Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Восстановление элементной серы в микробных сообществах гидротерм

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Восстановление элементной серы в микробных сообществах гидротерм"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ

РГ6 од

■ На правах рукописи

УДК 579.68 (269)

БОНН-ОСМОЛОВСКАЯ Елизавета Александровна

ВОССТАНОВЛЕНИЕ ЭЛЕМЕНТНОЙ СЕРЫ В МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВАХ ГИДРОТЕРМ

(03.00.07 - микробиология)

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

Москва -

1994

Работа выполнена в Института микробиологии РАН

Научный консультант член-корреспондент РАН, профессор Г.А.Заварзин

Официальные оппоненты:

академик РАН, профессор E.H. Кондратьева

доктор химических наук И.И. Волков

доктор биологических наук Е.Л. Головлев

Ведущая организация:

Кафедра микробиологии Биологического факультета Санкт-Петербургского государственного университета

Защита диссертации состоится " /8" илсиЯ 1994 г. в ¡4 часов на заседании Специализированного совета Д.002.64.01 по защите диссертаций при Институте микробиологии РАН по адресу: 117811 Москва, проспект 60-летия Октября, д.7, корп. 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии РАН.

Диссертация разослана " f3" (Xti^yCUj 1994 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук

Л.Е. Никитин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблелы.

В течение последних десятилетий существует устойчивый интерес к микробным сообществам гидротврм. Этот интерес обусловлен принципиальным значением микробной жизни в гидротермах как собственно для микробиологии, так и для других областей естествознания.

Биоценозы гидротерм представляют собой уникальные сообщества живых существ. Развиваясь при высоких температурах (от 40-45°С до точки кипения), они образуются в основном прокариотами - термофильными эу~ и архебактериями. Подавляющее большинство микроорганизмов, входящих в состав микробных сообществ гидротерм, не встречается в других местообитаниях. Таким образом, гидротермы являются богатейшим источником для выделения новых таксонов бактерий со специфическими физиолого-биохимическими свойствами, часто биотехнологически ценными.

Микробные сообщества гидротерм относят к наиболее древним биоценозам Земли; их изучение играет важную роль в формировании представлений об эволюции биосферы.

Особенностью биогеохимических циклов, функционирующих в гидротермах, является постоянное вовлечение в них продуктов вулканической активности. В частности, для термальных местообитаний характерна значительная роль цикла серы, соединения которой, имеющие исходно вулканическое происхождение, участвуют затем в цепи реакций, в том числе и осуществляемых микроорганизмами.

Элементная сера является одной из наиболее количественно значимых форм серы в гидротермах. Способность микроорганизмов к восстановлению элементной серы в сероводород известна давно; данные последних лет указывают на большое значение этого процесса именно для термофильных микроорганизмов, обитающих в гидротермах. Однако биогеохимическая роль процесса бактериальной еероредукции в гидротермах не определена.

Восстановление элементной серы может осуществляться литоавто-трофвыми микроорганизмами в процессе продукции органического вещества; этот же процесс может слукить терминальной восстановительной реакцией при его анаэробной деструкции. Среди подобных реакций наиболее значимыми с точки зрения биогеохимии считаются сульфатредук-

ция и метаногеназ. Вклад бактериальной свроредукции в процесс де струкции органического вещества в большинстве экосистем, как прави ло, не учитывается; конкретные механизмы участия сероредуцирующи бактерий в анаэробном цикле углерода не исследованы.

Таким образом, помимо специального интереса к микробным сооб ществам гидротерм как к уникальным биоценозам, они могут являться i удобным объектом для исследования нового терминального процесс; анаэробной деструкции - бактериальной сероредукции.

Состояние вопроса.

Способность микроорганизмов осуществлять восстановление элементной серы в сероводород в процессе анаэробного роста была впервые продемонстрирована Пельшем на примере водород-использующих се-роредуцирующих организмов - "Hydrogenthlóbacterla" (Пельш, 1936). 1 настоящее время показано, что эта реакция широко распространен! среди микроорганизмов, относящихся к различным таксономическим i физиологическим грушам, и выполняет разнообразные функции в их метаболизме - от побочной реакции до ключевого катаболического процесса (Ъе Faou et al., 1991; Schauder, Kroger, 1993). Группа обЛИ-гатных сероредуцирувдих бактерий относительно невелика и таксономи-чески разнородна. Первым таким организмом, долгое время остававшимся единственным представителем этой группы, была мезофильная эубак-терия De8ulfuromorva3 acetoxídana (Pfennig, Biebl, 1976); ее основным энергетическим субстратом является ацетат. Диссимиляционяая се-роредукция, или серное дыхание, свойственна также некоторым факультативным или облигатным анаэробам как один из альтернативных способов получения энергии (Widdel, Hansen, 1991). К моменту начала нашей работы в 1982 г. среда субстратов мезофильных бактерий с сернт дыханием были известны ацетат, молекулярный водород, формиат, лак-тат, что определяло их экологическую роль как участников терминального этапа анаэробной деструкции органического вещества - анаэробного окисления продуктов брожения. Вместе с тем роль сероредукции i процессе анаэробной деструкции органического вещества либо не рассматривалась, . либо считалась пренебрежимо малой (Lovley, Klug, 1986). В последувдие года появились данные, указывающие на значимость процесса бактериального восстановления элементной серы в эв-трофицированных морских и пресноводных осадках (Кучинскене, 1988,

Михеев и др., 1990, Горленко и др., 1990); недавно опубликованные данные расширили спектр субстратов, окисляемых в процессе серного дыхания, который включает теперь ряд летучих жирных кислот (Finster, Bak, 1993). Вместе с тем роль сероредуциругацих бактерий в мезофиль-ных анаэробных сообществах пока не охарактеризована.

Интерес к бактериальному восстановлению элементной серы получил мощный стимул в процессе исследования микробных сообществ гидротерм. Исследование термальных местообитаний, начатое в 60-е годы работами Брока в Иеллоустонском национальном парке ..(Brook, .1978), привело к открытию большого числа новых термофильных организмов, часто с высоким биотехнологическим потенциалом, что в свою очередь дало толчок к поиску новых термофильных бактерий. Совпав по времени с пиком интереса к анаэробным микроорганизмам и процессам, исследование термальных местообитаний в 1970-80-е годы привело к описанию ряда новых таксонов облигатно анаэробных бактерий. Из Иеллоустон-ского национального парка были выделены умеренно термофильные орга-нотрофг, метаногены, сульфатредукторы (Zeikus et al., 1979; Zeikus et al., 1980; Zeikus et al., 1983).

Немаловажную роль в привлечении внимания к микробным сообществам гидротерм сыграло сенсационное сообщение Дж. Барроса (Вагозз, Deming, 1983), впоследствии не подтвердившееся: о микробиологических процессах в глубоководных гвдротермах ("черных курильщиках"), протекающих при температуре 250°0.

Микробные сообщества наземных гидротерм исследовались в основном на примере цианобактериалъных матов, развивающихся при температуре 40-65°С. Было показано, что сульфатредукция и метаногенез являются основными процессами анаэробной деструкции органического вещества цианобактерий; важную роль в процессе утилизации продуктов брожения играет также фотоассимиляция их Ghloroflexua auronttacua -одним из основных фототрофных компонентов мата (Ward et al., 1984, Ward, et al., 1989).

В России исследования микробных процессов, протекающих в вулканических местообитаниях были начаты еще работами С.И. Кузнецова по гидротермам Камчатки (1955), продолжены Заварзиным, Ивановым, Каравайко (Заварзин, Жилина, 1964, Иванов, Каравайко, 1966; Завар-зин и др., 1967, ivanov et al., 1968). Связанные по большей части с исследованием окислительных микробиологических процессов в гидро-

термах, эти работы указывали на особое значение цикла серы для тер мальных биотопов. В более поздних работах Герасименко и Орлеанског по цнанобактериальным матам кальдеры Узон был исследован видово состав цианобактерий, охарактеризованы процессы газового обмена литификации (Герасименко и.др., 1989). Полученные данные послужил основой для обоснования гипотезы о вкладе цианобактериальных сооб ществ докембрия в формирование современной атмосферы Земли (Завар зин, 1984). Одновременно было начато исследование метанобразущи бактерий, входящих в состав термофильных цианобактериальных мато (Кожевникова, Ягодина, 1982, Жилина и др., 1986).

Элементная сера является одной из наиболее распространенны форм серы в термальных местообитаниях. Ее участие в метаболизм термофильных бактерий, обитающих в гидротермах, было вначале уста новлено для аэробных бактерий, окисляющих серу. Из гидротерм Итали и йеллоустонского национального парка был выделен Sulfolobus aciclo caldartua (Brook et al., 1967) - термоацидофильный организм, разви веющийся при температуре 70-75°0 и рК 2-4 за счет окисления. s° д сульфата.

Вместе с метаногенами и экстремальными галофилами термоацидо филы получили название архебактерий, представляющих собой независи мую филогенетическую ветвь (Woese, Fox, 1977; Woese et al., 1978 ! др.). Основанное на нуклеотидных последовательностях рибосомалъны: FKK, это деление потвервдается другими общими признаками: отсутствием даптидогликановой клеточной стенки, наличием бифитаниловы: эфиров в составе липидов, особенностями структуры FHK-полимеразы специфическими путями метаболизма, и, главное, обитанием в экстремальных условиях (Kandier, 1993). Архебактерии отнесены к домен: Archaea, подразделяющемуся на два царства: Crenarchaeota и Вигуаг-chaeota (Woese et al., 1990).

В Crenarchaeota вошли исключительно экстремально термофильны! серозависимые архебактерии, подразделенные на 3 порядка: Thermopro-tealea, Pyrodictiäles и Sulfolöbälea.

Два первых порядка целиком состоят из облигатно анаэробных экстремально термофильных архебактерий, восстанавливающих элементну! серу. Первый представитель этой группы - Thermoproteua tenax - Gm выделен Циллигом и Штеттером из накопительных культур Sulfolöbiu (Zillig et al., 1982). Этими же исследователями в последующие годе

были выделены еще 10 родов экстремально термофильных серовосстана-вливающих архебактерий: Deaulfurococcua, Thermofllvm, Staphylother-шиз и Pyröbaculm, относящиеся, как и род Thermoproteus, к порядку Thermoproteales; Pyrodicttm, Hyperthermie и Thermodlscua, входящие в порядок Pyro0.lctia.le3, а также Thermococctis и Ругососсиз, представляющие порядок Thermococcales, отнесенный к царству Euryarchae-ota. Все эти организмы развиваются в интервале температур 80-П0°С; так называемые "гипертермофилы" имеют температурный оптимум развития выше Ю0°С. По типу метаболизма они могут быть разделены на 3 группы:

а) облигатные литотрофы, использующие молекулярный водород -Pyrodlctiw occultm, Pyrodlcttum brockti (Stetter et al., 1983) и Thermoproteus neutrophllua (Fisher et al., 1983);

б) организмы, способные как к литотрофному росту с использованием водорода, так и к органотрофному за счет окисления пептидов и полисахаридов в процессе серного дыхания - T.tenax, Pyrobaculvm tslandicum (Huber et al., 1988);

в) облигатные органотрофы, растущие только за счет использования сложных органических субстратов - р. Desulfurococcua (Zillig et al., 1982), Thermococcus (Zillig et al., 1983), Ругососсиз (Fiala, Stetter, 1986), Staphylotbßrmu3 (Mala et al., 1986), НурегИютиз (Zillig et al., 1991), а также Pyrobaculvm organotrophim (Huber et al., 1988) и Pyrodictirm аЪузз1 (Pley et al., 1991).

Представители первых двух груш, а также P.organotrophm. были охарактеризованы как организмы, облигатно зависящие от элементной серы и при органотрофном росте осуществляющие полное окисление сложных органических субстратов до С02 и HgS (Zillig et al., 1981, Stetter et al., 1983, Huber et al., 1988). Для большинства представителей третьей группы - облигатных органотрофов - была показана возможность слабого роста в отсутствие серы за счет брожения органических субстратов, однако их рост в присутствии серы также характеризовался как "серное дыхание".

Способность восстанавливать элементную серу за счет окисления молекулярного водорода была также обнаружена у факультативно-анаэробных архебактерий р. Actdtamis и Desnlfurolobus, которые в аэробных условиях росли за счет окисления серы кислородом (Segerer et al., 1986, Zillig et al., 1986).

Особое значение цикла серы было установлено для биоценозов глубоководных гидротерм (Jannasoh, Mottl, 1985), где был впервые обнаружен "тиобиос" - биоценоз, основанный на использовании энергии вулканического сероводорода симбиозом беспозвоночных и хемолито-трофных бактерий. В глубоководных горячих источниках также содержатся многочисленные популяции экстремально термофильных органо-трофных архебактерий, нувдающихся в элементной сере (Belkin, Jannasoh, 1985, Pledger, Barross, 1989).

Таким образом, к моменту начала нашей работы в 1982 году существовал устойчивый интерес к микробным сообществам гидротерм: были подробно охарактеризованы продукционные и деструкционные процессы в термофильных цианобактериальных матах, шло интенсивное выделение новых термофильнах анаэробов, была только что открыта новая группа архебактерий с серным дыханием. Работы как зарубежных, так и русских микробиологов указывали на особую роль элементной серы в микробиологических процесах термальных местообитаний. Вместе с тем значение процесса бактериальной сероредукции для микробных сообществ гидротерм не исследовалось. В силу высокого температурного интервала развития экстремально термофильных архебактерий они не могли входить в состав таких продукционных сообществ как цианобактериаль-ные маты; умеренно термофильные бактерии, восстанавливающие элементную серу, известны не были.

Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось определение роли сероредуцирущих бактерий в микробных сообществах гидротврм с различными физико-химическими условиями.

Для достижения цели были поставлены конкретные задачи:

1. Определение распространения и численности сероредуцирующиа бактерий в гидротермах различного типа.

2. Выделение чистых культур термофильных сероредуцирующиз бактерий и определение их таксономического положения.

3. Исследование особенностей физиологии и биохимии выделении бактерий и роли элементной серы в их метаболизме.

4. Определение скорости бактериальной сероредукции in attu.

5. Определение значения процесса бактериальной сероредукции для микробных сообществ гидротерм различного типа.

Научная новизна и значимость работы.

Расширены представления о биоразнообразии прокариотных организмов, в частности, умеренных и экстремальных термофилов. Выделены и охарактеризованы новые таксоны прокариот, представители которых осуществляют процесс восстановления элементной серы.

На примере новых организмов исследованы различные случаи влияния элементной серы на катаболизм анаэробов. Показано, что физиологический смысл сероредунции различается у разных групп термофилов, и определяет их роль в циклах углерода и серы в гидротермах. Для широкого круга экстремально термофильных архебактерий, первоначально описанных как организмы с серным дыханием, установлена связь стимулирующего действия элементной серы,-с удалением молекулярного водорода, образующегося при брожении. Это же явление обнаружено в группе умеренно термофильных органотрофных эубактерий. Открыта новая группа умеренно термофильных бактерий с серным дыханием, представленная новым родом Вези1/иге11а и способная к полному окислению широкого спектра несбраживаемых субстратов. Спектр органических субстратов, которые могут быть окислены анаэробно в процессе бактериальной сероредукции, существенно расширен.

Процесс бактериального восстановления элементной серы исследован с точки зрения его вклада - как потенциального, так и реального - в биогеохимические циклы углерода и серы в гидротермах. Установлено, что бактериальная сероредукция может служить эффективным механизмом анаэробной деструкции: как влияя на первую стадию - брожение органических субстратов, так и выступая в качестве универсальной терминальной реакции окисления продуктов брожения.

Практическая ценность.

Создана уникальная коллекция экстремально и умеренно термофильных архе- и эубактерий, восстанавливающих элементную серу, содержащая большое количество штаммов - продуцентов термостабильных ферментов: ДНК-полимераз, протеаз, амилаз и др. и служащая базой для новой ветви биотехнологии. Исследована физиология новых организмов, разработаны методы их массового культивирования.

Установленная роль бактериальной сероредукции как значимого биогеохимического процесса обуславливает необходимость учитывать вклад этого процесса в циклы углерода и серы в различных биотопах,

как термальных, так и мезофильных.

Апробация работ.

Материалы диссертации доложены и обсуждены на Всесоюзной конференции "Термофильные микроорганизмы: теория и практика" (Москва, 1984 ), на IX Международном микробиологическом конгрессе (Манчестер, 1986), на Международном симпозиуме по литоавтотрофии (Геттин-ген, 1987), на IX Международном симпозиуме по биогеохимии окружающей среды (Москва, 1989), на Билатеральном симпозиуме СССР-ФРГ по архебактериям (Тбилиси, 1990), на Международном симпозиуме по морской биотехнологии (Балтимор, 1991).

• Публикации.

Основные материалы диссертации содержатся в 40 печатных работах: 26 экспериментальных статьях, 5 обзорах, 9 тезисах.

Место проведения работы.

Основная часть работы проводилась в Институте микробиологии РАН в лаборатории микробных сообществ, руководимой членом-корреспондентом РАН профессором Г.А. Заварзиным. В отдельных этапах работы принимали участие сотрудники лаборатории М.Л. Мирошниченко, М.А. Пушева, Т.Г. Соколова, стажер Е.В. Пикута. В начальных этапах работы участвовал аспирант ИМГАН А.И. Слесарев. Полевые исследования в районах современной поствулканической активности проводили« в сотрудничестве с В.М. Горленко, Б.Б. Намсараевым, В.А. Светличным, Д.Ю. Сорокиным (ИНМИ РАН), Г.А. Карповым (Институт вулканологии ДВНЦ РАН), В.Г. Тарасовым (Институт биологии моря ДВНЦ РАН), В.А. Алексеевым (ФИАЗ им. Курчатова). Определение форм серы в пробах из гидротерм проводили в Институте океанологии РАН под руководством H.H. Жабиной. Электронно-микроскопические исследования новыз организмов проводились в ИНМИ РАН сотрудниками лаборатории цитологии H.A. Кострикиной и Т.П. Светличной, а также в Институте биофизики РАН (Пущино) Г.М. Гонгадзе. Геносистематические исследованш проводились A.M. Лысенко и H.A. Черных (ИНМИ РАН) , а также (совместно с А. Нойнер) на кафедре микробиологии Университета Регенс-бурга (ФРГ), руководимой профессором К.О. Штеттером. Там же проводилось исследование межвидового переноса водорода в бинарных куль-

турах экстремально термофильных архебактерий. Особенности биохимии умеренно термофильных сероредуцируицих эубактерий исследовались Р. Шмитц в лаборатории профессора Р.К. Тауэра (Университет Марбурга, ФРГ). Белковый состав клеточных стенок архебактерий был исследован научным сотрудником Института белка РАН А.Ю. Костюковой. Способность органотрофных умеренно термофильных эубактерий к сероредукции - совместно с В.В.Кривенко в ИНМИ РАН.

Автор выражает глубокую признательность своему учителю Георгию Александровичу Заварзину, всем упомянутым участникам работы, а также друзьям и родным - за благожелательный интерес и поддержку.

Основные защищелые положения.

1. Способность восстанавливать элементную серу в процессе роста широко распространена среди анаэробных термофильных бактерий, входящих в состав микробных сообществ гидротерм и различающихся по своей экологии, физиологии, таксономическому*положению.

2. Экстремально термофильные архебактерии восстанавливают элементную серу в процессе органотрофного роста. Этот процесс не является облигатным и может не реализовываться в природных условиях. Для ряда органотрофных бактерий показана его связь с удалением водорода, оказыващего ингибирущее действие на процесс брожения. Элементная сера может быть замещена водород-потребляющими метаноге-нами, обеспечивающими межвидовой перенос водорода.

3. Среди умеренно термофильных эубактерий, восстанавливающих элементную серу, встречаются как органотрофы, осуществляющие брожение, так и облигатно зависящие от серы бактерии с серным дыханием. Последние способны полностью окислять широкий спектр органических соединений.

4. В сообществах умеренно термофильных бактерий с постоянно возобновляемым пулом элементной серы процесс бактериальной сероредукции является ведущим терминальным процессом анаэробной деструкции, обуславливая полную минерализацию органического вещества.

5. Бактериальная сероредукция'в микробных сообществах гидротерм может являться биогеохимически значимым процессом и важным пунктом сопряжения анаэробных циклов углерода и серы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

I. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИИ

Микробные сообщества гидротерм исследовались в районах совре менной поствулканической активности Тихоокеанской'вулканической ду ги. В 1982-1987' годах было организовано 4 экспедиции в кальдер вулкана Узон (юго-западная часть полуострова Камчатки) и на остро Кунашир (Курильские острова). Материалы для исследования были такж собраны в рейсе НИС "Академик Богоров" по Курильским островам 1988 году и в 18 рейсе НИС "Академик Несмеянов" в 1990 году - зали Плонти, острова Уэйл и Уайт (Новая Зеландия), остров Рауль (архипе лаг Кермадек, Новая Зеландия), бухта Матупи (остров Новая Британия Папуа-Новая Гвинея).

Определение распространения, численности и выделение чисты культур термофильных сероредуцирующих бактерий проводили в соответ ствии с принятой техникой работ с облигатно анаэробными организмам (Жилина, Заварзин, 1978).

Использованные аналитические метода,' методы световой и элек тронной микроскопии, биохимические, энзимологические, геносистема тические методы описываются в соответствующих публикациях.

Для определения скорости бактериального восстановления эле ментной серы в осадках и водах гидротерм было использовано два ос 'йовных метода: прямое определение прироста сероводорода в изолиро ванных пробах и радиоизотопное определение скорости образования се роводорода из 35з°.

Первый метод использовался при исследовании источников и мик робных обрастаний с высоким содержанием элементной серы и высоко: скоростью ее восстановления бактериями. Пробы осадков или обраста ний помещали в герметично закрытые флаконы, инкубировали в мест отбора пробы и определяли увеличение концентрации сероводорода единице объема за единицу времени. Одновременно с помощью радиоизо топного метода определяли интенсивность сульфатредукции в той ж пробе. Низкое содержание других частично окисленных соединений сер: (тиосульфат, тетратионат) позволяло пренебречь вкладом процессов и восстановления в суммарный сульфидогенез, и скорость бактериально: сероредукции вычисляли по разности суммарного прироста сероводород

и сероводорода, образованного в результате сульфатредукции.

Определение скорости бактериальной сероредукции радиоизотопным методом производили в образцах с различным содержанием элементной серы и различными скоростями ее восстановления. Для равномерного внесения метки получали гомогенную суспензию коллоидной 35s° путем ее растворения в ацетоне. Полученную суспензию добавляли к образцам вода и осадков гидротерм и инкубировали при температурах проб in ai tu. Параллельно в тех же условиях проводили инкубацию автоклави-рованных образцов. Образовавшийся меченый сероводород улавливали по общепринятой методике (Иванов и др., 1976). Скорость бактериальной сероредукции в пробах гидротерм получали, вычитая из общей скорости накопления сероводорода в опытных образцах скорость его образования в контрольных флаконах с автоклавированными пробами.

Достоинства и ограничения использованных методов будут обсуздены ниже.

Помимо вновь выделенных изолятов, в работе были использованы типовые культуры анаэробных термофильных архе- и эубактерий: Ther-moproteus tenca DSM 2078, Pyrobaculum islandlcum DSM 4184, Thermo-соссиз celer DSM 2476, Ругососсиз furlosua DSM 3638, Staphylother-тиз rnarinua DSM 3639, Methanococcus thermollthotrophlcua DSM 2095, Methanococcus JanmsTii DSM 2661 (получены от проф. К.О. Штеттера , ФРГ), De3ulfurococcu3 mucosus DSM 2162 (получен от д-ра Д. Ноуэна, Великобритания), Ttiermoanœroblwi brockii АТСС 33075, Tkermoanaero-bim lactoethylicu3 ZE-1, ThermóbaGteroides acetoethylicus АТСС 33265, Clostridium thermohyârosulfuricvm DSM 567, Clostridium ther-mosaccharoliticvm DSM 571 (получены от B.B. Кривенко, ИНМИ РАН). Также в работе были использованы культуры Thermococcus lit oral Is Z-1301 и Desulfurococcua z-1302, полученные от В.А. Светличного.

2. Распространение и численность термофильных сероредуцирувдих бактерий

Термофильные серовосстанавливахкдае бактерии широко распространены в вулканических местообитаниях и присутствуют в воде и осадках гидротерм с различными физико-химическими характеристиками, а также в термальных почвах и грунтовых водах. В процессе проведенных нами

исследований эти организмы были обнаружены в большинстве проб с температурой 40-Ю0°с и рН 4,5-7,0 (таблица I). Мы установили также, что высокотемпературные сероредуцирувдие бактерии могут быть выделены из низкотемпературных местообитаний. Так, например, серо-редуцирующие бактерии, развивающиеся при температуре 90°С были выделены из сульфидных ручейков с -к0 30°С, вытекающих из-под серны? куполов вулканов Менделеева и Головнина на о. Кунашир, из цианобак-териального мата с -ь0 45°с в кальдере Узон. Умеренно термофильные бактерии были обнаружены во всех пробах цианобактериальных матов у донных отложений.

Субстратами бактериальной сероредукции в пробах из гидротерь могут служить различные органические вещества и молекулярный водород; при этом спектр используемых субстратов различен в гидротермаз различного типа (таблица 2).

В сольфатарах с температурой в области 90°с основными субстратами сероредукции являются пептвды и полисахариды; использованш молекулярного водорода, сопряженное с восстановлением элементно! серы, мы отмечали только в пробах из наземных высокотемпературны: гидротерм. При этом доминирующие формы представлены правильными ила неправильными кокками и в морских, и в наземных гидротермах, а таю же палочками и нитями, характерными только для наземных горячи; источников.

При более низких температурах культивирования спектр субстратов сероредукции расширялся, включая сахара, смесь аминокислот, летучие жирные и органические кислоты, спирты. В некоторых проба: микробный рост и образование сероводорода из элементной серы бы, получен в присутствии циклических соединений и алканов (гексадека на). На средах с богатыми энергией сбраживаемыми субстратами доми нировали споровые палочки; если в качестве энергетических субстра тов использовались летучие жирные кислоты, спирты и водород, пре обладали подвижные короткие палочки или овальные клетки.

Численность термофильных сероредуцирущих бактерий в гидротер мах была достаточно высокой и свидетельствовала о их активном учас тии в микробиологических процессах, протекающих в гидротерма (таблица 3). Однако без наличия чистых культур невозможно было су дать о том, является ли зависимость от элементной серы облигатнс или факультативной.

Таблица I. Распространение термофильных бактерий, восстанавливающих элементную серу.

Географическое Характе-положение места ристика исследования биотопа

t°C

Число проб рН общее давших роет Б-редукторов '

Наземные гидротермы кальдеры Узон, долины Гейзеров (Камчатка;, кальдеры Головнина, вулкана Менделеева (о. Кунашир, Южные Курилы), о-ва Рауль, о-ва Уайт (Новая Зеландия)

Сульфидные источники

Источники и грязевые котлы

Парогазовые выхода

73-99 5,5-7,1 88-100 2,0-5,5 96-102 6,0-7,0

Обрастания 70-75 6,0-6,6 Thermottirix

Цианобакте- 40-68 6,5-8,0

риальные

маты

Донные от- 60

ложения

озер

6,6

21

19

8 II

16

II

8 II

I

Морские гидро- Береговые

термы бухты Кра- котлы терной (о.Янки-

ча, средние Ку- Газопаро- 85

Еилы), Горячего вые выхо-

ляжа (о.Куна- да на што-

шир, Южные Ку- рали рилы), залива

Пленти, о. Уэйл Горячие исковая Зелан- точники на дия), бухты Ма- литорали туш (о.Новая

Британия, Папуа- Донные отло Новая Гвинея)

85-95 6,2-6,5

6,4-6,6

45-60 6,2-6,5

50-85 6,0-6,4

жения в зоне горячих выходов, глубина 2-40 м

90

3,0

17

Всего " III

I) Температура инкубации и pH среды - те же, что in situ.

15 3

I

3

Таблица 2. Субстраты сероредукции1' в пробах из гидротерм различного типа.

Местоположение и на звание/ха-рактеристи ка биотопа

Кальдера Узон

ист.Трещинный 87 6,0 + ■ + +

ист.Бурлящий 94 6,2 + +

обрастания 75 6,5

ТЬегто1Ъг1х + + + + - - + - + - + +

цианобактери-

альный мат из

сульфидного 53 6,2 + + + + + + + + + + + +

источника

Кальдера Голов-

нина

горячий ис- 87 6,6 + + +

точник

Оз. Грин 60 6,6

донные отло- + + + + + + + + + + + +

жения

Бухта Кратер-

ная

береговой ко- 87 6,5 +

тел

гидротерма на 50

литорали 6,4 + + + + + - + - + - + +

донные отложе- ?2) 6,6

ния +

Залив Пленти

донные отложе-

ния 85 6,5 + - - - - - _ _ - - - -

п 55 6,4 + + + + - + + - + + + +

О-в Уэйл

газопаровой вы- 85 6,5 + + +

ход на литорали

Бухта Матупи

гидротерма на 50

литорали 6,2 + + + + + + - + + + +

донные отложе-

ния 90 6,6 +

1) Пп - пептон, Кр - крахмал, Ам - смесь аминокислот, Гл - глюкоза, Лк - лактат, Фр - формиат, Ац - ацетат, Пр - пропионат, Бт - бути-рат, Мт - метанол, Эт - этанол, Н2 - молекулярный водород.

2)-.Температуру осадков не определяли; культивирование проводили при

1;°С рН Пп Кр Ам Гл Лк Фр Ац Пр Бт Мт Эт К^

Г-

Подученные в ходе исследования распространения и субстратной специфичности накопительные культуры, а также предельные разведения, полученные при учете численности, были использованы для выделения чистых культур доминирующих видов сероредуцирующих бактерий.

3. Экстремально термофильные архебактерии, восстанавливающие элементную серу

Доминирующие формы сероредуцирующих бактерий в исследованных высокотемпературных пробах и полученных затем накопительных культурах по морфологии соответствовали основным морфотипам экстремально термофильных серозависимых архебактерий (ветвящиеся палочки с утолщениями на концах, нити, правильные и неправильные кокки). Более 20 штаммов было выделено в чистую культуру, 10 полностью охарактеризовано и на основании этого описано 5 новых видов (таблица 4). По устойчивости к ряду антибиотиков, строению клеточной стенки и характерным особенностям физиологии все они отнесены к архебактериям.

3.1. Новые виды экстремально термофильных серовосстанавливающих архебактерий, выделенные из наземных гидротерм

Наиболее многочисленными и широко распространенными в наземных гидротермах Камчатки и Кунашира экстремально термофильными сероре-дукторами оказались палочковидные архебактерии. Их клетки имели характерную для этой группы морфологию: палочки варьирующей длины, иногда со вздутиями на концах и ветвлением; клеточная стенка представлена слоем гексагонально упакованных глобул. 3 штамма, выделенных из кальдеры Узон, долины Гейзеров и кальдеры Головкина, с одинаковой морфологией и размерами клеток (1-20 х 0,3-0,4 мкм), являлись облигатными анаэробами, использующими пептида с одновременным восстановлением элементной серы в сероводород, имели температурный оптимум роста при 90°С и оптимум рН при 5,4-5,7; Г+Ц состав ДНК -56%. Новые организмы были определены как штаммы одного вида, принадлежащего к р. Thermoproteua.

От двух других известных видов р. Thermoproteua - Т.tenas и T.neutropMlus (Zillig et al., 1982, Pisher et al., 1983) новый организм отличается отсутствием литоавтотрофного роста с водородом.

Таблица 3. Численность термофильных бактерий, восстанавливающих элементную серу.

Местоположение и нзвание/характе-ристка биотопа Л рН Численность бактерий, пептон сероредуцирующих , использующих Н^ ацетат

Кальдера Узон

ист. Трещинный 87 6,0 Ю6 Ю4 0

ист. Бурлящий 94 6,5 Ю6 ю2 0

ист. Очки 73 6,0 Ю3 0 0

вода с глубины" 2 м 96 6,5 Ю5 ю5 0

Черная площадка (Западное поле) 94 6,0 Ю8 ю8 0

цианобактериальный мат из сульфидного источника 53 6,2 Ю10 ю6 ю6

обрастания 17гегто- 75 6,2 Ю7 ю5 105

Бухта Кратерная ?1)

донные осадки 6,6 ю7 0 0

береговой котел 87 6,5 га7 0 0

Залив Пленти донные осадки с глубины 40 м 81 5,5 хо5 0 0

О-в Уэйл' газопаровой выход на литорали 85 6,5 га6 0 0

Бухта Матуш прибрежный источник горячий источник на 90 7,0 ю5 с 0 0

литорали 50

горячий источник на глубине 10 м 85

1^Температуру осадков 85°0.

6,5 7,0

10е Ю7

О О

о о

не определяли; культивирование проводили при

Таблица 4. Характеристика новых экстремально термофильных архебактерий, восстанавливающих элементную серу

Вид -типовой штамм Другие штаммы этого вида Морфо- ^ рНор1; логия Время удвое ния (час. суб- страты )

Thermo- Z-605 Z-208 Палочки 90 5,6 2 Пептиды

protetia DSM Z-601 с шаро-

uzoniensis 5362 образны

ми утол-

щениями

Desulfuro- Z-553 z-боз Правиль- 92 6,4 I Пептиды,

соссиз DSM ные кок- - крахмал,

amylolyti- 3822 ки, иног- пектин,

сиз да полу- гликоген

сферы

Thermococ- K-3 K-15 Непра- 75-88 6,2 1,2 Пептиды,

сиз stet- SSM K-17 вильныэ крахмал

teri 5263 кокки

Thermococ- P-4 88 6,4 0,8 Пептиды

cus paci- крахмал

ficua

Thermocoa- W-2 - Мелкие 88 . 6,2 1,5 Пептида

CU3 gorgo- клетки с

nartus выростами

Организм восстанавливает элементную серу, однако способен к росту в ее отсутствие (рис. I). ДНК-ДНК гомология с Г.tenor, оцененная методом "дот-блот", практически отсутствовала. Таким образом, мы описали новый - третий - вид р. Thermoproteua - Thermopro-teua uzonlenalа с типовым штаммом z-605.

Врелля(час)

Рис. I. Рост Т.игоп1епз1а г-605 на среде с пептоном в присут ствии элементной серы (I); образование сероводорода (2); рост в отсутствие элементной серы (3).

В большинстве обследованных нами наземных гидротерм Камчатки и Кунашира присутствовали также экстремально термофильные серовосста-навливающие архебактерии с клетками в виде правильных или неправильных кокков. Три охарактеризованных нами штамма определены как

принадлежащие к новому виду ОезМ/игососсиз ату1о1уИсиз с типовым штаммом 2-533- Пластичность белковой клеточной оболочки приводит к большому полиморфизму клеток д.ату1о1уИсиз, которые, наряду с правильными кокками диаметром 1-1,5 мкм, могут иметь форму вдавленных полусфер. Это облигатный анаэроб с температурным оптимумом роста 92°0 и оптимальным для роста рН 6,3-6,5. Элементная сера не обязательна для роста, но значительно его стимулирует. Иммунотест по Ух-терлони (ОисМег1опз., 1962) свидетельствовал в пользу принадлежности нового изолята к р. ВезиХ/игососсиэ. От двух известных ранее видов р. ОезиТ/игососсиз - В.ттюозш и В.тоЫНз - В.шу1о1уИсиз отличается отсутствием капсулы и жгутиков, способностью использовать полисахариды и значительно более низким содержанием Г+Ц пар в ДНК (42 мол. % по сравнению с 51 мол. % у типового вида).

3.2. Новые вида морских экстремально термофильных архебактерий

Из мелководных гидротерм западной части Тихого океана нами было выделено в чистую культуру и охарактеризовано 5 штаммов морских экстремально термофильных архебактерий. Из них три отнесены к новому виду ТЬегтососсиз з1еНег1, два - описаны как новые виды ТПегто-соссиз pзctficuз и Иъегтососсиз §^отюг1из.

Штаммы Т.з1еНег1 быт выделены из донных осадков бухты Кра-терной, а также из высокотемпературных котлов, расположенных на берегу этой же бухты; Т.рас1/1сиз - из горячего грунта на глубине 40 м в заливе Пленти (Новая Зеландия). Клетки этих организмов - неправильные кокки; цитоплазматическая мембрана окружена белковой оболочкой из двух глобулярных слоев. На препаратах T.зtetterl обнаружен и внутренний слой субъединиц, также двойной, примыкающий к мембране со стороны цитоплазмы. Среди штаммов Т.з1еНег1 встречаются как неподвижные, так и подвижные с пучком жгутиков. Эти штаммы различаются также по температурным характеристикам роста (различие в оптимальных температурах роста примерно 12°С), однако высокий уровень ДНК-ДНК гомологии заставляет отнести их к одному виду. Рост Т. зtetterí и T.paclflcuз облигатно зависит от присутствия морской соли в среде: его наблюдали в интервале 1-4% с оптимумом 2.5 55. Используемые субстраты - пептиды и полисахариды. По Г+Ц составу ДНК и морфофизиологическим свойствам эти бактерии отнесены к р. ИТгеппо-

соссиз. Изучение последовательности 320 нуклеотидов в IBS рРНК T.stettert показало только 5 замен по сравнению с I6s рРНК T.celer. Сколько-нибудь значительная гомология ДНК новых видов с ДНК других видов p. Thermococcua и между собой отсутствует (таблица 5). Различаются также белки внешней клеточной оболочки (таблица 6). >

Таблица 5. Уровень гомологии ДНК видов p. Thermococcus (%).

T.celer T.stettert T.pactftcus T.gorgonarius

T.celer 100 -9 5-0,1 ' 8-0,2 5-0,1

T.stettert 100-13 10±0,1 10-0,2

T.paclftcus 100-7 54-5

Таблица 6. Состав белков клеточных стенок архебактерий р. ТЬегтососсья .

Вид М.в. основных белков клеточных стенок

T.celer 180000

T.stettert 80000; 210000

T.pactficua 75000

T.gorgonartus 56000

Т.вог$от\аг1ив был выделен из песчаного грунта в области горячего выхода, расположенного на литорали о-ва Уэйл (Новая Зеландия). Как и предыдущие два вида, Т.£ог£опаг1иа нуждается в морской соли, имея тот же интервал и оптимум солености для роста. Однако этот ор-

ганизм отличается своеобразной морфологией: малым размером клеток (0,3-0,5 мкм по сравнению с 1-1,5 мкм у остальных видов р. ТЬегтососсиз) и наличием выростов нескольких типов - клеточных, напоминающих простеки эубактерий, и образованных материалом клеточной оболочки. В отличие от предыдущих двух видов Г.^о^ошг(из способен использовать только пептиды. ДНК-ДНК гибридизация этого вида с другими видами р. ЧТгвгтососсиз показала отсутствие гомологии со всеми видами за исключением Г.рас£/1'сиа (таблица 5) и иной состаз белков клеточной стенки (таблица 6).

Все три новых вида р. ТЬегтососсиз, в отличие от типового, при культивировании в герметично закрытых сосудах, на 2/3 заполненных жидкой средой, облигатно нуждались в присутствии элементной серы, которую восстанавливали в сероводород. В отсутствие серы сколько-нибудь заметного роста в этих условиях не наблюдалось.

Для выяснения роли элементной серы в метаболизме экстремально термофильных органотрофных архебактерий физиология как новых, так и типовых видов была исследована более подробно.

3.3. Исследование физиологии экстремально термофильных органотрофных архебактерий.

В отличие от Т.игоп1епз1в, виды ТЛепах и РЛзХапсИст были^ описаны как облигатно зависящие от- элементной серы и осуществляющие полное окисление органических субстратов до С02. 3 наших опытах типовые штаммы этих видов оказались способными к оргакотрофному анаэробному росту без серы.

Рост всех трех видов на пептоне, независимо от присутствия серы в среде, сопровождался, помимо образования СО^, накоплением продуктов брожения пептидов: ацетата, изобутирата, изовалерата. Лактат к спирты в составе продуктов брожения обнаружены не были. В присутствии элементной серой шло образование сероводорода; в ее отсутствие в газовой фазе обнаружены следовые количества водорода; относительное образование летучих жирных кислот возрастало (таблица 7).

При исследовании метаболизма бактерий р. ВезиТТигососоиз, по-

мимо двух штаммов D. amylolttlcua и типового штамма D.mucosus, был использован штамм Desulfurococcus z-1302, выделенный В. Светличным из гидротерм кальдеры Узон.

Таблица 7. Образование продуктов метаболизма палочковидными органотрофными экстремально термофильными архебактериями.

Вид Наличие s° в среде Образование ацетат' (мкмоль/108 изобутират клеток) изовалерат

T.uzaniensie +. 5,7 1,4 0,1 0,4

- - 3,3 0,8 1.0

F.tencix + 7,8 0,5 0,06 1,0

- - 1.9 0,1 0,5

Р. islandicum + 7,4 0,7 • ' 0,04 0,2

— — 2,5 0,1 0,4

И 0.ату1о1уНсиз, и В.тхюозиз способны к росту как в присутствии,. так и в отсутствие элементной серы (таблица 8), образуя и в том, и в другом случае углекислоту и полуокисленныв продукты брожения пептидов (ацетат, пропионат, изобутират, изовалерат) или полисахаридов (ацетат). Лактат и спирты в составе продуктов брожения не обнаружены. Элементная сера значительно стимулирует рост В.<жу1о1у-Х1сиз и Ъ.тисозиз, но не оказывает существенного влияния на рост БезиХ/игососсиз г-1302 (таблица 9). В отсутствие элементной серы все исследованные виды образовывали молекулярный водород, причем особенно значительные его количества - до 8% газовой фазы - образовывал БезиТ/игососсиа г-1302.

Было исследовано влияние' молекулярного водорода на рост архе-бактерий рода. деаи1{игососсиз (таблица 9). Молекулярный водород (80Ж газовой фазы) полностью ингибирует рост В.ату1о1И1сиз и Ъ.тисозиа на среде без серы, но не оказывает существенного влияния на рост дези.1?игососсиз г-1302. Присутствие элементной серы в среде

снимает ингибирующее действие молекулярного водорода на рост первых двух организмов.

Таблица 8. Образование продуктов метаболизма органотрофными экстремально термофильными архебактериями р. ИезиТ/игососсиз.

Вид, Наличие Образование (мкмоль/108 клеток)

штамм Б0 н?з ацетат изобу- изова-

в среде тират лерат

П.ату1о1у- + 2,4 0,12 0,55 0,03 0,15

Исиз - - 7,3 1,47 0,06 0,43

0.тисо8иэ + 2,9 0,24 0,73 0,09 0,29

- - 4,0 0,9 0,1 0,56

Таблица 9. Влияние водорода на рост бактерий р. 1)ези1/игососсиз.

Рост на среде с пептоном +Б -Б

Вид, штамм Газовая фаза Газовая фаза

М2+С02 Н2+С02 Н2+С02 Н2+С02

0 <жу1а1у11сиз г-533 6,9 Ю7 1,7 Ю7 2,9 Ю7 0,2 Ю7

В.ату1о1уИсиз г-боз 1,9 Ю8 1,3 Ю8 3,3 Ю7 0,4 Ю7

ЦезиХ^игососсиз г-1302 2,5 Ю7 1.7 Ю7 2,6 Ю7 2,0 Ю7

Влияние элементной серы на рост морских органотрофных экстре-

мально термофильных археОактерий было исследовано более подробно. Помимо новых видов T.stetterl, T.pacificus, T.gorgonarius были исследованы также T.lttoralia z-1301, выделенный В. Светличным из мелководных гидротерм о. Кунашир, и типовые штаммы T.celer, S.marl-пиз и P.furlosиз. Все исследованные организмы в присутствии сери образуют, помимо H^S и С02, частично окисленные продукты: при росте на пептидах - ацетат, пропионат, изобутират, изовалерат; при росте на полисахаридах - ацетат. Лактат и спирты обнаружены не были. T.celer, T.litoralls, P.furloau3 и S.marinus способны к слабому росту без серы; основным восстановленным продуктом в этом случае является водород. Атмосфера водорода практически полностью ингиби-

8 12 Вресля (час }

2Ц

Рис. 2. Рост Thermococcua lit oral la z-1301 на среде с пептоном и.элементной серой (I); образование сероводорода (2) и водорода (3).

рует рост T.celer и T.lttoralia на среде без серы; в присутствии серы ингибирукхций эффект снимается.

Т.lit oral1з образовывал водород не только в отсутствие элементной серы, но и на среде с серой. Образование <щцорода шло в первой фазе роста, затем основным восстановленным продуктом становился водород (рис. 2).

T.stetteri, T.paciftcus, T.gorgonarlua в использованных условиях оказались неспособными к росту на среде, лишенной элементной серы. Однако последующие эксперименты показали, что зависимость от серы связана со снятием ингибирующего эффекта водорода, к которому перечисленные организмы оказались особенно чувствительны. При изменении объемного соотношения газовой и жидкой фаз от 1:2 к 10:1 удалось добиться роста T.stetteri на среде без серы (рис. 3). При увеличении объема газовой фазы ингибирующая концентрация водорода достигается значительно позднее, что обеспечивает возможность броже-ння.

100

0 G 12 й S 12

Время (час) Время (час)

Рис. 3. Рост. (I) и образование водорода (2) Thermococcus stettert K-I5 на среде с пептоном без элементной серы при культивировании в сосудах с объемным соотношением жидкой и газовой фаз 2:1 (А) и 1:10 (Б); концентрация водорода в газовой фазе (3).

Роль элементной серы могут выполнять водород-потребляющие микроорганизмы. Был исследован рост бинарных культур морских экстремально термофильных архебактерий: серозависимых органотрофов и ме-таногенов (таблица 10). Все исследованные штаммы продемонстрировали интенсивный рост на среде без серы в присутствии водород-использующих метаногенов. Концентрация клеток метаногенов в бинарных культурах составляла лишь один процент от общего числа клеток; тем не менее, такое количество их оказалось достаточным, чтобы обеспечить интенсивное развитие органотрофов. Рост бинарной культу-' ры Т.зíetteri и иеОтшососсиз jannaзhi на среде с пептоном, лишенной серы, представлен на рис. 4. Полученные ассоциации оказались

Время (час)

Рис. 4. Рост Thermococcus stetterl (I) и Methanococcua Jannascht (2) в комбинированной культуре на среде с пептоном без элементной серы; образование метана (3), ацетата (4), изобутирата (5), изовалерата (6).

Таблица 10. Рост и образованна восстановленных продуктов экстремально термофильными органотрофными архебактериями в чистых и комбинированных культурах.

Штаммы Субстрат

Урожай клеток хЮ8/мл

Образование СН

Н2з

мкмоль/мл мкмоль/мл

Т.се1ег

п

Т.сеХег + М.з'аппазсЫ

Пептон

14,5 0,2 8,3

24,0 О О

О О

19,5

Г.steííeгí кэ Пептон » и

Г.•síeííeгt КЗ + " ИЛ1\егто11Шо-£горМсиз

12,3 0,09 7,8

37,0 0,4 О

О О 11,7

о

T.зtetteri КЗ Крахмал и и

T.aШteri КЗ + "

ХЛЪегтоТШю-

ХгорЫсиз

1,6 0,09 1,8

9,7

О

О

О

о

1,5

T.зtetteri К15 Пептон

и и

í'.síeííeг{ К15 •1- М./аппазсМ

12,0 0,07 5,2

34,7 О О

0. . О 12,6

Р./игЧозиз

II

Р./иг1озиз + М^аппазсМ

Пептон

7,8 0,6 2,1

15,2 О О

О О

14,8

Б.тагЫиз

п

Б.таг1пиз + Ш^апхгазсШ

Пептон

7,1 0,3 3,1

33,1 О О

О О

13,8

З.таПтшз

и

З.таг1пиз + М^аплазсМ

Крахмал

0,75

0,2 3,1

2,6

О О

О

О 2,0

Расчет продуктов брожения пептидов, сделанный для 3-х видов ТЬегтососсиз (таблица II), показал, что присутствие элементной серы влияет только на образование восстановленного продукта (водород или сероводород); количественное соотношение продуктов практически не меняется и на ю8 клеток образуется в среднем (мкмоль):

вН^ и/или % + 3 Шд + 3,7 С02 + 1,6 ацетат+ 0,4 пропионат + + 0,2 изобутират + 0,9 изовалерат

ч

Таблица II. Образование продуктов метаболизма архебактериями р. ТЬегтососсш

Штамм

мкмоль/юв клеток

Н23

то.

рп аце- пропи- изобу- изова-2 тат онат тират лерат

+ 8,4 0,16 3,0 4,0 1,5 0,3 0,4 0,4

Т.сеХег

— 7,9 3,2 3,6 1,5 0,2 0,2 0,7

+ 8,3 0,7 3,0 3,8 1,6 0,7 0,2 1,1

Т. то-

га! 1 а

7,4 2,8 3,7 1,6 0,4 0,2 0,9

8,0 0,04 3,2 3,6 2,0 0,4 0,2 0,4

T.atet-

Хег1

; 7,9 3,1 3,7 1,7 0,2 0,2 1.0

В бесклеточных экстрактах Т.агеМегЬ была обнаружена гидроге-назная активность. В присутствии молекулярного водорода катализировалась восстановление бензил- и метилвиологена. Максимум активности приходился на П0°С. Показано также выделение молекулярного водорода бесклеточными экстрактами Т.згеИег1 из восстановленного бензилвиологена. Удалось также обнаружить сероредуктазную актив-

о

в

н

2

ность: в присутствии молекулярного водорода наблюдалось восстановление элементной серы бесклеточныш экстрактами Т.з1еНег1 (рис. 5). Показано, что гидрогеназная активность локализована в основном в цитоплазматической фракции, в то время как сероредуктазная активность содержится в мембранах.

°?воо

Время (мим)

Рис. 5. Восстановление элементной серы бесклеточными экстрактами ТЪегтососсиз зtettert К-15: изменение поглощения суспензии серы в присутствии Н^ (I), к^ + клеточная фракция (2), + мембранная фракция (3), Б^ + цитоплазматическая фракция (4), Н^ + мембранная фракция (5).

Таким образом, проведенное исследование экстремально термофильных архебактерий, восстанавливающих элементную серу, показало, что все новые выделенные нами виды являются органотрофами, исполь-зукщими пептида (пептон, гидролизат казеина, дрожжевой экстракт); некоторые виды также способны к использованию полисахаридов (крахмал, пектин, гликоген). Как новые изоляты, так и коллекционные типовые штаммы восстанавливали элементную серу в процессе роста и, за

единственным исключением (Desulfurococcua Z-I302), этот процесс оказывал стимулирующее действие на скорость роста и урожай клеток.

Все исследованные наш экстремально термофильные органотрофные архебактерш оказались факультативными сероредукторами, способными к росту в отсутствие элементной серы.

Палочковидные экстремальные термофилы, относящиеся к родам Thermoproteua и Pyrobaculum, были описаны как организмы с серным дыханием, полностью окисляющие органическое вещество до С02 (Zillig et al., 1981, Huber et a1., 1988). В пользу дыхания как основного катаболического процесса у этой группы свидетельствует способность некоторых видов к росту с молекулярным водородом и, следовательно, наличие у них цепи переноса электрона на элементную серу.

Способность палочковидных экстремально термофильных архебакте-рий к полному окислению органического вещества подтверждается данными о наличии у этих организмов ферментов окисления ацетата (Schäfer, Schönheit, 1992). Однако, по нашим данным,и в присутствии серы окисление органического вещества палочковидными экстремально термофильными архебактериями не было полным (таблица 5). Возможно, полное окисление органических субстратов идет только в экспоненциальной фазе (Sohafer, Schönheit, 1992), в то время как в стационарной фазе организмы переходят на брожение. Регулирующим фактором может быть сероводород, накапливающийся в культуральной жидкости.

Архебактерии рода Desulfurococcua также были описаны как осуществляющие серное дыхание в присутствии серы (zillig et al., 1982), однако у них была сразу же обнаружена способность к росту без серы за счет брожения пептидов или полисахаридов. Предполагалось, что в присутствии серы они осуществляют полное окисление органического вещества. Однако показанное нами неполное окисление, сопряженное с продукцией летучих жирных кислот как в присутствии, так и в отсутствие серы, подтверждается отсутствием у архебактерий рода Deaulfurococcua ферментов утилизации ацетата (Sohafer, Schönheit, 1992). Тип катаболического обмена, осуществляемый представителями Deaulfurococcua в присутствии серы, пока остается неясным, и, в принципе, перенос электрона и окислительное фосфорилирование не исключаются.

В отсутствие элементной серы кокковидные организмы, как выде-

ленные из наземных гидротерм, так и морские, осуществляют брожение органических субстратов с образованием водорода. Водород оказывает янгибирующее действие на процесс брожения, причем различные организмы обладают разной чувствительностью к водороду: от полной толерантности у Desulfurococcua z-1302 до ингибирования начальными концентрациями водорода у некоторых бактерий p. Thermoooccua. Степень чувствительности к водороду коррелирует со степенью зависимости от присутствия элементной серы в среде. Восстанавливаясь в сероводород, элементная сера служит стоком для электронов, освобождающихся в процессе брожения, и позволяет избежать образования водорода, чем и объясняется ее стимулирующее действие. Удаление водорода или поддержание его низкой концентрации обеспечивает эффективный рост экстремально термофильных органотрофов в отсутствие элементной серы, включая и виды, ранее•описанные как неспособные к росту в отсутствие элементной серы (T.stetteri, S.marinua).

Сопоставление состава продуктов брожения, осуществляемого организмами p. Thermococcus в присутствии и в отсутствие серы, приводит к выводу о том, что элементная сера не влияет на тип катаболизма у этих организмов, а используется лишь для сброса электронов, освобождающихся при брожении. Сероредуктазная активность, обнаруженная в мембранной фракции бесклеточного экстракта T.stetteri, проявляется в присутствии молекулярного водорода. Это говорит о возможном переносе электронов с гидрогеназы на сероредуктазу.

Явление стимуляции процесса брожения в результате наличия внешнего стока для электронов известно достаточно давно; его частный случай - явление межвидового переноса водорода при совместном росте бродилыциков и водород-использующих анаэробов (Wolin, Miller, 1982). Использование элементной серы как акцептора электронов при брожении ранее было показано только для экстремально термофильной архебактерии Ругососсиз furtoaua (Piala et al., 1986), рост которой оставался неизменным, если присутствие элементной серы заменяли удалением образующегося водорода при продувке ферментера азотом. Подавление брожения водородом связано с ингибированием им ферредок-син-зависимой гидрогеназы (Adams, 1991); образование сероводорода вместо водорода снимает ингибирующий эффект.

Недавно было установлено, что присутствие элементной серы стимулирует рост экстремально термофильной эубактерии p. Thermotoga,

позволяя избежать образования ингибирующих количеств водорода, при том же удельном урожае клеток на' молекулу использованной глюкозы (Jansen, Morgan, 1992). Зто явление было обозначено как "облегченное брожение". ,3 отсутствие серы увеличивается образование лактата. Экстремально термофильные архебактерии лишены способности к образованно частично восстановленных ' продуктов - • лактата или этанола; единственным восстановленным' продуктом в отсутствие серы является молекулярный водород. Таким обр'аэЪм, процесс брожения, осуществляемый экстремально термофильными архебактериями, оказывается особенно уязвимым и, следовательно, зависимым от-наличия экзогенного акцептора , электрона - элементной серы. " ' л : . ' ' '■•■

Следует отметить, однако, - что ингибирующий эффект водорода проявляется-прежде всего при лабораторном культивировании- чистых

* культур бактерий в замкнутых сосуда* с' относительно'небольшим свободным объемом. Любое приближение к природным условиям (продувание инертным газом, увеличение свободного объема, культивирование в

- присутствии водород-использующих метаногенов) снимает этот эффект, и, следовательно, зависимость от элементной серы.

ОЧ; v.-

4. Умеренно термофильные бактерии, восстанавливающие элементную серу

В .отличие от экстремальных термофилов, , развивающихся в сольфа-тарах,с температурой выше 75°С, умеренно термофильные бактерии обитают в гидротермах с температурой 45-65°. t . Группа'умеренно термофильных бактерий, восстанавливающих эле'' ментную серу в г£роцессе роста, находится лишь в начальной фазе описания. Несомненно, 'число видов и; их разнообразие будут в будущем значительно-расширены. Выделенные нами организмы и их характеристики представлены в таблице 12. Среди них. присутствуют как органо-' ' -трофные умеренно термофильные анаэробы, использущие углевода,' пептида, лактат, так и бактерии, восстанавливающие элементную серу за счет .окисления продуктов брожения: летучих жирных кислот, спиртов,

• молекулярного водорода.

Таблица 12. Умеренно термофильные бактерии, восстанавливающие элементную серу.

Источник выделения

Вид, Морфология итамм

Субстраты Продукты Способность к росту без в

ЦианоОак- ?8" тэриальный мат, кальдера Узон

ьв

Донные осадки оз. Грин

Донные осадки бухты Матупи

храм-положительные палочки с плек-тридиальными спорами

Грэм-положительные палочки с кло-стридиальны-ми спорами

Цепочки грам-положительных клеток со спорами и.пери-трихальным жгутикованием

ОевиТ/и- Грам-отрица-геПа тельные .ко-асеИт- роткие, палоч-галз ки с полярным А-63, жгутиком ГбМ- 5264-

РЯ1 Овальные* или коккоидные подвижные клетки-

Грам-отрица-тельные, короткие 'палочки с полярным' жгутиком

Пептиды - Ацетат, про- +

,,. пионат, изо-бутирзт, этанол, СО,,

»Г ГТ (-1

По 1 ГЬ^о Л О

Углеводы, Ацетат, эта- +

,'- нол, СОо, гцу,

■ ■ ■

Углеводы

ОезШ/и-

ге11а

тиШ-

ро1епз

ЙН-8,

Г)ЗМ 8415

2М1

¿410

Короткие

подвижные

палочки

Неподвижные мелкие кокки

Лактат Ацетат, брр, Н2, Н2з " V

Ацетат, Н?5, С0п пиру ват 10

пальмитат, стеарат

Пропио Н^Б, С02 нат

Н„,; аце-' Но5, С09 ,

т§т, та- " ^ •

рувзт,

бутират,

пальмитат,

стеарат

Этанол _Е>3, СО,

Ацетат ЛоВ, С02

и

И

4.1.Органотрофнна умеренно термофильные сероредуцирующие бактерии.

Из цианобактериального мата, развивающегося в источнике с высоким содержанием сульфида (см. раздел 5.2), были получены чистые культуры доминирующих микроорганизмов, 'осуществляющих сероредукцию за счет окисления таких субстратов .как глюкоза, пептон, лактат при 55°С. Все они представлены облигатно-анаэробными грам-положитэльны-ми спорообразущими палочками (таблица 12)-. В процессе анаэробного роста в присутствии элементной серы шло ее восстановление в сероводород; одновременно менялось относительное образование других продуктов брожения': снижалось образование водорода и этанола, увеличивалось образование ацетата (рис. 6). Восстановление элементной серы в сероводород стимулировало рост: выход клёток возрастал на 35-80% (рис. 7). Вместе с тем удельный урожай,клёток на молекулу использованного субстрата оставался неизменным, -"

Ряд типовых культур анаэробных умере'нно термофильных органо-трофных эубактерий был проверен на способность восстанавливать эле-ментую серу при росте на глюкозе. Эта способность была обнаружена у ТЬвпаоапаегоЫш ЬгосРЛ(, ШегшоапаегоЬIш Та^оеМгуИсит, ТНегто-ЪаМегоЬЗез асе1оеищ11сиз, С1оз^Ш1т thermohtJclrosv.lftJr(сш. Тем не менее, рост исследованных организмов не стимулировался, а в некоторых случаях даже подавлялся серой, видимо, за счет ингибирова-ния образующимся сульфидом. Потребление глшозы и образование продуктов брожения оставались на прежнем уровне; состав продуктов существенно не менялся.

4.2. Умеренно-термофильные бактерии с серным дыханием.

Умеренно термофильные бактерии нового рода ОеэиТ/игеНа (Вопо!1-0впто1оубкауа, 1990; 43:624) выделены нами из цианобактериального мата кальдеры Узон и донных осадков озера Грин (таблица 12). Это грам-отрицательные эубактерии с короткими палочковидными клетками, окруженными глобулярным Б-слоем, подвижные с одним полярным жгутиком. Бактерии р. Вези1^е11а - облигатные анаэробы, обли-гатно зависящие от элементной серы, которая не может быть заменена никаким другим акцептором электронов. Таким образом, по морфологии и физиологии новые изоляты близки к мезофильному роду 1>ези7/игдао-

15 5

X

о

<

со о

л <

I 1

X

«

о х

о. С

ш 5

г/Л «га гга

1

2 3 ,

ГШи

яаи

1 и

Ш в гИ т

Е>

3

Р73 Ш

Рис. 6. Состав продуктов метаболизма умеренно-термофильных эу-бактерий в присутствии (I) и в отсутствии (II) элементной серы: А - штамм Р8, субстрат - пептон; Б - штамм 61, субстрат - глюкоза; В - штамм £6, субстрат - глюкоза.

1 - сероводород, 2 - водород, 3 - ацетат, 4 - этанол, 5 -изобутират, 6 - изовалерат.

Рис. 7. Влияние элементной серы на рост штаммов умеренно термофильных эубактерий на пептоне (?-8) и глюкозе , ьб).

паз. Кх отличает, однако, термофилия (рост в интервале температур 43-72°С с оптимумом при 55°С), а также низкий Г+Ц состав ДНК (33 мол.% по сравнению с 50-60 мол.% у дезиТ/иготопаэ) и отсутствие цитохромов. Типовой вид ВвзиТ^геНа асеИиогалз использует ацетат, пируват, а также окисляет насыщенные жирные кислоты. Элементная сера в процессе роста восстанавливается до сероводорода (рис. 8). Спектр источников энергии, используемых В.тиШрагепз, шире: в дополнение к субстратам, окисляемым О.асеИьогапз, этот организм использует бутират, а также способен к росту в литоавтотрофных условиях на минеральной среде с молекулярным водородом, элементной серой и С02 (таблица 13, рис. 9).

Время (час)

Рис. 8. Рост (I), потребление ацетата (2) и образование сероводорода (3) ВезиЛ/игеПа асеНиогапз А-бз.

Таблица 13. Рост и образование сульфида 0.тиШро£епз на минеральной среде с различными источниками энергии.

Субстрат Урожай клеток • н25,

хЮ3/мл (мкмоль/мл)

К2 15,8 115,0

Ацетат 5,4 42,5

Бутират 7,3 30,0

Пирувзт 51,3 35,0

Пентадеканат. 2,2 12,5

Пальмитат 2,9 19,0

80 |

N.

Л <

0

1

Б0 I

(Л

СМ г^

X X

•г.0

20

0 ¿.0 80 120 Время (час)

Рис. 9. Рост (I), потребление водорода (2) и образование сероводорода (3) Оеаий/игеНа mu.lt ipotenз Ш-в.

Бактерии р. Веэи1?иге11а осуществляют полное окисление всех используемых субстратов: единственными продуктами жизнедеятельности являются СС>2 и ¡^з. Окисление большинства субстратов, используемых бактериями р. 1>еаи1/иге11а, не может обеспечить субстратного фосфо-рилирования, а лишь окислительное фосфоршшрование в цепи переноса электрона; таким образом, следует предположить, что бактерии р. Ве-8и1{иге11а осуществляют серное дыхание, то есть получают энергию в процессе переноса электронов по цепи.

Отсутствие цитохромов у О.асеиуогота было показано с помощью дифференциальной спектрофотометрии как клеточной суспензии, так и

за

бесклеточных экстрактов. Установлено присутствие менахинона. Исследован процесс окисления ацетата и показано, что, как и у Desulfvro-топаз acetoxidan3, этот процесс идет через восстановительный цикл трикарбоновых кислот, однако активация ацетата происходит иным путем: ацетил КоА образуется из ацетата через ацетилфосфат.

Еще ряд умеренно термофильных бактерий, восстанавливающих элементную серу за счет окисления несбраживаемых субстратов, был выделен из тех же источников, а также из морских гидротерм с температурой 50-60°С. И в цианобактериальном мате кальдеры Узон, и в донных осадках озера Грин были обнаружены сероредуцирующие эубактерии с крупными клетками кокковидной или овальной формы, использующие только пропионат. В морских гидротермах, расположенных на литорали бухты Матупи, популяция умеренно термофильных сероредуцирующих эу-бактерий представлена короткими мелкими палочками, использующими ацетат и этанол. Из той же бухты, но с глубины 10 м, выделены мелкие кокковидные или овальные эубактерии, окисляющие ацетат за счет восстановления элементной серы при t° 75°С.

Способность к восстановлению элементной серы достаточно широко распространена среди эубактерий, в подавляющем большинстве мезо-фильных. Сероредуцирующие эубактерии не являются физиологически единой группой - такой как метаногены, и даже сульфатредуцирующие бактерии; существуют, по-видимому, все возможные варианты использования элементной серы в процессах катаболизма. Так, эубактерии с облигатным серным дыханием p. Desulfuromonaa (Pfennig, Biebl, 1976) по степени специализации сопоставимы с метаногенами или сульфатре-дукторами. Восстановление элементной серы может производиться факультативными анаэробами в процессе анаэробного дыхания в качестве одной из нескольких возможных терминальных восстановительных реакций (аналогия - денитрификация). Примером таких организмов являются бактерии p. Campylobacter (baanbrook et al., 1973), Schewanella (Perry et al., 1992), DeaulfurospirIlium deleytanum (Schumacher et al., 1993). Наконец, элементная сера может восстанавливаться в ходе брожения, осуществляемого облигатными анаэробами. Этот процесс может быть сопоставлен с нитратредукцией, и у мезофильных организмов отмечен только у галофильных бактерий p. Halobacterotdea и Haloin-cola (Жилина и до 1991, Кевбрин, Заварзин, 1992), хотя можно

предположить значительно более широкое распространение этой реакции.

В нашей работе исследовались только облигатше анаэробы, относящиеся, следовательно, к первой или третьей группе организмов. Несомненно, эта ориентация оставила вне рамок исследования группу факультативных анаэробов, среди которых также могли присутствовать сероредукторы. Примером таких микроорганизмов является термофильный вариант Pseudomonas mendoclna (Балашова, 1985), восстанавливающий элементную серу в числе многих других неорганических акцепторов электрона.

Способность к восстановлению элементной серы оказалась широко распространенной среди умеренно термофильных органотрофных эубакте-рий - как типовых культур, так и новых изолятов, выделенных на средах с элементной серой. Однако лишь рост последних существенно стимулировался в присутствии элементной серы. Можно предположить, что селекция именно таких организмов происходит в накопительных культурах, поддерживавшихся на средах с элементной серой, в то время как типовые культуры анаэробных умеренно термофильных органотрофов выделялись на среде без элементной серы и отбор их по признаку стимуляции роста серой не происходил. Ранее способность к восстановлению элементной серы умеренно термофильными органотрофами не изучалась, хотя способность к восстановлению тиосульфата сочтена признаком родового ранга при последней реклассификации этой группы (Jain et al., 1993).

Ни один из исследованных органотрофных организмов в присутствии элементной серы не осуществлял полного окисления используемых субстратов. Элементная сера не влияла также на удельный урожай клеток на единицу использованного субстрата. Таким образом, процесс, осуществляемый умеренно термофильными органотрофными эубактериями в присутствии элементной серы, можно, так же, как и в случае экстремально термофильных архебактерий, классифицировать как "облегченное брожение", ранее показанное для бактерий р. Thermotoga (Jansen, Morgan, 1992). Аналогично Thermtoga, зависимость умеренно термофильных органотрофов от элементной серы не имеет такого жесткого характера, как у экстремально термофильных архебактерий; альтернативным восстановительным процессом является, однако, образование не лактата, а этанола.

В умеренно термофильных сообществах гидротерм, наряду с орга-нотрофными бродилыциками, мы обнаружили новую группу серореАудирующих эубактерий, в настоящее время представленную одним родом БеаиТ-рзгеНа. Бактерии рода ВезиХ/игеНа и сходные с ними являются истинными сероредукторами, осуществляющими серное дыхание и полное окисление органического вещества. Недавнее исследование нуклеотид-ной последовательности 16Э рРКК О.асе?{иогааз показало принадлежность этого рода к классу Рго1еоЪас1ег1а, но одновременно его большую филогенетическую обособленность: равную удаленность от всех 5 подклассов (йа1пеу et а1., 1993).

По сравнению с бактериями р. Вези!/иготопаз организмы р. Ве-виТ/игеПа отличаются более широким спектром окисляемых субстратов, куда входят, помимо ацетата, жирные кислоты с большим числом атомов, вплоть до С^д-Охд насыщенных жирных кислот. Неполная характеристика других новых изолятов с серным дыханием не позволяет определить их таксономическое положение. Тем не менее, можно говорить о значительном биоразнообразии умеренно-термофильных эубактерий, способных к анаэробному росту за счет серного дыхания.

Таким образом, исследование богатых элементной серой вулканических биотопов с температурой ниже 80°С обнаружило наличие в них новой группы умеренно термофильных эубактерий с серным дыханием, способных окислять широкий спектр субстратов, представляющих основные продукты брожения. В сообществе с органотрофными умеренно термофильными эубактериями, гвдролизующими и сбраживающими биополимеры, эта группа может осуществлять полную минерализацию органического Еещества с образованием Н^з и С02 как единственных продуктов.

Тем не менее, только прямые измерения скорости бактериальной сероредукции непосредственно в местообитаниях термофильных сероре-дуцирузощих бактерия могли дать окончательную оценку их места в микробных сообществах гидротерм и роли в циклах углерода и серы.

5. Количественная оценка интенсивности бактериальной сероредукции в микробных сообществах гидротерм

Интенсивность бактериальной сероредукции была определена в нескольких типичных местообитаниях термофильных сероредуцирующих бактерий: морских мелководных гидротермах, цианобактериальных матах,

сообществе, ассоциированном с Thermothrtx thlopara.

5.1. Морские гидротермы

Скорость бактериальной сероредукции была определена с помощью радиоизотопного метода в гидротермах с различными физико-химическими условиями и различным содержанием элементной серы. Б ряде гидротерм был зарегистрирован процесс восстановления элементной серы (таблица 14). Наиболее высокая скорость сероредукции была отмечена в гидротермах с температурой в области 50°С , расположенных на литорали (бухта Матупи, бухта Кратерная) - до 5,7 г Б2~/л/еутки. Во всех случаях параллельно определяли интенсивность небиологического восстановления элементной серы в автоклавированных контрольных пробах, составлявшую от 0,02 до 16% от опытных величин.

В некоторых пробах процесс сероредукции выявить не удалось, возможно, из-за нарушения анаэробиоза при их отборе. Чтобы оценить потенциальную скорость сероредукции в этих биотопах, пробы предварительно восстанавливали добавлением 2 мМ Na2S 9Н20. Полученные результаты представлены в таблице 15. Наиболее высокая потенциальная скорость сероредукции была■зарегистрирована в пробе с литорали о. Уэйл. В пробах высокотемпературных осадков залива Пленти и бухты Матупи скорость сероредукции оставалась низкой даже после восстановления.

5.2. Цианобактериальные маты кальдеры Узон

В кальдере Узон, наряду с хорошо изученными цианобактериальны-ми матами источника Термофильный, основными путями анаэробной деструкции в которых являются сульфатредукция и метаногенез, мы обнаружили совершенно иной тип мата. Из описанных ранее он наиболее близок к "аноксигенному типу" матов, развивающихся в источниках с высоким содержанием сульфида (Ward et al., 1989). Исследованный нами мат развивается по периферии бессточного грифона в области температур 40-55°С. В воде грифона содержится значительная концентрация сульфата (96 мг/л) и сульфида (концентрация в центре источника 1480 мг/л, концентрация под матом 930 мг/л). Мат толщиной до 1,5 см занимает площадь в несколько квадратных метров. Между слоями мата

Таблица 14. Скорость восстановления элементной серы в морских мелководных гидротермах.

Место исследования Характеристика биотопа Проба ^С. рн Образование Б , мг/л/сутки опыт контроль

Залив Пленти, Новая Зеландия, впадина МакЗванса Песок вокруг горячего выхода на глубине 15 м Р2 52 6,5 0 0

Там же, вулканическая воронка Ил с глубины 40 м ?4 Р7 81 65 5,5 5,5 0 15,89 0 2,54

О-в Уэ&я, Новая Зеландия Береговой источник Газопаровой выход на литорали 7Г1 Ш 92 85 1.4 6.5 0 0 0 0

Бухта Матупи, Папуа-Новая Гвинея Горячий источник на литорали М2-1 50 6,5 5736,8 0,81

Песок с глубины 2 м М2-5 50 6,5 3,9 0,31

Прибрежный, источник МЗ-1 эо • 7,0 2,7 0,4

Горячий источник на глубине 23 м МЗ-2 80 3,6 0 0

Горячий источник на глубине 12 м МЗ-10 85 7,0 0,21 0,01

Бухта Кра-терная, Курилы Горячий источник на литорали К1 45 6,5 938,4 0,9

Прибрежный источник К4 87 6,5 0,51 0,05

Таблица 15. Потенциальная скорость восстановления серы в морских мелководных гидротермах.

Проба Образование Б2" ", мг/л/сутки

опыт контроль

Р2 0,14 0,03

?4 0,59 0,14

»?1 0 0

160,13 12,8

МЗ-2 0 0

содержится элементная сера, что обуславливает его желтовато-оливковый цвет.

При инкубации изолированных проб мата 1п аНи общая скорэсть сульфидогенеза составила 560 мкг з~2/с.м2/час; одновременно определенная изотопным методом скорость бактериальной сульфатредукцщ составляла 0,12 мкг З^/см^/час. Тиосульфат и тетратионат, которые также могли бы быть восстановлены в сероводород, присутствовали в пробах в следовых количествах. Следовательно, прирост сульфида в изолированной пробе следует приписать процессу восстановления элементной серы, присутствовавшей между слоями мата.

Добавление различных энергетических субстратов к пробам циано-бактериального мата из источника Термофильного с последующей инкубацией в анаэробных условиях стимулировало образование метана (таблица 16). В пробах серосодержащего мата добавление тех же субстратов стимулировало образование сероводорода. Образование метана при этом ингибяровалось.

5.3. Сообщество НтегтогЬггх

Обрастания ТЬегтоПтг1х 1Ыорога, широко распространенные в кальдере Узон к на острове Кунашир, исследовались также на примере ист. Термофильный, где они развиваются по руслу ручья в температурной зоне 66-73°С. Цепочки клеток ТавтоШпхпокрыты элементной се-

Таблица' 16. Стимуляция образования восстановленных продуктов в цианобактериальных матах при добавлении различных субстратов.

Субстрат

Образование (шоль/см ) пробами мата,г содержащего серу мата Термофильного ист.

CK,,

** г»

n-S л

CK,

НглЭ

Пектин 0 625 170 40

Дрожжевой экстракт 0 355 120 -

Гидролиза-? казеина о40 180 -

Лактат 370 680 220 -

Формиат 870 860 310 - '

Ацетат 0 1175 14 -

Метанол 0 III5 ' 800 20

Зтчнол 0 1025 430 -

!ЛКЦйрИН 0 LOf О 810 -

инкубация 14 суток

рой, СОДнрлгв hrti * которой составляет 3 ■г <-,..3 .i мГ/См , , Скорое1 ть восстановле-

ну; Я Э-Л^м^НТН 0? серы в к< юмчх Thermoi hrtx была Опреде, лека по прирос-

ту сульфида _ —л . /. . в и з о лиро ванкых пробах и составила величину 0,6 мкг

1"чч«тельно превысив скорость сульфатредукции (0,13

—? ?

мкг Б /см"7'час). Образования метана в этом сообществе зарегистрировано не было; таким образом, сероредукция явилась основным путем анаэробной деструкции клеточной массы Т1\егт.о1Ъх,1х.

Несомненно, полученные данные, в особенности результаты радиоизотопных исследований, требуют некоторой осторожности при их интерпретации. Известно, что при температуре в области Ю0°С идет химический процесс восстановления элементной серы (Roy, Trudinger, 1970, Belkin et_al., 1S85). Кроме этого, показан процесс изотопного обмена между 3о5° и n?;S (Rössing, Jorgensen, 1SS2), зарегистрированный в морских осадках с pH 7,5 и идущий через образование поли-сульфзда. Б наших опытах мы также отмечали небиологический процесс

образования однако разница между опытными и контрольными из-

мерениями была значительной и составляла в среднем 90%. В пользу трактовки разности между скоростью образования н|5з в опытных и контрольных образцах как характеризующей биологический процесс се-роредукции говорит тот факт, что большая часть изотопных определений интенсивности сероредукции проводились в гидротермах с рН=6,5, в то время как образование полисульфида происходит при рк>7,0.

При определении общего прироста сульфида в изолированных пробах основным акцептором электрона являлась сера, содержавшаяся в пробе. Такой способ определения скорости сероредукции - по суммарному сульфидогенезу - представляется более надежным, чем радиоизотопный, однако имеет несравненно более низкую чувствительность и может быть использован только для биотопов с высоким содержанием элементной серы и высокой интенсивностью ее восстановления.

Серьезным недостатком использованных методов являлось определение только кислоторастворимого сульфида, хотя значительная его часть могла переходить в пирит и не учитываться, вследствие чего результаты могли быть занижены.

Тем не менее, совокупность использованных методов дает представление о биогеохимической значимости процесса бактериальной сероредукции в микробных сообществах гидротерм. Для рассмотрения конкретных механизмов участия сероредуцирующих бактерий в важнейших баогеохимических циклах необходимо вернуться к свойствам чистых культур, выделенных из термальных местообитаний.

6. Биогеохимическая роль сероредуцирующих бактерий в микробных сообществах гидротерм

Широкое распространение и высокая численность сероредуцирующих бактерий в гидротермах свидетельствует о том, что они являются существенным компонентом термальных местообитаний. Полученные нами данные о свойствах чистых культур термофильных сероредуцирующих бактерий позволяют охарактеризовать их место и роль в важнейших биогеохимических циклах, протекающих в этих биотопах.

6.1. Роль бактериальной сероредукции в анаэробном цикле углерода в микробных сообществах гидротерм

Восстановление элементной серы может происходить как в процессе продукции органического вещества хемолитоавтотрофами, так и в процессе деструкции органических субстратов.

Экстремально термофильные сероредукторы наряду с метаногенами рассматриваются как возможные первичные продуценты органического вещества в вулканических местообитаниях (stetter et al., 1989). Источником энергии для них служит вулканический водород, источником углерода - углекислота; таким образом, предполагается существование полностью автономного сообщества, не зависящего от солнечной энергии. Однако наши исследования, как и многочисленные литературные данные (Pledger et,al. 1989; Jannasoh et al., 1993, и пр.), показали значительно более широкое распространение и высокую численность органотрофных экстремально термофильных сероредукторов, использующих сложные органические субстраты. Несмотря на теоретическую возможность участия термофильных сероредукторов в микробных сообществах гидротерм в качестве первичных продуцентов, их роль как деструкторов органического вещества представляется экспериментально более обоснованной.

Таким образом, органическое вещество, служащее субстратом для сероредуцирующих архебактерий, имеет чаще всего аллохтонное происхождение, поступая в морские осадки из продуктивных слоев водной толщи (Tarasov et al., 1986), а в континентальные горячие источники - с грунтовыми водами за счет температурной конвекции (Brook, 1990, Заварзин и др., 1989).

Субстратами экстремально термофильных сероредуцирующих архебактерий являются пептиды и полисахариды (крахмал, гликоген, пектин). Процесс анаэробной деструкции сложных полимерных субстратов обычно рассматривается как многоступенчатый процесс, осуществляемый многокомпонентным микробным сообществом (см., .например, Заварзин, 1986). Основными стадиями процесса анаэробной деструкции считаются гидролиз полимеров, брожение мономеров, стадия ацетогенеза, на которой разнообразные промежуточные продукты брожения превращаются в ацетат и водород, и, наконец, терминальные восстановительные реакции, завершающие полную минерализацию органического вещества. Нали-

чие неорганического акцептора электрона может направлять поток восстановителя по тому или иному пути (Бонч-Осмоловская, 1978), определяя конечную восстановительную реакцию (сульфатредукция, метано-генез и др.).

Проведенные нами исследования бактериальной сероредукции показали существование различных возможностей участия осуществляющих его организмов в процессе анаэробной деструкции органического вещества .

Палочковидные экстремально термофильные органотрофные архебак-терии, относящиеся к родам ТЬегторго1еиз и РугоЪаоиТш, могут предположительно осуществлять полный процесс анаэробной - минерализации сложных органических субстратов за счет серного дыхания (рисЛОА). Тем не менее, процессы, представляющие собой варианты анаэробного дыхания, далеко н& всегда сопровождаются полным окислением органических субстратов (Югаиег et а1., 1989). Об этом же свидетельствуют и наши экспериментальные данные (таблица 5). Что касается кокковид-ных экстремально термофильных органотрофных архебактерий, в особенности морских, то в их сообществах осуществляются лишь первые два этапа процесса анаэробной деструкции - гидролиз и брожение (рис.

/ОБ). Пока не обнаружены экстремально термофильные микроорганизмы, способные анаэробно окислять недоокисленные продукты брожения, в частности, ацетат. Возможно, что этот процесс в морских высокотемпературных гидротермах осуществляют сульфатредуцирующие бактерии, высокая активность которых при 90°С в глубоководных гидротермах была недавно зарегистрирована с помощью радиоизотопного метода (ОЧл^егшеп et а1., 1993).

По нашим данным, в высокотемпературных гидротермах вклад сероредукции значительно ниже, чем метаногенеза и сульфатредукции, в то время как в умеренно-температурных сообществах сероредукция является доминирующим процессом (таблица 17).

Процесс анаэробной деструкции, осуществляемый сообществом умеренно термофильных бактерий, представляет собой классическую систему реакций (рис.(ОВ). Умеренно термофильные эубактерии осуществляют гидролиз и брожение органических субстратов, используя элементную серу как акцептор электронов. Бактерии рода ВезиТ/игеНа и сходные с ниш умеренно термофильные бактерии с серным дыханием осуществляют полное окисление продуктов брожения до СО^ и Й^з.

ПЕПТИДЫ ПОЛИСАХАРИДЫ

"г5-

СО о

А)

ПЕПТИДЫ ПОЛИСАХАРИДЫ

Н25

■СО,

Лй!,у-1*5Е лмРНЫЕ КИСЛОТЫ

ПЕПТИДЫ ПОЛИСАХАРИДЫ

СО„

ЛЕТУЧИЕ аИРКЫЕ КИСЛОТЫ

со.

В)

В)

Рис. 10. Участие сероредуцирующих бактерий в процессе анаэробной деструкции органического вещества в высокотемпературных наземных (А) и морских (В) гидротермах; в мезофильных микробных сообществах (Б).

Таблица 17. Вклад терминальных процессов анаэробной деструкции в минерализацию органического вещества в гидротермах.

Место исследования t0c Деструкция органического вещества-1" (мг С/л/сутки) метано- сульфат- сероре-генез редукция дукция

Залив Пленти, Булкзниче екая Боронка 65 1,20 4,08 0,20

Бухта '«атупи, подводный горячий источник 85 0,9 1,56 0,07

Бухта Матупи, литораль 50 5,88 3,65 2035,6

^Данные по интенсивности сульфатредукцш и метаногекезэ получекь Б.З. Нэмсараевым.

Окисленич ацетата является "узким местом" процесса анаэробно! деструкции, что подтверждается закономерностями использования этогс соединений в цианобактериальных матах. В матах Иеллоустонского национального парке образование метана из ацетата зарегистрировано н< (&до, и основным путем его утилизации является фотоассимяляци С!-'Лого/1етв - процесс, сам по себе деструкцией ке являющийся. I цийнобактерианьном мате ист. Термофильный в кальдере Узой, образование метана ид ацетата, хотя и было зарегистрировано нами с помощью радиоизотопного метод*, а также подтверждается присутствием з мате авьТитоТЬгЬх IЬегтгмсе'со[АI1а, составляло лишь 13% от суммарного метаногенеза и не могло обеспечить полное окисление ацетата > глубинных темновых горизонтах. Возможно, именно отсутствие•эффективного пути использования ацетата является причиной отставай^ скорости деструкционных процессов от продукционных, что приводит ; накоплению органического вещества циааобактерий (таблица 18).

В цианобактериальком мате, развивающемся в богатом сульфидо» источнике и содержащем элементную серу, присутствует многочисленна! популяция сероредукторов р. Г*?5к</и»\?Иа, окисляющих летучие жирны* кислоты, и в первую очередь ацетат. В таком сообществе скорость да-

струкции органического вещества соответствует скорости продукции (таблица 18). То же самое наблюдается в сообществе ТЬегтоОтг1х, где бактериальная сероредукция также является доминирующим процессом анаэробной деструкции.

Если процесс анаэробной деструкции идет в присутствии нескольких акцепторов электрона, соответствующие группы микроорганизмов конкурируют между собой за источник- энергии (Бонч-Осмоловская, 1978). Наш исследования бактериальной сероредукции в гидротермах показывают, что этот процесс является конкурентоспособным, подавляя альтернативные реакции (метаногенез и сульфатредукцию). Однако, в отличие от большинства других акцепторов электрона, элементная сера нерастворима и транспорт ее может быть затруднен, а в случае структурированных микробных сообществ и просто невозможен. В связи с этим особое значение приобретает проблема происховдения элементной серы в гидротермах.

Таблица 18. Продукционные и деструкционные процессы в микробных обрастаниях горячих источников кальдеры Узон

1)

Местообитание Продукция органического вещества мкг С/см~/час

Деструкция органического вещества мкг С/см^/час метано- сульфат еероре- суммар-генез редукция дукция ная

Дианобактери-альный мат из ист. Термофильный

10,8

3,5

4,5

8,0

Цианобактери-альный мат из сульфидного источника

58,4

следы

0,1

3,9 89,0

Обрастания ТЬег7йо1Ьг1х

0,075

следа 0,09

0,28 0,37

1)

Данные получены совместно с В.М. Горленко

6.2. Роль сероредуцирующих бактерий в цикле серы в микробных сообществах гидротерм

Элементная сера является одной из наиболее значимых форм серы в районах современного вулканизма и поствулканической активности. Так, в кальдере Узон общий запас элементной серы оценивается в I00C т (Карпов, 1988). Элементная сера'может иметь непосредственно вулканическое происхождение,, возгоняясь с водяными парами и переосаждаясь в области газопаровых выходов - так называемая самородная сера. Однако основным источником элементной серы считается вулканический сероводород, который реагирует с вулканическим S02 или - в зонах разгрузки гидротерм - с атмосферным кислородом (Giggenbach, 1980).. Осаждение элементной серы может также идти и в глубинных горизонтах, где насыщенный сероводородом флюид встречается с обогащенными кислородом холодными грунтовыми водами (Карпов, 1988). Е подводных гидротермах, морских или озерных, образование элементной серы идет на фронте встречи гидротермального флюида с холодной океанической или озерной водой, содержащей кислород. Активное образование элементной серы может идти за счет периодической смены окислительно-восстановительных условий в приливно-отливной зоне. Е исследованных нами случаях примерами таких сообществ являются мелководные гидротермы на литорали бухт Матупи и Кратерной. Так, например, в бухте Кратерной мы наблюдали смену окислительно-восстановительных условий, связанную с приливом и отливом и обеспечивающую постоянное пополнение пула элементной серы за счет окисления вулканического и биогенного водорода (рис. II).

Процесс окисления сероводорода до элементной серы может быт! как химическим, так и биологическим. Известно достаточно много микробиологических процессов, осуществляемых как термофильными, так * мезофильными бактериями и связанных с использованием энергии окисления вулканического сероводорода. Так, для глубоководных гидротерь показано, что практически весь вулканический сероводород окисляете? биологически (Jannasoh et al., 1993). Цикл серы, протекающий в подобном биотопе, схематически представлен на рис. I2A.

Образование элементной серы может также быть связано с процессами первичной продукции органического вещества хемо- или фотосинтетиками. Примерами таких сообществ являются обрастания Thenmtbrii

(рис. I2B) и цианобактериальные маты, развивающиеся в богатых сульфидом источниках (рис. 123). Tnermothrix thiopara, развиваясь в сульфидных источниках с температурой в области 70°, окисляет вулканический сероводород до элементной серы, отлагающейся на поверхности агрегатов клеток (Caldwell et al., 1976). В цианобактериальных матах образование серы может идти за счет окисления сероводорода кислородом, образующимся при оксигенном фотосинтезе, а также в процессе аноксигенного фотосинтеза.

■ Восстановление элементной серы в процессе анаэробной деструкции замыкает короткий цикл серы, "серный шунт":

з°<—>H2s

Вреш.час

Рис. II. Изменение основных параметров среды в горячем источнике, расположенном в приливно-отливной зоне бухты Кратерной: уровень воды (I); температура (2); концентрация сероводорода (3), растворенного кислорода (4) и элементной серы (5).

Данные получены совместно с Д.Ю. Сорокиным.

МЕЗОФЙЛЬНЫЕ ХЕМОЛЙТОТРОШ ХИМИЧЕСКОЕ ОКИСЛЕНИЕ

"2

ОРГАНИЧЕСКОЕ ВЕЩЕСТВО

АгсМеа (>80°С) Бас1еИй (<80°С)

Ш<2гто1Ъг*1х

Г* »ч * * и»^ <чт I

п^Ь Кий оЩЬоТ-/

СЕР0РЕД7-70"С ЦРРУЩКЗ БАКТЕРИИ

ФОТОТРОФм

К23 КОЕ ВЕЩЕСТ- 50

СЕРОРЕДУ-50°С ЦйРУмцКЕ БАКТЕРИИ

Рис. 12.. Участке сероредуцирущих бактерий в цикле серы з подводных гидротермах (А), в сообществе, ассоциированном с Т)-1£гшо'(.Т<г1х Шорага (Б) и в анокситенном термофильном цийнобактериальном мате

Таким образом, исследуя микробные сообщества гидротерм, мы обнаружили, что ряд из них характеризуется новым типом анаэробной деструкции, происходящей за счет восстановления элементной серы, запас которой постоянно пополняется в результате окислительных процессов, происходящих в пределах того же сообщества. Могут ли найденные закономерности быть распространены на иные, чем вулканические , биотопы?

Лабораторным аналогом аноксигенного цианобактериального мата может служить синтрофная ассоциация мезофильных бактерий -фототрофной, окисляющей сероводород, и сероредуцирующей (Wolfe, Pfennig, 1976). Такая ассоциация может существовать за счет короткого цикла серы даже при ее очень низком исходном содержании в среде.

Несомненно, цикл сера<—>сероводород может осуществляться на аэробно-анаэробной поверхности осадков с интенсивной сульфатредук-цией а нижних слоях. Уже был охарактеризован аналогичный цикл, основанный на образовании и окислении тиосульфата, "тиосульфатный шунт" (Jorgeneen, Bäk, 1ЭЭ1). Существование тиосульфатного цикла было показано также для лабораторной модели сообщества Thertaothrix (Балашова, 1984). Вместе с тем окисление сероводорода не до тиосульфата, а до серы характерно для дефицитных по кислороду условий (Gourraelon et al., 1977). Следовательно, можно предположить доминирование серного цикла над тиосульфатшм в условиях слабого премеши-зания или при низкой растворимости кислорода. Иллюстрацией последнего предположения может являться обнаруженный нами интенсивный процесс бактериального восстановления серы, идущий в галофильных цианобактериальных матах и водорослевых массах оз. Сиваш.

Заключение

Исследование микробных сообществ гидротерм показало, что способность к восстановлению элементной серы широко распространена среди термофильных бактерий, обитающих в гидротермах. Облигатно анаэробные архе- и эубактерии способны как к литоавтотрофному росту за счет окисления молекулярного водорода и одновременного восстановления элементной серы до сероводорода, так и к окислению широкого спектра органических субстратов: от биополимеров до низкомолекуляр-

них продуктов брожения. Физиологический смысл бактериальной сероре-дукции может быть различным: элементная сера может обеспечивать "облегченное брожение", являясь внешним акцептором электронов, или серное дыхание с полным окислением органических субстратов. Сообщества термофильных сероредуцирущих бактерий могут осуществлять полную минерализацию органического вещества до С02 и Н^э. Особое значение процесс сероредукции приобретает в тех микробных сообществах, где продукция органического вещества связана с образованием элементной серы, а также там, где пространственное или временное разделение окислительных и восстановительных процессов обеспечивает функционирование короткого цикла серы 5°<—>Е,3. Движимый притоком вулканического сероводорода, этот цикл становится эффективным механизмом анаэробной деструкции органического вещества в гидротермах, а бактериальная сероредукция - важным новым пунктом сопряжения анаэробных циклов углерода и серы в вулканических местообитаниях.

Выводы

1. Показаны широкое распространение, высокая численность и значительный катаболический потенциал термофильных бактерий, восстанавливающих элементную серу.

2. Из наземных и морских гидротерм выделены и охарактеризованы новые виды облигатко анаэробных органотрофных экстремально термофильных архебактерий !merшoproíeuз игоп1епз1з и Юеаи1/\хгососсиа атуШШсиа, ТЬетососсиз síeííert, ТГхегтососсиз goгgoг^яг£u6•, •Лтзппососсиэ pacificlia.

3. Показано, что все исследованные органотрофные экстремально термофильные архебактерии не осуществляют полного окисления органических субстратов, а в отсутствие серы способны к росту за счет брожения. У архебактерий р. ЕезиТ/игососсиа и ТЬегтососсиз брожение кнгибируется образующимся водородом, с удалением которого связано стимулирующее действие, оказываемое элементной серой на рост.

4. В гидротермах с температурой 50-60°С обнаружена многокомпонентная популяция эубактерий, способных к восстановлению элементно? серы. Органотрофные бактерии восстанавливают элементную серу в процессе брожения; этот процесс оказывает стимулирующее действие на ю рост. Выделены и охарактеризованы бактерии нового рода Е>ези1/иге11с

с облигатным серным дыханием, полностью окисляющие широкий спектр несбраживаемых органических субстратов и молекулярный водород.

5. дана количественная оценка интенсивности бактериальной се-роредукции в гидротермах и показана ведущая роль этого процесса при анаэробной деструкции органического вещества в ряде гидротерм.

6. Совокупность микробиологических и биогеохимических данных позволяет определить роль бактериальной сероредукции в гидротермах как осуществление важного пункта сопряжения анаэробных циклов углерода и серы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Бонч-Осмоловская Е.А. Восстановление элементной серы в термофильных альгобактериальшх матах кальдеры Узон (Камчатка). Всесоюзная конференция "Термофильные микроорганизмы в теории и практике народного хозяйства". Тезисы докладов. Москва, 1334, с.42.

2. Бонч-Осмоловская S.A., Жилина Т.К., Кожевникова А.Н., Слесарев А.й. Экстремально термофильные бактерии из гидротерм кальдеры Узон. VI Всесоюзное вулканологическое совещание. Тезисы докладов. Петропавловск-Камчатский, 1935, с.205.

3. Герасименко Л.М., Бонч-Осмоловская Е.А., Заварзин Г.А.. Микробные сообщества и их геохимическая роль. VII съезд БМО. Тезисы докладов. Алма-Ата, 1935, с.38.

4. Бонч-Осмоловская S.A. Восстановление элементной серы в термофильных альгобактериальных матах кальдеры Узон (Камчатка). В сб.: "Биология термофильных микроорганизмов". Ред.: A.A. Имшенецкий. М., Наука, 1986, с.112-113.

5. Бонч-Осмоловская S.A., Слесарев А.И., Мирошниченко М.Л., Светличная Т.П. Desulfvrococcua amylolyt1сиз n.sp., новая экстремально термофильная бактерия из гидротерм. ДАН, 1986, т.290, с.1259-1263.

6. Горленко В.М., Компанцева Е.И., Бонч-Осмоловская S.A., Старынин Д.А. Дифференциация микробных сообществ в зависимости от физико-химических условий в ист. Термофильный (кальдера Узон, Камчатка). Микробиология, 1987, т.56, с.314.

7. Горленко В.М., Бонч-Осмоловская S.A., Качалкин В.И., Старынин

Д.А. Продукционные процессы в микробных сообществах горячего источника Термофильный (кальдера Узон, Камчатка). Микробиология, 1987, т.56, с.872-878. '

8. Бонч-Осмоловская S.A., Горлекко В.М., Старынин Д.А., Карпов Г.А. Анаэробная деструкция цианобактериальных матов ист. Термофильный (кальдера'Узон, Камчатка). Микробиология, 1987, т.56, с.1022-1028.

9. Бонч-Осмоловская S.A., Карпов Г.А. Бактериальное образование метана в гидротермах кальдеры Узон (Камчатка). Микробиология, 1987, т.57, с.516-518.

10. Bonch-Osmolvskaya Е.А. Lithotrophio sulfur-reáuoing bacteria ir extreme environments. In: "Lithoautotrophy: a centenary meeting ir memory oí S.K. Yinogradski". Abstracts. Gottingen, 1987, p.43-

11. Бонч-Осмоловская E.A., Слесарев А.И., Мирошниченко М.Л., Светличная Т.П., Алексеев В.А. Характеристика Desúlfurococcus amyloly-iícus n.sp. - новой экстремально термофильной архебактерии, выделенной из гидротерм Камчатки и о. Кунашир. Микробиология, 1933, т.57, с.94-101.

12. Бонч-Осмоловская S.A., Заварзин Г.А., Герасименко Л.М., Венец-кая О.Л. Исследование терминальных процессов анаэробной деструкция нагонных масс водорослей в оз. Сиваш. Микробиология, 1988, т.57, с.312-319.

13. Бонч-Осмоловская Е.А., Веденина И.Я., Заварзин Г.А. Гиперсоле-кые лагуны оз.,'Сиваш и анаэробная деструкция органического вещества в галофильннх альгобактериальшх матах. Микробиология. 1988, т.57, с.442-449.

14. Кривенко В.М., Вадачкория P.M., Мирошниченко М.Л., Бонч-Осмоловская Е.А. Зосстановление элементной серы анаэробными термофильными сахаролитическими бактериями. Микробиология, 1988, т.57, с.689-690.

15. Cohen J., Gorlenko V.M., Bonch-Osraoiovskaya Е.А. Interaction oí sulfur and carbon cycles in microbial mats. In: "Evolution oí the global biogeochemical sulphur cycle". Eds.: P. Brimblecombe, A.Yu. Lein. Wiley & Sons, 1989, p.191-229.

,16. Бонч-Осмоловская E.A., Светличный B.A. Экстремально термофильные сероредуцирующие архебактерии. В сб.: "Архебактерии". Ред. Г.А, Заварзин. Пущино, 1989, с.50-59.

17. Бонч-Осмоловская Е.А., Заварзин Г.А. Термофильные бактерии,

восстанавливающие серу и формирование ими геохимического барьера. В сб.: "Кальдерные микроорганизмы". Ред. Г.А. Заварзин. М., Наука, 1989. с.98-112.'

18. Горлэнко З.М., Бонч-Осмоловская Б.А. Формирование микробных матов в горячих источниках и активность продукционных и деструкцион-ных процессов. В сб.: "Кальдерные микроорганизмы". Ред. Г.А. Заварзин. М., Наука, 1989, с.98-112.

19. Бонч-Осмоловская В.А., Мирошниченко M.JT., Алексеев Б.А. Экстремально термофильные бактерии из бухты Кратерной. Биология моря, 1989, N3, С.77-83.

20. MiroshniohenKo M.L., Bonoh-Osmolovskaya Е.А., Neuner A., Kos-trikina N.A., Chernyeh N. A., Alekseev V.A. Thermococcus stetteri sp.nov., a new extermely thermophilic sulfur-metabolizing archae-baoterium. System. Appl. Microbiol., 1989, v.12, p.257-262.

21. Бонч-Осмоловская S.A. Сероредуцирующие бактерии и их участие в процессе анаэробной деструкции органического вещества. В сб.: "Хемосинтез". Ред.: М.В. Иванов. М., Наука. 1939, с. 183-198.

22. Бонч-Осмоловская В.А. Восстановление элементной серы как терминальный процесс анаэробной деструкции органического вещества. 9 Международный симпозиум по биогеохимии окружающей среды. Тезисы докладов. М., 1989, с.156.

23. Zavarzin G.A., Svetlichny Y.A., Bonch-Osmolvskaya 2.A. Extreme thermophiles in hydrotherms. In: "Recent advances in microbial ecology". Ed.: T. Hattori. Japan Sci. Soc. Press, 1989, p-53-37.

24. Bonch-Osmolovskaya E.A., Sokolova Т.О., Kostrikina N.A., Zavar-2 in G.A. Desulfurella acet ivorana gen. no v. and. sp.nov. - a new thermophilic sulfur-reducing eubaoterium. Aroh. Microbiol., 1990, v.153, p.151-155.

25. Sohmitz R.A., Bonch-Osmolovskaya E.A., Thauer R.K. Different mechanisms of acetate activation in Desulfurella acetivorana and Deaulfuromonaa acetooxidans. Aroh. Microbiol., 1990, v.154, p.274-279.

26. Bonch-Osmolovskaya E.A., Miroshniohenko M.L., Kostrikina li.A., Chernyeh N.A., Zavarzin G.A. Thermoproteua uzonienais sp.nov., a new extremely thermophilic archaebaoterium from Kamchatka continental hot springs. Arch. Microbiol., 1991, v.154, p.556-559-

27. Bonch-Osmolovskaya E.A., Stetter K.O. Interspecies hydrogen

transfer in cocultures of thermophilic arohaea. System. Appl. Microbiol., 1991, v.14, p.205-208.

28. Bonoh-Osmolovskaya Б.А., Slobodkin A.I. Metabolism oi hyper-thermophilic organotrophic arohaebaoteria in the presence and ir absenoe of sulfur. In: "Arohaebaoteria". OSSR-FRG bilateral sympoE um. Abstraots. Tbilisi, 1990, p.15.

29. Pusheva M.A., Slobodkin A.I., Bonoh-Osmolovskaya K.A. Kydroge-nase aotivity of the hyperthermophilio archaebacterium Thermococcui Stettert K-15. In: "Arohaebaoteria". USSR-PRG bilateral symposium. Abstracts. Tbilisi, 19S0, p.15.

30. Bonch-Osmolovskaya B.A. Sulfur-reducing bacteria and their aotivity in natural environments. Журн. Общ. Биол., 1991, v.52, p.453-463.

31. Пуаева M.A., Слободкин А.И., Бонч-Осмоловская Б.А. Исследование гидрогеназной активности экстремально термофильной архебактерии Thermococcusi stetteri. Микробиология, IS9I, т.БО, с.5-11.

32. Копылов В.М., Бонч-Осмоловская Е.А., Светличный В.А., Мирошниченко M.JI., Скобкин B.C. Гамма-устойчивость и ультрафиолетовая чувствительность экстремально термофильных архебактерий и эубактерий. Микробиология, 1993, т.62, с.90-95.

33. Gongadze G.M, Kostyukova A.Yu., Miroshniohenko М.Ь., Bonoh-Osmolovskaya S.A. Regular proteinaceous layersof Thermococcus stetteri. Current Microbiol., 1993, v.27, p.5-9-

34. Bonoh-Osmolovskaya B.A., Wiroshnichenko M.L., rikuta S.7. Bacterial reduction of elemental sulfur in hot vents. In: "Thermo-philes: science and technology". Abstraots. Reykjavik, 1992, p. 137. '

35. Бонч-Осмоловская Б.А., Мирошниченко M.JI., Пикута E.B., Сорокин Д.Ю., Намсзрзев Б.Б. Бактериальная сероредукция в мелководных гидротермах юго-западной части Тихого океана. Микробиология, 1993, т. 62, с. 564-573.

36. Намсараев Б.Б., Бонч-Осмоловская Е.А., Качалкин В.й., Пропп Л.Н., Тарасов В.Г. Микробиологические процессы круговорота углерода в мелководных гидротермах западной окраины Тихого океана. Микробиология, 1994, т.63, c.IOO-III.

37. Miroshniohenko М.Ь., Gongadze G.M., bysenko A.M., Bonch-Osmolovskaya E.A. DeaulfureTla multipotena sp.nov., a new sulfur-

respiring thermophilic eubaoterium from Raoul Island (rCermadeo archipelago, New Zealand). Arch. Microbiol., 1993, v.60, p.88-93.

38. Старынин Д.А., Намсараев 5.Б., Бонч-Осмоловская Е.А., Качалкин З.М., Пропп Л.Н. Микробиологические процессы в донных осадках оз. Грин (архипелаг Кермадек, Тихий океан). Микробиология, 1994, т.S3, в печати.

39. Бонч-Осмоловская Е.А., Мирошниченко М.Л. Влияние молекулярного водорода и элементной серы на метаболизм экстремально термофильных архебактерий рода Thermococcua. Микробиология, 1994, т.63, в печати

40. Слободкин А.Я., Бонч-Осмоловская Е.А. Рост и образование продуктов метаболизма экстремально термофильными археями p. Desulfuro-coccus. Микробиология, 1994, т.63, в печати.

РИЦ ИСПИ РАН заказ N 1400, тар. 120.