Изучение механизмов антиоксидантного действия пептидов и их композиций

Николаев, Илья Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение механизмов антиоксидантного действия пептидов и их композиций
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов антиоксидантного действия пептидов и их композиций"

На правах рукописи

00501313*

НИКОЛАЕВ Илья Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ И ИХ КОМПОЗИЦИЙ

Специальность 03.01.04 - «Биохимия»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук

МОСКВА-2012

005013132

Работа выполнена в лаборатории молекулярных основ биотрансформаций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук профессор О.В. Королева

Официальные оппоненты:

доктор химических наук профессор И.В. Перминова доктор биологических наук К.Б. Шумаев

Ведущая организация:

Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Научно-исследовательский институт физико-химической медицины Федерального медико-биологического агентства»

Защита состоится «2.9» марта 2012 г. в «_» часов на заседании

диссертационного совета (Д 002.247.01) при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 2.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН по адресу: 119071, Москва, Ленинский проспект, дом 33, строение 1.

Автореферат разослан «22» февраля 2012 г. Ученый секретарь ^

диссертационного совета, у )

кандидат биологических наук А.Ф. Орловский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Оксидативный стресс является одной из универсальных форм ответа организма на воздействие неблагоприятных экзогенных и эндогенных факторов и играет существенную роль в патогенезе воспалительно-дистрофических, нейродегенеративных, сердечнососудистых и онкологических заболеваний и ускорении процессов старения живых организмов [Arts ct al., 2005; Skulachev, 2007; Knasmuller ct al., 2008J. Оксидативный стресс сопряжен с избыточной продукцией активных форм кислорода (АФК). Основная роль в защите биомолекул от действия АФК принадлежит экзогенным и эндогенным антиоксида![там [Frankcl ct al., 2008].

В настоящее время известен широкий спектр природных и синтетических экзогенных антиоксидантов, поступающих в организм с пищей. При этом природные антиоксиданты обладают рядом преимуществ по сравнению с синтетическими, включая отсутствие побочных и кумулятивных эффектов, а также более низкую токсичность.

Основными классами природных антиоксидантов являются каротиноиды, тиолы, фенольные соединения и пептиды. В литературе описаны последовательности более 100 антиоксидантных пептидов, выделенных из различных источников, а также полученных при конверсии белков с использованием ферментов и / или микроорганизмов [Dziuba ct al., 2007; Sarmadi ct al., 2010]. Наличие остатков редокс-активных аминокислот (Туг, Trp, Met, Cys, His) является важным структурным дескриптором антиоксидантных пептидов [Saito et al., 2003; Sarmadi ct al., 2010]. Однако механизмы их антиоксидантного действия остаются недостаточно изученными.

Для разработки обоснованной стратегии поиска перспективных пептидных антиоксидантов необходимо исследование механизмов их взаимодействия с АФК и модельными свободными радикалами. Несмотря на различия в химической структуре антиоксидантов, ключевыми механизмами их взаимодействия с АФК являются донирование атома водорода (ДАВ) или допирование электрона (ДЭ). Тем не менее, антиоксидантные эффекты большинства сосдинснгл реализуются по смешанному механизму: последовательное донирование электрона с депротонированием (ПДЭД) или последовательное дспротонированис с донированием электрона (Г1ДДЭ) [Barclay et al., 2003; Justino ct al., 2010]. Образующиеся интермедиаты зачастую могут вступать во взаимодействие друг с другом и /или во вторичные реакции со свободными радикалами, что вносит вклад в наблюдаемый антиоксидантный эффект и создаст дополнительные сложности при анализе экспериментальных данных.

Расчетные кваитово-химичсские методы являются эффективным инструментом для изучения механизмов взаимодействия антиоксидантов со свободными радикалами и позволяют выявить молекулярные (структурные) и электронные дескрипторы, определяющие антиоксидантные свойства различных классов соединений. Благодаря применению полуэмпирических расчетных методов, в последнее время были выявлены структурные особенности флаваноидов, обуславливающие их антиоксидантные свойства, включая степень планарности молекулы, взаимное расположение фенольных гидроксильных групп, стабилизационные эффекты за счет делокализации неспаренного электрона при образовании фсноксильных радикалов [Russo ct al., 2000; Lcmanska, ct al 2001; Justino et al., 2010]. Однако, исследования такого рода для пептидов отсутствуют, что обуславливает актуальность соответствующих структурно-функциональных исследований.

Shibamoto et al., 2009]. Их классификация базируется на ключевом механизме взаимодействия различных радикалов с тестируемыми антиоксидантами. Широко используемыми для характеристики природных антиоксидактов in vitro, являются методы гашения катион-радикала АБТС (2,2'-азино-бис-(3-этил-бензтиазолин-6-сульфонат) (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity - ТЕАС) и пероксильного радикала (Oxygen Radical Absorbance Capacity - ORAC). Данные методы позволяют проводить количественную характеристику антиоксидантных свойств соединений с различными физико-химическими свойствами и характеризуются высокой воспроизводимостью и надежностью. В то же время, эти методы тестирования антиоксидантов in vitro не позволяют провести интегральной оценки эффективности антиоксидантов в живых системах, поскольку они не учитывают целый ряд факторов, включая биодоступность, распределение и метаболизм антиоксидантов, а также их взаимодействие с системой антиоксидантной защиты [Blair et al., 2006]. Для объективной характеристики антиоксидантов необходима верификация их антиоксидантных эффектов in vivo.

Таким образом, вышесказанное свидетельствует об актуальности структурно-функциональных исследований пептидных антиоксидантов для оценки их эффективности и создания стратегии скрининга атиокеидантных пептидов с использованием эмпирических и квантово-химических дескрипторов.

Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы был структурно-функциональный анализ и исследование механизмов антиоксидантного действия пептидов в системах с различными типами радикалов.

В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

1. Исследование антиоксидантных свойств модельных низкомолекулярных соединений: редокс-активных аминокислот, метионин- и тирозин- содержащих дипептидов, ароматических гидроксикислот (модели тирозина) по отношению к катион-радикалу АБТС и псроксильному радикалу;

2. Исследование геометрии молекул и электронных дескрипторов рсдокс-активных аминокислот, метионин- и тирозин- содержащих дипептидов и ароматических гидроксикислот полуэмпиричеокими методами;

3. Анализ механизмов антиоксидантного действия метионин- и тирозин-содержащих дипептидов и ароматических гидроксикислот;

4. Исследование антиоксидантных свойств пептидных композиций, полученных при гидролизе коллагеновых и мышечных белков, по отношению к пероксильному радикалу и катион-радикалу АБТС in vitro. Идентификация антиоксидантных пептидов в исследуемых пептидных композициях;

5. Разработка стратегии скрининга антиоксидантных пептидов с использованием набора дескрипторов;

6. Исследование влияния пептидных композиций на антиоксидантный статус in vivo.

Научная новизна.

Впервые проведены квантово-химические расчеты электронных дескрипторов и оптимизация геометрии тирозиновых и метиониновых дипептидов в газовой фазе. Впервые установлены механизмы антиоксидантного действия метионин- и тирозин-содсржащих дипептидов. Показано, что взаимодействие мстионин-содержащих дипептидов с пероксильным радикалом протекает по механизму локирования электрона, а взаимодействие тирозин-содержащих дипептидов с катион-радикалом АБТС протекает по механизму последовательного депротонирования и отдачи электрона. Впервые на основе экспериментального исследования антиоксидантной емкости тирозиновых и метиониновых дипептидов и результатов квантово-химических расчетов предложена стратегия отбора пептидов с высокой антиоксидантной емкостью.

Практическое значение работы. Выявленные закономерности взаимного влияния остатков аминокислот на антиоксидантныс свойства дипептидов могут служить основой для разработки биотсхнологичсских процессов, позволяющих получать пептидные композиции с заданными антиоксидантными свойствами. Предложенная стратегия скрининга пептидов с высокой антиоксидантной емкостью позволит проводить теоретически обоснованный поиск и отбор перспективных антиоксидантов пептидной природы. Данные, полученные при исследовании антиоксидантных свойств пептидных композиций in vitro и in vivo, могут быть использованы для создания функциональных пищевых продуктов для профилактики нейродегенеративных заболеваний.

Апробация работы. Основные результаты работы были представлены на 1-м Европейском пищевом конгрессе (2008, Любляна); 14-й Конференции международного Гуминового общества (2008, Москва-Санкт-Пстсрбург); конгрессе Биотехнология: состояние и перспективы развития (2009, Москва); 14-м Международном биотехнологичсском симпозиуме (2010, Римини), VIII Международной конференции Биоантиоксидант (2010, Москва).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 статей, а также 7 тезисов докладов на конференциях.

Объем и структура работы. Работа изложена на f%¿> страницах печатного текста, содержит $ рисунков и 32. таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего S3L источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования.

Аминокислоты и их производные: набор L-аминокислот (Fluka, Германия), 3-N-метил-L-Hís I-N-mctwi-L-Hís, N-Ac-L-Trp-NHj, (Sigma, США), N-Ac-L-Trp, L-Trp-NH2, N-Ac-L-Mct-NH2, N-Ac-L-Mct, L-Met-NH2, N-Ac-L-Tyr-NH2, N-Ac-L-Tyr, L-Tyr-NH2 (Bachem, Швейцария).

Дипсптиды: L-Ala-L-Tyr, L-Tyr-L-Ala, L-Val-L-Met, L-His-L-Tyr, L-Val-L-Tyr (Sigma, США), L-Mct-Gly, Gly-L-Met, L-Mct-L-Ala, L-Ala-L-Mct, L-Mct-L-Lys, L-Lys-L-Mct, L-Met-L-Cilu, L-Mct-L-Val, L-Mct-L-Trp, L-Trp-L-Met, L-Mct-L-His, L-His-L-Mct, L-Met-L-Mct, L-Tyr-Gly, Gly-L-Tyr, L-Tyr-L-Lys, L-Lys-L-Tyr, L-Tyr-L-Glu, L-Glu-L-Tyr, L-Tyr-L-Val, L-Tyr-L-Trp, L-Trp-L-Tyr, L-Tyr-L-His, L-Met-L-Tyr, L-Tyr-L-Tyr (Bachem, Швейцария)

Гидроксибснзойныс (ГБ) кислоты: п-гидроксибензойная кислота (п-ГБК) и ванилиновая кислота (ВК) (Aldrich, Германия), сиреневая кислота (СирК, Sigma, США).

Гидроксикоричныс (ГК) кислоты: п-кумаровая кислота (КК), феруловая кислота (ФК) и синаповая кислота (СинК, Sigma, США).

Пептидные композиции ФМП1 и ФМП2 с различным пептидным профилем молекулярно-массовым распределением и содержанием свободных аминокислот, полученные при ферментативном гидролизе коллагеновых и мышечных белков мультиферментной композицией, содержащей ферментные препараты Alcalasc, Ncutrasc, Protamcx, Flavourzymc (Novozymes, Дания).

Аитиоксидаитную емкость (АОЕ) по отношению к катион-радикалу АБТС определяли спектрофотомстричсски на фотомстре-флуоримстре Synergy 2 (США) при длине волны 734 нм. Катион-радикал АБТС получали согласно [Re et al., 1999]. Реакционная среда содержала 180 мкл 48 мкМ раствора катион-радикала АБТС и 20 мкл раствора исследуемого антиоксиданта в 50 мМ ФСБ, pH 7,40. Кинетику убыли

оптической плотности регистрировали при 25°С в течение 40 мин. АОЕ выражали в мкмоль эквивалентов тролокса в расчете на мкмоль соединения.

АОЕ по отношению к пероксильному радикалу определяли по методу Oy в модификации Мура [Ou ct al., 2001; Moore et al., 2006]. Кинетику убыли интенсивности флуоресценции флуоресцеина регистрировали при 37°С в течение 50 мин. АОЕ выражали в мкмоль эквивалентов тролокса в расчете на мкмоль соединения.

Расчет геометрии молекул и электронных дескрипторов исследуемых антиоксидантов. Квантово-химичсские расчеты геометрии и электронных дескрипторов аминокислот, пептидов и ароматических гидроксикислот проводили в B3LYP/6-31++G**(d,p) и ВЗГ^Р/б-ЗЛ-Н-О*'^?) базисах программы Gaussian 3.0 (США) соответственно. Все расчеты были выполнены в условиях газовой фазы при 298К. Проверку типа минимума проводили по данным анализа колебательных спектров. В случае аминокислот и дипептидов расчеты проводили для форм, суммарный заряд которых соответствовал таковому при физиологических значениях pH. Расчеты были также выполнены для незаряженной, моноанионной и дианионной форм ГБ и ГК кислот и соответствующих им радикалов и катион-радикалов. Для оптимизированных структур рассчитывали распределение Мулликсновских зарядов, энергии молекулярных орбиталей (ВЗМО и НВМО), энергию диссоциации связи в протон-донорной группе (ЭДС), потенциал ионизации (ПИ), электроотрицательность (х), электрофильность (со), жесткость (г)), сродство к протону (СП), энтальпию диссоциации протона (ЭПД), энтальпию переноса электрона (ЭПЭ).

Характеристика_пептидных_композиций. Молекулярно-массовое

распределение пептидных композиций определяли методом гельпроникающей хроматографии согласно [Еремеев и др., 2009]. Содержание свободных аминокислот определяли методом ВЭЖХ с предколоночной дериватизацией (AccQ Tag, Waters, США), а общее содержание аминокислот - тем же методом после предварительного гидролиза пептидных композиций 6М соляной кислотой при 110°С в течение 23 ч. Общее содержание триптофана определяли спсктрофотометрическим методом согласно [FJetouris et al., 1993]. АОЕ пептидных композиций определяли по отношению к пероксильному радикалу и катион-радикалу АБТС как описано выше.

Анализ пептидного профиля композиций. Анализ пептидного профиля композиций проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с масс-спсктромстрисй ионно-циклотронного резонанса. Пептидные композиции фракционировали на колонке BioScp SEC-S 200 (Phenomcx, США) на хроматографе ProStar (Varían Inc., США). Полученные фракции 15-18, 19-22 и 23-28 с максимальной АОЕ разделяли на субфракции на капиллярной колонке Reprosil-Pur Basic CI8, 3 мкм (75 мкм (внутренний диаметр) х 12 см) на жидкостном хроматографе Agilent 1100 (Agilent Tcchnogics, Paolo Alto, CA, США). Масс-спектромстрический анализ полученных субфракций проводили на масс-спектрометре 7-Tesla Finnigan LTQ-FT Ultra (Thermo Electron, Германия) в диапазоне m/z 100-1600 с разрешением R=50000 при m/z равном 400. Для автоматического поиска по базам данных анализа пептидов использовали программное обеспечение Mascot Daemon 2.2.2 (Matrix Science, Великобритания).

Исследование антиоксидантных свойств пептидных композиций in vivo.

Эксперименты проводили на 4 экспериментальных группах крыс линии Wistar (42 самцах, масса 145-150 г). Животных содержали при 20°С на полусинтетических рационах, отличающихся источником белка: группа 1 (казеин), группа 2 (ФМП1), группа 3 (ФМП2) и контрольная группа - безбелковый рацион. На 28 день эксперимента проводили забор крови, печени и головного мозга.

Определение содержания ТБК-реактивных продуктов в сыворотке крови и гомогенатах тканей печени и головного мозга проводили спсктрофотометрически (на

длинах волн 535 и 572 нм) согласно методу [Sattler et al., 1998] с использованием 1,1,3,3- тетраэтоксипропана в качестве стандарта.

Определение АОЕ тканевых экстрактов по отношеншо к катион-радикалу АБТС. Экстракцию водорастворимых антиоксидантов проводили 1,15% раствором хлорида калия. АОЕ гидрофильной фракции определяли как описано выше. Экстракцию жирорастворимых антиоксидантов проводили по методу Фолча с последующим высушиванием и перерастворением экстракта в гексане. Реакционная смесь содержала 2 мл 48 мкМ раствора катион-радикала АБТС в смеси этанол-гексан 10:1 (об./об.) и 100 мкл экстракта. АОЕ определяли по убыли оптической плотности при длине волны 734 нм в течение 3 мин на спектрофотометре Сагу 100 Bio (США).

Определение АОЕ тканевых экстрактов но отношению к псроксильному радикалу. Экстракты жиро- и водорастворимых антиоксидантов получали как описано выше. Экстракт жирорастворимых антиоксидантов перерастворяли в 7% растворе метил-Р-циклодекстрина в смеси ацетон-вода 1:1 (об./об). Анализ АОЕ проводили по методу Oy в модификации Мура [Ou et al., 2001; Moore et al., 2006].

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В качестве объектов исследования были выбраны низкомолекулярные модельные соединения, включая свободные аминокислоты, ацетилированные и / или амидированные производные аминокислот как модели образования пептидной связи, метиониновые и тирозиновые дипептиды, ароматические гидроксикислоты как упрощенные модели для исследования антиоксидантных свойств тирозина и его производных. Полученные результаты структурно-функционального исследования антиоксидантных свойств модельных соединений были использованы при характеристике мультикомпонентных смесей - композиций с различным пептидным профилем.

Исследование антиоксидантных свойств аминокислот, метиониновых и тирозиновых дипептидов.

При тестировании АОЕ аминокислот по отношению к пероксильному радикалу и катион-радикалу АБТС было показано, что редокс активными в концентрациях не более 1 мМ в случае пероксильного радикала являются 5 аминокислот - Туг, Tip, Met, Cys и His (рис. 1), в случае катион-радикала АБТС только 3 аминокислоты - Туг, Tip и Cys, что объясняется меньшей реакционной способностью катион-радикала АБТС (ОВП 0,68 В) по сравнению с пероксильным радикалом (ОВП 1,00В). АОЕ редокс активных аминокислот по отношению к пероксильному радикалу убывает в ряду Trp>Tyr>Met=Cys>His, по отношению к катион-радикалу АБТС - в ряду Tyr=Trp>Cys (рис.1).

Рис. 1.

Антиоксидантная емкость аминокислот по отношению к пероксильному радикалу (75 мМ НФБ, pH 7,40) и катион-радикаду АБТС (50 мМ ФСБ, pH 7,40).

His His

§5

-54

Г5

h-ц -3

о s ¡2

lu §1

□ Tyr

□ Trp

□ Met

aa-NH2 Ac-aa

Ac-aa-NH2

О Tyr □ Trp П Met

Были проанализированы

антиоксидантные свойства

модифицированных аминокислот, включая метил-производные His, часто встречающиеся в составе антиоксидантных пептидов (ансерин, офидин), и ацетилированные и/ или амидированные производные,

моделирующих образование

пептидной связи. Метилирование имидазольного кольца His приводит к увеличению АОЕ

соответствующих метил-His по отношению к пероксильному радикалу в 1,4-1,7 раза (рис. 1), что, по-видимому, объясняется

положительным влиянием

метальной группы на электронную плотность в имидазольном кольце.

Ацетилирование Туг и Trp в случае катион-радикала АБТС и ацетилирование Trp - в случае с пероксильным радикалом

приводило к снижению значений АОЕ производных в 1,5 раза по сравнению с таковыми для аминокислот (рис. 2). Амидирование Туг наоборот приводит к возрастанию АОЕ по отношению к катион-радикалу АБТС в 1,4 раза (рис. 2а). Ацетилирование и амидирование метионина не приводит к выраженному изменению антиоксидантных свойств

соответствующих производных (рис. 26).

Для подтверждения

полученных данных (рис. 2) были исследованы антиоксидантные свойства тирозиновых и метиониновых дипептидов с алифатическими аминокислотами, редокс-акгивными аминокислотами и остатками аминокислот, содержащих ионогенные группы в боковых радикалах (табл. 1 и 2).

Установлено, что дипептиды, содержащие N-концевой остаток тирозина, характеризуются в среднем в 1,4 раза более высокими значениями АОЕ по отношению к катион-радикалу АБТС по сравнению с тирозином (табл. 1). Аналогичные пептиды с С-концевым положением тирозина характеризуются вдвое меньшими значениями АОЕ по сравнению с тирозином. Средние значения АОЕ дипептидов с N- и С,-концевыми остатками тирозина по отношению к катион-радикалу АБТС - 4,81±0,10 и 1,70±0,27 мкмоль ТЭ/мкмоль соответственно. Дипептид Lys-Tyr характеризовался вдвое большим значением АОЕ по отношению к катион-радикалу АБТС по сравнению с другими дипептидами с С-терминальным положением Туг остатка (табл. 1). По-видимому, это обусловлено взаимодействием фенольного гидроксила Туг с е-аминогруппой Lys. Результаты тестирования АОЕ тирозиновых дипептидов по

aa-NH2 Ас-аа

Ас-аа-NH2

Рис.

2. Антиоксидантная емкость производных аминокислот по отношению к катион-радикалу АБТС (а) и пероксильному радикалу (б). Ас

ацетилированные, NH2 - амидированные аминокислоты.

отношению к катион-радикалу АБТС свидетельствуют о важной роли а-аминогруппы, наличие которой, по-видимому, определяет механизм взаимодействия остатков тирозина с катион-радикалом АБТС н спектр образующихся продуктов.

Анализ АОЕ тирозиповых дипептидов по отношению к псроксилыюму радикалу показал, что дипептиды тирозина с алифатическими аминокислотами характеризуются сходными значениями АОЕ по сравнению с тирозином (табл. 1). Средние значения АОЕ дипептидов с N- и С-концсвыми остатками тирозина по отношению к псроксильному радикалу составили 0,95±0,11 и 1,04±0,01 мкмоль ТЭ/мкмоль соответственно. Влияние остатков аминокислот с ионогенными группами в боковых радикалах на АОЕ тирозиповых дипептидов по отношению к псроксильному радикалу определяется их взаимным расположением (табл. 1). Наличие на С-конце тирозиповых дипептидов остатка Glu приводит к двухкратному снижению АОЕ по сравнению с тирозином, в то время как наличие остатка Lys - наоборот, к возрастанию АОЕ по сравнению с тирозином в 1,5 раза (табл. 1). Практически обратная тенденция наблюдается в случае дипептидов с С-тсрминальным тирозиновым остатком: наличие в этом случае соседнего остатка Glu - не оказывает влияния на величину АОЕ, в то время как наличие соседнего остатка Lys приводит к снижению АОЕ в 1,7 раза по сравнению с тирозином (табл. 1).

Таблица 1. Антиоксидантнная емкость тирозиновых дипептидов по отношению к псроксильному радикалу (ORAC) и катион-радикалу АБТС (ТЕАС).

Пептид АОЕ, мкмоль ТЭ/мкмоль

ORAC TEAC

Gly-Tyr 1,11±0,05 1,43±0,12

Ala-Tyr 1,05±0,05 1,70±0,14

Val-Туг 1,03±0,06 1,97±0,11

Glu-Туг 1,11 ±0,02 1,45±0,15

Lys-Tyr 0,60±0,02 3,60±0,05

Mct-Tyr 1,65±0,03 2,48±0,05

His-Tyr 1,08±0,09 2,03±0,05

Trp-Tj'r 5,07±0,10 5,18±0,10

Tyr-Gly 0,93±0,04 4,87±0,07

Tyr-Ala 1,04±0,06 4,70±0,19

Тут-Val 0,98±0,03 4,88±0,11

Tyr-Glu 0,46±0,03 5,00±0,10

Tyr-Lys 1,47±0,07 4,80±0,12

Tyr-Tyr 1,97±0,07 5,62±0,11

Tyr-His 0,94±0,02 5,19±0,05

Tyr-Trp 3,36±0,11 6,04±0,15

Анализ АОЕ мстиониновых дипептидов по отношению к псроксильному радикалу (табл. 2) показал, что АОЕ дипептидов с С-концевым положением метионина по отношению к псроксильному радикалу (0,45±0,01 мкмоль ТЭ/мкмоль) соответствуют АОЕ свободного метионина (0,49±0,03 мкмоль ТЭ/мкмоль). По сравнению со свободным мстионином дипептиды, содержащие М-концевой остаток метионина, характеризовались в среднем на 20% более низкими значениями АОЕ (табл. 2). Таким образом, карбоксильная группа метионина, по-видимому, участвует во взаимодействии соответствующих пептидов с пероксильным радикалом.

Исследование АОЕ дипептидов, содержащих остатки двух рсдокс-активных аминокислот, по отношению к псроксильному радикалу показало, что в случае Мс1-Тгр, Тгр-Ме1, Тут-Туг, Туг-Тгр, Туг-ЕПв, Ш-Туг и Туг-Мй наблюдалась аддитивность

антиоксидантных эффектов остатков редокс-активных аминокислот (табл. 1 и 2). Для Тгр-Туг показан эффект внутримолекулярного синергизма остатков редокс-активных аминокислот при взаимодействии с пероксильным радикалом (табл. 1). Полученные данные по величине АОЕ Тгр-Туг свидетельствуют, что при взаимодействии данного дипептида с пероксильным радикалом происходит первичное окисление остатка триптофана с последующим внутримолекуляным переносом электрона с фенольного гидроксила тирозина на радикал триптофана. Процессы прямого окисления Тут остатка пероксильным радикалом и внутримолекулярного переноса электрона с Туг остатка на триптофильный радикал конкурируют между собой, при этом, исходя из величины АОЕ Тгр-Туг по отношению к пероксильному радикалу, 2/3 Туг остатков подвергается прямому окислению пероксильным радикалом, в то время как в 1/3 случаев реализуется процесс внутримолекулярного переноса электрона.

Исследование АОЕ дипептидов с двумя остатками редокс-активных аминокислот по отношению катион-радикалу АБТС (табл. 1) показало, что в случае Met-Tyr, Tyr-His и His-Tyr наблюдается эффект внутримолекулярного синергизма, обусловленного, по-видимому, процессами внутримолекулярного

туннельного переноса электрона с метионинового или гистидинового остатка на тирозиновый феноксильный радикал. Величины АОЕ Met-Trp (2,60±0,06) и Тгр-Met (3,30±0,04 мкмоль ТЭ/мкмоль) по отношению к катион-радикалу АБТС соответствуют значениям АОЕ N- и С-терминальных остатков Тгр, что свидетельствует о том, что Met остатки не участвуют во взаимодействии данных дипептидов с катион-радикалом АБТС.

Таким образом, эмпирическими дескрипторами, определяющими высокую величину АОЕ тирозиновых пептидов по отношению к катион-радикалу АБТС, являются: N-концевое положение остатков Туг и Тгр, наличие соседних с Туг остатков Met или His, наличие в последовательности пептида предшествующих Туг остатков Lys и Arg. В случае пероксилыюго радикала в последовательности пептида наоборот остатки Lys и Arg должны следовать после остатка Туг, в то время как в этой позиции не должно быть остатков кислых аминокислот (Asp, Glu). Также пептид будет обладать более высокой АОЕ по отношению к пероксильному радикалу при наличии в нем последовательности Тгр-Туг. Эмпирическим дескриптором, определяющим высокую величину АОЕ метиониновых пептидов по отношению к пероксильному радикалу, является С-концевое положение Met остатка.

Молекулярные и электронные дескрипторы антиоксидантных свойств метионин- и тирозин- содержащих дипептидов.

Выбор анализируемых дескрипторов базировался на существующих данных по электронным и термодинамическим характеристикам процесса электрофильного замещения (SE) в ароматических системах (распределение Мулликеновских зарядов, <о, X, л), а также механизмов ДАВ (ЭДС), ПДЭД (ПИ, ЭПД) и ПД ЦЭ (СП, ЭПЭ).

Таблица 2. Антиоксидантиная емкость метиониновых дипептидов по

отношению к пероксильному _радикалу (ORAC)._

АОЕ, мкмоль

Пептид ТЭ/мкмоль

ORAC

Gly-Met 0,44±0,02

Ala-Met 0,44±0,03

Val-Met 0,45±0,04

Lys-Met 0,48±0,03

His-Met 0,37±0,01

Trp-Met 3,48±0,06

Met-Gly 0,36±0,01

Met-Ala 0,41 ±0,01

Met-Val 0,36±0,02

Met-Glu 0,35±0,02

Met-Lys 0,36±0,01

Met-Met 0,71±0,02

Met-His 0,36±0,01

Met-Trp 2,49±0,04

Для расчетов молекулярных и электронных дескрипторов антиоксидантных свойств дипептидов с помощью полуэмпиричсских методов решены трехмерные структуры мстионин- и тирозин- содержащих дипептидов в газовой фазе.

Результаты расчетов молекулярных и электронных дескрипторов мстиониновых дипептидов показали, что дипептиды с аминокислотами, не содержащими ионогенных групп в боковых радикалах, и С-концсвым положением остатка метионина характеризуются более низкими значениями ПИс (6,35-7,75 эВ) по сравнению с их аналогами с N-концсвым мстиониновым остатком (7,58-8,53 эВ), что свидетельствует о большей устойчивости последних к окислению и согласуется с результатами определения АОЕ (табл. 2). В то же время, наличие в мстиониновых дипептидах остатков кислых аминокислот (Glu, Asp) приводит к двухкратному снижению величины ПИе до 3,99—4,15, а остатков Lys и Arg - наоборот, к увеличению ПИс до 9,45-10,42 эВ. Выявленная тенденция обусловлена наличием соответственно отрицательных и положительных зарядов на ионогенных группах, что приводит к закономерным изменения ПИ исследуемых соединений в газовой фазе. Сопоставление результатов квантово-химичсских расчетов и значений АОЕ мстиониновых дипептидов по отношению к псроксильному радикалу позволило установить наличие значимой (р<0,05) обратной корреляции величин АОЕ и значений ПИе (r=-0,819), х (г=-0,874) и со (г=-0,818).

0,6 0,5

О 0,4 <

° 0,3 ш

< 0,2

0,1 0

7,5 8 ПИе, эВ

8,5

0,6 0,5

о 0,4 <

0,3

ш О

< 0,2

0,1 0

0,6 0,65 0,7

электрофильность, эВ

0,75

0,6 0,5

" 0,4 <

а.

0,3

ш О < 0,2

0,1

3,4 3,5 3,6 3,7 3,8 3,9 электроотрицательность, эВ

Рис. 3. Сопоставление величин АОЕ метиониновых дипептидов по отношению к пероксильному радикалу и значений их потенциалов ионизации (ПИе -

а), электроотрицательности (у -

б) и электрофильности (ш - в).

Результаты расчета Мулликеновского распределения электронной плотности в катион-радикалах метиониновых дипептидов показали, что наиболее высокая плотность отрицательного заряда локализуется на а-атоме углерода метионинового остатка. Таким образом, наличие значимой обратной корреляции АОЕ мстиониновых дипептидов по отношению к пероксильному радикалу с величиной их ПИе и данные по

распределению Мулликеиовских зарядов в катион-радикалах метиоииновых пептидов, свидетельствуют в пользу механизма одноэлектронного окисления остатков метионина пероксильным радикалом (рис. 4). Донирование электрона атомом серы приводит к образованию пероксид аниона и катион-радикала метионина. Перераспределение электронной плотности в катион-радикале метионина приводит к локализации неспаренного электрона на a-атоме углерода с последующим декарбоксилированием при С-терминальном положении остатка метионина (рис. 4). В случае дипептидов с N-терминалъным метиониновым остатком перераспределение электронной плотности в катион-радикале метионина будет приводить к разрыву пептидной связи. При этом процесс декарбоксилирования, по-видимому, более энергетически выгоден по сравнению с разрывом пептидной связи, что объясняет более высокие значения АОЕ дипептидов с С-концевым остатком метионина по сравнению с аналогичными дипептидами, содержащими N-концевой остаток метионина (табл. 2).

нр ROOH + он

е в

соо roo. roo© cog

i ч / +• I .0

CHj-S-CHz-CHz— C-NHj —СНз— S—CH2-CH2— C— NH3-► CHj— S— CHy-CHr-C-nh3

I в I ® I

H + CO2 H

Рис. 4. Механизм взаимодействия метионина с пероксильным радикалом.

Результаты расчетов молекулярных и электронных дескрипторов тирозиновых дипептидов свидетельствуют, что при С-концевом положении остатка тирозина предпочтительным для атаки электрофильными агентами является атом углерода С1 в орто-положении по отношению к фенолыгому гидрокешту (С6) (рис. 5). При N-концевом положении тирозинового остатка в дипептидах максимальная электронная плотность наблюдается на атоме углерода С4, либо значения электронной плотности на атомах углерода С1 и С4 сопоставимы (Tyr-Gln, Tyr-Ser, Tyr-Leu и др.). Таким образом, как механизм взаимодействия дипептидов с N и С-концевым положением тирозина с катион-радикалом АБТС, так и спектр образующихся продуктов может существенно отличаться, что подтверждает выявленные отличия в величинах АОЕ соответствующих тирозиновых дипептидов по отношению к катион-радикалу АБТС (табл. 1). Результаты расчетов Мулликеновского распределения электронной плотности в радикалах и катион-радикалах тирозина и тирозиновых пептидов, свидетельствует о том, что максимальная электронная плотность локализуется на атомах углерода С1 и С4, которые предпочтительны для вторичной атаки электрофильных агентов.

Результаты расчетов термодинамических характеристик реакций окисления тирозиновых дипептидов в газовой фазе свидетельствуют о том, что дипептиды тирозина с аминокислотами, не содержащими ионогенных групп в боковых радикалах, и С-концевым положением тирозинового остатка характеризуются в среднем на 10% более низкими значениями ПИе (7,20±0,49 эВ) по сравнению с аналогами с N-концевым тирозиновым остатком (7,93±0,38 эВ). В то же время установлено, что дипептиды с N- и С-концевым положением тирозиновых остатков не отличаются по величине ЭДС О-Н в фенольном гидроксиле (83,2±2,8 и 82,9±5,4 ккал/моль соответственно). Сопоставление данных по величинам АОЕ тирозиновых дипептидов по отношению к катион-радикалу АБТС и пероксилыюму радикалу (табл 2) и рассчитанных термодинамических и энергетических характеристик не выявило наличия значимых корреляций. Данный факт объясняется существенным отличием структуры тирозиновых пептидов в газовой фазе и в водных растворах, за счет

6Т

он

Рис.5.

Структурная

формула

тирозина.

образования в последнем случае цвитгер-ионных форм дипсптидов и их взаимодействия с молекулами растворителя. Для ответа на вопрос о механизме антиоксидантного действия тирозиновых дипсптидов была проведена характеристика антиоксидантныс свойства модельных соединений - ароматических гидроксикислот. Следует отмстить, что тирозин является предшественником п-ГБ и п-ГК кислот в шикиматном путс их биосинтеза, что позволяет рассматривать последние в качестве упрощенных аналогов Туг.

Характеристика антиокемдантных свойств ГБ и ГК кислот.

Структуры ГБ и транс-ГК кислот представлены на рис. 6. Следует отмстить, что п-ГБК, ВК и СирК являются структурными аналогами соответствующих ГК кислот -КК, ФК и СинК (табл. 3).

По аналогии с аминокислотами и дипептидами, АОЕ ГБ и ГК кислот определяли по отношению к катион-радикалу АБТС (ТЕАС) и псроксильному радикалу ((ЖАС) при рН 7,4 (табл. 4). Сравнение АОЕ ГБ и ГК кислот показало, что ГК кислоты характеризуются в 1,2-2,5 раза более высокими значениями АОЕ по отношению к обоим типам радикалов по сравнению с аналогичными ГБ кислотами (табл. 4). Данный факт может объясняться двумя причинами: стабилизацией фсноксильных радикалов ГК

кислот за счет делокализации нсспарснного электрона при сопряжении бензольного кольца с СЗ цепочкой и более высокой электронной плотностью в бензольном кольце ГК кислот по сравнению с ГБ за счет наличия у ГК этенильного мостика между

карбоксильной группой и бензольным кольцом.

Анализ АОЕ ГК кислот показал, что значения их АОЕ по отношению к псроксильному радикалу убывает в ряду КК>ФК>СинК (табл. 4). Следовательно, введение как одного, так и двух мстоксильных заместителей в о-положение по отношению к гидроксигруппс приводит к снижению АОЕ Г'К кислот по отношению к псроксильному радикалу.

Таблица 3. Заместители в бензольном кольце ГБ и ГК кислот.

Соединение Я] Яб

п-гидроксибснзойные кислоты

п-гидроксибснзойная (п-ГБК) Н Н ОН

ванилиновая (ВК) Н ОСНз он

сиреневая (СирК) ОСН3 ОСНз он

п-гидроксикоричные кислоты

п-кумаровая (КК) Н Н он

феруловая (ФК) Н ОСНз он

синаповая (СинК) ОСНз ОСНз ОН

Значения АОЕ ГК кислот по отношению к катион-радикалу АБТС убывают в ряду ФК=СинК>КК (табл. 4). Отличия в наблюдаемых тенденциях изменения АОЕ ГК кислот с различным числом мстоксильных заместителей по отношению к катион-

но^о

Рис. 6. Структурные формулы гидроксибензойных (а) и транс-гидроксикоричных (б) кислот.

радикалу АБТС и пероксильному радикалу обусловлены неконкурентным и конкурентным характером соответствующих методов анализа АОЕ. В случае анализа АОЕ по отношению к катион-радикалу АБТС первичные продукты окисления частично сохраняют способность к гашению радикала, что вносит вклад в определяемое значение АОЕ.

Таблица 4. Антиоксидантная емкость гидроксибензойных и гидроксикоричных кислот но отношению к пероксильному радикалу (ОИАС) катион-радикалу АБТС(ТЕАС).___

Соединение АОЕ, мкмоль ТЭ/мкмоль

ОЯАС ТЕАС

п-ГБК 2,17±0,18 2,34±0,07

ВК 3,44±0,19 2,33±0,08

СирК 1,52±0,11 1,46±0,09

КК 5,02±0,26 3,04±0,18

ФК 4,59±0,31 3,90±0,21

СинК 2,94±0,19 3,66±0,15

Величины АОЕ ГБ кислот по отношению к пероксильному радикалу убывают в ряду ВК>п-ГБК>СирК. В отличие от ГК кислот, введение 1 метоксильного заместителя в о-положение по отношению к гидроксигруппе приводит к увеличению АОЕ ГБ кислот, однако наличие 2-х метоксильных заместителей наоборот приводит к сс снижению (табл. 4). В целом сходная тенденция наблюдается в случае анализа АОЕ ГБ кислот по отношению к катион-радикалу АБТС: АОЕ убывает в ряду ВЮ=п-ГБК>СирК.

Результирующее влияние метоксильных заместителей на АОЕ ГБ и ГК кислот определяется суммой трех эффектов: влияния метоксильных заместителей на распределение электронной плотности в ароматических системах, стабилизационных эффектов при делокализации неспарснного электрона образующегося фсноксильного радикала и стерических эффектов. Наличие в ГБ и ГК двух метоксильных заместителей вызывает снижение электронной плотности в ароматической системе и возникновение стерических препятствий при взаимодействии с пероксильным радикалом и катион-радикалом АБТС, что приводит к снижению АОЕ (табл. 4). В то же время, при наличии одного метоксильного заместителя преобладающим является эффект стабилизации фсноксильного радикала, который нивелирует негативное влияние остальных двух факторов на АОЕ ГБ и ГК кислот.

Молекулярные и электронные дескрипторы антиоксидантных свойств ГБ и ГК кислот.

Атомы углерода бензольного кольца с максимальной электронной плотностью наиболее предпочтительны для атаки электрофильных агентов, к которым относятся свободные радикалы. Результаты расчетов молекулярных и электронных дескрипторов моноанионных (с депротонированной карбоксильной группой) форм ГБ и ГК кислот свидетельствуют, что предпочтительными для атаки элсктрофильными агентами являются атомы углерода, находящиеся в м-положениях (С2, С4) по отношению к фенольному гидроксилу (рис. 5). В случае п-ГБК и ВК введение одного метоксильного заместителя снижает величину Мулликеновского заряда в полрожении С2 в 2,7 раза, однако АОЕ по отношению к пероксильному радикалу для ВК в 1,5 раза выше по сравнению с п-ГБК (табл. 4). В данном случае, по-видимому, более значимым оказывается стабилизационный эффект и отсутствие выраженных пространственных затруднений. В то же время при добавлении еще одного метоксильного заместителя (СирК), Мулликеновский заряд в положении С2 снижается в 3,2 раза и возникают пространственные затруднения для атаки объемных радикалов по С2 атому углерода,

что в совокупности приводит к снижению АОЕ по сравнению с п-ГБК в 1,8 и 1,4 раза по отношению к катион-радикалу АБТС и псроксилыюму радикалу соответственно. Аналогичная тенденция наблюдалась при сравнении транс-КК и транс-СинК.

Сопоставление данных табл. 4 по АОЕ ГБ и ГК кислот по отношению к псроксильному радикалу и величин Мулликсновких зарядов в положениях С2/С4 моноанионных форм гидрокси-ароматичсских кислот показало наличие значимой (р<0,05) обратной корреляции (г=-0,889) между данными параметрами (рис. 7а). Также было установлено наличие значимой (р<0,05) корреляции между значениями АОЕ ГБ и ГК кислот по отношению к псроксилыюму радикалу и величиной энергии ВЗМО (г=0,824) и жесткостью (1=-0,871) моноанионных форм данных соединений (рис. 7 б,в). Таким образом, различия в величинах АОЕ ГБ и ГК по отношению к псроксилыюму радикалу объясняются более высокими значениями Мулликсноского заряда на предпочтительном для атаки элсктрофилов атоме углерода и более низкой жесткостью ГК по сравнению с ГБ.

Мулликсновскос распределение электронной плотности было также рассчитано для радикалов и катион-радикалов ГБ и ГК в различных состояниях ионизации. Полученные данные показали, что отдача атома водорода или электрона приводит к образованию соответствующих фсноксильных радикалов и катион-радикалов, у которых наиболее высокая электронная плотность отмечается на атомах углерода, находящихся в мста-положсниях по отношению к фенольному гидроксилу. Таким образом, именно эти положения являются предпочтительными для вторичной атаки электрофильных агентов.

г Ё

-0,2 •0,4 _-0,6 £-0,8 -1 -1,2 -1,4 ■1,6

АОЕ ОР^АС, мкмоль ТЭ/мкмоль 2 4 6

: и

1,85 1,8 1,75 1,7 1,65 1,6 " 1,55 1,5 1,45

АОЕ СЖАС, мкмоль ТЭ/мкмоль

-0 ОГСАС, мкмоль ТЭ/мкмоль

-0,057 2

■0,058 -0,059 4,06 -0,061 -0,062 -0,063

Рис. 7. Сопоставление величии АОЕ ГБ и ГК по отношению к

псроксильному радикалу и значений Мулликеновской электронной плотности в положении С2/С4 (а), энергии ВЗМО (б) и жесткости Сп - в1.

Согласно квантово-химичсским расчетам СЗ цепочка участвует в дслокапизации нсспарснного электрона у радикалов и катион-радикалах транс-ГК кислот, а также радикалов моноанионной формы цис- ФК и СинК. Полученные данные свидетельствуют, что дслокализация нсспарснного электрона в фсноксильных радикалах ГК кислот возможна при величине угла между плоскостями, в которых находятся атомы углерода бензольного кольца и атомы углерода при двойной связи в

СЗ цепочке, не более ±10°С. По-видимому, именно большая стабильность феноксильных радикалов транс-ГК кислот является причиной того, что в структуре растительных лигнинов преобладают звенья именно транс-ГК кислот и альдегидов. Таким образом, сравнение результатов квантово-химических расчетов с результатами анализа АОЕ подтвердило сделанный вывод о влиянии СЗ фрагмента и этенильного мостика между карбоксильной группой и бензольным кольцом на АОЕ ГК кислот (табл. 4).

Для дискриминации механизма взаимодействия ГБ и ГК кислот с катион-радикалом АБТС был проведен анализ корреляций значений АОЕ с термодинамическими характеристиками моноанионных форм ГБ и ГК кислот. Выявлена значимая (р<0,05) корреляция значений АОЕ моно-ГБ и моно-ГК кислот по отношению к катион-радикалу АБТС наблюдается только с величиной ЭПЭ (г= 0,901). Следовательно, при рН реакционной среды 7,40 основным механизмом реализации антиоксидантных свойств ГБ и ГК кислот по отношению к катион-радикалу АБТС является ПДДЭ. Поскольку п-ГБ и п-ГК кислоты являются структурными аналогами тирозина, следует ожидать, что взаимодействие тирозин-содержащих дипептидов с катион-радикалом АБТС, также протекает по механизму ПДДЭ.

На основе результатов проведенного анализа корреляций величин АОЕ и термодинамических и электронных характеристик предложена схема, описывающая механизм взаимодействия п-ГБ и п-ГК кислот и тирозиновых пептидов с пероксильным радикалом (рис. 8). Первичная атака псроксильного радикала реализуется по многостадийному механизму Бе: пероксильный радикал атакует ароматическую систему по атому углерода с наибольшей электронной плотностью с образованием интермедиата 1, распад которого приводит к отрыву атома водорода фенольного гидроксила с образованием гидропероксида и феноксильного радикала. Затем происходит делокализация неспаренного электрона с образованием наиболее термодинамически устойчивой формы феноксильного радикала. В случае ванилиновой кислоты максимальная электронная плотность локализуется на С2 атоме углерода, по которому проходит вторичная атака пероксильным радикалом, приводящая к образованию интермедиата 2, который, в свою очередь, вступает в последующие химические реакции с образованием стабильных продуктов.

ванилиновая интермедиат феноксильный делокализация интермедиат кислота 1 радикал неспаренного электрона 2

Рис. 8. Механизм взаимодействия гидроксибензойных и гидроксикоричных кислот с пероксильным радикалом на примере ванилиновой кислоты.

Характеристика композиций с различным пептидным профилем.

Для верификации антиоксидантных свойств пептидов и аминокислот in vivo было проведено исследование влияния пептидных композиций, полученных при ферментативном гидролизе коллагеновых и мышечных белков, на антиоксидантный статус крыс. Пептидная композиция ФМП2 была получена из ФМП1 методом последовательной тангенциальной микро- и ультрафильтрации. Сравнительная характеристика состава и антиоксидантных свойств исследованных пептидных композиций in vitro представлена в табл. 5.

Пептидные композиции ФМП1 и ФМП2 характеризовались сопоставимым общим содержанием аминокислот и белка (табл. 5). В то же время пептидные композиции ФМП1 н ФМП2 отличались по молекулярно-массовому распределению и содержанию свободных аминокислот. В ФМП1 преобладающей (>50%) являлась низкомолекулярная фракция (М.в.<3 кДа), а в ФМП2 - фракция с молекулярным весом компонентов от 3 до 10 кДа. Кроме того, содержание свободных аминокислот в ФМГ12 было в 1,6 раза ниже по сравнению с ФМП1. Более низкое содержание свободных аминокислот, которые обладают выраженной способностью к гашению пероксилыюго радикала и катион-радикала АБТС in vitro (рис. 1), обуславливает в 1,3-1,5 раза более низкие величины ЛОЕ ФМП2 по отношению к обои типам радикалов по сравнению с таковыми для ФМП1 (табл. 5). Для определение вклада компонентов с различными молекулярными массами, входящих в состав пептидных композиций ФМП1 и ФМП2, было проведено их фракционирование методом гель фильтрации с последующим анализом ЛОЕ полученных фракций (табл. 5, рис. 9). Анализ относительного вклада компонентов с различным М.в. в АОЕ пептидных композиций ФМП1 н ФМП2 показал, что более половины величины ЛОЕ по отношению к пероксилыю.му радикалу и более 70% - по отношению к катион-радикалу АБТС приходится на долю низкомолекулярной фракции (М.в.<3 кДа), включающей короткие пептиды и свободные аминокислоты (табл. 5, рис. 9).

25 относительный М.в. >10 кДа М.в. 3-10 кДа вклад в AOEJjfr__л_

□ ORAC

□ ТЕАС

М.в. <3 цЦа

- .----------ГШ. — г*. ГЪ гъ

1 2 3 4 5 8 7 8 91011 12 13 14 1516

25 относительный вклад в АОЕ, %

20 15 п 10 5 0 -

□ ORAC

□ ТЕАС

• па,ш r£i СЭ Di L

7 18 19 20 21 22 23

номер фракц!

шиш

ФМП1

ГЫ (11 Ш 11J1U ГЪ m__,_________

>4 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 И

ФМП2

12345678 9 10 1112 13 14 15)6 1 718 )9 2021 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40

б номер фракции

Рис. 9. - Анализ вклада компонентов с различными молекулярными массами в аптиокендантиую емкость пептидных композиции ФМП1 и ФМП2.

Таблица 5. Сравнение пептидных композиций ФМП1 и ФМП2.

Параметр Пептидная композиция

ФМП1 ФМП2

массовая доля белка (Мх6,25), % 86,5 85,5

относительное содержание компонентов с М.в.>10 кДа 10,6 11,6

относительное содержание компонентов с М.в. 3-10 кДа 34,4 60,3

относительное содержание компонентов с М.в. <3 кДа 55,1 28,1

общее содержание аминокислот, мг/г 873,8±37,4 864,1±33,7

содержание свободных аминокислот, мг/г 281,2±13,9 173,1 ±20,6

АОЕ ОЫАС, мкмоль ТЭ/г 319±13 209±2

вклад компонентов с М.в.>10 кДа в АОЕ ОЯАС, % 5,7 8,1

вклад компонентов с М.в. 3-10 кДа в АОЕ ОЯАС, % 38,9 32,8

вклад компонентов с М.в.<3 кДа в АОЕ ОКАС, % 57,6 59,1

вклад свободных аминокислот в АОЕ ОЯАС, % 46,6 35,8

АОЕ ТЕАС, мкмоль ТЭ/г 638±13 484±19

вклад компонентов с М.в.>10 кДа в АОЕ ТЕАС, % 3,5 6,1

вклад компонентов с М.в. 3-10 кДа в АОЕ ТЕАС, % 21,0 15,1

вклад компонентов с М.в.<3 кДа в АОЕ ТЕАС, % 75,5 78,8

вклад свободных аминокислот в АОЕ ТЕАС, % 43,9 39,3

Установлено, что пептидные композиции ФМП1 и ФМП2 характеризовались бимодальным распределением относительного вклада фракций в АОЕ по отношению к псроксильному радикалу, при этом основная часть АОЕ приходилась на фракции 20-26 (пептиды, Туг, Met, His, анссрин, карнозин) и 30-33 (свободный Тгр) (рис. 9). В случае ФМП1 также наблюдается бимодальное распределение относительного вклада фракций с различным молекулярным весом компонентов в АОЕ по отношению к катион-радикалу АБТС, с максимальной относительной долей фракций 23-28 и 30-33. На фоне пониженного содержания свободных аминокислот в ФМП2 отмечалось возрастание относительного вклада низкомолекулярных пептидов в АОЕ по отношению к катион-радикалу АБТС и пероксильному радикалу на 8 и 23% соответственно (табл. 5). Анализ распределения относительного вклада фракций в АОЕ ФМП2 по отношению к катион-радикалу АБТС показал, что оно существенно отличалось от такового для ФМП1: на долю фракций 27 и 28 приходилось около 40% от общей АОЕ (рис. 9).

Анализ пептидного профиля композиций ФМП1 и ФМП2 методом масс-спсктрометрии ионно-циклотронного резонанса позволил идентифицировать соответственно 573 и 620 последовательностей пептидов, для которых основными предшественниками являлись саркоплазматические и миофибриллярные белки, коллагены и белки крови. Анализ последовательностей идентифицированных пептидов с учетом данных по рсдокс-активности различных аминокислот (рис. 1) позволил выявить в ФМП1 296 пептидов, вступающих в реакции с псроксильным радикалом и 164 пептида, вступающих в реакции с катион-радикалом АБТС, а в ФМП2 - 353 и 189 пептидов соответственно. Для решения проблемы обоснованного выбора соединений для последующего анализа была разработана стратегии скрининга антиоксидантных пептидов с использованием набора установленных ранее молекулярных дескрипторов антиоксидантных свойств дипептидов (табл. 6, рис. 10).

Таблица 6. Молекулярные дескрипторы ангноксидантов пептидной природы.______

Дескриптор Значение эффекта АОЕ по отношению к пероксильному радикалу АОЕпо отношению к катион-радикалу АБТС

Предпочтительное или С-концевое положение остатка редокс-активной аминокислоты +1 С-концевое положение Met N-копцевое положение Туг и Ттр

Наличие в составе пептида последовательностей, обуславливающих эффекты внутримолекулярного синергизма между соседними остатками редокс-активных аминокислот +1 Trp-Tyr Tyr-His His-Tyr Met-Туг

Наличие в составе пептида последовательностей, в которых соседние остатки аминокислот с иопогениыми группами в боковых радикалах оказывают позитивное или негативное влияние на антиоксидантные свойства остатков редокс-активных аминокислот +1/-1 -1: Ly s-Tyr, Arg-Tyr, Tyr-Glu, Tyr-Asp +1: Tyr-Lys, Tyr-Arg +1: Lys-Tyr, Arg-Тут

Следует отметить, что имеющиеся литературные данные свидетельствуют о снижении АОЕ пептидов с увеличением числа аминокислотных остатков, входящих в их состав [Негпапс1е2-Ье(1езта й а1., 2007; БЬеп е1 а1., 2010]. При этом средняя длина антиоксидантных пептидов, описанных в литературе, составляет порядка 10 аминокислотных остатков. Для оценки АОЕ пептидов был предложен интегральный параметр I, учитывающий размер пептида и количество в нем остатков редокс-активных аминокислот, а также позиционные эффекты и эффекты взаимного влияния аминокислотных остатков на антиоксидантные свойства пептидов (уравнение 1). С учетом вышеизложенного для каждого идентифицированного пептида рассчитывали величииу интегрального параметра I.

/ =

где Е; - величина эффекта согласно табл. 6; п - число остатков редокс-активных аминокислот в составе пептида; N - общее число аминокислотных остатков в пептиде.

Разработанная стратегия отбора пептидов с потенциально высокой антиоксидантной емкостью базируется на подсчете числа остатков редокс-активных аминокислот в пептиде с учетом эффектов взаимного влияния аминокислотных остатков, выявленных при анализе антиоксидантных свройств модельных низкомолекулярных соединений - дипептидов.

На основе данных по числу и качественному составу остатков редокс-активных аминокислот, входящих в состав исследуемого пептида, а также рассчитанных величин характеристического параметра I, из числа антиоксидантных пептидов, идентифицированных в композициях ФМП1 и ФМП2, были отобраны соединения с

потенциально высокими величинами АОЕ. В качестве примера в табл. 7 приведены последовательности соответствующих пептидов в ФМП1. Полученные данные свидетельствуют, что основными предшественниками пептидов с потенциально высокими значениями АОЕ в исследованных пептидных композициях являются миофибриллярные (а-актин, цепи миозина), сакроплазматические (глицслальдегид-3-фосфатдегидрогеназа, енолазы) белки и белки крови (а-субъсдиница гемоглобина, сывороточный альбумин).

Таблица 7. Пептиды, входящие в состав композиции ФМП1, с потенциально высокой антиоксидантной емкостью по отношению к пероксильному радикалу (РИАС) и катион-радикалу АБТС (ТЕАС).__

Белок предшественник Gallus galliis ORAC TEAC

а-акгин DSGDGVTHNVPIYEGY, WIGGSILA YDEAGPS, YELPDGQVIT, YELPDGQVITIGNER, YELPDGQVITIG, DSGDGVTHNVPIYEGY, NVPAMY, WIGGSILA, TNFVPAMY, YVGDEAQSKRG, YELPDGQVITrGNE

тяжелая цепь миозина TTNPYDYHYVSQ, TNPYDYHY TTNPYDYHYVSQ, TNPYDYHY,

регуляторная легкая цепь миозина DPEDVIM -

глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназа AINDPFIDLNYMVY, VSWYDNEFGYSN, SWYDNEFGYSN, VSWYDN^FGYSNR, INDPFroLNYMVY WAINDPFIDLNYM AINDPFIDLNYMVY, VSWYDNEFGYSN, YDSTHGHFK, SWYDNEFGYSN,

ß-енолаза - YPVVSIEDPFDQDDWE, YPWS

а-енолаза - YGKDATNVGDEGGFAP, YGKDATNVGDEGGFAPN YGKDATNVGDEGGFAPNIL

креатин-киназа М-типа GDDLDPKY, GGDDLDPKY, KGGDDLDPKY, NLKGGDDLDPKY -

сывороточный альбумин DTKYVPPPFNPDM, MDDMARMM YVPPPFNPDMFSFDE, YVPPPFNPDMF

а-субъединица гемоглобина А YPPTKTYFPHFD YGAETL, YPPTKTYFPHFD, YGAETLERMF, YPPTKTYFP

овотрансфсррин GWV1PM -

Пептиды размером до 20 а.о.

Пептиды,

содержащие >4

остатков ре доке-

активных

аминокислот J

Пептиды, содержащие > 3 остатков р едоке-активных аминокислот и й 2 остатков Туг и I илиТгр ,

Пептиды, содержащие 2 1 остаток Туг и / или ТФ

Пептиды, содержащие £ 1 остатка Met или His

l>0,3

l>0,5

Пептиды с потенциально высокой аитиоксидантной емкостью

Рис. 10. Стратегия скрининга антиокендащных пептадов, входящих в состав пептидных композиций.

Характеристика антноксидантных свойств пептидных композиций с различным пептидным профилем ш viro.

Исследование антноксидантных свойств пептидных композиций in vivo проводили на 4 экспериментальных группах крыс. Животных содержали на полусинтетических рационах, отличающихся источником белка: группа 1 (казеии), группа 2 (ФМП1), группа 3 (ФМП2) и контрольная группа - безбелковый рацион.

Величины АОЕ и содержание ТБК-реактивных продуктов в сыворотке крови как у экспериментальных животных, так и в контрольной группе были практически одинаковыми (табл. 8). Данные показатели экстрактов гидрофильных и лнпофштьных компонентов тканей печени также не отличались у экспериментальных животных (группы 1-3). В то же время, у животных контрольной группы значения АОЕ экстрактов гидрофильных и липофильных компонентов из печени по отношению к пероксилыюму радикалу были соответственно в 1,9 и 3,0 раза ниже по сравнению с остальными экспериментальными группами (табл. 8). Отличия в значениях АОЕ обусловлены различной реакционной способностью пероксилыюго радикала и катион-радикала АБТС.

Наиболее выраженные отличия между экспериментальными группами животных в значениях показателен антиоксидантного статуса выявлены при анализе экстрактов головного мозга. У животных контрольной группы значения АОЕ экстрактов гидрофильных компонентов головного мозга по отношению к пероксилыюму радикалу были в 1,3 раза ниже по сравнению с таковыми в остальных экспериментальных группах (табл. 8). Таким образом, при безбелковой диете у крыс наблюдается снижение функционального резерва в первую очередь водорастворимых антиоксидантов в печени и головном мозге. Содержание ТБК-реактивных продуктов в гомогенатах головного мозга было достоверно (р<0,05) ниже у животных 2 и 3 групп, получавших рационы на основе пептидных композиций (табл. 8). Животные 3 экспериментальной группы также характеризовались достоверно (р<0,06) более высокими значениями АОЕ экстрактов гидрофильных компонентов головного мозга по отношению к катион-радикалу АБТС по сравнению с таковыми для животных 1 и 4 групп (табл. 8). Выявленный более выраженный антиоксидантный эффект пептидной композиции ФМП2 с меньшим содержанием свободных аминокислот, обусловлен преобладанием в

ее составе низкомолекулярных пептидов. Таким образом антиоксидангаый эффект исследованных пептидных композиций in vivo обусловлен не свободными аминокислотами, а пептидами с М.в.< 3 кДа.

Таблица 8. Антиоксидантная емкость к содержание ТБК-реактивных продуктов в сыворотке крови и органах экспериментальных животных._

Объект Параметр Группа, M±SD

1(п=11), казеин 2 (п=11), ФМП1 3 (п=10), ФМП2 4(п=10), безбелковый ращон

сыворотка крови ТЕАС, мМ ЮД9±О,70 9,89±0,34 10,08±0,43 9,68±0,57

ОЛАС, мМ 4,92±0,26 4,81±0,64 5,19±0,3б 4,82±0,30

МДА, мкМ 1,22±0,20 1,45±0,28 1,14±0,22 1,23±0,26

печень ТЕАС гидрофильная фракция, мкмольТЭ/г 89,2±13,6 69,6±4,2 64,6±2,8 64,4±6,0

ТЕАС липофильная фракция, мкмоль ТЭ/г 0,34±0,07 0,40±0,09 0,45±0,11 0,38±0,06

ОИЛС. гидрофильная фракция, мкмоль ТЭ/г 17,3±2,6 18,2±1,4 17,2±2,2 9,2±1,9

ОКАС липофильная фракция, мкмольТЭ/г 2,73±0,99 2,88±0,79 2,34±0,75 0,88±0,40

МДА, нмоль/ г 59,0±8,7 55,2±12,7 57,9±4,1 54,4±10,2

головной мозг ТЕАС гидрофильная фракция, мкмольТЭ/г 38,Ш,8 43,5±3,1 49,9±3,2 37,2±5,6

ТЕАС липофильная фракция, нмоль ТЭ/г 19±4 25±5 21±3 19i3

011АС гидрофильная фракция, мкмоль ТЭ/г 6,26±1,16 6,72±0,78 6,77+0,85 4,83±1,27

011АС липофильная фракция, мкмоль ТЭ/г 2,43±0,70 2,60+0,58 2,99±0,61 2,63+0,33

МДА, нмоль/ г 44,8±4,4 32,9±4,2 36,3 ±4,1 41,2±7,7

ВЫВОДЫ

1. Показано, что редокс-активными по отношению к пероксилыюму радикалу являются аминокислоты Туг, Тгр, Met, Cys и His, по отношению к катион-радикалу АБТС - Туг, Тгр и Cys. Включение остатков Туг и Met в состав дипептидов приводит к разноплановым влияниям на величину их АОЕ, что определяется типом радикала, положением остатка редокс-активной аминокислоты, взаимодействием остатка редокс-активной аминокислоты с остатками других редокс-активных аминокислот и аминокислот с и оиогеипыми группами в боковых радикалах. Эффект внутримолекулярного синергизма остатков редокс-активных аминокислот показан при взаимодействии Тгр-Туг с пероксильным радикалом, а также Met-Tyr, Tyr-His и His-Tyr с катион-радикалом АБТС.

2. В результате проведенных структурно-функциональных исследований показано, что наиболее значимыми дескрипторами антиоксидантных свойств тирозина и его упрощенных модельных аналогов (ароматических п-гидроксикислот) по отношению к пероксилыюму радикалу являются энергия ВЗМО, жесткость (г|) и величина Мулликеновского заряда на атоме углерода в м-положении по отношению к фенолыюму гидроксилу, а по отношению к катион-радикалу АБТС при рН 7,40 -энтальпия переноса электрона от фенолят иона. Установлено, что наиболее значимыми

дескрипторами аитиоксидантных свойств мстиониповых дипсптидов по отношению к псроксилыюму радикалу являются потенциал ионизации (ПИ), элсктроотрицатслыюсть (х) и электрофилыюсть (<о).

3. На основе анализа результатов квантово-химичееких расчетов и тестирования антиоксидантной емкости установлено, что тирозин и сто упрощенные модельные аналоги (ароматические п-гидроксикислоты) взаимодействуют с пероксильпым радикалом по механизму элсктрофилыюго замещения с допированием атома водорода, а мстионин и дипептиды на сто основе - по механизму одноэлсктронного допирования. Механизм взаимодействия тирозиновых пептидов и ароматических п-гидроксикислот с катион-радикалом АБТС включает последовательное дспротонирование фенольного гидроксила и допирование электрона.

4. Предложен интегральный параметр I для оценки антиоксидантных свойств пептидов с учетом установленных эмпирических дескрипторов. На основании полученных данных разработана стратегия скрининга антиоксидантных пептидов.

5. Установлено, что основной вклад (>50%) в АОЕ пептидных композиций in vitro вносят низкомолекулярные компоненты (М.в.< 3 кДа), включающие пептиды и свободные аминокислоты. Показано, что антиоксидантный эффект пептидных композиций ir¡ vivo в условиях без индукции экзогенного окислительного стресса обусловлен не свободными аминокислотами, а пептидами с М.в.< 3 кДа.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в рецензируемых журналах:

1. Николаев И.В., Степанова Е.В., Еремеев Н.Л., Исмаилова Д.Ю., Зайчик Б.Ц., Ружицкий А.О, Хотчснков В.П., Костылсва Е.В., Синицын А.П., Волик В.Г., Королева О.В. (2008) Оптимизация процесса ферментативного гидролиза для получения функционального мясного протеина. Биотехнология, 5: 59-67.

2. Николаев И.В., Колобкова Л.Н., Ландесман Е.О., Степанова Е.В., Королева О.В. (2008) Антиоксидантная и псроксидазная активность слюны при воспалительных заболеваниях пародонта и возможность их коррекции. Биомедицинская химия, 54 (4): 454-462.

3. Николаев И.В., Степанова Е.В., Ландесман Е.О., Королева О.В., Митасева Л.Ф. (2008) Антиоксидантные свойства белковых гидролизатов животного происхождения. Мясная индустрия, 12: 36-39.

4. Еремеев Н.Л., Николаев И.В.а Керучснько И.Д., Степанова Е.В., Сатрутдинов А.Д., Зиновьев C.B., Исмаилова Д.Ю., Хотчснков В.П., Цурикова Н.В., Синицын А. П., Волик В.Г., Королева О.В. (2009) Ферментативный гидролиз кератинсодсржащсго сырья для получения белковых гидролизатов. Прикладная биохимия и микробиология, 45(6): 717-725.

5. Николаев И.В., Зайчик Б.Ц. Степанова Е.В., Королева О.В. (2009) Оценка антиоксидантной емкости коньяков. Виноделие и виноградарство, 2: 13-15.

6. Николаев И.В., Степанова Е.В., Митасева Л.Ф., Королева О.В., Машснцева Н.Г., Глазкова И.В. (2009) Многофункциональные продукты с улучшенными свойствами. Мясная индустрия, 9: 66-69.

7. Scmjonyschcva A. I., Nikolaew I.W., Maschenzewa N.G., Stcpanowa E.W., Mytascwa F. F., Koroljowa O.W. (2010) Methoden der rationellen Verarbeitung eines in der Geflügelverarbeitungsindustric anfallenden Rohstoffers (Rational processing of a raw material generated in the poultry processing industry). Fleischwirtschaft 3: 122-125.

8. Николаев И.В., Степанова Е.В., Королева О.В., Попов В.О. (2011) Биологически активные пептидные композиции из вторичных продуктов переработки птицы - обзор. Fleischwirtschaft International - Россия, 1:61 -64.

Тезисы докладов:

1. Nikolaev I.V., Stepanova Е. V., Keruchcnko I.D., Keruchenko J.S., Khotchcnkov V.P., Korolcva O.V. (2008) Influence of hydrolysis degree on antioxidant properties of peptide hydrolysatcs. Proceedings of the First European Food CoHgrew.Ljubljana, Slovenia, p 191.

2. Ilya Nikolaev, Olga Klein, Natalia Kulikova, Elena Stepanova, Olga Koroleva (2008) Development and validation of antioxidant capacity assessment protocol for humic and humic-like substances. Proceedings of the 14-th meeting of International Humic Substances Society. Moscow-Saint-Petersburg, Russia, p. 441-444.

3. Зайчик Б.Ц., Николаев И.В., Ружицкий A.O., Хотченков В.П., Королева О.В.

(2009) Исследование качества и безопасности крепких алкогольных напитков. Биотехнология: состояние и перспективы развития. Москва, ч. 1 с. 449-450.

4. Nikolaev I.V., Lambertini F., Khotchcnkov V.P., Sforza S., Koroleva O.V. (2010) Antioxidant constituents of functional animal protein. 14-th International Biotechnology Symposium and exhibition. Rimini, Italy, J. Biotechnol. 150, Suppl. 1, p. 336-337.

5. Popov V.O., Dossena A., Nikolaev I.V., Lambertini F., Sforza S., Volik V.G., Korolcva O.V. (2010) Biocatalytic approach for poultry meat&bone residues conversion. 14th International Biotechnology Symposium and exhibition. Rimini, Italy, J. Biotechnol. 150, Suppl. 1, p. 570.

6. Кляйн О.И., Николаев И.В., Куликова H.A., Степанова Е.В., Королева О.В.

(2010) Оценка антиоксидантной емкости гуминовых и гуминоподобных веществ. Сборник тезисов докладов VIII Международной конференции Биоантиоксидант, Москва, с. 205-207.

7. Николаев И.В., Храмеева Е.Е., Степанова Е.В., Королева О.В. (2010) Структурно-функциональная характеристика антиоксидантных свойств гидроксибензойных и гидроксикоричных кислот. Сборник тезисов докладов VIII Международной конференции Биоантиоксидант. Москва, с. 205-207.

Работа выполнена при финансовой поддержке Государственных контрактов №16.512.11.2272 от 14 сентября 2011 года «Разработка биокаталитичсских подходов получения биоразлагасмых полимеров из малоценного кератин содержащего сырья», №02.522.11.2143 от 01 марта 2011 года «Разработка методов создания функциональных продуктов и кормов для домашних животных из малоценного сырья животного происхождения», № 02.740.11.0878 от «28» июня 2010 г «Разработка подходов биокаталитичсской конверсии малоценных отходов переработки птицы и создание аналитической платформы для тестирования многокомпонентных белковых гидролизатов».

СОКРАЩЕНИЯ И ОБОЗНАЧЕНИЯ, ИСПОЛЬЗОВАННЫЕ В ТЕКСТЕ

АБТС - 2,2'-азинобис-(3-этил-бсизотиазолинсульфонат)

АОЕ - аптиоксидантная емкость

АФК - активные формы кислорода

ВЗМО - высшая заполненная молекулярная орбиталь

ВК- ванилиновая кислота

ГБ - гидроксибензойныс кислоты

ГК- гидроксикоричные кислоты

ДАВ - допирование атома водорода

КК - п-кумаровая кислота

М.в. - молекулярный всс

НВМО - низшая вакантная молекулярная орбиталь НФБ - натрий-фосфатный буфер п-ГБК - п-гидроксибснзойная кислота

ПДДЭ - последовательное дспротонированис с донированисм электрона

ПДЭД - последовательное допирование электрона с депротонированием

ПИ - потенциал ионизации

СинК - синаповая кислота

СирК - сиреневая кислота

СП - сродство к протону

ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота

ФК - феруловая кислота

ФСБ - фосфатно-солсвой буфер

ЭДС - энтальпия диссоциации связи

ЭПД - энтальпия диссоциации протона

ЭПЭ - энтальпия переноса электрона

ОИАС - аптиоксидантная емкость по отношению к псроксильному радикалу ТЕАС - антиоксидантная емкость по отношению к катион-радикалу АБТС

Подписано в печать 24 февраля 2012 г. Объем 1,2 п.л. Тираж 130 экз. Заказ № 114 Отпечатано в Центре оперативной полиграфии ООО «Ол Би Принт» Москва, Ленинский пр-т, д.37

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Николаев, Илья Владимирович, Москва

61 12-2/307

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИМЕНИ А.Н. БАХА РОССИЙСКОЙ

АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи

/ '

НИКОЛАЕВ Илья Владимирович

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ АНТИОКСИДАНТНОГО ДЕЙСТВИЯ ПЕПТИДОВ И ИХ КОМПОЗИЦИЙ

03.01.04 - биохимия

Диссертация на соискание

ученой степени кандидата химических наук

Научный руководитель: проф., д.б.н. Королева О.В.

Москва-2012

Оглавление

Оглавление 2

Список сокращений 5

1. Введение 7

2. Литературный обзор 10

2.1 Методы анализа антиоксидантных свойств пептидов 11

2.2 Получение антиоксидантных пептидов и их композиций 16

2.3 Антиоксидантные свойства пептидов 25

2.4 Применение антиоксидантных пептидов 38

3. Материалы и методы 43

3.1 Материалы 43

3.1.1 Экспериментальные животные 43

3.1.2 Реагенты 43

3.1.3 Пептидные композиции 44

3.2 Методы 45

3.2.1 Определение антиоксидантной емкости (АОЕ) 45

3.2.2 Расчет геометрии молекул и электронных дескрипторов 49 исследуемых антиоксидантов полуэмпирическими квантово-химическими методами

3.2.3 Характеристика пептидных композиций 52

3.2.3.1 Определение содержания свободных аминокислот в составе 52 пептидных композиций

3.2.3.2 Определение общего содержания аминокислот в составе 53 пептидных композиций

3.2.3.3 Анализ молекулярно-массового распределения пептидных 54 композиций

3.2.3.4 Фракционирование и идентификация низкомолекулярных 54 компонентов пептидных композиций

3.2.3.5 Фракционирование и идентификация олигопептидных 56 компонентов пептидных композиций

3.2.4 Верификация антиоксидантных свойств пептидных композиций in 58 vivo

3.2.5 Определение содержания ТБК-реактивных продуктов в сыворотке 59 крови лабораторных животных

3.2.6 Определение содержания ТБК-реактивных продуктов в 60 гомогенатах тканей лабораторных животных

3.2.7 Определение АОЕ сыворотки крови лабораторных животных по 60 отношению к пероксильному радикалу и катион-радикалу АБТС

3.2.8 Определение АОЕ тканевых экстрактов по отношению к катион- 60 радикалу АБТС

3.2.9 Определение АОЕ тканевых экстрактов по отношению к 62 пероксильному радикалу

4. Результаты и их обсуждение 64

4.1 Антиоксидантные свойства аминокислот, тирозин- и метионин- 64 содержащих дипептидов

4.1.1 Антиоксидантные свойства аминокислот и их производных 64

4.1.2 Антиоксидантные свойства тирозиновых дипептидов 67

4.1.3 Антиоксидантные свойства метиониновых дипептидов 71

4.2 Расчеты молекулярных и электронных дескрипторов 72 антиоксидантных свойств аминокислот, метиониновых и тирозиновых

дипептидов

4.2.1 Расчеты молекулярных и электронных дескрипторов редокс 73 активных аминокислот

4.2.2 Расчеты молекулярных и электронных дескрипторов дипептидов 81

4.2.2.1 Расчеты молекулярных и электронных дескрипторов метионин- 82 содержащих дипептидов

4.2.2.2 Расчеты молекулярных и электронных дескрипторов 89

тирозин-содержащих дипептидов

4.3 Характеристика антиоксидантных свойств модельных аналогов 95 тирозина - ГБ и ГК кислот

4.4 Расчеты молекулярных и электронных дескрипторов 102 антиоксидантных свойств ГБ и ГК кислот

4.5 Разработка стратегии скрининга пептидов с высокой АОЕ 126

4.6 Характеристика композиций с различными пептидными профилями 129

4.7 Характеристика антиоксидантных свойств композиций с различными 140 пептидными профилями in vivo

5. Выводы 145

6. Список литературы 147 Приложение А 160 Приложение Б 167 Приложение В 171

Список сокращений

АБТС - 2,2'-азинобис-(3-этил-бензотиазолинсульфонат);

а.о. - аминокислотный остаток;

АОЗ - система антиоксидантной защиты;

АОЕ - антиоксидантная емкость;

АФК - активные формы кислорода;

ВЗМО - высшая заполненная молекулярная орбиталь;

ВК - ванилиновая кислота;

ГалК - галловая кислота;

ГБ - гидроксибензойные кислоты;

ГК - гидроксикоричные кислоты;

ДАВ - донирование атома водорода;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота;

ДФПГ - дифенил-пикрилгидразил радикал;

ДЭ - донирование электрона;

КК - п-кумаровая кислота;

М.в. - молекулярный вес;

МДА - малоновый диальдегид;

МС/МС - тандемная масс-спектрометрия;

НВМО - низшая вакантная молекулярная орбиталь;

ОВП - окислительно-восстановительный потенциал;

п-ГБК - п-гидроксибензойная кислота;

ПДДЭ - последовательное депротонирование с донированием электрона;

ПДЭД - последовательное донирование электрона с депротонированием;

ПИ - потенциал ионизации;

РНК - рибонуклеиновая кислота;

СинК - синаповая кислота;

СирК - сиреневая кислота;

СП - сродство к протону;

США - Соединенные Штаты Америки;

ТБК - 2-тиобарбитуровая кислота;

ТЭ - эквиваленты тролокса;

ТЭП - 1,1,3,3- тетраэтоксипропан;

ФК - феруловая кислота;

ФМП - функциональный мясной протеин;

ФСБ - фосфатно-солевой буфер;

ЭГТА - этиленгликоль-бис(2-аминоэтиловый эфир)- ]Ч,М,М',М'-тетрауксусная кислота;

ЭДС - энтальпия диссоциации связи;

ЭДТА - этилендиаминтетрауксусная кислота;

Э Д П- энтальпия диссоциации протона;

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс;

ЭПЭ - энтальпия переноса электрона;

Ас - ацетильный остаток;

АиС - площадь под кинетической кривой;

ВЗЬУР - тройной гибридный функционал Ли-Янга-Парра;

ЬС-М8/М8 - жидкостная хроматография с тандемной масс-спектрометрией;

пе!АиС- приведенная площадь под кинетической кривой;

О ЛАС - метод анализа антиоксидантной емкости по отношению к пероксильному радикалу;

рК - показатель константы диссоциации;

ИР-НРЬС-Е81-РТ-1С11-М8 - обращено-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография с электроспрей ионизацией и масс-спектрометрией ионно-циклотронного резонанса с преобразованием Фурье; 8е - электрофильное замещение;

ТЕАС - антиоксидантная емкость по отношению к катион-радикалу АБТС.

1. Введение

Оксидативный стресс является одной из универсальных форм ответа организма на воздействие неблагоприятных экзогенных и эндогенных факторов и играет существенную роль в патогенезе воспалительно-дистрофических, нейродегенеративных, сердечнососудистых и онкологических заболеваний и ускорении процессов старения живых организмов [1-3]. Оксидативный стресс сопряжен с избыточной продукцией активных форм кислорода (АФК). Основная роль в защите биомолекул от действия АФК принадлежит экзогенным и эндогенным антиоксидантам [4].

Основными классами природных антиоксидантов являются каротиноиды, тиолы, фенольные соединения и пептиды. В литературе описаны последовательности более 100 антиоксидантных пептидов, выделенных из различных источников, а также полученных при конверсии белков с использованием ферментов и / или микроорганизмов [5,6]. Наличие остатков редокс-активных аминокислот (Туг, Тгр, Met, Cys, His) является важным структурным дескриптором антиоксидантных пептидов [6,7]. Однако механизмы их антиоксидантного действия остаются недостаточно изученными.

Для разработки обоснованной стратегии поиска перспективных пептидных антиоксидантов необходимо исследование механизмов их взаимодействия с АФК и модельными свободными радикалами. Несмотря на различия в химической структуре антиоксидантов, ключевыми механизмами их взаимодействия с АФК являются донирование атома водорода (ДАВ) или донирование электрона (ДЭ). Тем не менее, антиоксидантные эффекты большинства соединений реализуются по смешанному механизму: последовательное донирование электрона с депротонированием (ПДЭД) или последовательное депротонирование с донированием электрона (ПДДЭ) [8,9]. Образующиеся интермедиаты зачастую могут вступать во взаимодействие друг с другом и /или во вторичные реакции со свободными радикалами, что вносит вклад в

наблюдаемый антиоксидантный эффект и создает дополнительные сложности при анализе экспериментальных данных.

Расчетные квантово-химические методы являются эффективным инструментом для изучения механизмов взаимодействия антиоксидантов со свободными радикалами и позволяют выявить молекулярные (структурные) и электронные дескрипторы, определяющие антиоксидантные свойства различных классов соединений. Благодаря применению полуэмпирических расчетных методов, в последнее время были выявлены структурные особенности флаваноидов, обуславливающие их антиоксидантные свойства, включая степень планарности молекулы, взаимное расположение фенольных гидроксильных групп, стабилизационные эффекты за счет делокализации неспаренного электрона при образовании феноксильных радикалов [9-11]. Однако, работы такого рода для пептидов отсутствуют, что обуславливает актуальность соответствующих структурно-функциональных исследований.

При структурно-функциональном подходе параллельно с расчетом молекулярных и электронных дескрипторов необходимым этапом является характеристика антиоксидантных свойств пептидов in vitro. В настоящее время описано более 40 различных методов для тестирования антиоксидантов in vitro [12,13]. Их классификация базируется на ключевом механизме взаимодействия различных радикалов с тестируемыми антиоксид антами. Широко используемыми для характеристики природных антиоксидантов in vitro, являются методы, основанные на гашении катион-радикала АБТС (2,2'-азино-бис-(3-этил-бензтиазолин-6-сульфонат) (Trolox Equivalent Antioxidant Capacity - ТЕАС) и пероксильного радикала (Oxygen Radical Absorbance Capacity - ORAC). Данные методы позволяют проводить количественную характеристику антиоксидантных свойств соединений с различными физико-химическими свойствами и характеризуются высокой воспроизводимостью и надежностью. В то же время, эти методы тестирования антиоксидантов in vitro не позволяют провести интегральной оценки эффективности антиоксидантов в живых системах, поскольку они не учитывают целый ряд факторов, включая биодоступность, распределение и метаболизм антиоксидантов, а также их взаимодействие с системой антиоксидантной защиты [14]. Для объективной

характеристики антиоксидантов необходима верификация их антиоксидантных эффектов in vivo.

Таким образом, вышесказанное свидетельствует об актуальности структурно-функциональных исследований пептидных антиоксидантов для оценки их эффективности и создании стратегии скрининга антиоксидантных пептидов с использованием эмпирических и квантово-химических дескрипторов.

Целью настоящей работы был структурно-функциональный анализ и исследование механизмов антиоксидантного действия пептидов в системах с различными типами радикалов.

В диссертационной работе были поставлены следующие задачи:

2. Исследование геометрии молекул и электронных дескрипторов редокс-активных аминокислот, метионин- и тирозин- содержащих дипептидов и ароматических гидроксикислот полуэмпирическими методами;

5. Разработка стратегии скрининга антиоксидантных пептидов с использованием набора дескрипторов;

6. Исследование влияния пептидных композиций на антиоксидантный статус in vivo.

2. Литературный обзор

Воздействие неблагоприятных экзогенных и эндогенных факторов приводит к избыточной генерации активных форм кислорода (АФК) как на уровне клетки, так и целого организма Условием поддержания нормального функционирования организма человека является баланс между генерацией АФК и способностью системы антиоксидантной защиты (АОЗ) эффективно блокировать их негативное воздействие. При недостаточности последней развивается патологический процесс, называемый оксидативным стрессом, сопровождающийся окислением белков, ненасыщенных жирных кислот и азотистых оснований ДНК и РНК [14, 15]. Коррекция антиоксидантного статуса организма человека может быть проведена как напрямую путем введения экзогенных антиоксидантов, так и опосредованно за счет стимуляции собственных защитных систем организма, нормализации микроциркуляции и тканевого метаболизма.

Антиоксиданты - это вещества, эффективно блокирующие процесс окисления молекул-мишеней (липиды, белки, нуклеиновые кислоты, и др.). При этом диапазон концентраций тестируемого соединения, в котором проявляется антиоксидантный эффект, должен быть сопоставим с концентрацией молекул-мишеней [4,12,13]. В норме 95-98% кислорода, потребляемого организмом человека, расходуется на окислительный катаболизм, в то время как 2-5% вступает в побочные реакции, приводящие к образованию активных форм кислорода, таких как супероксид антион-радикал (02"-)> пероксильный радикал (ROO-), гидроксильный радикал (ОН-), пероксонитрит (ONOO"), гипохлорит (СЮ") и др. В защите биомолекул от повреждающего действия АФК существенную роль играют ферменты системы АОЗ (супероксиддисмутаза, каталаза, глутатионпероксидаза и др.), экзогенные и эндогенные неферментативные антиоксиданты. К числу последних принадлежат пептиды и белки. Так, относительный вклад сывороточного альбумина в антиоксидантную емкость плазмы крови человека составляет от 7,3 до 31,5% в зависимости от метода анализа [16]. Кроме того, в антиоксидантную емкость биологических жидкостей существенный вклад вносят свободные аминокислоты и пептиды [16,17]. Таким образом, антиоксиданты пептидной природы играют существенную роль в поддержании антиоксидантного статуса живых систем.

2.1 Методы анализа антиоксидантных свойств пептидов

Для создания рациональных стратегий применения пептидных антиоксидантов необходима разработка и стандартизация комплекса методических подходов, позволяющих проводить эффективный скрининг антиоксидантных свойств пептидов и их композиций in vitro с последующей верификацией in vivo.

Для индивидуальных антиоксидантов мерой количественной оценки антиоксидантных свойств зачастую является антиоксидантная активность, выражаемая константой скорости взаимодействия исследуемого соединения с различными АФК или синтетическими радикалами. Для многокомпонентных смесей, к которым относятся пептидные композиции, возникают значительные трудности при работе в кинетическом режиме:

- сложный характер кинетики взаимодействия с АФК и модельными радикалами, не позволяющий точно определить константы скорости реакции [18,19];

отсутствие выраженных фаз (лаг-период, фазы конкурентного и неконкурентного взаимодействия с модельным радикалом в случае конкурентных методов анализа АОЕ) в кинетике взаимодействия многокомпонентных смесей с АФК и модельными радикалами [12,18];

- наличие эффектов синергизма и антагонизма между веществами, входящими в состав многокомпонентных смесей [13].

Поэтому более целесообразно при характеристике антиоксидантных свойств пептидных композиций оперировать понятием антиоксидантной емкости (АОЕ), обычно выражаемой числом эквивалентов стандарта на единицу массы или объема пробы [12,13,18]. В качестве стандарта в международной практике используется водорастворимый аналог витамина Е - тролокс (6-гидрокси-2,5,7,8-тетраметилхроман-2-карбоновая кислота). В ряде случаев, хотя и достаточно редко, в качестве стандартов используют аскорбиновую и галловую кислоты. Выражение АОЕ в стандартизованных единицах необходимо для сравнения антиоксидантных свойств различных соединений и композиций, а также для сопоставления результатов, полученных различными исследовательскими группами [19].

Анализ литературных данных показывает большое разнообразие методических подходов как in vitro, так и in vivo, используемых при исследовании антиоксидантных свойств различных объектов [18]. В целях стандартизации подходов для анализа

антиоксидантных свойств была предложена классификация соответствующих методов [19], основанная на механизме химической реакции, протекающей между антиоксидантом и АФК или модельными органическими радикалами [13,18]:

• методы, реализующие механизм переноса электрона (ПЭ);

• методы, реализующие механизм донирования атома водорода (ДАВ);

• методы, сочетающие оба механизма, причем доминирующий механизм реакции

зависит от условий анализа.

В ряде работ, основой классификации методов тестирования антиоксидантов является тип используемой детекции протекающей реакции [18,19]. Универсальным прямым методом регистрации свободных радикалов является спектроскопия �

Информация о работе

Николаев, Илья Владимирович
кандидата химических наук
Москва, 2012
ВАК 03.01.04

Диссертация

Изучение механизмов антиоксидантного действия пептидов и их композиций - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему Изучение механизмов антиоксидантного действия пептидов и их композиций ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Изучение механизмов антиоксидантного действия пептидов и их композиций"

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата химических наук, Николаев, Илья Владимирович, Москва

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Изучение механизмов антиоксидантного действия пептидов и их композиций
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия