Структурно-функциональной исследование природных пептидных антибиотиков

Овчинникова, Татьяна Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурно-функциональной исследование природных пептидных антибиотиков
ВАК РФ 03.01.06, Биотехнология (в том числе бионанотехнологии)

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональной исследование природных пептидных антибиотиков"

УЧРЕЖДЕНИЕ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК ИНСТИТУТ БИООРГАНИЧЕСКОЙ ХИМИИ ИМ. АКАДЕМИКОВ М.М. ШЕМЯКИНА И Ю.А. ОВЧИННИКОВА РАН

На правах рукописи

ОВЧИННИКОВА Татьяна Владимировна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ ПЕПТИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.10 - Биоорганическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва-2011

4854727

Официальные оппоненты:

академик РАН и РАМН, доктор биологических наук, профессор Ткачук Всеволод Арсеньевич

член-корреспондент РАН,

доктор химических наук,

профессор Кочетков Сергей Николаевич

член-корреспондент РАН,

доктор химических наук,

профессор Северин Евгений Сергеевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 10 октября 2011 г. в 15 часов на заседании Совета по защите докторских диссертаций Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.ВЛомоносова (МИТХТ им. М.В.Ломоносова) по адресу: 119571 Москва, проспект Вернадского, 86.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова.

Диссертация в виде научного доклада размещена на сайте http://www.vak.ed.gov.ru Высшей аттестационной комиссии (ВАК) Министерства образования и науки Российской Федерации

Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук,

Диссертация в виде научного доклада разослана

старший научный сотрудник

А.И.Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования.

Стремительный рост числа патогенов, резистентных к антибиотикам, диктует насущную необходимость создания новых противоинфекционных лекарственных средств. В ряде случаев традиционные антибиотики уже не обеспечивают эффективного контроля над возбудителем при развитии хронических и рецидивирующих инфекционных заболеваний. Возрастающая

антибиотикорезистентность наблюдается в отношении ряда штаммов Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium и Pseudomonas aeroginosa, а также таких распространенных патогенов человека, как Staphylococcus aureus и Staphylococcus pneumoniae. Структурно-функциональное изучение природных пептидных антибиотиков показывает, что на их основе возможно создание новых антимикробных средств.

Эффективные механизмы защиты от патогенов вырабатывались многоклеточными организмами в процессе их эволюции. Лимфоцитарный иммунитет возник лишь с появлением челюстных рыб и существует менее чем у 2% видов многоклеточных организмов. Однако даже те из них, которые обладают способностью вырабатывать антитела, в первые часы встречи с патогеном могут полагаться только на защитные механизмы системы врожденного иммунитета. Эндогенные антимикробные пептиды (далее АМП) относятся к молекулярным факторам системы врожденного иммунитета, обеспечивающим выживание организмов в окружении патогенов (бактерий, грибков, простейших, вирусов). Распространенность АМП в природе и их структурное разнообразие дают основание полагать, что каждый биологический вид вырабатывает свой уникальный набор защитных пептидов, позволяющий ему успешно бороться с окружающей его патогенной микрофлорой. В настоящее время определены структуры около тысячи АМП, выделенных из различных тканей человека, позвоночных и беспозвоночных животных, растений, грибов и бактерий. Природные пептидные антибиотики обладают способностью инактивировать широкий спектр микроорганизмов. Поиск и исследование новых АМП позволяет лучше понять закономерности функционирования врожденного иммунитета у человека. По мере углубления наших знаний о пептидных антибиотиках появляется все больше сведений об их участии в процессах регуляции иммунитета и регенерации тканей.

Наряду с фундаментальными исследованиями структурно-функциональных свойств АМП важное прикладное значение имеют работы по созданию эффективных лекарственных средств на их основе. Природные пептиды могут стать прототипами новых антибиотиков широкого спектра действия, способных решить проблему резистентности к существующим противоинфекционным средствам. Подавляющее большинство АМП относятся к мембранотропным антибиотикам, поэтому развитие резистентности патогенов к ним менее вероятно из-за низкоизбирательного механизма их действия и возможно только при существенных изменениях структуры и свойств клеточной мембраны. Кроме того, многие АМП усиливают действие традиционных антибиотиков.

Известно, что длительная терапия антибиотиками в ряде случаев вызывает состояние иммунодефицита и эндотоксемию, однако многие АМП наряду с антибиотической обладают иммуномодулирующей и эндотоксин-нейтрализующей активностью. Все это создаёт предпосылки для создания новых эффективных антибиотических лекарственных средств на основе природных пептидных антибиотиков, лишенных перечисленных выше недостатков. Учитывая наличие выраженной антибиотической и иммуномодулирующей активности у природных АМП, многие зарубежные фармацевтические компании уже приступили к созданию нового класса антибиотиков на их основе, а первые из них уже проходят клинические испытания. Структурно-функциональные исследования природных пептидных антибиотиков могут внести существенный вклад в развитие этого перспективного направления медико-биологической науки, а разработка способов их получения с целью создания на их основе лекарственных средств нового поколения является одной из актуальных задач современной биотехнологии.

Диссертация выполнялась по разделам основных направлений научных исследований ИБХ РАН «Структура и функции белков и пептидов" и „Биотехнология", утвержденных Ученым Советом ИБХ РАН. Работа проводилась при поддержке РФФИ; ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы; ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы»; ФЦП «Национальная технологическая база» на 2007-2011 годы; целевой программы Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине».

Цель и задачи исследования.

Цель данной диссертационной работы состоит в исследовании структуры, биологических свойств и молекулярных механизмов действия природных пептидных антибиотиков, а также в разработке биотехнологических способов их получения. Объектами исследования являются антимикробные пептиды ареницины из целомоцитов морского червя Arenicola marina [тип - кольчатые черви (Annelida), класс - многощетинковые (Polychaeta)]; аурелин из мезоглеи сцифоидной медузы Aurélia aurita [тип - кишечнополостные (Cnidaria), класс - сцифоидные (Scyphozoa)]; буфорин из желудка азиатской жабы Bufo bufo gargarizans [тип - хордовые (Chordata), класс - земноводные (Amphibia), отряд - земноводные бесхвостые (Anura), семейство - жабы настоящие (Bufonidae)]; дефенсин и липид-траспортирующий белок из чечевицы обыкновенной Lens culinaris [отдел - покрытосеменные (Magnoliophyta), класс - двудольные (Dicotylédones), порядок - бобовоцветные (Fabales), семейство -бобовые (Fabaceae), подсемейство - мотыльковые (Faboideae)]; зервамицин и антиамебин из мицелиальных спорообразующих грибов Emericellopsis salmocynnemata и Emericellopsis minima [отдел - настоящие грибы (Eumycota), подотдел - аскомицеты (Ascomycotina), класс - эуаскомицеты (Euascomycetes)]; латероцидин и латероцин из аэробной грамположительной бактерии Brevibacillus laterosporus; лихеницидин из терморезистентной грамположительной бактерии Bacillus licheniformis.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

1. Изучить структуру и свойства антимикробных пептидов ареницинов, аурелина, дефенсина и липид-транспортирующих белков чечевицы, зервамицина, антиамебина, латероцидина, латероцина, лихеницидина.

2. Разработать биотехнологические способы получения ареницинов, аурелина, буфорина, дефенсина и липид-транспортирующего белка чечевицы в искусственных экспрессирующих системах, включая методики их выделения и очистки.

Научная новизна работы.

Все результаты, изложенные в настоящей работе, получены впервые.

1. Впервые установлена структура новых антимикробных пептидов ареницинов из целомоцитов морского кольчатого червя Arenicola marina, нового антимикробного пептида аурелина из мезоглеи сцифоидной медузы Aurelia aurita, нового дефенсина и новых липид-траспортирующих белков из семян чечевицы Lens culinaris, новых антимикробных пептидов латероцидина и латероцина из аэробных грамположительных бактерий Brevibacillus laterosporus, новой двухкомпонентной системы лантибиотиков из терморезистентных грамположительных бактерий Bacillus lichenifromis. Впервые определены полные нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующих белки-предшественники ареницинов, аурелина, дефенсина и липид-траспортирующих белков чечевицы, лихеницидина, и соответствующие им полные аминокислотные последовательности белков-предшественников.

2. Впервые сконструированы биотехнологические системы для гетерологичной экспрессии ареницина, аурелина, буфорина, дефенсина и липид-транспортирующего белка чечевицы, полностью идентичных природным антимикробным пептидам. Впервые получены штаммы-продуценты, позволяющие экспрессировать гибридные белки, содержащие искомые пептидные антибиотики. Впервые разработаны способы получения, методики выделения и очистки рекомбинантных ареницина, аурелина, буфорина, дефенсина и липид-транспортирующего белка чечевицы, идентичных природным пептидным антибиотикам по молекулярной массе, аминокислотной последовательности и антимикробной активности.

3. Впервые разработаны биотехнологические способы получения аналогов ареницина, аурелина, зервамицина, антиамебина, дефенсина и липид-транспортирующего белка чечевицы, меченных стабильными изотопами.

4. Впервые проанализированы структурные особенности выделенных антимикробных пептидов и спектр их биологического действия в сравнении с другими представителями этого класса биологически активных веществ. Впервые изучены физико-химические свойства рекомбинантных ареницина, аурелина, дефенсина и липид-транспортирующего белка чечевицы, а также зервамицина, антиамебина и лихеницидина. С использованием полученных данных, предложены модели, описывающие механизмы антимикробной активности ряда исследованных пептидных антибиотиков.

Полученные сведения обогащают наши знания о природных защитных пептидах как молекулярных факторах врожденного иммунитета и могут стать основой для дальнейших исследований механизмов биологической активности этих веществ, а также могут представлять ценность для исследований в области молекулярной эволюции АМП.

Практическая значимость работы.

Полученные в ходе выполнения данной работы АМП представляют большой практический интерес в качестве прототипов антибиотиков нового поколения. Ряд полученных пептидов обладают широким спектром антимикробного действия и по своей активности не уступают лучшим мировым аналогам. Известно, что большинство АМП относятся к мембранотропным антибиотикам. Поскольку развитие резистентности патогенов к ним возможно только при значительных изменениях в структуре клеточной мембраны, природные пептидные антибиотики способны решить проблему резистентности к существующим противоинфекционным средствам. Кроме того, многие АМП усиливают действие традиционных антибиотиков и наряду с антибиотической обладают иммуномодулирующей и эндотоксин-нейтрализующей активностью, что обеспечит возможность избегать эндотоксемии и состояния иммунодефицита при длительной антибиотикотерапии. Все перечисленное создаёт предпосылки для создания новых эффективных антибиотических лекарственных средств на основе природных пептидных антибиотиков. Ряд зарубежных фармацевтических компаний уже приступили к созданию нового класса антибиотиков на основе природных АМП. Структурно-функциональные исследования природных пептидных антибиотиков могут внести значительный вклад в развитие этого направления медико-биологической науки.

Широкому применению АМП в клинической практике препятствует высокая себестоимость их производства. Проблема может быть успешно решена методами биотехнологии, применение которых является более экономически эффективным по сравнению с химическим синтезом. Разработка способов получения пептидных антибиотиков с целью создания на их основе лекарственных средств нового поколения является одной из актуальных задач современной биотехнологии.

Полученные в ходе данной работы новые АМП могут быть также использованы для решения задач сельскохозяйственной биотехнологии по повышению устойчивости растительных культур по отношению к микробным, в особенности грибковым патогенам.

Апробация работы.

Результаты исследований были представлены на IV, VI и VIII Гордоновских международных конференциях по антимикробным пептидам (Gordon Research Conferences "Antimicrobial peptides", Барга, Италия, 2003, 2007, 2011), 33-м и 36-м конгрессах Федерации европейских биохимических обществ (Афины, Греция, 2008 и Турин, Италия, 2011), XVIII международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Бирмингем, Великобритания, 2000), международной конференции "Peptaibols: Biosynthesis, Structural Diversity and Mode of Action" (Йена, Германия, 2002), международных конференциях по магнитному резонансу "EUROMAR-2009" и "EUROMAR-2010" (Гётеборг, Швеция, 2009 и Флоренция, Италия, 2010), международном симпозиуме «Nuclear magnetic resonance in condensed matter. The 4 meeting «NMR in life sciences» (Санкт-Петербург, 2007), российско-шведской конференции "NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recognition" (Москва, 2000), XI и XII международных конференциях "New information technology in medicine, biology, pharmacology, and ecology" (Гурзуф, Украина, 2003, 2004), IV, V и VI Московских международных конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009, 2011), международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2009), международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008), международной конференции «Scenarios for a coordinated approach to sustainable cooperation with the Eastern neighbors of the EU" (Москва, 2007), международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004), международной конференции «Фармацевическая биоэтика» (Москва, 1997), рабочих совещаниях участников международного проекта INTAS (Санкт-Петербург, 2005 и Триест, Италия, 2006), симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» (Москва, 2008), III съезде Биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), III съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005), Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007, 2008, 2009), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), 50-й научной конференции МФТИ (Москва-Долгопрудный, 2007), научных конференциях ФИБХ РАН (Пущино, 1999, 2004), школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), XV-XXIII зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003-2011).

Публикации и патенты.

По теме диссертации опубликовано 139 работ, в том числе 46 статей в ведущих отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, из них 15 статей в российских журналах (Биоорганическая химия, Биотехнология, Биохимия, Доклады Академии наук и др.), 28 статей в зарубежных журналах (Analytical & Bioanalytical Chemistry, Applied Magnetic Resonance, BBA - Biochimica et Biophysica Acta, Biochemical & Biophysical Research Communications, Biochemistry (USA), Bioorganic Chemistry (USA), Biochemical Journal, Biophysical Journal, Biopolymers, Chemistry & Biodiversity, FEBS Letters, JACS - Journal of the American Chemical Society, Journal of Biological Chemistry, Journal of Biomolecular NMR, Journal of Peptide Science, Protein & Peptide Letters, Proteomics и др.) и 3 статьи в сборниках научных работ. По результатам исследований получено 10 патентов на изобретение РФ и подана 1 заявка на выдачу, патента РФ. В 2009 г. патент на изобретение RU 2316595 «Способ получения антимикробного пептида ареницина» вошёл в число 100 лучших изобретений России и получил диплом Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам. По теме работы опубликовано также 82 тезиса докладов, в том числе 43 на международных и 39 на российских конференциях.

Личный вклад автора.

Автору принадлежит решающая роль в выборе направления и объектов исследований, разработке и проверке предложенных в работе экспериментальных подходов на всех этапах работ по выделению, изучению структуры, биотехнологическому получению аналогов и исследованию биологической активности природных пептидных антибиотиков - от постановки задачи и планирования экспериментов до анализа, обсуждения, обобщения и оформления полученных результатов. Весь экспериментальный материал получен при непосредственном участии автора и под его научным руководством, за исключением физико-химических исследований, выполненных в лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Исследование новых антимикробных пептидов ареницинов из целомоцитов морского кольчатого червя Arenicola marina.

1.1. Определение первичной структуры ареницинов. Определение полных последовательностей кДНК, кодирующих предшественники ареницинов, и соответствующих им полных аминокислотных последовательностей препроареницинов.

Ареницины были выделены из целомоцитов морского кольчатого червя пескожила Arenicola marina, который принадлежит к семейству Arenicolidae, отряду Drilomorpha, классу Polychaeta, типу Annelida, с помощью препаративного гель-электрофореза и обращенно-фазовой ВЭЖХ и предоставлены для исследований лабораторией общей патологии Института экспериментальной медицины РАМН (рук. проф. В.Н.Кокряков). С помощью масс-спектрометрического анализа на приборе Vision 2000 (ThermoBioAnalysis, США) нами были выявлены две изоформы пептида, имеющие молекулярные массы 2758,3 Да и 2772,3 Да и названные ареницином-1 и ареницином-2, соответственно, и установлены их первичные структуры.

Одной из характеристик, положенных в основу современной классификации антимикробных пептидов, является наличие внутримолекулярных дисульфидных связей, играющих важную роль в формировании их пространственной структуры. Определение числа остатков цистеина проводилось путем их химической модификации с помощью 4-винилпиридина. Ареницины подвергали денатурации в гуанидинхлориде, после чего дисульфидные связи восстанавливали дитиотреитолом с последующим алкилированием 4-винилпиридином с образованием S-пиридилэтилцистеинов. Масс-спектрометрический анализ полученных производных выявил молекулярные ионы с m/z 2970,3 и 2984,7 для S-пиридилэтилированных ареницина-1 и ареницина-2, что соответствует возрастанию молекулярной массы каждого пептида на 212 Да после модификации и свидетельствует о наличии в каждом пептиде двух остатков цистеина, образующих одну дисульфидную связь.

Для определения N-концевой аминокислотной последовательности выделенных пептидов применяли автоматическое микросеквенирование на приборе Precise 491 cLC Protein Sequencing System (Applied Biosystems, США). Идентификацию фенилтиогидантоиновых производных аминокислот проводили на анализаторе 120А РТН Analyzer (Applied Biosystems, США). В результате автоматического микросеквенирования ареницинов и их S-пиридилэтилированных производных были установлены частичные (95%) аминокислотные последовательности обеих изоформ ареницина, включая локализацию остатка цистина.

Для установления полной первичной структуры предшественников ареницинов была выделена суммарная РНК из целомоцитов Arenicola marina с использованием колонки Spin (Promega, США). Определение структуры генов, кодирующих ареницины, проводили путем обратной транскрипции и амплификации с помощью набора реактивов SMART* RACE * cDNA Amplification Kit (Clontech, США; "SMART -Switching Mechanism at 5' end of RNA Transcript; "RACE - Rapid Amplification of cDNA Ends). RACE представляет собой метод быстрой амплификации концевых

последовательностей кДНК с помощью полимеразной цепной реакции. Методом RACE были амплифицированы сначала З'-концевые, а затем 5'-концевые области транскриптов, кодирующих ареницины. Структуры ген-специфических праймеров для З'-RACE выбирались на основании данных по аминокислотной последовательности зрелых пептидов с учетом вырожденности генетического кода и данных по частоте использования кодонов у Arenicola marina и филогенетически близких организмов. Продукты ПЦР были клонированы и просеквенированы. Структура полноразмерной кДНК (около 1300 п.н.) предшественника ареницина-1 была получена путем сопоставления результатов секвенирования 3'- и 5'-концевых фрагментов (рис. 1). Структуры кДНК были зарегистрированы в банке данных GenBank под номерами AY684856 и AY684857.

Анализ установленной нуклеотидной последовательности в обоих случаях показал наличие открытой рамки считывания, кодирующей предшественник ареницина размером 202 аминокислотных остатка, и позволил определить полную первичную структуру предшественника каждой изоформы пептида (регистрационные номера в банке данных SwissProt - Q5SC59 и Q5SC60). Зрелые ареницин-1 и ареницин-2 содержат по 21 аминокислотному остатку каждый и имеют расчётные молекулярные массы 2758,3 Да и 2772,3 Да, совпадение которых с экспериментальными значениями m/z молекулярных ионов говорит об отсутствии постгрансляционных модификаций у этих пептидов. Участок, соответствующий зрелому пептиду (21 аминокислотный остаток), расположен в С-концевой области предшественника. С помощью компьютерного анализа с использованием алгоритма SignalP 3.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/) выявлена вероятная N-концевая сигнальная последовательность белка (25 аминокислотных остатков), необходимая для его транспортировки в эндоплазматический ретикулум. Длина фрагмента между сигнальным и зрелым пептидами - 156 аминокислотных остатков. На границе между продоменом и зрелым пептидом выявлена последовательность -Lys-Arg-, что указывает на возможное участие протеиназы из семейства фурина в процессинге проареницинов. При сравнении кДНК предшественников изоформ ареницина были обнаружены также нуклеотидные замены в области сигнального пептида и продомена, в отдельных случаях приводящие к аминокислотным заменам (рис. 2).

Таким образом, установлено, что обе изоформы зрелых ареницинов содержат по 21 аминокислотному остатку, более половины из которых имеют выраженные гидрофобные свойства. Катионный характер ареницинов обусловлен присутствием 6 остатков аргинина. Уникальная особенность ареницинов состоит в формировании ими 18-членных циклов, замкнутых дисульфидной связью. С-Концевая карбоксильная группа ареницинов не амидирована; данная модификация возможна лишь при наличии в структуре предшественника остатка глицина, следующего непосредственно за концевым остатком зрелого пептида. Установленная нами полная первичная структура зрелых ареницинов позволяет сделать вывод о выявлении оригинальных пептидов, не имеющих гомологии с известными АМП и не принадлежащими ни к одному из известных ранее классов эндогенных АМП, что послужило основание для получения патента РФ.

ЗАВАбАТССА ЗВСАЗАТССС ЗАТАСЗТСАА СОСТОАОСАО ТТТСАЗАЗАА ЗТСТССАТАВ АВТСТСТВаА ТАВССАЗТЗА тсстт8с(3(3т СТСССДССАА аТТЗССАААС ТТвАСАВСАА ВСССАвААВА СвСАТАввСС вАЗАТАвТТв ТЗАТСААССА

161

401

481

Л С<3 АС АТССАТ

тготоасссоа тсостоааос оаоозссвса оссптаатэ Аасодалаос ОАРАТсаолт 38А8ААТ03А А8СААТТТ0А

■□УМ О Е К I Е V N Е Ц Е N Я Е I I ВОАСЗОЗУЕЗ-

СВТТААСВВС ВАОААвАТГВ А'З'ЗТАААСВА 'ЗСАЗВААААС СЗ<»ШШ!|рЩШевС вввАвВАДАС ЗЗСВТОЗАЗВ

алтстатсАт аатвдтсвАС САсастААва отстзатсао ставтстАтс ссвсатаста аавАвтастА ссталтсваА

ЗЗввТВвАСА ААСАВСТЗСС авАТОСССАв вААСТССТЗС АСТАТТТССА вТСАвСТСАв ввстсавссв АТввТВАВВВ

•0 V Е в А О V К * Е Р В Р V Т__□__N Л Р _Е_ V Я Е-

ЗЗТТВАААЗС ЗСТСТвЗАСТ АСВТЗААЗвС ТСАвОАССвС ССАаТЗАССО АССТЗААССТ ССТЗЗССССС ЗАЗЭТвСВАв

10 ¡TFf.CE)

Н V с

АвОССТвССА аввСАААТСА ВТЗТАСТВвС ТЗЗАвААвАЗ СТСТОаТОАС ААСААТВАЗС СввААААААв А2Н2ШЭ

721 801

втстасвсат АсетсАвввт ссадввтвтв стйзтзсзтт АССвААоатв ттев

ГАввАА АвССАЗАССС СЗАСЗвСАвС

САвАССССЗА СввТАвССАв АССССЗАСвв САвССАвАСС ССЗАСЗАСАТ ССАСТТТСАС ЗЗСАТССАСТ вТСАвввСАТ

881 СТАСТЗТСАС ввСАТССАСТ ЗТСАСввСАТ ССАСТЗТСАС ЗвСАТССАСТ вТСАСввСАТ СТАСТвТСАС ВЗСАТССАСТ

________¿»пУци»»нУкоУогьш кпоидУ

961 вТСАСввСАТ ССАСТвТСАС ЗвСАТССАСТ ВАвААССвАС вАТТСТвСАв СССТСАвАвТ вТЗАССАТТТ ТЗАААТвавА

...............................ж^у:^;^,.';;^.......................• ...........................вдк-ьвд............................ мггя-ь'дш—

1041 ТСААТвАСАТ ТТТСТАСТТТ СААвТАТТАТ ТСАААААТвТ вАТТЗТТТТв ААСААТТАСА ААТТТА5ТСА АСвААЗТТвТ

..................ИГЦВЩ............

1121 СТЗТАСАСТТ ТЗСЗТАЗААА аСАСаТААТА СТАТССасаЗ ТТАТТССАСТ АССТАЗСТТА ВАТАТТСАСА АСТТСААВСС 1201 АЗАСАССТТв ЗТСАТВЗААТ ТАТвТТЗЗСА ТАААЗААААС ТТТТАТАААТ АСАААААААА ААААААА

Рис. 1. Последовательность кДНК, кодирующая предшественник ареницина-1, и соответствующая ей аминокислотная последовательность препроареницина-1. Участки транслируемой области, кодирующие отдельные функциональные домены предшественника, выделены цветом: темно-серым - сигнальный пептид, светло-серым - продомен, черным - зрелый пептид. Указаны сайты отжига праймеров, использованных для амплификации концов кДНК, повторяющиеся последовательности двух типов (I и И), а также отличия, наблюдаемые в разных клонах (в области сигнального пептида и З'-ШИ).

Л ч ¿1

«а Л

Препроареницик-1 Препроареницин-2

101

ÏLÏGGVDK ÏLIGGVDK

QENRZIIRQAGGDGVEGSVMVlDHAKGLlEkslPIiAGEC QENRE11RQAGGDGVEGSVMVI D HAKGLI|I WSI PfA~.EC

ISO

ÎLLH ÏFgSAOGSADGEGVgSAiDYVKAEDRPVTDLN LLLHYElpjsAQGSADGEGvHsAbDYVtlAEDPPVTDLU

151

LLAPEVREACQGKSVÏVfbEKSSGDNNEPEK LLAPEVREACQGKSVYWLEKSSGDNNEPEKRjgJ^g^Jl

77ГГ

ЯР

sss

202 Я

Hil

Рис. 2. Сравнение аминокислотных последовательностей предшественников ареницина-1 и ареницина-2. Темно-серым цветом выделен сигнальный пептид, светло-серым - продомен, черным - зрелый пептид. В рамки заключены аминокислотные замены. Один из вариантов препроареницина-1 содержит аминокислотную замену Туг/Суя в положении 10 сигнального пептида.

Поиск в базах данных по аминокислотным и нуклеотидным последовательностям (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) позволил выявить сходство продомена предшественника ареницина с продоменами предшественников хондромодулинов - факторов роста и дифференцировки хрящевой ткани и ингибиторов ангиогенеза у различных видов позвоночных. Степень гомологии достигает 25% идентичных или 46% эквивалентных остатков. При этом для выравнивания последовательностей длиной около 130 аминокислотных остатков достаточно введения всего нескольких разрывов (рис.3). С помощью анализа, основанного на сравнении установленной последовательности с моделями Маркова, построенными для известных консервативных доменов (http://smart.embl-heidelberg.de), была выявлена принадлежность препроареницинов к группе белков, содержащих домен BRICHOS, идентифицированный в ряде белков, фунционально не связанных между собой и ассоциированных с различными заболеваниями человека. К ним относятся хондромодулины, участвующие в патогенезе хондросаркомы; белки семейства BRI, мутации которых наблюдаются при наследственной деменции; гастрокин-1 (белок СА11), пониженная экспрессия которого отмечается при раке желудка; сурфактантный белок SP-C, снижение уровня экспрессии которого сопряжено с расстройствами дыхательной системы. К настоящему времени домен BRICHOS обнаружен в 12 различных семействах белков. О древнем происхождении домена BRICHOS свидетельствует наличие гомологичных ему участков в геномных последовательностях круглых червей, иглокожих, насекомых и ланцетников. Ранее было высказано предположение о том, что домен BRICHOS участвует в процессинге содержащих его белков. Действительно, наблюдается некоторое сходство в механизмах процессинга этих белков. Большинство из них являются секретируемыми белками, расщепляемыми по сайту из сдвоенных катионных остатков и содержащими склонный к агрегации С-концевой фрагмент, стабилизированный

1 * 70

Ar-1 VNGE----KIEVNEQENREIIRQAGGDGVEGSVMVIDHAKGLISWSIPRAGECYLIGGVDKQLPDAQELL

Ar-2 VNGE----KVEVNEQENRJ! 11RQAGGDGVEGSVMVIDHAKGLIIWSIPRAGECYLIGGVDKQLPDAQELL

BtChM INGKLQDGSMEIDAGNNLETFKM—GSGAEEAVEVNDFQNGITGIRFAGGEKCYIKAQVKARIPEVGTMT HsChM INGKLQDGSMEIDAGNNLETFKM—GSGAEEAXAVNDFQNGITGIRFAGGEKCYIKAQVKARIPEVGAVT XlChM INGKVQEGSMEIDSGNNLETFKT—GTGNDEAVEVHDFQIGITGIRFTGGEKCYIKAQAKAHXPDVDSVT OcChM INGKLQDGSMEIDARNNLETFKM—GSGAEEAIEVNDFQNGITGIRFAGGEKCYIKAQVKARVPEVGTVT MmChM INGKLQDGSMEIDAVNNLETFKM—GSGAKEAIEVNDFKNGITGIRFAGGEKCYIKAQVKARIPEVGTVT RnChM INGRLQDASMEIDAÄNNLETFKM—GSGAEEAIEVNDFQNGITGIRFAGGEKCYIKAQVKARIPEVSTGT GgChM INGKVQDGSMEIDAGNNLETFKT—GSGSEEAVEVHDFQIGITGIRFAGGEKCYIKAQPKARVPEVDAMT TnChM---------MEMDAANNMERFST—GSGSDEALEVHDFEIGIAGIRFAGGDKCYIKTQAKARLPDVAALN

71 * 139

Ar-1 HYFQSAQGSADGEGV-----ESALDyVKAEDRPVTDLNLLAPEVREACQGKSVYWLEKSSGDNNEPEKR

Ar-2 HYFRSAQGSADGEGV-----QSAXiDÏVKAEDRPVTDLNLLAPEVREACQGKSVYWbEKSSGDNNEPEKR

BtChM К—QSISSELEGKIMPVKÏEENSLIWV-AGDQPVKDNSFLSSKVLELCGDLPIFWLKPTYPKEIQRERR HsChM К—QSISSKLEGKIMPVKÏEENSLIWV-AVDQPVKDNSFLSSKVLELCGDLPIFWbKPTYPKEIQRERR XlChM К—EGLSFELEDEIMPAKET3EMSLIWV-AADQPVKDSSFLSPKIQELCADLPIFWLRPTYPKEHQRGKR OcChM Q—QS X S SELEGKIMPVKHEEEALVWV-AVGQPVQDNS FLSARVLELCGDLPI FWbKPTYPKE IQRERR MmChM К—QSIS-ELEGKIMPVNYEENSLIWV-AVDQPVKDSSFLSSKILELCGDLPIFWLKPMYPKEIQRERR RnChM К—QSIS-ELEGKIMPVKYEENSLIWV-AVDQpVKDNSFLSSKILEFCGDLPIFWbKPMYPKEIPRERR

Рис. 3. Сходство продомена предшественников ареницинов с предшественниками хондромодулинов. Сокращения: Аг-1, Аг-2 - предшественники ареницина-1 и ареницина-2; Bt - Bos taurus, Hs - Homo sapiens, XI - Xenopus laevis, Oc -Oryctolagus cuniculus, Mm - Mus musculus, Rxi - Rattus norvegicus, Gg - Gallus gallus, Tn - Tetraodon nigroviridis. Звездочками отмечены консервативные остатки цистеина.

дисульфидной связью. В настоящее время появились данные об участии домена BRICHOS в процессе биосинтеза ряда ß-структурных пептидов и белков в качестве шаперона, предотвращающего образование амилоидных структур,

1.2. Гетерологичная экспрессия и очистка ареницина.

В ходе выполнения данной работы создана патентно-чистая технология гетерологичной экспрессии ареницина. Получены патенты на изобретение «Рекомбинантная плазмидная ДНК pE-His8-TrxL-Ar2, кодирующая гибридный белок, содержащий антимикробный пептид ареницин морского кольчатого червя Arenicola marina, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 - продуцент гибридного белка, содержащего ареницин» и «Способ получения антимикробного пептида ареницина». Первое изобретение позволило решить задачу конструирования плазмиды для получения ареницина в составе гибридного белка, а также задачу создания высокопродуктивного штамма-продуцента данного гибридного белка. Поставленная задача была решена за счет конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рЕ-His8-TrxL-Ar2 размером 4059 п.н., кодирующей гибридный белок His8-TrxL-Ar2, содержащий гистидиновый октамер, модифицированный тиоредоксин A (M37L) и искомый антимикробный пептид ареницин (рис. 4), а также за счет создания штамма Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 - продуцента гибридного белка, содержащего антимикробный пептид ареницин. Введение остатка метионина непосредственно перед N-концевым остатком рекомбинантного ареницина обеспечило возможность избирательного химического расщепления полипептидной цепи бромцианом с высвобождением целевого пептида, не содержащего каких-либо дополнительных аминокислотных остатков по сравнению с природным ареницином. Использование тиоредоксина А в качестве партнера для рекомбинантной экспрессии позволило нейтрализовать токсичность антимикробного пептида для штамма-продуцента и благодаря этому достичь высоких выходов гибридного белка. Преимущество замены лейцином остатка метионина в положении 37 природного тиоредоксина А состоит в уменьшении числа фрагментов, получаемых в результате расщепления гибридного белка бромцианом. Расщепление гибридного белка His8-TrxL-Ar2 бромцианом привело к образованию всего одного побочного продукта, значительно отличающегося по молекулярной массе и физико-химическим свойствам от целевого пептида, что облегчило его выделение. Наличие гистидинового октамера в N-концевом участке экспрессируемой последовательности обеспечило возможность аффинной очистки гибридного белка His8-TrxL-Ar2 методом металло-хелатной хроматографии. Для биосинтеза рекомбинантного белка применялись оптимальные регуляторные элементы, контролирующие его экспрессию. Конструирование нового гена, кодирующего гибридный белок His8-TrxL-Ar2, осуществляли на основе плазмиды рЕТ20Ь(+). Искусственный ген, кодирующий гистидиновый октамер, модифицированный тиоредоксин A (M37L) и ареницин, фланкированный сайтами рестриктаз Bglll и Xhol, был получен химическим синтезом набора олигонуклеотидных фрагментов с последующей их сборкой и амплификацией при помощи полимеразной цепной реакции.

T7lac Promoter

His8-TrxL-Ar2

lad

f1 origin

pET-His8-TrxL-Ar2 I

5822 ьр ff

ColEI (pBR322| origin

T7 lac

8xHis

TrxA (M37L)

s-s'

144 a.o. 16,14 kDa

Рис. 4. Физическая карта рекомбинантной ллазмиды pET-His8-TrxL-Ar2 и участок, кодирующий гибридный белок. ColEI origin - участок инициации репликации плазмиды pBR322; fl origin - участок инициации репликации бактериофага fl; bla - ген устойчивости к ß-лактамным антибиотикам; lacl - ген 1ас-ингибитора; Т71ас promoter -промотор транскрипции бактериофага Т7 с lac-оператором; Т7 terminator - терминатор транскрипции; His8-TrxL-Ar2 - ген гибридного белка, содержащего ареницин-2. Указаны размеры гибридного белка в аминокислотных остатках, его молекулярная масса, порядок дисульфидных связей и сайт расщепления бромцианом.

Перед лигированием для получения липких концов продукт амплификации и векторную плазмиду обрабатывали рестриктазами Bglll и Xhol. Лигазную смесь использовали для трансформации компетентных клеток E.coli DH10B. Отбор клонов проводили при помощи ПЦР с использованием специфических праймеров и последующим рестриктным анализом выделенной плазмидной ДНК. Структуру гена, кодирующего гибридный белок, содержащий ареницин, определяли секвенированием по методу Сэнгера.

Для получения штамма-продуцента гибридного белка His8-TrxL-Ar2 препаратом плазмидной ДНК pE-His8-TrxL-Ar2 трансформировали компетентные клетки Е. coli BL21(DE3) и проводили отбор клонов, обладающих способностью экспрессировать рекомбинантный белок.

Преимущества штамма E.coli BL21(DE3) заключаются в использовании бактерий с фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого de novo рекомбинантного белка и загрязнения препарата наиболее активными протеазами Е. coli. Уровень экспрессии рекомбинантных белков контролировали с помощью электрофореза в полиакриамидном геле. Было показано, что клетки E.coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 являются суперпродуцентом ареницина. При индукции изопропилтио-р-О-галактозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка His8-TrxL-Ar2, содержащего ареницин, который накапливается в клетках в количестве 20-25% от суммарного белка бактерии. Задача получения рекомбинантного ареницина, полностью идентичного природному пептиду, была решена путем культивирования штамма-продуцента, индукции синтеза рекомбинантного белка, разрушения клеток, отделения нерастворимой фракции клеточного белка, очистки гибридного белка His8-TrxL-Ar2 с помощью металло-хелатной хроматографии, его солюбилизации и расщепления бромцианом по остатку метионина, разделения продуктов реакции и окончательной очистки ареницина методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Увеличение выхода рекомбинантного белка было достигнуто с помощью принудительной аэрации культуральной жидкости и использования обогащенных питательных сред с добавлением глюкозы.

Идентичность рекомбинантного ареницина природному пептиду устанавливали методами электрофореза в полиакриамидном геле, масс-спектрометрии, автоматическим секвенированием N-концевой аминокислотной последовательности по методу Эдмана. Выход продукта составил около 5 мг/л культуры.

1.3. Антимнкробная активность ареницина.

Антимикробная активность природного и рекомбинантного ареницинов определялась методом радиальной диффузии в агарозном геле с тест-культурой микроорганизма и методом двукратных серийных разведений антибиотика в жидкой питательной среде LB. Для определения антимикробной активности использовали культуры следующих микроорганизмов: грамотрицательные бактерии Escherichia coli ML-35p, Pseudomonas putida 1-97 и Agrobacterium tumefaciens A281; грамположительные бактерии Listeria monocytogenes EGD, Bacillus megaterium VKM41 и Micrococcus luteus В1314; дрожжеподобный грибок Candida albicans 820; фитопатогенные грибки Fusarium solani VKM F-142, Fusarium oxysporum TCXA-4, Aspergillus niger VKM F-2259, Aspergillus versicolor VKM F-1114, Botrytis cirenea VKM F-85 и Neurospora crassa VKM F-184. Минимальные ингибирующие концентрации (МИК) определяли в трёх независимых экспериментах. Результаты тестирования представлены в таблице 1. Показано, что ареницин обладает широким спектром антимикробного действия и ингибируют рост всех исследованных тест-микроорганизмов. Наиболее выраженную активность ареницин проявляет в отношении грамположительных бактерий. Для таких тест-культур, как Listeria monocytogenes EGD, Bacillus megaterium VKM41 и Micrococcus luteus B1314, МИК находится в диапазоне концентраций 0,6-2,6 мкг/мл.

Таблица 1. Спектр антимикробной активности ареницина.

Тест-культуры микроорганизмов МИК (мкг/мл)*

Грамположительные бактерии

Listeria monocytogenes EGD 0,6

Bacillus megaterium VKM41 2,6

Micrococcus luteus B1314 2,6

Грамотрицательные бактерии

Escherichia coli ML-35p 4,0

Agrobacterium tumefaciens A281 5,0

Pseudomonas putida 1-97 ЗД

Грибки

Candida albicans 820 4,5

Botrytis cirenea VKM F-85 12,5

Neurospora crassa VKM F-184 12,5

Fusarium solani VKM F-142 25,0

Aspergillus versicolor VKM F-l 114 25,0

Aspergillus niger VKM F-2259 100,0

Fusarium oxysporum TCXA-4 100,0

Ареницин также подавляет рост грамотрицательных бактерий Escherichia coli ML-35p, Pseudomonas putida 1-97 и Agrobacterium tumefaciens 281, а также дрожжеподобного грибка Candida albicans 820. МИКдля этих культур не превышает 5 мкг/мл. Ареницин ингибирует прорастание спор и созревание всех исследованных фитопатогенных грибков. Наиболее чувствительными к ареницину грибковыми культурами являются Neurospora crassa VKM F-184 и Botrytis cinerea VKM F-85, для которых МИК не превышает 12,5 мкг/мл. Существенных различий в антимикробной активности ареницина-1 и ареницина-2 также не наблюдается. Установлено, что МИК природного и рекомбинантного ареницинов достоверно не различаются.

1.4. Биотехнологическое получение аналогов ареницина, меченных стабильными изотопами гзС и 1SN.

Экспрессия меченых аналогов ареницина проводилась с использованием штамма E.coli BL21(DE3), трансформированного плазмидой pET-His8-TrxL-Ar2. Для наработки плазмидной ДНК использовался штамм Е. coli DH-10B (RecA-). Полученными препаратами плазмиды были трансформированы компетентные клетки Е. coli BL21 (DE3), приготовленные стандартным кальциевым методом. Трансформанты выращивались на чашках с агаризованной средой LB, содержащей ампициллин. Для подавления базальной экспрессии гибридного белка в питательную среду добавлялось 0,5% глюкозы. Клетки клонов, отобранных для экспрессии, выращивались в 100 мл жидкой среды LB, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,5% глюкозы при 37°С и 250 об/мин в течение 16 часов.

По окончании инкубации оптическая плотность клеточной культуры СЮ6оо составляла 2,0-3,0 ед. Клеточную массу собирали центрифугированием при 2000 об/мин и трижды отмывали физиологическим раствором ЫаС1 от остатков богатой питательной среды. Для препаративной экспрессии ареницина, меченного стабильными изотопами, полученной клеточной массой засевали 1-2 л бедной питательной среды М9, включающей 13С6-меченую глюкозу и/или 1!М-меченый хлорид аммония. Экспрессия проводилась при температуре 30°С и индукции ИПТГ в концентрации 0,2-0,5 мМ в течение 18 часов. Клеточный осадок получали центрифугированием, после чего клетки ресуспендировали и подвергали обработке ультразвуком. Нерастворимую фракцию клеточного белка (тельца включения) отделяли центрифугированием. Осадок растворяли в фосфатном буфере, содержащем 6М гуанидин-гидрохлорид и 10 мМ имидазола (рН 7,7). Раствор подвергали металло-хелатной очистке на №-ЭТА агарозе в указанном буфере, элюируя белок повышением концентрации имидазола до 500 мМ. Компоненты буфера удаляли с помощью диализа против воды через мембрану с размером пор 14 кДа. Выпавший в осадок гибридный белок высушивали, взвешивали и перерастворяли в 80% растворе ТФУ в концентрации 5%. Целевой пептид получали с помощью расщепления гибридного белка бромцианом при 100-кратном молярном избытке последнего в течение 16 часов. Летучие компоненты реакционной смеси удаляли путем упаривания в вакууме. Тонкая очистка ареницина осуществлялась с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ в градиенте концентрации ацетонитрила.

Идентификацию целевого пептида и оценку чистоты полученного препарата проводили с помощью электрофореза в полиакриламидном геле и времяпролётной МАЛДИ масс-спектрометрии. Экспериментально полученные значения молекулярных масс 15Ы-меченого и 13С,'^-меченого ареницина-2 с высокой точностью совпадали с расчётными, составляющими 2812,5 и 2939,5 Да, соответственно. 15>1- и 13С,15М-Меченые аналоги ареницина-2 были охарактеризованы также методом ЯМР-спектроскопии. Было установлено, что препараты имеют высокую степень обогащения стабильными изотопами (более 98% для и более 95% для С). Разработанная схема гетерологичной экспрессии и очистки аналогов ареницина, меченных стабильными изотопами, позволила получить эти пептиды для проведения дальнейших исследований методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии. Использование изотопно-меченых аналогов ареницина позволило детально исследовать динамику основной и боковых цепей пептида в водном окружении.

1.5. Исследование физико-химических свойств ареницина.

Физико-химическое исследование ареницина проводилось в лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН (с.н.с. З.О.Шенкарёв, зав. лаб. проф. А.С.Арсеньев). Используя рекомбинантные аналоги ареницина, методами ЯМР-спектроскопии была определена пространственная структура ареницина-2 в водном растворе (рис. 5). Было показано, что молекула ареницина-2 представляет собой протяженную р-шпильку, на конце которой находится р-поворот Г типа (остатки Ие10-Уа113). Методами 'Н,13С,15Ы-ЯМР-спектроскопии была исследована пространственная структура ареницина в растворе мицелл ОРС, моделирующих мембранное окружение. Показано, что пептид формирует параллельные симметричные димеры путем

ассоциации Ы-концевых р-тяжей (СЫТТИС) (рис. 6). Установлено, что пептид при взаимодействии с мицеллой ОРС и димеризации сохраняет структуру Р-шпильки, однако ее скрученность значительно уменьшается, и тип р-поворота изменяется с Г на IV.

Рис. 5. Пространственная структура ареницина-2 в водном растворе

1*49

1*48

И48

У43 V Й49

К18

180°

Н18

Рис. 6. Пространственная структура димера ареницина в мицеллах ОРС.

Методом КД-спектроскопии также было показано, что при связывании с поверхностью мицелл детергентов (ОРС, 808) происходит изменение конформации пептида. С использованием метода КД-спектроскопии было проведено исследование взаимодействия ареницина-2 с липидными везикулами различного состава. Для исследования использовались как нейтральные моноламеллярные липосомы (РОРС), моделирующие мембраны эукариотических клеток, так и отрицательно заряженные липосомы (РОРЕ/РОРО), моделирующие мембраны бактериальных клеток. Было установлено, что ареницин-2 эффективно взаимодействует с заряженными мембранами, но практически не взаимодействует с нейтральными мембранами. Полученные данные дают основания для предположения, что основной мишенью для антимикробного действия ареницинов является клеточная мембрана.

1.6. Модель антибиотического действия ареницина.

На основании полученных результатов совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМР-спектроскопии предложена модель антибиотического действия пептида, в рамках которой действие пептида опосредовано образованием олигомерных р-структурных пор в мембране клетки-мишени (рис. 7).

Согласно предложенной модели механизм действия пептида включает несколько этапов.

1) Молекулы ареницина, несущие положительный заряд (+6), в конформации скрученной р-шпильки приближаются к поверхности мембраны клетки. При контакте пептида с поверхностью мембраны происходит значительное уменьшение скрученности ¡3-шпилыси пептида с образованием димеров.

2) Димеры пептида претерпевают дальнейшую олигомеризацию на поверхности мембраны клетки с участием отрицательно заряженных липидных головок. Образуется так называемая «ковровая» структура. При увеличении концентрации пептидов в наружном монослое мембраны часть молекул пептида переходит в трансмембранное положение (длина р-шпильки ареницина > 30 ангстрем).

3) Трансмембранные олигомеры ареницина образуют пептид-липидные («тороидальные») поры в мембране. В образовании каждой поры участвуют как димеры пептида, так и головки отрицательно заряженных липидов, встроенные между ними. Полярные группы боковых цепей ареницина и головки липидов выстилают внутренность поры, а гидрофобные участки димеров контактируют с липидными хвостами окружающей мембраны. Образование «тороидальных» пор ведет к лизису и гибели бактериальной клетки.

2. Исследование антимикробного пептида аурелииа из мезоглеи сцифоидной

медузы Aurelia aurita.

2.1. Определение первичной структуры аурелииа. Определение полной последовательности кДНК, кодирующей предшественник аурелииа, и соответствующей ей полной аминокислотной последовательности препроаурелина.

Новый антимикробный пептид аурелин с молекулярной массой 4296,95 Да был выделен из мезоглеи медузы Aurelia aurita [тип - кишечнополостные (Cnidaria), класс - сцифоидные (Scyphozoa)] с помощью препаративного гель-электрофореза и обращенно-фазовой ВЭЖХ и предоставлен для исследований лабораторией общей

Рис. 7. Модель антибиотического действия ареницина.

патологии Института экспериментальной медицины РАМН (зав. лаб. проф. В.Н.Кокряков).

Определение числа остатков цистеина проводилось путем их химической модификации с помощью 4-винилпиридина по методике, описанной в разделе 1.1. Масс-спектрометрический анализ полученного S-пиридилэтилированного производного восстановленного аурелина выявил молекулярный ион с m/z 4926,15, соответствующим возрастанию молекулярной массы на 629,2 Да, что свидетельствует о наличии в аурелине шести остатков цистеина, образующих 3 дисульфидные связи. Для определения N-концевой аминокислотной последовательности аурелина применяли автоматическое микросеквенирование на приборе Precise 491 cLC Protein Sequencing System (Applied Biosystems, США). Идентификацию фенилтиогидантоиновых производных аминокислот проводили на анализаторе 120А РТН Analyzer (Applied Biosystems, США). В результате автоматического микросеквенирования аурелина и его S-пиридилэтилированного производного была установлена его частичная аминокислотная последовательность (35 остатков), включая локализацию остатков цистеина.

Для установления полной первичной структуры предшественника аурелина была выделена суммарная РНК из мезоглеи медузы Aurelia aurita с использованием колонки Spin (Promega, США). Амплификация З'-концевого участка кДНК аурелина по описанной в разделе 1.1 методике не позволила получить искомый фрагмент в одну стадию ОТ-ПЦР ввиду низкого содержания соответствующей мРНК в тканях медузы. Продукты RACE были успешно реамплифицированы с внутренними ген-специфическими праймерами методом «полугнездовой» ПЦР. Секвенирование клонированных фрагментов длиной около 300 п.н. показало, что они содержали последовательность, кодирующую С-концевую область зрелого аурелина, и область З'-UTR. Дальнейшие эксперименты по амплификации и секвенированию 5'-концевой области кДНК позволили установить полную структуру транскрипта длиной около 500 п.н. (рис. 8). Анализ нуклеотидной последовательности показал наличие открытой рамки считывания, кодирующей предшественник антимикробного пептида аурелина, состоящий из 84 аминокислотных остатков. Зрелый пептид длиной 40 аминокислотных остатков локализован в С-концевой области предшественника непосредственно за последовательностью Arg-Ser-Arg-Arg, представляющей собой типичный сайт протеолиза для конвертаз семейства фурина. С помощью программы SignalP 3.0 была определена вероятная N-концевая сигнальная последовательность, отщепляемая при гидролизе связи А1а22 - Glu23.

Результаты секвенирования нуклеотидной последовательности кДНК предшественника аурелина подтвердили наличие в структуре зрелого пептида шести остатков цистеина. Уникальный порядок расположения остатков цистеина в аурелине отличает его от всех других семейств цистеин-содержащих АМП (табл. 2). Его ближайшими гомологами в настоящее время можно считать группу токсинов из яда морских анемон (класс Anthozoa, тип Coelenterata), блокирующих калий-селективные каналы нервных клеток.

1 ЗЗТАСААССА САТСАОвОТС ТОСАТАААОТ САСЗТТСАСА САЗТСАСТЗЗ САААСТОАТС АТАТТКСААС АТООСТТбТТ

•г ■FKVt.Vl.FAAI LCMSLi.VCAEDEVNl.QA

• 2 (Э1Е Е 0РМЕА 1 ЯЗПИААСЗОЯАНВН 1 С Е

161 САААТТЗААЗ ААввАССТАТ ввА1ШСААТТ СвАТССАвАС йВ'^^к'гЫ.иЛ^^к'^Д^Д^^сЫ^а^^Л'^.Т^Л^ц^^)!

• 2 11 н 12 (р**мппифик*ция продуктов З'-ЯДСЕ] •Е 8 Р К 2 Р С К О Э б Я N СЗ V К 1 Я А N С КК Т С б 1 С-

241 |ААвСТТТААв АСГТТТТССА ААбАТТСАвв АСвСААСввА ОТААААСТвА ввбСАААТТв СААвААААСА ТССССАТТАТ|

• 2 321 С • «пи»^м*гньнк1И оигн«л ро1цА ШгААЗЗЗАТ АТТвбАААТТ САЗАЗЗАСТУ ТЗАТЗАЗСАА АЗСААССАТЗ АААТАААЗТА АСТЗТТАЗЗА ААЗЗЗААААв

*'*'**' 62(реамП|П1»фИК4ин'я продукта 5ЯАСЕ)........ ........——........- 53..................-•■--—.....

сигналы ро!уА

401 АААТТТАвСА ЗАТЗСААОТЗ СТАЗССАСТв САТАТСАААТ АААТАААТАА АТАААТААСТ АААТЗТАСТС СЗААЗТАЗТТ

481 ААТЗААТЗАА АТАСССАААА АААААААААА АААААААААА АААААА

Рис.8. Полная последовательность кДНК, кодирующая предшественник антимикробного пептида аурелина из А.аигНа, и соответствующая ей аминокислотная последовательность препроаурелина. Участки транслируемой области, кодирующие отдельные функциональные домены предшественника, выделены цветом: темно-серым - сигнальный пептид, светлосерым - продомен, черным - зрелый пептид. Показаны сайты отжига праймеров, использованных для амплификации концов кДНК, а также сигналы полиаденилирования.

Перечень структур, гомологичных аурелину, не ограничивается токсинами морских анемон. Близкий по структуре гексацистеиновый мотив с неизвестной функцией, обозначаемый в разных источниках как домен NC6, SXC, Toxi или ShKT, был идентифицирован в ряде белков позвоночных и беспозвоночных животных. Мотив присутствует главным образом в секретируемых муцин-подобных гликопротеинах и некоторых ферментах (астацин-подобных металлопротеиназах, тирозиназах, миелопероксидазах). Предполагается, что домен может участвовать во взаимодействиях внеклеточных белков и играть роль лиганда в опосредованной м'ембранными рецепторами передаче сигналов внутрь клетки.

Таблица 2. Расположение шести консервативных остатков цистеина в последовательности аурелина, некоторых антимикробных пептидов и токсинов.

Число аминокислотных остатков,

разделяющих консервативные

остатки цистеина

С1-С2 С2-СЗ СЗ-С4 С4-С5 С5-С6

Аурелин (медуза) 8 6 13 3 2

Токсины группы БЬК (морские анемоны) 6-8 4-8 8-10 3 2-3

Харибдотоксин А (скорпион) 5 3 10 4 1

Дефенсины беспозвоночных 5-16 3 9-10 4-7 1

а-Дефенсины (млекопитающие) 1 3-1 9 6-10 0

Р-Дефенсины (млекопитающие, птицы) 4-8 3-5 9-13 4-7 0

АЭЛВР* (круглые черви) 15 3 9 8 1

Митилин А* (мидии) 3 3 16 1 1

Митицин А* (мидии) 4 3 9 8 1

Термицин* (термиты) 4 3 12 4 1

Гелиомицин* (бабочка) 10 3 9 7 1

Дрозомицин* (муха) 7 3 9 5 1

Скорпин* (скорпион) 9 3 8 4 1

Бутинин* (скорпион) 5 3 6 5 1

Тахистатины (мечехвост) 6 7, 11 0 4 4, 11

Пенеидины (креветки) 1-3 10 0 5 0

Микроплюзин (клещ) 12 21 4 5 27

* Дефенсин-подобные антимикробные пептиды

Наиболее консервативной областью домена является фрагмент между С4 и С6, включающий диаду Lys-Thr непосредственно перед С5. Остаток Lys из этой диады участвует в стабилизации домена, электростатически взаимодействуя с консервативным остатком Asp, находящимся в положении -2 относительно Cl (рис. 9). Более детальный анализ позволил выявить наличие в последовательности аурелина двух консервативных остатков, играющих ключевую роль в функционировании ShK-подобных токсинов. Способность токсинов избирательно блокировать ионные каналы зависит от присутствия и пространственной локализации определенных молекулярных детерминант.

Сканирование аланином последовательностей токсинов ShK и BgK позволило установить сайты связывания этих молекул с потенциал-зависимыми калиевыми каналами. Было показано, что решающую роль в этом взаимодействии играет функциональная диада Lys-Tyr, расположенная на участке С4-С5. В структуре аурелина сохраняется главный компонент диады - остаток Lys, однако в роли его партнера выступает не Туг, а остаток Leu (рис. 9). Похожая картина наблюдается у метридина, токсина из анемоны Metridium senile, в молекуле которого функцию второго остатка выполняет Val. Известно также, что аминокислотная замена Tyr/Leu в диаде токсинов ShK и BgK не приводит к потере их блокирующей активности.

Пептид n — ** — 1 п — Pi

Метридин bsjj С ¡g:,¡2 -с gëyI g-gsf С @l|-----¡ ¡gvg sn- С ш т с GV0 С 8,29

АеК ¡ge:: ГС ;ant с jgHvBí nun с-gs - —q0yatn - с aBt С g-j S с 9,08

AsKS С JdnfaaatTc gHV gEN^N С -gs----q Hyatn- С a¡J т с g-0 С 9,06

BgK —V с ¡IWE^Jtac |ha ¡slgn с §ts----q S'S an- с А| т с |l- с 9,13

HmK -St с ¡dlmpvslj С t|i ! с Sts----m ||yS lnl с rk т с gs- с 9,15

ShK -gs с ; dt : ; gs§ с taf ----q с ян s----M lag lsf с rk т с gt- с 9,55

Аурелин -RA с slgAHGHIС |se] sf с SiSG|gNGV| g * an- с кк т с GL- С 9,13

_ _ _ L

Рис. 9. Сравнение аурелина и токсинов из яда морских анемон. В рамки заключены консервативные остатки цистеина; звездочками отмечено положение функциональной диады; черным цветом выделены основные остатки, серым - кислые; знаками «+» и «-» обозначены взаимодействующие остатки Lys и Asp.

Препроаурелин имеет типичное для предшественников многих АМП строение: вслед за сигнальным пептидом, несущим положительный заряд на М-конце, следуют анионный продомен и зрелый катионный пептид, отщепляемый по сайту из сдвоенных основных остатков (рис. 10). Сходными структурными чертами обладает предшественник НтК - единственного токсина этого семейства, последовательность кДНК которого была депонирована в ОепВапк. Гомология предшественников токсина НтК и аурелина наблюдается лишь в области зрелых пептидов, в то время как сходство сигнальных участков и продоменов ограничивается распределением заряженных и гидрофобных остатков.

Структурное сходство аурелина с пептидами из морских анемон наводит на мысль о вероятной способности этого пептида блокировать ионные каналы. В настоящее время известен ряд фактов гомологии и функционального сходства АМП и пептидных токсинов. Наиболее убедительным объяснением такого сходства служит гипотеза о существовании общих эволюционных предшественников у представителей именно этих классов пептидов и дивергентной эволюции этих молекул.

Сигнальный ПРПТИ/I Продомен Зрелый пептид

AurAP mgcfJvlvlfaailcmsllv EDÉVNI.QAQ IEEGPKEAI Jí 03 AACSCflAHGH 1CÍS F^S FcjDSG^NGvjLjANC^TCGLC

HmK mJsqmiaavlliafclcvw J'.ELODVEDXENG FQQ jTcjDLMPVSjÉCTDlJcjTSífl'íjLNLcJ[TCGSC

SIIIA mmsJlgvlltvcpllfplta lppdgdqpae^paeJmqddissdehplfl^J qnccnggcss^wcJdhaJccc-J

AaDef mJsitvicflalctvaitsa vpqIpvladeaJpfanslfdelpeetyqaavehi-JlHI atcellsgfgvgIsacaahcií^gnJggycns^vcvcIn

HNP-1 мЩт LAILAAILLVALQAQA EPLQ/^ADEVAAAFEQIAADIPEVWSLAKDESLApjHPr.K^KK AC YC JI PAC I age^ ygtc iyqgJlwafcc

hBD-1 1^TSYLLLFTLCLLLS§MAS gnfltglghJs iHYNCVSSGGQCLYSACPIFTjlQGTCYjG^P^Ccj

BR1E MFTL^SMLLLFFLGTINLS eeeJdadeeeQJdnpíjeseveve^ flpllaglaanflpJi:

Рис.10. Сравнение структур препроаурелина и предшественников некоторых токсинов и антимикробных пептидов. Черным цветом выделены основные остатки, серым - кислые. AurAP - препроаурелин; НтК. - токсин из актинии Heteractis magnifica (ААВ97830); SIIIA - ц-конотоксин SIIIA из моллюска Conus striatus (Q86DU6); AaDef- дефенсин А из москита Aedes aegypti (Р91793); HNP-1 - а-дефенсин человека (P59665);hBD-l - Р-дефенсин человека (Р60022); BR1E - бревинин-1Е из лягушки Rana esculenta (Р32412).

2.2 Гетерологичная экспрессия и очистка аурелина.

Штамм-продуцент гибридного белка His8-TrxL-Aur, содержащего последовательность целевого пептида аурелина, был получен путем трансформации препаратом векторной ДНК pET-His8-TrxL-Aur (рис. 11) компетентных клеток Е. coli и отбора клонов, обладающих способностью экспрессировать рекомбинантный белок. В качестве родительского штамма для создания штамма-продуцента использовали E.coli BL21(DE3). Преимущество использования данного штамма в качестве основы для создания штамма-продуцента состоит в том, что BL21 (DE3) обладает фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого гибридного белка и загрязнения препарата наиболее активными протеазами Е. coli. В хромосомную ДНК BL21(DE3) интегрирован ген Т7-РНК полимеразы, который совместно с Т7 промотором и Т7 терминатором в плазмиде рЕТ-His8-TrxL-Aur обеспечивает продукцию гибридного белка клетками Е. coli при индукции изопропилтио-р-О-галактозидом или лактозой. Базальная экспрессия (до момента добавления индуктора) Т7 РНК-полимеразы и гибридного белка His8-TrxL-Aur поддерживается на минимальном уровне благодаря наличию системы контроля на основе 1ас-операторов и генов lac-penpeccopa, присутствующих как в плазмиде рЕТ-His8-TrxL-Aur, так и в хромосоме нггамма-продуцента.

Рис. 11. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pET-His8-TrxL-Aur. CoIEl origin - участок инициации репликации плазмиды; fl origin - участок инициации репликации

бактериофага fl; Ыа - ген устойчивости к р-лактамным антибиотикам; lacl - ген lac-ингибитора; Т71ас promoter -промотор транскрипции

бактериофага Т7 с lac-оператором; Т7 terminator -терминатор транскрипции;

His8-TrxL-Aur - ген гибридного белка, содержащего аурелин.

Препаратами плазмиды были трансформированы компетентные клетки Е. coli BL21 (DE3), приготовленные стандартным кальциевым методом. Трансформанты выращивали при температуре 37°С на чашках с агаризованной средой LB, содержащей 50 мкг/мл ампициллина. Для подавления базальной экспрессии гибридного белка в питательную среду добавляли 0,5 % глюкозы.

Т7 Promoter

BffllI

lac operator

pBR322

t'36) terminator

Препаративную экспрессию гибридного белка His8-TrxL-Aur проводили при температуре 30°С. Индукцию осуществляли путем добавления изопропилтио-p-D-галактозида до концентрации 0,2 мМ. Плотность культуры (OD6rj0) в момент добавления индуктора составляла 0,6, конечная плотность после инкубации в течение 4,5 часов - 1,8. Клеточный осадок отделяли центрифугированием, ресуспендировали и подвергали ультразвуковой обработке. Растворимую фракцию клеточного белка получали центрифугированием и разделяли с помощью металло-хелатной хроматографии на Ni-NTA. Целевой пептид получали в результате расщепления гибридного белка бромцианом. Продукты расщепления повторно пропускали через металло-хелатную колонку. Целевой пептид подвергали тонкой очистке методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход пептида в пересчете на 1л клеточной культуры составил 10 мг.

Идентичность рекомбинантного и природного аурелина устанавливали методами ПААГ-электрофореза в денатурирующих условиях, времяпролётной МАЛДИ масс-спектрометрии, автоматическим микросеквенированием N-концевой аминокислотной последовательности по методу Эдмана, тестированием антимикробной активности. Полученный препарат антимикробного пептида аурелина был проанализирован методом 'Н-ЯМР спектроскопии. Анализ спектров ЯМР позволил установить, что пептид имеет жесткую пространственную структуру, и чистота препаратов рекомбинантного аурелина составляет не менее 98%.

2.3. Антимикробная активность аурелина.

Антимикробную активность аурелина определяли методом радиальной диффузии в агарозном геле в отношении тест-культур бактерий Bacillus megaterium VKM41, Staphylococcus aureus 209p, Micrococcus luteus B1314. Антимикробное действие пептида определяли по диаметру зон ингибирования роста тест-культуры. Результаты тестирования активности рекомбинантного аурелина представлены в таблице 3.

Таблица 3. Антимикробная активность рекомбинантного аурелина.

Количество пептида (мкг на лунку) Диаметр зоны ингибирования роста тест-культуры в концентрациях 105 КОЕ/мл, мм (±0,5 мм)

Micrococcus luteus Bacillus megaterium Staphylococcus aureus

20,0 10,0 12,0 4,5

10,0 7,0 10,5 3,5

5,0 6,5 9,5 3,0

Показано, что аурелин в количестве 5 мкг/лунку проявляет антимикробную активность и ингибирует рост всех тестируемых бактерий. Наиболее чувствительной к пептиду культурой является В. megaterium. Активность рекомбинантного аурелина совпадает в пределах погрешности измерения с активностью природного пептида.

2.4. Биотехнологическое получение аурелина, меченного стабильным изотопом 151Ч, для изучения его пространственной структуры методом гетероядерной 'Н,'\\- ЯМР -спектроскопии.

Аурелин, тотально меченный стабильным изотопом |51Ч, был получен по методике, описанной в разделе 1.4, с использованием плазмиды рЕ-Швв-ТгхЬ-Аиг путем культивирования штамма Е.соИ ВЬ21(Т)ЕЗ), трансформированного данной плазмидой, на бедной питательной среде М9, содержащей '^ЕЦС! в качестве единственного источника азота. С использованием образов немеченого и |5Ы-меченого рекомбинантных аналогов аурелина в лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН (с.н.с. З.О.Шенкарёв, зав. лаб. проф. А.С.Арсеньев) была изучена пространственная структура пептида в водном растворе.

Рис 12. Пространственная структура аурелина в воде. Красным цветом отмечены отрицательно заряженные остатки (Asp5, Glul3, Asp21), синим -положительно заряженные (Arg6, His8, HislO, Lys 16, Lys20, Arg24, Lys28, Arg30, Lys34, Lys35). Структура имеет в своем составе две а-спирали (остатки 10-14 и 24-32 - выделено красным) и одну Зщ-спираль (остатки 17-20 - выделено бирюзовым). Оранжевым цветом выделены дисульфидные связи (Cys3-Cys40, Cysl2-Cys33, Cysl9-Cys37). Водородная связь HN Thr36 - О81 Asp5 обозначена пунктирной линией.

Показано, что пространственная структура аурелина представляет собой небольшую глобулу с двумя а-спиралями (остатки 10-14 и 24-32) и одной Зю-спиралью (остатки 17-20). Структура стабилизирована тремя дисульфидными, 17 водородными связями между атомами основной цепи и одной водородной связью между HN Thr36 и О51 Asp5 (рис. 12). Анализ структуры аурелина указывает на амфифильность молекулы пептида. На поверхности наблюдается небольшой гидрофобный регион, образованный боковыми группами остатков Ilell, Phel5, Phel8. Наличием гидрофобного региона и окружающих его положительно заряженных остатков может быть обусловлено сродство пептида к мембранам бактериальных клеток, содержащим анионные липиды.

3. Биотехнологическое получение буфорина-2 из пищеварительного тракта дальневосточной жабы Bufo bufo gargarisans.

3.1. Гетерологичная экспрессия и очистка буфорина-2.

Одним из перспективных для клинического применения АМП является буфорин-2, впервые выделенный из пищеварительного тракта дальневосточной жабы Bufo bufo gargarisans (Park C.B. et al., 1996). Буфорин-2 является фрагментом N-концевой части гистона Н2А. Размер пептида составляет 21 аминокислотный остаток (TRSSRAGLQFPVGRVHRLLRK, молекулярная масса 2434,4 Да). Пептид обладает широким спектром бактерицидного и фунгицидного действия, механизм которого, согласно последним исследованиям, состоит в образовании нестабильных тороидальных пор, быстрой транслокации антибиотика через мембрану и последующем связывании с нуклеиновыми кислотами. Минимальные ингибирующие концентрации буфорина-2 находятся в диапазоне 0,4-1,5 мкМ, причем в данных концентрациях пептид не проявляет гемолитической активности. Ранее в экспериментах на животных моделях было показано, что буфорин-2 способствует снижению концентрации бактериального эндотоксина и фактора некроза опухолей TNF-a в плазме крови, препятствуя, таким образом, развитию септического шока. При совместном применении буфорина-2 с традиционными антибиотиками наблюдается явление синергизма. Так, буфорин-2 в комбинации с цефазолином эффективен против метициллин-устойчивых штаммов Staphylococcus epidermidis, вызывающих серьезные инфекционные осложнения при трансплантации сосудов. Существующие системы экспрессии буфорина-2 в виде тандемных мультимеров (Lee J.H. et al., 2002) или в виде гибридного белка с фрагментом амидотрансферазы PurF (Руо S.H. et al., 2004) позволяют получить буфорин-2, несущий дополнительный С-концевой остаток гомосерина или N-концевой остаток глицина.

В ходе выполнения данной работы была создана генетическая конструкция для гетерологичной экспрессии буфорина-2, разработана эффективная технология получения и очистки генно-инженерного буфорина-2, полностью идентичного природному пептиду. Для получения генно-инженерного буфорина-2 была выбрана система BL-21(DE3)/pET-KSI-Buf2. Конструирование плазмидной ДНК pET-KSI-Bui2 (рис. 13), экспрессирующей гибридный белок KSI-Buf2, осуществляли на основе большого фрагмента Bglll-Xhol плазмиды рЕТ20Ь(+). Искусственный ген, кодирующий модифицированную кетостероидизомеразу (KSI) и буфорин-2, фланкированный сайтами рестриктаз Bglll и Xhol, получали химическим синтезом набора олигонуклеотидных фрагментов с последующей их сборкой и амплификацией при помощи ПЦР. Матрицей для амплификации последовательности KSI служила плазмида рЕТ-31Ь(+). Перед лигированием для получения липких концов очищенный ампликон и векторную плазмиду обрабатывали рестриктазами Bglll и Xhol.

¡¡gl и (2) T7 Promoter

Ma I (77)

Рис. 13. Физическая карта рекомбинангной плазмиды рЕТ-KSI-Bu£2. Bglll, Xbal, Ndel, PstI, Xhol - сайты рестрикции; pBR322 Ori - участок инициации репликации плазмиды pBR322; fl origin - участок инициации репликации бактериофага fl; Ыа - ген устойчивости к р-лактамным антибиотикам; Т7

Ше 1(117)

KSI-Buf2

Pst I (522) Xho I (578)

T7 terminator

PBR322 Ori

f1 origin

promoter

промотор

Ыа

Pst I (1884)

транскрипции; T7 terminator -терминатор транскрипции; KSI-Bu£2 - последовательность, кодирующая гибридный белок.

Продуктами лигазной реакции трансформировали компетентные клетки штамма Е. coli DH-10B с выключенной системой рекомбинации и рестрикции ДНК. Отбор положительных клонов проводили при помощи ПЦР с использованием специфических праймеров и последующим рестриктным анализом выделенной плазмидной ДНК. Структуру гена, кодирующего гибридный белок, содержащий буфорин-2, определяли секвенированием по методу Сэнгера.

Для получения штамма-продуцента гибридного белка KSI-Buf2 плазмидной ДНК pET-KSI-Buf2 трансформировали компетентные клетки Е. coli BL21(DE3) и проводили отбор клонов, обладающих способностью экспрессировать рекомбинантный белок. Устойчивость к ампициллину была обусловлена наличием в плазмиде pET-KSI-Buf2 гена ß-лактамазы {Ыа). Преимущества штамма Е. coli BL21 (DE3) в качестве основы для создания штамма-продуцента заключаются в использовании бактерий с фенотипом Lon OmpT, что исключает возможность протеолитического расщепления синтезируемого рекомбинантного белка и загрязнения препарата наиболее активными протеазами Е. coli. В хромосомную ДНК BL21(DE3) интегрирован ген Т7-РНК полимеразы, что, совместно с использованием Т7 промотора и Т7 терминатора в плазмиде pET-KSI-Bufi, обеспечивает быструю и эффективную продукцию белка клетками Е. coli при индукции изопропилтио-ß-D-галактозидом или лактозой. Клетки Е. coli BL21(DE3)/pE-KSI-Buf2 являются суперпродуцентом. При индукции изопропилтио-р-О-галактозидом происходит эффективный биосинтез гибридного белка KSI-Buß, содержащего буфорин-2, который накапливается в клетках в количестве 50-70% от суммарного белка бактерии. Клетки штамма Е. coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2 выращивали в среде LB с добавлением 100-200 мкг/мл ампициллина до достижения культурой оптической плотности СШ6оо 0,5-1,0 при температуре 37°С, ступенчато увеличивая объем культуральной жидкости путем последовательных пересевов материала, после чего индуцировали синтез белка изопропил-р-О-галактозидом и растили еще 6 часов при температуре 25-37°С.

Увеличение выхода рекомбинантного достигалось с помощью принудительной аэрации культуралыюй жидкости и использования обогащенных питательных сред (например, с добавлением глюкозы).

Выделение антимикробного пептида буфорина-2 из клеток продуцента включало следующие стадии: центрифугирование, ультразвуковая дезинтеграция клеток, отмывка и солюбилизация телец включения, обработка полученного гибридного белка бромцианом, разделение продуктов реакции, очистка целевого пептида методом обращенно-фазовой ВЭЖХ. Молекулярная масса полученного пептида, определенная методом времяпролётной МАЛДИ масс-спектрометрии, соответствовала расчётной массе буфорина-2. Чистота препарата подтверждалась с помощью времяпролётной МАЛДИ масс-спектрометрии и электрофореза в ПААГ в присутствии SDS. Созданная конструкция pET-KSI-Buf2 позволяет с помощью одной стадии хроматографической очистки получать полностью идентичный природному буфорин-2 в количестве 5-10 мг/л культуры.

3.2. Антимикробная активность генно-инженерного буфорина-2.

Антимикробная активность генно-инженерного буфорина-2 определялась методом радиальной диффузии в агарозном геле со следующими тест-культурами: Escherichia coli С600, Bacillus subtilis LI, Staphylococcus aureus 209р. Результаты тестирования активности буфорина-2 после 21ч инкубации представлены в таблице 4.

Таблица 4. Антимикробная активность генно-инженерного буфорина-2.

Количество пептида (мкг на лунку) Диаметр зоны ингибирования роста тест-культуры, мм (±0,5 мм)

Escherichia coli Bacillus subtilis Staphylococcus

С600 LI aureus 209p

20,0 12,5 11,5 6,5

10,0 11,0 10,5 5,0

5,0 9,0 9,5 4,0

2,5 8,5 8,5 3,5

1,25 7,0 7,5 3,0

4. Поиск, выделение и структурио-функциональная характеристика нового дефенсина из проросших семян чечевицы Lens culinaris.

Известно, что растения обладают сложной системой защитных механизмов, к которым относятся гиперчувствительный ответ, утолщение клеточной стенки, повышение концентрации фитогормонов, обеспечение локальной и системной резистентности, в том числе путем синтеза белков, связанных с патогенезом (Pathogenesis-Related Proteins или сокращенно PRP), а также вторичных метаболитов, обладающих антимикробным действием. PRP растений являются стресс-индуцируемыми белками, синтезируемыми только в ответ на воздействие неблагоприятных факторов, таких как присутствие фитопатогенов, дефицит влаги,

механическое повреждение, изменение температуры или обработка химическими агентами. Растения синтезируют большое число различных PRP, которые подразделяются на 17 классов. Активация синтеза PRP происходит под воздействием неблагоприятных абиотических и биотических факторов окружающей среды. Аналогичный эффект наблюдается при прорастании семени, когда нарушается целостность кожуры, являющейся эффективным физическим барьером, и молодой проросток оказывается в среде, густо населенной микроорганизмами. В настоящей работе был проведен поиск новых защитных белков и пептидов в проросших семенах чечевицы. Фракционирование суммарного белкового препарата, полученного в результате гомогенизации проросших семян чечевицы, проводилось методами гель-фильтрации, ионообменной и обращенно-фазовой хроматографии.

4.1. Поиск, выделение и определение структуры нового дефенсина Lc-def.

Дефенсин чечевицы, названный Lc-def, был обнаружен и выделен в результате двухстадийного разделения объединенных фракций, полученных после гель-фильтрации и содержащих белки с Mr 3-6 кДа. Катионообменную хроматографию проводили на колонке Mono S. Масс-спектрометрический анализ выявил присутствие белка с m/z 5441,1. Дальнейшая очистка пептида осуществлялась с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Luna Ci8. Частичная N-концевая аминокислотная последовательность выделенного пептида

(KTXENLSDSFKGPXIPDGN-), установленная методом автоматического микросеквенирования, имела значительное сходство с соответствующими последовательностями дефенсинов бобовых растений. Выделенный дефенсин-подобный пептид, названный Lc-def, содержал 8 остатков цистеина, образующих четыре дисульфидные связи, что характерно для растительных дефенсинов. Число цистеиновых остатков и дисульфидных мостиков определяли, используя реакцию алкилирования белка 4-винилпиридином без предварительного восстановления дититреитолом и после него.

Для того, чтобы определить полную аминокислотную последовательность Lc-def, была выделена суммарная РНК, проведены обратная транскрипция и амплификация 3'- и 5'-концевых фрагментов кДНК. На первом этапе была проведена ПЦР с двумя вырожденными ген-специфическими праймерами, комплементарными консервативным участкам нуклеотидной последовательности дефенсинов бобовых растений. На втором этапе амплификацию проводили с ген-специфическим праймером, комплементарным фрагменту сигнального пептида предшественника Lc-def. На третьем этапе использовалась система вложенных праймеров, комплементарных З'-нетранслируемой области кДНК. Структура полноразмерной кДНК предшественника дефенсина была установлена путем сопоставления результатов секвенирования 3'- и 5'-концевых фрагментов. Установленная нуклеотидная последовательность, зарегистрированная нами в банке данных по нуклеотидным последовательностям GenBank под номером EF194158, включает в себя открытую рамку считывания длиной 222 п.н., кодирующую последовательность предшественника дефенсина чечевицы, состоящую из 74 аминокислотных остатков (рис. 14а).

ME KK TVAALSFLFIVL 1 catatcactacttaagccatggagaagaaaacagtagccgccttgtccttcctcttcatcgttctat 67

F V A Q E

праймер 5

A V T E А К T С E N L S D S F К

133

197

gcaggtgcagggatgattttcgctgctggtgcactagaaactgtj

праймер 6 праймер 9

264 acgacattatatatatgaataaatagatatattccttgclagtagccaggactgcatctgtatgctata 332

праймер 8

333 ctgcttcgttgtgaattatgtgtgtaatcaatatcgt

369

41-34)

IVII-M)

N11135-47)

\[3?-41)1 | \1\|41-|5;Х\\4(.-47)

KTCENLSDSFKGPCIPDGNCNKHCKEKEHLLSGRCRDDFRCWCTRNC

Л 111128-34)

IX(28-4(I)

Рис. 14. а. Последовательность кДНК, кодирующая предшественник Ьс-сМ, и соответствующая ей аминокислотная последовательность предефенсина чечевицы. Открытая рамка считывания включает сигнальный пептид (выделен светло-серым цветом) и зрелый белок (выделен черным цветом). Показаны сайты отжига праймеров, использованных для амплификации концов кДНК. б. Триптические фрагменты восстановленного Ьс-скГ Серым цветом выделены аминокислотные остатки, по которым проходило расщепление пептида.

Анализ аминокислотной последовательности, транслированной с кодирующей нуклеотидной последовательности, с помощью алгоритма SignalP v.3.0 (http://www.cbs. dtu.dk/semces/SignalP). показал высокую вероятность

наличия характерного для растительных дефенсинов сигнального пептида, отщепляемого по связи Ala27-Lys28 и состоящего из 27 аминокислотных остатков. Соответствие транслированной последовательности кДНК аминокислотной последовательности выделенного Lc-def было подтверждено путем проведения триптического гидролиза восстановленного белка. Рассчитанные с помощью программы Protean (DNASTAR) молекулярные массы триптических фрагментов дефенсина соответствовали массам фрагментов выделенного Lc-def, определенных методом времяпролётной МАЛДИ масс-спектрометрии (рис. 146).

В результате была установлена полная аминокислотная последовательность нового дефенсина Lc-def, которая была зарегистрирована в банке данных UNIPROT под номером Р85530, а также структура его предшественника.

Зрелый Lc-def состоит из 47 аминокислотных остатков и имеет расчётную молекулярную массу 5440,21 Да (EditSeq, DNASTAR), совпадение которой с экспериментальным значением m/z молекулярного иона свидетельствует об отсутствии посттрансляционных модификаций у дефенсина чечевицы.

В соответствии с существующей классификацией растительные дефенсины подразделяются на четыре группы с учетом особенностей их структурной организации и функциональной активности. Все четыре группы характеризуются наличием консервативных аминокислотных остатков. Однако структурные и функциональные характеристики некоторых дефенсинов растений не вписываются ни в одну четырех групп. Поиск в базах данных аминокислотных и нуклеотидных последовательностей ('http://vvvvvv.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi) показал, что структура выделенного нами полноразмерного дефенсина чечевицы Lc-def имеет наибольшее сходство с неклассифицированными дефенсинами из семян бобовых растений (рис. 15). Дефенсины бобовых растений обладают противогрибковой активностью и обеспечивают защиту трансгенных растений от фитопатогенных грибов, а также подавляют рост бактерий. Кроме того, они ингибируют обратную транскриптазу ВИЧ-1, обладают митогенным действием по отношению к спленоцитам мышей и антипролиферативной активностью в отношении опухолевых клеток.

Lens culinaris, Lc-def Pisum sativum, Psd2 Phaseolus vulgaris

Phaseolus llmensis, limenin Trigonella foenum-graecum, Tfgd: Pachyrrhizus erosus, SPE10 Vigna radiata

Vigria radiata, VrD2

Cicer arietinum

Medicago sativa, Msdefl

Рис. 15. Сравнение аминокислотных последовательностей Ес^еГ и других дефенсинов бобовых растений; %И - процент идентичных аминокислотных остатков. Серым цветом выделены консервативные аминокислотные остатки; звездочками отмечены остатки цистеина, расположенные консервативно. Характерная для дефенсинов бобовых растений аранжировка дисульфидных связей представлена в нижней части рисунка.

Высокая степень гомологии и сходная функциональная активность дефенсинов бобовых растений дают основание выделить их в новую, пятую структурную группу, к которой и принадлежит выделенный нами из семян чечевицы новый дефенсин Ьс-с1е£

4.2. Создание генно-инженерной конструкции для экспрессии рекомбинантного дефенсина из семян чечевицы Lens culinaris.

Создана генно-инженерная конструкция, позволяющая проводить препаративную экспрессию дефенсина Lc-Def из семян чечевицы Lens culinaris в клетках Е. coli. В состав плазмидного вектора pE-Trx-Lc-Def для экспрессии гибридного белка, содержащего дефенсин чечевицы, были включены следующие регуляторные элементы: промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, 1ас-оператор, консенсусный сайт связывания бактериальной рибосомы и стартовый кодон ATG. Открытая рамка считывания завершается стоп-кодоном ТАА, а транскрибируемая область ограничивается терминатором транскрипции фага Т7. Для подавления базальной экспрессии гена гибридного белка в состав вектора pE-Trx-Lc-Def был включен ген lac-penpeccopa (lacl). В состав вектора также входят сайт инициации репликации (Ori) плазмиды pBR322 и маркерный ген р-лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой клеток Escherichia coli к ампициллину (до 500 мкг/мл) и позволяющий проводить отбор клеток, содержащих векторную ДНК, путем выращивания на соответствующей селективной питательной среде. Размер плазмиды составил 5903 п.н., размер кодируемого гибридного белка - 172 аминокислотных остатка (19,0 кДа). Конструкция pE-Trx-Lc-Def предназначена для функционирования в штаммах Е. coli, способных синтезировать РНК-полимеразу фага Т7. Белок-носитель тиоредоксин А широко применяется для суперэкспрессии биологически активных полипептидов, в первую очередь для экспрессии полипептидов, обогащенных остатками цистеина. Расщепление гибридного белка бромцианом по остатку Met, введенному между последовательностями белка-носителя и дефенсина, позволяет получать рекомбинантный дефенсин, идентичный природному. Для предотвращения фрагментации белка-носителя при обработке бромцианом внутренние остатки Met были заменены методом направленного мутагенеза. В целях упрощения очистки целевого продукта в состав гибридного белка Trx-Lc-Def была включена N-концевая последовательность из восьми остатков гистидина, позволяющая проводить очистку гибридного полипептида методом металло-хелатной аффинной хроматографии.

Конструирование плазмидного вектора pE-Trx-Lc-Def осуществлялось путем лигирования BglII/XhoI-фрагмента плазмиды pET-31b(+) (Novagen), содержащего область инициации репликации, Т7 терминатор, гены р-лактамазы и 1ас-репрессора, со вставкой, кодирующей ген гибридного белка. Искусственный ген, содержащий промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, 1ас-оператор, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий гибридный полипептид (последовательно связанные гистидиновый октамер, тиоредоксин с заменой M37L, сайт расщепления бромцианом и дефенсин), был получен путем синтеза набора олигонуклеотидов с последующей сборкой и амплификацией промежуточных и конечного продуктов методом ПЦР. Выбор структуры олигонуклеотидов для синтеза каждого из структурных элементов основывался на их нуклеотидных последовательностях, депонированных в банках данных GenBank, EMBL-Bank, DDBJ.

Последовательность, кодирующая дефенсин, была получена методом амплификации соответствующего участка природной кДНК препродефенсина с использованием ПЦР-праймеров, обеспечивающих замену двух редких аргининовых кодонов ко донами, предпочтительными для экспрессии в E.coli. На завершающей стадии синтеза последовательность гена амплифицировали с помощью праймеров, несущих на 5'-концах сайты узнавания рестриктаз Bglll и Xhol. Продукт амплификации гидролизовали указанными рестриктазами, очищали электрофорезом в агарозном геле, полосу ДНК размером 656 п.н. выделяли из геля методом электроэлюции в раствор ПЭГ-6000 и лигировали с фрагментом ДНК размером 5,25 тыс. п.н., полученным в результате обработки плазмиды рЕТ31Ь(+) рестриктазами Bglll и Xhol. В результате лигазной реакции получали кольцевую ДНК размером 5,8 п.н. После трансформации компетентных клеток E.coli DH10B суспензию бактерий смешивали с питательной средой LB, растили 1 ч при 37°С и высевали на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина.

Первичный отбор клонов, содержащих нужную плазмиду, осуществляли методом ПЦР с использованием праймеров на плазмидный остов и вставку. Отобранные клоны подращивали в жидкой питательной среде и выделяли плазмидную ДНК, которую анализировали на наличие вставки с помощью рестрикционного анализа. Минипрепаративное выделение экспрессирующей плазмиды проводилось с помощью наборов реактивов и микроколонок Zymo Research. Для наработки плазмидной ДНК использовался штамм Е. coli DH-10B (RecA-). Строение плазмид, содержащих искомый фрагмент, подтверждали секвенированием нуклеотидной

последовательности по Сэнгеру (рис. 16).

Ori

pBR322 Ori

Т7 Promoter

Рис. 16. Физическая карта рекомбинантной плазмиды pE-Trx-LcDef. Bglll, Xhol - сайты рестрикции; pBR322 - участок инициации репликации плазмиды; Ыа - ген устойчивости к р-лакгамным антибиотикам; lacl - ген 1ас-репрессора; Т7 promoter - промотор транскрипции; Т7 terminator -терминатор транскрипции; lac operator -сайт связывания lac-penpeccopa; RBS -сайт связывания рибосомы; His8 -аффинная последовательность из восьми остатков гистидина; Тгх - участок, кодирующий тиоредоксин; Lc-Def -последовательность, кодирующая

дефенсин.

4.3. Биотехнологический способ получения рекомбинантного дефенсина из семян чечевицы Lens culinaris, тотально меченного стабильными изотопами 1SN.

Возможность использования плазмиды pE-Trx-Lc-Def для получения дефенсина, тотально меченного стабильными изотопами, была подтверждена путем культивирования штамма Е.соИ BL21(DE3), трансформированного данной плазмидой, на бедной питательной среде М9, содержащей ^-аммония хлорид в качестве единственного источника азота. Индукцию экспрессии гена гибридного белка осуществляли путем добавления в культуральную жидкость изопропил-ß-D-тиогалактозида. Препаративную экспрессию гибридного белка His8-TrxL-Lc-def проводили при температуре 37"С в двухлитровых колбах, заполненных на четверть объема культуральной средой. Начальная плотность культуры при инокуляции в бедную среду (OD,;oo) составляла 0,1, плотность в момент индукции - 0,771, конечная плотность культуры после инкубации в течение 6 часов - 1,24. Клеточный осадок получали центрифугированием, после чего ресуспендировали его и подвергали ультразвуковой обработке. Полученную суспензию центрифугировали, и осветленный лизат разделяли с помощью аффинной хроматографии на колонке при нормальном давлении. Элюцию гибридного белка проводили повышением концентрации имидазола в денатурирующем буфере с 20 до 500 мМ. К разбавленному элюату добавляли ß-меркаптоэтанол, после чего полученную смесь инкубировали в течение часа. Ренатурацию гибридного белка осуществляли диализом против воды. Целевой пептид получали в результате расщепления гибридного белка бромцианом. Тонкую очистку дефенсина осуществляли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход гибридного белка с 1 л культуры составил 35 мг, целевого пептида - 1,5 мг.

Идентичность полученного пептида природному дефенсину была подтверждена методами электрофореза в ПААГ и обращенно-фазовой ВЭЖХ.

По данным времяпролётной МАЛДИ масс-спектрометрии молекулярная масса полученного пептида составляет 5513,694 Да, что на 73 Да превышает молекулярную массу природного дефенсина и соответствует расчётной массе его аналога, тотально меченного изотопом 15N.

4.4. Антимикробная активность дефенсина Lc-def.

Антимикробная активность дефенсина Lc-def определялась методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Противогрибковая активность природного дефенсина была исследована в отношении двух фитопатогенных грибов - Aspergillus rtiger VKM F-2259 и Alternaría alternata VKM F-3047. Противогрибковая активность рекомбинантного аналога Lc-def была исследована в отношении еще семи фитопатогенных грибов: Aspergillus versicolor VKM F-114, Fusarum solani VKM F-142, Fusarum culmorum VKM F-844, Fusarum oxysporum TCXA-4, Neurospora crassa VKM F-184, Botrytis cinerea VKM F-85, Ascochytapisi VKM F-l 173. Результаты тестирования показали, что дефенсин чечевицы Lc-def характеризуется специфичностью действия и ингибирует рост шести использованных тест-культур (табл. 5). Наиболее чувствительными к Lc-def являются возбудители фузариоза и серой гнили бобовых и злаковых растений F. culmorum и В. cinerea, соответственно, а также N. crassa (рис. 17). В то же время, дефенсин чечевицы не влияет на прорастание

спор и рост таких фитопатогенов, как F. solani, A. alternata и A. pisi в максимальной использованной концентрации 37 мкм/л. Характерную для растительных дефенсинов специфичность противогрибкового действия связывают с возможным механизмом их действия. В отличие от большинства катионных АМП дефенсины растений вызывают нарушение проницаемости клеточной мембраны фитопатогенных грибов не в результате электростатического взаимодействия с отрицательно заряженными компонентами мембраны, а в результате связывания с высокоаффинными сайтами на плазматической мембране грибной клетки.

Таблица 5. Противогрибковое действие Lc-def.

Фитопатогенные грибы IC50, мкМ/л

Aspergillus niger VKM F-2259 28,7

Aspergillus versicolor VKM F-l 14 37,0

Botrytis cinerea VKM F-85 4,65

Fusarum culmorum F-844 18,5

Fusarum oxysporum TCXA-4 >37,0

Neurospora crassa VKM F-l84 18,5

А 620 0,7

0,6

0,5

0,4

0,3

0,2

0,1

■ контроль

□ 4,65 мкМ

□ 9,25 мкМ

□ 18,5 мкМ

□ 37 мкМ

[

24 36 Время, ч

Рис. 17. Влияние дефенисна Lc-def на рост

Neurospora crassa.

Идентифицированные для некоторых растительных дефенсинов сайты связывания представляют собой специфичные для различных фитопатогенных грибов кислые и нейтральные гликосфинголипиды. Следствием связывания растительного дефенсина с гликосфинголипидом может являться либо встраивание пептида в мембрану фитопатогена с образованием ион-проницаемой поры, либо активация соединений, влияющих на активность ионных каналов или транспортеров. Пока остается невыясненным, является ли ингибирование роста грибкового фитопатогена прямым следствием изменения проницаемости его мембраны или результатом воздействия растительных дефенсинов на внутриклеточную мишень.

4.5. Исследование пространственной структуры дефенсина чечевицы в водном растворе.

Все дефенсины растений имеют схожую третичную структуру, представленную тремя складчатыми р-листами и одной а-спиралью (.рсфр мотив) и стабилизированную четырьмя дисульфидными связями (Суэ'-Суз8, СуБ^Сув5, Су53-Суз6 и Суэ^Сув7). Дисульфидная связь Суз1-Суз образована цистеинами, расположенными соответственно в К- и С-концевых участках структуры, что делает дефенсины растений псевдоциклическими молекулами.

Используя полученные образцы немеченого и ,5К-меченого рекомбинантных аналогов пептида, в лаборатории биомолекулярной ЯМР -спектроскопии ИБХ РАН (с.н.с. З.О.Шенкарёв, зав. лаб. проф. А.С.Арсеньев) была определена пространственная структура дефенсина Ьс-ёеГ в водном растворе. На рис. 18 показана установленная структура, которая представляет собой глобулу с одной а-спиралью (остатки 21-27) и тремя р-тяжами (остатки 2-6, 32-36 и 41-47). Структура стабилизирована 4 дисульфидными и 16 водородными связями между атомами основной цепи.

Рис. 18. Пространственная структура дефенсина Ьс-с1еГ в водном растворе в ленточном представлении. Красным цветом отмечены отрицательно заряженные остатки, синим - положительно заряженные. Жёлтым цветом выделены дисульфидные связи (Су$3-Су547, СуэМ-СуэЗв, Суз20-Су541, Суз24-Суз43).

Анализ пространственной структуры дефенсина Lc-def указывает на отсутствие выраженной амфифильности у молекулы пептида, на поверхности которой не наблюдается протяженных гидрофобных регионов, а положительно и отрицательно заряженные остатки распределены практически равномерно.

Подобные свойства дефенсина Lc-def, возможно, предопределяют отсутствие у пептида мембранной активности. Тем не менее, небольшой положительный заряд поверхности пептида (+2) может обусловливать слабое сродство молекулы дефенсина к мембранам, содержащим анионные липиды.

5. Поиск, выделение и структурно-функциональная характеристика новых лииид-транспортирующих белков из проросших семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris.

5.1. Выделение и определение первичной структуры новых липид-транспортирующих белков чечвицы.

Четыре новых липид-транспортирующих белка (LTP) чечевицы были выделены из проросших семян чечевицы с помощью гель-фильтрации, ионообменной хроматографии и обращенно-фазовой ВЭЖХ. Масс-спектрометрический анализ полученных фракций выявил присутствие молекулярных ионов с m/z 9121,9, 9135,0, 9269,1 и 9283.1.

1CYS3!

Последовательности первых 24 аминокислотных остатков, установленные методом N-концевого автоматического секвенирования по Эдману, оказались идентичными для всех четырех белков (AISXGAVTSDLSPXLTYLTGGPGP-). N-Концевая аминокислотная последовательность выделенных белков, гомологичная последовательности белков подкласса LTP1, была депонирована в базы данных SWISS-PROT и TrEMBL под номером Р84255. В результате реакции алкилирования 4-винилпиридином без предварительного восстановления дититреитолом и после него было показано, что каждый из выделенных LTP чечевицы содержит 8 остатков цистеина, образующих 4 дисульфидных связи. С-Концевые аминокислотные остатки были определены путем расщепления белков смесью карбоксипептидаз А и В.

Для установления полных первичных структур LTP чечевицы с помощью молекулярного клонирования и секвенирования кДНК использовали метод быстрой амплификации концов кДНК (RACE). На первом этапе структура вырожденных ген-специфических праймеров для амплификации З'-концов кДНК была выбрана, исходя из N-концевой аминокислотной последовательности выделенных LTP. На втором этапе для амплификации 5'-концов к ДНК были использованы ген-специфические праймеры, комплементарные З'-нетранслируемым областям кДНК (рис. 19а). В результате клонирования и секвенирования 3'- и 5'-концевых фрагментов нами была установлена структура шести полноразмерных кДНК предшественников LTP. Пять нуклеотидных последовательностей [номера GenBank: AY793553 (Lc-LTPl), AY793554 (Lc-LTP2), AY793555 (Lc-LTP3), AY793558 (Lc-LTP4), AY793557 (Lc-LTP6)] включают в себя открытую рамку считывания длиной 354 п.н., кодирующую белки-предшественники, состоящие из 118 аминокислотных остатков. Шестая последовательность [номер GenBank AY793556 (Lc-LTP5)] содержит открытую рамку считывания длиной 348 п.н., кодирующую укороченный на две аминокислоты белок-предшественник, состоящий из 116 аминокислотных остатков. Анализ аминокислотных последовательностей с помощью алгоритма SignalP v.3.0 показал высокую вероятность наличия сигнального пептида, состоящего из 24-25 аминокислотных остатков и отщепляемого по связям А1а25-А1а26 (в случае Lc-LTPl и Lc-LTP3), Gly25-Ala26 (для Lc-LTP2, Lc-LTP4 и Lc-LTP6) и Gly24-Ala25 (в случае Lc-LTP5). Три из выделенных LTP чечевицы (Lc-LTP2, Lc-LTP4 и Lc-LTP6) очень близки по своей структуре. Lc-LTP2 и Lc-LTP4 различаются между собой всего двумя аминокислотными остатками в положении 85 зрелого пептида (Thr/Ser) и в положении 14 сигнального пептида (Met/Ile). Изоформы Lc-LTP4 и Lc-LTP6 отличаются только одним аминокислотным остатком в положении 77 (Asn/Asp). Наименьшее сходство со структурами других липид-транспортирующих белков чечевицы имеет Lc-LTPl Триптический гидролиз восстановленных и S-пиридилэтилированных LTP привел к образованию 13 фрагментов (рис. 196). Рассчитанные с помощью программы Protean (DNASTAR) молекулярные массы триптических фрагментов Lc-LTP2, Lc-LTP4 и Lc-LTP6 соответствовали массам фрагментов выделенных LTP, определенных методом времяпролётной МАЛДИ масс-спектрометрии. Принимая во внимание то, что разница между молекулярными массами Lc-LTP4 и Lc-LTP6 составляет всего 1,0 Да, было выполнено микросеквенирование фрагмента XI CGV(JV,Z))IPYK при помощи тандемной масс-спектрометрии, которое позволило идентифицировать остаток Asn77.

1МС1.К8ААС51ТК1-МТМЦААА1.Р0КССУ \ 1Р

271

YKISTTTNCNTVKF

361 .ил-кшш.шл^м.т^тмш^ 450

~ праймер 15

451 аа1сас1ад1дсддссдсс1дсадд1сдас 480

б ■4-

■й-

II (1-34)_ _VI (35-53) X (54-73) XIII (74-92)

^ISCGДVTSDLSPCLTYLTGGPGPSPQCCGGV^LAAД^^TTPD^QAACNCL^AGSITKLNTNNAДДLPGKCGV(D/N)IPYKIЭТ(S^T)TNCNTVKF 1(1-33) 111(35-45) V (46-53) у П) (54.(,[) IX (62-73) XI (74-81) XII (82-92)

^ IV (34-45)

VII (34-53)

Рис. 19. Последовательность кДНК, кодирующая предшественник Ьс-1_ТР2, и соответствующая ей аминокислотная последовательность пребелка. Открытая рамка считывания включает сигнальный пептид (показан светло-серым цветом) и зрелый белок (показан черным цветом). Показаны сайты отжига праймеров, использованных для амплификации концов кДНК. 6 - Триптические фрагменты восстановленных Ьс-ЬТР2,4,6 Серым цветом выделены аминокислотные остатки, по которым происходило расщепление.

1 10 20 30 40 50 60

Рис. 20. Сравнение аминокислотных последовательностей предшественников Lc-LTPl-8 Светло-серым цветом выделены сигнальные пептиды, черным - зрелые белки, аминокислотные замены показаны белым цветом

В результате было установлено, что выделенные LTP чечевицы с m/z 9269,1 и 9283,1 соответствуют зрелым белкам Lc-LTP4 и Lc-LTP2 (расчётные молекулярные массы 9268Л Да и 9282,7 Да, соответственно). Выделенные LTP с m/z 9121,9 и 9135,9, названные Lc-LTP8 и Lc-LTP7, являются укороченными изоформами LC-LTP4 и Lc-LTP2 без С-концевого Phe (расчётные молекулярные массы 9121,5 Да и 9135,5 Да. соответственно).

Выделенные нами липид-транспортирующие белки из чечевицы обладают высокой степенью гомологии с LTP из семян нута Cicer arietinum: 76% для Lc-LTP2 и 77% для U-LTP4 (рис. 20).

5J. Создание генно-инженерной конструкции для экспрессии рекомбинантного липид-транспортирующего белка из семян чечевицы Lens culinaris. Биотехнологическнй способ получения LTP чечевицы, тотально меченного стабильными изотопами ISN.

Создана генно-инженерная конструкция, позволяющая проводить препаративную экспрессию липид-транспортирующего белка Lc-LTP2 из семян чечевицы Lens culinaris в клетках Е. coli, в том числе на бедной питательной среде, содержащей источники 15N. Особенностью полученной плазмидной конструкции pE-Trx-Lc-LTP является присутствие в ее составе гена, кодирующего один из белков подсемейства Lc-LTP в составе гибридного белка His8-Trx-Lc-LTP, содержащего тиоредоксин А в качестве белка-носителя. С целью дальнейшего высвобождения целевого белка из молекулы гибридного белка His8-Trx-Lc-LTP между последовательностями Lc-LTP2 и тиоредоксина был введен сайт, позволяющий проводить избирательное расщепление гибридного полипептида химическим способом.

В состав плазмидного вектора pE-Trx-Lc-LTP были включены регуляторные элементы, необходимые для достижения высокого уровня экспрессии в цитоплазме E.coli: промотор РНК-полимеразы бактериофага Т7, 1ас-оператор, консенсусный сайт связывания бактериальной рибосомы и стартовый кодон ATG. Открытая рамка считывания завершается стоп-кодоном ТАА, а транскрибируемая область ограничивается терминатором транскрипции фага Т7. Для подавления базалъной экспрессии гена гибридного белка в состав вектора pE-Trx-Lc-LTP был включен ген lac-penpeccopa (lacl). В состав вектора также введен сайт инициации репликации (Orí) плазмиды pBR322 и маркерный ген ß-лактамазы, придающий трансформированным плазмидой клеткам Е. coli устойчивость к ампициллину и позволяющий проводить отбор клеток, содержащих векторную ДНК, путем выращивания на селективной питательной среде. Размер плазмиды составил 6041 п.н., размер кодируемого гибридного белка - 219 аминокислотных остатков (молекулярная масса 23,0 кДа). Расщепление гибридного белка бромцианом по остатку Met, введенному между последовательностями тиоредоксина и липид-транспортирующего белка, позволило получить искомый рекомбинантный белок, полностью идентичный природному Lc-LTP. Очистку целевого белка упростили за счет включения октагистидиновой последовательности в состав гибридного полипептида Trx-Lc-LTP и последующей металло-хелатной хроматографии. Конструирование вектора осуществлялось путем лигирования BglII/XhoI-фрагмента плазмиды рЕТ-31Ь(+) (Novagen), содержащего область инициации репликации, Т7 терминатор, гены ß-лактамазы и lac-penpeccopa, со вставкой, несущей ген гибридного белка. Искусственный ген гибридного белка, содержащий промотор транскрипции Т7 РНК-полимеразы, 1ас-оператор, участок связывания рибосомы и участок, кодирующий гибридный полипептид, был получен путем синтеза набора олигонуклеотидов с последующей сборкой и амплификацией промежуточных и конечного продуктов с помощью ПЦР. Фрагмент, кодирующий белок-носитель тиоредоксин (M37L), получали методами ПЦР-амплификации и направленного мутагенеза с помощью ген-специфических праймеров, используя в качестве исходной матрицы плазм иду рЕТ32а(+), содержащую ген тиоредоксина. Последовательность, кодирующая липид-транспортирующий белок, была получена методом амплификации соответствующего участка природной кДНК предшественника липид-транспортирующего белка. На завершающей стадии синтеза последовательность гена амплифицировали с помощью праймеров, несущих на 5'-концах сайты узнавания рестриктаз BglII и Xhol. Продукт амплификации гидролизовали указанными рестриктазами, очищали электрофорезом в агарозном геле, полосу ДНК размером 790 п.н. выделяли из геля методом электроэлюции и лигировали с фрагментом ДНК размером 5,25 тыс. п.н., полученным в результате обработки плазмиды рЕТ31Ь(+) рестриктазами BglII и Xhol. В результате лигазной реакции получали кольцевую ДНК размером 6,0 тыс. п.н. Продуктами лигазной реакции трансформировали компетентные клетки E.coli DH10B. После трансформации суспензию бактерий смешивали с питательной средой LB, растили 1 час при 37°С и высевали на чашки Петри с LB-агаром, содержащим 50 мкг/мл ампициллина. Отбор клонов, содержащих искомую плазмиду, осуществляли методом ПЦР с использованием праймеров на плазмидный остов и вставку. Отобранные клоны подращивали в жидкой питательной среде. Выделенную плазмидную ДНК анализировали на наличие вставки с помощью рестрикционного анализа.

Минипрепаративное выделение экспрессирующей плазмиды проводилось с помощью наборов реактивов и микроколонок Zymo Research. Для наработки плазмидной ДНК использовался штамм Е. coli DH-10B (RecA-). Строение плазмид подтверждали секвенированием нуклеотидной последовательности по Сэнгеру. По данным секвенирования отбирали плазмиду со вставкой, нуклеотидная последовательность которой полностью соответствовала заданной (рис. 21).

Рис 21. Физическая карта рекомбинангной плазмиды

pE-Trx-Lc-LTP BgUI, Xhol - сайты рестрикции; pBR322 Ori - участок инициации репликации плазмиды; Ыа - ген устойчивости к ft-лактамным антибиотикам; ¡ас/- ген lac-penpeccopa; Т7 promoter -промотор транскрипции; Т7 terminator - терминатор транскрипции; lac operator - сайт связывания lac-penpeccopa; RBS -сайт связывания рибосомы; His8-Trx-Lc-LTP - последовательность, кодирующая гибридный белок, включающий аффинный участок из восьми остатков гистадина (His8), тиоредоксин (Тгх) и

последовательность липид-

транспортирующего белка LC-LTP2.

Препаративную экспрессию, получение гибридного белка Н1з8-ТгхЬ-1х-ЬТР и искомого белка 1х-ЬТР2 проводили по методике, аналогичной описанной выше в разделе 4.3. Тонкую очистку липид-транспортирующего белка Ьс-Ы'Р2 осуществляли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Выход гибридного белка с 1 л культуры составил 32 мг, целевого белка - 1,2 мг. Полученный белок продемонстрировал идентичность природному Ьс-ЬТР2 в условиях ПААГ-электрофореза и обращенно-фазовой ВЭЖХ.

Возможность использования плазмиды рЕ-Тгх-Ьс-ЬТР для получения липид-транспортирующего белка, тотально меченного стабильным изотопом была подтверждена путем культивирования штамма Е.соИ ВЬ21(ОЕЗ), трансформированного данной плазмидой, на бедной питательной среде М9, содержащей 15МН4С1 в качестве единственного источника азота. По данным времяпролётной МАЛДИ масс-спектрометрии молекулярная масса меченого белка на 113 Да превысила молекулярную массу природного аналога, составив 9395,892 Да, что полностью соответствует расчётной массе тотально 15Ы-меченого аналога Ьс-ЬТР2.

рвЮ22олдт

5.4. Характеристика биологической активности выделенных LTP.

Представители семейства растительных LTP являются многофункциональными белками. Они обладают антимикробной активностью и способностью связывать и переносить липиды. Имеются косвенные данные об участии LTP в таких биологических процессах в растениях, как синтез кутана, эмбриогенез, адаптация к стрессу (холод, засуха, засоление почвы и т.д.), защита растений от фитопатогенов. Наличие нескольких изоформ в одном растении типично для семейства LTP.Считается, что разные изоформы LTP выполняют различные функции в растениях, и уровень их экспрессии зависит от условий окружающей среды. В подтверждение присутствия в семенах чечевицы множественных изоформ LTP нами были обнаружены мРНК шести белков Lc-LTPl-6, которые, по-видимому, синтезируются на разных стадиях развития растения. Синтез изоформ Lc-LTP2,4.7,8, выделенных нами из проращённых в течение трех дней семян чечевицы, происходит на ранней стадии развития проростков и, возможно, обусловлен участием этих белков в борьбе с патогенами и в мобилизации липидов при переходе эмбриональных клеток из фазы покоя к активному метаболизму при прорастании семян.

Наличие антимикробной активности у выделенных LTP было подтверждено методом серийных разведений в жидкой питательной среде. Выявлена активность природного Lc-LTP2 чечевицы в отношении двух фитопатогенных грибов -Aspergillus niger VKM F-2259 и Alternaría altérnala VKM F-3047, а также в отношении грамотрицательной бактерии Agrobacterium tumefaciens А281. Противогрибковая активность рекомбинантного аналога LC-LTP2 была исследована в отношении еще семи фитопатогенных грибов: Aspergillus versicolor VKM F-114, Fusarum solani VKM F-142, Fusarum culmorum VKM F-844, Fusarum oxysporum TCXA-4. Neurospora crassa VKM F-184, Botrytis cinérea VKM F-85, Ascochyta pisi VKM F-l 173. Результаты тестирования показали, что Lc-LTP2 обладает как антибактериальной, так и противогрибковой активностью и ингибирует рост пяти использованных тест-культур (табл. 6).

Таблица 6. Антимикробное действие Lc-LTP2.

Тест-микроорганизмы IC50, мкМ/л

Грамотрицательные бактерии

Agrobacterium tumefaciens А281 27,0

Фитопатогенные грибы

Aspergillus niger VKM F-2259 17,5

Botrytis cinerea VKM F-85 10,9

Fusarum culmorum F-844 >21,7

Neurospora crassa VKM F-184 >21,7

А 620 0,8 0,7 -0,6 ■ 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 ■ 0

■контроль

□ 13,5 мкМ

□ 27 мкМ □40,5 мкМ

□ 54 мкМ

18 24 Время, ч

Рис. 22. Влияние Lc-LTP2 на рост Agrobacterium tumefaciens.

Наиболее чувствительными к Lc-LTP2 чечевицы являются возбудители аспергиллезной и серой гнили растений A. niger и В. cinerea, соответственно, а также почвенная бактерия A. tumefaciens, вызывающая опухоли у растений (рис. 22). В то же время, Lc-LTP2 чечевицы не влияет на прорастание спор и рост таких фитопатогенов, как A. versicolor, A. altérnala, A. pisi, F. oxysporum и F. solani в максимальной использованной концентрации 21,7 мкм/л.

Известно, что некоторые представители класса LTP являются растительными аллергенами, участвующими в развитии аллергических реакций на пыльцу, растительные продукты и латекс. Чечевица относится к бобовым растениям, часто вызывающим аллергические реакции у жителей (в основном, у детей) Индии и стран Средиземноморского бассейна. Ранее в семенах чечевицы были обнаружены два аллергена: субъединица у-вицилина Len с i (47 кДа) и специфический для семян биотинилированный белок Len с 2 (66 кДа). Совместно с отделом экспериментальной иммунологии Академического медицинского центра г. Амстердама (Нидерланды) нами было проведено исследование взаимодействия природных LTP чечевицы и рекомбинантного аналога Lc-LTP2 с IgE из сывороток пациентов с пищевой аллергией. Результаты иммуноблоттинга (рис. 23) и иммуноферментного анализа с использованием тест-системы ImmunoCap показали, что в сыворотках пациентов с пищевой аллергией на чечевицу, горох, орехи, фрукты и другие продукты присутствуют IgE, специфичные к LTP чечевицы. Анализ полученных данных позволил прийти к выводу о том, что LTP чечевицы являются перекрестными аллергенами и имеют наибольшее сходство с Ara h 9 из арахиса LTP чечевицы были внесены нами в базу данных по аллергенам (www.allergen.org) Международного союза иммунологических обществ (IU1S) под аббревиатурой Len с 3. Таким образом, чечевица является третьим бобовым растением (наряду с арахисом и фасолью), из которого были выделены LTP, охарактеризованные как новые аллергены.

Рис. 23. Иммуноблоттинг Ьс^ТР2 с сыворотками пациентов с пищевой аллергией из Испании (Е8) и Нидерландов (ЛЬ). Детектирование специфичных \gjci проводили авторадиографией, используя 1М1-меченые овечьи антитела.

ES1 ES2 ES3 NU NLS NL6 NL7

5.5. Исследование пространственной структуры Lc-LTP2 чечевицы в водном растворе.

Используя полученные образцы немеченого и ,5Ы-меченого рекомбинантных аналогов Lc-LTP2 чечевицы, в лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектрос копии ИБХ РАН (с.н.с. З.О.Шенкарёв, зав. лаб. проф. А.С.Арсеньев) была определена пространственная структура белка Lc-LTP2 в водном растворе. На рис. 24 показана структура Lc-LTP2, которая представляет собой связку из четырёх а-спиралей, сформированных аминокислотными остатками на участках полипептидной цепи Gly5-Leul8, Pro26-Ala37, Thr42-Lys53 и Thrt4-Cys74. На участках Ala55-Ser58 и Cys88-Thr90 наблюдаются отдельные витки Зщ-с пирата, а на участке Cys74-Cys88 вблизи С-концевого остатка находится длинная неупорядоченная петля. Пространственная структура, включающая связку из четырёх а-спиралей, характерна для всех LTP первого семейства.

Анализ установленной пространственной структуры показывает, что поверхность молекулы Lc-LTP2 в основном гидрофильна, но значительное число гидрофобных остатков (Ala, Не, Leu и Val) в составе белка Lc-LTP2 обращены внутрь молекулы и формируют гидрофобный канал (рис. 25).

Рис. 24. Пространственная структура Ес-ЬТР2 в водном растворе в ленточном представлении. Синим цветом выделены дисульфидные связи (Су54-Су551, СуяМ-Суэгв, Суз29-Сув74, Суз49-Су588).

Рис. 25. Распределение гидрофобных остатков (выделены жёлтым цветом) в молекуле Lc-LTP2. Показаны консервативные остатки Аяр44, А^45 и Туг80.

Три из четырёх а-спиралей амфифильны и параллельны этому каналу и ограничивают его с одной стороны. С другой стороны канал ограничен четвёртой а-спиралью и С-концевой петлей. Аналогичные гидрофобные каналы наблюдаются в пространственных структурах всех белков первого семейства LTP. Именно в этой гидрофобной полости находится сайт связывания липидных молекул. У входа в полость локализованы консервативные остатки Туг80 и Arg45. Согласно литературным данным остаток Tyr80 LTP бобовых растений образует водородные связи с полярной головкой липида, связанного с LTP, а боковая цепь остатка Arg45 направлена внутрь канала. Этот остаток, возможно, отвечает за электростатическое взаимодействие с полярными головками липидов.

б. Структурно-функциональное изучение антябиотиков-пептаиболов из грибов Emericeilopsis salmocynnemata и Emericeilopsis minima.

Пептаиболы представляют собой семейство мембрано-активных антимикробных пептидов, выделенных из мицелиальных спорообразующих грибов [царство - грибы (Fungi), отдел - настоящие грибы (Eumycota), подотдел -аскомицеты (Ascomycotina), класс - эуаскомицеты (Euascomycetes)]. Термин «пептаибол» указывает на пептидную природу этих антибиотиков, наличие в их составе а,а-диалкиламинокислот, в частности а-аминоизомасляной кислоты (Aib), а также С-концевых 1,2-аминоспиртов. Представители этого семейства природных антибиотиков являются относительно короткими пептидами (7-24 аминокислотных остатков), обладающими антибактериальной и антигрибковой активностью. Установлено также, что пептаиболы проявляют антипротозойное действие, в частности, против паразитических простейших рода Plasmodium - возбудителей малярии; рода Trypanosoma - возбудителей сонной болезни и болезни Шагаса (трипаносомоза); рода Entamoeba, вызывающих дизентерийный амёбиаз.

К семейству пептаиболов относится группа антибиотиков зервамицинов, выделенных из гриба Emericellopsis salmosynnemata (Argoudelis А. et al., 1974). Ранее в культурах различных штаммов гриба было обнаружено и охарактеризовано 11 изоформ пептида, среди которых преобладающими являются зервамицин IIA (Zrv-IIA) и зервамицин IIB (Zrv-IIB). Зервамицины содержат 1S аминокислотных остатков и С-концевой остаток аминоспирта фенилаланинола. Первичная структура Zrv-IIA и Zrv-ПВ практически идентична, за исключением аминокислотного остатка в положении 4:

Zrv-IIA

Ac-T^14Ie2-Gto3-AibMle5-Thr6-Aib7-Leu8-Aib,-Hyp10-Gln1,-Aibl2-Hyp13-Aib14-Pro15-PhI16 Zrv-ПВ

Ac-TrpI-Ile2-Gln3-IvaMle5-Thr6-Aib7-Leu8-Aib9-Hyp'°-Glnn-Aib12-Hyp13-Aib14-Pro15-Phl16, где Aib - а-аминоизомасляная кислота, Iva - D-изовалин, Hyp - 4-гидроксипролин, Phi - фенилаланинол.

Зервамицин образует в мембранах серию ион-проводящих агрегатов. Характерной особенностью зервамициновой проводимости является ее зависимость от приложенного электрического поля. В этом отношении зервамицин может рассматриваться как простейшая модель ионных каналов возбудимых мембран. Изучение биологических свойств зервамицинов показало, что они не только обладают выраженной активностью против грамположительных и грамотрицательных бактерий, но и проявляют антипротозойные свойства в отношении устойчивых форм возбудителя малярии Plasmodium falciparum (Nagaraj G. et al., 2001).

К семейству пептаиболов относится также группа антибиотиков антиамебинов, выделенных из грибов рода Emericellopsis (Pandey R. et al., 1977). Ранее в культурах различных штаммов гриба было обнаружено и охарактеризовано 16 изоформ пептида, среди которых антиамебин I, имеющий следующую структуру:

Ac-Phe1-Aib2-Aib3-Aib4-Iva5-Gly6-Leu7-Aib8-Aib9-Hypl0-Gln11-Ivau-Hypu-Aib14-Pro,s-Phlls

Антиамебины также обладают антимикробными и антипротозойными, в частности, противоамёбными и противомалярийными свойствами. В модельных системах эти пептаиболы проявляют мембранную активность и эффективное каналообразование. Однако, при значительном структурном сходстве биологическая активность антиамебина I менее выражена по сравнению с зервамицином IIB. С целью сравнительного изучения механизма действия зервамицина IIB и антиамебина I нами были разработаны эффективные методики выделения зервамицина IIB из гриба Emericellopsis salmosynnemata (штамм 336 IMI58330) и антиамебина I из гриба Emericellopsis minima (штамм F1483).

6.1. Биотехнологический способ получения пептидных антибиотиков зервамицина IIB и антиамебина I, тотально меченных стабильными изотопами 1SN и 13С

Современные методы гетероядерной ЯМР-спектроскопии позволяют изучать конформацию мембрано-активных пептидов как в растворе, так и при их непосредственном взаимодействии с липидным бислоем. Применение комплексных методов 'Н,13С,'^-ЯМР-спектроскопии и использование тотально меченых соединений в подобных исследованиях позволяют значительно увеличить объём получаемых данных и повысить качество рассчитанных структур. Получение тотально меченых препаратов биологически активных соединений целесообразно проводить биотехнологическим методом, то есть путём культивирования соответствующих штаммов-продуцентов на средах, содержащих атомы только того изотопа, который должен быть включён в молекулы целевых соединений. В данной работе представлены результаты применения биотехнологического подхода для получения тотально меченых стабильными изотопами 15N и 13С препаратов пептидных антибиотиков зервамицина ИВ и антиамебина I.

Для получения препаратов пептидных антибиотиков зервамицина IIB и антиамебина I использовали культуры штаммов-продуцентов Emericellopsis salmosynnemata 336IMI58330 и Emericellopsis minima F1483, соответственно.

Известно, что максимальный выход пептаиболов наблюдается при культивировании грибов-продуцентов на полноценной среде с высоким содержанием глюкозы. В наших предварительных опытах было установлено, что использование даже половинных концентраций компонентов среды приводит к резкому снижению уровня накопления пептаиболов. На основании этих данных было сделано предварительное заключение, что ростовые среды для получения препаратов тотально меченых зервамицина IIB и антиамебина I должны содержать ростовые факторы в тех же концентрациях, что и в стандартной полноценной среде для Е. salmosynnemata и Е. minima. Таким образом, для тотального включения стабильной изотопной метки в молекулы пептаиболов необходимо, чтобы абсолютно все ростовые субстраты были тотально меченными стабильными изотопами.

Культивирование штаммов-продуцентов проводили на полноценных тотально l5N- или (13С+ ^-меченых средах. Коммерческие тотально l5N- и (15Ы+13С)-меченые полноценные ростовые среды (обычно на основе изотопно-меченой биомассы микроводорослей), как правило, являются дорогостоящими. При приготовлении полноценных ростовых сред, тотально меченных стабильными изотопами, мы использовали автолизаты клеток и экзополисахариды облигатных метилотрофных бактерий Melhylobacillus flagellatum КТ, выращенных на тотально 15N- или (,3C+15N)-мечеиой минимальной среде. Во втором случае в среду добавляли С-меченый метанол в качестве единственного источника углерода. Автолизаты биомассы, охарактеризованные по их питательной ценности, использовали в таком разведении, которое являлось адекватной заменой стандартной полноценной среде на основе смеси бакто-пептона и дрожжевого экстракта. При этом вместо экзогенной глюкозы и крахмала в состав среды вводили требуемое количество |3С,'^-меченых экзополисахаридов, синтезированных теми же метилотрофными бактериями.

Таблица 7. Состав тотально меченых полноценных ростовых сред для получения препаратов тотально меченых зервамицина ПВ и антиамебина I.

Полноценные среды Источники азота и углерода Дополнительный источник углерода

Стандартная среда Бакто-пептон, дрожжевой экстракт Крахмал, глюкоза

15№меченая среда Автолизат '^-меченой биомассы метилотрофов Крахмал, глюкоза

(N+°C)-меченая среда Автолизат (1:Ы+иС)-меченой биомассы метилотрофов "И/^С-меченые экзополисахариды, [и-13С]-меченая глюкоза*

* - добавляли в части экспериментов.

Наработка тотально меченой биомассы и экзополисахаридов с использованием облигатных метилотрофных бактерий МеЛуЬЬасШш Аа^еНаШт КТ и подбор сред для культивирования грибов-продуцентов пептаиболов проводились совместно с ГНЦ Генетики и селекции промышленных микроорганизмов (д.б.н. Д.А.Складнев).

Стандартная полноценная среда для культивирования грибов-продуцентов содержала (в расчёте на 1л): глюкозу - Юг, крахмал - Юг, бакго-пептон - Юг, дрожжевой экстракт - 2,5г, CaCOj- 8г; pH 7,2. Культивирование грибов-продуцентов проводили на полноценной тотально (|5Ы+13С)-меченой ростовой среде (табл. 7). Посевную культуру выращивали в пробирках, содержащих 5мл среды, в течение 4 суток при 28°С на качалке. Содержимое пробирок с выросшими мнцелиальными "шариками" использовали для засева колб Эрленмейера, содержащих 1/5 объёма стерильной среды. Продолжали культивирование в тех же условиях в течение 8-10 суток. Для уменьшения риска разбавления изотопных меток посевную культуру гриба выращивали также в ( SN+13C) -меченой среде. Наблюдение за ростом продуцента проводили путём ежедневного отбора проб, в которых определяли pH среды и концентрацию пептаиболов. Культивирование для наработки |3С,'^-меченых пептаиболов проводили в течение 7-8 суток в колбах объёмом 350 мл, содержащих 1/5 объёма стерильной (1SN + С)-меченой среды. Экстракция и |3С,'ТЧ-меченых пептаиболов из мицелия гриба проводилось метанолом, а из культуральной жидкости - этилацетатом. Фракционирование полученных экстрактов и выделение тотально 15N-и

-меченых зервамицина и актиамебина I осуществлялось с помощью двух стадийной обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Vydac С-18. Применение предложенного двухстадийного биотехнологического метода для получения тотально меченых пептаиболов позволяет достичь продуктивности около 1 мг пептидного антибиотика из 1г сырого мицелия или из 10мл культуральной жидкости, что соответствует продуктивности на полноценной среде стандартного состава. Анализ полученных препаратов с помощью время пролётной МАЛДИ масс-спектрометрии выявил совпадение m/z молекулярных ионов и теоретически рассчитанных молекулярных масс l5N- и |3С,15Ы-меченых аналогов зервамицина IIB (1857Да и 1947Да, соответственно) и антиамебина I (1687Да и 1770Да, соответственно). По данным ЯМР-спектроскогага степень включения метки и по азоту (ISN) и углероду (|3С) составила не менее 95%.

6.2. Физико-химическое исследование пептаиболов зервамицина IIB ■ аитиамебина I и модель их антимикробного действия.

Используя полученные образцы немеченых зервамицина IIB и антиамебина I, а также их I5N- и 13С,15М-меченых аналогов, в лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН (с.н.с. З.О.Шенкарёв, зав. лаб. проф. А.С.Арсеньев) проведено физико-химическое исследование пептаиболов зервамицина IIB и антиамебина I. Методом ЯМР-спектроскопии установлены пространственные структуры зервамицина IIB и антиамебина I в метаноле (растворитель с низкой полярностью). Молекула зервамицина (рис. 26) представляет собой правозакрученную спираль, изогнутую в районе остатка Hyp1" под углом 43°. Спираль имеет длину около 23 ангстрем. N-Концевая часть молекулы (Trp'-Leu8) представляет собой а-спираль, а С-концевая (Aib'-Phl16) - спираль, сформированную последовательностью ß-изгибов, заканчивающуюся витком а-спирали. Все полярные боковые группы локализованы на выпуклой стороне спирали, а гидрофобные - на вогнутой.

В случае антиамебина I С-концевой участок (Ьеи'-РЫ16) также имеет коиформацию правозакрученной спирали, сформированной последовательностью Э-изгибов, в то время как Ы-концевой фрагмент (РЬс'-01у6) совершает быстрые динамические переходы между право- и левозакрученной 310-спиральной конформацией (рис. 27).

Рис. 27. Конформационная гетерогенность антиамебина I в метаноле. Правозакрученная (а), изогнутая (б) и левозакрученная (в) структуры пептида показаны в ленточном представлении.

Поскольку метанол не может адекватно моделировать анизотропное мембранное окружение, методом гетероядерной ЯМР-спектроскопии была исследована структура зервамицина ПВ и антиамебина I в мембрано-моделирующих средах с использованием -меченых аналогов этих пептаиболов. Показано, что в растворе мицелл ОРС С-концевая область спирали зервамицина ПВ расположена на поверхности мицеллы, а М-концевой участок пептаибола заглублён в её гидрофобную часть. Установлено, что антиамебин I имеет полностью правозакрученную спиральную коиформацию в анизотропной мембрано-моделирующей среде - растворе бицелл ПМРС7Ш1РС. Методом КД-спектроскопии показано, что антиамебин I имеет полностью правозакрученную спиральную коиформацию в нейтральных биологических мембранах (РОРС).

На основании полученных данных совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН предложена модель, описывающая различия в механизме антимикробной активности зервамицина IIB и антиамебина I. Согласно этой модели оба пептаибола не имеют определённой конформации в водном растворе. На первом этапе происходит взаимодействие молекулы пептида с поверхностью мембраны, при этом формируется его спиральная структура, расположенная параллельно плоскости бислоя. На втором этапе N-концевая часть молекулы заглубляется в гидрофобную область мембраны и пептид переходит в трансмембранное состояние. На третьем этапе трансмембранные мономеры пептаибола агрегируют и формируют каналы га связок спиралей, через которые вытекает цитоплазматическое содержимое клетки-мишени. Исследование мембранной активности показало, что по сравнению с зервамицином IIB антиамебин I обладает как пониженным сродством к мембране, так и более низкой каналообразующей активностью в мембрано-связанном состоянии. Полученные данные указывают на то, что высокая динамическая подвижность пептида затрудняет как начальное связывание антиамебина I с мембраной, так и последующее образование каналов по механизму связки спиралей, и позволяют о&ьяснить более низкую биологическую активность антиамебина I по сравнению с зервамицином IIB.

6.3. Антибиотик-пептанбол зервамицин обладает неиротропной активностью.

В процессе структурно-функционального исследования антибиотиков-пептаиболов нами была выявлена нейротропная активность зервамицинов ПА и IIB. Исследование влияния зервамицинов на поведение экспериментальных животных проводилось на самцах крыс Wistar в возрасте двух месяцев. Работа проводилась совместно с лабораторией биологических испытаний ФИБХ РАН (зав лаб., д.б.н. А.Н.Мурашев). Все манипуляции с животными выполнялись в соответствии с протоколом, утвержденным комиссией по контролю за содержанием и использованием лабораторных животных ФИБХ РАН.

Влияние антибиотиков на поведение, в частности на локомоторную и поисковую активность крыс исследовали в тесте «Открытое поле» (ОП). ОП представляет собой круглую арену диаметром 80 см, разделенную на сектора, в каждом из которых имеется отверстие (норка). При испытании животное помещали в центр арены и локомоторную активность оценивали по количеству пройденных секторов в течение 3 минут, а поисковую активность - по количеству подъемов на задние лапки и обследованных норок. Определяли также время грумминга, время нахождения в центре арены и количество дефекаций и уренаций. Растворы зервамицинов в 30% этиловом спирте вводили однократно (внутрибрюшинно) в дозе 2 мг/кг массы тела животного. В качестве контроля использовали интактных животных (контроль-1) и животных, которым вводили внутрибрюшинно 30% спирт в дозе 2 мл/кг без антибиотиков (контроль-2). Исследование поведенческой активности в тесте ОП проводили через 20 и 60 минут после введения исследуемых веществ. Каждое животное подвергалось тестированию только один раз.

Показано, что исследуемые препараты зервамицинов НА и ПВ достоверно снижают локомоторную активность крыс в тесте ОП относительно обоих

контролен как через 20 минут, так и через 60 минут после введения (рис. 28). Поисковая активность экспериментальных животных (суммарное количество стоек и обследованных норок) под влиянием 30% спирта (контроль-2) достоверно снижалась относительно интактных животных (контроль-1) через 20 минут после введения (рис. 29). Исследуемые пегггаиболы также снижали поисковую активность относительно контроля-1 через 20 и 60 минут после введения. Однако, только у животных, получавших зервамицин ПА, наблюдали статистически значимое снижение поисковой активности относительно контроля-2 через 20 минут после введения, что может свидетельствовать как о потенцировании этим пептаиболом угнетающего действия 30% спирта на ЦНС, так и о собственном воздействии на ЦНС.

Под действием зервамицина НА время нахождения крыс в центре площадки увеличивалось через 20 минут после введения, что свидетельствует о понижении эмоционального возбуждения животных под влиянием препарата, так как в первые минуты страх усиливает двигательную активность крыс в тесте ОП. На это также указывает достоверное уменьшение эмоционально-вегетативной реакции крыс (по сумме дефекаций и уренаций) под влиянием зервамицина ПА через 20 минут после введения (0,9+0,2 по сравнению с ¡,7+0,3 в контроле-2). Вегетативные реакции являются компонентом оборонительной реакции животных, вызываемой страхом при помещении в незнакомую среду.

□ Интактные 0 Этанол 30% в Зервамицин ПАЙ Зервамицин IIВ 80

20 мннут 60 мкнут

Рис. 28. Влияние пептаиболов зервамицинов ПА и НВ на локомоторную активность крыс 'МкХа:. #,* - Р<0,05 по Исриггерию Стьюденгга относительно групп интактных животных (контроль-1) и животных после введения 30% этанола (конгроль-2), соответственно.

□ Интактаые ® Этанол 30% 1 Зервамидин IIА Ш Зервамицин IIВ

20 минут 60 минут

Рис. 29. Влияние пептаиболов зервамицинов IIA и IIB на поисковую активность крыс Wistar. . #,* - Р<0,05 по t-критерию Стьюдента относительно групп интактных животных (контроль-1) и животных после введения 30% этанола (контроль-2), соответственно.

Таким образом, в тесте «Открытое поле» было показано, что у крыс под действием пептаиболов зервамицинов НА и IIB снижаются локомоторная и поисковая активности, а также наблюдается уменьшение уровня эмоциональности и стрессируемости, что указывает на нейротропную активность исследуемых пептаиболов.

Известно, что под действием нейролептиков происходит снижение не только локомоторной и поисковой активности, но и температуры тела животных (гипотермическое действие). В следующей серии экспериментов нами было изучено влияние зермамицинов на температуру тела животных. Для измерения ректальной температуры у мышей использовали датчик MLT1404 и компьютеризированную систему Chart ADInstruments (ADInstrurnents, США). Зервамицины IIA и IIB растворяли в 30% этаноле и вводили однократно (внутрибрюшинно) в дозах 0,5, 2,0 и 4,0 мг/кг массы тела животного. В качестве контроля использовали животных, которым вводили 0,9% раствор NaCl (контроль-1) или 30% этанол в объеме 2 мл/кг (контроль-2). Было показано, что зервамицины достоверно снижают температуру тела животных, что может свидетельствовать в пользу их нейролептических свойств. Снижение температуры тела наблюдали у зервамицина ИВ в дозах 2,0 и 4,0 мг/кг, а у зервамицина IIA только в дозе 4,0 мг/кг.

7. Выделение и структурно-функциональное исследование новых пептидных антибиотиков бактериального происхождения.

7.1. Выделение и определение структуры новых пептидных антибиотиков латероцидина и латероцина.

Серьезные экономические и медико-социальные проблемы, вызываемые цианобактериями, определяют необходимость поиска новых методов подавления их роста и улучшения состояния пресноводных водоёмов. Увеличение массы цианобактерий в водных резервуарах приводит к неблагоприятным последствиям, таким как «цветение» воды и обрастание технологического оборудования. Зарастание цианобактериями природных водоёмов и водохранилищ, обеспечивающих питьевой водой население, снижает качество воды за счёт выделения соединений с резким запахом, в частности геосмина, а также токсических веществ, например, микроцистина LR. Токсины, продуцируемые цианобактериями, могут накапливаться в рыбах, моллюсках, ракообразных. Антидотов к токсинам цианобактерий в настоящее время не выявлено. Кроме того, цианобактерии вызывают ряд аллергических заболеваний. Поэтому при высоком уровне "цветения" воды становится нежелательным использование природных водоёмов для купания.

Штаммы грамположительных спорообразующих бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-8287 и ВКПМ В-10531, обладающие активностью против цианобактерий, были выделены и идентифицированы во ФГУН ГНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов (д.б.н. Р.Р.Азизбекян).

Из штаммов Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-8287 и ВКПМ В-10531 были выделены цианолитические соединения, названные латероцидином и латероцином, соответственно. С целью выделения пептидных антибиотиков каждый из штаммов Brevibacillus laterosporus культивировали в жидкой питательной среде NBY. Культуральную жидкость центрифугировали, полученную надосадочную жидкость отбрасывали, а к осадку добавляли абсолютный этанол. Спиртовую экстракцию продолжали в течение 20 часов при комнатной температуре. Полученный спиртовой экстракт отделяли центрифугированием, раствор упаривали досуха, а осадок перерастворяли в этаноле. Раствор фракционировали с помощью двухстадийной обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонках Delta Рак С-18 и Vydac С-18 в линейном градиенте ацетонитрила. Фракции, проявляющие антибактериальную активность, объединяли и упаривали досуха. Для определения молекулярной массы выделенных пептидов использовали масс-спектрометрический анализ на приборе VISION 2000 (Thermo BioAnalysis, США). ЯМР-спектры выделенных пептидных антибиотиков в метаноле были получены в лаборатории биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН. На основании анализа 'Н-ЯМР спектров проведено полное отнесение сигналов протонов исследуемых образцов, которое соответствует аминокислотным последовательностям:

Латероцидин (молекулярная масса 1224,4 Да)

[cyclo-(L-Val-L-Orn-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Phe-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Leu)]

Латероцин (молекулярная масса 1240,6 Да)

[cyclo-(L-Val-L-Om-L-Leu-D-Tyr-L-Pro-L-Phe-D-Phe-L-Asn-L-Asp-L-Met-)]

Анализ баз данных по аминокислотным последовательностям показал, что приведенные выше структуры не описаны ранее, а выделенные нами циклодекапептиды являются новыми пептидными антибиотиками. Выделенные пептиды, названные нами латероцидином и латероцином, относятся к семейству тироцидиновых 'антибиотиков. Интерес к этому классу пептидных антибиотиков существенно возрос в последние годы в связи с обнаружением их высокой эффективности против возбудителей малярии - паразитических простейших рода Plasmodium (свыше 90 % случаев — Plasmodium falciparum). В настоящее время возбудители малярии ежегодно инфицируют более 300 миллионов человек, в подавляющем большинстве случаев - детей раннего возраста.

7.2. Поиск и структурно-фукциональное изучение новых лантибиотиков.

Одним из самых перспективных направлений поиска новых пептидных антибиотиков является изучение метаболитов с антибиотической активностью из грамположительных бактерий. Особое внимание уделяется исследованиям бактерий рода Bacillus - грамположительным спорообразующим аэробам. Представители рода Bacillus в большей своей части непатогенны для человека и животных и в течение десятилетий успешно используются в народном хозяйстве. Так, например, низин, вырабатываемый культурами молочнокислых бактерий Lactococcus lactis, уже более 40 лет широко используется в пищевой промышленности в качестве консерванта в таких процессах, как обработка мясных и молочных продуктов, изготовление сыра, пива, вина, консервация фруктовых напитков и т.д. В 1988 г. Управление по контролю качества лекарственных препаратов, пищевых продуктов и косметических средств США (FDA) присвоило низину статус GRAS (Generally recognized as safe -общепризнан как безопасный). Низин также входит в список пищевых добавок, разрешенных к применению в пищевой промышленности в Российской Федерации (код Е234).

7.2.1. Поиск и выделение новых лантибиотиков из штамма Bacillus licheniformis VK21.

Bacillus licheniformis - грамположительная аэробная терморезистентная бактерия, обитающая в верхний слоях почвы. Bacillus licheniformis является антагонистом патогенной и условно-патогенной микрофлоры, подавляет рост стафилококков, стрептококков, сальмонелл, дрожжевых грибков. Нами было показано, что штамм терморезистентных бактерий Bacillus lichenoformis VK21 продуцирует пептиды, проявляющие выраженную антимикробную активность в отношении широкого круга микроорганизмов. Было установлено, что эти пептиды относятся к классу лантибиотиков.

Лантибиотики - пептидные антибиотики, синтезируемые на рибосомах и содержащие необычные аминокислоты, образующиеся в результате

пострансляционных модификаций остатков Ser и Thr (Dha, 2,3-дидегидроаланин; Dhb, 2,3-дидегидроаминомасляная кислота; Lan, лантионин; MeLan, З-метиллантионин). Тиоэфирные связи в структуре остатков Lan и MeLan, формируемые в результате взаимодействия пространственно сближенных остатков Cys и Dha или Dhb, играют ключевую роль в проявлении антимикробной активности лантибиотиков.

Различия в путях биосинтеза лантибиотиков позволяют разделить их на две группы. Для представителей I группы'(низин, эпидермин, субтилин, Рер5) характерно участие в биосинтезе двух ферментов (дегидратазы LanB и циклазы LanC), осуществляющих потсрансляционные реакции дегидратации и образования тиоэфирной связи, соответственно. Лидерный участок предшественников таких лантибиотиков отщепляется сериновой протеазой LanP. Ко II группе принадлежат лантибиотики цитолизин, лактицин 481 и мерсацидин, пострансляционные модификации в которых осуществляются одним ферментом LanM.

Одним из самых перпективных направлений изучения свойств лантибиотиков является поиск и изучение новых двухкомпонентных систем. Наличие таких систем выявлено у некоторых бактерий, способных вырабатывать два различных по строению лантибиотика, обладающих синергическим действием. В настоящее время известно всего шесть двухкомпонентных лантибиотиков, включая стафилококцин С55 из Staphylococcus aureus С55; лактицин 3147 (Ltna и Ltnß) из Lactococcus lactis DPC3147; плантарицин W из Lactobacillus plantarum\ SmbA и SmbB из мутантных штаммов Streptococcus GS5; ВНТ-А из Streptococcus rattus ВНТ; галодурацин (Hala и Halß) из Bacillus halodurans С-125. Большинство из известных двухкомпонентных лантибиотиков охарактеризовано только на уровне нуклеотидной последовательности предшественников пептидов. До настоящего времени полные химические структуры зрелых пептидов установлены только для двух пар лантибиотиков - лактицина 3147 (Ltna и Ltnß) и галодурацина (Hala и Halß).

Ранее в двух штаммах Bacillus lichenifirmis - АТТС14580 и DSM13 - был обнаружен кластер генов, предположительно кодирующий двухкомпонентную систему лантибиотиков, включая два структурных гена (АТТС14580: bliAl и bliA2\ DSM13: licAl и licA2). Соответствующие им двухкомпонентные системы (пептиды Blia и Büß, Lica и Ließ) были только частично охарактеризованы (Begley M. et al., 2009; Dischinger J. et al., 2009).

7.2.2. Определение нуклеотидной последовательности кластера генов лантибиотиков в геноме Bacillus licheniformis VK21.

Нами была определена нуклеотидная последовательность кластера генов лантибиотиков в геноме Bacillus licheniformis VK21, включая структурные гены предшественников лантибиотиков (IchAl и lchA2) и модифицирующих их ферментов (IchMl и lchM2). Для амплификации фрагментов генома Bacillus licheniformis VK21, содержащих гены предшественников лантибиотиков и ферментов, осуществляющих их посттрансляционные модификации, были сконструированы ген-специфичные праймеры на основе известной нуклеотидной последовательности генов lanAl, 1апА2 и lanMl из штамма Bacillus licheniformis АТСС14580 и проведена «гнездовая» ПЦР.

На первом этапе в качестве матрицы использовалась геномная ДНК В. licheniformis VK21, на втором - продукты первой реакции в разведении 1:20. Полученные на каждом этапе продукты фракционировали в агарозном геле, фрагменты требуемой длины выделяли с помощью набора «Zymoclean Gel DNA Recovery Kit» (Zymo Research, США). Нуклеотидная последовательность определялась секвенированием по методу Сэнгера. Было установлено, что предшественники лантибиотиков LchAl и LchA2 состоят из 74 и 72 аминокислотных остатков, соответственно В структуре предшественников лантибиотков LchAl и LchA2 можно выделить две функциональные части: N-концевые л ядерные последовательности, обогащенные заряженными аминокислотными остатками, и С-концевые гидрофобные последовательности самих пропептидов (рис. 30).

Ich Ш lchA2 IchAl IchMl

LchAl

HalAl PluAl

SmbAl BhtAl

LtnAl SacAl Mrs

Leader peptide of LchAl:

MSKKEMILSWKNPMYRTE S SÏHPAGNILKELQEEEQHSI AGG

...3.954.000

m fcifoi

LchA2 TPATTSSHTCXTAGV'IV-iÎASLCMrTEÎISRr; 32

HalA2 «WPCATVGV---Щ&ХЩЩТ1Ш!Щ 24

PlwA2 SGIPCTIGAAVAA6lAVgP3rrKCSKK£ GKKXK 32

SmbA2 BhtA2

STPACAIGWGITVAVreiSTAO ÏSRCXNK SrPSlïAIGVVGirVÂVÎGXSTAC'ÏSBCIHK

LtnA2 TPAT---PA-ISILSAÏISTHT iPÏTRÎÏRAi

SacA2 GTPLALL-GGAATGVIGYISNQTCPTTAC'TRAC

Leader peptide of LchA2 : MKMSAAREAFKGAMHPAGMVSEEELKALVGGITOVNPE

Hi 8

tl H ?

WW WW

нГН

Рис. 30. (А) Структура кластера генов двухкомпоненпюго

л антибиотика лнхеницидина в геноме Bacillus licheniformis VK21. (Б,В) Сравнение аминокислотных последовательностей предшественников лантибиотиков LchAl н LchA2 и пропептидов других выделенных ранее лантибиотиков. Остатки Ser/Thr, посттрансляционно модифи-цированные до D-Ala/OBu, выделены зеленым и жёлтым цветами Другие остатки Ser/Thr выделены бирюзовым цветом, а ^модифицированные остатки подчеркнуты. Остатки Cys показаны малиновым цветом. Тиоэфирные и дисульфицные связи отмечены стрелками и выделены серым фоном. Тиоэфирные кольца в зрелых пептидах Lcha и Lchß отмечены латинскими буквами A,B,C,D. Наиболее вероятный сайт расщепления протсааой LchT показан красным цветом.

(Г) Структуры посттрансляционно модифицированных аминокислотных остатков: (1) 2-оксомаспяная кислота (Obu); (2) Ri=H, 2,3-диаегидроаланин (Dha, U); Ri=CH;, 2,3-дидегидробугирин (Dhb, О); (3) R2=H, лантионин (Ala-S-Ala, Lan); R2=CH3, 3-метиллантионин (Abu-S-AIa, MeLan).

ГХ1 J в 11 I с I D I

X3SLSg^LSKPLGHKGYI.::rytKgOMgSg

CAHYNI №:RLGHKGAT®ili^VEßMPSj К KUHNIS DLGKNGBV ÏLSHECQVS'.'

В состав лидерных последовательностей обоих пептидов входят сайты расщепления Gly-Gly. В структуре и предшественника LchA2 присутствует дополнительный сайт расщепления, следующий за сайтом Gly-Gly и состоящий из 6 аминокислотных остатков. Установленная нуклеотидная последовательность кластера генов депонирована в GenBank под регистрационным номером GU949560.

7.23. Культивирование штамма Bacillus licheniformis VK21 и выделение индивидуальных лантибнотнков Leba и Lchß.

Культуру штамма Bacillus licheniformis VK21 выращивали на LB-агаре при 45'С в течение 16 часов. Культивирование проводили в среде С2Мп (0,15% казаминовые кислоты, 0,02% KCl, 0,3% К2НРС>4, 0,1% КН2Р04, 0,02% MgS0„*7H20, 0,001% MnS04x5H20, 0,4% сахароза, pH 7,3) при температуре 45'С и 220 об/мин в течение 6 часов до выхода культуры на стационарную фазу роста. Культуральную жидкость центрифугировали и супернатант концентрировали. Для удаления высокомолекулярных соединений к полученному раствору добавляли двойной объем ацетона и проводили повторное центрифугирование. Супернатант упаривали в вакууме на роторном испарителе и перерастворяли в воде, после чего проводили экстракцию бутанолом. Бутанольную фракцию упаривали досуха, нерерастворяли и наносили на колонку Silasorb С8. Дальнейшее разделение проводили с помощью двухстадийной обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонках Diasorb-130C8T и Diaspher-110С4(рис. 31).

Рис. 31. Выделение ЬсЬа и ЬсЬр (А) Фракционирование грубого экстракта, содержащего лнхеницидин УК21, методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке П1ачогЬ-130С8Т. Активные фракции 1 и 2 заштрихованы. (Б,В) Разделение фракций 1 и 2 методом обращенно-фазовой ВЭЖХ на колонке Ь|азрЬег-110С4. Активные фракции, содержащие ЬсЬа и ЬсЬР, заштрихованы. (Г,Д) ВЭЖХ индивидуальных пептидов ЬсЬа и ЬсЬр.

Наличие искомых пептидов во фракциях устанавливали с помощью теста на антимикробную активность. Выделенные пептиды исследовали методом времяпролётной МАЛДИ масс-спектрометрии на приборе Reflex Ш Broker. В результате из культуральной жидкости терморезистентной бактерии Bacillus licheniformis VK21 было выделено два новых пептидных антибиотика Lcha и Lchp с молекулярной массой 3249,51 Да и 3019,36 Да, соответственно. Пептиды Lcba и Lchp образуют двухкомпонентную синергическую систему, названную лихеницидином VK21.

7.2.4. Антимикробная активность выделенных пептидов Lcba ■ Lcbp.

Для определения антимикробной активности выделенных пептидов в качестве тест-культур использовали штаммы бактерий Bacillus subtilis LI, Rhodococcus sp. SS2, Micrococcus luteus B1314, Pseudomonas aeruginosa PAOl; Pseudomonas putida 1-97. Перечисленные штаммы бактерий были получены из коллекции Института биохимии и физиологии микроорганизмов РАН. Штамм Escherichia coli С600 был получен из коллекции Филиала Института биоорганической химии РАН (Пущино). Штамм Bacillus megaterium VKM41 был получен их Всероссийской коллекции микроорганизмов (Пущино). Штамм Staphylococcus aureus 209р был получен из Кубанской государственной медицинской академии (Краснодар). Штаммы бактерий Bacillus pumilus 2001, Bacillus globigii I, Bacillus amyloliquefaciens I, Mycobacterium smegmatis 1171, Mycobacterium phlei 1291 были получены из ГНУ НИИ пушного звероводства и кролиководства имени В.А.Афанасьева (Родники, Московская обл.). Количественную оценку антибактериальной активности пептидов проводили методом двукратных серийных разведений в жидкой питательной среде. Был определен спектр антимикробной активности и минимальные ингибирующие концентрации в отношении перечисленных тест-культур (табл. 8).

ICso определялась как концентрация пептида, необходимая для ингябирования роста тест-культуры на 50%. Значение MIC соответствовало минимальной концентрации пептида, полностью подавляющей рост тест-культуры при инкубации в течение ночи. МВС определялось с помощью внесения 110 мкл культуры из каждой лунки, где не наблюдался рост тест-культуры при определении MIC, на LB-агар н дальнейшей инкубации культуры в течение ночи. МВС соответствало минимальной концентрации пептида, предотвращающей рост тест-культуры на поверхности LB-агара после инкубации в течении ночи и приводящей к подавлению >99,9% CFU по сравнению с контролем.

При тестировании смеси Lcha и Lchp было установлено синергическое действие индивидуальных пептидов против грамположительных бактерий. Хотя антимикробная активность индивидуальных пептидов Lcha и Lchp проявляется в микромолярных концентрациях, их смесь в соотношении 1:1 вызывает от 20- до 50-кратного повышения активности в зависимости от тест-культуры по сравнению с активностью индивидуальных пептидов. Синергическое действие пептидов Lcba и Lchp позволяет наблюдать активность их смеси в отношении рада грамположительных бактерий даже в наномолярном диапазоне концентраций. Наряду с этим, ни индивидуальные пептиды, ни их смесь не обладали активностью против грамотрицательных бактерий.

Таблица 8. Антимикробная активность лихеницидина VK21 и индивидуальных пептидов Lcha and Lchß.

Пептиды Концентрация, pM B. megaterium B. subtilis M. luteus Rhodococcus sp. S. aureus

Lcha IC50 1,8 9,0 1,2 9,0 3,1

MIC 7,2 15,0 >4,8 >15,0 18,4

MBC 10,8 >36 H.O. И.о. >46,1

MBC MIC 1,5 H.O. H.O. H.O. >2,5

Lchß ICso 2,0 30,0 2,6 16,6 20,0

MIC 12,0 >50,0 >5,3 >16,6 50,0

MBC >12,0 и.о. H.O. H.O. H.O.

MBC MIC и.о. H.O. H.O. H.O. H.O.

Lcha + Lchß ici0 0,12 0,64 0,09 0,64 0,64

MIC 0,48 0,96 0,17 >2,56 0,96

MBC 0,96 3,84 1,92 H.O. >4,8

MBC MIC 2,0 4,0 11,0 H.O. >5,0

Рис. 32. (А-Д) Антимикробная активность смеси Lcha+Lchß (в соотношении 1:1) против различных грашюложительных бактерий (о) Контроль без пептидов. (Е) Эффект смеси Lcha+Lchß на рост Bacillus megaterium VKM41 при различных молярных соотношениях пептидов и концентрациях, показанных белым (0,36 рМ), серым (0,24 цМ) и черным (0, (2 рМ) цветами.

S. fvbrilb

Afl.MtfM S6§tM

Сравнительное исследование антимикробной активности выделенных лантибиотиков Lcha и Lchp и их смесей проводилось с целью выявления оптимального соотношения индивидуальных пептидов для проявления синергизма их антибиотического действия. Была исследована антимикробная активность смеси Lcha и Lchp при различных концентрациях и молярных соотношениях индивидуальных пептидов (рис. 32). Показано, что смесь Lcha и Lchp наиболее активна при молярном соотношении индивидуальных пептидов 1:1 (рис. 32Е).

Таким образом, установлено, что лихеницидин VK21 является новым двухкомпонентным лантибиотиком, индивидуальные компоненты которого обладают синергическим действием.

7.2.S. Определение структуры выделенных пептидов Lcha н Lchp.

g LchA2 прелептед

«""Л »"Л „

LMder - Л'-- -(BJVMPE- TTVATTSSHTC l "AííV'. V'AST.

LchM2 (оепдоатадеОДислкзэц«в!

I ® I Г*-1 ГSn

Z -ШЛ1ЮТ- ООРАОСАОК^А lOUSVCVflASU- PÁCSA J&W

LchT? J (сежреиия/протеопиз)

rs-i r5-i

HDVNPE- OPäOOAUWTAIOAGVOVAASI^ pXc*AASRA

допопн*тепьмый гротеопкэ.

- NDVNPS - NHs «-НЮ4

♦ N-*OMueeoco DtiB до Obu

LchA1 препептнд

Le*de Г -Gr- -ТГП. SIT AXLSKPUan#STIX- TVTKECKi'S'.'N

- 7 НзО-*-'! (o

r5-! I ...

Leader--;:; - ОХА1.КйА1ЬЛКРЬСКЖГГЪА AVAKEAMPSí\N

I „„TV

| {омредекпротестз} I Ls_l

NHi » НЮЧ-^j cnowiaM** Зрелым Lehe

Галодурацин « (Hala)

Мерсацадин (Mrsl

Лактицкн 3147 AI

(Una)

Лдг'иции 3147 А2

(Un»

Рис. 33. Сравнение структур компонентов лихеницидина УК21 - пептидов ЬсЬа и 1хЬр - с другими лантибиотиками. (А,Б) Первичные структуры и предполагаемый механизм созревания пептидов Lcha и ЬсЬр. (В) Первичные структуры других лантибиотиков. Домены, связывающие липид П, обведены зеленым цветом.

Структуры выделенных пептидов ЬсЬа и 1хЬ0 были установлены совместно с лабораторией биомолекулярной ЯМР-спектроскопии ИБХ РАН (с.н.с. З.О.Шенкарёв, зав. лаб. проф. А.С.Арсеньев) с применением методов ЯМР-спектроскопии и масс-спектрометрии. Установлено, что каждый из выделенных пептидов содержит 31 аминокислотный остаток, 4 внутримолекулярных тиоэфирных связи и Ъ!-концевой остаток 2-оксомасляной кислоты (рис. 33).

Пространственные структуры ЬсЬа и ЬсЬ(3 были установлены методом ЯМР-спектроскопии в растворе метанола. ЬсЬа проявляет черты структурной гомологии с мерсацидин-подобными лантибиотиками и содержит относительно хорошо структурированные >1- и С-концевые домены, связанные между собой подвижной | петлей, стабилизированной тиоэфирной связью А1а11 -8-А1а21. Напротив, ЬсЬр представляет собой вытянутую гидрофобную а-спираль, фланкированную более подвижными М- и С-концевыми доменами (рис. 34).

7.2.6. Модель антимикробного действия лихеницидияа VK21.

Выделенные нами из культуры штамма В. Ucheniformis VK21 пептиды Lcha и Lchp принадлежат к группе двукомпонентных лантибиотиков. Они способны ингибировать рост широкого числа грамположительных бактерий, таких как Staphylococcus aureus. Bacillus megaterium, Micrococcus luteus, Bacillus subtilis. Антибактериальная активность смеси этих пептидов проявляется в наномолярных концентрациях. С целью построения модели антибиотического действия было проведено сравнение структурно-функциональных характеристик выделенных пептидов и других лантибиотиков.

На основании сходства пространственной структуры лантибиотики подразделяются на две группы. К первой группе относятся пептиды, формирующие поры в мембране клеток-мишеней (низин, Рер5, эпидермин). Ко второй группе относят лантибиотики, механизм действия которых связан с нарушением процесса биосинтеза клеточной стенки (циннамицин, дурамицин, мерсацидин).

Рис. 34. Пространственные структуры лантибиотиков Lcha и Lchp в метаноле.

Современная концепция молекулярного механизма антимикробного действия двухкомпонентных лантибиотиков включает представление о многостадийном процессе, результатом которого является порообразование в мембране и гибель клетки-мишени. На первой стадии этого процесса а-компонент селективно связывается с липидом II клеточной стенки бактерии. Второй этап процесса заключается в селективном связывании образовавшегося комплекса а-компонент/липид II с (5-компонентом, представляющим собой вытянутую спираль, в соотношении 1:1. В лантибиотиках идентифицированы два типа мотивов, связывающих липид II. Один их них обнаружен в низине и низин-подобных пептидах (галлидермин, эпидермин, мутации 1140, субтилин). Взаимодействие этого мотива с липидом II препятствует дальнейшему вовлечению последнего в биосинтез клеточной стенки. Второй тип липид П-связывающего мотива был обнаружен в мерсацидине и мерсацидин-подобных лантибиотиках (плантарицин С, лактицин 481, а-компоненты лактицина 3147 и галодурацина). Образование комплекса с липидом II в этом случае ингибирует реакцию трансгликозилирования в процессе биосинтеза пептидогликана.

Полученные в рамках данной работы структурные данные позволяют предложить модель антимикробного действия лихеницидинов. ЬсЬа проявляет черты структурного сходства с мерсацидин-подобными лантибиотиками и низином А в участках, ответственных за связывание с липидом II клеточной стенки бактерий, что позволяет высказать предположение об аналогичном механизме антимикробного действия лихеницидина УК21. Вероятнее всего, ЬсЪа образует комплекс с липидом II с участием одного или двух предполагаемых сайтов связывания (низин-подобным и/или мерсацидин-подобным). Последующее вовлечение ЬсЬр во взаимодействие с этим комплексом в соотношении 1:1, по-видимому, может опосредовать его внедрение в мембрану, что приводит к порообразованию. Эта модель подтверждается рядом экспериментальных данных. Во-первых, смесь ЬсЬа+1хЬр проявляет антимикробную активность в наномолярном диапазоне концентраций, что свидетельствует о наличии специфической молекулярной мишени на мембране клетки. Структурное сходство липид Н-связывающих мотивов ЬсЬа и других лантибиотиков указывает на липид II как на наиболее вероятную мишень для связывания с ЬсЬа. Центральный домен Ьс1ф представляет собой протяженную спираль длиной около 23 ангстрем, что достаточно для пронизывания липидного бислоя. Предложенная модель хорошо согласуется с данными о синергическом действии ЬсЬа и ЬсЬ(3, максимальный эффект от которого достигается при соотношении индивидуальных пептидов 1:1. Полученные данные позволяют объяснить более слабую активность индивидуальных пептидов. Скорее всего, взаимодействие индивидуального ЬсЬа и липида II ингибирует биосинтез пептидогликана, а катионный 1,сЬр сам по себе может связываться с анионными липидами мембраны бактериальной клетки и приводить к образованию пор по аналогии с механизмом действия низина в отсутствие липида II.

выводы

1. Установлена первичная структура новых антимикробных пептидов ареницинов из целомоцитов морского кольчатого червя Arenicola marina. Определены полные нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующих белки-предшественники ареницинов, и соответствующие им аминокислотные последовательности препроареницинов. Показано, что ареницины не обладают структурной гомологией ни с одним из ранее известных антимикробных пептидов и могут быть названы первыми представителями нового семейства пептидных антибиотиков. В то же время, последовательности продоменов предшественников ареницинов обладают гомологией со структурой предшественников хондромодулинов позвоночных в области домена BRICHOS. Показано, что ареницины обладают широким спектром микробицидного, в том числе антибактериального и противогрибкового действия.

2. Сконструированы биотехнологические системы для гетерологичной экспрессии ареницина в Е. coli в составе различных гибридных белков. Получен штамм-продуцент, позволяющий экспрессировать гибридный белкок, содержащий ареницин. Разработан способ получения, методика выделения и очистки рекомбинантного ареницина, полностью идентичного природному пептидному антибиотику, а также его аналогов, меченных стабильными изотопами l5N и 13С. С использованием полученных рекомбинантных аналогов изучены физико-химические свойства рекомбинантного ареницина. На основании полученных данных предложена модель, описывающая механизм антимикробной активности пептида.

3. Установлена первичная структура нового антимикробного пептида аурелина из мезоглеи сцифоидной медузы Aurelia aurita. Определена полная нуклеотидная последовательность кДНК, кодирующей белок-предшественник аурелина, и соответствующая ей полная аминокислотная последовательность препроаурелина. Проанализированы структурные особенности аурелина и его предшественника в сравнении с другими антимикробными пептидами беспозвоночных Показано, что аурелин является новым пептидом, не обладающим существенной гомологией ни с одним из известных ранее антимикробных пептидов. В то же время, обнаружены некоторые черты его структурного сходства с дефенсинами, а также токсинами морских анемон - блокаторами калий-селективных каналов, что может быть следствием их дивергентной эволюции от общего предшественника. Установлено, что аурелин обладает антибактериальным и противогрибковым действием.

4. Сконструирована биотехнологическая система для гетерологичной экспрессии аурелина в Е. coli в составе гибридного белка. Получен штамм-продуцент, позволяющий экспрессировать гибридный белок, содержащий аурелин. Разработан способ получения, методика выделения и очистки рекомбинантного аурелина, полиостью идентичного природному пептидному антибиотику, а также его аналога, меченного стабильным изотопом 1SN. С использованием полученных рекомбинантных аналогов аурелина изучены физико-химические свойства пептида.

5. Сконструирована биотехнологическая система для гетерологичной экспрессии в клеках Е. coli буфорина-2, антимикробного пептида из желудка азиатской жабы Bufo bufo gargarizans. Получен штамм-продуцент, позволяющий экспрессировать с высоким выходом гибридный белок, содержащий буфорин-2. Разработан способ получения, методика выделения и очистки генно-инженерного буфорина-2, позволяющий получать рекомбинантный пептидный антибиотик, полностью идентичный природному по молекулярной массе, аминокислотной последовательности и антимикробной активности.

6. Выделен новый дефенсин из семян чечевицы Lens culinaris и установлена его структура. Определена полная последовательность кДНК, кодирующей белок-предшественник дефенсина чечевицы, и соответствующая ему полная аминокислотная последовательность. Установлено, что дефенсин чечевицы обладает активностью против ф иго патогенных грибов. Проведен сравнительный анализ структурных и биологических характеристик нового дефенсина и ранее известных дефенсинов бобовых растений.

7. Сконструирована биотехнологическая система для гетерологичной экспрессии дефенсина чечевицы в клеках Е. coli. Получен штамм-продуцент, позволяющий экспрессировать гибридный белок, содержащий дефенсин чечевицы. Разработан способ получения, методика выделения и очистки генно-инженерного дефенсина, позволяющий получать антимикробный пептид, полностью идентичный природному пептидному антибиотику, а также его аналог, меченный стабильным изотопом i5N. С использованием полученных рекомбинантных аналогов дефенсина чечевицы изучены физико-химические свойства пептида, показано сходство структур дефенсина чечевицы и других растительных дефенсинов.

8. В семенах чечевицы Lens culinaris обнаружено восемь новых липид-транспортирующих белков. Разработана методика выделения и установлена структура четырех липид-транспортирующих белков из семян чечевицы Lens culinaris. Установлены структуры полноразмерных кДНК, кодирующих белки-предшественники шести изоформ липид-транспортирующих белков из семян чечевицы Lens culinaris, и соответствующие им полные аминокислотные последовательности. Показано, что липид-транспортирующие белки чечевицы обладают антибактериальной активностью и ингибируют рост фитопатогенных грибов.

9. Сконструирована биотехнологическая система для гетерологичной экспрессии в клеках Е. coli липид-транспортирующего белка Lc-LTP2 из семян чечевицы Lens culinaris. Получен штамм-продуцент, позволяющий экспрессировать гибридный белок, содержащий липид-транспортирующий белок чечевицы. Разработан способ получения, методика выделения и очистки генно-инженерного липид-транспортирующего белка, позволяющие получить антимикробный пептид, полностью идентичный природному липид-транспортирующему белку, а также его аналог, меченный стабильным изотопом С использованием полученных рекомбинантных аналогов липид-транспортирующего белка чечевицы изучены физико-химические свойства пептида, показано сходство структур Lc-LTP2 и других растительных липид-транспортирующих белков. Установлено, что липид-транспортирующий белок чечевицы Lc-LTP2 является новым пищевым аллергеном. LC-LTP2 внесен в международную базу данных по аллергенам как Len с 3.

10. Разработаны методики выделения и очистки антимикробных пептидов зервамицина IIB и антиамебина I из мицелиальных спорообразующих грибов Emericellopsis salmocynnemata и Emericellopsis minima, соответственно, а также биотехнологический способ получения их аналогов, меченных стабильными изотопами 13С и Используя |3С,15Ы-меченые аналоги зервамицина IIB и антиамебина I изучены физико-химические свойства пептаиболов в мембрано-моделирующих средах. На основании полученных данных предложена модель, описывающая различия в механизмах действия зервамицина и антиамебина. Выявлена нейротропная активность зервамицинов, изучено их влияние на локомоторную и поисковую активность, а также на температуру тела лабораторных животных.

11. Выделены новые антимикробные пептиды латероцидин и латероцин из ппаммов аэробных грамположительных бактерий Brevibacillus laterosporus ВКПМ В-8287 и ВКПМ В-10531, соответственно, и установлена их первичная структура.

12. Выделен новый двухкомпоиентный л антибиотик лихеницидин VK21 из штамма терморезистентных грамположительных бактерий Bacillus lichenifromis VK21 и установлена структура каждого его компонентов - пептидов Lcha и Lchß. Проанализированы структурные особенности лихеницидина VK21 в сравнении с другими лантибиотиками. Изучен спектр антибактериальной активности лихеницидина VK21 и исследован синергизм действия его компонентов -лантибиотиков Lcha и Lchß. Предложена модель, описывающая механизм антибактериальной активности двухкомпонентного л антибиотика лихеницидина VK21.

Список опубликованных работ по теме диссертации.

Статьи.

1. Shenkarev Z.O., Balandin S.V., Trunov K.I., Paramonov A.S., Sukhanov S.V., Barsukov L.I., Arseniev A.S., Ovchinnikova T.V. Molecular mechanism of action of P-hairpin antimicrobial peptide arenicin: oligomeric structure in DPC micelles and pore formation in planar lipid bilayers // Biochemistry (USA). - 2011. - V.50. -P.6255-6265.

2. Salnikov E.S., Aisenbrey C., Balandin S.V., Zhmak M.N., Ovchinnikova T.V., Bechinger B. Structure and alignment of the membrane-associated antimicrobial peptide arenicin by oriented 15N and 31P solid-state NMR spectroscopy II Biochemisrty (USA). -2011.- V.50. - P.3784-3795.

3. Machan R., Hof M., Chernovets Т., Zhmak M.N., Ovchinnikova T.V., Sykora J. Formation of arenicin-1 clusters in bilayers and their specific lipid interaction revealed by z-scan FCS // Analytical & Bioanalytical Chemistry. - 2011. - V.399. - P.3547-3554.

4. Novgorodov S.A., Wu B.X., Gudz T.I., Bielwaski J., Ovchinnikova T.V., Hannun Y.A., Obeid L.M. Novel pathway of ceramide production in mitochondria: thioesterase and neutral ceramidase produce ceramide from sphingosine and acyl-CoA // J. Biol. Chem. -2011. - V. 286. - P.25352-25362.

5. Shenkarev Z.O., Finkina E.I., Nurmukhamedova E.K., Balandin S.V., Mineev K.S., Nadezhdin K.D., Yakimenko Z.A., Tagaev A.A., Temirov Y.V., Arseniev A.S., Ovchinnikova T.V. Isolation, structure elucidation, and synergistic antibacterial activity of a novel two-component lantibiotic lichenicidin from Bacillus licheniformis VK21 // Biochemistry (USA). - 2010. - V.49. - P.6462-6472.

6. Stavrakoudis A., Tsoulos I.G., Shenkarev Z.O., Ovchinnikova T.V. Molecular dynamics simulation of antimicrobial peptide arenicin-2: р-hairpin stabilization by noncovalent interactions // Biopolymers. - 2009. - V.92. - No.3. - P. 143-155.

7. Stegemann C., Kolobov A., Leonova Y.F., Shamova O., Ovchinnikova T.V., Kokryakov V.N., Hoffmann R. Isolation, purification and de novo sequencing of TBD-1, the first beta-defensin isolated from reptiles // Proteomics. - 2009. -V.9. - No.5. - P. 13641373.

8. Milov A.D., Samoilova R.I., Shubin A.A., Gorbunova E.Y., Mustaeva L.G., Ovchinnikova T.V., Raap J., Tsvetkov Y.D. Self-aggregation and orientation of the ionchannel forming zervamicin IIA in the membranes of ePC vesicles studied by CW EPR and ESEEM spectroscopy // Appl. Magnetic Reson.- 2009. - V.39. - P.75-84.

9. Шенкарёв 3.O., Люкманова E.H., Соложенкин О.И., Гагнидзе И..Э, Некрасова О.В., Чупин В.В., Тагаев А.А., Якименко З.А., Овчинникова Т.В., Кирпичников В.П., Арсеньев А.С. Липид-белковьге нанодиски: возможность применения для ЯМР-исследований мембранных белков и мембрано-активных пептидов И Биохимия. -2009. - Т.74. - Вып. 7. - С.933-945.

10. Ovchinnikova T.V., Shenkarev Z.O., Balandin S.V., Nadezhdin K.D., Paramonov A.S., Kokryakov V.N., Arseniev A.S. Molecular insight into mechanism of antimicrobial action of the р-hairpin peptide arenicin: specific oligomerization in detergent micelles // Biopolymers. - 2008. - V.89. - P.455-464.

11. Finkina E.I., Shramova E.I., Tagaev A.A., Ovchinnikova T.V. A novel defensin from the lentil Lens culinaris seeds II Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2008. - V. 371. -No. 4. - P. 860-865.

12. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Pararaonov A.S., Sobol A.G., Ovchinnikova T.V., Chupin V.A., Kirpichnikov M.P., Blommers M.J.J., Arseniev A.S. Lipid-protein nanscale bilayers: a versatile medium for NMR investigations of membrane protein and membrane-active peptides // J. Am. Chem. Soc. - 2008. - V. 130. - P.2140-2141.

13. Дьяченко И.А., Мурашев A.H., Овчинникова T.B. Особенности нейротропной активности зервамицинов IIA и IIB // Доклады Академии наук. - 2008. -Т.419. - №.3. - С.403-405.

14. Дьяченко И.А., Мурашев А.Н., Овчинникова Т.В. Исследование нейротоксичности пептаиболов зервамицинов // Токсикологический вестник. - 2008. -Т.З. - С.35-38.

15. Ovchinnikova T.V., Shenkarev Z.O., Nadezhdin K.D., Balandin S.V., Zhmak M.N., Kudelina I.A., Finkina E.I., Kokryakov V.N., Arseniev A.S. Recombinant expression, synthesis, purification, and solution structure of arenicin // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2007. - V.360. - No. 1. - P. 15 6-162.

16. Овчинникова T.B., Мурашев A.H. Антибиотик-пептаибол зарвамицин обладает нейротропной активностью // Доклады Академии наук. - 2007. - Т.414. - №5. - С.707-709.

17. Ovchinnikova T.V., Levitskaya N.G., Voskresenskaya O.G., Yakimenko Z.A., Tagaev A.A., Ovchinnikova A.Y., Murashev A.N., Kamenskii A.A. Neuroleptic properties of the ion channel-forming peptaibol zervamicin: locomotor activity and behavioral effects //Chemistry and Biodiversity. - 2007. - V.4. -No.6. - P. 1374-1387.

18. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Nadezhdin K.D., Bocharov E.V., Kudelina I.A., Skladnev D.A., Tagaev A.A., Yakimenko Z.A., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. Antiamoebin-I in methanol solution: rapid exchange between right-handed and left-handed Зю-helical conformations // Chemistry and Biodiversity. - 2007. - V.4. - No.6. - P.1219-1242.

19. Milov A.D., Tsvetkov Y.D., Gorbunova E.Y., Mustaeva L.G., Ovchinnikova T.V., Handgraaf J.-W., Raap J. Solvent effects on the secondary structure of the membrane-active zervamicin determined by PELDOR spectroscopy II Chemistry and Biodiversity. -2007.-V.4. -No.6. - P.1243-1255.

20. Финкина Е.И., Баландин C.B., Серебрякова M.B., Потапенко H.A., Тагаев

A.A., Овчинникова T.B. Выделение и первичная структура новых липид-транспортирующих белков из проращённых семян чечевицы (Lens culinaris) // Биохимия. - 2007. - Т.72. - №4. - С.533-543.

21. Берлов М.Н., Кораблёва Е.С., Андреева Ю.А., Овчинникова Т.В., Кокряков

B.Н. Лактоферрин из нейтрофилов собаки: выделение, физико-химические и антимикробные свойства // Биохимия. - 2007. - Т.72. - №4. - С.551 -559.

22. Ovchinnikova T.V., Balandin S.V., Aleshina G.M., Tagaev A.A., Leonova Y.F., Krasnodembsky E.G., Men'shenin A.V., Kakryakov V.N. Aurelin, a novel antimicrobial peptide from jellyfish Aurelia aurita with structural features of defensins and channel-blocking toxins // Biochem. Biophys. Res. Commun. - 2006. - V.348. - No.2. - P.514-523.

23. Raap J., Hollander J., Ovchinnikova T.V., Swischeva N.V., Skladnev D.A., Kiihne S.. Trans and surface membrane bound zervamicin IIB: 13C-MAOSS-NMR at high spinning speed // J. Biomol. NMR. - 2006. - V.35. - No.4. - P.285-293.

24. Шамова О.В., Орлов Д.С., Овчинникова Т.В., Сал Х.Г., Тверьянович И.А., Попова В.А., Орлов С.Б., Дюбнн В.А., Кокряков В.Н. Антимикробные пептиды из лейкоцитов русского осетра (Acipenser guldenstadti) И Фундаментальные исследования. Биологические науки. - 2006.- №1.-С.10-13.

25. Kropacheva T.N., Salnikov E.S., Nguyen Н.-Н., Reissmann S., Yakimenko Z.A., Tagaev A.A., Ovchinnikova T.V., Raap J. Membrane association and activity of membered peptide antibiotics: zervamicin IIB, ampullosporin A and antioamoebin I // BBA. - 2005. -V.1715. - No.l- P.6-18.

26. Ovchinnikova T.V., Aleshina G.M., Balandin S.V., Krasnosdembskaya A.D., Markelov M.L., Frolova E.I., Leonova Y.F., Tagaev A.A., Krasnodembsky E.G., Kokryakov V.N. Purification and primary structure of two isoforms of arenicin, a novel antimicrobial peptide from marine polychaeta Arenicola marina II FEBS Lett. - 2004. -V.577. -No.1-2. - P.209-214.

27. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Balashova T.A., Yakimenko Z.A., Ваш M.B., Mustaeva L.G., Raap J., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. High stability of the hinge region in the membrane-active peptide helix of zervamicin: paramagnetic relaxation enhancement studies // Biochem. Biophys. Res. Commun. -2004. - V.325. - No.3- P. 10991105.

28. Shenkarev Z.O., Balashova T.A., Yakimenko Z.A., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. Peptaibol zervamicin IIB structure and dynamics refinement from trans-hydrogen bond ] couplings // Biophys J. - 2004. - V.86. - No.6. - P. 3687-3699.

29. Мальцева A.JI., Алешина Г.М., Кокряков B.H., Овчинникова Т.В., Краснодембский Е.Г. Новые антимикробные пептиды из целомоцитов Asterias rubens И Вестник СпбГУ. - 2004. - Сер.З. - Вып.4. - С.98-103.

30. Шенкарёв З.О., Парамонов А.С., Балашова Т.А., Овчинникова Т.В., Арсеньев А.С. Высокая стабильность шарнирного региона в спиральном каналообразующем антибиотике зервамицине IIB в растворе метанола по данным парамагнитного усиления ЯМР релаксации П Успехи современного естествознания. -2004.-Т.2.- №6,- С. 62-63.

31. Ovchinnikova T.V., Shenkarev Z.O., Yakimenko Z.A., Swischeva N.V., Tagaev A.A., Skladnev D.A., Arseniev A.S. Biosynthetic uniform l3C,15N-labelling of zervamicin IIB. Complete 13C and 15N NMR assignment // J. Pept. Sci. - 2003. - V.9. - No.11-12. -P.817-826.

32. Zolotarev Y.A., Dadayan A.K., Borisov Y.A., Dorokhova E.M., Kozik V.S., Vtyurin N.N., Bocharov E.V., Ziganshin R.N., Lunina N.A., Kostrov S.V., Ovchinnikova T.V., Myasoedov N.F. The effect of three-dimensional structure on the solid state isotope exchange of hydrogen in polypeptides with spillover hydrogen // Bioorg. Chem. (USA). -2003. - V.31. - No.6. - P.453-463.

33. Milov A.D., Tsvetkov Y.D, Gorbunova E.Y., Mustaeva L.G., Ovchinnikova T.V., Raap J. Self-aggregation of spin-labelled zervamicin IIA in the solvents of low polarity studies by PELDOR spectroscopy // Biopolymers. - 2002. - V.64. - No.6. - P.328-336.

34. Shenkarev Z.O., Balashova T.A., Efremov R.G., Yakimenko Z.A., Ovchinnikova T.V., Raap J., Arseniev A.S. Spacial structure of zervamicin IIB bound to DPC micelles. Implication for voltage-gating // Biophys. J. - 2002. - V.82. - No.2. - P.762-771.

35. Крачковский С.А., Соболь А.Г., Овчинникова Т.Н., Тагаев А.А., Якименко З.А., Азизбекян P.P., Кузнецова Н.И, Шамшина Т.Н., Арсеньев А.С. Выделение, биологические свойства и пространственная структура антибиотика лолоатина А // Биоорганическая химия. - 2002. - Т.28. - № 4. - С.298-302.

36. Складнев Д.А., Рогожкина Е.А., Кондакова Е.В., Швец В.И., Свищева Н.В., Якименко З.А., Шенкарёв З.О., Овчинникова Т.В., Раап Я. Получение изотопно модифицированного 13С +15N пептидного антибиотика зервамицина IIB // Биотехнология. -2002. - Т.5. - С.33-41.

37. Bechinger В., Skladnev D.A., Ogrel A., Li X., Rogozhkina E.V., Ovchinnikova Т.V., O'Neil J.D., Raap J. ,5N and 31P solid-state NMR investigation on the orientation of zervamicin IIB and alamethicin in phosphatidylcholine membranes // Biochemistry (USA). -2001. - V.40. -No.31. - P.9428-9437.

38. Korshnev D.M., Bocharov E.V., Zhuravlyova A.V., Orekhov V.Y., Ovchinnikova T.V., Billeter M., Arseniev A.S. Backbone dynamics of the channel-forming antibiotic zervamicin IIB studied by 15N NMR relaxation // FEBS Lett. - 2001. - V.495. - No.1-2. -P.52-55.

39. Краснодембская А.Д., Алёшина Г.М., Лодыгин П.А., Овчинникова Т.В., Краснодембский Е.Г., Кокряков В.Н. Новые антимикробные пептиды из целомоцитов пескожила Arenicola marina (Polychaeta, Annelida) // Вестник СпбГУ. - 2001. - Сер.З. - Вып.4. - №27. - С. 104-108.

40. Меньшенин А.В., Алёшина Г.М., Леонова Л.Е., Краснодембский Е.Г., Овчинникова Т.В., Кокряков В.Н. Дефенсиноподобные пептиды сцифоидной медузы Aurelia aurita II Вестник СПбГУ. - 2001. - Сер.З. - Вып.4. - №27. - С.99-103.

41. Balashova Т.А., Shenkarev Z.O., Tagaev A .A., Ovchinnikova T.V., Raap J., Arseniev A.S. NMR structure of the channel-former zervamicin IIB in isotropic solvents // FEBS Lett. - 2000.- V.466. - P.333-336.

42. Кухтина B.B., Вайзе К., Осипов А.В., Старков В.Г., Титов М.И., Есипов С.Е., Овчинникова Т.В., Цетлин В.И., Уткин Ю.Н. MALDI-масс-спектрометрия для идентификации белков в яде змей II Биоорганическая химия,- 2000. - Т. 26.- №11. - С. 803-807.

43. Овчинникова Т.В., Тагаев А.А., Свищева Н.В., Якименко З.А., Сазыкин Ю.О. Структурно-функциональное изучение семейства антибиотиков зервамицинов из Emertcellopsis salmosynnemata // Биомедицинские технологии.-1999.- Т.П.-С. 1013.

44. Овчинникова Т.В., Тагаев А.А., Мартынова Н.Ю., Рысс И.С., Сазыкин Ю.О., Быков В.А. Выделение антибиотика-каналообразователя зервамицина из гриба Emericellopsis salmosynnemata И Биомедицинские технологии,-1998.- Т.8. - С.78-80.

45. Зайцева Л.Г., Зайцев В.Г., Фенюк Б.А., Павлов П.Ф., Виленская Н.Д., Овчинникова Т.В., Плужников К.А„ Гришин Е.В., Гринкевич В.А. Исследование белкового состава ядов некоторых видов тропических муравьев и их влияние на Н -АТФазу митохондрий // Биоорганическая химия. - 1995. - Т.21. - С. 563-370.

Обзор

46. Липкин В.М., Овчинникова Т.В.. Новейшие результаты в биоорганической химии и биотехнологии // Вестник Российской академии наук, 2010, т.80, №4, с. 356360.

Патенты

47. Овчинникова Т.В., Арсеньев А.С., Баландин С.В., Нурмухамедова Э.К., Тагаев А.А., Темиров Ю.В., Финкина Е.И., Шенкарёв З.О., Якименко З.А. Пептид LanAl, выделенный из бактерии Bacillus licheniformis VK21, обладающий антимикробным действием // Заявка № 2009139393. Приоритет изобретения 27.10.2009 г. Решение о выдаче патента от 16.08.2010 г. Патент на изобретение RU 2408732. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10.01.2011 г.

48. Овчинникова Т.В., Арсеньев А.С., Баландин С.В., Нурмухамедова Э.К., Тагаев А.А., Темиров Ю.В., Финкина Е.И., Шенкарёв З.О., Якименко З.А. Пептид LanA2, выделенный из бактерии Bacillus licheniformis VK21, обладающий антимикробным действием // Заявка № 2009139394. Приоритет изобретения

27.10.2009 г. Решение о выдаче патента от 12.08.2010 г. Патент на изобретение RU 2408604. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10.01.2011 г.

49. Овчинникова Т.В., Финкина Е.И., Баландин С.В. Плазмидный вектор pE-Lc-LTP, штамм бактерии Escherichia coli для экспрессии липид-транспортирующих белков чечевицы Lens culinaris и способ получения указанных белков // Заявка № 2009129838. Приоритет изобретения 04.08.2009 г. Патент на изобретение RU 2415940. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений 10.04.2011 г.

50. Баландин С.В., Финкина Е.И., Кокряков В.Н., Овчинникова Т.В. Плазмидный вектор pE-Trx-Aur, штамм Escherichia coli для экспрессии антимикробного пептида аурелина и способ получения указанного пептида // Заявка № 2009143085. Приоритет изобретения 24.11.2009 г. Решение о выдаче патента от

13.10.2010 г. Патент на изобретение RU 2412999. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 27.02.2011 г.

51. Азизбекян P.P., Овчинникова Т.В., Арсеньев А.С., Рубин А.Б., Кузнецова Н.И., Тагаев А.А., Шенкарёв З.О., Погосян С.И., Кузин А.И., Трунов К.И., Якименко З.А. Пептидный антибиотик бактериального происхождения латероцин, подавляющий развитие микроскопических водорослей // Заявка №2010113715. Приоритет изобретения 08.04.2010 г. Решение о выдаче патента от 26.04. 2011 г.

52. Баландин С.В., Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pE-Trx-Lc-def, штамм Escherichia coli для экспрессии антимикробного пептида дефенсина чечевицы Lens culinaris и способ получения указанного пептида//Заявка № 2010154169. Приоритет изобретения 30.12.2010 г.

53. Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК рЕТ-KSI-Buf2, кодирующая гибридный белок, содержащий антимикробный пептид буфорин-2, штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pET-KSI-Buf2 - продуцент указанного белка и способ получения антимикробного пептида буфорина-2 // Заявка №2007130536. Приоритет изобретения 09.08.2007 г. Решение о выдаче патента от 18.08.2008 г. Патент на изобретение RU 2347811. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений 27.02.2009 г.

54. Баландин С.В., Кокряков В.Н., Овчинникова Т.В. Рекомбинантная плазмидная ДНК pE-His8-TrxL-Ar2, кодирующая гибридный белок, содержащий антимикробный пептид ареницин морского кольчатого червя Arenicola marina, и штамм Escherichia coli BL21(DE3)/pE-His8-TrxL-Ar2 - продуцент гибридного белка, содержащего ареницин//Заявка № 2006121112. Приоритет изобретения 16.06.2006 г. Решение о выдаче патента от 02.07.2007 г. Патент на изобретение RU 2316590.

Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10.02.2008 г.

55. Баландин С.В., Кокряков В.Н., Овчинникова Т.В. Способ получения антимикробного пептида ареницина // Заявка № 2006121111. Приоритет изобретения 16.06.2006 г. Решение о выдаче патента 12.07.2007 г. Патент на изобретение RU 2316595. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10.02.2008 г.

56. Овчинникова Т.В., Алешина Г.М., Баландин С.В., Маркелов M.JL, Краснодембская А.Д., Кокряков В.Н. Пептиды ареницины, выделенные из морского кольчатого червя Arenicola marina, обладающие антимикробным действием // Заявка №2004103808. Приоритет изобретения 10.02.2004 г. Решение о выдаче патента 11.04.2005 г. Патент на изобретение RU 2261866. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10.10.2005 г.

57. Азизбекян P.P., Овчинникова Т.В., Шамшина Т.Н., Тагаев А.А., Смирнова Т.А., Якименко З.А., Кузнецова Н.И., Арсеньев А.С., Кузин А.И., Соболь А.Г., Орлова М.В. Циклодекапептидный антибиотик широкого спектра антагонистического действия латероцидин. Штамм бактерий Brevibacillus laterosporus, обладающий широким спектром антагонистического действия, - продуцент антибиотика латероцидина // Заявка № 2002129351. Приоритет изобретения 05.11.2002 г. Патент на изобретение RU 2229520. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 27.05.2004 г.

Избранные тезисы докладов на международных конференциях.

58. Shenkarev Z.O., Balandin S.V., Trunov K.I, Paramonov A.S., Sukhanov S.V., Barsukov L.I., Arseniev A.S., Ovchinnikova T.V. Oligomeric structure in DPC micelles and pore formation in planar lipid bilayers give the insight into molecular mechanism of antimicrobial action of beta-hairpin peptide arenicin II Abstracts of the 36th FEBS Congress "Biochemistry for Tomorrow's Medicine". - Torino, Italy. - 2011. - P. 124.

59. Овчинникова Т.В. Эндогенные антимикробные пептиды как молекулярные факторы врожденного иммунитета и прототипы лекарственных средств нового поколения // Труды VI Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. - 2011.- Т.1. - С.122-123.

60. Пантелеев П.В., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Получение вымеченного рекомбинантного антимикробного пептида аурелина // Тезисы докладов XXIII зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва. - 2011. -С.156.

61. Trunov K.I., Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Baurin P.V., Balandin S.V., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. Spatial structure and backbone dynamics of asymmetric dimer of р-hairpin antimicrobial peptide arenicin-2 in membrane mimicking environment // Abstracts of the Magnetic Resonance Conference "EUROMAR 2010". - Florence, Italy.-2010.-P.407.

62. Овчинникова Т.В. Разработка лекарственных средств нового поколения на основе природных антимикробных пептидов - молекулярных факторов врожденного иммунитета // Тезисы докладов V Московского международного конгресса «Биотехнология: состояние и перспективы развития». - Москва. - 2009. - Т.1. -С.185-187.

63. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Nekrasova O.V., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. Lipid-protein nanodiscs: possible application in high-resolution NMR investigations of membrane proteins and membrane-active peptides // Abstracts of the Magnetic Resonance Conference "EUROMAR 2009". - Goteborg, Sweden.- 2009. - P.50.

64. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Гетерологическая экспрессия липид-транспортирующего белка чечевицы в клетках Е. coli // Тезисы Международной научной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященная 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова. Москва. - 2009. - Т.2. - С. 137-140.

65. Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Исследование антимикробных пептидов беспозвоночных. // Тезисы докладов XX зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва. - 2008. - С.19.

66. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Структурно-функциональная характеристика PR-белков из проращенных семян чечевицы Lens culinaris И Тезисы докладов Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты». Москва. - 2008. - С.227.

67. Shenkarev Z.O., Nadezhdin K.D., Lyukmanova E.N., Ovchinnikova T.V., Skjeldal L., Arseniev A.S. The [1-hairpin containing membrane-active antimicrobial peptides: from spatial structure in membrane-mimicking media to mechanisms of action // Abstracts of the 33rd FEBS Congress and 11th IUBMB Conference "Biochemistry of Cell Regulation". - Athens, Greece. - 2008. - P.175.

68. Lyukmanova E.N., Shenkarev Z.O., Ovchinnikova T.V., Chupin V.V., Blommers M.J., Arseniev A.S. Reconstiuted high density lipoprotein particles: a promising medium for high-resolution NMR investigations of membrane proteins and membrane-active peptides. Abstracts of the 33rd FEBS Congress and 11th IUBMB Conference "Biochemistry of Cell Regulation". - Athens, Greece. - 2008. - P. 171.

69. Шенкарёв 3.O., Парамонов A.C., Надеждин К.Д., Гагнидзе И.Э., Юрченко Ю.Ю., Люкманова Е.Н., Овчинникова Т.В., Арсеньев А.С. Структура и динамика каналообразующего пептидного антибиотика антиамебина I в различных мембрано-моделирующих средах // Тезисы докладов XV международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». Симпозиум «Достижения современной биоорганической химии и перспективы их применения». - Гурзуф, Украина. - 2007,- С.306-308.

70. Shenkarev Z.O., Paramonov A.S., Nadezhdin K.D., Gagnidze I.E., Yurchenko Y.Y., Lyukmanova E.N., Bocharov E.V., Balashova T.A., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S.. Structure and dynamics of channel forming peptide antibiotic antiamoebin I in several membrane mimicking media // Abstracts of the International symposium «Nuclear magnetic resonance in condensed matter». The 4th meeting "NMR in life sciences". - Saint-Petersburg. - 2007.-P. 118.

71. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Выделение и первичная структура нового дефенсина из проращенных семян чечевицы Lens culinaris И Тезисы докладов IV Московского международного конгресса "Биотехнология: состояние и перспективы развития. - Москва. - 2007. - С.308.

72. Баландин С.В., Кокряков В.Н., Овчинникова Т.В. Новые антимикробные пептиды морских беспозвоночных // Тезисы докладов международной конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова. - Москва. - 2004. - С.31.

73. Шенкарёв З.О., Парамонов А.С., Балашова Т.А., Овчинникова Т.В., Арсеньев А.С. Высокая стабильность шарнирного региона в спиральном каналообразующем антибиотике зервамицине IIB в растворе метанола по данным парамагнитного усиления ЯМР релаксации // Тезисы трудов XII международной конференции «Новые информационные технологии в медицине, биологии, фармакологии и экологии». - Гурзуф, Украина. - 2004. Успехи современного естествознания. - 2004. - Т.2. - №6. - С. 62-63.

74. Баршунина Е.В., Якименко З.А., Складнев Д.А., Овчинникова Т.В. Получение N-меченого пептидного антибиотика антиамебина III Тезисы докладов XV зимней международной молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва..- 2003. -С.21.

75. Shenkarev Z.O., Balashova Т.A., Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. Structure and dynamics of peptide ion channel zervamicin IIB in membrane mimic media // Abstracts of the XI International conference on new information technology in medicine, biology, pharmacology, and ecology. - Gurzuf, Ukraine. - 2003. -P.36.

76. Ovchinnikova T.V., Yakimenko Z.A., Swischeva N.V., Skladnev D.A., Raap J. Stable isotope labelling of the peptaibol antibiotics zervamicin IIB and antiamoebin I // Proceedings of the workshop "Peptaibols: biosynthesis, structural diversity and mode of action". - Jena, Germany. -2002. - P.35.

77. Raap J., Milov A.D., Tsvetkov Yu.D., Ovchinnikova T.V., Formaggio F., Crisma M., Toniolo C. Pecularities of trichogin GA IV bound to the gram-positive bacterial cell // Proceedings of the workshop "Peptaibols: biosynthesis, structural diversity and mode of action". - Jena, Germany. - 2002. - P.25.

78. Ovchinnikova T.V., Ваш M.B, Gorbunova E.Yu., Vazhenina I.V., Mustaeva L.G., Miroshnikov A.I., Raap J. Total solid phase synthesis of the biologically active peptaibol antibiotic zervamicin // Proceedings of the 18 International congress of biochemistry and molecular biology. - Birmingham, UK. - 2000. - P.195.

79. Shenkarev Z.O., Balashova T.A., Yakimenko Z.A, Ovchinnikova T.V., Arseniev A.S. NMR structure of the channel-former zervamicin IIB in isotropic solvents and DPC micelles: possible mechanism of the voltage activation // Abstracts of the Open Russian-Swedish conference "NMR in protein-protein and protein-DNA recognition". - Moscow. -2000. - P.36.

80. Овчинникова T.B., Тагаев A.A., Мартынова Н.Ю., Сазыкин Ю.О. Исследование зервамицинов - антибиотиков группы пептаиболов // Материалы международной конференции «Фармацевическая биоэтика». - Москва. - 1997. - С. 66-67.

Избранные тезисы докладов на российских конференциях

81. Нурмухамедова Э.К., Баландин С.В., Овчинникова Т.В. Определение нуклеотидной последовательности и гетерологичная экспрессия генов предшественника лантибиотика LanAl и модифицирующего его фермента LanMl из штамма Bacillus licheniformis VK21 // Тезисы докладов XXII зимней молодежной

научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва. - 2010. - С.110.

82. Корнева Е.А., Алёшина Г.М., Перекрест C.B., Кокряков В.Н., Баландин C.B., Финкина Е.И., Тагаев A.A., Овчинникова Т.В. Конструирование лекарственных средств нового поколения на основе пептидных антибиотиков животного происхождения // Тезисы итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2009 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». Москва. — 2009. - С.42-43.

83. Мельникова Д.Н., Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Получение рекомбинантного липид-транспортирующего белка чечевицы обыкновенной Lens culinaris // Тезисы докладов XXI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». -Москва.-2009.-С.66.

84. Овчинникова Т.В., Кокряков В.Н. Конструирование лекарственных средств нового поколения на основе природных пептидных антибиотиков - молекулярных факторов врожденного иммунитета // Тезисы докладов симпозиума «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств».-Москва. - 2008. - С. 147-148.

85. Меныпенин A.B., Алёшина Г.М., Кокряков В.Н., Корнева Е.А., Баландин C.B., Финкина Е.И., Якименко ЗА., Тагаев A.A., Овчинникова Т.В. Конструирование лекарственных средств нового поколения на основе пептидных антибиотиков животного происхождения // Тезисы итоговой конференции по результатам выполнения мероприятий за 2008 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы». - Москва. -2008.-С.126-127.

86. Овчинникова Т.В., Баландин C.B., Тагаев A.A., Финкина Е.И., Шенкарёв З.О., Якименко З.А. Создание лекарственных средств нового поколения на основе природных антимикробных пептидов // Тезисы докладов на конференции по научным направлениям Программы фундаментальных исследований РАН «Фундаментальные науки - медицине».- Москва. -2008. - С. 158-159.

87. Надеждин К.Д., Шенкарёв З.О., Баландин C.B., Овчинникова Т.В., Арсеньев A.C. Исследование пространственной структуры и механизмов специфической олигомеризациий ^-структурного антимикробного пептида ареницина-2 // Труды 50-й научной конференции МФТИ. Часть IV «Молекулярная и биологическая физика». Москва-Долгопрудный. - 2007. - С.240-241.

88. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Новый дефенсин из семян чечевицы Lens culinary // Тезисы докладов III Российского симпозиума «Белки и пептиды». -Пущино. - 2007. - С.20.

89. Баландин C.B., Надеждин К.Д., Шенкарёв З.О., Кокряков В.Н., Арсеньев A.C., Овчинникова Т.В. Тетерологичная экспрессия и исследование пространственной структуры новых антимикробных пептидов ареницинов // Тезисы докладов XIX зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - Москва. - 2007. - С.23.

90. Баландин C.B., Овчинникова T.B. Получение рекомбинантных антимикробных пептидов морских беспозвоночных // Тезисы докладов XVIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва. - 2006. - С.29.

91. Баландин C.B., Кокряков В.Н., Овчинникова Т.В. Новый антимикробный пептид аурелин из сцифоидной медузы Aurelia aurita: определение полной последовательности кДНК, кодирующей препроаурелин, и гетерологичная экспрессия в E.coli // Тезисы докладов VIII чтений, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова. - Москва-Пущино. - 2006. - С.59.

92. Финкина Е.И., Баландин C.B., Овчинникова Т.В. Новый дефенсиноподобный белок из семян чечевицы обыкновенной Lens culinaris // Тезисы докладов XVIII зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва. - 2006. - С.53.

93. Баландин C.B., Кокряков В.Н., Овчинникова Т.В. Структурные исследования новых антимикробных пептидов животного происхождения // Тезисы докладов XVII зимней молодежной научной школы "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии". - Москва. - 2005. - С.31 -32.

94. Кокряков В.Н., Алешина Г.М., Шамова О.В., Овчинникова Т.В. Антибиотические пептиды как эффекторные и регуляторные факторы врожденного иммунитета // Тезисы докладов объединенного иммунологического форума. -Екатеринбург. - 2004. - Russian Journal of Immunology. - 2004. - V.9 - Suppl.l. - P.73.

95. Алешина Г.М., Мальцева A.JI., Краснодембский Е.Г., Овчинникова Т.В. Антибиотические факторы морской звезды Asterias rubens Н Тезисы докладов объединенного иммунологического форума. - Екатеринбург. - 2004. - Russian Journal of Immunology. - 2004. - V.9 - Suppl.l. - P.71.

96. Финкина Е.И., Овчинникова Т.В. Выделение белково-пептидных антибиотиков из семян чечевицы Ervum lens // Тезисы докладов XVI зимней молодежной научной школы «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии». - Москва. - 2004. - С.43.

97. Дьяченко И.А., Коршунов В.А., Мурашев А.Н., Свищева Н.В., Якименко З.А., Овчинникова Т.В. Исследование нейротропной активности антибиотика-пептаибола зервамицина // Тезисы трудов научной конференции ФИБХ РАН. - Пущино. - 2004. -С.7.

98. Овчинникова Т.В., Алёшина Г.М., Потапенко H.A., Леонова Ю.Ф., Меныпенин A.B., Кокряков В.Н. Новый пептидный антибиотик из сцифоидной медузы Aurelia aurita II Тезисы докладов III съезда биохимического общества. -Санкт-Петербург. - 2002. - С.556.

99. Якименко З.А., Свищева Н.В., Тагаев A.A., Овчинникова Т.В. Структурно-функциональное исследование антибиотиков-пептаиболов зервамицинов из гриба Emericellopsis salmosynnemata" Н Тезисы трудов школы-конференции «Горизонты физико-химической биологии». - Пущино. - 2000. - С.111-112.

100. Горбунова Е.Ю., Бару М.Б., Важенина И.В., Мустаева Л.Г., Раап Я., Мирошников А.И., Овчинникова Т.В. Синтез биологически активных [D-Iva4] и [L-Iva4] зервамицинов IIB // Тезисы трудов отчетной конференции ФИБХ РАН. -Пущино. -1999. - С.12-13.

Подписано в печать 26.08.2011 г. Заказ № 5813 Тираж: 100 экз.

Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора химических наук, Овчинникова, Татьяна Владимировна, Москва

На правах рукописи

ОВЧИННИКОВА Татьяна Владимировна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ ПРИРОДНЫХ ПЕПТИДНЫХ АНТИБИОТИКОВ

03.01.06 - Биотехнология (в том числе бионанотехнологии) 02.00.10 - Биоорганическая химия

ДИССЕРТАЦИЯ в виде научного доклада на соискание ученой степени доктора химических наук

Москва-2011

Официальные оппоненты: академик РАН и РАМН,

доктор биологических наук, профессор Ткачук Всеволод Арсеньевич

член-корреспондент РАН,

доктор химических наук,

профессор Кочетков Сергей Николаевич

член-корреспондент РАН,

доктор химических наук,

профессор Северин Евгений Сергеевич

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук

Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН

Защита состоится 10 октября 2011 г. в 15 часов на заседании Совета по защите докторских диссертаций Д 212.120.01 при Московском государственном университете тонких химических технологий имени М.В.Ломоносова (МИТХТ им. М.В.Ломоносова) по адресу: 119571 Москва, проспект Вернадского, 86.

С диссертацией в виде научного доклада можно ознакомиться в библиотеке МИТХТ им. М.В.Ломоносова.

Диссертация в виде научного доклада разослана 30 августа 2011 г.

Учёный секретарь Диссертационного совета кандидат химических наук, старший научный сотрудник

А.И.Лютик

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования.

антибиотикорезистентность наблюдается- в отношении ряда штаммов Mycobacterium tuberculosis, Enterococcus faecium и Pseudomonas aeroginosa, а также таких распространенных патогенов- человека, как Staphylococcus aureus и Staphylococcus pneumoniae. Структурно-функциональное изучение природных пептидных антибиотиков показывает, что на их основе возможно создание новых антимикробных средств.

Эффективные механизмы защиты от патогенов вырабатывались многоклеточными организмами-в процессе их эволюции. Лимфоцитарный иммунитет возник лишь с появлением челюстных рыб и существует менее чем у 2% видов многоклеточных организмов. Однако даже те из них, которые обладают способностью вырабатывать антитела, в первые часы встречи с патогеном могут полагаться только на защитные механизмы системы врожденного иммунитета. Эндогенные антимикробные пептиды (далее АМП) относятся к молекулярным факторам системы врожденного иммунитета, обеспечивающим выживание организмов в окружении патогенов (бактерий, грибков, простейших, вирусов). Распространенность АМП в природе и их структурное разнообразие дают основание полагать, что каждый биологический вид вырабатывает свой уникальный набор защитных пептидов, позволяющий ему успешно бороться с окружающей его патогенной микрофлорой. В настоящее время определены структуры около тысячи АМП, выделенных из различных тканей человека, позвоночных и беспозвоночных животных, растений, грибов и бактерий. Природные пептидные антибиотики обладают способностью инактивировать широкий спектр микроорганизмов. Поиск и исследование новых АМП позволяет лучше понять закономерности функционирования? врожденного иммунитета у человека. По мере углубления наших знаний о пептидных антибиотиках появляется все больше сведений об их участии в процессах регуляции иммунитета и регенерации тканей.

Наряду с фундаментальными исследованиями структурно-функциональных свойств АМП важное прикладное значение имеют работы по созданию эффективных лекарственных средств на их основе. Природные пептиды могут стать прототипами новых антибиотиков широкого спектра действия, способных решить проблему резистентности к существующим противоинфекционным средствам. Подавляющее большинство АМП относятся к мембранотропным антибиотикам, поэтому развитие резистентности патогенов, к ним менее вероятно из-за низкоизбирательного механизма их действия и возможно только при существенных изменениях структуры и свойств клеточной мембраны. Кроме того, многие АМП усиливают действие традиционных антибиотиков.

Известно, что длительная терапия антибиотиками в ряде случаев вызывает состояние иммунодефицита и эндотоксемию, однако многие АМП наряду с антибиотической обладают иммуномодулирующей и эндотоксин-нейтрализующей активностью. Все это создаёт предпосылки для создания новых эффективных антибиотических лекарственных средств на основе природных пептидных антибиотиков, лишенных перечисленных выше недостатков. Учитывая наличие выраженной антибиотической и иммуномодулирующей активности у природных АМП, многие зарубежные фармацевтические компании уже приступили к созданию нового класса антибиотиков на их основе, а первые из них уже проходят клинические испытания.- Структурно-функциональные исследования природных пептидных антибиотиков могут внести существенный вклад в развитие этого перспективного направления медико-биологической? науки, а разработка способов их получения« с целью создания на их основе лекарственных средств нового поколения является одной из актуальных задач современной биотехнологии.

Цель и задачи исследования.

Цель данной диссертационной работы состоит в исследовании структуры, биологических свойств и молекулярных механизмов действия природных пептидных антибиотиков, а также в разработке биотехнологических способов их получения. Объектами исследования являются антимикробные пептиды ареницины из целомоцитов морского червя Arenicola marina [тип — кольчатые черви (Annelida), класс - многощетинковые (Polychaeta)]; аурелин из мезоглеи сцифоидной медузы Aurélia aurita [тип - кишечнополостные (Gnidaria), класс - сцифоидные (Scyphozoa)]; буфорин из желудка азиатской-жабы Bufo bufo gargarizans [тип - хордовые (Chordata), класс - земноводные (Amphibia), отряд - земноводные бесхвостые (Anura); семейство - жабы настоящие (Bufonidae)]; дефенсин и липид-траспортирующий белок из чечевицы обыкновенной Lens culinaris [отдел - покрытосеменные (Magnoliophyta), класс - двудольные (Dicotylédones), порядок - бобовоцветные (Fabales), семейство — бобовые (Fabaceae), подсемейство - мотыльковые (Faboideae)]; зервамицин и антиамебин из мицелиальных спорообразующих грибов Emericellopsis salmocynnemata и Emericellopsis minima [отдел — настоящие грибы (Eumycota), подотдел — аскомицеты (Ascomycotina), класс - эуаскомицеты (Euascomycetes)]; латероцидин и латероцин из аэробной грамположительной бактерии Brevibacillus laterosporus; лихеницидин из терморезистентной грамположительной бактерии Bacillus licheniformis.

В соответствии с поставленной целью были сформулированы следующие задачи:

Научная новизна работы..

Все результаты, изложенные в настоящей работе, получены впервые.

1. Впервые установлена структура новых антимикробных пептидов ареницинов из целомоцитов морского кольчатого червя Arenicola marina, нового антимикробного пептида аурелина из мезоглеи сцифоидной медузы Aurelia aurita, нового дефенсина и новых липид-траспортирующих белков из семян чечевицы Lens ciilinaris, новых антимикробных пептидов латероцидина и латероцина из аэробных грамположительных бактерий Brevibacilliis laterosporus, новой двухкомпонентной системы лантибиотиков из терморезистентных грамположительных бактерий Bacillus lichenifromis. Впервые определены полные нуклеотидные последовательности кДНК, кодирующих белки-предшественники ареницинов, аурелина, дефенсина и липид-траспортирующих белков чечевицы, лихеницидина, и соответствующие им полные аминокислотные последовательности белков-предшественников.

Практическая значимость работы.

Полученные в ходе выполнения данной работы АМП представляют большой практический интерес в качестве прототипов антибиотиков нового» поколения. Ряд полученных пептидов обладают широким спектром антимикробного действия и по своей активности не уступают лучшим мировым аналогам. Известно, что большинство АМП относятся к мембранотропным антибиотикам. Поскольку развитие резистентности патогенов к ним возможно только при значительных изменениях в структуре клеточной мембраны, природные пептидные антибиотики способны решить проблему резистентности к существующим противоинфекционным средствам. Кроме того, многие АМП усиливают действие традиционных антибиотиков и наряду с антибиотической обладают иммуномодулирующей и эндотоксин-нейтрализующей активностью, что обеспечит возможность избегать эндотоксемии и состояния иммунодефицита при длительной антибиотикотерапии. Все перечисленное создаёт предпосылки для создания^ новых эффективных антибиотических лекарственных средств на основе природных пептидных антибиотиков. Ряд зарубежных фармацевтических компаний уже приступили к созданию нового класса антибиотиков на основе природных АМП. Структурно-функциональные исследования природных пептидных антибиотиков могут внести значительный вклад в развитие этого направления медико-биологической науки.

Широкому применению АМП в клинической практике препятствует высокая себестоимость их производства. Проблема может быть успешно решена методами биотехнологии, применение которых является более экономически эффективным по сравнению« с химическим синтезом. Разработка способов получения пептидных антибиотиков с целью создания на их основе лекарственных средств нового поколения является одной из актуальных задач современной биотехнологии.

Апробация работы.

Результаты исследований были представлены на IV, VI и VIII Гордоновских международных конференциях по антимикробным пептидам (Gordon Research Conferences "Antimicrobial peptides", Барга, Италия, 2003, 2007, 2011), 33-м и 36-м конгрессах Федерации европейских биохимических обществ (Афины, Греция, 2008 и Турин, Италия, 2011), XVIII международном конгрессе по биохимии и молекулярной биологии (Бирмингем, Великобритания, 2000), международной конференции "Peptaibols: Biosynthesis, Structural Diversity and Mode of Action" (Йена, Германия, 2002), международных конференциях по магнитному резонансу "EUROMAR-2009" и "EUROMAR-2010" (Гётеборг, Швеция; 2009 и Флоренция, Италия, 2010), международном симпозиуме «Nuclear magnetic resonance in condensed matter. The 4th meeting «NMR in life sciences» (Санкт-Петербург, 2007), российско-шведской конференции "NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recognition" (Москва, 2000), XI и XII международных конференциях "New information technology in medicine, biology, pharmacology, and ecology" (Гурзуф, Украина, 2003, 2004), IV, V и VI Московских международных конгрессах "Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2007, 2009, 2011), международной конференции по биоорганической химии, биотехнологии и бионанотехнологии, посвященной 75-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2009), международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты» (Москва, 2008), международной конференции «Scenarios for a coordinated approach to sustainable cooperation with the Eastern neighbors of the EU" (Москва, 2007), международной» конференции по физико-химической биологии, посвященной 70-летию со дня рождения академика Ю.А.Овчинникова (Москва, 2004), международной конференции «Фармацевическая биоэтика» (Москва, 1997), рабочих совещаниях участников международного проекта INTAS (Санкт-Петербург, 2005 и Триест, Италия, 2006), симпозиуме «Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств» (Москва, 2008), III съезде Биохимического общества России (Санкт-Петербург, 2002), III съезде Общества биотехнологов России (Москва, 2005), Объединенном иммунологическом форуме (Екатеринбург, 2004), III Российском симпозиуме «Белки и пептиды» (Пущино, 2007), итоговых конференциях по результатам выполнения мероприятий в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (Москва, 2007, 2008, 2009), VIII чтениях, посвященных памяти академика Ю.А. Овчинникова (Москва, 2006), 50-й научной конференции МФТИ (Москва-Долгопрудный, 2007), научных конференциях ФИБХ РАН (Пущино, 1999, 2004), школе-конференции «Горизонты физико-химической биологии» (Пущино, 2000), XV-XXIII зимних молодежных научных школах «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2003-2011).

Публикации и патенты.

По теме диссертации опубликовано 139 работ, в том числе 46 статей в ведущих отечественных и зарубежных рецензируемых журналах, из них 15 статей в российских журналах (Биоорганическая химия, Биотехнология, Биохимия, Доклады Академии наук и др.), 28 статей в зарубежных журналах (Analytical & Bioanalytical Chemistry, Applied Magnetic Resonance, BBA - Biochimica et Biophysica Acta, Biochemical & Biophysical Research Communications, Biochemistry (USA), Bioorganic Chemistry (USA), Biochemical Journal, Biophysical Journal, Biopolymers, Chemistry & Biodiversity, FEBS Letters, JACS - Journal of the American Chemical Society, Journal of< Biological Chemistry, Journal of Biomolecular NMR, Journal of Peptide Science, Protein'& Peptide Letters, Proteomics и др:) и 3 статьи в сборниках научных работ. По результатам исследований получено 10 патентов на изобретение РФ и подана 1 заявка на выдачу патента- РФ. В 2009 г. патент на изобретение RU 2316595 «Способ получения антимикробного пептида ареницина» вошёл в число 100 лучших изобретений России и получил-диплом^ Федеральной службы по интеллектуальной собственности, патентам и товарным знакам. По теме работы опубликовано также 82 тезиса докладов, в том числе 43 на международных и 39 на российских конференциях.

Личный вклад автора.

Автору принадлежит решающая роль в выборе направления и объектов исследований, разработке и проверке предложенных в работе экспериментальных подходов на всех, этапах работ по выделению, изучению структуры, биотехнологическому получению аналогов и исследованию биологическ�

Информация о работе

Овчинникова, Татьяна Владимировна
доктора химических наук
Москва, 2011
ВАК 03.01.06

Диссертация

Структурно-функциональной исследование природных пептидных антибиотиков - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы