Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты"

На правах рукописи

СОКОЛОВА Татьяна Геннадиевна

ТЕРМОФИЛЬНЫЕ ГИДРОГЕНОГЕННЫЕ КАРБОКСИДОТРОФНЫЕ ПРОКАРИОТЫ

Специальность 03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Москва-2008

003446885

Работа выполнена в Институте микробиологии им С Н Виноградского РАН

Научные консультанты:

доктор биологических наук Е А Бонч-Осмоловская академик РАН, профессор Г А Заварзин

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

доктор биологических наук, профессор

доктор биологических наук, профессор

АН Ножевникова ЮА Троценко Р Н Ивановский

Ведущая организация:

Факультет почвоведения МГУ имени М В Ломоносова, г Москва

Защита диссертации состоится " 6 " октября 2008 г в 12 часов на заседании Диссертационного совета Д 002 224 01 при Институте микробиологии им СН Виноградского РАН по адресу 117312, Москва, проспект 60-летия Октября, д 7, корп 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии им С Н Виноградского РАН

Автореферат диссертации разослан " " сентября 2008 г

Отзывы в двух экземплярах, заверенные печатью, просим направлять по адресу 117312 Москва, проспект 60-летия Октября, д 7, кор 2, Институт микробиологии им С Н Виноградского РАН, Ученому секретарю диссертационного совета Т В Хижняк Факс (499) 135-65-30

Ученый секретарь Диссертационного совета, кандидат биологических наук

Т В Хижняк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Оксид углерода - СО - широко известен как высоко токсичный газ для человека и животных СО - один из важных малых газов атмосферы Он присутствует в атмосфере в концентрации 0 06-0 15 ppm (IPCC) Значение СО определяется тем, что его участие в фотохимических реакциях в тропосфере приводит к усилению парникового эффекта (Crutzen, 1974, Bergamaschi et al, 2000). Предполагается, что атмосфера ранней Земли содержала СО в значительной концентрации (Holland, 1984; Kasting, 1990, Kharecha et al, 2005), ряд гипотез приписывает СО важную роль в происхождении жизни (Pinto et al, 1980, Chameides and Walker, 1981, Wachtershauser 1997, Miyakawa et al, 2002; Martin and Rüssel 2004) Аналогами древних биоценозов считаются современные сообщества гидротерм (Заварзин, 1984, Stetter, 2006) Источниками СО в гидротермах являются вулканические газы, которые могут содержать до нескольких % СО по объему (Соколов, 1971, Symonds et al, 1994) СО также может быть продуктом термического разложения органического вещества (Conrad and Seiler, 1985, Schade et al, 1999, Hellebrand and Schade, 2008) и промежуточным метаболитом микробного синтеза или разложения ацетил-КоА по пути Вуда-Льюнгдаля (Conrad and Thauer, 1983, Diekert et al,1984, Eikmans et al, 1985, Ragsdale, 2004)

Окисление СО микроорганизмами было открыто в начале прошлого века (Bejerinck and van Delden, 1903, Kaserer, 1906) Аэробное окисление CO карбоксидобактериями по реакции 2СО + 02 = 2С02 подробно изучено (Ножевникова, 1974, Заварзин, 1977; Meyer et al, 1986, Conrad, 1996, King and Weber, 2007) Среди аэробных карбоксидобактерий известно несколько умеренных термофилов (Lyons et al, 1984; Meyer and Schlegel, 1983, Krueger and Meyer 1984, Gadkan et al, 1990) До начала нашей работы было известно, что некоторые анаэробы - ацетогены, метаногены и сульфатредукторы - могут использовать СО как субстрат для роста с образованием ацетата, метана или сероводорода, соответственно Среди них было известно лишь несколько термофильных представителей (Savage et al, 1987, Diekert and Thauer, 1978, Daniel et al, 1990, Daniels et al, 1977) Кроме того, был выделен один штамм мезофильной фототрофной несерной пурпурной бактерии Rhodocyclus (Rubrivivax) gelatinosus, способный расти в темноте в анаэробных условиях за счет окисления СО до С02, сопряженного с восстановлением воды до водорода (Uffen, 1983) В 1990 г В А Светличным в гидротермальных местах обитания Курильских островов были обнаружены анаэробные СО-окисляющие бактерии с новым для термофилов типом метаболизма, использовавшие для роста энергию реакции СО + ЩО = С02 + Н2 (AGo= - 20 кДж/моль) (Светличный и др ,

1990, БуеЙюпЬу е! а1, 1991) К началу наших исследований ничего не было известно о филогенетическом и физиологическом разнообразии водородобразующих (гидрогеногенных) СО-окисляющих

(карбоксидотрофных) прокариот, их распространении в гидротермальных местах обитания и роли в микробных сообществах гидротерм

Интерес к термофильным гидрогеногенным карбоксидотрофным прокариотам носит и прикладной характер Гидрогеногенные карбоксидотрофы могут быть использованы для получения высокоочищенного водорода при переработке синтез-газа Синтез-газ, получаемый в результате паровой конверсии природного газа или газификации угля, является наиболее дешевым сырьем для получения водорода и содержит от 29 до 76% водорода и от 5,6 до 60% СО Водород -экологически чистое средство аккумулирования, транспортировки и потребления энергии Переработка синтез-газа с участием микроорганизмов, образующих водород как один из продуктов, может значительно увеличить выход водорода и одновременно избавляет от токсичного компонента - СО Помимо этого, СО-трофы, как и все термофильные микроорганизмы, являются потенциальными источниками новых термостабильных ферментов

Цели и задачи исследования

Целью представленного исследования являлось изучение термофильных гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот их физиологического и филогенетического разнообразия, распространения в различных гидротермальных местах обитания, их роли в микробных сообществах гидротерм

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи

(^характеристика исследуемой группы и определение активностей предполагаемых ключевых ферментов метаболизма СО у термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот,

(2) поиск термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот в разнообразных по физико-химическим параметрам и географическому положению наземных и глубоководных гидротермах,

(3) определение скорости и основных продуктов трансформации СО микробными сообществами горячих источников,

(4) определение численности анаэробных карбоксидотрофных прокариот в горячих источниках,

(5) выделение и характеристика микроорганизмов, осуществляющих анаэробную трансформацию СО в горячих источниках

Научная новизна работы

Впервые с помощью разработанного нами радиоизотопного и хроматографического методов показана высокая активность микробной трансформации СО в наземных гидротермах Определены основные продукты микробной трансформации СО

Показано физиологическое и филогенетическое разнообразие термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, их широкое распространение в разнообразных гидротермальных местах обитания

Описана новая физиологическая группа анаэробных термофильных прокариот Приняты к классификации новый класс, новое семейство, 5 новых родов, 8 новых видов В типе Firmicutes описан новый класс Thermohthobacteria, включающий порядок Thermohthobacteriales семейство Thermohthobacteraceae и новый род Thermohthobacter, содержащий два вида Т carhoxydivorans и Т femreducens Выделены и описаны новые роды Carboxydothermus, Thermincola, Carboxydocella, Thermosinus Выделены гидрогеногенные карбоксидотрофные бактерии рода Dictioglomus и археи типов Euryarchaeota и Crenarchaeota Thermococcus АМ4 и новый вид "Thermofilum carboxydotrophus "

Впервые было показано наличие и высокая активность ферментов метаболического пути Вуда-Льюнгдаля формиатдегидрогеназы, гидрогеназы, СО дегидрогеназы, фолатных соединений в бесклеточном экстракте представителя гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот Carboxydothermus hydrogenoformans Обнаружена высоко термостабильная СО-дегидрогеназа

Практическая значимость работы

Разработан аналитический метод нехроматографического разделения газовой смеси метана и СО, и радиоизотопный метод количественного определения продуктов трансформации СО чистыми культурами карбоксидотрофных термофилов и термофильными микробными сообществами Создана коллекция новых термофильных микроорганизмов, которая может быть использована для целей биотехнологии Экстремально термофильные бактерии и гипертермофильные археи являются потенциальными продуцентами термостабильных ферментов Умеренно термофильные гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты представляют большой интерес как потенциальные агенты для переработки синтез-газа с целью получения водорода

Личный вклад соискателя

Цикл работ, составляющих диссертационную работу, был начат автором как работа на соискание ученой степени кандидата биологических наук под руководством академика РАН профессора Г А Заварзина В дальнейших исследованиях, составляющих данную диссертационную работу, соискателю принадлежит решающая роль в выборе направления исследований, разработке экспериментальных подходов и обобщения полученных результатов Автор принимал личное участие в организации и реализации научных экспедиций в районы гидротермальной активности Баргузинский и Кроноцкий Национальные Заповедники В работах, выполненных в соавторстве, вклад соискателя заключался в непосредственном участии во всех этапах исследования, - от постановки задач и проведения конкретных экспериментов до обсуждения полученных результатов и подготовки их к публикации

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на международных конференциях Thermophiles'98, "Extremophiles 2000", "15th International Symposium of Environmental Biogeochemistry" - 2001, "Thermophiles 2001", «Astrobiology in Russia» - 2002, "Extremophiles 2002", "Extremophiles 2004", "Thermophiles 2005", "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles" - 2005, The 2nd FEMS congress of European microbiologists - 2006, The 11"1 International Symposium on Microbial Ecology - 2006, "Extremophiles 2006", "Thermophiles 2007", The 18th International Symposium on Environmental Biogeochemistry - 2007

Публикации

Материалы диссертации опубликованы в 49 печатных работах, включая 19 экспериментальных работ, 3 главы в Bergey's Manual, 3 обзора, 24 тезисов конференций

Место проведения работы

Работа проводилась с 1991 по 1996 гг в Лаборатории микробных сообществ и с 1996 по 2008 гг в Лаборатории гипертермофильных микробных сообществ Института микробиологии им С Н Виноградского РАН (ИНМИ РАН)

Радиоизотопные исследования проводились в Лаборатории микробиологии и биогеохимии водоемов ИНМИ РАН Секвенирование последовательностей 16S рДНК чистых и накопительных культур выполнялось в Центре «Биоинженерия» РАН, в Центре Морской Биотехнологии, Балтимор, США, факультете биологии Университета Портлэнда, США Электронно-микроскопические исследования чистых культур выполняли в ИНМИ РАН и МГУ им М В Ломоносова

Автор приносит искреннюю благодарность академику РАН ГА Заварзину и дбн ЕА, Бонч-Осмоловской за постоянное внимание, помощь и интерес к работе Автор глубоко благодарен за помощь и поддержку на начальном этапе работы В А Светличному и дбн МА Пушевой Автор выражает глубокую признательность Н А Черных, А В Лебединскому, ТВ Слеповой, НА Кострикиной, ТП Туровой, ТВ Колгановой и А М Лысенко (ИНМИ РАН), д г -м н ГА Карпову (Институт вулканологии и сейсмологии ДВО РАН), а также проф Фрэнку Робу (Центр Морской Биотехнологии, Балтимор, США) за предоставленные пробы из Иеллоустонского Национального Парка и глубоководные пробы из гидротерм Окинавской впадины Автор выражает глубокую признательность всем соавторам за сотрудничество, а также сотрудникам и аспирантам лаборатории гипертермофильных микробных сообществ за дружескую поддержку и участие

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 266 страницах машинописного текста и включает 50 рисунков и 10 таблиц Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 34 русских и 248 английских наименований

Основные защищаемые положения:

(1) термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты широко распространены в наземных и глубоководных гидротермальных местах обитания и составляют существенную часть микробных сообществ гидротерм,

(2) ключевыми ферментами процесса анаэробного окисления СО с образованием водорода являются СО-дегидрогеназы и гидрогеназы, фиксация углерода происходит с участием СО-дегидрогеназы по пути Вуда-Льюнгдаля,

(3) в гидротермальных местах обитания, населенных анаэробными термофильными микробными сообществами, присутствует растворенный СО и идет активный процесс его трансформации, причем основным продуктом является С02,

(4) термофильные гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты разнообразны по фенотипическим свойствам, они не образуют единую филогенетическую группу,

(5) существуют как факультативно, так и облигатно зависящие от СО термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты, в разной степени чувствительные к высоким концентрациям СО

Объекты и методы исследования

Объектами исследования служили микроорганизмы и микробные сообщества, населяющие горячие источники

Пробы воды, ила и бактериальных обрастаний были отобраны из гидротерм Байкальской рифтовой зоны, расположенных на берегу реки Большая, в долине реки Аллы и из горячего источника Гаргинской группы, горячих источников Камчатки, расположенных в кальдере Узон, Долине Гейзеров, в районах вулканов Мутновский и Карымский, наземных и мелководных морских горячих источников острова Кунашир (Курильские острова), из источника, расположенного в гейзерном бассейне Норрис, Иеллоустонский Национальный парк, из горячего источника острова Рауль (архипелаг Кермодек), глубоководных горячих источников Окинавской впадины и Восточно-Тихоокеанского поднятия В наземных источниках температура воды в источниках была от 30 до 97 "С, pH воды от 4,0 до 9,5 Для комплексных исследований трансформации СО радиоизотопными, хроматографическими, молекулярными и культуральными методами были выбраны несколько источников кальдеры Узон Характеристики этих источников приведены в таблице 1

Культивирование накопительных и чистых культур гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот проводили в анаэробно приготовленной жидкой среде (Hungate, 1966, Жилина и Заварзин, 1978) в атмосфере, содержащей от 100 до 5 % СО в смеси с азотом Базовая минеральная среда для культивирования пресноводных нейтрофильных гидрогеногенных карбоксидотрофов имела следующий состав (г/л) NH4C1 - 0,66, MgCl26H20 - 0,16, СаС122Н20 - 0,1, KCl - 0,33, КН2Р04 - 0,33, NaHCOj-0,5 В среду добавляли 1 мл/л раствора витаминов (Wohn et al, 1963), 1 мл/л раствора микроэлементов (Кевбрин и Заварзин, 1992). В среду для культивирования алкалофильных или алкалотолерантных гидрогеногенов добавляли Na2C03 (0,5 г/л). Среду восстанавливали добавлением Na2S 9Н20 (1 г/л) Для культивирования морских организмов использовали базовую среду следующего состава (г/л) NaCl (18), KCl (0,7), MgS04 (3,9), СаС12 2НгО (0,4), NH4C1 (0,3), Na2HP04 (0,15), Na2Si03 (0,03), NaHC03 (0,5), дрожжевой экстракт (Difco) (0,05), резазурин (0,002) В некоторых случаях в среду вносили дрожжевой экстракт (0,2 г/л), ацетат натрия (0,2 г/л), лактат натрия (0,2 г/л), пируват (0,2 г/л) Способность выделенных штаммов расти на органических субстратах проверяли в атмосфере азота. Потенциальные субстраты роста, доноры и акцепторы электронов вносили в конечной концентрации 2 г/л S°, Fe(III) в виде аморфного оксида или цитрата и 9,10-антрахинондисульфонат натрия (AQDS) вносили до конечных концентраций 10 г/л, 90 мМ, 20 мМ и 20 мМ, соответственно Среду готовили анаэробно, с кипячением и последующим охлаждением

под током чистого N2, с добавлением резазурина и, в качестве восстановителя, №2Б9Н20 (0,5 г/л) Среду с АСЗББ, аморфным оксидом или цитратом железа готовили без добавления восстановителя и резазурина До нужного значения рН доводили с помощью 6Н НС1 или 6Н ЫаОН, после чего под током азота разливали среду по пробиркам и флаконам с герметично закрывающимися крышками Затем газовую фазу во флаконах полностью или частично замещали СО (100, 45, 15 или 5% СО в газовой фазе) Среды стерилизовали автоклавированием при 1 или 0 5 (при наличие в среде Б0) АТИ Рост СО-окисляющих прокариот оценивали по убыли СО в газовой фазе и образованию Н2 и С02, а также наблюдая рост в световой микроскоп

Таблица 1. Характеристика горячих источников кальдеры Узон, в которых проводились исследования трансформации ,4С0 радиоизотопным методом

Источник Т,*С рН ЕЬ, мВ Описание источника Тип пробы

Бурлящий 90 65 290 воронка, 15 м в диаметре, с постоянным интенсивным выходом газа в центре серые обрастания со дна

Трещинный 80 65 270 глубокая трещина, 1 м в длину, стенки покрыты серыми обрастаниями серые обрастания со стенок

Оранжевый Нейтральный 70 60 310 воронка, 1 м в диаметре, с мутной водой светло-серый осадок

Грифон Заварзина 60 62 296 воронка, 2 5*7 м, покрытая гранулами нативной серы белого цвета, по краям воронки активно развиваются циано- бактериальные маты циано- бактериальный мат

Численность карбоксидотрофных анаэробов в осадках определяли методом предельных разведений, инкубируя пробы на минеральной среде со 100% СО в газовой фазе Общую численность прокариот определяли окрашиванием препаратов 1 мкМ раствором ДНК-специфического флуоресцентного красителя ДАФИ (4', 6'-диамидино-2-фенилининдол) в течение 5-7 мин (Huber et al, 1985), с использованием флуоресцентного микроскопа (Ахю Imager D1, Германия)

Чистые культуры гидрогеногенных карбоксидотрофов получали методом предельных разведений, с последующим высевом на твердые среды для получения отдельных колоний Использовали твердые среды двух типов "roll tubes" со средой, содержащей 3% агара в атмосфере 100% СО, или «агаровые столбики» со средой с органическими субстратами с 1,5% агара Для получения клеточной массы культивирование проводили в герметично закрытых сывороточных бутылях объемом 500 мл, при соотношении жидкой и газовой фазы 1 4, или в 5 л ферментере с перемешиванием, со 100% СО в газовой фазе Клетки хранили при -18 °С под азотом

Определение газообразных субстратов и продуктов метаболизма Определение газообразных продкутов метаболизма (СО?. СНд, Н?) и СО определяли на газово-жидкостном хроматографе GLC-Chrom 5 (Laboratorm Pristrozhe, Чехия) со стеклянной колонкой, заполненной активированным углем АГ-3, газ-носитель - Аг, детектор - катарометр

Восстановление Fe(III) количественно характеризовали, определяя концентрации образованного Fe(II) с дипиридилом (Резников и др, 1970)

Микроскопия Наблюдение за ростом и подсчет клеток проводили с помощью светового микроскопа Микмед-1 с фазово-контрастным устройством КФ-4 (JIOMO, Россия) В случае присутствия в среде Fe его нерастворимые в воде формы растворяли в оксалатном буфере (Гаврилов и др, 2003), разведение учитывали при подсчете Тонкое строение клеток изучали с помощью стандартных методов фиксации клеток и окраски срезов (Reynolds, 1963) с использованием трансмиссионного электронного микроскопа JEM-100C (Jeol, Япония)

Бесклеточный экстракт получали разрушением клеток обработкой лизоцимом яичного белка с последующим осмотическим шоком протопластов или в прессе Френча Разрушение клеток проводили анаэробно Мембраны осаждали ультрацентрифугированием

Активности ферментов СО-дегидрогеназы. формиатдегидрогеназы и гидрогеназы определяли спектрофотометрическим методом в регистрирующем спектрофотометре Specord UV VIS (Германия) с термостатирующим устройством в анаэробных кюветах Активность гидрогеназы определяли по востановлению бензилвиологена бесклеточным экстрактом в атмосфере водорода (Пушева и др, 1986) Активность формиатдегидрогеназы определяли по восстановлению

метилвиологена бесклеточным экстрактом в атмосфере азота в присутствии 50 мМ формиата натрия (Andresen and Ljungdahl, 1976) Активность СО-дегидрогеназы определяли по восстановлению бензилвиологена бесклеточным экстрактом в атмосфере 100% СО (Clark et al, 1982) Востановление метилвиологена и бензилвиологена регистрировали при длине волны проходящего света 600 нм

Состав цитохромов определяли по дифференциальным спектрам поглощения восстановленных дитионитом против окисленных Н2О2 мембранных препаратов с помощью спектрофотометра Specord UV VIS (Германия)

Флавины, тетрагидрофолаты определяли по спектрам флуоресценции на флуоресцентном спектрофотометре МРФ-2А (Япония)

Выделение ДНК проводили методами Мармура или Бирнбойма-Доли в модификациях (Marmur, 1961, Булыгина и др, 2002), с применением технологии фирмы Promega (США) Определение содержания Г+Ц пар оснований в ДНК проводили по кривым плавления (Marmur, Doty, 1962) ДНК-ДНК гибридизацию проводили методом оптической реассоциации (De Lay et al, 1970)

Определение концентрации растворенного в воде источников СО проводили с использованием "head-space" метода отбора проб воды, по методике равновесной дегазации (Большаков, Егоров, 1987) Концентрацию СО в воздушной фазе определяли на газовом хроматографе Кристалл 5000 («ЗАО Хроматэк», Россия) с пламенно-ионизационным детектором и метанатором

Определение кинетики трансформации СО микробным сообществом горячего источника Под током азота в 60-мл флаконы помещали 2 мл пробы - ила из горячего источника Трещинный В газовую фазу СО вводили в концентрации 0,2-155 мкмоль/л газовой фазы Инкубировали пробы при температуре 80 °С, на водяной бане-шейкере ThermoHaake SWB25 (Германия) со скоростью 80 об/мин Заранее была подобрана такая скорость перемешивания, при увеличении которой скорость потребления СО уже не повышалась Остаточное содержание СО в газовой фазе определяли на газовом хроматографе Кристалл 5000 («ЗАО Хроматэк», Россия) с пламенно-ионизационным детектором и метанатором Расчет концентрации СО в осадках проводили с использованием табличного значения коэффициента его растворимости при данной температуре и минерализации среды

Оценка потенциальной активности и определение основных продуктов анаэробной термофильной трансформации СО микробными сообществами горячих источников Перед началом исследования трансформации СО термофильными прокариотами была проверена эффективность действия при высоких температурах трех традиционных в радиоизотопных исследованиях способов фиксации добавления NaOH,

глютарового альдегида и автоклавирования Оптимальным фиксатором для данных исследований оказался глютаровый альдегид (в конечной концентрации 2 5% от общего объема)

С использованием 14СО были измерены скорости трансформации СО чистой культурой термофильной автотрофной гидрогеногенной карбоксидотрофной бактерии и микробными сообществами горячих источников Интенсивность трансформации СО чистой культурой определяли модифицированным радиоизотопным методом (Беляев и др , 1975) Вносили 0,1 мл 14СО общей активностью 0,2 мКи, в конечной концентрации 450 мкмоль/л культуры Культуру инкубировали с меченным субстратом в течение 3 часов при 65 °С, после фиксировали глютаровым альдегидом Опыты с природными пробами проводили в 18мл пробирках Хангейта 2 мл осадка заливали до края водой из источников, герметично закрывали За счет вытеснения воды вводили 1 мл газовой смеси, содержащей N2 и 14СО (общая активность 0,0046 мКи, конечная концентрация 116 мкмоль 14СО/л осадка) Анаэробную трансформацию СО микробными сообществами прослеживали с течением времени Пробы инкубировали in situ 3, 6, 9, 12 и 24 часа Затем образцы фиксировали глютаровым альдегидом

Интенсивность микробной трансформации 14СО в природных пробах оценивали по образованию 14СН4, 14С02, включению углерода 14СО в растворенное органическое вещество (РОВ), биомассу клеток и летучие жирные кислоты (ЛЖК) Для отделения газообразных продуктов трансформации 14СО (14СН4, 14С02, 14С-ЛЖК) от оставшегося субстрата была разработана и успешно апробирована специальная установка Разделение продуктов состояло из следующих этапов в реакционной колбе |4СО, связывалась добавлением 2 Н NaOH, затем проба нагревалась и 14С-ЛЖК конденсировались при помощи обратного холодильника, подсоединенного к колбе, оставшаяся смесь 14СН4 и 14СО пропускалась через нагретую до 300 °С колонку с СиО, где происходило окисление |4СО до 14COj, которая на выходе улавливалась р-фенилэтиламином в сцинтилляционной смеси, 14СН4 поступал в нагретую до 700-800°С кварцевую трубку, наполненную силикагелем, пропитанным солями кобальта, где сжигался до 14С02 Остальные продукты 14СО трансформации разделяли и количественно определяли, используя описанные ранее методики (Беляев и др, 1975, Гальченко, 1994) Радиоактивность образовавшихся продуктов определяли на жидкостном сцинтилляционном счетчике Rack-Beta (LKB, Швеция)

Амплификацию генов 16S рРНК с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) и секвенирование полученных ампликонов проводили согласно описанным ранее методикам (Субботина и др , 2003) При этом использовали следующие бактериальные, архейные и универсальные

праймеры Bact8-27F, Arch338F, Bact907R, Archl381R, Arch915R, Univ515F, Univ 1492R

Филогенетическое положение изолятов и разделенных ДГГЭ фрагментов природной ДНК определяли путем сравнения последовательностей генов 16S рРНК с последовательностями, представленными в базе данных GenBank, с использованием программ BLAST (http //www ncbi nlm nih gov/blast) и CLUSTAL W v 1 75 (Thompson et al, 1994) Филогенетические деревья были построены с помощью программ TREECON W (Van de Peer, De Wächter, 1994) и PHYLIP (Felsenstein, 1989)

Результаты

1. Краткая характеристика и основные черты метаболизма термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот

Предметом нашего исследования были обитающие в гидротермах термофильные прокариоты, характеризующиеся хемолитотрофным типом метаболизма, основанным на использовании СО в качестве единственного источника энергии с образованием Нг как единственного восстановленного продукта, в соответствии с уравнением СО + Н20 = СОг + Н2 Традиционно, физиологические группы анаэробных прокариот называются в соответствии с образуемым продуктом и/или используемым акцептором (метаногенные, ацетогенные, сульфатредуцирующие прокариоты) Для исследуемой нами группы прокариот было предложено название «гидрогеногенные», т е образующие водород (ЗуеИ^сИпу! е1 а1, 2001) Способность к росту на СО (оксиде углерода, карбоксиде) также является определяющей особенностью представителей этой группы и должна быть отражена в ее наименовании - «гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты»

В начале нашей работы из гидротерм Курильских островов были выделены несколько штаммов гидрогеногенных карбоксидотрофных бактерий, отнесенных к новому виду нового рода СагЬохуёоЖегтиз hydrogenoformans (см разд 6) - первому представителю карбоксидотрофных гидрогеногенных прокариот Так как ничего не было известно о метаболизме прокариот исследуемой группы, мы выбрали один из штаммов для определения активностей ключевых ферментов предполагаемого пути метаболизма

Ферментативные активности были определены в экстракте клеток СагЬохудсНкеппш Иус^^епо/огтапз Ъ-2906, выращенных на СО Были

обнаружены высокие активности СО-дегидрогеназы,

формиатдегидрогеназы и гидрогеназы, которые составляли 18,35 мкмоль/мин мг белка (при 73 °С , рН 7,0) ,0,11 мкмоль/минмг белка (при 74 °С) и 1,57 мкмоль/минмг белка (при 65 °С), соответственно Для СО-дегидрогеназы было определено значение Кшсо, которое составляло 20 мкМ Обнаруженная нами СО-дегидрогеназная активность была устойчива к высокой температуре Максимальная активность наблюдалась при 109 °С, при 135 °С активность была лишь в два раза ниже максимальной Периоды полуинактивации СО-дегидрогеназной активности составляли 35 минут при инкубации при 110 °С и 6 минут -при 130 °С При инкубации реакционной смеси, содержащей бесклеточный экстракт, при 85 °С в течение 1 часа СО-дегидрогеназная активность не изменялась По спектрам флуоресценции в бесклеточном экстракте было обнаружено высокое содержание фолатных производных Исследование дифференциальных спектров выявило возможное присутствие ферредоксина Присутствие в клетках Carboxydothermus hydrogenoformans СО-дегидрогеназной, формиатдегидрогеназной, гидрогеназной активностей и высокого содержания фолатных соединений указывало на вероятное функционирование нециклического пути фиксации углерода Вуда-Льюнгдаля Впоследствии это было подтверждено работами В А Светличного и исследованиями полного генома Carboxydothermus hydrogenoformans Был выделен ключевой ферментный комплекс пути Вуда-Льюнгдаля - СО-дегидрогеназа/ацетил-КоА синтаза (Svetlitchnyi et al, 2004) В геноме Carboxydothermus hydrogenoformans обнаружены гены, кодирующие все ферменты, задействованные в этом метаболическом пути (Wu et al, 2005) В получении энергии этим организмом участвует ферментный комплекс, включающий СО-дегидрогеназу и гидрогеназу особого типа, относящуюся к так называемым "energy converting hydrogenases" (ЕСН) Была выделена СО-дегидрогеназа, входящая в этот комплекс (Svetlitchnyi et al, 2001) Было обнаружено сходство структуры этого комплекса с СО-окисляющим Н2-образуютим комплексом способной к гидрогеногенному карбоксидотрофному росту несерной пупурной бактерии Rhodospirillum rubnim (Soboh et al, 2002, Fox et al, 1996) С применением праймеров, созданных на основе консенсусной последовательности генов cooS и cooS-1, кодирующих СО-дегидрогеназы Rhodospirillum rubrum и Carboxydothermus hydrogenoformans, и консенсусной последовательности генов сооН, кодирующих ЕСН этих организмов, было показано присутствие сходных генов и их локализация в едином кластере у ряда филогенетически удаленных гидрогеногенных карбоксидотрофов Carboxydothermus hydrogenoformans, Thermosinus carboxydivorans, Carboxydocella thermautotrophica, Thermincola carboxydiphila, Desulfotomaculum carboxydovorans и Thermolithobacter carboxydivorans (Lebedinsky et al, 2005) Недавнее исследование генома

ТИегтососст Бр АМ4 показало, что объединение СО-дегидрогеназы и гидрогеназы (ЕСН) в одном генном кластере является специфической особенностью и геномным маркером гидрогеногенных карбоксидотрофов (ЬеЬесЬпБку & а1, 2008)

2. Распространение гидрогеногенных карбоксидотрофных

прокариот

Прокариоты, осуществляющие реакцию анаэробного окисления СО, сопряженного с образованием водорода как единственного восстановленного продукта в соответствии с уравнением

СО + Н20 -> С02+ Н2 (ДС0= - 20 кДж/моль), были обнаружены в пробах воды, ила и бактериальных обрастаний, отобранных из географически удаленных и разнообразных по физико-химическим параметрам гидротерм (табл 2)

Таблица 2 Географическое положение и физико-химические характеристики исследованных источников

Места отбора проб рН в местах отбора проб Температура в местах отбора проб СС) Количество исследованных источников Количество источников, где обнаружены СО-трофы

Баргузинский заповедник 7,6-9,5 35-70 16 15

Камчатка Узон, Долина Гейзеров, вулканы Мутновский и Карымский 3,5-9,5 30-94 59 36

Иеллоустонский Национальный парк, гейзерный бассейн Норрис 7,5 50 1 1

о Рауль(архипелаг Кермадек) 7,2 80 1 I

Окинавская впадина нд нд 1 1

Восточно-Тихоокеанское поднятие нд нд 24 13

Таким образом, было показано, что термофильные гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты присутствуют в наземных и глубоководных источниках с температурами от 30 до 97 °С и рН от 4,0 до 9,5

3. Трансформация СО термофильными микробными сообществами гидротерм

Концентрация растворенного СО была измерена в трех континентальных источниках, расположенных в кальдере Узон, Камчатка (табл 1) Бурлящий, Трещинный и грифон Заварзина В источнике Бурлящий концентрация растворенного СО составила 33 нМ, в двух других - по 20 нМ

Кинетику анаэробной трансформации СО изучали на примере микробного сообщества осадков источника Трещинный (80 °С), расположенного в кальдере Узон, Камчатка (табл 1) Трансформация СО начиналась без лаг-фазы, или она была непродолжительна (около 1 часа), что свидетельствует о том, что анаэробная СО-окисляющая микрофлора находилась в активном состоянии Зависимость скорости потребления СО от его концентрации имела двуступенчатый характер (рис. 1) Были найдены следующие кинетические параметры = 54 нМ, V]"' = 0 45 ммоль СО/л осадка/сут, К$г = 1 мкМ , \/2т = 45 ммоль СО/л осадка/сут Исходя из реальной концентрации СО в источнике (в данном источнике 20 нМ) и пользуясь полученной зависимостью, можно оценить реальную скорость его трансформации микробным сообществом источника Трещинный, которая составила 0,09 ммоль/л осадка/сут

Рис. 1 Зависимость скорости потребления СО от его текущей (остаточной) концентрации в газовой фазе

Таким образом, в окислении СО в исследованном горячем источнике могут участвовать карбоксидотрофные прокариоты с высоким и низким сродством к субстрату. Другим объяснением может быть присутствие нескольких СО-дегидрогеназ с разными кинетическими характеристиками в одном организме И в том, и в другом случае микробное сообщество обладает способностью к адаптации к изменяющимся концентрациям СО в источнике и, следовательно, к наиболее полному использованию этого субстрата

4. Пути трансформации СО микробными сообществами гидротерм.

Процессы трансформации СО термофильными микробными сообществами исследовали в четырех источниках кальдеры У зон (табл 1) с помощью радиоизотопных методов 14СО вносили в концентрации, существенно превышающей полученные значения К8, что позволяло проследить включение метки во все возможные продукты и оценить потенциальную активность процессов Была выявлена быстрая трансформация СО микробными сообществами Более 90% от внесенной метки переходило в продукты трансформации СО за 9 часов инкубации в источнике Заварзина (60 °С), за 3 часа в источнике Трещинный (80°С)

время инк}бпшш (ч)

Рис. 2. Динамика трансформации 14СО в 14СОг и 14С-органическое вещество (14С-ОВ) микробными сообществами источника Бурлящий (90 °С), где ,4С-ОВ - это сумма ,4С-ЛЖК, ,4С-РОВ (растворенное органическое вещество) и 14С-клеточной массы

В источнике Бурлящий (90 °С) 80% от внесенной 14СО трансформировалось в продукты за 12 часов инкубации (рис 2) Потенциальная активность анаэробной микробной трансформации СО в источниках с температурами 60, 70, 80 и 90 °С составила 0,09, 0,10, 0,48 и 0,13 ммоль/л осадка/сут, соответственно

Основным продуктом микробной трансформации СО всеми четырьмя исследованными сообществами был С02 (90-100% от использованного 14СО) Не более 5% от использованного СО трансформировалось в летучие жирные кислоты (ЛЖК), доля метки, обнаруживаемой в ЛЖК, снижалась с повышением температуры в источнике Оставшийся 14С включался в РОВ (растворенное органическое вещество) и биомассу (табл 3) Перехода метки в 14СН4 отмечено не было

Пути трансформации СО микробными сообществами, по-видимому, зависят от температуры, при которой развивается сообщество В составе продуктов трансформации СО при температурах 60, 70, 80 и 90 °С исследованными нами сообществами преобладал С02; заметная доля ЛЖК среди продуктов трансформации СО наблюдалась при 60 °С

Таблица 3. Распределение метки в продуктах трансформации 14СО микробными сообществами за 6 часов инкубации

Название источника Температура в источнике (°С) Распределение метки в продуктах трансформации 14СО

14 С02 14С-ЛЖК С- клеточная масса 14С-РОВ

Грифон Заварзина 60 95 0% 4.8% 0 1% 0%

Оранжевый 70 100% 0% 0% 0%

Трещинный 80 99 2% 0 8% 0% 0%

Бурлящий 90 90 4% 0 8% 0 5% 8 3%

Таким образом, присутствующий в составе растворенных газов в гидротермальных источниках СО в анаэробных условиях при температуре от 60 до 90 °С активно трансформируется микробными сообществами гидротерм Основным продуктом трансформации является С02

5. Определение численности анаэробных термофильных карбоксидотрофных прокариот

Анаэробные карбоксидотрофные прокариоты являются значимым компонентом микробных сообществ в горячих источниках (табл 4) Доля анаэробных СО-окисляющих прокариот составляет от 0 1 до 10% от числа органотрофов, которое в источниках Заварзина, Трещинный и Бурлящий совпадало с общей численностью Следует особо отметить высокую численность гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот в высокотемпературных источниках

Таблица 4. Соотношение численности анаэробных термофильных карбоксидотрофных и органотрофных прокариот в микробных сообществах горячих источников

Название или № источника Описание пробы Т инкубации, °С Число клеток в 1 мл пробы СО-трофных прокариот/ органотрофных прокариот

Грифон Заварзина Цианобактериаль-ный мат, ил 60 105/108

Трещинный Темно-серый ил 82 10/108

Бурлящий Темно-серый ил 90 106/108

1534 Оранжевое поле, керн, нейтральная часть 90 106/107

1312 Розовато-бежевые гранулы,78 °С/8,2 70 105/107

1315 Нитевидные обрастания розового цвета в ручье 72 °С/8,4 70 104/106

6. Выделение и описание чистых культур новых гидрогеногенных карбоксидотрофных термофильных прокариот

Из ряда исследованных горячих источников были получены накопительные культуры, использующие СО, и выделены и описаны новые гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты Характеристика мест отбора проб, из которых они были выделены, приведена в таблице 5

Анаэробные термофильные карбоксидотрофные гидрогеногенные прокариоты легко выделялись из проб, богатых органическим веществом, таких как цианобактериальные маты, бактериальные обрастания или илы В пробах с температурами 50-60 "С, содержащих цианобактериальные маты, гидрогеногенные карбоксидотрофы обнаруживались практически во всех случаях За редким исключением, все они были впоследствии выделены в чистую культуру на восстановленной сульфидом натрия среде (Eh= - 250 мв) в атмосфере СО

Большинство представленных в этой работе термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот были получены в накопительную культуру и выделены в чистую с использование среды в атмосфере 100% СО за исключением выделенной на среде с ацетатом и гидроморфным оксидом трехвалентного железа Thermincola ferriacetica

Большинство выделенных нами организмов оказалось представителями новых таксонов (рис 3, табл 6) Они не образуют единую филогенетическую группу, среди них есть представители доменов бактерий и архей Большая часть выделенных нами термофильных карбоксидотрофных бактерий относится к типу "Firmicutes" Наиболее многочисленны представители класса Clostridia, относящиеся к порядку Clostridials, к семействам Peptococcaceae, Syntrophomonadaceae, Acidaminococcaceae Один из выделенных нами организмов оказался представителем глубокой, на уровне класса, ветви в типе "Firmicutes" и был отнесен к новому классу Thermolithobacteria Нами было показано, что среди Dictyoglomi также есть гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты. Среди архей нами были обнаружены гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты, относящиеся к Euryarchaeota и Crenarchaeota (табл 6) Способность к окислению СО была в разных случаях как признаком рода, так и штаммовым или видовым признаком

гС

- СагЬох\<1оФетш$ 1г)(}^епс/огтат --Са> Ьог\ (¡ог/и гним /еп п «///л т

~ СаШапаегоЬасиг знЫеггапеих 5(1 яш 2707 I СаШпаегоЬааег ьиЫсггаиап «о рааПст

СлМаппРгпЬпсГег ънЬгп тпст ^>ногож>г//5/з ]|— СаШпаегоЬааег шЫепопет «и \ottstoiUi - СаМанасгоЬаскп кегагшоЫп1чб'

--СлМапао оЬп^ег зиЫеп паеа5 ъиЬгпиансн',

Им тоапаегоЪпаег \iiogelit

Пк'ппоапае} оЬас!а еЖ опокам ТЬепиоанае! оЬоасг ¡.нЗегоо^нЫз

ТЬеппшше)оЬаск) кпш Ппч шомше! оЬоск г Ъюски 77/ о нюанаегоЬясге! пшЬгаии

-ТЬеппоанлооЬас!?} иаЬсич

4тшош/ех ¿^ент

Ое}т)исос( 01 (¡а, с г/к

—В\ст\ о<*/ошиз гЬешор!п 1шн

ТЬРПИЛП оЬоаа иЮ1 тнети \looi I На ¡¡и I гпоас 'Пса

_г ТЬеттоЫЬоЬааег сагЬоххогапъ

— 71)еп>ю1}тЬо1)лсп>) еЛисепч — ТЬепптсоЫ /етасеЬса

Тиегттсо1а сагЬох\(?с>р1и1а

-и!пш ни?/ фсат

$рого!ошси}ип) Ь\(}го\-\Ьсп:о1сшп ЬешКоютаЫит ЖепиоЬелхнапн г~ "СагЬо\) йосеИа [егпгЫиссп$ " СагЬо\\(/осеНа ГЛ егтоаШо(гор!чса

-ГЛтпохшш сагЬо\\Ф\огат

-Оеп&оьрогоЬас1ег (¡на асо!из

!-Веи(!/(ГоЬасге1 шш Ма1о§епап$

-Оеьи$1оЬаасг1иш Ьа{шете

- {пае) оЫ апса ЬоикозЬп

~~ ТЬеппыхнГгорЬстниор)м ¡1ро1уйС(1 ВмшорЬошаш ио!/ег 5г пггорЬоьро/ а Ьп ант ТУеш^омЬ) ю у и^ат \tifgans ~ Юю^ртПит гиЬгит

-ЯиЬтпах яеШшозт

Рис. 3 Филогенетическое положение анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных представителей "РптшсШез" и наиболее изученных гидрогеногенных карбоксидотрофных мезофильных бактерий

Таблица 5. Источники выделения термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот

Географическое положение места отбора пробы Описание пробы Температура (°С)/рН в месте отбора пробы Название организма

Наземные горячие источники

о Кунашир, Курильские острова Ил из горячего болота 68/5 5 СагЬохуАо1кегти$ 1гус1го%епо[огтапз

Долина Гейзеров, Камчатка Нитевидные розовые обрастания в потоке 72/8 4 " СагЬохус1о111егтш зк)егорк11ш "

Река Большая, Байкальский заповедник Ил и цианобактериаль-ный мат 51-72/6 8-9 5 Ткегттсо1а сагЬохуЛрИйа

О Кунашир, Курильские острова Вода, ил, отложения охры 65 /6 8-7 0 ТИегттсоЬ (етасеиса

Долина Гейзеров, Камчатка Ил и цианобактериаль-ный мат 60/8 6 СагЬо\ус1осе11а ЛегтаиШгорЫса

Подводный источник в озере Карымское, Камчатка Ил и цианобактериаль-ный мат 60/6 6 СагЬохус1осе11а 5рогорг(х1исе№

Кальдера Узок, Камчатка Керн, глина 55/5 8 "СагЬоху^осеИа (егпгеЗисет "

Гейзерный бассейн Норрис, Йеллоустонский Национальный парк Вода, ил, гравелит 50/7 5 ТИегтозтиз сагЪохудмогат

О Кунашир, Курильские острова Вода и осадок 97/6 0 Са1с1апаегоЬас1ег штамм 2707

Остров Рауль, архипелаг Кермадек Вода, осадок 80/7 2 ПегтоИЛоЬаМег сагЬохус!могат

Кальдера Узон, Камчатка Вода, ил 80/6 5 "ОМую^отиь сагЬоху(1мога№ "

Кальдера Узон, Камчатка Вода, ил 90/6 5 "ТЬегтоА1ит сагЬохус!о1гор11т'

Глубоководные горячие источники

Окинавская впадина Ил нет данных СаШапаегоЬас1ег зиЫеггапеиз эиЬзр расфсш

Восточно- Тихоокеанское поднятие Активная гидротермальная постройка нет данных ТИегтососсж АМ4

Таблица 6 Характеристика термофильных гидрогекогенных СО-окиеляющих прокариот, выделенных из гидротермальных мест обитания

Название организма Морфология Г+Ц мол % Зависимость от СО Автотро фия/ брожение Акцепторы электронов Акцепторы при росте на СО Топт(°С)/ pH опт Время удвое ПИЯ (часы) Ссылки

Bacteria, Firmicutes. Clostndia

Clostndiales, Peptococcaceae

Carboxydoíhermus hydrogenojormans короткие, изогнутые палочки, подвижные, Грам + 42 Факультативная + / + Fe(III), AQDS, s°, so32, s2o32, фу марат, нитрат AQDS фумарат 70-72/ 7,0 2 Svetlichny et al , 1991 b, Henstra and Stams, 2004

' Carboxydoíhermus siderophúus Короткие, прямые, неподвижные палочки, Грам+ 41 Факультативная Fe(lll), AQDS Fe(lll) AQDS 70 / 7,0 9,0 Slepova et al, 2008

Thermincola carboxydiphda прямые палочки, подвижные, Грам+ 48 Облигат-ная -/- 55 / 8,0 1,3 Sokolova et al, 2005

Thermmcola ferriacelica прямые или изогнутые палочки, подвижные, спорообразую- щие, Грам+ 48 Факультативная -/- Fe(Ill) oxide, AQDS, Mn02, S2032 nd 57-60/ 7,0-7,1 1 5 Zavarzina et al, 2007

ОозшёЫев. ЗуШгорЬотопасЬсеае

СагЪохубосеИа ЛегтаиЮНорЫса короткие, прямые, подвижные палочки, Грам+ 46 Облигат-ная + /- 58 / 7,0 1,1 8око1оуа е! а!, 2002

СагЪохуйосеИа ьрогоргоАисепз короткие прямые палочки, неподвижные, спорообразую-щие, Грам+ 47 Факультативная + / + 60 / 6,8 1,0 81ероуа е1 а1, 2006

' СагЪохуЛосеИа /егпгес/исепэ " короткие прямые палочки, подвижные, спорообразую-щие, Грам+ 48 Факультативная -/ + Ре(Ш), Ре(Ш) 60 / 6,8 1,0 наши неопубликованные данные

С1о51гк11а1е8, Ас^аттососсасеае

Пегтоятш сагЬохуёмогапх изогнутые палочки, подвижные, Грам- 52 Факультативная -/ + Ре(Ш), ЭеОз2 Ре(Ш), БеОз2 60 / 6,87,0 1,5 ЭокоЬуа е! а1, 2005а

ТЬегтоапаегоЬас1епа1е5, ТЬегтоапаегоЬа^епасеае

СаШапаегоЬас1ег ^иЫеггапет виЬзр расфсм тонкие длинные прямые иногда ветвящиеся палочки, неподвижные, Грам+ 33 Факультативная -/ + ЭгОз'- 70 / 6,87,1 7,1 5око1оуа е1 а1, 2001, Рагс!еаи е! а!, 2004

СаШапаегоЬасгег тонкие, длинные, 35 Факуль- -/ + - 75 / 7,0 3,2 наши

вй-аш 2707 слегка изогнутые тативная неопубли-

палочки, кованные

спорообразующи данные

е, Грам+

Вааепа. Рптшси(е5. ТЬегтоЬйюЬайепа

"П1еппо1пЬоЬас1ега1е5. ТЬеппоЬЛоЬа^егасеае

Пегто111ИоЬас1ег короткие прямые 52 Факуль- + / + - - 70 / 6,8- 8,3 8око1оуа е!

сагЬохускуогат палочки, тативная 7,0 а!, 2007

подвижные,

Грам+

Вас1епа, 01С1уое1огш, О1с1уор1оггп (сЫбб)

В1с1уое1ота1е5. О1с(уой1отасеае

"■О/с^о^/о/яги длинные тонкие нд нд -/нд нд нд 75/нд нд 51ероуа, е(

сагЬохус1погап$ " палочки, а1, 2007

неподвижные,

Грам-

АгсЬаеа, ЕигуагсЬаео1а, ТЬегтососс!

ТЬегтососса1е5. ТЬегтососсасеас

Пегтососсия АМ4 подвижные 55 Факуль- Б Б 85 / 7,0 3,1 Боко1оуа е!

кокки тативная а1, 2005Ь

АгсЬаеа, СгепагсЬае^а, ТЬегторго1е1

ТЬегторго1еа1е8. ТЬегтоШасеае

"ТИегто/Иит длинные тонкие па Факуль- -/нд нд нд 92/нд нд 5!ероуа е!

сагЪохуНо^оркт " палочки тативная а!, 2007

Род СагЬохуАмЪсгтиъ (Ва^епа; ГчгткчПс^; Ооз^сНа; С.'1(Шпс1Ые*;

Рер1ососсасеае)

Рис. 4. Морфология СагЬохус1о(Иегтих куск^епо/огтат (А) и "С. siderophilus "(В). Негативное контрастирование.

Род СагЬохусЯоЖегтиз (табл. 6) был первым валидно описанным таксоном, включающим представителей термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных бактерий. В настоящее время род содержит три вида: описанные нами СагЬохус1оМегтш hydrogenoformans и "С. siderophilus ", а также С. /егп^исет, который первоначально был описан как новый вид нового рода железовосстанавливающих бактерий, Ткегто1еггаЬас1егшт /егги-еЛисеж (81оЬос1кш е1 а1., 1997), и впоследствии реклассифицирован нами как новый вид рода СагЬохуЛоЖегтт. К виду С. hydrogenoformans были отнесены 3 штамма, выделенных из горячих источников острова Кунашир. "С. ¡¡ЛегорЬПиз" представлен единственным штаммом, выделенным из горячего источника в Долине Гейзеров. Все виды рода Carboxydothermus представлены палочковидными клетками, имеющими клеточную стенку грамположительного типа строения. Все представители рода СагЬохудо^егтт - строгие анаэробы, экстремальные термофилы, нейтрофилы (табл.6), все они факультативные карбоксидотрофы, способные к росту как на СО, так и на других субстратах. Все представители рода CarЪoxydothermus растут на 100% СО в газовой фазе. С. hydrogemformans и "С. з^ЛегорИИиз" - гидрогеногены - литотрофно растут на СО, образуя С02 и Н2 как единственный восстановленный продукт (рис. 5). С. hydrogenoformans способен к хемолитоавтотрофному росту на СО, "С. siderophilus" нуждается в дрожжевом экстракте (0.2 г/л). При этом рост "С. siderophilus" как на СО, так и на других субстратах

облигатно зависит от присутствия в среде Fe(III) или AQDS С ferrireducens растет на СО в присутствии гидроморфного оксида трехвалентного железа В процессе его роста происходит окисление СО до СОг и восстановление гидроморфного оксида Fe(III) с образованием магнетита, но без образования водорода Было показано, что С ferrireducens может расти на СО, восстанавливая фумарат до сукцината или AQDS до AQDSH2, но не образуя при этом водорода (Henstra et al, 2004) С hydrogenofoi mans также может расти, восстанавливая гидроморфный оксид Fe(III) водородом С hydrogenoformans растет в отсутствие СО в атмосфере азота, сбраживая пируват с образованием ацетата, Н2 и СОг , или окисляя формиат, лактат, глицерин или водород и восстанавливая AQDS, или на лактате, восстанавливая сульфит, тиосульфат, серу, нитрат или фумарат (Henstra et al, 2004) "С siderophilus " в отсутствие СО в атмосфере азота растет хемоорганотрофно на глюкозе, ксилозе, лактате или дрожжевом экстракте (в присутствии трехвалентного железа или AQDS) Представители разных видов рода Carboxydothermus выделены из географически удаленных источников, расположенных на Камчатке, острове Кунашир и в Иеллоустонском Национальном парке, что свидетельствует о широком распространении представителей этого рода в вулканических местах обитания В то же время в базе данных GenBank отсутствуют клоны природной 16S рДНК, близкородственные 16S рДНК Carboxydothermus, что может объясняться низкой численностью этих микроорганизмов в микробных сообществах горячих мест обитания или плохим выделением ДНК представителей этого рода применяемыми методами

7 0,10-

10 20 время, часы

1

Рис. 5 Рост, потребление СО и образование Нг Carboxydothermus hydrogenoformans Z-29017 при 75 °С на 100% СО в газовой фазе,

Род ТИегпипсо1а (Вас1епа; Ртгнси1е5; ОоэМсИа; С1о$1г1(На]с$; Рер1ососсасеае)

Б

МР

Рис 6. Морфология ТИегттсоЬ сагЬохусИркИа 2204Т. (А) Ультратонкий срез. (В). Негативное контрастирование. Шкала 0.5 мкм.

Описанный нами род ТИегттсо1а (табл.6) включает два вида: ТЬегпипсо1а сагЬохусИркЦа и Т. /егпасейса. Оба вида представлены клетками палочковидной формы с клеточной стенкой грамположительного типа. Т. (егпасейса образует споры. Представители рода ТЬегттсо!а строгие анаэробы, умеренные термофилы. Оба вида представлены единичными штаммами. ТИегттсо1а сагЬохусИрИИа 2204т был выделен из слабощелочного горячего источника Байкальской рифговой зоны, Т. /егпасейса г-оо1т был выделен Д. Г. Заварзиной из отложений охры в горячем источнике острова Кунашир. Т. сагЬохуЛрНИа 22041 — алкалотолерантный организм, Т. /етасеПса 7-0011 - нейтрофил. Представители рода Т11егпппсо1а способны к хемолитотрофному росту на СО с образованием С02 и Н2, растут на 100% СО в газовой фазе. Не растут на сбраживаемых субстратах, Т. сагЬохусЧркИа - облигатный карбоксидотроф, растет на СО хемолитогетеротофно, нуждается в ацетате (0.2 г/л) или дрожжевом экстракте (0.2 г/л). Т. /егпасейса, помимо хемолитотрофного роста на СО, способна к росту за счет восстановления трехвалентного железа водородом, ацетатом, петоном, дрожжевым экстрактом, гликогеном, гликолятом, пируватом. Представители рода

Therminco/a широко распространены, причем их места обитания не ограничиваются горячими источниками. Штамм, принадлежащий к роду Thermincola, был также выделен из горячего источника Исландии (Н.К.Биркланд, личное сообщение), Гены 16S рРНК с высоким сходством с генами 16S рРНК рода Thermincola были детектированны в нефтеносных пластах (Liew and Jong, GenBank accession no. EF095439), в сточных водах очистных сооружений (А.И. Слободкин, неопубликованные данные), в накопительных культурах из шахты с проявлениями геотермальной активности, Япония (Kaksonen et al., 2006), в морских осадках (Mathis et al., 2007).

Род Carboxydocella. (Bacteria; Firmicutcs; Clostridia; Clostridiales, Syntrophomonadaceae)

Описанный нами род СагЬохус1осе11а (табл. 6, рис. 3) представлен тремя видами: СагЬохудосеНа гЬегтаШо^оркгса, С. зрогорго/Зисепя, "С.

Рис. 7. Морфология (А) Carboxydocella thermautorrphica 41т. (В) "C.ferrireducem" 019. (С) С. sporoprodiicens Kai'1. Негативное контрастирование. Шкала 1 мкм.

/егпгес!исею". Виды СагЬохус!осе11а представлены палочковидными клетками разной длины. Клетки С. хрогоргос/исепя образуют споры (рис. 7). Представители рода СагЬихуЛосеНа строгие анаэробы, умеренные термофилы, нейтрофилы. Все представители рода СагЬоху^осеНа выделены из горячих источников Камчатки: С. IИегтаиШгорЫса - из

источника в Долине Гейзеров, С врогоргойисет - из оз Карымское, "С {сгпгес1исе.п^,"- из кальдеры Узон Все виды СагЬох\>с1осеИа

хемолитотрофно растут на 100% СО в газовой фазе, образуя С02 и водород С ¡Не) таиШ1горЫса и С хрогоргодисет растут на СО автотрофно "С /етгес/исепя "нуждается в дополнительном источнике углерода, которым может быть ацетат (0,2 г/л), лактат ( 0,2 г/л) или дрожжевой экстракт (0,2 г/л) "С /етгесЛ/сеиз " растет на СО также и в присутствии трехвалентного железа в виде гидроморфного оксида, образуя С02 и Н2 Во время роста происходит восстановление трехвалентного железа до двухвалентного, минорное по сравнению с образованием водорода, которое не нарушает заметно соотношение окисленного СО и образованного Н2 С ¡ИегтаиШгорЫса - облигатный карбоксидотроф С $рогоргос1исепз органотрофно растет в атмосфере азота, сбраживая дрожжевой экстракт, сахарозу или пируват "С [егпгес1исеж" органотрофно растет на глюкозе, пирувате, глицерине, мальтозе, лактозе Кроме восстановления трехвалентного железа во время роста на СО, "С /егпгес1исет" способен восстанавливать тиосульфат водородом в присутствии дрожжевого экстракта

10 20 врелгя, часы

Рпс 8 Рост Со Ьог\ с1осе11а /1и'1 ттПоП ор)иса н 100 0о СО при 60'С

Еще три принадлежащих к роду СагЬохус(осе11а штамма были выделены из умеренно горячих источников кальдеры Узон, значения рН в которых были близки к нейтральным Один из этих штаммов был выделен из источника Заварзина, в котором мы показали активный процесс трансформации присутствующего в гидротермальном растворе СО в С02 Еще один штамм был выделен из источника в районе вулкана Мутновский (75 °С, рН 6,5) Все выделенные штаммы представлены палочками размером 0 5x3 мкм Два штамма способны образовывать споры Все эти штаммы росли хемолитоавтотрофно при концентрации 100% СО в газовой

фазе, образуя равные количества Н2 и ССЬ, или хемоорганогетеротрофно на дрожжевом экстракте и глюкозе. Таким образом, показано широкое распространение представителей рода СагЬохус!осеИа в различных гидротермальных системах Камчатки.

Род Пег/поя/пия (15ас1спа; ПгткчНс»; С1о$(п<На1е$; Апйагтпососсасеае)

Рис. 9. Морфология ТИегтоятш сагЬохусНуогат. Негативное

контрастирование. Шкала 1 мкм.

Единственный известный к настоящему времени представитель рода ТИегтозтш - Т. сагЬохус1^огапБ (табл. 6) был выделен на среде, содержащей гидроморфный оксид трехвалентного железа, в атмосфере 100% оксида углерода. Клетки Т. сагЬохусИчогат - изогнутые подвижные палочки с латеральным жгутикованием (рис. 9). Клеточная стенка грамотрицательного типа строения. Как и другие водородобразующие карбоксидотрофные бактерии, Т. сагЬохус^Ыогат получает энергию для роста в результате анаэробного окисления СО в реакции с водой, продуктами которой являются эквимолярные количества СО? и Н2; другие продукты не образуются. Т. сагЬохусНуогат растет в атмосфере СО как на восстановленной среде (ЕЬ=-250 тУ), так и на среде, приготовленной анаэробно, но не содержащей восстановливающий агент (Е1т=+50 тУ), как в присутствии, так и в отсутствие соединений трехвалентного железа. Во время роста на СО Т. сагЬохус/^огат способен восстанавливать трехвалентное железо в двухвалентное; при этом происходит образование водорода и С02 в количествах, близких к тем, что образуются этим организмом при росте на СО в отсутствие железа (рис. 10). При окислении 0,22 ммоль СО образуется 11,2 мкмоль Ре(П), что явно недостаточно для того. чтобы существенно повлиять на количество другого восстановленного продукта - водорода. Т. сагЬохусЦуогапз не способен к автотрофному росту на оксиде углерода, но нуждается в дрожжевом экстракте (0,1 г/л) как дополнительном источнике углерода. Повышение

концентрации дрожжевого экстракта в среде до 1,0 г/л ведет к увеличению урожая клеток до 5x109 клеток/мл Кроме роста за счет анаэробного окисления СО, Т сагЬохус/могат способен к росту за счет сбраживания ряда Сахаров глюкозы, лактозы, арабинозы, мальтозы, фруктозы, ксилозы, сахарозы и пирувата

0,25

с: 5 -о С О 2 2

О О

10 20 30 Время, часы

10 20 30 Время, часы

-vi

«с

о

•11

EJ10 •■j

9

О

-8

О

"7 V

5t

+ 6 —

(В)

Рис 10 Рост Thermosums carboxydivorans Nor1 при 60°С в атмосфере 100% СО(А) в отсутствие и (В) в присутствии 20 мМ цитрата Fe (III)

Т. сагЬохус1могапз не растет на целлобиозе, галактозе, пептоне, дрожжевом экстракте, лактате, ацетате, формиате, этаноле, метаноле или на цитрате натрия. В процессе сбраживания глюкозы образуются ацетат, водород и С02. В атмосфере азота на среде, не содержащей восстановителя (Е11=+50 тУ), он растет на глюкозе, лактозе или сахарозе только в пристствии акцепторов электронов - трехвалентного железа или тиосульфата - восстанавливая их до двухвалентного железа или Н28 соответственно. Во время роста на СО в присутствии Ыа28е04 (2мМ) восстанавливает четырехвалентный селен до элементного.

Рис. 11. Морфология СаШапаегоЬаМег ¡иЫеггапет эиЬзр. расфсш Ж; (а), (Ь) негативное контрастирование (с) ультратонкий срез. Шкала 0.5 мкм,

СаЫапаегоЪас1ег яиЫеггапеш виЬзр. рас'фсиъ (табл. 6, рис.3) был первым гидрогеногенным СО-окисляющим термофилом, выделенным из глубоководных мест обитания. Штамм Ж был выделен нами из глубоководного горячего источника Окинавского прогиба, описан и валидно опубликован как представитель нового вида нового рода СагЬохуЛоЬгаскшт рас'фсит. Позднее он был реклассифицирован как подвид нового рода нового вида СаШапаегоЬааег зиЫеггапет - С.

Карбоксидотрофные гидрогеногенные представители рода Саи1апаегоЬас(ег (ТЬегтоапаегоЬа^епакБ; ТЬегтоапаегоЬа^епасеае)

subterraneus subsp pacifiais (Fardeau et al, 2004) К тому же виду Caldanaerobacter subterraneus нами был отнесен еще один гидрогеногенный СО-окисляющий организм - штамм 2707, выделенный из наземного пресноводного источника острова Кунашир. Эти штаммы представлены очень длинными тонкими палочковидными клетками Клетки С subtetranens subsp pacificus JM иногда ветвятся (рис 11), клетки штамма 2707 образуют споры Строгие анаэробы, экстремальные термофилы, нейтрофилы От других представителей вида Caldanaerobacter subterraneus наши изоляты отличаются способностью к хемолитотрофному росту на СО, сопровождающемуся образованием равного количества Н2 и С02 Также оба штамма растут органотрофно на ряде сбраживаемых субстратов, образуя Н2, С02 и ацетат как основные продукты брожения Оба штамма восстанавливают тиосульфат до H2S во время роста на сбраживаемых субстратах Штамм 2707 восстанавливает гидроморфный оксид трехвалентного железа во время роста на пептоне

Род Thermolithobacter (Bacteria; Firmicutes; Thermohthobacteria;

Thermolithobacterales; Thermolithobacteraceae)

Гидрогеногенный карбоксидотрофный штамм R1 был выделен из пресного гидротермального источника острова Рауль, архипелага Кермадек Источник был расположен на берегу озера вулканического происхождения На основании фенотипического сходства с Carboxydothermus hydrogenoformans он был отнесен к новому виду того же рода "Carboxydothermus restrictus" Впоследствии выяснилось, что последовательность 16S рРНК гена штамма R1T имеет 99% сходства с тремя штаммами хемолитоавтотрофных железоредуцирующих бактерий (JW/KA -1, JW/KA-2T и JW/JH-Fiji-2), выделенными Ю Вигелем шестью годами позже из горячих источников Йеллоустонского Национального парка и острова Фиджи Уровень ДНК-ДНК гибридизации между штаммами R1T и JW/KA-21 составил 35% На основании физиологических характеристик, уровня ДНК-ДНК-гибридизации и анализа последовательности генов 16S рРНК гидрогеногенный штамм R1T и три железоредуцирующих штамма были отнесены к двум новым видам нового рода Thermolithobacter, принадлежащего типу Firmicutes Анализ последовательности генов 16S рРНК показал, что род Thermolithobacter представляет глубокую ветвь на уровне класса в типе Firmicutes На этом основании было предложено отнести новый род Thermolithobacter к новому классу Thermolithobacteria, входящему в филогенетический тип Firmicutes Штамм R1T был описан как типовой штамм нового вида Thermolithobacter carboxydivorans

Новый класс ТЬегто^ЬоЬайепа включает семейство

ТЬегтоЬЛоЬа^егасеае и род ТИегто1иИоЬас1ег В него входят два вида Пегто1иоЬас(ег сагЬ охуск \'о гап.ч - гидрогеногенный СО-троф и ТИегто1икоЬас1ег/егпгескюепз - литоавтотрофный водород-использующий железоредуктор

ТЬегтоМЬоЬа^епа с1а5518 поу.

Класс ТЬегтоЬЙтоЬаЛепа принадлежит к РнтшсШек Представители ТЬегтокЛоЬайепа образуют отдельную линию внутри РптшсЩеБ, облигатно или предпочтительно растут хемолитотрофно Описание класса такое же, как рода Типовой порядок ТЬегто111;ЬоЬас1епа1е5

«5

79

67

83

100

100

• ВвсШш ¡иЬЫх 5иЬ5р аЬЫа 05М10Т (026185) ——— ШтесЬт тШЬуЫюп 05М 3532Т (Х89071) ..............РуЬИпрШсаа апаыоЬш 05М 2949Т (1М68)

> С/йНмАмя Ъищст СБМ 552Т (М59085)

»Ве^/оЮтасиЫ каЬрЫия 1КМ11559т (1188891) • Рерыост тгегТ&и 2М75Т (Х55797) МоаеПй АтяотшорЬхаЪШ 1974Т(Х77849)

ПегтоаяатЬаМ ейачоШ Ш 200Т<Ь09162)

ПтоИИюЬпскг^еггЫисет $1г. КА-2т5ефЬ (АГ282254) Т11егтоШ1юЬпс!ег/етге<1нст (АР282252)

ПегтоШкоЬаскг тЬохуйтят Яг, Ш1 (00095862) Т11егто1ШЬвс(егугггШисею КА-21я (АГ282253)

ТЬегттеготопм Ьуакеюи РЗМ 14490Т(АВ062280) — Пз1ттгаЬас1епт/апга!исет1)Ш 11255х (1175363)

100

. Пяти цтт Б$М 625Т (1.09563) 010

Рис. 12 Безкорневое филогенетическое дерево, показывающее положение видов ТкегтоЬЛоЪаЫег/етгесЬлсет .1\У/КА-2Т и Т сагЪохуйкогапз Шт

Thermolithobacteriales ord. nov.

Описание такое же, как рода Типовое семейство Thermolithobacteraceae

Thermolithobacteraceae fam.nov.

Описание такое же, как рода Типовой род Thermolithobacter

Thermolithobacter gen. nov

Клетки - короткие палочки. Грам-положительный тип клеточной стенки Бактерия Облигатный анаэроб Термофил Нейтрофил Хемолитотроф Г+Ц содержание в ДНК 52-53 ± 1 мол % Типовой вид Thermolithobacter femreducens В род входят два вида- Т ferrireducens и Т carboxydivorans

Клетки Thermolithobacter carboxydivorans - короткие подвижные палочки с перитрихальным жгутикованием, клеточная стенка грамположительного типа Строгий анаэроб, экстремальный термофил, нейтрофил Хемолитоавтотрофно растет на СО, образуя водород, как единственный восстановленный продукт Рост и окисление СО ингибируются пенициллином, эритромицином, хлорамфениколом, но не стрептомицином, рифампицином или тетрациклином (100 мг/мл) Не восстанавливает сульфат, тиосульфат, фумарат или АХДС во время роста на СО Не восстанавливает сульфат, тиосульфат или элементную серу при росте с дрожжевым экстрактом, пируватом, ацетатом, цитратом, сукцинатом, лактатом или смесью Н2/С02 Не растет на СО в присутствии нитрата или трехвалентного железа в виде цитрата или гидроморфного оксида

Штаммы Т ferrireducens росли за счет восстановления гидроморфного оксида трехвалентного железа водородом и были неспособны к росту на СО

Гидрогеногенный карбоксидотрофный представитель рода

Dictyoglomus "Dictyoglomus carboxydivorans" sp. nov. (Bacteria;

Dictioglomi; Dictioglomi; Dictioglomales; DIctioglomaceae)

Штамм 1512 был выделен из источника Трещинный (Восточное термальное поле, кальдера Узон) (табл 1), в котором нами был обнаружен активный процесс трансформации присутствующего в гидротермальном растворе СО Новый изолят хемолитотрофно растет на СО при содержании 5% СО в газовой фазе, образуя Н2 и С02 Способен расти при 15% СО в газовой фазе, при 45% уже не растет Не растет на смеси Н2 С02 (4 1) Органотрофно растет на пирувате Нуждается в

дрожжевом экстракте (0.2 г/л). Время генерации при росте с 5% СО в оптимальных условиях составляет 60 часов. Таким образом, культивирование в атмосфере с низким содержанием СО позволило выделить гидрогеногенный карбоксидотрофный микроорганизм,

относящийся к новому для карбоксидотрофов филогенетическому типу

т

Dictyoglomi, с ближайшим родственником О. /ИегторкПит Н-6-12 (98.6% сходства) (Ба^к! а1., 1985). На основании филогенетических и фенотипических отличий отнесен к новому виду '¿). сагЬохусЦуогапз'

Гидрогеногенный представитель рода Т/иетососсив (АгсЬаеа; Еигуагс11аео1а; ТЬегшососс];ТЬегтососса1е8; ТЬегтососсасеае).

1512.

Рис. 13. Морфология 'Dictyoglomus сагЬохусЦуогапз' 1512. Негативное контрастирование. Шкала 1 мкм

Рис. 14. Морфология Ткегтососст АМ4. Негативное

контрастирование. Шкала 1 мкм.

Штамм АМ4 был выделен из одной из накопительных культур, полученных из проб глубоководных гидротермальных построек, отобранных в районе Восточно-Тихоокеанского поднятия 13°N Он был первым гидрогеногенным карбоксидотрофным представителем гипертермофильных архей. Штамм АМ4 растет на 100% СО, образуя Н2 и С02 В присутствии элементной серы штамм АМ4 рос на дрожжевом или соевом экстрактах, или на пептоне в атмосфере азота Анализ последовательности гена 16SpPHK показал, что он имеет высокое сходство с видами Т gammatolerans (98,9%), Т peptonophilus (98,8%) и Т Stetten (98,7%)

— "Thermococcus wammguaensis" Wai21 .S1 (AF09S975)

-Thermococcus zilhgn AN1T (U765J4)

-Thermococcus waiotapiensis WT1T (AF134982)

-Thermococcus pacificas DSM1(B94T (AJ291811)

Thermococcus sicuh DSM 12349T (A/291808)

г Tliei

~1_ H

Thermococcus celer VU1 Зт (Ш1529) Thermococcus barossn" (U76535) Thermococcus hydrothermahs AL662r (Z70244) ■ "Thermococcus radiophilus" EÍ2 (AF479013)

Thermococcus profundus DT5432T (Z75233) - ThermococcusguaymasenmDSM 111 13T(Y08385)

£

Strain ЛМ4

Thermococcus sp strain 9N2 (Ш50363)

-Thermococcus gammatolerans EJ3T{ W79014)

"Thermococcus marmus" EJ1 (AF479012)

4

" Пеппососсич kodakaraemis" KOD1 (D38650) Thennococcuspeptonophilus DSM 10343T(AJ291810) — Thermococcus Stetten КЗ1 (Z75240)

— Thermococcus gorgonanusT)SM 10395T(AJ291809) "Thermococcus sulfumpklus" 0GL-2QP (AF394925)

l'i

Рис. 15 Филогенетическое положение Thermococcus AM4

Мы проверили способность к росту на СО (100% в газовой фазе) у других представителей Thermococcales Pyrococcus furiosus, Thermococcus peptonophilus,T profundus, T chitonophagus, T stetteri, T gorgonarius, T

/\toralis и Т. ра&/1сиз. Было показано, что ни один из них не способен к анаэробному окислению СО. В то же время все остальные гипертермофильные СО-окисляющие накопительные культуры, полученные из проб глубоководных гидротермальных построек Восточно-Тихоокеанского Поднятия, были представлены кокками, возможно, относящимися к ТЬегтососсакя. К настоящему моменту с нашим участием прочитан полный геном Ткегтососсиз АМ4 и выявлен генный кластер, содержащий гены, кодирующие основные ферменты, участвующие в метаболизме СО: СО-дегидрогеназу и гидрогеназу.

Гидрогеногенный представитель рода ТИегто/Иит. (АгсИаеа;

СгепагсЬае^а; ТИегторпйе1; ТЬегторго1еа1е«; ТИегтоШасеае) "Ткеппо/Иит сагЫ>хуч1о1горИиз" «р. поу.

"Ткегтор.1ит сагЬохускэ^орИив" ер. поу. был выделен из горячего источника в районе вулкана Мутновский. Хемолитотрофно рос на СО при 45% СО в газовой фазе, образуя равные количества Н2 и С02. Облигатно зависел от присутствия дрожжевого экстракта и цистеина (0.2 г/л). Время генерации в данных условиях при температуре инкубации 92°С - 30 часов.

Не рос при 15% СО в газовой фазе, при 100% СО рост значительно замедлялся. Органотрофно рос на дрожжевом экстракте. Не рос на смеси Н2:С02 (4:1), лактате или пептоне. Максимальное сходство по

последовательности гена 16S рРНК - с Thermofilum pendens Hrk-5T (97.8%)

Рис. 16. 'Thermofilum carboxydotrophus' 1505 (ТЭМ, негативное контрастирование). Шкала 1 мкм.

по

(Zilligetal, 1983). (рис. 16)

По филогенетическим и фенотипическим отличиям новый изолят отнесен к новому виду Т carboxydotrophus' 1505т

Таким образом, был выделен еще один представитель гидрогеногенных карбоксидотрофных архей, обладающий наиболее высоким температурным оптимумом роста среди СО-трофных прокариот -92 °С Новый изолят оказался представителем другого филогенетического типа архей - Crenarchaeota, и лишь третьим видом рода Thermofilum (Zillig et al, 1983, Burggraf et al, 1997)

Также оказалось, что последовательность гена 16S рРНК выделенного изолята имела 100% сходства с последовательностями ДНК-клонов, полученных из различных проб горячих источников Йеллоустонского Национального Парка (США) (Barns et al, 1994, Reysenbach et al, 2000, Korf et al, неопубликованные данные) Это позволяет предположить, что представители нового вида Т carboxydotrophus' широко распространены в наземных гидротермах, в том числе в горячих источниках Йеллоустонского Национального Парка

-Г

Г Themococcus gmratolemns г Themococcus sp АШ

Thermococcusjxter ' Mlksiobactenimformaaon

Afethanopyrus kandlen - Thermcplasma aadophilum

Aivhaeoglobwfidgdus -Mihanosarcina barkcri

Halcboclemtm sdamm ' kkthamtncrchum rmhle

Euryarchaeota

" b/Lihamaxats vcmndii

Sulfolobus actdocddcrms DesiJfirococcusmobilis Thermopmteus tenax Г Thmmfihjm pendens 'Thertttfilum carbaxytbtrophus' J

Cbenarchaeota

" Escherichia edi

Рис. 17. Филогенетическое положение 'Thermofilum carboxydotrophus' 1505

Обсуждение результатов

В результате проделанной работы нами было показано, что анаэробные гидрогеногенные карбоксидотрофы широко распространены в гидротермальных местах обитания и составляют существенную часть микробных сообществ гидротерм Мы показали, что в наземных гидротермах идет активный процесс трансформации присутствующего там СО, причем в исследованных нами случаях основным продуктом этого процесса был С02 Мы выделили из различных гидротермальных мест обитания ряд термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, осуществляющих анаэробное окисление СО в реакции с водой, сопряженное с образованием С02 и водорода Мы впервые показали, что в клетках одного из представителей этой группы, Carboxydothermiis hydrogenoformans, содержатся высоко активные компоненты пути Вуда-Льюнгдаля Более глубокое и всестроннее исследование энзимологии гидрогеногенной карбоксидотрофии было осуществлено В А Светличным на примере того же организма (Svetlitchny et al, 2001; 2003, 2004, Dobbek et al, 2001) Наша работа была в большей степени посвящена изучению биоразнообразия гидрогеногенных карбоксидотрофов Эти организмы оказались филогенетически разнообразными, включающими как бактерий типов Firmicutes и Dictioglomi, так и архей типов Euryarchaeota и Crenarchaeota Среди них были как облигатные карбоксидотрофы, так и микроорганизмы, способные к росту на других субстратах Наши исследования значительно расширили представления о фенотипическом и филогенетическом разнообразии термофильных микроорганизмов, способных осуществлять анаэробное окисление СО В дополнение к известным к началу наших работ нескольким анаэробным термофилам, способным окислять СО в процессе роста трем ацетогенам - Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica и Thermoanaerobacter kivuu (Savage et al, 1987, Diekert and Thauer, 1978, Daniel et al, 1990), и одному метаногену - Methanothermobacter thermoautotrophicus (Daniels et al, 1977), мы показали способность к росту за счет анаэробного окисления СО у 15 новых видов темофильных и гипертермофильных прокариот 14 из них относятся к группе гидрогеногенных карбоксидотрофов, использующих для роста энергию реакции СО + Н20 —> С02 + Н2 AG0= - 20 кДж/моль Один из видов, относящийся к роду Carboxydothermiis, окисляет СО в процессе восстановления трехвалентного железа в виде гидроморфного оксида и не образует водород Выделенные нами из гидротермальных мест обитания анаэробные термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты не образуют единую филогенетическую группу В домене Bacteria они представлены в шести различных ветвях типов Firmicutes, а также в типе Dictioglomi В домене Archaea гидрогенногенные

карбоксидотрофы представлены в типах Euryarchaeota и Crenarchaeota Все описанные нами новые гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты обитают в природных термальных местах обитания - горячих источниках различного типа Другими исследователями из ила анаэробного биореактора был выделен еще один термофильный факультативный гидрогеногенный карбоксидотроф - сульфатредуцирующая бактерия Desulfotomaculum carboxydivorans (Parshina et al, 2005) Также было показано, что представитель гипертермофильных архей Archaeoglobus fulgidus может расти на СО, образуя ацетат или, в присутствии сульфатов, сероводород (Henstra et al, 2007) За время наших исследований расширился круг мезофильных гидрогеногенных СО-трофов в дополнение к известному ранее штамму Rhodocyclus gelatinosas были описаны еще три мезофильных бактерии с этим типом метаболизма Rhodospinllum rubrum (Kerby et al, 1995), Citrobacter sp (Jung et al, 2002) и Sulfurospirillum carboxydovorans (Jensen and Finster, 2005). Было также установлено, что Methanosarcina acetivorans может расти на СО, образуя в качестве основных продуктов ацетат и формиат (Rother and Metealf, 2004) Таким образом, выявлено значительно более широкое распространение способности к СО-трофии среди анаэробов, чем это представлялось ранее

Выделенные нами гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты представлены умеренными, экстремальными и гипертермофильными организмами Экстремальные термофилы относятся к бактериальным родам Carboxydothermus, Caldanaerobacter, Thermohthobacter, Dictioglomus Гипертермофилы относятся к археям родов Thermococcus и Thermofillum

Большинство гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот нейтрофилы, нами был выделен только один алкалитолерантный представитель этой группы - Thermmcola carboxydiphda Ацидофильных представителей исследуемой группы пока не обнаружено

Большинство гидрогеногенных карбоксидотрофных покариот, известных к настоящему времени, устойчивы к высоким концентрациям СО и хорошо растут при 100% СО в газовой фазе Только два выделенных нами организма -"Dictyoglomus carboxydivorans" и "Thermofilum carboxydotrophus"- чувствительны к высоким концентрациям СО, оптимально развиваясь при 5 или 45 % СО в газовой фазе Однако даже и эти относительно низкие концентрации СО значительно превышают полученные нами значения содержания СО в гидротермах и полученные нами значения Ks для потребления СО микробным сообществом, обитающим в осадках гидротермального источника Таким образом, возникает вопрос о роли выделенных нами микроорганизмов как агентов трансформации СО в природных горячих местах обитания Исследования Carboxydothermus hydrogenoformans, проведенные голландскими учеными показали, что этот организм способен к потребления чрезвычайно низких

концентраций СО - до 2 ppm (Henstra et al, 2004) Однако полученные нами значения Ks указывают на вероятное существование термофильной микрофлоры с еще более высоким сродством к СО Похожая ситуация наблюдается в аэробной системе, где осуществление процесса окисления СО в природных местах обитания приписывается так называемым «карбоксидоворам» - микроорганизмам с высоким сродством к СО, использующим его в процессе миксотрофного роста (King and Weber, 2007)

Большинство описанных нами микроорганизмов способно к росту на других субстратах помимо СО, но два вида облигатно зависят от СО, - это Carboxydocella thermautoti ophica и Thermincola carboxydophila

Многие описанные нами гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты способны расти за счет восстановления различных акцепторов электронов Было показано, что способность к анаэробному окислению СО и диссимиляционному восстановлению трехвалентного железа является общим признаком ряда таксонов термофильных организмов Эти свойства могут встречаться у разных видов одного рода - как в случае Thermincola carboxydiphila и Thermincola ferriacetica — или сочетаться в одном организме - Thermosmus caroxydivorans, "Carboxydocella ferrireducens" Особый интерес представляют представители рода Carboxydothermus, где мы наблюдаем оба случая сочетания этих свойств

Среди способных к окислению СО анаэробных термофильных прокариот виды, относящиеся к гидрогеногенным карбоксидотрофам, наиболее многочисленны Термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты, как правило, легко выделяются из гидротермальных мест обитания, их численность достигает 10% от числа анаэробных органотрофных организмов в исследованных микробных сообществах гидротерм Это позволяет предположить, что СО окисляющие гидрогеногены играют в них важную роль Гидротермальные системы характеризуются поступлением энергии в виде восстановленных химических соединений, содержащихся в вулканических эксгаляциях СО, наряду с водородом и сероводородом, может служить источником энергии для развития хемолитотрофных прокариот, населяющих гидротермы Автотрофные представители этой группы, такие как Carboxydothermus hydrogenoformans, Thermolithobacter carboxydivorans, представители рода Carboxydocella могут быть первичными продуцентами органического вещества Как автотрофные, так и хемолитогетеротрофные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты окисляют СО с образованием другого энергоемкого соединения - водорода, который является субстратом для многих членов микробных сообществ гидротерм Кроме того, карбоксидотрофные прокариоты удаляют из системы СО, токсичный для многих, как аэробных, так и анаэробных микроорганизмов

выводы

1 Термофильные водородобразующие карбоксидотрофные прокариоты широко распространены в географически удаленных наземных и глубоководных гидротермальных местах обитания с рН от 5,5 до 10,0 и температурами от 50 до 94 "С и составляют существенную часть микробных сообществ гидротерм Установлено, что численность СО-окисляющих водородобразующих термофильных прокариот в горячих источниках кальдеры Узон и Долины Гейзеров составляет до 10% от численности анаэробных органотрофных организмов

2. В клетках Carboxydothermus hydrogenoformans Z-2906 были обнаружены ферментативные активности, характерные для нециклического пути фиксации углерода Вуда-Льюндаля формиатдегидрогеназная, гидрогеназная, СО-дегидрогеназная, спектрофотометрически показано наличие фолатных соединений и ферредоксина Показана высокая активность и термостабильность и низкое сродство к СО выявленной в бесклеточном экстракте СО дегидрогеназной активности

3 Установлено, что в горячих источниках кальдеры Узон при температуре 60-90 °С и нейтральных значениях рН, идет активное окисление СО до С02

4 Группа термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот филогенетически разнообразна В нее входят бактерии типов Firmicutes и Dictyoglomi и археи типов Euryarchaeota и Crenarchaeota. В типе Firmicutes описан новый класс Thermolithobactena, включающий семейство Thermolithobactenaceae и род Thermolithobacter 10 представителей типа Firmicutes отнесены к 5 новым родам класса Clostridia Carboxydothermus, Thermmcola, Carboxydocella, Thermosinus и Caldanaeobacter Выделены и описаны новые гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты Carboxydothermus hydrogenoformans, "Carboxydothermus siderophilus", Thermmcola carboxydiphila, Carboxydocella thermautotrophica, Carboxydocella sporoproducens, "Carboxydocella ferrireducens", Thermosinus carboxydivorans, Caldanaerobacter subterraneus subsp pacificus, Thermolithobacter carboxydivorans, "Dictyoglomus carboxydivorans","Thermofilum carboxydotrophus ", Thermococcus sp AM4

5 Группа термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот метаболически разнообразна, она включает как облигатных СО-

окисляющих литотрофов, так и микроорганизмы, способные к росту на других субстратах

6 Анаэробное окисление СО, сопряженное с образованием водорода, может сопровождаться восстановлением ряда акцепторов электронов, таких как трехвалентное железо, в форме гидроморфного оксида или цитрата, или четырехвалентный селен, в форме селенита Показана способность к росту на СО железоредуцирующих бактерий Thermincola ferriacetica - с образованием водорода и Carboxydothermus femreducens - без образования водорода или ацетата

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1 Светличный В А, Соколова Т,Г., Герхардт М, Заварзин ГА (1990)

Новая группа анаэробных термофильных карбоксидобактерий выделяющих водород Докл АН СССР, 314 742-745

2 Svetlichny V А, Sokolova T.G, Kostrikina NA, Zavarzin GA (1991)

Anaerobic extremely thermophilic carboxydotrophic bacteria in hydrotherms of Kunashir Island Microbial Ecology, 21 1-7

3 Svetlichny, V A , Sokolova T. G., Gerhardt M , Ringpfeil M , Kostrikina N A and Zavarzin G A (1991) Carboxydothermus hydrogenoformans gen nov, sp nov , a CO-utilizing thermophilic anaerobic bacterium from hydrothermal environments of Kunashir Island System Appl Microbiol 14: 254-260

4 Светличный В A, Соколова, Т.Г., Кострикина, H А, Лысенко А М (1994) Carboxydothrmus res trie tus sp nov - новая термофильная анаэробная карбоксидотрофная бактерия Микробиология, 63: 523-528,

5 Пушева М А, Соколова, Т.Г. (1995) Распределение активностей СО-дегидрогеназы при СО-зависимом и пируват-зависимом росте анаэробной термофильной карбоксидотрофной бактерии Carboxydothermus hydrogenoformans Микробиология, 64 581-586

6 Бонч-Осмоловская Е А , Мирошниченко М Л , Слободкин А И , Соколова Т.Г., Карпов Г А, Кострикина Н А , Заварзина Д Г , Прокофьева МИ, Русанов ИИ, Пименов НВ (1999) Биоразнообразие анаэробных литотрофных прокариот в наземных гидротермах Камчатки Микробиология, 68 398-406

7. Sokolova T.G., Gonzales J М , Kostrikina N А , Chernyh N А , Tourova TP, Bonch-Osmolovskaya EA, Robb FT (2001) Carboxydobrachium pacificum gen nov , sp nov , a new anaerobic thermophilic carboxydotrophic actenum from Okinawa Trough Int J System Bacteriol, 51 141-149

8 Sokolova T.G., Kostrikina N A , Chernyh N A , Tourova T.P , Kolganova T V, Bonch-Osmolovskaya E A (2002) Carboxydocella

thermoautotrophica gen nov, sp nov, a novelanaerobic CO-utilizing thermophile from a Kamchatkan hot spring Int J System Evol Microbiol, 52 1961-1967

9. Субботина И В , Черных Н А , Соколова Т.Г., Кубланов И В , Бонч-Осмоловская Е А, Лебединский А В (2003) Олигонуклеотидные зонды для детекции представителей рода Thermoanaerobacter Микробиология, 72 377-382

10 Sokolova, Т. G., Gonzalez, J М, Kostrikina, N А, Chernyh, N А, Slepova, Т. V, Bonch-Osmolovskaya ЕА and Robb, FT (2004a) Thermosinus carboxydivorans gen nov, sp nov, a new anaerobic thermophilic, carbon-monoxide-oxidizing, hydrogenogenic bacterium from a hot pool of Yellowstone National Park Int J Syst Evol Microbiol, 54 23532359

11 Sokolova, T. G., Jeanthon, С, Kostrikina, N A, Chernyh, N A, Lebedinsky, A V, Stackebrandt, E and Bonch-Osmolovskaya, E A (2004b) The first evidence of anaerobic CO oxidation coupled with H2 production by a hyperthermophilic archaeon isolated from a deep-sea hydrothermal vent Extremophiles, 8 317-3236

12 Sokolova T. G., Kostrikina N A , Chernyh N A , Kolganova T V , Tourova T P, Bonch-Osmolovskaya E A (2005) Thermincola carboxydiphila gen nov, sp nov, a new anaerobic carboxydotrophic hydrogenogenic bacterium from a hot spring of Lake Baikal area Int J Syst Evol Microbiol, 55 2069-2073

13 Slepova T V., Sokolova T.G., Lysenko A M, Tourova T P , Kolganova T V, Kamzolkina О V, Karpov G A , Bonch-Osmolovskaya E A (2006) Carboxydocella sporoproducens sp nov, a novel anaerobic CO-utilizing/H2-producing thermophile bacterium from Kamchatka hot spring

Int J Syst Evol Microbiol, 56 797-80014

14 Slobodkin AI, Sokolova T.G, Lysenko AM, Wiegel J (2006) Reclassification of Thermoterrabacterium ferrireducens as Carboxydothermus ferrireducens comb nov, and emended description of the genus Carboxydothermus Int J Syst Evol Microbiol, 56 2349-2351

15 Zavarzma DG, Sokolova T.G., Tourova TP,Chernyh NA, Kostrikina N A , Bonch-Osmolovskaya E A (2007) Thermincola ferriacetica sp nov , a new anaerobic, thermophilic, facultatively chemolithoautotrophic bacterium capable of dissimilatory Fe(III) reduction Extremophiles, 11 1-7

16 Sokolova T, Hanel J, Oneynwoke RU, Reysenbach A-L, Banta A, Geyer R, Gonzalez J, Whitman WB, Wiegel J (2007) Novel chemolithotrophic, thermophilic, anaerobic bacteria Thermohthobacter ferrireducens gen nov , sp nov and Thermohthobacter carboxydivorans sp nov Extremophiles, 11 145-157

17 Слепова ТВ, Русанов ИИ, Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская, Пименов Н В (2007) Радиоизотопное измерение интенсивности

трансформации СО анаэробными термофильными прокариотами Микробиоюгия, 76: 594-601

18 Slepova Т V , Sokolova Т G , Kolganova Т V , Tourova Т Р and Bonch-Osmolovskaya Е A Carboxydothermus sidetophilus sp nov, a novel thermophilic hydrogenogemc carboxydotrophic dissimilatory Fe(III)-reducing bacterium from Kamchatka hot spring hit J Syst Evol Microbiol, in press

19 Kozina I, Hodges M, Lee K, Wagner I, Wiegel J, Slobodkin A, Tourova T, Bonch-Osmolovskaya E, Sokolova T Isolation of Caldanaerobacter strains from terrestrial hot springs and description of Caldanaerobacter uzonensis sp nov Int J Syst Evol Microbiol, submitted

Обзоры

1 Слободкин А И , Заварзина Д Г, Соколова Т.Г., Бонч-Осмоловская ЕА (1999) Диссимиляционное восстановление неорганических акцепторов электронов термофильными анаэробными прокариотами Микробиология, 68 600-622

2 Бонч-Осмоловская Е А, Мирошниченко М JI, Соколова Т.Г., Слободкин А И (2004) Термофильные микробные сообщества новые физиологические группы, новые места обитания В кн Труды Института микробиологии им С Н Винорадского, вып 12 Юбилейный сборник к 70-летию института С 29-40

3 Robb F Т , Gonzalez J М , Sokolova Т., Chernyh N , Lebedinski А , Eisen J A , Wu, M , Tallón L J , Jones К (2005) Primary energy metabolism in geothermal environments The role of carbon monoxide First Biannual Workshop on Geothermal Biology and Geochemistry in Yellowstone National Park Ed W Inskeep

4 Sokolova T G (2008) The genus Carboxydocella Sokolova, Kostrikina, Chernyh, Tourova, Kolganova,and Bonch-Osmolovskaya 2002, 1965 VP Second Edition of Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol 3

5 Sokolova T G (2008) The genus Thermosinus Sokolova, González, Kostrikina, Chernyh, Slepova, Bonch-Osmolovskaya, and Robb 2004, 2357VP Second Edition of Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol 3

6 Sokolova TG and Zavarzina DG (2008) The genus Thermincola Sokolova, Kostrikina, Chernyh, Kolganova, Tourova, Bonch-Osmolovskaya 2005, 2072 VP Second Edition of Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, vol 3

Тезисы конференций.

1 Svethchny V A , Sokolova T.G., Gerhardt M , Zavarzin G A (1990) New СО-utilizing H2-forming anaerobic extremely thermophilic bacterium -

Carboxydothermus hydrogenoformans In Thermophily today International meeting on cell constituents, genetics and biotechnological applications of thermophilic microorganisms Viterbo, Italy, May 7-9,1990, p 30

2 Gerhardt M , Rmgpfeil M , Svetlichny V A., Sokolova T.G., Zavarzin G A, Neumann A ,Genyi K Bath- and Fed-Bath-Fermentation des strict anaerobic thermophilic bacterium - Carboxydothermus hydrogenoformans Iahustagung der Biotechnologen (Dichema), January 30 - February 1, 1991, Berlin, p 28

3 Bonch-Osmolovskaya E A, Miroshnichenko M L, Sokolova T.G., Slobodkin AI Lithotrophic thermophilic anaerobes from Kamchatka thermal areas Thermophiles'98 International Conference, Brest, France, 1998 Absracts B-02

4 Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Bonch-Osmolovskaya E A , Gonzales J M , Robb F T Isolation of new anaerobic thermophilic marine carbon monoxide utilizing bacterium from the hot vent of Okinawa trough Thermophiles'98. International Conference, Brest, France, 1998 Absracts B-P31

5 Sokolova T.G., Kostrikina N A, Chernyh N A, Slobodkin AI, Bonch-Osmolovskaya E A , Gonzales J M , Robb F T Isolation of new anaerobic thermophilic carbon monoxide oxidizing Fe(III) reducing bacterium from a hot spring of Yellowstone National Park Abstracts of 3rd International Congress on Extremophiles 3-7 Sept 2000, Hamburg, Germany, p 67

6 Sokolova T.G., Kostrikina N A , Chernyh N A, Slobodkin AI, Bonch-Osmolovskaya E A, Gonzales J M , Robb F.T Isolation of new anaerobic thermophilic carbon monoxide oxidizing Fe(III) reducing bacterium from a hot spring of Yellowstone National Park Abstracts of 3rd International Congress on Extremophiles 3-7 Sept 2000, Hamburg, Germany, p 67

7 Sokolova T.G., Gonzales J M , Kostrikina N A, Chernuh N A, Tourova TP, Robb FT, Bonch-Osmolovskaya EA (2001) Anaerobic CO oxidation and H2 production by thermophilic bacteria from terrestrial and deep-sea hot vents In Proceedings of the 15th International Symposium of Environmental Biogeochemistry, Wroclaw, Poland, September 11-15, 2001, p 227

8 Sokolova T.G., Kostrikina NA, Jeanthon C., Nercessian OG, Bonch-Osmolovskaya EA Anaerobic extremely thermophilic carbon monoxide oxidizing hydrogen-producing archaeon from deep-sea hot vent at East Pacific Rise In Thermophiles 2001 International Conference, New Delhi, India, December 3-7, 2001, p 3

9 Sokolova T.G., González J, Kostrikina N A, Chernyh N A,Tourova T P , Bonch-Osmolovskaya E A, Robb F Anaerobic CO-oxidizing, H2-producing prokaryotes from volcanic habitats Workshop «Astrobiology in Russia» March 25-29, 2002, St Petersburg, Russia

10 Bonch-Osmolovskaya EA, Miroshnichenko ML, Sokolova T.G., Zavarzina D G, Slobodkin AI Novel anaerobic thermophilic prokaryotes

from terrestrial and deep-sea volcanic habitats In Thermophiles 2001 International Conference, New Delhi, India, December 3-7, 2001, p 3

11 Sokolova T.G., Gonzales J , Kostnkina N A , Chernyh N A , Tourova T P , Bonch-Osmolovskaya E A, Robb F T Thermophilic anaerobic CO-oxidizing, H2-producing prokaryotes In The 4th International Congress on Extremophiles Naples, September 22-26, 2002, p 417

12 Lebedinsky, A , Subbotina, I, Chernyh, N , Sokolova Т., Robb, F , Bonch-Osmolovskaya, E (2004) Is the metabolism of diverse hydrogenogenic carboxydotrophs determined by specific-type carbon monoxide dehydrogenases and hydrogenases7 In The 5th International Congress on Extremophiles Cambridge, Maryland, September 19-23,2004, p 54

13 Sokolova, T. (2004) Metabolic and phylogenetic diversity of thermophilic hydrogenogenic СО-oxidizing prokaryotes In The 5th International Congress on Extremophiles Cambridge, Maryland, September 19-23, 2004, p 106

14 Slepova, T, Subbotina, I, Chernyh, N, Tourova, N, Kostnkina, N, Sokolova T. (2004) Carboxydocella sporoforma sp nov , a novel anaerobic thermophilic, CO-utilizing hydrogenogenic bacterium from a Kamchatka hot spring In, The 5th International Congress on Extremophiles Cambridge, Maryland, September 19-23, 2004, p 112

15 Sokolova T.G. (2005) Thermophilic hydrogenogenic CO-oxidizmg prokaryotes In Thermophiles '05 From evolution to revolution September 18-22 p 56-57

16 Slepova TV, Sokolova T.G., Kolganova TV (2006) Anaerobic thermophilic CO-utilizing hydrogenogenic microorganisms from terrestrial hot springs of Geyzer valley and Uzon Caldera, Kamchatka, Russia In Thermophiles'05 From evolution to revolution September 18 - 22 p 124

17 Sokolova T.G (2006) Thermophilic hydrogenogenic CO-oxidizing prokaryotes from hot volcanic environments In 2nd FEMS congress of European microbiologists Spain, Madrid, July 4-8

18 Слепова ТВ, Колганова ТВ. и Соколова Т.Г. Распространение анаэробных термофильных СО-окисляющих/Н2-образующих микроорганизмов в наземных горячих источниках Долины Гейзеров и Кальдеры Узон, Камчатка, Россия Молодежная школа-конференция "Актуальные аспекты современной микробиологии", Ноябрь 2005, Москва, Россия

19 Slepova Т V, Sokolova T.G., Kolganova Т V and Bonch-Osmolovskaya Е A Anaerobic thermophilic CO-utilizing hydrogenogenic microorganisms from terrestrial hot springs of Geyser Valley and Uzon Caldera, Kamchatka, Russia International workshop "Biodiversity, molecular biology and biogeochemistry of thermophiles", August 2005, Petropavlovsk-Kamchatky, Russia

20 Slepova T, Sokolova T. and Kolganova T Anaerobic thermophilic CO-utilizing hydrogenogenic microorganisms from terrestrial hot springs of Geyser valley and Uzon caldera, Kamchatka, Russia International conference "Thermophiles", September 2005, Cold Coast, Australia Abstract P45

21 Lebedinsky A, Subbotma I, Slepova T, Chernyh N and Sokolova T. Occurrence of coo-type gene clusters in phylogenetically diverse thermophilic CO-oxidizing H2-producing prokaryotes International conference "Thermophiles", September 2005, Cold Coast, Australia Abstract P46

22 Slepova T V, Sokolova T.G., Kolganova T V, Pimenov N V., Rusanov 11 and Bonch-Osmolovskaya E A Hydrogenogenic CO-oxidizing prokaryotes m microbial communities of Kamchatka hot environments 11th International Symposium on Microbial Ecology, August 2006, Vienna, Austria Abstract 374.

23 Slepova T V , Sokolova T.G., Kolganova T V , Tourova T P , Kostnkina N A, Bonch-Osmolovskaya E A A novel thermophilic hydrogenogenic CO-oxidizing Fe(III)-reducing bacterium International conference "Extremophiles", September 2006, Brest, France Abstract P032

24 Slepova T, Sokolova T., Rusanov I, Pimenov N, Lebedinsky A, Kolganova T, Kostnkina N, Bonch-Osmolovskaya E CO transformation by anaerobic microbial communities of Kamchatka hot springs International conference "Thermophiles", September 2007, Bergen, Norway Abstract L9

Заказ № 26/09/08 Подписано в печать 03 09 2008 Тираж ЮОэкз Уел пл 3

ООО "Цифровичок", тет (495) 797-75-76, (495) 778-22-20 ) ) штг с/г т, е-тш1 т/о@с/г ги

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Соколова, Татьяна Геннадиевна

ЧАСТЬ 1. ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы.

Цель и задачи работ.

Научная новизна и значимость работы.

Основные защищаемые положения диссертации.

Публикации.

Структура и объем.

ЧАСТЬ 2. МОНОКСИД УГЛЕРОДА В ПРИРОДНЫХ МЕСТООБИТАНИЯХ И ОКИСЛЕНИЕ ЕГО МИКРООРГАНИЗМАМИ

Глава 2.1. Химические и токсические свойства оксида углерода.

Глава 2.2. Круговорот оксида углерода.

Глава 2.3. Оксид углерода в гидротермальных местообитаниях.

Глава 2.4. Теоретически возможные реакции преобразования

СО в гидротермальных местообитаниях.

Глава 2.5. Аэробные СО-окисляющие прокариоты.

2.5.1. История открытия и разнообразие СО-окисляющих аэробных прокариот.

2.5.2. Метаболизм аэробных СО-окисляющих прокариот.

2.5.3. Функциональные гены аэробных СО-окисляющих прокариот.

2.5.4. Распространение аэробных СО-окисляющих прокариот.

Глава 2.6. Анаэробные карбоксидотрофные прокариоты.

2.6.1. Биоразнообразие анаэробных прокариот способных к росту за счет анаэробного окисления СО.

2.6.2. Термофильные гомоацетатные бактерии способные к росту за счет окисления СО.

2.6.3. Термофильные СО-использующие метанобразующие археи.

2.6.4. Термофильные СО-использующие сульфатредуцирующие бактерии и археи.

2.6.5. Анаэробные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты.

Глава 2.7. Ключевые ферменты метаболизма анаэробных карбоксидотрофных прокариот.

2.7.1. СО дегидрогеназа и ацетил-КоА-синтаза.

2.7.2. Гидрогеназа. Роль гидрогеназ семейства ЕсИ в метаболизме анаэробных прокариот.

Резюме.

ЧАСТЬ 3. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава 3.1. Материалы и методы исследования.

3.1.1. Объекты исследования и места отбора проб.

3.1.2. Культивирование анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофов.

3.1.3. Определение численности микроорганизмов в пробах.

3.1.4. Исследование морфологии и тонкого строения клеток.

3.1.5. Методы, использованные для характеристики роста анаэробных термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофов.

3.1.6. Биохимические и молекулярно-биологические методы, примененные в ходе исследования.

3.1.7. Определение кинетики трансформации СО микробным сообществом горячего источника.

3.1.8. Оценка потенциальной активности и определение основных продуктов анаэробной термофильной трансформации СО микробными сообществами горячих источников.

Глава 3.2. Краткая характеристика и основные черты метаболизма термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот.

Глава 3.3. Экология термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот.

3.3.1. Распространение гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот.

3.3.2. Кинетика трансформации СО термофильными микробными сообществами гидротерм.

3.3.3. Пути трансформации СО микробными сообществами гидротерм.

3.3.4. Численность анаэробных термофильных карбоксидотрофных прокариот в горячих источниках.

Глава 3.4. Описание новых гидрогеногенных карбоксидотрофных термофильных прокариот.

3.4.1. Род Carboxydothermus (Bacteria; Firmicutes;

Clostridia;CIostridiales; Peptococcaceae).

3.4.2. Род Thermincola (Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales; Peptococcaceae).

3.4.3. Род Carboxydocella (Bacteria; Firmicutes; Clostridia; Clostridiales

Syntrophomonadaceae).

3.4.4. Род Thermosinus (Bacteria; Firmicutes; Clostridiales; Acidaminococcaceae).

3.4.5. Карбоксидотрофные гидрогеногенные представители рода Caldanaerobacter (Thermoanaerobacteriales; Thermoanaero-bacteriaceae).

3.4.6. Род Thermolithobacter (Bacteria; Firmicutes; Thermolithobacteria; Thermolithobacterales;

Thermolithobacteraceae).

3.4.7. Гидрогеногенный карбоксидотрофный представитель рода Dictyoglomus.

3.4.8. Гидрогеногенный представитель рода Thermococcus (Archaea; Euryarchaeota).

3.4.9. Гидрогеногенный представитель рода Thermofilum. (Archaea; Crenarchaeota).

Введение Диссертация по биологии, на тему "Термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты"

ЧАСТЬ 1. ВВЕДЕНИЕ Актуальность проблемы.

Оксид углерода - СО - широко известен как высоко токсичный газ для человека и животных. СО - один из важных малых газов атмосферы. Он присутствует в атмосфере в концентрации 0.06-0.15 ppm (IPCC). Значение СО определяется тем, что его участие в фотохимических реакциях в тропосфере приводит к усилению парникового эффекта (Crutzen, 1974, Bergamaschi et al., 2000). Предполагается, что атмосфера ранней Земли содержала СО в значительной концентрации (Holland, 1984; Kasting, 1990; Kharecha et al., 2005); ряд гипотез приписывает СО важную роль в происхождении жизни (Pinto et al., 1980; Chameides and Walker, 1981; Wachtershauser 1997; Miyakawa et al., 2002; Martin and Rüssel, 2003). Аналогами древних биоценозов считаются современные сообщества гидротерм (Заварзин, 1984; Stetter, 2006). Источниками СО в гидротермах являются вулканические газы, которые могут содержать до нескольких % СО по объему (Соколов, 1971; Symonds et al., 1994). СО также может быть продуктом термического разложения органического вещества (Conrad and Seiler, 1985; Schade et al., 1999; Hellebrand and Schade, 2008) и промежуточным метаболитом микробного синтеза или разложения ацетил-КоА по пути Вуда-Льюнгдаля (Conrad and Thaiier, 1983; Diekert et al, 1984; Eikmans et al, 1985; Ragsdale, 2004).

Окисление СО микроорганизмами было открыто в начале прошлого века (Bejerinck and van Delden, 1903; Kaserer, 1906; цит. по Заварзин, 1978). Аэробное окисление СО карбоксидобактериями по реакции: 2СО + 02 = 2С02 подробно изучено (Ножевникова, 1974; Заварзин, 1978; Meyer et al., 1990; Conrad, 1996; King and Weber, 2007). Среди аэробных карбоксидобактерий известно несколько умеренных термофилов (Lyons et al., 1984; Meyer and Schlegel, 1983; Krueger and Meyer 1984; Gadkari et al., 1990). До начала нашей работы было известно, что некоторые анаэробы - ацетогены, метаногены и сульфатредукторы - могут использовать СО как субстрат для роста с образованием ацетата, метана или сероводорода, соответственно. Среди них было известно лишь несколько термофильных представителей (Savage et al., 1987; Diekert and Thauer, 1978; Daniel et al., 1990; Daniels et al., 1977). Кроме того, был выделен один штамм мезофильной фототрофной несерной пурпурной бактерии Rhodocyclus (.Rubrivivaxj gelatinosus, способный расти в темноте в анаэробных условиях за счет окисления СО до С02, сопряженного с восстановлением воды до водорода (Uffen, 1976; 1983). В 1990 г. В.А. Светличным в гидротермальных местах обитания Курильских островов были обнаружены анаэробные СО-окисляющие бактерии с новым для термофилов типом метаболизма, использовавшие для роста энергию реакции: СО + Н20 = С02 + Н2 (AGo= - 20 кДж/моль) (Светличный и др., 1990; Svetlicnhy et al., 1991). К началу наших исследований ничего не было известно о филогенетическом и физиологическом разнообразии водородобразующих (гидрогеногенных) СО-окисляющих (карбоксидотрофных) прокариот, их распространении в гидротермальных местах обитания и роли в микробных сообществах гидротерм.

Интерес к термофильным гидрогеногенным карбоксидотрофным прокариотам носит и прикладной характер. Гидрогеногенные карбоксидотрофы могут быть использованы для получения высокоочищенного водорода при переработке синтез-газа. Синтез-газ, получаемый в результате паровой конверсии природного газа или газификации угля, является наиболее дешевым сырьем для получения водорода и содержит от 29 до 76 % водорода и от 5,6 до 60 % СО. Водород - экологически чистое средство аккумулирования, транспортировки и потребления энергии. Переработка синтез-газа с участием микроорганизмов, образующих водород как один из продуктов, может значительно увеличить выход водорода и одновременно избавляет от токсичного компонента - СО. Помимо этого, СО-трофы, как и все термофильные микроорганизмы, являются потенциальными источниками новых термостабильных ферментов.

Цели и задачи исследования.

Целью представленного исследования являлось изучение термофильных гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот: их физиологического и филогенетического разнообразия, распространения в различных гидротермальных местах обитания, их роли в микробных сообществах гидротерм.

Для достижения поставленной цели были сформулированы следующие задачи: характеристика исследуемой группы и определение активностей предполагаемых ключевых ферментов метаболизма СО у термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот;

2) обнаружение термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот в разнообразных по физико-химическим параметрам и географическому положению наземных и глубоководных гидротермах;

3) определение скорости и основных продуктов трансформации СО микробными сообществами горячих источников;

4) определение численности анаэробных карбоксидотрофных прокариот в горячих источниках;

5) выделение и характеристика микроорганизмов, осуществляющих анаэробную трансформацию СО в горячих источниках.

Научная новизна и значимость работы.

Впервые с помощью разработанного нами радиоизотопного и хроматографического методов показана высокая активность микробной СО трансформации в горячих местах обитания. Определены основные продукты микробной трансформации СО.

Показано физиологическое и филогенетическое разнообразие термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, их широкое распространение в разнообразных гидротермальных местах обитания.

Описана новая физиологическая группа анаэробных термофильных прокариот. Узаконены новый класс, новое семейство, 5 новых родов, 8 новых видов. В типе ПгтюШез описан новый класс ТкегтоШкоЪаМепа, включающий семейство ТкегтоШкоЬа&епа1е8 и новый род ТкегтоШкоЬаЫег, содержащий два вида: Т. сагЪохусИуогат и Т. /егпгес!исепз. Выделены и описаны новые роды СагЬохус1о¡кегтиз, Ткегттсо1а, СагЬохус1осе11а, ТкегтоБтш. Выделены гидрогеногеннные карбоксидотрофные представители рода Dictioglomus и типов ЕигуагсЬаеога и СгепагсЬаео1а: ТНегтососсш АМ4 и новый вид "ТНегторкИит сагЬохус/о^оркш'".

Впервые было показано наличие и высокая активность ферментов метаболического пути Вуда-Льюнгдаля: формиатдегидрогеназы, гидрогеназы, СО-дегидрогеназы, фолатных соединений в бесклеточном экстракте представителя гидрогеногенных СО-окисляющих прокариот С. hydrogenoformans. Показана высокая термостабильность СО-дегидрогеназы.

Практическая значимость работы заключается в том, что разработан аналитический метод нехроматографического разделения газовой смеси метана и СО, и радиоизотопный метод количественного определения продуктов трансформации СО чистыми культурами карбоксидотрофных термофилов и термофильными микробными сообществами. Создана коллекция новых термофильных микроорганизмов, которая может быть использована для целей биотехнологии. Экстремально термофильные бактерии и гипертермофильные археи являются потенциальными продуцентами термостабильных ферментов. Умеренно термофильные гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты представляют большой интерес как потенциальные агенты для переработки синтез-газа с целью получения водорода.

Основные защищаемые положения

1) термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты широко распространены в наземных и глубоководных гидротермальных местах обитания и составляют существенную часть микробных сообществ гидротерм;

2) ключевыми ферментами процесса анаэробного окисления СО с образованием водорода являются СО-дегидрогеназы и гидрогеназы, фиксация углерода происходит с участием СО-дегидрогеназы по пути Вуда-Льюнгдаля;

3) в гидротермальных местах обитания, населенных анаэробными термофильными микробными сообществами, присутствует растворенный СО и идет активный процесс его трансформации, причем основным продуктом является СОг;

4) термофильные гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты разнообразны по фенотипическим свойствам и не образуют единую филогенетическую группу;

5) существуют как факультативно, так и облигатно зависящие от СО термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты, в разной степени чувствительные к высоким концентрациям СО.

Публикации.

Материалы диссертации опубликованы в 49 печатных работах, включая 19 экспериментальных работ, 3 обзора, 3 главы в монографиях, 24 тезисов конференций.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 283 страницах машинописного текста. Экспериментальная часть включает 38 рисунков и 8 таблиц. Работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, содержащей методы и результаты исследования, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 33 русских и 269 английских наименований.

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Соколова, Татьяна Геннадиевна

выводы

1. Термофильные водородобразующие карбоксидотрофные прокариоты широко распространены в географически удаленных наземных и глубоководных гидротермальных местах обитания с рН от 5,5 до 10,0 и температурами от 50 до 94 °С и составляют существенную часть микробных сообществ гидротерм. Установлено, что численность СО-окисляющих водородобразующих термофильных прокариот в горячих источниках кальдеры Узон и Долины Гейзеров составляет до 10% от численности анаэробных органотрофных организмов.

2. В клетках СагЬохус1о1кегти$ куйго^епоЗогтат 2-2906 были обнаружены ферментативные активности, характерные для нециклического пути фиксации углерода Вуда-Льюндаля: формиатдегидрогеназная, гидрогеназная, СО-дегидрогеназная; спектрофотометрически показано наличие фолатных соединений и ферредоксина. Показана высокая активность и термостабильность и низкое сродство к СО выявленной в бесклеточном экстракте СО дегидрогеназной активности.

3. Установлено, что в горячих источниках кальдеры Узон при температуре 60-90°С и нейтральных значениях рН, идет активное окисление СО до С02.

4. Группа термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот филогенетически разнообразна. В нее входят бактерии типов Firmicutes и Dictyoglomi и археи типов Euryarchaeota и Crenarchaeota. В типе Firmicutes описан новый класс Thermolithobacteria, включающий порядок Thermolithobacteriales, семейство Thermolithobacteraceae и род Thermolithobacter. 10 представителей типа Firmicutes отнесены к 5 новым родам класса Clostridia: Carboxydothermus, Thermincola, Carboxydocella, Thermosinus и Caldanaeobacter. Выделены и описаны новые гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты: Carboxydothermus hydrogenoformans, 'Carboxydothermus siderophilusThermincola carboxydiphila, Carboxydocella thermautotrophica, Carboxydocella sporoproducens, "Carboxydocella ferrireducens", Thermosinus carboxydivorans , Caldanaerobacter subterraneus subsp. pacificus, Thermolithobacter carboxydivorans, 'Dictyoglomus carboxydivorans'Thermofilum carboxydotrophus', Thermococcus sp. AM4. Показана способность к росту на СО железоредуцирующих бактерий: Thermincola ferriacetica - с образованием водорода и Carboxydothermus ferrireducens - без образования водорода или ацетата.

5. Группа термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот метаболически разнообразна, она включает как облигатных СО-окисляющих литотрофов, так и микроорганизмы, способные к росту на других субстратах.

ЧАСТЬ 4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проделанной работы нами было показано, что анаэробные гидрогеногенные карбоксидотрофы широко распространены в гидротермальных местах обитания и составляют существенную часть микробных сообществ гидротерм. Мы показали, что в наземных гидротермах идет активный процесс трансформации присутствующего там СО-, причем в исследованных нами случаях основным продуктом этого процесса был С02. Мы выделили из различных гидротермальных мест обитания ряд термофильных гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, осуществляющих анаэробное окисление СО в реакции с водой, сопряженное с образованием С02 и водорода. Мы впервые показали, что в клетках одного из представителей этой группы, СагЬоху^^егтт hydrogenoformans, содержатся высоко активные компоненты пути Вуда-Льюнгдаля. Более глубокое и всестроннее исследование энзимологии гидрогеногенной карбоксидотрофии было осуществлено В.А. Светличным на примере того же организма (БуеШ^Ьпу а1., 2001; 2003; 2004; БоЬЬек е1 а1., 2001). Наша работа была в большей степени посвящена изучению биоразнообразия гидрогеногенных карбоксидотрофов. Эти организмы оказались филогенетически разнообразными, включающими как бактерий типов Рштс^ев и Б1с1:^1огш, так и архей типов ЕигуагсЬаео1а и СгепагсЬаео1а. Среди них были как облигатные карбоксидотрофы, так и микроорганизмы, способные к росту на других субстратах. Наши исследования значительно расширили представления о фенотипическом и филогенетическом разнообразии термофильных микроорганизмов, способных осуществлять анаэробное окисление СО. В дополнение к известным к началу наших работ нескольким анаэробным термофилам, способным окислять СО в процессе роста: трем ацетогенам - Moorella thermoacetica, Moorella thermoautotrophica и Thermoanaerobacter kivuii (Savage et al., 1987; Diekert & Thauer, 1978; Daniel et al., 1990), и одному метаногену - Methanothermobacter thermoautotrophicus (Daniels et al., 1977), мы показали способность к росту за счет анаэробного окисления СО у 15 новых видов темофильных и гипертермофильных прокариот (рис. 3.4.1, табл. 3.4.1). 14 из них относятся к группе гидрогеногенных карбоксидотрофов, использующих для роста энергию реакции СО + Н20 —> С02 + H2 AGo~ - 20 кДж/моль. Один из видов, относящийся к роду Carboxydothermus, окисляет СО в процессе восстановления трехвалентного железа в виде гидроморфного оксида, и не образует водород. Выделенные нами из гидротермальных мест обитания анаэробные термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты не образуют единую филогенетическую группу (рис. 3.4.1, табл. 3.4.1). В домене Bacteria они представлены в шести различных ветвях типов Firmicutes и Dictioglomi. В домене Archaea гидрогенногенные карбоксидотрофы представлены в типах Euryarchaeota и Crenarchaeota. Все описанные нами новые гидрогеногенные СО-окисляющие прокариоты обитают в природных термальных местах обитания - горячих источниках различного типа.

Другими исследователями из ила анаэробного биореактора был выделен еще один термофильный факультативный гидрогеногенный карбоксидотроф - сульфатредуцирующая бактерия Desulfotomaculum carboxydivorans (Parshina et al., 2005). Также было показано, что представитель гипертермофильных архей Archaeoglobus fulgidus может расти на СО, образуя ацетат или, в присутствии сульфатов, сероводород (Henstra et al., 2007). Также расширился круг мезофильных гидрогеногенных СО-трофов: в дополнение к известному ранее штамму Rhodocyclus gelatinosus были описаны еще три мезофильных бактерии с этим типом метаболизма: Rhodospirillum rubrum (Kerby et al, 1995), Citrobacter sp. (Jung et al., 2002) и Sulfurospirillum carboxydovorans (Jensen and Finster, 2005). Было также установлено, что Methanosarcina acetivorans может расти на СО, образуя в качестве основных продуктов ацетат и формиат (Rother and Metealf, 2004). Таким образом, выявлено значительно более широкое распространение способности к СО-трофии среди анаэробов, чем это представлялось ранее.

Выделенные нами гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты представлены умеренными, экстремальными и гипертермофильными организмами. Экстремальные термофилы относятся к бактериальным родам Carboxydothermus, Caldanaerobacter, Thermolithobacter, Dictioglomus. Гипертермофилы относятся к археям родов Thermococcus и Thermofillum.

Большинство гидрогеногенных карбокисдотрофных прокариот нейтрофилы; нами был выделен только один алкалитолерантный представитель этой группы - Thermincola carboxydiphila. Ацидофильных представителей исследуемой группы пока не обнаружено.

Большинство гидрогеногенных карбоксидотрофных прокариот, известных к настоящему времени, устойчиво к высоким концентрациям

СО; онии хорошо растут при 100% СО в газовой фазе. Только два выделенных нами организма - "Dictyoglomus carboxydivorans" и

Thermofilum carboxydotrophus"- чувствительны к высоким концентрациям СО, оптимально развиваясь при 5 или 45 % СО в газовой фазе. Однако даже и эти относительно низкие концентрации СО значительно превышают полученные нами значения содержания СО в гидротермах и значения Ks для потребления СО микробным сообществом, обитающим в осадках гидротермального источника. Таким образом, возникает вопрос о роли выделенных нами микроорганизмов как агентов трансформации СО в природных горячих местах обитания. Исследования

Carboxydothermus hydrogenoformans, проведенные голландскими учеными показали, что этот организм способен к потребления чрезвычайно низких концентраций СО - до 2 ppm (Henstra et al., 2004). Однако полученные нами значения Ks указывают на вероятное существование термофильной микрофлоры с еще более высоким сродством к СО. Похожая ситуация наблюдается в аэробной системе, где осуществление процесса окисления

СО в природных местах обитания приписывается так называемым карбоксидоворам» - микроорганизмам с высоким сродством к СО, использующим его в процессе миксотрофного роста (King and Weber, 2007).

Большинство описанных нами микроорганизмов способно к росту на других субстратах, помимо СО, но два вида облигатно зависят от СО, - это Carboxydocella thermautotrophica и Thermincola carboxydophila.

Многие описанные нами гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты способны расти за счет восстановления различных акцепторов электронов. Было показано, что способность к анаэробному окислению СО и диссимиляционному восстановлению трехвалентного железа является общим признаком ряда таксонов термофильных организмов. Эти свойства могут встречаться у разных видов одного рода - как в случае Thermincola carboxydiphila и Thermincola ferriacetica - или сочетаться в одном организме - Thermosinus caroxydivorans, "Carboxydocella ferrireducens". Особый интерес представляют представители рода Carboxydothermus, где мы наблюдаем оба случая сочетания этих свойств.

Среди способных к окислению СО анаэробных термофильных прокариот виды, относящиеся к гидрогеногенным карбоксидотрофам, наиболее многочисленны. Термофильные гидрогеногенные карбоксидотрофные прокариоты, как правило, легко выделяются из гидротермальных мест обитания, их численность достигает 10 % от числа анаэробных органотрофных организмов в микробных сообществах гидротерм. Это позволяет предположить, что СО окисляющие

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Соколова, Татьяна Геннадиевна, Москва

1. Басков Е.А., Суриков С.Н. (1989). Гидротермы Земли. Л.:Недра.

2. Беляев С.С., Лауринавичус К.С., Иванов М.В. (1975) Определение интенсивности процесса микробиологического окисления метана с14использованием СН4> Микробиология, 44(3): 542-545.

3. Большаков A.M., Егоров A.B. (1987) Об использовании методики фазово-равновесной дегазации при газометрических исследованиях. Океанология, 27(5): 861-862.

4. Гальченко В.Ф. (1994) Сульфатредукция, метанообразование и метаноокисление в различных водоемах оазиса Бангер Хиллс, Антарктида. Микробиология, 63(4): 683-698.

5. Гебрук AB (2002). Биология гидротермальных систем. Изд. «Товарищество науных изданий КМК»

6. Гордон А., Форд Р. (1976). Спутник химика. М.: Мир. 542 стр.

7. Горленко В.М., Бон-Осмоловская Е.А. (1989). Формирование микробных матов в горячих источниках и активность продукционных и деструкционных процессов. В сборнике: «Кальдерные микроорганизмы», М.: Наука

8. Гудвин, Т., Мерсер, Э. (1986) Введение в биохимию растений: В 2 т. // Пер. с англ. А.О. Ганаго и др., Под ред. В.А.Кретовича. М.: Мир.

9. Дедыш С.Н., Паников Н.С. (1997) Влияние концентрации метана на скорость его бактериального окисления в сфагновом торфе. Микробиология. Т. 66(4). С. 563-568.

10. Заварзин Г.А .(1978) Водородные и карбоксидобактерии. М. «Наука».

11. Заварзин Г.А. (1984) Бактерии и состав атмосферы. М., «Наука».

12. Лебединский A.B., Ивановский Р.Н., Ножевникова А.Н. (1976) Состав и концентрация цитохромов в клетках карбоксидобактерий. Микробиология, 45(1):176-177.

13. Мархинин Е.К. (1985) Вулканизм. М.: «Недра».

14. Назина Т.Н., Иванова А.Е., Канчавели Л.П., Розанова Е.П. (1988) Новая спорообразующая термофильная метилотрофная сульфатредуцирующая бактерия, Desulfotomaculum kuznetsovii sp. nov. Микробиология, 57: 823-827.

15. Ножевникова А.Н. (1974). Отношение СО-окисляющих бактерий к окиси углерода. Известия АН СССР. Сер. Биологическая 6: 878-884.

16. Ножевникова А.Н., Заварзин Г.А. (1973) Симбиотическое окисление оксида углерода бактериями. Микробиология 42(1): 158-159.

17. Ножевникова А.Н., Заварзин Г. А. (1974) Таксономия СО-окисляющих Грам отрицательных бактерий. Известия АН СССР. Сер. Биологическая 3: 436-440.

18. Ножевникова А.Н., Савельева Н.Д. (1972) Автотрофная ассимиляция диоксида углерода бактериями, окисляющими оксид углерода. Микробиология 41(6): 939-946.

19. Ножевникова А.Н., Юрганов JI.H. (1979) Цикл атмосферной окиси углерода и использование ее бактериями. В Роль микроорганизмов в круговороте газов в при роде. М.: «Наука», стр. 178-204.

20. Резников A.A., Муликовская Е.П., Соколов И.Ю. (1970) Методы анализа природных проб. М.: Недра.

21. Романова А.К., Ножевникова А.Н., Зыкалова К.А., Алексеева С.А., Веденина И .Я. (1978) Биохимические пути ассимиляции СОкарбоксидобактерией Pseudomonas gazotropha. Микробиология, 47(2): 197202.

22. Романова А.К., Ножевникова А.Н., Леонтьев И.Г., Алексеева С.А. (1977) Пути ассимиляции окислов углерода карбоксидобактериями Seliberia carboxydphydrogena и Achromobacter carboxydus. Микробиология, 46(5): 885-889.

23. Санжиева Э.У., Заварзин Г.А. (1971) Бактерия, окисляющая окись углерода. Докл АН СССР, 196: 956.

24. Соколов В.А. (1971) Геохимия природных газов. М. «Недра».

25. Светличный В.А., Светличная Т.П. (1988) Dictyoglomus turgidus sp. nov. новая экстремально термофильная эубактерия, выделенная из горячих источников Кальдеры вулкана Узон. Микробиология, 57: 435-441.

26. Светличный В.А., Соколова Т.Г., Герхардт М., Заварзин Г.А. (1990) Новая группа анаэробных термофильных карбоксидобактерий выделяющих водород. Докл АН СССР, 314: 742-745.

27. Светличный В.А., Соколова, Т.Г., Кострикина, H.A., Лысенко A.M. (1994) Carboxydothrmus restrictus sp.nov. новая термофильная анаэробная карбоксидотрофная бактерия. Микробиология, 63: 523-528.

28. Шарп Д., Госни И., Роули А. (1993) Практикум по органической химии. М.: Мир.

29. Химия. Большой Энциклопедический словарь. Гл ред. И.Л. Кнунянц. Второе издание. «Большая Российская Энциклопедия». 1998г. 772 стр.

30. Химия. Справочное руководство. ГДР, 1972г. Переводе немецкого. Ленинград: Химия, 1975.

31. Abrini J., Naveau Н., Nyns E.J. (1994) Clostridium autoethanogenum, sp. nov., an anaerobic bacterium that produces ethanol from carbon monoxide. Arch Microbiol, 161: 345-351.

32. Adams M.W.W. (1990a) The structure and mechanism of iron-hydrogenases. Biochim Biophys Acta 1020: 115-145.

33. Adams M.W.W. (1990b) The metabolism of hydrogen by extremely thermophilic, sulfur-dependent bacteria. FEMS Microbiol Rev 75: 219-238.

34. Allard P., Barton M. (2004) High resolution FTIR sensing of magmatic gas composition during explosive eruption of primitive Etna basalt. Geophys Res Abstr 6: 06493.

35. Balk ML, van Gelder Т., Weelink S.A., Stams A.J. (2008) (Per)chlorate reduction by the thermophilic bacterium Moorellaperchloratireducens sp. nov., isolated from underground gas storage. Appl Environ Microbiol, 74: 403-409.

36. Barns S.M., Fundyga R.E., Jeffries M.W., Pace N.R. (1994) Remarkable archaeal diversity detected in a Yellowstone National Park hot spring environment. Proc Natl Acad Sci USA, 91: 1609-1613.

37. Baross J.A., Deming J.W. (1983) Growth of'black smoker' bacteria at temperatures of at least 250 °C. Nature, 303: 423-426

38. Bartholomew G.W., Alexander M. (1981) Soil as a sink for atmospheric carbon monoxide. Science, 212: 1389-1391.

39. Bartholomew G.W., Alexander M. (1982) Microorganisms responsible for the oxidation of carbon monoxide in soil. Environ Sci Technol, 16: 300-301.

40. Bateson M.M., Wiegel J., Ward D.M. (1989) Comparative analysis of 16S ribosomal RNA sequences of thermophilic fermentative bacteria isolated from hot spring cyanobacterial mats. SystAppl Microbiol 12: 1-7.

41. Beeder J., Nilsen R.K., Rosnes J.T., Torsvik T., Lien T. (1994) Archaeoglobus fulgidus isolated from hot North Sea oil field waters. Appl Environ Microbiol 60: 1227-1231.

42. Bell J.M., Falconer C., Colby J., Williams E. (1987) CO metabolism by a thermophilic actinomycete, Streptomyces strain G26. J Gen Microbiol, 133: 3445-3456.

43. Bender M., Conrad R. (1992) Kinetics of CH4 oxidation in oxic soils exposed to embient air or high CH4 mixing ratios. FEMS Microbiol Ecol 101: 261-270.

44. Bender M., Conrad R. (1994) Microbial oxidation of methane, ammonium and carbon monoxide, and turnover of nitrous oxide and nitric oxide in soils. Biogeochem, 27: 97-112.

45. Bennett B., Lemon B.J., Peters J.W. (2000) Reversible carbon monoxide binding and inhibition at the active site of the Fe-only hydrogenase. Biochemistry, 39: 7455-7460.

46. Bergamaschi P., Hein R., Heimann M., Crutzen P.J. (2000) Inverse modeling of the global CO cyclQ.JGeophys Res, 105: 909-1927.

47. Bott M., Thauer R. K. (1987) Proton-motive-force-driven formation of CO from C02 and H2 in methanogenic bacteria. Eur J Biochem 168(2): 407-412.

48. Burggraf S., Jannasch H.W., Nicolaus B., Stetter K.O. (1990) Archaeoglobus profundus sp.nov, represents a new species within the sulfate-reducing archaebacteria. Syst Appl Microbiol, 13: 24-28.

49. Charlou J.L., Donval J.P., Fouquet Y., Jean-Baptiste P., Holm N. (2002) Geochemistry of high H2 and CH4 vent fluids issuing from ultramafic rocks at the Rainbow hydrothermal field (36°14'N, MAR). Chemical Geol, 191: 345359.

50. Conrad R. (1996) Soil microorganisms as controllers of atmospheric trace gases (H2, CO, OCS, N20 and NO). Microbiol Rev, 60: 609-640.

51. Conrad R., Meyer O., Seiler W. (1981) Role of carboxydobacteria in consumption of atmospheric carbon monoxide by soil. Appl Environ Microbiol, 42:211-215.

52. Conrad R., Seiler W. (1982) Utilization of traces of carbon monoxide by aerobic oligotrophic microorganisms in ocean, lake, and soil. Arch. Microbiol, 132:41-46.

53. Conrad R., Seiler W. (1985) Characteristics of biological carbon monoxide formation from soil organic matter, humic acids, and phenolic compounds. Environ Science Technol, 19: 1165-1169.

54. Conrad R., Schütz H., Seiler W. (1988) Emission of carbon monoxide from submerged rice fields into the atmosphere. Atmos Environ, 22: 821-824.

55. Conrad, R., Thauer R.K. (1983) Carbon monoxide production by Methanobacterium thermoautotrophicum. FE MS Microbiol Lett 20: 229-232.

56. Crutzen P.J. (1974) Photochemical reactions initiated by and influencing ozone in unpolluted tropospheric air. Tellus, 26: 47.

57. Cypionka H., Meyer O. (1983) Carbon monoxide-insensitive respiratory chain of Pseudomonas carboxydovorans. J Bacteriol, 156(3): 1178-1187.

58. Daniel S.L., Hsu T., Dean S.I., Drake H.L. (1990) Characterization of thehydrogen- and carbon monoxide-dependent chemolithotrophic potentials of the acetogens Clostridium thermoaceticum and Acetogenium kivui. JBacteriol, 172; 4464-4471.

59. Daniels L., Fuchs G., Thauer R.K., Zeikus J.G.( 1977) Carbon monoxide oxidation by methanogenic bacteria. J Bacteriol, 132: 118-126.

60. Dashekvicz M.P., Uffen R.L. (1979) Identification of a carbon monoxide metabolizing bacterium as a strain of Rhodopseudomonas gelatinosa (Molisch). Int J Syst Bacteriol, 29:145-148.

61. Davidova M.N., Tarasova N.B., Mukhitova F.K., Karpilova I.U. (1994) Carbon monoxide in metabolism of anaerobic bacteria. Can J Microbiol, 40: 417—425.

62. De Lay J., Cattoir H., Reynaerts A. (1970) The quantities measurements of DNA hybridization from renaturation rates. Eur Biochem 12: 133-142.

63. Denton M.D., Reeve W.G., Howieson J.G., Coventry D.R. (2003) Competitive abilities of common field isolates and a commercial strain of Rhizobium leguminosarum bv. trifolii for clover nodule occupancy. Soil Biol Biochem, 35: 1039-1048.

64. Desbruyéres D., Laubier L. (1980) Alvinellapompejana gen. nov., sp. nov., aberrant Ampharetidae from the East pacific Rise hydrothermal vents. Oceanol Acta, 3: 267-274.

65. Desbruyéres D., Laubier L. (1991) Systematics, phylogeny, ecology and distribution of Alvinellidae (Polychaeta) from deep-sea hydrothermal vents. Ophelia 5: 31-45.

66. Diekert G.B., Thauer R.K. (1978) Carbon-monoxide oxidation by Clostridium thermoaceticum and Clostridium formicoaceticum. J Bacteriol, 136. 597-606.

67. Diekert G., Hansch M., Conrad R. (1984) Acetate synthesis from 2 C02 in acetogenic bacteria: is carbon monoxide an intermediate? Arch Microbiol, 138: 224-228.

68. Dobbek H., Svetlichny V., Gremer L., Huber R., Meyer O. (2001) Crystal structure of the carbon monoxide dehydrogenase reveals a Ni-4Fe-5S. cluster. Science, 293(5533): 1281-1285.

69. Dobbek H., Svetlitchnyi V., Liss J., Meyer O. (2004) Carbon monoxide induced decomposition of the active site Ni-4Fe-5S. cluster of CO dehydrogenase. J Am Chem Soc, 126(17): 5382-5387.

70. Doukov, T.I., Iverson, T., Seravalli, J., Ragsdale, S.W., Drennan,C.L. (2002) A Ni-Fe-Cu center in a bifiinctional carbon monoxide dehydrogenase/acetyl-CoA synthase. Science, 298(5593): 567-572.

71. Drake H.L., Daniel S.L. (2004) Physiology of the thermophilic acetogen Moorella thermoacetica. Research in Microbiology, 155: 422-436.

72. Eikmanns B., Fuchs G., Thauer R.K. (1985) Formation of carbon monoxide from C02 and H2 by Methanobacterium thermoautotrophicum. Eur JBiochem 146: 149-154.

73. Erbes D.L., Burris R.H. (1978) The kinetics of methyl viologe oxidation. Biochim Biophys Acta, 525: 45-54.

74. Erickson D.J. (1989) Ocean to atmosphere carbon monoxide flux: Global inventory and climate implications. Global Biogeochem Cyc, 3: 305-314.

75. Felsenstein J. (1981) Evolutionary trees from DNA sequences: a maximum likelihood approach. JMol Evol 17(6): 368-376.

76. Felsenstein J. (1989) PHYLIP Phylogenetic Inference Package version 3.2. Cladistics, 5: 164-166.

77. Ferenci T., Strom T., Quayle J.R. (1975) Oxidation of carbon monoxide and methane by Pseudomonas methanica. J Gen Microbiol, 91(1): 79-91.

78. Ferry J.G., House C.H. (2006) The stepwise evolution of early life driven by energy conservation, molecular biology and evolution. 23(6): 1286-1292.

79. Fitch W.M. (1971) Toward defining the course of evolution: minimum change for a specified tree topology. Systematic Zoology, 20: 406-416.

80. Fitch W.M., Margoliash E. (1967) Construction of phylogenetic trees. Science, 155: 279-284.

81. Fox J.D., He Y., Shelver D., Roberts G.P., Ludden P.W. (1996a) Characterization of the region encoding the CO-induced hydrogenase of Rho do spirillum rubrum . J Bacteriol, 178: 6200-6208.

82. Fox J.D., Kerby R.L., Roberts G.P., Ludden P.W. (1996 b) Characterization of the CO-induced, CO-tolerant hydrogenase from Rhodospirillum rubrum and the gene encoding the large subunit of the enzyme. J Bacteriol, 178: 1515-1524.

83. Frunzke K., Meyer O. (1990) Nitrate respiration, denitrification, and utilization of nitrogen sources by aerobic carbon monoxide-oxidizing bacteria. Arch Microbiol 154: 168-174.

84. Furdui C., Ragsdale S.W. (2000) The role of pyruvate ferredoxin oxidoreductase in pyruvate synthesis during autotrophic growth by the Wood-Ljungdahl pathway J Biol Chem, 275: 28494-28499.

85. Gadkari D., Schricker K., Acker G., Kroppensetdt R. M., Meyer O. (1990) Streptomyces thermoautotrophicus sp. nov., a thermophilic CO- and H2-oxidizing obligate chemolithotroph. Appl Environ Microbiol 56 : 3727-3734.

86. Garofalo K., Tassi F., Vaselli O., Delgado-Huertas A., TedescoD., Frische M., Hansteen T.H. PoredaR.J., Strauch W. (2007) Fumarolic gases at

87. Mombacho volcano (Nicaragua): presence of magmatic gas species and implications for volcanic surveillance. Bull Volcanol 69: 785-795.

88. González J.M., Robb F.T. (2000) Genetic analysis of Carboxydothermus hydrogenoformans carbon monoxide dehydrogenase genes cooF and cooS. FEMS Microbiol Lett, 191: 243-247.

89. González J.M., Sheckells D., Viebahn M., Krupatkina D., Borges K.M., Robb F.T. (1999) Thermococcus waiotapuensis sp. nov., an extremely thermophilic archaeon isolated from a freshwater hot spring. Arch Microbiol, 172: 95-101.

90. Grahame D.A., DeMoll E. (1995) Substrate and accessory protein requirements and thermodynamics of acetyl-CoA synthesis and cleavage in Methanosarcina barkeri. Biochemistry, 34(14): 4617-4624.

91. Greenland L.P. (1986) Gas analyses from the Pu'u O'o eruption in 1985, Kilauea volcano, Hawaii. Bull Volcanol, 48: 341-348.

92. Grethlein A.J., Worden R.M., Jain M.K., Datta R. (1991) Evidence for production of n-butanol from carbon monoxide by Butyribacterium methylotrophicum. J Ferment Bioeng, 72: 58-60.

93. Guenther A., Geron C., Pierce T., Lamb B., Hartley P., Fall R. (2000) Natural emissions of non-methane volatile compounds, carbon monoxide, and oxide of nitrogen from North America. Atmos Environ, 34: 2205-2230.

94. Hansteen T.H., PoredaR.J., Strauch W. (2007) Fumarolic gases at Mombacho volcano (Nicaragua): presence of magmatic gas species and implications for volcanic surveillance. Bull Volcanol, 69: 785-795.

95. Hardy K.R., King G.M. (2001) Enrichment of high-affinity CO oxidizers in Maine forest soil. Appl Environ Microbiol, 67: 3671-3676.

96. Hedderich R. (2004) Energy-converting NiFe. hydrogenases from archaea and extremophiles: ancestors of complex I. J Bioenerg Biomembr, 36: 65-75.

97. Hedderich R., Forzi L. (2005) Energy-converting Ni-Fe.-hydrogenases: more than just H2 activation. J Mol Microbiol Biotechnol, 10: 92 -104.

98. Hendrickson, O. Q., Kubiseski T. (1991) Soil microbial activity at high levels of carbon monoxide. J Environ Qual, 20: 675-678.

99. Hekinian R., Fevrier M., Bischoff J.L., Picot P., Shanks W.C. (1980) Sulfide deposits from the East Pacific Rise near 21°N. Science, 207: 1433-1444.

100. Hekinian R., Fouquet Y. (1985) Volcanism and metallogenesis of axial and off-axial structures on the East Pacific Rise near 13°N. Econ Geol, 80: 221-249.

101. Hellebrand H.J, Schade G.W, (2008) Carbon monoxide from composting due to thermal oxidation of biomass. J Environ Qual, 37: 592-598.

102. Hendrickson O.Q., Kubiseski T. (1991) Soil microbial activity at high levels of carbon monoxide. J Environ Qual, 20: 675-678.

103. Henstra A.M. (2006) CO metabolism of Carboxydothermus hydrogenoformans and Archaeoglobus fulgidus. The PhD Thesis Wageningen University, Wageningen, the Netherlands, ISBN: 90-8504-408-1.

104. Henstra A.M., Dijkema C., Stams A.J.M. (2007a) Archaeoglobus fulgidus couples CO oxidation to sulfate reduction and acetogenesis with transient formate accumulation. Environ Microbiol, 9: 1836-1841.

105. Henstra A.M., Sipma J., Rinzema A., Stams A.J.M. (2007b) Microbiology of synthesis gas fermentation for biofuel production. Current Opinion in Biotechnology, 18: 200-206.

106. Hino S., Tauchi H. (1987). Production of carbon monoxide from aromatic amino acids by Morganella morganii. Arch Microbiol 148: 167-171.

107. Hoehler T.M., Bebout B.M., Marais J.D. (2001) The role of microbial mats in the production of reduced gases on the early Earth. Nature, 412: 324-327.

108. Holden J.F., Takai K., Summit M., Bolton S., Zykowski J., Baross J.A. (2001) Diversity of three novel groups of hyperthermophilic deep-sea Thermococcus species from three sites in the northeastern pacific Ocean. FEMS Microbiol Ecol, 36: 51-60.

109. Holland H.D. (1984) The chemical evolution of the Atmosphere and Oceans. Princeton University Press, Princeton, NJ.

110. Houchins J.P., Burris R.H. (1981) Comparative characterization of two distinct hydrogenases from Anabaena sp. strain 7120. J Bacteriol, 146(1): 215— 221.

111. Hu S.I., Drake H.L., Wood H.G.( 1982) Synthesis of acetyl coenzyme A from carbon monoxide, methyltetrahydrofolate, and coenzyme A by enzymes from Clostridium ihermoaceticum. J Bacteriol, 149: 440-448.

112. Huber H., Huber G., Stetter K.O. (1985) A modified DAPI fluorescence staining procedure suitable for the visualization of lithotrophic bacteria. Syst Appl Microbiol 6: 105-106.

113. Hubley J.H., Mitton J.R., Wilkinson J.F. (1974) The oxidation of carbon monoxide by methane-oxidizing bacteria. Arch Microbiol, 95(4): 365-368.

114. Hugenholtz P., Pitulle C., Hershberger K.L., Pace N.R. (1998) Novel division level bacterial diversity in a Yellowstone hot spring. J Bacteriol, 180: 366-376.

115. Inman R.E., Ingersoll R.B., Levy E.A. (1971) Soil: a natural sink for carbon monoxide. Science, 172: 1229-1231.

116. IPCC (2001) Climate Change 2001, The Scientific Basis. Contribution of Working Group 1 to the Third Assessment Report of the Intergovernmental Panel on Climate Change, Cambridge University Press, New York.

117. Jensen A., Finster K. (2005) Isolation and characterization of Sulfurospirillum carboxydovorans sp. nov., a new microaerophilic carbon monoxide oxidizing epsilon Proteobacterium. Antonie van Leeuwenhoek, 87: 339-353.

118. Johnson K.M., Davis P.G., McN. Sieburth J. (1983) Diel variation of C02 in the upper layer of oceanic waters reflects microbial composition, variation and possibly methane cycle. Marine Biology 77: 1-10.

119. Jones R.D. (1991) Carbon monoxide and methane distribution and consumption in the photic zone of the Sargasso Sea. Deep-Sea Res, 38: 625-635.

120. Jung G.Y., Jung H.O., Kim J.R., Ahn Y., Park S. (1999a) Isolation and characterization of Rhodopseudomonas palustris P4 which utilizes CO with the production of H2. Biotechnol Lett, 21: 525-529.

121. Jung G.Y., Kim J.R., Jung H.O., Park J.Y., Park S. (1999b)A new chemoheterotrophic bacterium catalyzing water-gas shiftreaction. Biotechnol Lett, 21:869-873.

122. Jung G.Y., Kim J.R., Park J.Y., Park S. (2002) Hydrogen production by a new chemoheterotrophic bacterium Citrobacter sp. Y19. Int J Hydrogen Energy, 27: 601-610.

123. Kaneko, Т. et al. (2002) Complete genomic sequence of nitrogen-fixing symbiotic bacterium Bradyrhizobium japonicum USDA110. DNA Res, 9: 189197.

124. Karnovsky M.J. (1965) A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. J Cell Biol, 27: 137A-138A.

125. Kasting J.F. (1990) Bolide impacts and the oxidation state of carbon in the Earth's early atmosphere. Origins of Life, 20: 199-231.

126. Kerby R.L., Hong S.S., Ensign S.A., Coppoc L.J., Ludden P.W., Roberts G.P. (1992) Genetic and physiological characterization of the Rhodospirillum rubrum carbon monoxide dehydrogenase system. J В acteriol, 174: 5284-5294.

127. Kerby R.L., Ludden P.W., Roberts G.P. (1995) Carbon monoxide dependent growth of Rhodospirillum rubrum. J В acteriol, 177: 2241-2244.

128. Kerby R.L., Ludden P.W., Roberts G.P. (1997) In vivo nickel insertion into the carbon monoxide dehydrogenase of Rhodospirillum rubrum : molecular and physiological characterization of cooCTJ. JBacteriol, 179: 2259-2266.

129. Khalil M.A.K., Rasmussen R.( 1994) Global decrease in atmospheric carbon monoxide. Nature, 370: 639-641.

130. Khalil M.A.K. (1999) Atmospheric carbon monoxide. Chemosphere, 1, ix-xi.

131. Kharecha P., Kasting J., Siefert J. (2005) A coupled atmosphere-ecosystem model of the early Archean Earth. Geobiology, 3: 53-76.

132. King G.M. (1999) Attributes of atmospheric carbon monoxide oxidation by Maine forest soils. Appl Environ Microbiol 65: 5257-5264.

133. King G.M. (1999) Characteristics and significance of atmospheric carbon monoxide consumption by soils. Chemosphere, 1: 53-63.

134. King G.M. (2000). Land use impacts on atmospheric carbon monoxide consumption by soils. Global Biochemic Cycles, 14: 1161-1172.

135. King G.M. (2001) Aspects of carbon monoxide production and oxidation by marine macroalgae. Mar Ecol Prog Ser 224: 69-75.

136. King G.M. (2003) Uptake of carbon monoxide and hydrogen at environmentally relevant concentrations by mycobacteria. Appl Environ Microbiol, 69: 7266-7272.

137. King, G. M. (2003) Molecular and culture based analyses of aerobic carbon monoxide oxidizer diversity. Appl Environ Microbiol 69: 7257-7265.

138. King G.M. (2006) Nitrate-dependent anaerobic carbonmonoxideoxidation by aerobicCO-oxidizing bacteria. FEMS Microbiol Ecol, 56: 1-7.

139. King G.M. (2007) Microbial carbon monoxide consumption in saltmarsh sediments FEMS Microbiol Ecol, 59: 2-9.

140. King G.M., Crosby H. (2002) Impacts of plant roots on soil CO cycling and soil- atmosphere exchange. Global Change Biol, 8: 1-9.

141. King G.M., Hungria, M. (2002) Soil-atmosphere CO exchanges and microbial biogeochemistry of CO transformations in a Brazilian agriculture ecosystem. Appl Environ Microbiol, 68: 4480-4485.

142. King G.M., Weber C.F. (2007) Distribution, diversity and ecology of aerobic CO-oxidizing bacteria. Nature Rev Microbiol, 5: 107-118.

143. Kim S.B., Falconer C., Williams E., Goodfellow M. (1998) Streptomyces thermocarboxydovorans sp. nov., and Streptomyces thermocarboxydus sp. nov., two moderately thermophilic carboxydotrophic species from soil. Int J Syst Evol Microbiol, 48: 59-68.

144. Kim S.B., Goodfellow M. (2002) Streptomyces thermospinisporus sp. nov., a moderately thermophilic carboxydotrophic streptomycete isolated from soil. Int J Syst Evol Microbiol, 52: 1225-1228.

145. Klages K.U., Morgan H.W. (1994) Characterization of an extremely thermophilic sulfur-metabolizing archaebacterium belonging to the Thermococcales. Arch Microbiol, 152: 261-266.

146. Klemps R., Cypionka H., Widdel F. & Pfennig N. (1985) Growth with hydrogen, and further physiological characteristics of Desulfotomaculum species. Arch Microbiol, 143: 203-208.

147. Krueger B., Meyer O. (1984) Thermophilic bacilli growing with carbon monoxide. Arch Microbiol, 139: 402-408.

148. Krumholz L.R., Bryant M.P. (1985) Clostridium pfennigii sp. nov. uses methoxyl groups of monobenzenoids and produces butyrate. Int J Syst Bacterio/, 35: 454-456.

149. Kodosky L.G., Motyka RJ, Symonds R.B. (1991) Fumarolic emissions from Mount St. Augustine, Alaska: 1979-1984 degassing trends, volatile sources and their possible role in eruptive style. Bull Volcanol, 53: 381-394.

150. Ktinkel A., Vorholt J.A., Thauer R.K., Hedderich R. (1998) An Escherichia coli hydrogenase-3-type hydrogenase in methanogenic archaea. Eur J Biochem, 252: 467^476.

151. Lane D.J. (1991) 16S/23S rRNA sequencing. In E. Stackebrandt, and M. Goodfellow (ed.), Nucleic acid techniques in bacterial systematics. p. 115-175 John Wiley & Sons, Inc., New York, NY.

152. Lindahl, P.A. (2002) The Ni-containing carbon monoxide dehydrogenase family: Light at the end of the tunnel? Biochemistry, 41: 2097-2105.

153. Lorite M.J., Tachil J., Sanjuan J., Meyer O., Bedmar E.J. (2000) Carbon monoxide dehydrogenase activity in Bradyrhizobium japonicum. Appl Environ Microbiol, 68: 1871-1876.

154. Lorowitz W.H., Bryant M.P. (1984) Peptostreptococcusproductus strain that grows rapidly with CO as the energy source. Appl Environ Microbiol, 47: 961-964.

155. Lupton F.S., Conrad R., Zeikus J.G. (1984) CO metabolism of Desulfovibrio vulgaris strain Madison physiological function in the absence or presence of exogenous substrates. FEMS Microbiol Lett, 23: 263-268.

156. Lyons, C.M., Colby, J.P., Williams, E. (1984) Isolation and characterization and autotrophic metabolism of a moderately thermophilic caboxydobacterium, Pseudomonas thermocarboxydovorans sp. nov. J Gen Microbiol 130: 1097- 1105.

157. Lynd L., Kerby R., Zeikus J.G. (1982) Carbon monoxide metabolism of the methylotrophic acidogen Butyribacterium methylotrophicum. JBacteriol, 149: 255-263.

158. Marmur J. (1961) A procedure for the isolation DNA from microorganisms. J Molecular Biol, 3: 208-218.

159. Martin D.R., Misra A., Drake H.L. (1985) Dissimilation of carbon monoxide to acetic acid by glucose-limited cultures of Clostridium thermoaceticum. Appl Environ Microbiol, 49(6): 1412-1417.

160. Martin W., Russell M.J. (2003) On the origin of cells: an hypothesis for the evolutionary transitions from abiotic geochemistry to chemoautotrophic prokaryotes, and from prokaryotes to nucleated cells. Phil Trans R Soc B, 358: 59-85.

161. Maynard E.L., Lindahl P.A. (1999) Evidence of a molecular tunnel connecting the active sites for C02 reduction and acetyl-CoA synthesis in acetyl-CoA synthase from Clostridium thermoaceticum. J Am Chem Soc, 121: 92219222.

162. Maynard E.L., Lindahl P.A. (2001) Catalytic coupling of the active sites in acetyl-CoA synthase, a Afunctional CO-channeling enzyme. Biochemistry 40(44): 13262-13267.

163. Menyailov I.A., Nikitina L.P. (1980) Chemistry and metal contents of magmatic gases: The new Tolbachilc volcanoes case (Kamchatka). Bull Volcanol 43:197-205.

164. Meuer J., Bartoschek S., Koch J., Kiinkel A., Hedderich R. (1999) Purification and catalytic properties of Ech hydrogenase from Methanosarcina barkeri. Eur JBiochem, 265: 325-335.

165. Meyer O., Rhode M. (1984) Enzymology and bioenergetics of carbon monoxide-oxidizing bacteria. In Microbial growth on CI compounds, pp. 2633. R.L. Crawford, and R.S. Hanson, Eds., American Society for Microbiology, Washington, DC.

166. Meyer O., Schlegel H.G. (1978) Reisolation of the carbon monoxide utilizing hydrogen bacterium Pseudomonas carboxydovorans (Kistner) comb, nov. Arch Microbiol, 118(1): 35-43.

167. Meyer O., Schlegel H.G. (1983) Biology of aerobic carbon monoxide-oxidizing bacteria. Ann Rev Microbiol 37: 277-310.

168. Meyer O., Frunzke K., Gadkari D., Jacobitz S., Hugendieck I., Kraut M. (1990) Utilization of carbon monoxide by aerobes recent advances. FEMS Microbiol Rev 87: 253-260.

169. Meyer O., Stackebranbdt E., Auling G. (1993) Reclassification of ubiquinone Q-10 containing carboxidotrophic bacteria: transfer of

170. Meyer O., Stackebranbdt E., Auling G. (1994). Validation list № 48 Int J Syst Bacteriol 44: 182-183.

171. Meyer O., Frunzke K., Gadkari D., Jacobitz S., Hugendieck I., Kraut M. (2006) Utilization of carbon monoxide by aerobes: recent advances. FEMS Microbial Lett, 87: 253- 260.

172. Miyakawa S., Yamanashi H., Kobayashi K., Cleaves H.J., Miller S.L. (2002) Prebiotic synthesis from CO atmospheres: implications for the origin of life. PNAS, 99: 14628-14631.

173. Min H., Zinder S.H. (1990) Isolation and characterization of a thermophilic sulfate-reducing bacterium Desulfotomaculum thermoacetoxidans sp.nov. Arch Microbiol, 153: 399-404.

174. Mopper K., Zhou X.L., Kieber R.J., Kieber D.J., Sikorski R.J., Jones R.D. (1991) Photochemical degradation of dissolved organic carbon and its impact on the oceanic carbon cycle. Nature, 353: 60-62.

175. Mori K., Hatsu M., Kimura R., Takamizawa K. (2000) Effect of heavy metals on the growth of a methanogen in pure culture and coculture with a sulfate-reducing bacterium. J Bios ci Bioeng, 90: 260-265.

176. Mörsdorf G., Frunzke K., Gadkari D., Meyer O. (1992) Microbial growth on carbon monoxide. Biodegradation, 3: 61-82.

177. Moxley J.M., Smith K.A. (1997) Factors affecting utilization of CO by soils. Soil Biol Biochem, 30: 65-79.

178. Muyzer G. (1998) Structure, function and dynamics of microbial communities: the molecular biological approach. In G. R. Carvalho (ed.), Advances in molecular ecology, p. 87-117. NATO Science Series.

179. O'Brien J.M., Wolkin R.H., Moench T.T., Morgan J.B., Zeikus J.G. (1984) Association of hydrogen metabolism with unitrophic or mixotrophic growth of Methanosarcina barkeri on carbon monoxide. JBacteriol, 158: 373-375.

180. Ohta K. (1997) Diurnal variations of carbon monoxide concentration in the equatorial pacific upwelling region. J Oceanogr, 53: 173-178.

181. Oremland R.S., Hoeft S.E., Santini J.A., Bano N., Hollibaugh R.A., Hollibaugh J.T. (2002) Anaerobic oxidation of arsenite in Mono Lake water and by a facultative, arsenite-oxidizing chemoautotroph, strain MLHE-1. Appl Environ Microbiol 68: 4795-4802.

182. Park S. W. Hwang E.H., Park H., Kim J.A., Heo J., Lee K.H., Song T., Kim E., Ro Y.T., Kim S.W., Kim Y.M. (2003) Growth of mycobacteria on carbon monoxide and methanol. JBacteriol, 185: 142-147.

183. Patel B.K., Morgan H.W., Wiegel J., Daniel R.M. (1987) Isolation of an extremely thermophilic chemoorganotrophic anaerobe similar to Dictyoglomus thermophilum from New Zealand hot springs. Arch Microbiol, 147: 21-24.

184. Peer C.W., Painter M.H., Rasche M.E., Ferry J.G. (1994) Characterization of a CO: heterodisulfide oxidoreductase system from acetate-grown Methanosarcina thermophila. J Bacteriol, 176(22): 6974-6979.

185. Petron G., Gamier C., Khattatov B., Yudin,V., Lamarque J.-F., Emmons L., Gille J., Edwards D.P. (2004) Monthly surface sources inventory based on 20002001 MOPITT satellite data. Geophys Res Lett, 31: L21107.

186. Pimenov N.V., Slepova T.V., Sokolova T.G., Rusanov I.I., Bonch

187. Osmolovskaya E.A. (2007) Microbial activity in Uzon Caldera (Kamchatka)thhot springs. 18 International Symposium on Environmental Biogeochemistry, Taupo, New Zealand. Abstract G-9.

188. Plügge C., Balk M., Stams A.J.M. (2002) Desulfotomaculum thermobenzoicum subsp. thermosyntrophicum subsp. nov., a thermophilic syntrophic propionate-oxidizing spore-forming bacterium. Int J Syst Evol Microbiol, 52: 391-399.

189. Potter C.S., Klooster S.A., Chatfield R.B. (1996) Consumption and production of carbon monoxide in soils: a global model analysis of spatial and seasonal variation. Chemosphere, 33: 1175-1193.

190. Prieur (2005) Microbiology of Deep-Sea Hydrothermal Vents: Lessons for Mars Exploration. In Water on Mars and Life, pp. 299-324. Tetsuya Tokano (ed.), Adv. Astrobiol. Biogeophys.

191. Ragsdale S.W. (2004) Life with carbon monoxide. Crit Rev Biochem Mol Biol, 39(3): 165-95.

192. Ragsdale, S.W., Kumar M. (1996) Ni containing carbon monoxide dehydrogenase/acetyl-CoA synthase. ChemRev, 96: 2515-2539.

193. Reynolds E.S. (1963) The use of lead citrate at high pH as electron opagae strain in electron microscopy. J Cell Biol, 17: 208.

194. Reysenbach A.L., Ehringer M., Hershberger K. (2000) Microbial diversity at 83 degrees C in Calcite springs, Yellowstone National Park: another environment where the Aquificales and 'Korarchaeota' coexist. Extremophiles, 4: 61-67.

195. Robinson E., Robbins R.C. (1972) Emissions, concentrations and fate of gaseous atmospheric pollutants. In Air Pollution Control, pp. 1-94. W. Strauss (Ed.), Wiley Interscience, NY.

196. Rother M., Metcalf W.W. (2004)Anaerobic growth of Methanosarcina acetivorans C2A on carbon monoxide: an unusual way of life for a methanogenic archaeon. Proc Natl Acad Sci USA, 101: 16929-16934.

197. Saiki T., Kobayashi Y., Kawagoe K., Beppu T. (1985) Dictyoglomus thermophilum gen. nov., sp. nov., a chemoorganotrophic, anaerobic, thermophilic bacterium. Int JSyst Bacteriol 35: 253-259.

198. Saitou N., Nei M. (1987) The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees. Mol Biol. Evol, 4(4): 406-425.

199. Sakai, H., Gamo, T., Kim, E.-S., 10 other authors (1990). Unique chemistry of the hydrothermal solution in the mid-Okinawa Trough back arc basin. Geophys Res Lett, 17: 2133-2136.

200. Sandbeck, K.A., Ward D.M. (1982) Temperature adaptations in theterminal processes of anaerobic decomposition of Yellowstone National Parkand Icelandic hot spring microbial mats. Appl Environ Microbiol 44: 844-851.

201. Sanger F., Nicklen S., Coulson A.R. (1977) DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci USA, 84: 5463-5467.

202. Sanhueza E., Dong Y., Scharffe D., Lobert J.M., Crutzen P.J. (1998) Carbon monoxide. Tellus, 50B: 51-58.

203. Sapra R., Bagramyan K., Adams M.W. (2003) A simple energy-conserving system: proton reduction coupled to proton translocation. Proc Natl Acad Sci USA, 100: 7545-7550.

204. Sato M., Mori T., Shimoile Y., Nagao K., Notsu K. (2002) Carbon isotope systematic of C02, CO and CH4 in fumarolic gases from Satsuma-Iwojimavolcanic island, Japan. Earth Planets Space, 54: 257-263.

205. Savage M.D., Wu Z.G., Daniel S.L., Lundie L.L., Drake H.L. (1987) Carbon monoxide-dependent chemolithotrophic growth of Clostridium thermoautotrophicum. Appl Environ Microbiol, 53: 1902-1906.

206. Seetfeldt L.C., Rasche M.E., Ensign S. (1995) Carbonyl sulfide and carbon dioxide as new substrates, and carbon disulfide as new inhibitor, of nitrogenase. Biochemistry, 34: 5382-5389.

207. Seiler W. (1974) The cycle of atmospheric CO. Tellus, 26: 116-135.

208. Seiler W., Conrad R. (1987) Contribution of tropical ecosystems to the global budgets of trace gases, especially CH4, H2, CO, and N20. In The Geophysiology of Amazonia, Ch.9, pp. 133-162. Dickinson R.E. (Ed), John Wiley, New York,

209. Seravalli J., Ragsdale S.W., (2000) Channeling of Carbon Monoxide during anaerobic carbon dioxide fixation. Biochemistry, 39 (6): 1274 -1277.

210. Schade G.W., Hofmann R.-M., Crutzen P.J. (1999) CO emissions from degrading plant matter (I). Measurements. Tellus, 51B: 889-908.

211. Schade G.W. Crutzen P.J. (1999) CO emissions from degrading plant matter. (II). Estimate of a global source strength. Tellus 51: 909-918.

212. Scharffe D., Hao W. M., Donoso L., Crutzen P. J., Sanhueza E. (1990) Soil fluxes and atmospheric concentration of CO and CH4 in the northern part of the Guayana Shield, Venezuela. J Geophys Res, 95: 22475-22480.

213. Schneider K., Cammack R„ Schlegel H.G., Hall D.O. (1979) The iron-sulphur centres of soluble hydrogenase from Alcaligenes eutrophus. Biochim BiophysActa 578: 445^61.

214. Sharak Genthner B.R., Bryant M.P. (1982) Growth of Eubacterium limosum with carbon monoxide as the energy source. Appl Environ Microbiol, 43: 70-74.

215. Sharak Genthner B.R., Bryant M.P. (1987) Additional characteristics of one-carbon-compound utilization by Eubacterium limosum and Acetobacterium woodii. Appl Environ Microbiol, 53: 471-476.

216. Shelver D., Kerby R.L., He Y„ Roberts G.P. (1997) CooA, a CO-sensing transcription factor from Rhodospirillum rubrum, is a CO-binding heme protein. Proc Natl Acad Sci USA, 94: 11216-11220.

217. Shen G.J, Shieh J.S, Grethlein A.J, Jain M.K, Zeikus J.G. (1999) Biochemical basis for carbon monoxide tolerance and butanol production by Butyribacterium methylotrophicum. Appl Microbiol Biotechnol, 51: 827-832.

218. Shock L.E, (1993). Hydrothermal dehydration of aqueous organic compounds. Geochim Cosmochim Acta, 57: 3341-3349.

219. Silva P.J, van den Ban E.C, Wassink H, Haaker H,de Castro B, Robb F.T, Hagen W.R. (2000) Enzymes of hydrogen metabolism in Pyrococcus furiosus. Eur JBiochem, 267: 6541-6551.

220. Singer S.W, Hirst M.B,. Ludden P.W. (2006) CO-dependent H2 evolution by Rhodospirillum rubrum: role of CODH:CooF complex. Biochim Biophys Acta, 57(12): 1582-1591.

221. Sipma J., Henstra A.-M., Parshina S.N., Lenz P.N.L., Lettinga G., Stams A.J.M. (2006) Microbial CO conversions with applications in synthesis gas purification and bio-desulfurization. Crit Rev Biotech, 26: 1-25.

222. Soboh B., Linder D., Hedderich R. (2002) Purification and catalytic properties of a CO-oxidizing:H2-evolving enzyme complex from Carboxydothermus hydrogenoformans. Eur J. Biochem, 269: 5712-5721.

223. Spiess F.N. (1980) East Pacific Rise: Hot springs and geophysical experiments. Science, 207(4438): 1421-1432.

224. Stetter K.O., Lauerer G., Thomm M., Neuner A. (1987) Isolation of extremely thermophilic sulfate reducers: Evidence for a novel branch of archaebacteria. Science, 236: 822-824.

225. Stetter K.O. (1988) Archaeoglobus fulgidus gen. nov., sp. nov.: a new taxon of extremely thermophilic archaebacteria. Syst Appl Microbiol, 10: 172173.

226. Stetter K.O., Huber R., Blochl E., Kurr M., Eden R.D., Fielder M., Cash H.,Vance I. (1993) Hyperthermophilic archaea are thriving in deep North Sea and Alaskan oil reservoirs. Nature, 365: 743-745.

227. Stupperich E., Fuchs G. (1984) Autotrophic synthesis of activated acetic acid from two C02 in Methanobacterium thermoautotrophicum. Arch Microbiol, 139: 14-20.

228. Svetlichny V.A., Sokolova T.G., Kostrikina N.A., Zavarzin G.A. (1991) Anaerobic extremely thermophilic carboxydotrophic bacteria in hydrotherms of Kunashir Island. Microbial Ecology, 21: 1-7.

229. Svetlitchnyi V., Peschel C., Acker G., Meyer O. (2001) Two membrane-associated NiFeS-carbon monoxide dehydrogenases from the anaerobic carbon-monoxide-utilizing eubacterium Carboxydothermus hydrogenoformans, J Bacteriol, 183: 5134-5144.

230. Swinnerton J.W., LinnenbomV.J., Lamontagne R.A. (1970). The ocean: a natural source of carbon monoxide. Science, 167, 984-986.

231. Symonds R.B., Rose W.I., Bluth G.J.S., Gerlach T.M. (1994) Volcanic gas studies: Methods, results and applications. In Volatiles in Magma (Carroland MR & Holloway JR, eds) pp. 1-66. Mineral Society of America, Washington, DC.

232. Tanner R.S., Miller L.M., Yang D. (1993) Clostridium ljungdahlii sp. nov., an acetogenic species in clostridial ribosomal-RNA homologygroup-I. Int JSyst Bacteriol, 43: 232-236.

233. Tarr M.A., Miller W.L., Zepp R.G. (1995) Direct carbon monoxide photoproduction from plant matter. J Geophys Res, 100: 11403-11413.

234. Tassi F., Martinez C., Vaselli O., Capaccioni B., Viramonte J. (2005b). Light hydrocarbons as redox and temperature indicators in the geothermal field of El Tatio (northern Chile). Appl Geochem 20: 2049-2062.

235. Tersteegen, A., Hedderich, R. (1999) Methanobacterium thermoautotrophicum encodes two multi-subunit membrane-bound NiFe. hydrogenases.Transcription of the operons and sequence analysis of the deduced proteins. Eur JBiochem, 264: 930-943.

236. Thauer R.K., Käufer B., Zähringer M., Jungermann K. (1974) The reaction of iron-sulfur protein hydrogenase with carbon monoxide. Eur J Biochem, 42: 447-452.

237. Thompson, A.M. (1992) The oxidizing capacity of the Earth's atmosphere: probable past and future changes. Science, 256: 1157-1165.

238. Thompson J.D., Higgins D.G., Gibson T.J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice. Nucleic Acids Res, 22: 4673-4680.

239. Tolli, J.D., Taylor C.D. (2005) Biological CO oxidation in the Sargasso Sea and in Vineyard Sound, Massachusetts. Limnol Oceanogr, 50: 1205-1212.

240. Uffen R.L. (1976) Anaerobic growth of a Rhodopseudomonas species in the dark with carbon monoxide as sole carbon and energy substrate. Proc Natl AcadSci USA, 73: 3298-3302.

241. Uffen R.L. (1981) Metabolism of carbon monoxide. Enzyme Microbial Technol, 3: 197-206.

242. Uffen RL. (1983) Metabolism of carbon monoxide by Rhodopseudomonas gelatinosa: cell growth and properties of the oxidation system. J Bacteriol 155: 956-965.

243. Van de Peer Y., De Wachter R. (1994) TREECON for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for the Microsoft Windows environment. Comput Applic Biosci, 10(5): 569-570.

244. Vignais P.M., Billoud B, Meyer J. (2001) Classification and phylogeny of hydrogenases. FEMS Microbiol Rev, 25: 455-501.

245. Vignais P.M., Billoud B. (2007) Occurrence, classification, and biological function of hydrogenases: an overview. Chem Rev, 107(10): 4206-4272.

246. Volbeda A, Charon M.H., Piras C, Hatchikian E.C., Frey M, Fontecilla-Camps J.C. (1995) Crystal structure of the nickel-iron hydrogenase from Desulfovibrio gigas. Nature, 373: 580-587.

247. Volbeda A, Fontecilla-Camps J.C. (2004) Crystallographic evidence for a CO/CO2 tunnel gating mechanism in the bifunctional carbon monoxide dehydrogenase/ acetyl Coenzyme A synthase from Moorella thermoacetica. J Biol Inorg Chem, 9(5): 525-532.

248. Voordouw G. (2002) Carbon monoxide cycling by Desulfovibrio vulgaris Hildenborough. JBacteriol, 184: 5903-5911.

249. Wardell L.J, Kyle P.R, Chaffin C. (2004) Carbon dioxide and carbon monoxide emission rates from an alkaline intra-plate volcano: Mt. Erebus, Antarctica. J Volcanol Geotherm Res, 131: 109-121.

250. Warneck P. (1999). Chemistry of the Natural Atmosphere, 2nd ed. International Geophysics Series Vol.71, Academic Press, New York, Ch.4.

251. Weber C.F, King G.M. (2007) Physiological, ecological, and phylogenetic characterization oiStappia, a marine CO-oxidizing bacterial genus. ApplEnviron Microbiol, 73: 1266-1276.

252. Wachtershauser G. (1997) The origin of life and its methodological challenge. J Theor Biol, 187: 483-494.

253. Wächtershäuser G. (2006) From volcanic origins of chemoautotrophic life to Bacteria, Archaea and Eukarya. Phil Trans R Soc B, 361: 1787-1808.

254. Wiegel J., Braun M., Gottschalk G. (1981) Clostridium thermoautotrophicum species novum, a thermophile producing acetate from molecular hydrogen and carbon dioxide. Curr Microbiol, 5: 255-260.

255. Wilks S.S. (1959) Carbon monoxide in green plants. Science, 129: 964966.

256. Whalen S.C., Reeburgh W.S. (2001) Carbon monoxide consumption in upland boreal forest soils. Soil Biol Biochem 33: 1329-1338.

257. Wray J.W., Abeles R.H. (1993) A bacterial enzyme that catalyzes formation of carbon monoxide. J Biol Chem, 268: 21466-21469.

258. Yagi, T. (1959) Enzymic oxidation of carbon monoxide. II. JBiochem (Tokyo), 46: 949-955.

259. Yang H.C., Drake H.L. (1990) Differential effects of sodium on hydrogen-and glucose-dependent growth of the acetogenic bacterium Acetogenium kivui. Appl Environ Microbiol, 56(1): 81-86.

260. Zavarzin G.A., Nozhevnikova A.N. (1977) Aerobic carboxydobacteria. Microb Ecol, 3: 305-326.

261. Zeikus J.G., Wolfe R.S. (1972) Methanobacterium thermoautotrophicus sp. n., an anaerobic, autotrophic, extreme thermophile. JBacteriol, 109: 707- 713.

262. Zhao W.D., Zhang C.L., Romanek C.S. (2006). Geochemistry of reduced gases and carbon dioxide in Kamchatka hot springs. In UGA Academy of the Environment Symposium, Athens, GA.