Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональные исследования белка рековерина

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Щульга-Морской, Сергей Владиславович, Пущино

. пи ~ У / ЦА'-Г - 2.

' ^ Л,- .- и / /

/

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМЕНИ М.М. ШЕМЯКИНА И

Ю.А. ОВЧИННИКОВА РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

На правах рукописи

ШУЛЬГА-МОРСКОЙ СЕРГЕЙ ВЛАДИСЛАВОВИЧ

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ БЕЖА

РЕКОВЕРИНА

03.00.04. - Биохимия

диссертация на соискание ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: с.н.с., к.х.н. Заргаров A.A.

Пущино 1998

1 СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ....................................4

2 ВВЕДЕНИЕ..........................................................................................................5

3 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ......................................................................................7

3.1 Молекулярные механизмы передачи сигнала в

фоторецепторной клетке..................................................................10

3.1.1 Родопсин...................................................................................10

3.1.2Трансдуцин................................................................................15

3.1.3 сОМР-фосфодиэстераза........................................................17

3.1.4сОМР-зависимый катионный канал......................................19

3.2 Механизмы выключения сигнала в фоторецепторной клетке и восстановление темнового состояния........................21

3.2.1 Выключение родопсина...........................................................21

3.2.2 Выключение трансдуцина и фосфодиэстеразы..................24

3.2.3 Светозависимое изменение [Ca2+]fв фоторецепторной клетке................................................................................................26

3.2.4 Гуанилатциклаза.....................................................................27

3.3 Са2+-связывающие белки НСП, принимающие участие в фототрансдукции..............................................................................29

3.3.1 Общая характеристика Са2+-связывающих белков, содержащих структуру типа "ЕР-Ъапй".....................................29

3.3.2 Общая характеристика калъмодулина.................................34

3.3.3 Активатор гуанилатциклазы 1.............................................39

3.3.4 Активатор гуанилатциклазы 2.............................................40

3.3.5 Рековерин..................................................................................42

4 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ..............................................................49

4.1 Материалы..................................................................................49

4.2 Методы........................................................................................50

4.2.1 Работа с ДНК и генноинженерные манипуляции...............50

4.2.2 Выделение мутантных рекомбинантных рековеринов.......62

4.2.3 Определение степени миристоилироеания рекомбинантных

рековеринов.......................................................................................64

4.2.4Кальциевый блот.....................................................................64

4.2.5Изучение связывания кальция рековерином и его

мутантами флуоресцентным методом.......................................65

4.2.6 Определение протеолитической активности делеционньгх

мутантов рековерина......................................................................66

4.2.7Выделение наружных сегментов палочек сетчатки (НСП)

66

4.2.8Получение сетчаточного рековерина...................................67

4.2.9Получение родопсинкиназы и отмытых мочевиной мембран НСП68

4.2.10 Получение родопсинкиназы с использованием рековериновой колонки....................................................................70

4.2.11 Фосфорилирование родопсина в суспензии НСП..............70

4.2.12 Определение активности родопсинкиназы в реконструированной системе, содержащей отмытые мочевиной мембраны НСП и очищенную родопсинкиназу..........71

4.2.13 Аналитические процедуры...................................................72

5 РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................................................................74

5.1 Получение миристоилиров анной и

немиристоилированной форм рекомбинантного рековерина и сравнение их функциональной активности с сетчаточным рековерином........................................................................................74

5.2 Получение, выделение и структурно-функциональные свойства делеционных мутантов рековерина............................82

5.2.1 Протеолитические свойства мутанта рековерина р2бА29. 91

5.3 Получение, выделение и структурно-фуьжциональные

свойства точечных мутантов рековерина...................................98

5.3.1 Выделение мутантных форм рековерина...........................101

5.3.2 Проверка способности мутантных форм рековерина связывать Са2+...............................................................................104

5.3.3 Исследования вторичной структуры точечных мутантов рековерина в зависимости от концентрации кальция..............116

6 ВЫВОДЫ..........................................................................................................118

7 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.............................................................................119

1 Список использованных сокращений.

НСП - наружные сегменты палочки ТМС - трансмембранные столбы

ПААГ - ДсЫа - полиакриламидный гель с додецилсульфатом натрия

[Ca2+]f - концентрация свободного Са2+

АТ - антитела

ДТТ - дитиотреит

ПКА - протеинкиназа А

ПКС - протеинкиназа С

Та, Тр, Ту - а-, Р-, у- субъединицы трансдуцина, соответственно ФДЭ - фосфодиэстераза циклического 3',5'-гуанозинмоно-фосфата ФДЭа, ФДЭР и ФДЭу - а-, Р-, у-субъединицы фосфодиэстеразы, соответственно

цГМФ - циклический 3', 5'-гуанозинмонофосфат

ЭГТА - бис-(2-аминоэтиловый) эфир этиленгликоль-^К,К,1Ч'-

тетрауксусной кислоты

IgG - иммуноглобулины G

Mw - молекулярная масса

Rho - "темновой" родопсин

Rho* - фотовозбужденный родопсин

Rho-P - фосфорилированный "темновой" родопсин

Rho*-P - фосфорилированный светоактивированный родопсин

TEMED - 1Ч,М,ТчГ,1чР-тетраметилэтилендиамин

2 Введение

Наиболее распространенными мессенджерами в клетках являются ионы Са2+ и процессы фосфорилирования/ дефосфорилирования белков, которые используются для передачи и регуляции самых разнообразных внешних и внутриклеточных сигналов, управляющих такими основными биологическими функциями, как клеточное деление и дифференцировка, иммунитет, транспорт и гормональная регуляция. Поскольку наиболее высокое содержание сигнальных белков обнаружено в фоторецепторных клетках, то зрительный пигмент родопсин, принадлежащий к семейству сопряженных с О-белками мембранных рецепторов, и зрительный каскад родопсин - трансдуцин - сОМР-фосфодиэстераза послужили моделями для огромного числа работ по системам рецептор - О-белок - эффекторный белок, функционирующим в клетках других типов.

Действие Са2+ на системы клеточной сигнализации зачастую опосредовано Са2+-связывающими белками, мишенями для которых

/•у

очень часто служат протеинкиназы и протеинфосфатазы. Са -связывающим белкам и механизмам регуляции ими процессов фосфорилирования/дефосфорилирования посвящено огромное число работ; фоторецепторная клетка в этом отношении -исключение. К настоящему времени ясны общая картина и многие детали зрительной трансдукции у позвоночных животных, в частности доказана важность фосфорилирования родопсина для аттеньюации сигнала в зрительном каскаде и для световой адаптации фоторецепторной клетки. Однако систематическое и

интенсивное исследование роли Са2+-связывающих белков в регуляции фототрансдукции у позвоночных животных, в том числе -в регуляции фосфорилирования зрительного рецептора (родопсина) и соответствующей протеинкиназы (родопсинкиназы), было начато лишь недавно, во многом благодаря обнаружению в 1991 году Са2+-связывающего белка рековерина, функция которого по видимому является предотвращение нежелательного фосфорилирования темноадаптированного родопсина.

С момента открытия рековерина было обнаружено еще около 20 белков со сходной структурой в самых различных тканях, как позвоночных так и беспозвоночных. Это позволило ввести понятия рековериноподобного белка и семейства рековериноподобных белков. Однако структурно-функциональные исследования рековерина не проводились и было неясно, как кальцийсвязывающие участки влияют на функцию белка.

Изучение влияния кальцийсвязывающих участков рековерина на его функцию является темой этой работы.

3 Обзор литературы

Сенсорную функцию в сетчатке выполняют фоторецепторные клетки: палочки и колбочки, представляющие собой высокоспециализированные нейроны. Палочек в сетчатке млекопитающих, в том числе человека, примерно 120 миллионов на одну сетчатку, причем расположены они преимущественно по периферии ее зрительной части; колбочки - их около 7 миллионов на сетчатку - концентрируются в центральной ее зоне. Палочки отвечают за сумеречное зрение при низкой освещенности, которое имеет малую разрешающую способность, и преобладают у животных, ведущих ночной образ жизни. Колбочки эффективно работают при достаточно ярком освещении и обеспечивают цветное зрение; соответственно, их больше у животных, активных преимущественно днем [1,2].

Оба типа фоторецепторов - это длинные, узкие клетки, свое название они получили из-за формы их наружных сегментов, которые у палочек тонкие, цилиндрические, у колбочек -значительно более утолщенные (рис. 1). Наружный сегмент - часть фоторецепторной клетки, которая своим окончанием обращена к наружи глаза. В наружном сегменте присутствуют зрительный пигмент и катаболические ферменты необходимые этой структуре для выполнения функции световой антенны [3]. Наружный сегмент палочки (НСП) в онтогенезе развивается из цилии и представляет собой стопку из сотен или даже тысяч так называемых фоторецепторных дисков. Фоторецепторные диски образуются у основания НСП как впячивание плазматической мембраны, причем внутреннее пространство вновь образованных дисков еще

Палочка

" в о

А. Б.

СВЕТ

Внутренний сегмент

Колбочка

Наружный сегмент

Биполярные нейроны

Ганглии

Нервные волокна к мозгу

ю. <

Диски

Рисунок 1. Схема строения сетчатки позвоночных (А) и отдельной палочки (Б) [1].

сообщается с внеклеточным пространством. Позднее диски как бы отпочковываются от плазматической мембраны, превращаясь в замкнутые структуры, и становятся независимыми как от нее, так и друг от друга. Тем самым наружная поверхность плазматической мембраны оказывается внутренней поверхностью дисков, а их просвет ведет свое происхождение от внеклеточного пространства

[3].

Наружные сегменты колбочек имеют принципиально отличаются от НСП тем, что колбочковые диски представляют

собой складки плазматической мембраны и их внутриклеточное пространство сообщается с внеклеточной средой.

На диски приходится подавляющая часть массы НСП, в то время как на плазматическую мембрану всего - 1-5% [4, 5]. Около 70% общего белка НСП составляет интегральный мембранный белок - родопсин [6]. Только два белка присутствуют в количестве, превышающем 1 копию на 100 молекул родопсина, - это трансдуцин и аррестин. Еще 16 белков, включая свМР-фосфодиэстеразу (ФДЭ), представлены 1-10 копиями на 1000 молекул родопсина. Молярное соотношение ФДЭ : трансдуцин : родопсин выглядит как 1 : 10 : 100

[7].

3.1 Молекулярные механизмы передачи сигнала в фоторецепторной клетке

Фосфодиэстеразный каскад опосредует передачу сигнала от фотовозбужденного родопсина (Rho*) к cGMP-завиеимым ионным каналам путем светозависимой активации системы гидролиза cGMP [8, 9]. Последовательность событий в этом каскаде имеет следующий вид: светозависимая активация родопсина —> катализ фотовозбужденным родопсином GDP/GTP-обмена на трансдуцине —> активация ФДЭ —> гидролиз cGMP —> закрывание катионных каналов в плазматической мембране НСП и ее гиперполяризация.

3.1.1 Родопсин Первый шаг процесса фототрансдукции - поглощение кванта

света родопсином и переход этого белка в фотоактивированное

состояние. Согласно имеющимся данным молекула родопсина-

гликопротеид с молекулярной массой около 40 кДа, состоящий из

348 аминокислотных остатков [10] и хромофорной группы - 11-цис-

ретиналя [11]. Белковая часть родопсина, опсин, как и более чем 100

других членов семейства сопряженных с G-белками рецепторов,

характеризуется наличием 7 гидрофобных участков из 20-25

аминокислотных остатков каждый, которые образуют 7

трансмембранных а-цепей [12]. Во внутридисковое пространство

экспонирован N-концевой фрагмент молекулы родопсина, к

которому присоединены две углеводные цепи, ковалентно

связанные с боковой группой Asp-2 и Asp-15; при этом

модификация по Asp-15 необходима для правильной организации

Рисунок 2. Общая схема фоторецепторного каскада [9].

Рисунок 3. Родопсин в липидном бислое [39].

пространственной конформации молекулы, ее транспорта в мембрану. Сюда же обращены три относительно гидрофильные петли, соединяющие II - III, IV - V и VI - VII гидрофобные

трансмембранные ос-цепи. Участки полипептидной цепи родопсина, выходящие из мембраны в цитоплазму НСП, имеют много гидрофильных аминокислот и представлены тремя петлями, соединяющими I - II, III - IV и V - VI трансмембранные а-цепи, и С-концевым фрагментом, состоящим приблизительно из 40 аминокислотных остатков. Исследования мутантных форм родопсина позволили приписать следующие функции доменам этого белка: внутридисковая часть - поддержание общей структуры, трансмембранный домен - прием сигнала; цитоплазматические петли и С-конец - передача сигнала к трансдуцину [13, 14, 15, 16]. С использованием мутантов родопсина с удаленными первыми 1, 1.5, 2, 3, или 5 трансмембранными участками показано, что для поддержания пространственной структуры родопсина в мембране необходимо минимум 5 трансмембранных столбов, для правильной интеграции в эндоплазматический ретикулум в процессе синтеза 2 ТМС; синтез же последующих 5 обязателен для выхода из ретикулума [17].

Кроме гликозилирования по остаткам Азр-2 и Азр-15 родопсин подвергается ряду других важных посттрансляционных модификаций [13,18]. Так Су 8-110 и Суз-187 образуют единственную в молекуле родопсина дисульфидную связь, необходимую для стабилизации активного состояния белка [18]; СуБ-322 и Суэ-323 пальмитоилированы, что приводит к "заякориванию" С-концевого участка родопсина в мембране [12].

Молекула родопсина содержит в своем составе 11-цис-ретиналь, ковалентно связанный протонированным основанием Шиффа с е-аминогруппой боковой цепи ЬуБ-296 (в седьмой трансмембранной а-цепи). Методами направленного мутагенеза и

фотоафинного мечения [19, 20] были установлены 7 аминокислот, образующих ретиналь-связывающий "карман" - это Phe-115, Ala-117, Glu-122, Trp-126, Ser-127, Trp-265 и Tyr-268. В структурном и функциональном отношениях важно, что протонированное основание Шиффа, через которое хромофор связан с белком, стабилизируется за счет взаимодействия с противоионом -карбоксильной группой Glu-113 в третьей трансмембранной а-цепи [21,22]. Сближение III-й и VII-й трансмембранных а-цепей стабилизирует неактивное состояние родопсина [23, 24].

Поглощение родопсином кванта света приводит к ряду его фотохимических превращений - фотолизу, продуктами которого являются полностью-транс-ретиналь и опсин. Собственно фотохимический процесс - 11-цис—>11-транс-изомеризация ретиналя, является единственным светозависимым процессом, приводящим к светоактивации родопсина; все остальные стадии фотолиза - светонезависимые, они сопряжены с конформационными перестройками в молекуле родопсина и реакциями протонирования - депротонирования основания Шиффа между ретиналем и s-аминогруппой Lys-296 [13]. Наибольшую важность для биохимических реакций, приводящих к возникновению фоторецепторного ответа, представляет один из интермедиатов фотолиза родопсина - метародопсин II, появление которого при комнатной температуре наблюдается примерно через 10"3 сек после поглощения родопсином кванта света и сопровождается значительными конформационными перестройками в молекуле белка, связанными, в том числе с разрушением солевого мостика между III и VII-ой трансмембранными а-цепями родопсина [25].

Рисунок 4. Изменение взаимного положения трансмембранных столбов родопсина при переходе в светоактивированное состояние [26].

С использованием методов направленного мутагенеза и ядерного магнитного резонанса удалось выяснить, что для активации трансдуцина необходимо изменение взаимного положения ТМС III и VI, при связывании спиралей между собой активация не наступает [26].

Метародопсин II выступает в роли катализатора в процессе активации следующего белка фосфодиэстеразного каскада -трансдуцина. Во взаимодействии с трансдуцином и его активации принимают участие П-я (остатки 141 - 153) и Ш-я (остатки 230 -252) цитоплазматические петли и остатки 310 - 321 между УП-ой трансмембранной а-цепью и жирнокислотным "якорем": соответствующие пептиды конкурируют с метародопсином II за связывание с трансдуцином [27].

3.1.2 Трансдуцин

Молекула трансдуцина состоит из трех полипептидов: альфа,

бета и гамма (Та, Т(3 и Ту) с молекулярной массой 39, 36 и 8 кДа соответственно [28,29]. В а-субъединице локализован нуклеотид-связывающий центр, способный при взаимодействии трансдуцина с метародопсином II обменивать связанный GDP на GTP и играющий ключевую роль в активации трансдуцина [1]. Та обладает собственной GTP-азной активностью, благодаря которой происходит гидролиз GTP до GDP [30]. Тр и Ту прочно связаны друг с другом и функционируют как единая тру-субъединица [31]. Исходно Ta-GDP находится в комплексе с ТРу; метародопсин II катализирует обмен GDP на GTP с образованием Ta-GTP, которая в результате диссоциирует от ТРу и активирует эффекторный фермент - ФДЭ. Насколько известно, роль ТРу в НСП быка состоит в обеспечении взаимодействия Та с метародопсином II [32]; кроме этого, есть указания, что ТРу-ди�