляется по самой короткой связи. Следовательно, если бы трансформация 1,4-ДМН протекала с расщеплением незамещенного кольца, то взаимодействие фермента с субстратом проходило бы по связи 5-6 или 7-6 ( Rogoff, 1962), Однако, такой путь трансформации в случае 1,4-Д1Ш экспериментально не показан.

Отсутствие гидроксилирования незамещенного кольца 1,4-ДМН по связи 5-6 или 7-8 можно было бы объяснить наличием стерических помех взаимодействию фермента с субстратом со стороны CHj-rpynn сопряженного кольца.

Однако, возможность атаки по связи 7-8 на неэамещевзое кольцо 1,2- и 1,3-ДШ не дает основания для подобного объяснения.

Можно предположить, что введение CRj-rpynn в нафталиновое ядро вносит измене! зя в электронные плотности молекулы. Причем, эти изменения; вероятно, захватывают не только области присоединения заместителей к ядру ( Rogoff, 1962), но и распространяются на другие связи в молекулах ДИН.

По-видимому, степень перераспределений электронных tUOTtiOCTött молекулы зависит от положения заместителей (CHj-rpynn) в нафталиновом ядре.

В связи о этим, можно полагать, что глубокое окисление Д1Ш наблюдается в тех случаях, когда величины электронных плотностей коротких связей незамещенного »сольца близки к величине электронной плотности, характерной для 1-2 связи нафталина. Вследствие этого возникает возможность диг идроке иди ров а ви я незамещенного кольца ДШ по связи 5-6 или 7-8 с образованием соответствующих диметил-замещенных диоксивафталинов.

В свою очередь, образование диокоипроиэводных является обязательным условием дальнейшего катаболизма ароматических соединений, протекающего о расщеплением ароматического кольца ( Розанова,1967;

Dagley,I9?I). Свидетельством такого пути окисления может служить наличие "диметилсалициловах кислот в качестве продуктов трансформации 2,3-, 1,2- и 1,3-ДМН.

В тех случаях, когда величины электронных плотностей коротких связей в молекулах ДШ отличаются от величины влелтровной плотности 1-2 связи нафталина, взаимодействие фермента, осуществляющего дигидроксилирбванае незамещенного кольца по этим связям, по-видимому, невозможно. В этих случаях трансформация ДЫН ограничена последовательным окислением CH5-rpytm, протекающим беа расщепления нафталинового ядра. Примерами этого могут быть схемы окисления 1,8-, I,--, 1,4-, 1,6-, 1,7- и 2,6-ДНН.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что способность использовать нафталин как единственный источник углерода среди изученных бактерий рода Pseudomo пае присуща липь тем культурам, которые была выделены из почв, подверженных воздействию ртого углеводорода.

2. Установлен новый путь микробиологической трансформации нафталина, включающий окисление салициловой кислоты через гентизиновую кислоту и исключающий возможность образования пирокатехина.

3. Количество салициловой и гентиэиновой кислот, накапливав' пихся в культуральной жидкости в качестве продукт.в трансформации нафталина, зависит от концентрации трансформируемого субстрата,

формы азота в среде, рН, наличия ряда металлов. Ре++ явпяетоя обязательным компонентом среди для осуществления трансформации нафталина бактериями рода Раеийотоаав.

4. Доказана возможность получения с высоким выходом салициловой кислота ( 9,2 г/л ) или гентизииовой ( 10,0 г/л ) путем микробиологической трансформации нафталина (I %) при непрерывном удалении из культуральной жидкости продуктов трансформации о помощью иоло-Обменной смолы.

5. Впервые установлены пути микробиологической трансформации дпметилнафгалииов (ДШ). Показано влияние положения СНд-грушш в нафталиновом ядре па направленность трансформационных процессов:

а) трансформация'1,8-; I;5—; 1,4-; 1,6- и 2,6-ЛМН включает в себя последовательное окисление Щд-группы с образоваляем в конечном счете оксиметилиафтойных или нафталиндикарбоповых кислот;

б) трансформация 1,7-ЛЩ ограничена альтерната гтм окислением СЕд-грутш с образованием изомеров метилнафгойннх кислот;

в) трансформация 1,2- й 2,3-ДМН наряду о окислением СНд-групп в нафталиновой ядре затрагивает расщепление незамещенного кольца с образовавшем "дЕметшгеалщилоЕЦх" кислот в качестве конечных цродуктов;

г) трансформация 1,3-ДМН протекает с расщеплением -незамещенного кольца с образованием 2-окси-З,5-доплетшн5ензоЙной кислоты и лактош 2-окси-4нигетил-6-оксиметилбензоАноД кислоты.

6. В результате изучения микробиологической трансформации ДМН получены продукты, представляющие практический интерес: метил-оксиметилнафталины, диоксиметилнафталины, метилнафгойные, кислоты, оксиметилнафтойные кислоты и нафталшдикарбоновые кислоты.

Основное содержание диссертации отражено в следующих работах:

1. Старовойтов И.И, 1971, -Окисление алкилнафталинов бактериями рода Рзвийоаюлав .Сб."Биология и научно-технический прогресс", 177-180, Цуишно-на-Оке.

2. Скрябин ГХ, Старовойтов И.И., Головлева Л.А. 1972. -Микробиологический способ получения 2,6-нафгалшдикарбопорой молоты в соокислительных условиях. Докл.АН СССР, №4, 973-574.

3. Старовойтов И.И., Головлева Л.А., Скрябин Г.К., Кулаков B.H., Андреев Л.В. 1973. Способ получения 2,6-нафталиндикарбоновой кислоты. Авт.са-во Я 370228. Бол. "Открытия, изобретения, пром. образцы, товарные знаки" J6II, 76.

4. Старовойтов И.И,, Пширков C.D., Нефедова М.Ю., Яковлев Г. И,, Аданш В.М., Скрябин Г,К. 1973. Микробиологическое окисление 1,5-диметилнафгалша. Докл.АН СССР, 213, К б, I2I0-I2I2.

5. Скрябин Г.К., Старовойтов И.И,, Пширков С.Ю., Нефедова Ы.Ю,, Яковлев Г.И., Аданин В.М. 1975. -Способ получения 6-оксиметил--2-нафтоЙной кислоты. Авт. св-во № 463702. Boat. "Открытия, изобретения, пром.обраэвд, товарные знаки", № 10, 63.

6. Скрябин Г.К., Старовойтов И.И., Пширков С.10., Нефедова M.D., Червин И.И. Зякун A.M. 1973. -Способ получения 6-метил-2-нафтойной кислоты. Заявка № 1918678/28-13, положительное решение от 24.04.1974.

. ?. Старовойтов И.И., Пширков С.Ю., Нефедова М.Ю., Яковлев Г.И., Зякун A.M., Аданин В.М, 1974. -Изучение продуктов микробиологической трансформации I, в-диметшшафталдаа. Изв. АН СССР, сер.хим., 10, 2338-2345.

8. Скрябин Г.К., Старовойтов И.И. 1975. -Альтернативный путь катаболизма нафталина Pseudomonaa fluorescens .Докл.АН СССР, 221,

: Л» 2, 493-495.

9. Старовойтов И.И., Пширков С.Ю., Нефедова М.Ю,, Зякун A.M., Яковлев Г.И. -Продукты микробиологической трансформации 1,4-дшетилнафталина. Изв.АН СССР, сер.хим. ( в печати ).

10. Старовойтов И.И., Нефедова М.Ю., Яковлев Т.Ц,, Зякун A.M., Аданин В.М, - Гентазиновая кислота - продукт микробиологического окисления нафталина. Изв. АН СССР, сер.хим. ( в печати ).

Материалы диссертации докладывались на конференции молодых ученых научного центра биологических исследований ( Лущино-на--Ске, 1971 ) и на Всесоюзной конференции "Биосинтез? физиологичео-ки активных веществ на углеводородах " { Пущино-на-Оке, I97t ).

ЗЛОМІ WM АН СССР M 14 , тщЗОО , 1975г