Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурный полиморфизм кандидатных генов при аллергических заболеваниях (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит) у детей

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Структурный полиморфизм кандидатных генов при аллергических заболеваниях (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит) у детей"

Дедков Андрей Анатольевич

СТРУКТУРНЫЙ ПОЛИМОРФИЗМ КАНДИДАТНЫХ ГЕНОВ ПРИ АЛЛЕРГИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (БРОНХИАЛЬНАЯ АСТМА, АЛЛЕРГИЧЕСКИЙ РИНИТ, АТОПИЧЕСКИЙ ДЕРМАТИТ) У ДЕТЕЙ

03.02.07 - генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

2 ОЕВ Ш

Москва - 2012

005008832

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН,

заслуженный деятель науки РФ Иванов Владимир Петрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Щипков Валерий Петрович

доктор медицинских наук, профессор Петрин Александр Николаевич

Ведущая организация: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Защита диссертации состоится ^ 2012 г. в /часов

на заседании диссертационного совета Д 212.203.05 в ФГБОУ ВПО Российский университет дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 8.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГБОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, дом 6.

Автореферат размещен на сайте www.vak.ed.gov.ru

Автореферат разослан « /20/С. г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В изучении патогенеза аллергических заболеваний многие вопросы остаются открытыми. Однако тот факт, что в основе формирования заболеваний лежит комплекс генетических и иммунных факторов, является неоспоримым. В то время как детальному описанию иммунологических реакций уделено уже достаточно много внимания, вопросы генетической предрасположенности остаются малоизученными. Выявить конкретную причину, вызывающую развитие бронхиальной астмы (БА), атопического дерматита (АД), аллергического ринита (АР), зачастую не представляется возможным. Большинство авторов относят их к мультифакториальным заболеваниям (МФЗ). В изучении генетической природы МФЗ в настоящее время все большее значение приобретает выявление в различных популяциях специфичных генов и средовых факторов, взаимодействие которых формирует устойчивость организма к изменяющимся условиям окружающей среды. В связи с этим наиболее интересными ДНК-маркерами для изучения токсико-генетической компоненты МФЗ являются полиморфные варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков. Данная группа генов относится к «кандидат-ным» ввиду их участия в метаболизме медиаторов воспаления, оксидативном стрессе, детоксикации химических соединений. На сегодняшний день метаболические механизмы участия ФБК в аллергических реакциях изучены недостаточно. Основные научные исследования ведутся для атопической БА, и полученные результаты весьма противоречивы. Причиной этому может служить этнический фактор, эволюционно сложившийся именно в данной популяционной группе. В Курской области уже были проведены исследования на взрослой выборке больных БА, полученные результаты однозначно указывали на влияние данной группы генов на реализацию заболевания. В связи с чем изучение полиморфизма генов детоксикации у детей той же популяции, представляется актуальной темой. Полученные результаты могут помочь понять первопричину возникновения атопии и помочь в превентивной диагностике, не допуская клинически развернутой картины заболевания.

Цель исследования: провести комплексный анализ вовлеченности полиморфных вариантов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в формирование предрасположенности к аллергическим заболеваниям (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит) у детей.

Задачи исследования:

1. Провести анализ ассоциации аллелей и генотипов полиморфных вариантов генов ФБК: 1462V гена CYPJA1, H139R гена ЕРНХ1, I105V гена GSTP1, +/del гена GSTT1, +/del гена GSTM1 с предрасположенностью к аллергическим заболеваниям у детей.

2. Изучить проявления полового диморфизма и возрастной манифестации в ассоциациях полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при аллергических заболеваниях у детей.

3. Исследовать взаимодействия между различными классами генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и дать оценку их комплексного влияния на риск возникновения заболеваний.

4. Изучить вклад средовых факторов на реализацию наследственной предрасположенности к аллергическим заболеваниям у детей в зависимости от носительства генотипов ФБК.

5. Разработать регрессионные статистические модели индивидуального прогнозирования риска развития бронхиальной астмы, аллергического ринита, атопического дерматита у детей с учетом полового диморфизма на основании исследованных молекулярно-генетических маркеров и средовых факторов.

Научная новизна. Впервые проведен комплексный молекулярногенетический анализ вовлеченности генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при различных нозологических формах детских аллергических заболеваний: бронхиальной астме, аллергическом рините-и атопическом дерматите. Установлены гены, полиморфные варианты которых ассоциировались с повышенным риском развития БА (GSTP1, GSTM1), а также АД (GSTP1, GSTT1). Выявлен выраженный половой диморфизм генотипов генов ФБК, ассоциировавшихся с предрасположенностью к Б А у мальчиков (del/del GSTI'l, del/del GSTM1, 105IV GSTP1), АД у мальчиков (del/del GSTTI) и у девочек (462IV CYP1A1), а также установлено модулирующее влияние на возраст манифеста рассмотренных заболеваний. Получены новые данные о взаимодействиях генотип-среда, формирующие предрасположенность к повышенному риску развития бронхиальной астмы у детей, подвергающихся фактору пассивного курения.

Практическая значимость работы. Полученные в ходе исследования данные о взаимосвязях генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков при аллергопатологии в детском возрасте рекомендуются к применению врачами-

аллергологами и врачами медико-генетических консультаций для прогнозирования, разработки индивидуальных лечебных мероприятий и предотвращения дальнейшего развития патологии.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Генетическими маркерами подверженности к бронхиальной астме у детей являются генотип 105IV гена GSTP1, del/del гена GSTMI и отсутствие дикого генотипа 105II гена GSTP1. Фактором генетической предрасположенности к атопическому дерматиту - мутантный генотип 105VV гена GSTP1, делецион-ный генотип ded/del гена GSTT1.

2. Для мальчиков повышенный риск развития бронхиальной астмы ассоциируется с генотипами: del/del гена GSTTJ, del/del гена GSTMI, 105IV гена GSTP1, а атопического дерматита с del/del гена GSTPl. Для девочек повышенный риск атопического дерматита ассоциирован с присутствием генотипа 462IV гена CYP1A1.

3. Для раннего развитие бронхиальной астмы характерно наличие генотипов: del/del гена GSTMI, del/del гена GSTT1, атопического дерматита, мутантного генотипа 105VV гена GSTP1. Позднее развитие БА ассоциировано с генотипом: 105IV гена GSTP1, АД с делеционным генотипом del/del гена GSTT1, для АР поздний возраст начала заболевания сочетается с отсутствием функционального генотипа 462II гена CYP1A1.

4. Предрасположенность к повышенному риску БА у детей определяется сочетанием средового фактора (табачный дым) и наличием определенных генотипов: 139RR гена ЕРНХ1, 105IV гена GSTP1.

5. Установленные комбинации генотипов определяют повышенный риск возникновения. Установленные межгенные различия были обусловлены накоплением среди больных главным образом вариантных генотипов обеих фаз биотрансформации.

Апробация работы. Материалы работы доложены и обсуждены на научных конференциях: Итоговой научной сессии КГМУ и отделения медикобиологических наук Центрально-Черноземного научного центра РАМН (Курск, 2008, 2009), Международной научной конференции молодых ученых медиков (Курск, 2008, 2009, 2010), 2-го Международного конгресса «Иммунитет и болезни» (Москва, 2007), Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» (Курск, 2008, 2009, 2010), Межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Молодежная наука и современ-

ность» (Курск, 2009, 2010). По материалам диссертации опубликовано 16 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых журналах, рекомендуемых ВАК Минобрнауки РФ для публикации результатов диссертационных исследований по медицинским наукам.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 16 работ в центральной и местной печати, в том числе в 3 изданиях, рекомендуемых ВАК для публикаций материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав результатов собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций, библиографического списка и приложений. Работа изложена на 92 страницах машинописного текста, содержит 29 таблиц. Библиографический список используемой литературы включает 198 источников, 101 из которых - зарубежный.

Личный вклад автора. Диссертационная работа представляет собой законченный, самостоятельно выполненный труд автора. Все представленные в диссертации результаты получены лично Дедковым А.А. на базе лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии ГБОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет» Минздрав-соцразвития РФ, им проанализированы отечественные и зарубежные источники по теме диссертации, получены и обобщены результаты исследования, проведены статистическая обработка и анализ полученных данных. В работах, выполненных в соавторстве, использованы результаты исследований с долей личного участия автора 75-95%.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал исследования. Материалом для исследования послужила выборка детей, постоянно проживающих на территории Курской области. Всего было рассмотрено 450 случаев аллергических заболеваний. Из них 150 детей страдали бронхиальной астмой, 150 - аллергическим ринитом, 150 атопическим дерматитом. Молекулярно-генетический анализ проводился на базе лаборатории медицинской генетики кафедры биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета. Клиниколабораторные исследования проводились на базе областной детской клинической больницы г. Курска.

Методы исследования. Молекулярно-генетический метод. Выделение геномной ДНК осуществляли из замороженной (-20°С) венозной крови стандартным двухэтапным методом фенолыю-хлороформной экстракции. Леикоцк-ты, осажденные дважды с PBS центрифугированием, лизировали в ТЕ-буфере протеиназой К в присутствии 0,4% додецилсульфата натрия. Клеточную суспензию инкубировали в течение ночи в термостате при температуре 42°С. Геномную ДНК экстрагировали из клеточного лизата в 3 этапа: сначала фенолом, насыщенным 10 мМ Трис-HCl (рН=8,0) (1:1), затеял фенолом и хлороформом (по одному объему фенола и хлороформа на два объема надосадочной жидкости) и последний раз хлороформом (1:1). ДНК преципитировали 96% этанолом, высушивали, растворяли в ТЕ-буфере, замораживали и хранили при -20°С. Амплификацию фрагментов ДНК методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) проводили в 12 мкл реакционной смеси, содержащей 0,5 мкл образца геномной ДНК. Смесь для амплификации включала: 67 мМ Трис-HCl рН=8,8, 16,6 мМ сульфата аммония, 6,7 мкМ ЭДТА, 2,0-7,0 мМ MgCl2, 1 мМ [З-меркаптоэтанола, 1 мМ каждого dNTPs (dATP, dCTP, dTTP и dGTP), 15 нМ каждого из праймеров и 1 е.а. Taq-полимеразы. Амплификацию проводили на многоканальном термоциклере «Терцик» (НПО «ДНК-Технология», Москва). Обработка продуктов ПЦР проводилась специфическими рестриктазами согласно протоколам, описанным производителями ферментов. После инкубации рестрикционной смеси проводили разделение фрагментов ДНК с помощью электрофореза. В зависимости от размера разделяемых фрагментов ДНК использовали агарозный гель различной концентрации 0,8-3,5%, приготовленный на основе ТВЕ буфера (0,089 М Трис-HCl, 2 мМ ЭДТА, 0,089 М борная кислота), а также 6-8% ПААГ (соотношение акриламид : метиленбисакриламид 29 : 1). После электрофореза окрашенные этидиумбромидом гели визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете на приборе компьютерной видеосъемки GDS-8000 ("UVP Inc", США) с помощью программного аналитического пакета LabWorks™ v4.5 (США). В рамках проводимого исследования изучали 5 полиморфизмов 5 генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков: CYP1A1 (1462V), ЕРНХ1

(H139R), GSTM1 (+/0), GSTT1 (+/0), GSTP1 (1105V).

Клинико-лабораторные методы. Первичная постановка диагноза осуществлялась на основе общеклинического обследования, проводимого квалифи-

цированными специалистами на базе областной детской клинической больницы Г, Курска.

Вся исследуемая выборка также подвергалась общеклиническому исследованию: общий анализ крови, общий анализ мочи, анализ кала на яйца гельминтов и соскоб со слизистой прямой кишки на энтеробиоз, ЭКГ.

Комплекс клинико-лабораторных методов диагностики: постановка кожных скарификационных проб с набором неинфекционных аллергенов (бытовых, клещевых, пищевых, пыльцевых) у детей старше 2 лет. Общий уровень IgE определяли с помощью иммуноферментного анализа.

Для больных БА в возрасте старше 6 лет проводилось исследование функции внешнего дыхания и пикфлоумерия. Отдельно у больных АР проводилась риноцитоскопия для выявления тканевой эозинофилии.

Данный комплекс методов позволил выявить не только признаки наличия аллергопатологии, но и полностью дифференцировать диагноз.

Генетико-статистические методы. Статистический анализ полученных данных проводился на ПК с использованием пакета прикладных программ Sta-tistica 6.0 фирмы StatSoft Inc. (США) и MS Excel (Реброва О.Ю., 2006). Для оценки соответствия распределений генотипов ожидаемым значениям при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ) в выборке и сравнении с частотами аллелей и генотипов разных групп проводили с помощью критерия у~ Пирсона, при условии, когда объем выборки не превышал 10 случаев, использовали критерий у2 с поправкой Иетса. Ожидаемую гетерозиготность рассчитывали по Nei. Об ассоциации аллелей или генотипов с предрасположенностью к заболеваниям судили по величине отношения шансов (OR) - показателю, отражающему, во сколько раз вероятность оказаться в группе «случай» (больные) отличается от вероятности оказаться в группе «контроль» (здоровые) для носителя изучаемого генотипа. Меясгепные взаимодействия изучали методом сопоставления частот парных сочетаний генотипов в группах больных и здоровых с расчетом критерия X2 и OR. Анализ взаимодействий генотип-среда проводился методом сопоставления величин отношения шансов (OR), рассчитанных для индивидуальных генотипов в группах, сформированных по критерию наличия (ORf+) или отсутствия (ORf.) средового фактора риска. Метод логистической регрессии использовался для оценки влияния полиморфных генов ФБК на риск развития аллер-

гической патологии, ее клинические симптомы и особенности течения и развитие осложнений.

Результаты и обсуждение собственных исследований

1. Сравнительный анализ распределения аллелей и генотипов ФБК в детерминации аллергических заболеваний (БА, АР, АД) у детей

При анализе частот аллелей полиморфных вариантов генов контрольной группы с тремя нозологическими формами аллергических заболеваний, была выявлена ассоциация вариантного аллеля 105 Val гена GSTP1 с предрасположенностью к БА (OR=l,57 95%С1 1,11-2,22, р=0,01) и АР (C>R=0,65 95%С1 0,44-0,95, р=0,03). Распределение частот генотипов исследуемых полиморфизмов и их соответствие популяционному равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) проводилось раздельно в трех группах больных аллергическими заболеваниями и группе здоровых детей. Распределение генотипов в группе больных БА соответствовало ожидаемому при равновесии РХВ (р>0,05). С повышенным риском БА ассоциировалось наличие гетерозиготного генотипа 105IV гена GSTP7(OR~l,69 95%С1

1.06-2,70, р=0,03), делеционного полиморфизма del/del GSTM1 (OR=l,72 95%CI

1.07-2,75, р=0,02) а также отсутствие дикого, гомозиготного генотипа 10511 гена GSTP1 (OR=l,91 95%С1 1,21-3,02, р=0,01), полиморфизма + GSTM1 (OR=l,72 95%С1 1,07-2,75, р=0,02). Мутантный генотип 139RR гена ЕРНХ1 был несколько повышен у больных бронхиальной астмой, но не достигал статистически значимых различий (р=0,08).

В группе больных АР распределение генотипов соответствовало ожидаемому при равновесии РХВ (р>0,05). У детей, больных АР, наблюдалась тенденция в ассоциации дикого генотипа 46211 гена CYP1A1 с предрасположенностью к заболеванию, которая не достигала статистически значимой разницы (OR=1,80 95%С1 0,94-3,44, р=0,08). Для большинства полиморфизмов в группе больных АД, распределение генотипов находилось в соответствии с РХВ (р>0,05). Однако для полиморфизма 105IV гена GSTP1 отмечалось отклонение от РХВ (р=0,001), обусловленное повышением уровня фактической гетерозиготно-сти (Но=0,313, Не-0,442, ^=12,7, р<0,05). С повышенным риском развития АД у детей ассоциировались: наличие мутантного генотипа 105VV гена GSTP 1 (OR=2,04 95%С1 1,02-4,08, р=0,04), делеционного полиморфизма del/del GSTT1 (OR=2,04 95%CI 1,16-3,59, р=0,01). Кроме того, наблюдалась тенденция в увеличении частоты нефункциональных генотипов del/del GSTM1 (OR=l,58 95%CI

0,99-2,53, р=0,06) и снижение нормальных генотипов + 08ТМ1 (СЖ=1,58 95%С1 0,99-2,53, р=0,06) в группе больных АД, однако различия в частоте данных генотипов не достигали статистической значимости.

2. Изучение роли половозрастных особенностей в ассоциациях полиморфизма генов ФБК при аллергических заболеваниях у детей

Учитывая известные данные что, фенотипические эффекты кандидатных генов при мультифакториальных заболеваниях проявляют половые различия по распространенности в популяции, представлялось актуальным провести анализ полиморфных вариантов генов ФБК с предрасположенностью к рассматриваемым аллергическим заболеваниям раздельно для мальчиков и девочек.

Как видно из представленных в таблице 1 результатов, наличие гетерозиготного полиморфизма 4621У гена СУР1А1 (ОК-4,43 95%С1 0,95-20,59, р=0,04) и отсутствие гомозиготного генотипа дикого типа 46211 гена СУР1А1 (СЖ=4,43 95%С1 0,95-20,59, р=0,04) ассоциировалось с риском развития АД и АР ((Ж=5,63 95%С1 1,16-27,22, р=0,02) только у девочек.

Таблица 1

Проявления полового диморфизма в ассоциациях генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с предрасположенностью к аллергическим заболеваниям

Г енотииы Отношения шансов, OR (р<0,05)

Бронхиальная астма Атопический дерматит Аллергический ринит

М Д М Д М Д

46211 CYP1A1 4,43 - 5,63

4621V CYP1A1 - - 4,43 - .

GSTM1 del/del 2,10 - - - _

GSTM1+ 2,10 - - _ _

GSTT1 del/del 2,34 - 3,87 - - _

GSTT1+ 2,34 - 3,87 - - .

105И GSTP1 2,05 - - - -

105IV GSTP1 1,85 - - - - .

M - мальчики, Д - девочки

Наличие функционально неполноценного генотипа del/del GSTT1 ассоциировалось с повышенным риском развития БА (OR=2,34 95%С1 1,10-4,96, р=0,02) и АД (OR=3,87 95%С1 1,78-8,42, р=0,001) только у мальчиков. Также отсутствие нормального полиморфизма + GSTT1 ассоциировалось с предрасположенностью к БА (OR=2,34 95%С1 1,10-4,96, р=0,02) и АД (OR=3,87 95%С1 1,78-8,42, р=0,001) только у мальчиков. Отсутствие функционального генотипа

+ GSTM1 (OR=2,10 95%CI 1,20-3,66, p=0,01) и наличие делеционного полиморфизма del/del GSTM1 (OR=2,10 95%CI 1,20-3,66, p=0,01) ассоциировалось с повышенным риском развития БА у мальчиков. Кроме того, наличие гетерозиготного генотипа 105IV гена GSTPI (OR=l,85 95%С1 1,06-3,22, р=0,03) и отсутствие дикого гомозиготного генотипа 105II гена GSTPI (OR=2,05 95%С1 1,18-3,56, р=0,01) ассоциировались с повышенным риском развития БА у мальчиков.

Неблагоприятные генетические комбинации в сочетании с ухудшающимися условиями окружающей среды могут служить причиной раннего развития заболевания. Для проведения исследования нами были определены возрастные разделения детей по возрасту манифестации исследуемых заболеваний (табл. 2).

Таблица 2

Проявления возрастных различий в ассоциациях генотипов генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с предрасположенностью к аллергическим заболеваниям

Отношения шансов, OR (p<0,05)

Г енотипы Бронхиальная астма Атопический Аллергический

дерматит ринит

До 6 лет Старше 6 лет До 3 лет Старше 3 лет До 6 лет Старше 6 лет

462II CYP1A1 - - - - - 2,21

GSTM1 del/del 1,96 - - - - -

OSTM1+. 1,96 - - - - -

GSTT1 del/del 1,85 - - 2,79 -

GSTT1+ 1,85 ' - - 2,79 -

105II GSTPI - 2,16 - - - -

1051V GSTPI - 2,03 - - - -

105W GSTPI - - 2,4 - - -

Средний возраст манифеста БА составил 5,6±2,9 года. Учитывая эти данные, мы выбрали 6-летний возраст для разделения больных БА на две группы, с ранним возрастом (до 6 лет) и поздним (старше 6 лет) манифестом. У детей с АД был выбран возраст 3 лет как пограничный. У детей с АР возраст 6 лет. В таблице 2 представлены суммированные результаты статистически значимых

ассоциаций генотипов ФБК с предрасположенностью к изучаемым аллергическим заболеваниям у детей.

Установлено, что наличие делеционного полиморфизма del/del GSTMI (OR=l,93 95%CI 0,93-4,01, р=0,01), как и отсутствие функционального генотипа + GSTMI (OR=2,10 95%С1 1,10-4,01, р=0,02) ассоциировались с риском раннего развития астмы. Аналогичные отсутствие генотипа + GSTT1 (OR=l,85 95%С1 0,98-3,47, р=0,05) и наличие функционально неполноценного генотипа del/del GSTT1 (OR=l,85 95%CI 0,98-3,47, р=0,05) ассоциировались с риском раннего развития БА. У детей с поздним развитием бронхиальной астмы повышенный риск развития заболевания ассоциировался с отсутствием нормального генотипа 105II гена GSTP1 (OR=2,16 95%С1 1,14-4,10, р=0,02) и носительством гетерозиготного полиморфизма 105IV гена GSTP1 (OR=2,03 95%С1 1,08-3,81, р=0,03). В группе детей с ранней манифестацией атопического дерматита мутантный полиморфизм 105VV гена GSTP1 повышал риск развития заболевания более чем в 2 раза (OR=2,40 95%С1 1,15-5,01, р=0,02). Отсутствие генотипа + GSTT1 (OR=2,79 95%С1 1,34-5,80, р=0,01) и наличие генотипа del/del GSTT1 (OR=2,79 95%CI 1,34-5,80, р=0,01) ассоциировались с повышенным риском позднего развития атопического дерматита. Отсутствие генотипа 462II CYP1A1 (OR=2,21 95%CI 1,03—4,75, р=0,02) ассоциировалось с повышенным риском позднего развития аллергического ринита у детей. .

3. Оценка связи комбинаций генотипов и роль взаимодействий генотип-среда в формировании предрасположенности к аллергическим заболеваниям у детей

Основные различия между группами здоровых и больных БА мальчиков определялись сочетаниями всех 5 изучаемых генных локусов, парные комбинации которых формировали 12 ассоциаций с подверженностью к заболеванию. Так, 6 комбинаций генотипов определяли повышенный риск возникновения БА у мальчиков: GSTT1 del х GSTMI del (OR=3,80), GSTT1 del x GST PI 105IV (OR=3,50), GSm del x CYPlAl 462II (OR=2,83), GSTMI del x CYP1A1 46211 (OR=l,88), GSTMI del xEPHXl 139HR (OR=2,87), GSTP1 105IV xCYPlAl 46211 (OR=l,98). В то же время сочетания генотипов GSTMl+x GSTT1+ (OR=0,42), GSTT1 + xGSTPl 105II (OR=0,46), GSTT1 + x CYPlAl 462II (OR-0,47), GSTT1 + xEPHX1 139HH (OR=0,5), GSTMI + xGSTPl 105И (OR=0,29), GSTP1 105II x CYPlAl 462II (OR=Q,46) обладали протективными свойствами в отношении

риска развития БА у мальчиков. В группе девочек, больных БА, статистически значимых комбинаций не установлено.

У мальчиков ассоциации парных комбинаций генотипов с АР формировались посредством взаимодействия следующих 4 локусов: +/del GSTT1, +/del GSTM1, 1105V GSTP1, I462V CYP1A1. Так, 2 комбинации генотипов определяли повышенный риск возникновения АР у мальчиков: GSTT1 del х GSTP1 10511 (OR=3,41), GSTM1 del xGSTPl 105II (OR=2,85). Пониженный риск развития АР у мальчиков определяло лишь одно межгенное сочетание: GSTP1 105IV х CYP1A1 462II (OR=0,51). У девочек обнаружена ассоциация с предрасположенностью к АР по одной межгенной комбинации: GSTM1 del х ЕРНХ1 139НН (OR=3,48).

У мальчиков наследственная компонента предрасположенности к АД формировалась взаимодействием 5 локусов. Наиболее патогенетически важными межгенными взаимодействиями, определяющими предрасположенность к АД, а также существенно повышающими риск развития АД у мальчиков были следующие комбинации генотипов: GSTT1 del xGSTMl + (OR=2,96), GSTT1 del x GSTPJ 10511 (OR=3,78), GSTTl del x CYP1A1 46211 (OR=4,17), GSTT1 del x EPHX1 139HH (OR=3,53), GSTM1 del xGSTPI 10511 (OR=2,96), GYP1AI 462IV x EPHX1 139HR (OR=4,72). Протективными в отношении риска развития АД у мальчиков были парные межгенные сочетания генотипов: GSTTI + х GSTM1 + (OR=0,41), GSTT1 + х GSTP1 105IV (СЖ=0,41), GSTTl + х CYP1A1 462II (OR=0,42), GSTTl + x EPHXl 139HH (OR=0,38), GSTM1 + x GSTP1 105II (OR=0,50). У девочек обнаружены ассоциации 4 межгенных сочетаний генотипов с АД, образованные взаимодействием 4 генных локусов: +/del GSTM1, I105V GSTP1, H139R EPHXl, CYP1A1 I462V, эти парные сочетания, которые снижали риск развития АД, в целом совпадали с таковыми у мальчиков: GSTM1 4- х GSTPJ 105II (011=0,42), GSTM1 + xCYPlAl 462II (OR=0,44), CYP1A1 46211 х EPHXl 139HR (OR=0,43). И лишь одна комбинация ассоциировалась с повышенным риском АД у девочек: GSTM1 del хEPHXl 139НН (OR=4,69).

4. Влияние пассивного курения на предрасположенность к изучаемым аллергическим заболеваниям

Типичным примером генно-средового взаимодействия, лежащего в осно- ■ ве любого мультифакториального заболевания, является фактор пассивного курения. В таблице 3 суммированы статистически ассоциации полиморфных вариантов генов ФБК с риском развития БА, АР, АД в зависимости от фактора курения. В группе детей, больных БА, имеющих контакт с табачным дымом, мутантный генотип 1391*11 гена ЕРНХ1, был ассоциирован более чем с 9-кратным увеличением риска развития астмы (СЖ=9,09 95%С1 1,13-72,84, р-0,03). Кроме того, в этой же группе выявлена ассоциация гетерозиготного генотипа 1051У гена ОБТР! с повышенным риском развития БА (<Ж=2,10 95%С1 1,10-4,01, р=0,02).

У детей, не имеющих контакта с табачным дымом, значимых ассоциаций ни по одному полиморфизму не установлено.

Таблица 3

Влияние табачного дыма на риск развития аллергических заболеваний у детей с различными генотипами

Генотипы Отношения шансов, ОИ (р<0,05)

Бронхиальная астма Атопический дерматит Аллергический ринит

НК ПК НК ПК НК ПК

ЕРНХ1 139Ш1 0,68 9,09* 0,97 3,29 0,99 0,81

05ТР1 105IV 1,28 2,10* 0,76 0,95 0,87 0,61

НК не подвержены курению, ПК — подвержены курению

5. Прогнозирование риска развития БА, АР, АД на основании анализа данных генотипирования полиморфизмов генов ФБК и средовых факторов

С целью внедрения результатов исследования в практическую работу детских аллергологов и врачей медико-генетических консультаций для превентивной диагностики, нами были разработаны критерии прогнозирования риска возникновения БА, АД, АР с учетом полового диморфизма. Изучение влияния генотипов полиморфных вариантов генов и средовых факторов на риск развития аллергических заболеваний у детей проводили посредством логистического регрессионного анализа, который позволяет строить статистическую модель

прогнозирования вероятности наступления события по имеющимся прогностически ценным признакам (в нашем исследовании это полиморфные варианты генов ферментов детоксикации ксенобиотиков передовые факторы).

Результатом логистического регрессионного анализа является расчет оценок регрессионных коэффициентов Ь0, Ьь Ь2 ... bi уравнения:

y=bo+b|X|+b2X2+...+biXi, •

где Xi...Xi-независимые признаки (прогностически ценные).

Значение у в уравнении регрессии — это натуральный логарифм отношения шансов для изучаемого события. Вероятность этого события для каждого конкретного объекта исследования может быть вычислена по формуле:

Р=еу/(1+еу),

где е - математическая константа, равная 2,72.

Наиболее прогностически ценной моделью в отношении риска развития БА у мальчиков была модель, включающая следующие предикторы: 2 полиморфизма генов ФБК - +/del GSTT1, +/del GSTU1, реакция на прививки, психоэмоциональная обстановка в семье до развития болезни

Пациент А. Генотип + GSTT1, генотип + GSTM1, психоэмоциональная обстановка в семье до развития болезни удовлетворительная, реакции на прививки не было.

Y = 4,35 + (-1,847 х 1) + (-1,963 х 1)+ (-2,088 х 2) + 1,581 х 1 = - 2,055 Р = 2,72'2,055/(1+2,72'2'055) = 0,1 1

Пациент Б. Генотип del/del GSTT1, генотип del/del GSTM1, психоэмоциональная обстановка в семье до развития болезни удовлетворительная, реакций на введение прививки в виде гиперемии.

Для пациента Б.:

Y = 4,35 + (-1,847 х 0) +(-1,963 х 0) +(-2,088 х 2)+ 1,581 х 2 = 3,336 Р = 2,723,336/(1+2,723’336) = 0,96

Таким образом, у пациента А. вероятность возникновения БА составляет 11%, а у пациента Б. - 96%,

Среди всех оцененных моделей в отношении риска возникновения АД у мальчиков наиболее прогностически ценной была следующая модель: генотип +/del GSTT1, фактор грудного вскармливания, частота ОРЗ.

Пациент Е. Генотип + GSTT, находился на грудном вскармливании, частота ОРЗ до 2 раз в год.

Y = 4,552 + (-1,004 х 1) + (-1,523 х 2) + (-1,15 х 2) = -1,792

Р = 2,72'1,792/(1+2,72'1,792) = 0,14

Пациент Н. Генотип del/del GSTT1, находился на искусственном вскармливании, частота ОРЗ 3-4 раза в год.

Y = 4,552 + (-1,004 х 0) + (-1,523 х 0) + (-1,15 х 3) = 1,102 P = 2,72U02/(1+2,72U02) = 0,75

Вероятность развития АД у пациента Е. - 14%, а у пациента Н. составляет

75%.

В отношении риска возникновения АД у девочек наиболее значимая модель включала следующие предикторы: генотип 1462V CYP1A1, фактор грудного вскармливания, частота ОРЗ.

Пациент И. Генотип 462II CYPIA1, находилась на грудном вскармливании, частота ОРЗ до 2 раз в год.

Y = 5,065 + (-1,21 х 1) + (-0,286 х 2) + (-2,079 х 2) = -0,875 Р = 2,72"0,875/( 1 +2,72‘0,875) = 0,29

Пациент Г. Генотип 462IV CYP1A1, находилась на искусственном вскармливании, частота ОРЗ до 2 раз в год.

Y = 5,065 + (-1,21 х 0) + (-0,286 х 0) + (-2,079 х 2) = 0,907 Р = 2,720,907/(1 +2,720'907) = 0,72

Таким образом, у пациента И. вероятность возникновения АД составляет

- 29%, а у пациента Г. - 72%.

Наиболее значимая модель риска развития АР у девочек включала следующие предикторы: генотип I462V CYP1A1, фактор грудного вскармливания, частота ОРЗ, наличие вредностей на работе у матери.

Пациент Ж. Генотип 462II CYP1A1, находилась на грудном вскармливании, частота ОРЗ до 2 раз в год, на работе матери не имелось вредностей.

Y = 3,773 + (-2,197 х 1) + (-1,807х 2) + (-1,073 х 2) + 1,936 х 1 = -2,248 Р = 2,72'2,248/( 1 +2,72‘2,24 s) = 0,09

Пациент В. Генотип 462IV CYP1A1, находилась на грудном вскармливании, частота ОРЗ до 2 раз в год, имелись вредности на работе матери.

Y = 3,773 + (-2,197 х 0) + (-1,807х 2) + (-1,073 х 2) + 1,936 х 2 = 1,885 Р = 2,721,ш/(1+2,721,885) = 0,86

Вероятность развития АД у пациента Ж. составляет - 9%, а у пациента В.

- 86%.

Разработанные нами модели рекомендуется использовать для формирования групп риска развития аллергических заболеваний у детей с учетом поло-

кого диморфизма, а также для верификации диагноза и проведения лечебнопрофилактических мероприятий по предупреждению их развития.

ВЫВОДЫ

1. Установлены статистически значимые ассоциации генотипов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с риском развития бронхиальной астмы -генотипы 105IV GSTP1, del/del GSTM1 и отсутствие I05II GSTP1 а также атопического дерматита - генотипы 105VV GSTP1, del/del GSTTI.

2. В ассоциациях генотипов ферментов биотрансформации ксенобиотиков с изучаемыми аллергическими заболеваниями наблюдался выраженный половой диморфизм: для мальчиков повышенный риск развития бронхиальной астмы ассоциировался с генотипами del/del GSTTI, del/del GSTM1, 105IV GSTP1. Риск развития атопического дерматита для мальчиков - с полиморфизмом del/del GSTTI. Повышенный риск атопического дерматита для девочек с присутствием генотипа 462IV CYP1A1.

3. Генотипы ферментов биотрансформации ксенобиотиков оказывали модулирующее влияние на возраст манифеста рассмотренных заболеваний. На раннее развитие бронхиальной астмы оказывали влияние генотипы: del/del GSTM1, del/del GSTTI, на позднее 105IV GSTPI. Для раннего развития атопического дерматита был характерен генотип 105VV GSTPJ, для позднего - del/del GSTTI. Для аллергического ринита поздний возраст начала заболевания сочетался с отсутствием функционального генотипа 462II CYP1A1.

4. Выявлены статистически значимые взаимодействия генотип-среда, формирующие предрасположенность к повышенному риску развития бронхиальной астмы у детей, подвергающихся фактору пассивного курения, потенцирующиеся влиянием генотипов 139RR ЕРНХ1, 105IV GSTP1.

5. Анализ частот парных взаимодействий генотипов ФБК выявил статистически значимые различия в их распределении между группами больных и здоровых детей. Установленные межгенные различия были обусловлены накоплением среди больных, главным образом, вариантных генотипов обеих фаз биотрансформации.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать для внедрения в практику медико-генетического консультирования тестирование полиморфизма генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков в качестве превентивной диагностики бронхиальной астмы, атопического дерматита, аллергического ринита.

2. При консультировании детей для оценки вероятности развития бронхиальной астмы, атопического дерматита, аллергического ринита рекомендуется использовать приемы математического прогнозирования с учетом комплекса диагностически ценных признаков, разделенных по полу, установленных в ходе логистического регрессионного анализа.

3. Рекомендовать введение в практику лабораторной диагностики аллергических заболеваний (бронхиальной астмы, аллергического ринита и атопического дерматита) и тестирования полиморфизмов генов ФБК с последующим их использованием в вопросах прогнозирования и разработки индивидуальных лечебных мероприятий для предупреждения дальнейшего развития заболеваний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Дедков А.А. Связь генетических и иммунологических факторов в формировании атопического дерматита у детей / А.Д. Богомазов, Н.Г. Булатникова // Иммунитет и болезни: материалы 2-го Междунар. конгр. — М., 2007. — С. 73.

2. Дедков, А.А. Некоторые генетические аспекты бронхиальной астмы у детей / А.Д. Богомазов, Н.Г. Булатникова // Иммунитет и болезни: материалы 2-го Междунар. конгр. - М., 2007. - С. 73.

3. Дедков, А.А. Иммунологические факторы развития аллергического ринита у детей / А.Д. Богомазов, Н.Г. Булатникова // Иммунитет и болезни: материалы 2-го Междунар. конгр. - М., 2007. - С. 74.

4. Дедков, А.А. Генетические и иммунологические механизмы в развитии бронхиальной астмы у детей / Н.Г. Дедкова, А.Д. Богомазов, И.Ю. Расторгуев // Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов: материалы 73-й межвуз. науч. конф. студентов и молодых ученых (15-16 апр. 2008 г.): в 2 ч. - Курск: Изд-во КГМУ, 2007. - Ч. I. - С. 296.

5. Дедков, А.А. Анализ заболеваемости детей бронхиальной астмой на территории Курской области / Н.Г. Дедкова, А.Д. Богомазов, И.Ю. Расторгуев //

Молодежная наука: от фундаментальной идеи до инновационных проектов: материалы 73-й межвуз. науч. конф. студентов и молодых ученых (15-16 апр. 2008 г.): в 2 ч. - Курск: Изд-во КГМУ, 2007 - Ч. I. - С. 297-298.

6. Дедков, А.А. Анализ заболеваемости аллергическим ринитом у детей Курской области / Н.Г. Дедкова, А.Д. Богомазов // Материалы Первой Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» / КГМУ. - Курск, 2008. - С. 86-87.

7. Дедков, А.А. Генетические аспекты наследования бронхиальной астмы / Н.Г. Дедкова, А.Д. Богомазов // Материалы Первой Международной дистанционной научной конференции «Инновации в медицине» / КГМУ. - Курск, 2008.-С. 88-89.

8. Дедков, А.А. Влияние наследственности на уровень заболеваемости детей атопическим дерматитом на территории Курской области / А.Д. Богомазов, В .П. Иванов, В.А. Афанасьев // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сессии Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН: в 3 т. - Курск: Изд-во КГМУ, 2008 - Ч. I. - С. 384-386.

9. Дедков, А.А. Изучение некоторых генетических аспектов и структуры заболеваемости бронхиальной астмы у детей на территории Курской области / А.Д. Богомазов, В.П. Иванов, В.А. Афанасьев // Университетская наука: теория, практика, инновации: сб. тр. 73-й науч. конф. КГМУ и сессии Центр.-Чернозем. науч. центра РАМН: в 3 т. — Курск: КГМУ, 2008 — Ч. I. — С. 386-389.

10. Дедков, А.А. Наследственная предрасположенность в реализации бронхиальной астмы / Н.Г. Дедкова, М.С. Соболев // Молодежная наука и современность: материалы 74-й межвуз. итог. науч. конф. студентов и молодых ученых, посвященная Году молодежи в России (21-22 апр. 2009 г.). в 3 ч. - Курск: Изд-

во КГМУ, 2009. - Ч. 2. - С. 23-24.

11. Дедков, А.А. Изучение структуры заболеваемости бронхиальной астмой детей на территории Курской области / Н.Г. Дедкова, М.С. Соболев,

А.Н. Каплин // Молодежная наука и современность: материалы 74-й межвуз. итог. науч. конф. студентов и молодых ученых, посвященная Году молодежи в России (21-22 апр. 2009 г.). в 3 ч. - Курск: Изд-во КГМУ, 2009. - Ч. 2. -

С. 25-26. -

12. Дедков, А.А. Задействованность иммунологических и генетических факторов в развитии бронхиальной астмы у детей на территории Курской области / А.А. Дедков, И.Г. Хмелевская // Материалы IV Международной научной

конференции молодых ученых-медиков (25-26 фев. 2010 г.): в 3 т. / под ред.

В.А. Лазаренко. - Курск: Изд-во КГМУ, 2010. - Т. 1. - С. 325-327.

13. Дедков, А.А. Изучение структуры заболеваемости детей атопическим дерматитом на территории Курской области / А.А. Дедков, Хмелевская И.Г. // Материалы IV Международной научной конференции молодых ученых медиков (25-26 фев. 2010 г.) : в 3 т. / под ред. В.А. Лазаренко. - Курск: Изд-во КГМУ, 2010. - Т. 1. - С. 327-330.

14. Исследование связи полиморфизма 11е105Уа1 гена СвТП с развитием атопической бронхиальной астмы у детей в Курской области / А.А. Дедков, А.Д. Богомазов, В.П. Иванов и др. // Курский науч.-практ. вести. «Человек и его здоровье». - 2011. - № 1. - С. 31-36.

15. Дедков, А.А. Анализ полиморфизма гена глутатион-8-трансферазы (11е105Уа1) С8ТР1 при атопическом дерматите у детей / А.А. Дедков, А.Д. Богомазов // Врач-аспирант. - 2011. - № 1.3(44). - С. 418-424.

16. Анализ ассоциаций полиморфизма гена микросомальной эпоксид-гидролазы (Шв139А^) с риском развития бронхиальной астмы у детей в Курской области / А.А. Дедков, А.Д. Богомазов, В.П. Иванов и др. // Естественные и технические науки. - 2011. - № 2(52). - С. 111-117.

Дедков Андрей Анатольевич

Структурный полиморфизм кандидатных генов при аллергических заболеваниях (бронхиальная астма, аллергический ринит, атопический дерматит) у детей

В работе представлены результаты исследования, отражающие вовлеченность генов ферментов биотрансформадии ксенобиотиков в формирование аллергических заболеваний у детей. Установлен выраженный половой диморфизм и модулирующее влияние на возраст манифеста наиболее распространенных атопических заболеваний: бронхиальной астмы, аллергического ринита и атопического дерматита. Разработаны критерии раннего прогнозирования риска возникновения изучаемых заболеваний. Результаты исследования рекомендуются к использованию в научных исследованиях, а также в практической медицине.

Dedkov Andrey Anatolyevich The structural polymorphism of the candidate genes in children with the allergic diseases (bronchial asthma, allergic rhinitis and atopic dermatitis)

The results of this work represent the role of the xenobiotics biotransformation enzymes genes in the developing of the allergic diseases in children. It has been found pronounced sexual dimorphism and modulating influence on the onset of manifestation of the most widespread atopic diseases: bronchial asthma, allergic rhinitis and atopic dermatitis. The prognostic criterias were elaborated to predict the risk of developing of these diseases. The results of this investigation are recommended to application in the scientific researches and practical medicine.

Лицензия ЛР № 020862 от 30.04.99 г.

Сдано в набор 10.01.2012 г. Подписано в печать 12.01.2012 г. Формат 30x42Vg Бумага офсетная. Гарнитура Times New Rom. Печать офсетная. Уел. неч. л. 1,0.

Тираж 100 экз. Заказ №. 177"А".

Издательство Курского государственного медицинского университета 305041, г. Курск, ул. К. Маркса, 3.