Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Антиоксидантные и антирадикальные свойства эфирных масел in vivo и in vitro

ВАК РФ 03.01.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Антиоксидантные и антирадикальные свойства эфирных масел in vivo и in vitro"

На правах рукописи

АЛИНКИНА Екатерина Сергеевна

АНТИОКСИДАНТНЫЕ И АНТИРАДИКАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЭФИРНЫХ МАСЕЛ IN VIVO И IN VITRO

специальность 03.01.02 - Биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 9 СЕН 2013

МОСКВА-2013

005533078

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

Научные руководители: доктор химических наук

Мишарина Тамара Арсеньевна, кандидат биологических наук Фаткуллина Людмила Дмитриевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук

Дудник Людмила Борисовна,

ведущий научный сотрудник Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук

доктор биологических наук Веселова Татьяна Владимировна,

старший научный сотрудник кафедры биофизики Биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное

учреждение науки Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук

Защита состоится «16» октября 2013 г. в 12 — часов на заседании диссертационного совета Д 002.039.01 при ФГУБН Институте биохимической физики им. Н.М. Эмануэля Российской академии наук по адресу: 119334, Москва, ул Косыгина, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУБН Института химической физики им. Н.Н.Семенова РАН

Автореферат разослан « 10 » сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета Д 002.039.01

кандидат химических наук

^¿.¿¿с,^ Мазалецкая Л.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одной из острейших проблем настоящего времени является возрастающее негативное действие вредных факторов окружающей среды, которое приводит к развитию патологических состояний, «омоложению» многих заболеваний, ускорению старения. Большая роль в развитии таких процессов принадлежит активным свободным радикалам, которые есть везде и всегда и их роль в организме чрезвычайно высока. В 50-е годы прошлого столетия была предложена теория свободнорадикального старения, получившая признание и развитие в многочисленных работах зарубежных и отечественных исследователей, в первую очередь Н.М. Эмануэля и его школы [Эмануэль Н.М., 1975]. Эта теория до настоящего времени считается одной из самых перспективных, объясняющей механизмы старения и связанных с ним патологических процессов. Согласно этой теории старение организма вызвано ростом молекулярных повреждений, вызываемых свободными радикалами, а также нарушением функции системы антиоксидантной защиты организма [Бурлакова Е.Б., 2007]. С участием свободных радикалов осуществляется огромное число нужных организму химических превращений, но при их избытке происходит нарушение жизненно необходимых процессов и разрушение важных связей и структур. Радикалы могут изменять свойства биологических мембран, их проницаемость, структуру, влиять на функциональное состояние клеток и поддержание гомеостаза организма в целом. В основе этих нарушений лежат процессы окислительной модификации белков и ДНК, а также переписного окисления липидов (ПОЛ), которые носят каскадный характер.

Управление окислительно-восстановительными реакциями в организме осуществляется системой антиоксидантной защиты, включающей ферменты, витамины, пептиды и другие эндогенные антиоксиданты. Благодаря таким системам в здоровом организме подавляющее большинство «излишних» свободных радикалов нейтрализуется еще до того, как они успеют повредить те или иные компоненты клетки. Так, из каждого миллиона образующихся супероксидных радикалов от ферментной защиты ускользает не более четырех [Анисимов В.Н., 2003]. Избыточное образование радикалов и снижение активности защитных антиоксидантных систем способствует развитию окислительного стресса. Решением проблемы может быть употребление эффективных и безопасных дополнительных экзогенных антиоксидантов (АО) [Эмануэль Н.М., 1975]. Интересным и перспективным классом природных биологически активных соединений являются эфирные масла (ЭМ) пряно-ароматических растений, употребляемых в пищу. Их безопасность и полезные для здоровья свойства были известны еще с древних времен. В ряде работ было показано, что многие масла содержат АО и способны ингибировать окислительные процессы в модельных системах [КогосЬ А.Я. е1 а1., 2007; МаГГе1 М.Е. е1 а1., 2011; ЯиЬеЛо й. е1 а!., 2000]. Однако выявление реальной антиоксидантной эффективности эфирных масел на основе обобщения имеющихся литературных данных является сложной задачей,

так как это свойство зависит от состава модельных систем, от природы субстрата и метода определения. Проведенная в научных кругах в начале 21 века дискуссия не решила проблему стандартизации методов определения АО свойств веществ, но рекомендовано проводить оценку их антиоксидантной эффективности в одних и тех же условиях и несколькими методами [Frankel E.N. et al., 2008; Antolovich M. et al., 2002]. Поэтому экспериментальное изучение современными методами АО свойств эфирных масел и механизма их действия в модельных системах является актуальной задачей. Крайне важным вопросом является экспериментальная оценка влияния приема эфирных масел на биохимические процессы, протекающие в живых организмах. Таких исследований крайне мало, но только они могут выявить наличие биологической активности у препаратов и их реального влияния на организм. Более того, комплексное изучение свойств эфирных масел в модельных системах и живых организмах позволит выявить связи между составом масел, их антиоксидантными и антирадикальными свойствами, способностью проявлять биологическую активность, оказывать влияние на биохимические процессы в живых организмах, изучить возможные механизмы реализации биологического действия ЭМ, что представляет значительный научно-практический интерес.

Целью исследования являлось изучение антиоксидантных и антирадикальных свойств эфирных масел в модельных системах, определение влияния регулярного длительного приема малых доз эфирных масел на биохимические показатели мышей линии Balb/c и на их иммунитет, а также изучение биоантиоксидантного действия эфирных масел.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1. Определение кинетических параметров реакции компонентов эфирных масел со свободным стабильным радикалом - дифенилпикрилгидразилом.

2. Изучение механизма антирадикального действия эфирного масла и его отдельных компонентов.

3. Сравнение АО свойств композиций ЭМ различного состава в модельных реакциях ингибирования:

• автоокисления природных полиненасыщенных ЖК;

• автоокисления гексаналя;

• обесцвечивания ß-каротина в системе автоокисления метиллинолеата;

• образования диеновых конъюгатов.

4. Исследование цитотоксичности эфирного масла орегано на культуре трансформированных клеток почки китайского хомячка линии B11-dü FAF28.

5. Изучение влияния эфирных масел при их длительном систематическом приеме в малых дозах мышами линии Balb/c in vivo на следующие параметры:

• степень спонтанного гемолиза эритроцитов;

• микровязкость липидов мембран эритроцитов;

• интенсивность ПОЛ в эритроцитах и клетках печени и мозга;

• состав жирных кислот (ЖК) в печени и мозге;

• активность антиоксидантных ферментов в печени;

• иммунную реактивность и устойчивость мышей к воздействию ионизирующей радиации.

Научная новизна. Впервые в экспериментах in vivo получены данные о действии систематического приема малых доз эфирных масел гвоздики, орегано и смеси масла лимона и экстракта имбиря на биохимические показатели в тканях и органах мышей линии Balb/c. Установлено, что ЭМ действовали как эффективные биоантиоксиданты: их прием увеличивал устойчивость мембран эритроцитов к гемолизу, снижал интенсивность ПОЛ в мембранах эритроцитов и в тканях печени и мозга мышей, увеличивал активность эндогенных антиоксидантных ферментов в печени мышей. Впервые установлено, что изученные эфирные масла увеличивали устойчивость липидов печени и мозга мышей к окислению. Приоритетными являются исследования, проведенные в области изучения иммуностимулирующих и радиопротекторных свойств ЭМ в экспериментах in vivo. Установлено, что изученные ЭМ незначительно влияли на иммунокомпетентные органы интактных мышей, но проявляли себя как эффективные иммуномодуляторы, поддерживающие иммунный статус мышей при повреждающем действии ионизирующей радиации.

Практическое значение работы. В результате исследований установлены зависимости между содержанием отдельных компонентов эфирных масел и их антирадикальным и антиоксидантным действием, эти данные могут быть основой для получения композиций с заранее заданными свойствами. Выявлена прямая корреляция между антирадикальными свойствами ЭМ в модельных экспериментах и их влиянием на биохимические показатели органов мышей, принимавших малые дозы ЭМ. Установлено, что максимальной эффективностью в качестве радиопротектора и активатора ферментного звена антиоксидантной защиты обладало эфирное масло гвоздики, содержавшее около 78% эвгенола. Самым эффективным ингибитором перекисного окисления липидов в тканях печени и мозга являлась композиция, содержавшая экстракт имбиря. Проведенное исследование не выявило токсического действия ЭМ при их систематическом приеме в малых дозах с питьевой водой в течение 6 месяцев, это подтверждает безопасность выбранных доз ЭМ и позволяет рассматривать ЭМ, как новый класс перспективных биоантиоксидантов. Данные, полученные при изучении in vivo и in vitro свойств индивидуальных эфирных масел и их композиций различного состава, могут быть использованы при разработке специальных пищевых добавок для профилактики различных патологий, вызываемых окислительным стрессом или вредным воздействием свободных радикалов, а также для увеличения продолжительности жизни. При вдыхании, при нанесении на кожу или при употреблении с водой или едой компоненты эфирных масел попадают в кровь и во внутренние органы, где и проявляют свое благотворное действие, поэтому

результаты исследований могут стать научной базой такого эмпирического направления народной медицины как ароматерапия.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Эфирные масла и экстракт имбиря, содержащие фенолы, обладали высокой антирадикальной эффективностью в модельной реакции со свободным радикалом.

2. Прием малых доз эфирных масел снижал интенсивность ПОЛ в органах и тканях мышей и увеличивал активность антиоксидантных ферментов печени.

3. Биоантиоксидантные свойства исследуемых ЭМ in vivo и их антирадикальная эффективность в модельных системах зависели от состава ЭМ.

4. Прием мышами эфирных масел в малых дозах существенно снижал повреждающее действие ионизирующего излучения на иммунную систему.

Апробация работы. Результаты и основные положения диссертации доложены и обсуждены на VIII Международной конференции «Биоантиоксидант» (Москва. 2010); X и XI Международных ежегодных молодежных конференциях ИБХФ РАН -ВУЗы «Биохимическая физика» (Москва. 2010, 2011); Int. Conference "Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine". S.Petersburg. 2011); Международной научно-практической конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва. 2012); VI Международном конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (С-Петербург. 2012); VIII Международном симпозиуме «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва. 2012); Международной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул. 2012); Всероссийской научно-практической конференции «Биотехнология растительного сырья, качество и безопасность продуктов питания» (Иркутск. 2012).

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена в ИБХФ РАН рамках планов научно-исследовательских работ Института по теме «Природные и синтетические антиоксиданты. Синтез, кинетические характеристики, механизм действия в системах различной степени сложности, синергизм, специфическая активность, прикладные проблемы. Изучение антиоксидантной активности эфирных масел и ароматизаторов», и при финансовой поддержке ОХНМ Президиума РАН в 2009-2011 гг. «Исследование биологической активности эфирных масел пряно-ароматических растений» и в 2012-2013 гг. «Исследование антирадикальных и антиоксидантных свойств натуральных эфирных масел и экстрактов пряно-ароматических растений, обладающих физиологической активностью».

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 работ, 13 статей в журналах и в сборниках научных трудов (из них 8 в изданиях, рекомендованных ВАК), 16 тезисов докладов в сборниках материалов конференций. Получен патент на изобретение № 2475258 от 20.02.13.

Личный вклад автора. Представленные в диссертации экспериментальные данные получены либо лично автором, либо при его непосредственном участии на всех этапах исследований, включая планирование и проведение эксперимента, обработку, оформление и публикацию результатов. Обсуждение, обобщение и интерпретация некоторых экспериментальных данных, формулировка основных положений диссертации, составляющих ее новизну и практическую значимость, проведены в соавторстве с руководителями работы.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 148 страницах печатного текста, содержит 31 рисунок и 15 таблиц. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 210 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Объектами исследования являлись эфирные масла компаний Plant Lipids (Индия) и Lionel Kitchen (Англия), полученные из следующих растений: тмина (Carum carvi L.), кардамона (Elettaria cardamomum L.J, кориандра (Coriandrum sativum L.J, гвоздики (Caryophyllus aromaticus L.J, душистого перца (Pimenta officinalis L.J, корицы (Cinnamomum veru J.PreslJ, лимона (Citrus limon L.J, черного перца (Piper nigrum L.J, мускатного ореха (Myristica fragrans L.J, имбиря (Zingiber officinale RJ, тимьяна (Thymus vulgaris L.J, чабера (Satureja hortensis L.J, орегано (Origanum vulgare L.), экстракт имбиря, а также ионол ( Sigma-Aldrich, Германия).

Газохроматографнческий анализ (ГЖХ) образцов эфирных масел и метиловых эфиров жирных кислот (МЭЖК), выделенных из печени и мозга мышей осуществляли на хроматографе Кристалл 2000 M (ЗАО СКВ "Хроматэк", Россия) в режиме программирования температуры анализа. Для определения содержания компонентов использовали площади ГХ пиков.

Антирадикальную активность (АРА) по реакции обесцвечивания свободного 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил радикала (ДФПГ) определяли спектрофотометрически на спектрофотометре СФ-2000 (ЗАО «ОКБ Спектр»), >.= 515 нм. Исходная концентрация ДФПГ во всех реакционных смесях составляла 1x10 M (39,4 мкг/мл), концентрации субстратов варьировали в пределах от 1 до 20 000 мкг/мл. В качестве стандарта использовали ионол. Кинетику убыли оптической плотности регистрировали при 25°С каждые 5 мин в течение 2 часов. АРА оценивали по величинам ЕС50, ТЕС50 и АЕ - антирадикальной эффективности, которая рассчитывается по формуле: АЕ = 1/(ЕС50 х ТЕС50 ).

Оценку АО свойств ЭМ по степени ингибированин обесцвечивания ß-каротина проводили по методу Марко в модификации Миллера [Marco G.J., 1968; Miller Н.Е., 1971]. Изменение оптической плотности образцов регистрировали на СФ-2000 (ЗАО "ОКБ Спектр", Россия) при 470 нм. Степень ингибирования выражали в %.

Оценку АО свойств ЭМ по степени ингибирования образования диеновых конъюгатов в модельной системе автоокисления метиллинолеата проводили спектрофотометрически по появлению пика поглощения в ультрафиолетовой области спектра при Х = 230-235 нм [ Ruberto G. et al., 2000; Pryor W. A.,et al., 1993].

Исследование биоантиоксидантных свойств эфирных масел in vivo проводили на самках мышей линии Balb/c (питомник Столбовая, масса 18-20 г, возраст 2 мес). Мышей содержали на общевиварном рационе (рецепт ПК120 ООО "Лабораторкорм", Москва) при 20-22°С и естественном освещении. Контрольная группа мышей (37 шт) получала обычную питьевую воду, мыши трех опытных групп (по 37 шт) получали питьевую воду с добавлением по 150 нг/мл эфирных масел орегано, гвоздики или смеси ЭМ лимона и экстракта имбиря (1:1).Через 6 месяцев эксперимента проводили забор крови, печени и головного мозга мышей.

Определение содержания ТБК-активных продуктов в эритроцитах и гомогенатах тканей печени и головного мозга проводили спектрофотометрически согласно методу [ Mihara M., et al., 1978].

Устойчивость эритроцитов к спонтанному гемолизу изучали по методу Ягера [Jager F.C.,1968], основанном на фотометрическом определении (Х=540 нм) внеэритроцитарного гемоглобина, поступающего в среду вследствие спонтанного лизиса мембран эритроцитов, индуцированного окислением липидов кислородом воздуха. [Строев Е. А. и др., 1986].

Микровязкость липидов в мембранах эритроцитов определяли методом ЭПР-спектроскопии на спектрометре ER-200D SRC (Bruker, Германия). В качестве зондов использовали стабильные иминоксильные радикалы: 2,2,6,6-тетраметил-4-каприлоилоксилпиперидин-1-оксил (зонд 1) и 5,6-бензо-2,2,6,6-тетраметил-1,2,3,4-тетрагидро-у-карболин-3-оксил (зонд 2). По формуле для быстро вращающихся зондов определяли время вращательной корреляции, характеризующее микровязкость [Бурлакова Е.Б., Голощапов А.Н., 1986] .

Активности антиоксидантных ферментов в печени мышей определяли спектрофотометрически:

Активность супероксиддисмутазы (СОД) - по ингибированию реакции восстановления нитросинего тетразолия супероксидными радикалами, генерируемыми ксантиоксидазой в реакции окисления ксантина (Niashikimi et al. 1972; Fridovich I., 1974; Oberley L.W et al., 1985];

Активность глутатионпероксидазы (ГП) - по методу Mille в модификации Мальцева [Mille G., 1959; МальцевГ.Ю., 2002] по окислению восстановленного никотинамидадениндинуклеотидфосфата в сопряженной глутатионредуктазной реакции с использованием в качестве субстрата гидропероксида трет-бутила; Активность глутатион-5-трансФеразы (ГТ) - по скорости образования глутатион- S-конъюгатов между глутатионом и 1-хлор-2,4-динитробензолом [Habig W.H. et al., 1974; Смирнова, Е. Ю., 2011].

Оценку состояния иммунной системы проводили по числу живых ядросодержащих клеток в гомогенате тимуса и селезенки (клеточность) и по количеству антителообразуюших клеток (АОК) в селезенке по методу Каннингема [Лефковитс И.и др., 1981; Смирнова O.A., 1996].

Цитотокснчность эфирного масла орегано (ЭМО) определяли на культуре трансформированных клеток почки китайского хомячка линии Bll-dü FAF28 (Медико-генетический научный центр РАМН, Москва). К клеткам 3-4-дневного "возраста" с плотностью около 100 тыс. кл./см2 добавляли спиртовой раствор ЭМО до концентрации в среде 10"'5-10"3М. Флаконы термостатировали 4 сут при 37°С и подсчитывали количество клеток с помощью камер Горяева.

Статистическую обработку всех полученных результатов производили с помощью программ Microsoft Excel 2007 и SigmaPlot 11.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Изучение антиоксидантных и антирадикальных свойств эфирных масел в модельных системах

Анализ литературных данных показал, что антиоксидантные свойства веществ и их смесей существенно зависят от состава модельных систем, от природы субстрата, метода и условий проведения эксперимента. В случае эфирных масел имеющиеся данные часто противоречивы, их сложно обобщить и систематизировать. Это во многом связано с многокомпонентностью эфирных масел. Поэтому с целью сравнения различных ЭМ нами проведена оценка их АО свойств в различных модельных экспериментах in vitro в одних и тех же условиях и на основе полученных данных выбраны масла для дальнейших исследований in vivo.

Известно, что радикальные процессы играют важнейшую роль в живых организмах, поэтому было важно оценить именно антирадикальные свойства ЭМ. Для этого мы выбрали реакцию со свободным стабильным ДФПГ, изучили кинетические параметры реакции, механизм действия отдельных компонентов и провели сравнительную оценку АР свойств 13 ЭМ, экстракта имбиря и синтетического антиоксиданта - ионола. Важной задачей являлось установление связи между составом ЭМ и их АР свойствами. Для каждого препарата были получены кинетические кривые реакции с ДФПГ (концентрация 100 мкМ) с различными ЭМ при их концентрации в реакционной смеси от 1 мкг/мл до 20 мг/ мл. Степень прохождения реакции определяли по уменьшению концентрации ДФПГ. Реакция имела две стадии: первую - быструю, отражавшую взаимодействие самых активных антирадикальных компонентов ЭМ с радикалом, и вторую медленную, свидетельствующую о наличии в субстрате компонентов с низкой АРА. Вторая стадия реакции для ЭМ продолжалась до 5 суток, для ионола она заканчивалась через 5 часов. Наличие длительного антирадикального действия, которое характерно для многих сложных по составу природных экстрактов, является, с нашей точки зрения,

огромным достоинством таких препаратов. Обработка кинетических кривых при различных концентрациях ЭМ в модельных системах позволила нам получить следующие характеристики (табл. I), которые отражают их АР свойства:

1. Величина ЕС50, эквивалентна количеству ЭМ, восстанавливающего половину концентрации радикала.

2. ТЕС50. - время восстановления половины концентрации радикала.

3. АЕ, л/(г*сек) антирадикальная эффективность, объединяющая время восстановления половины концентрации радикала ТЕС50 и требуемую для этого концентрацию ЭМ ЕС50. Величина антирадикальной эффективности (АЕ) рассчитывается по формуле:

АЕ = 1/ (ЕС50 х ТЕС50 )

Таблица I. Характеристики ЭМ, отражающие их АРА, а также величины начальных скоростей, констант скоростей (К) первой стадии реакции поДФПГ и при концентрации ЭМ, близкой к концентрации ДФПГ

Эфирное масло ЕС 50, мкг/мл ТЕС50, сек АЕ, л/(гсек) Конц-я комп-в с высокой АРА, % Конец первой фазы, сек Начальная скорость реакции, нМ/с К, с-' £о,мкМ

Гвоздика 12 1148 5,22 х 10"1 58,5 905 289,8 3040 96,6

Экстракт имбиря 20 750 7,26 х 10"2 51,6 835 147,1 1670 88,1

Душистый перец 20 957 6,67 х 10"2 39,9 835 232,9 2480 93,9

Ионол 20 1683 2,97 х 10_i 75,7 2428 178,5 1880 94,9

Лимон+ экстракт имбиря 20+ 20 887 2,82 х 10"2 22,2 887 181,6 2027 89,6

Орегано 300 1080 3,09 х 10"3 3,4 926 50,7 1010 50,2

Тимьян 300 1320 2,53 х 10"J 3,1 903 45,8 970 47,2

Чабер 300 1380 2,42 х 10"J 3,1 973 35,1 640 54,8

Мускатны й орех 500 893 2,24 х 10"3 2,2 1229 37 670 55,2

Кардамон 1000 1210 8,26 х 10"4 0,7 943 27,8 1750 15,9

Имбирь 2000 1200 4,17 x 10'4 0,5 851 16,7 1970 8,5

Корица 5000 1414 1,41 x Ю-4 0,2 1212 10,4 1870 5,6

Лимон 15000 696 9,58 x 10° 0,09 1357 6,1 1670 3,6

Черный перец 20000 776 6,44 x 10-3 0,04 816 3,8 2230 1,7

Тмин 20000 1990 2,51 x 10° 0,03 987 3,7 2710 1,4

Кориандр 20000 2219 2,25 x 10° 0,02 1339 3,8 4440 0,9

Примечание:

- Величины R2 для всех изученных образцов лежали в интервале от 0,8589 до 0,9999

- При расчете концентрации компонентов ЭМ, средняя ММ веществ принята за 150 г/моль

- Расчет с,о проведен для систем с концентрацией ЭМ 200 мкг/мл

Из кинетических кривых также были рассчитаны: содержание в эфирном масле наиболее активных антирадикальных компонентов, стехиометрия реакции, скорость и константа скорости реакции начальной стадии восстановления радикала, параметр характеризующий АРА препарата по величине его предельной концентрации, способной восстановить i^o количество радикала (табл. 1).

Для описания кинетики первой стадии реакции радикала с компонентами ЭМ наряду с величинами скорости реакции по ДФПГ мы рассчитали константу скорости этой стадии реакции по методу, приведенному в работе [Bondet V. et.al, 1997]. Согласно этому методу, общий порядок реакции ( п ,■ + п к) рассчитывается по уравнению 1: n¡ + пл - С0 дфпг/£о , (1)

где п ¡ - порядок реакции по ингибитору, п к - порядок реакции по радикалу и - показатель, отражающий зависимость скорости реакции от концентрации восстановленного ДФПГ.

Общий порядок реакции (п, + nR) определяли по графику зависимости скорости реакции от концентрации восстановленного радикала (рис.1), величина является точкой пересечения касательной с осью абсцисс и равна той предельной концентрации, до которой исследуемое ЭМ способно восстановить ДФПГ, так как скорость реакции в этой точке равна 0.

180 -.--

о

0 10 20 30 40 50 60 70

з

Концентрация восстановленного ДФПГ, 1*10 нМ

Рис. I. Зависимость скорости реакции от концентрации восстановленного

ДФПГ

На рис. 2 показано, что между полученными величинами и АЕ (табл. 1.) существует линейная корреляция. Поэтому мы предлагаем использовать параметр ¡;0 в качестве альтернативного для количественной характеристики реальной антирадикальной эффективности изучаемых препаратов.

По величинам АЕ и ^о все изученные ЭМ можно разделить на четыре группы:

•с очень высокой АРА - ЭМ гвоздики и душистого перца, ионол, экстракт имбиря;

•с высокой АРА - ЭМ орегано, тимьяна, чабера, мускатного ореха; •со средней АРА - ЭМ кардамона, имбиря, корицы; •с низкой АРА - ЭМ лимона, черного перца, кориандра, тмина. Следует отметить, что величина АЕ для экстракта имбиря, ЭМ душистого перца и гвоздики была в 2 раза выше, чем для синтетического АО - ионола.

мкМ

Рис.2 . Корреляция между значениями АЕ и с0

Для таких сложных систем, как ЭМ и экстракты растительного сырья, имеющих многокомпонентный состав, мольное соотношение концентраций радикала и антиоксидантов, участвующих в реакции, определить невозможно. Для сравнения свойств многокомпонентных смесей антиоксидантов мы использовали величины, которые рассчитываются в эквивалентах радикала, концентрация которого определяется точно. В табл. 1 приведены полученные эквивалентные концентрации самых активных антирадикальных соединений в изученных ЭМ и их концентрация в масле. Расчет показал, что содержание таких активных соединений может составлять от десятых долей процента до 76% для ионола. Так, в эфирном масле имбиря содержится около 0,5 % соединений с антирадикальными свойствами, в экстракте имбиря - 51,6 %. За АРА ЭМ гвоздики и душистого перца отвечает эвгенол, его содержание в ЭМ гвоздики составляет около 80%, в ЭМ душистого перца - в 2 раза меньше. Полученные нами данные по содержанию активных компонентов в этих маслах составляют 58% и 40%, это означает, что мы видим синергетическое взаимодействие эвгенола и других компонентов в ЭМ душистого перца.

Анализ полученных данных показал, что механизм реакции компонентов ЭМ с радикалом был сложным. Найденные величины общего порядка реакции

свидетельствовали о том, что для всех ЭМ реакция не была стехиометрической. Это связано с тем, что в ЭМ и экстрактах растений присутствует несколько АО с различающейся активностью. Кроме того, одна молекула АО может иметь более, чем один элиминируемый атом водорода. В таких системах протекает не одна, а несколько реакций, в которых также могут принимать участие и образующиеся продукты [Вопс1е1 V. е1. а1, 1997]. Кроме того, многие из этих реакций являются обратимыми, поэтому в такой комплексной смеси как ЭМ равновесие подобных реакций может смещаться как в одну, так и в другую сторону. Возможно, это и обусловливает их пролонгированное действие и в некоторых случаях обеспечивает им более высокую АРА по сравнению с ионолом.

Установлены связи между содержанием отдельных компонентов в ЭМ и их антирадикальными свойствами. Найдено, что самой высокой АРА обладали ЭМ, в состав которых входили фенолы: эвгенол - ЭМ гвоздики и душистого перца, карвакрол и тимол — ЭМ орегано, тимьяна, чабера, сафрол и миристицин - ЭМ мускатного ореха. Очень высокой активностью обладал экстракт имбиря, в состав которого входили нелетучие полифенолы - флавоноиды, а также гингеролы и гингероны с числом атомов углерода от 4 до 12. Высокой АРА также обладала смесь экстракта имбиря с ЭМ лимона. Такие масла проявляли активность в низких концентрациях, имели высокую начальную скорость реакции, восстанавливали 50% содержавшегося в системе радикала за короткое время. Менее активные ЭМ кардамона, имбиря и корицы не содержали или содержали менее 1% фенолов. Величины их антирадикальной эффективности были на порядок меньше, а действующие концентрации выше, чем у активных масел. В этих маслах в высокой концентрации (10-40%) присутствовали терпены с двумя двойными связями, которые легко отдавали водород радикалу: а- и у- терпинены, терпинолен, зингиберен, а-терпинеол, цитраль, циннамаль. Самой низкой АРА, на порядок ниже, чем в предыдущей группе, обладали ЭМ лимона, черного перца, тмина и кориандра. В составе этих масел были монотерпеновые и сесквитерпеновые углеводороды, низкое (не более 5%) содержание а- и у- терпиненов. Найденные в работе зависимости между составом ЭМ и их антирадикальным и антиоксидантным действием являются основой для получения композиций ЭМ с заранее заданными свойствами.

Следует отметить, что одним из важных компонентов многих ЭМ является у-терпинен. Механизм АРА действия этого соединения был изучен и описан в работе [Рог! М.С. & 1гщоМ К.и., 2003]. Было показано, что у-терпинен обладает высокой реакционной способностью с активными кислородными радикалами, при этом он, окисляясь, образует р-цимен, который в небольших количествах изначально присутствует во многих ЭМ. Однако в нашей работе с медленным ДФПГ активность ЭМ, содержащих у-терпинен (ЭМ кориандра и лимона) была низкой, то есть ДФПГ был неактивен в реакции с у-терпиненом. Это подтверждает факт о том, что АО и АР свойства определяются составом всей системы и зависят от свойств субстрата.

К примеру, при оценке АО свойств ЭМ орегано и трех смесей эфирных масел мы получили, что смесь, состоящая из ЭМ лимона и кориандра (СЭМ 1) и содержавшая около 10% у-терпинена, была близка по антиоксидантной активности ЭМ орегано в модельной системе ингибирования окисления метилолинолеата и бета-каротина (рис. 3), хотя в ее составе отсутствовали фенолы.

Рис. 3. Антиоксидантная и антирадикальная активности ЭМО и СЭМ в реакциях: А. ингибирования обесцвечивания [¿-каротина в системе автоокисления метиллинолеата; Б. с дифенилпикрилгидразил радикалом

Но в реакции с ДФПГ она проявляла себя как слабый АР агент, что говорит о том, что различные соединения активны в различных тест-системах, например, фенолы активны в реакции с ДФПГ, а у-терпинен - в реакциях с кислородсодержащими радикалами при ингибировании окисления липидов. И это, на наш взгляд, является основным преимуществом многокомпонентных смесей, таких как ЭМ или растительные экстракты по сравнению с индивидуальным веществом, так как в живом организме в окислительно-восстановительных, и в том числе в радикальных реакциях, могут участвовать соединения с различной реакционной способностью. В смеси АО с различающейся активностью существует большая вероятность присутствия тех компонентов, которые способны проявлять наибольшую активность со «специфичными» субстратами и по определенному механизму.

Особое внимание мы уделили изучению свойств ЭМ орегано. Установлено, что в модельной системе оно эффективно ингибировало процессы автоокисления жирных кислот, выделенных из мозга мышей. В опытных образцах даже через три месяца после начала эксперимента количественно сохранялись все ПНЖК, даже с 6 двойными связями, то есть ЭМ орегано является эффективным АО. Также помимо ЭМ орегано мы изучили свойства ЭМ тимьяна и чабера, имеющих близкий качественный состав. Несмотря на различия в суммарном содержании и соотношении двух основных фенолов - тимола и карвакрола, АР свойства этих масел были

близкими. И, вполне вероятно, ЭМ чабера и тимьяна будут обладать такими же антиоксидантными свойствами в других модельных реакциях и в экспериментах с лабораторными животными, которые мы выявили у ЭМ орегано.

Таким образом, изучены антиоксидантные и антирадикальные свойства индивидуальных эфирных масел и их смесей в нескольких модельных системах. Получены количественные характеристики их АР активности, определены основные компоненты ЭМ, отвечающие за их АР свойства, определены способы получения композиций ЭМ и экстрактов пряно-ароматических растений с заданными АО и АР свойствами и способными проявлять эту активность с учетом состава и свойств субстрата.

Биологическое действие эфирных масел.

Влияние приема малых доз эфирных масел на биохимические показатели органов и тканей мышей

Для определения цитотоксичности проведено изучение влияния различных концентраций ЭМ орегано на насыщающую плотность клеточной тест-системы, в роли которой служила культура трансформированных клеток почки китайского хомячка. Обнаружено, что после 4 суток культивирования клеток в ростовой среде ЭМ орегано не проявляло цитотоксических свойств в диапазоне концентраций от 1 ■ 10~'3 до 1 ■ 10"6 М (в пересчете на карвакрол) (рис. 4).

150

140 -

130

о 1?П

ш

ь 110

п 100

о

о т 90

80

о

ц

70

о;

га т 60

50

С

С1!

40

30

О

т

н О 20

10

0

КОНТРОЛЬ

-15 -14 -13 -12 -11 -10 -9 -8 -7-6-5-4 -3 1д(концентрации ЭМО в ростовой среде, М)

Рис.4. Влияние эфирного масла орегано в диапазоне концентраций (в пересчете на карвакрол) от 1-1<Т'5 до 51(Г'М ни насыщающую плотность культивируемых клеток почки китайского хомячка после 4 суток культивирования.

При концентрациях ЭМ от М0"5М до МО"4 М насыщающая плотность клеток не превышала плотности посева культуры, то есть клетки теряли способность к пролиферации. При концентрации масла в ростовой среде выше МО"4 М наблюдалось его явное цитотоксическое действие (рис. 4).

Концентрация ЭМ в воде в проводимых нами экспериментах с мышами составляла около МО"8 М, то есть на 4 порядка меньше минимальной цитотоксической дозы и поэтому выбранную нами концентрацию можно считать абсолютно безопасной.

Для исследования биологической активности в экспериментах на животных мы выбрали ЭМ гвоздики (АЕ = 5,22 х 10"2, л/(г сек), £п== 96,6 мкМ), ЭМ орегано (АЕ = 2,82 х 10"2, л/(г сек), Е;о,= 89,6 мкМ), а также смесь ЭМ лимона и экстракта имбиря (АЕ = 3,09 х 10"3, л/(г сек), с,п,= 50,2 мкМ), все препараты имели высокую АР активность, но различались по компонентам, отвечающим за АР свойства. В ЭМ гвоздики таким соединением был эвгенол, в ЭМ орегано - карвакрол и тимол, в смеси ЭМ лимона и экстракта имбиря - нелетучие флавоноиды и гингеролы. Мыши трех опытных групп ежедневно пили воду, содержавшую 150 нг/мл ЭМ. Через 6 месяцев было определено влияние приема малых доз ЭМ на биохимические и физико-химические показатели органов и тканей мышей и на состояние их иммунной системы. При этом основное внимание уделяли поиску и определению возможного действия ЭМ как биоантиоксидантов, то есть изучали их влияние на параметры, характеризующие антиоксидантный статус организма.

Влияние эфирных масел на физико-химические параметры эритроцитов БАО действие выявляется в интенсивности процессов ПОЛ. Известно, что увеличение продуктов окисления липидов приводит к снижению устойчивости мембран к механическому гемолизу и увеличению их вязкости. Из данных табл. 2.

Таблица 2. Влияние ЭМ на физико-химические параметры эритроцитов

Параметр Контроль ЭМ орегано ЭМ гвоздики ЭМ лимона + имбирь

Степень гемолиза эритроцитов, % 100,0 ±6,8 85,0 ±6,2 66,3 ±6,9 91,7 ± 6,1

Микровязкость поверхностных липидов мембран эритроцитов, тс Ю"10 с 0,32 + 0,02 0,25 ± 0,03 0,22 ± 0,02 0,34 ± 0,03

Микровязкость прибелковых липидов мембран эритроцитов, тс Ю"10с 1,22 + 0,08 1,12 ± 0,07 1,14 ±0,05 1,24 ±0,07

ТБК-АП эритроцитов, мкмоль/л эритроцитарной массы 14,14+ 1,62 (100%) 10,77+ 0,40 (76%) 8,25 + 0,37 (59%) 11,00 + 0,38 (78%)

видно, что концентрация ТБК-АП в мембранах эритроцитов существенно снижалась при приеме всех трех ЭМ по сравнению с контролем. Степень гемолиза и микровязкость поверхностных липидов мембран эритроцитов также снижались при приеме ЭМ, и самым активным было ЭМ гвоздики. Таким образом, все три характеристики свидетельствуют о том, что ЭМ даже в малых дозах проявляли свойства биоантиоксидантов: они снижали интенсивность ПОЛ и способствовали сохранению структурной целостности и функциональной активности мембран эритроцитов.

Влияние приема ЭМ на биохимические показатели печени и мозга мышей

Аналогичное влияние ЭМ на процессы ПОЛ оказывали в печени и мозге (табл.3.). Прием всех ЭМ снижал содержание ТБК-АП в этих органах. Но, в отличие от эритроцитов, самым выраженным БАО действием обладала смесь ЭМ лимона и экстракта имбиря, которая снижала содержание продуктов ПОЛ в этих органах на 3040%.

Таблица 3. Влияние ЭМ на биохимические параметры печени и мозга мышей

Параметр Контроль ЭМ орегано ЭМ гвоздики ЭМ лимона + имбирь

ТБК-АП в печени, нмоль/г ткани 0 дней 3,14 ± 0,23 (100%) 2,95 +0,20 (94%) 2,23 +0,19 (71%) 1,92 +0,16 (61%)

Через 7дней 11,21 + 0,36 (357%) 7,12 + 0,23 (226%) 4,85 + 0,20 (154%) 3,26+ 0,18 (104%)

ТБК-АП в мозге, нмоль/г ткани 0 дней 1,72 + 0,24 (100%) 1,58 +0,15 (92%) 1,30 + 0,10 (75%) 1,22 +0,12 (71%)

Через 3 дня 3,72+ 0,39 (216%) 1,89+ 0,34 (110%) 2,92 + 0,38 (170%) 2,52 + 0,32 (146%)

Более того, при употреблении эфирных масел возрастала устойчивость липидов печени и мозга к окислению. Об этом свидетельствуют результаты определения величин ТБК-АП в хранившихся образцах печени и мозга при 2-5°С. Через 7 дней хранения в печени мышей контрольной группы содержание ТБК-АП увеличилось в 3,6 раза. В группе, принимавшей масло орегано, содержание ТБК-АП было меньше, чем в контроле в 1,6 раза, ЭМ гвоздики - в 2,3 раза и смесь масла лимона и экстракта имбиря - в 3,4 раза. В тканях мозга мышей мы наблюдали аналогичное действие ЭМ, но менее выраженное (табл.3). Вполне вероятно, что причиной повышения устойчивости липидов являлось накопление компонентов ЭМ в органах мышей. В этом случае становится понятной более высокая активность смеси масла лимона и экстракта имбиря. Известно, что экстракт имбиря содержит нелетучие ди- и тритерпеноиды, флавоноиды, замещенные метоксифенолы. Более высокая молекулярная масса и полифункциональность этих соединений по сравнению с моно-и сесквитерпенами, низкомолекулярными фенолами эфирных масел орегано и гвоздики обеспечивают компонентам имбиря большее связывание и удерживание, то есть большее накопление в тканях органов мышей. В таком случае крайне интересной

задачей было бы изучение антирадикальных свойств и БАО действия экстрактов других пряно-ароматических растений в модельных системах и в экспериментах на животных.

Вторым фактором, снижающим интенсивность процессов ПОЛ, может быть найденное увеличение активности антиоксидантных ферментов в печени мышей, принимавших ЭМ по сравнению с контролем (рис. 5). Изученные ферменты супероксиддисмутаза (СОД), глутатионпероксидаза (ГП) и глутатион-в-трансфераза (ГТ) участвуют в детоксикации пероксидных радикалов и различных ксенобиотиков.

2

X

2 а е- 150

á¡

X

X X 1 100 й [ I ] 9Л

га Й 50 Р i I И

X I J К;

S fe < 1 ! i I

сод ГП

С£Я Контроль Г"-'Орегако кдаздя Гвоздика

J Лимон + имбирь

Рис.5. Влияние приема эфирных масел на активность антиоксидантных ферментов в печени мышей по сравнению с контролем (отн.%).

Из рис. 5. видно, что прием всех масел увеличивал активность СОД в 1,2-1,5 раза, при этом самым активным было эфирное масло орегано. В меньшей степени прием ЭМ влиял на активность ГП, в этом случае активнее других было ЭМ гвоздики. Самое сильное влияние ЭМ оказывали на глутатион-Б-трансферазу, увеличивая ее активность в 1,6-2 раза, при этом самыми эффективными были ЭМ гвоздики и смеси ЭМ лимона и экстракта имбиря.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что ЭМ, принимаемые в малых дозах, проявляли себя как эффективные биоантиоксиданты in vivo. Они снижали степень ПОЛ в мембранах эритроцитов, в печени и мозге мышей, увеличивали устойчивость липидов печени и мозга к окислению, увеличивали активность антиоксидантных ферментов печени.

Влияние эфирных масел на иммунную реактивность и устойчивость мышей к воздействию ионизирующей радиации

Возрастающее техногенное загрязнение окружающей среды, применение в пищевых продуктах различных пищевых и технологических добавок, употребление фармацевтических препаратов, постоянные стрессы - все это способствует появлению иммунной недостаточности. В этих случаях возникает разрегуляция функций

отдельных звеньев иммунной системы и ослабление иммунного ответа [Зайко H.H., 1977]. Для нормализации функций иммунной системы применяют иммуномодуляторы, например, антиоксиданты. Так, было показано, что введение экспериментальным животным витамина Е, ионола или сантохина приводило к стимуляции гуморального или клеточного иммунитета [Агафонова И., 2003]. Мягким, пролонгированным иммуномодулирующим действием при отсутствии побочных реакций обладают, согласно исследованиям отечественных ученых [Николаевский В.В. и др., 1987; Бондаренко A.C. и др., 1979], некоторые натуральные ЭМ.

Совместно с лабораторией радиационной иммунологии ФГБУ МРНЦ Минздрава России (г. Обнинск) мы провели исследования влияния ЭМ на состояние иммунной системы у животных без облучения, а также через 3 суток после тотального воздействия ионизирующей радиации гамма-лучами 60Со в дозе 1 Гр на установке «Луч-1» с мощностью дозы 0,8 сГр/с. Для индукции системного гуморального иммунного ответа всем мышам внутрибрюшинно вводили эритроциты барана в дозе 1х108 клеток. Через 4 суток у мышей определяли массу, клеточность селезенки и тимуса и содержание антителообразующих клеток (АОК) в селезенке по методу Каннингема. Статистическую значимость различий между группами оценивали с помощью t-критерия Стьюдента.

Таблица 4. Иммунологические показатели (М±м, в скобках % к контролю) у

мышей, получавших в течение 6 месяцев воду с добавлением эфирных масел

Группа животных Селезенка Тимус

масса, мг клеточность 1*106 АОК, 1*Ю3 масса, мг клеточность 1*106

Контроль 148±6,1 (100±4,1) 326±28,7 (100±8,8) 373±40,9 (100±11,0) 25,1±0,46 (100±1,8) 36,9±1,9 (100±5,1)

Масло орегано 159±5,9 (107±4,0) 338±18,0 (104±5,5) 340±43,2 (91,2±11,6) 26,7±1,3 106±5,2 35,4±3,2 (96,0±8,7)

Масло гвоздика 152±8,4 (103±5,7) 315±15,7 (96,6±4,8) 377±37,7 (101±10,1) 27,3±0,8 (109±3,2) 39,4±4,0 (107±10,8)

Масло лимон + имбирь 169±6,2* (114±4,2) 355±30,2 (109±9,3) 270±21,7* (72,4±5,8) 25,1±1,6 (100±6,4) 35,5±2,6 (96,2±7,0)

Примечание: * - статистически значимые различия (р<0,05) с контролем

Как видно из табл.4, масса и клеточность селезенки и тимуса были практически одинаковы для всех групп животных, это свидетельствует о том, длительный прием ЭМ не препятствовал и не изменял естественно протекающие процессы в исследуемом органе. Количество АОК является одним из основных параметров иммунного ответа и по этому параметру выявляют действие исследуемых препаратов или малых доз облучения. По концентрации АОК в селезенке мышей, получавших эфирные масла орегано и гвоздики, значительных различий в способности к иммунному ответу на эритроциты барана обнаружено не было. Но в группе мышей,

получавшей ЭМ лимона и экстракт имбиря, количество АОК было на 15-20% ниже по сравнению с контролем (табл. 4).

У облученных в дозе 1 Гр мышей (табл. 5), как и следовало ожидать на основании известного действия радиации в этой дозе, были значительно снижены показатели массы и клеточности селезенки и тимуса. Самое сильное влияние облучение оказало на величины АОК. В контрольной группе мышей облучение привело к снижению количества АОК в 4,2 раза. Количество АОК в опытных группах мышей, подвергшихся облучению, также снизилось по сравнению с необлученными мышами, но эти различия были намного меньше, чем для контрольной группы. Максимальной эффективностью обладало ЭМ гвоздики, количество АОК в селезенке мышей этой группы было в 2 раза выше, чем в контрольной группе облученных мышей. В 1,6 раза увеличивал АОК прием ЭМ орегано и в 1,4 раза - ЭМ лимона и имбиря по сравнению с облученным контролем (табл. 5).

Таблица 5. Иммунологические показатели (М±м, в скобках % к контролю) у облученных (1Гр) мышей, получавших воду с добавлением эфирных масел в течение 6 месяцев до воздействия радиации

Группа животных Селезенка Тимус

масса, мг клеточность, 1«106 АОК, 1х103 масса, мг клеточность, 1хЮ6

Контроль 115±1,6 (100±1,4) 98,8±5,5 (100±5,6) 88,5±11,3 (100±12,8) 23,5±1,1 (100±4,7) 29,4 ±1,94 (100±6,6)

Масло орегано 119±2,1 (103±1,8) 100±8,1 (101±8,2) 144±27,9 (163±31,5) 23,8±1,0 (101±4,3) 27,2±1,6 (92,7±5,5)

Масло гвоздики 120±3,0 (104±2,6) 127±15,7 (128±15,9) 179±38,6 (202±43,6) 23,7±1,2 (101±5,1) 25,4±2,2 (86,6±7,7)

Масло лимон +имбирь 124±6,9 (108±6,0) 97,1±6,8 (98,3±6,9) 122±19,3 (138±21,8) 23,3±1,0 (99,1±4,3) 27,7±1,8 (94,3±6,4)

Полученные данные свидетельствуют о том, что прием ЭМ мышами до облучения увеличивал их способность к иммунному ответу, снижая последствия ионизирующего облучения, не влияя на массу и клеточность лимфоидных органов. Наиболее выраженными радиопротективными свойствами обладало ЭМ гвоздики. На основании полученных результатов можно предположить, что наиболее вероятным и обоснованным с точки зрения имеющихся на сегодняшний день данных, основным механизмом действия ЭМ при иммунодефицитных состояниях является наличие у них антиоксидантных и антирадикальных свойств.

ВЫВОДЫ

1. Для 13 эфирных масел, экстракта имбиря и ионола определены параметры, количественно характеризующие их антирадикальные свойства в реакции с ДФПГ. Установлено, что реакции радикала с ЭМ отличаются от реакции с ионолом наличием

пролонгированного антирадикального действия. Константы скорости реакции всех изученных препаратов являлись величинами одного порядка. Для характеристики свойств ЭМ наряду со значениями АЕ предложено использовать параметр £,0, равный предельной концентрации, до которой исследуемый агент способен восстановить радикал.

2. Установлено влияние состава ЭМ на их АРА. Выделено 4 группы масел, для которых активность уменьшалась на порядок. Самой высокой активностью обладали ЭМ и экстракты, в состав которых входили фенолы: эвгенол, карвакрол, тимол, полифенолы, гингеролы и гингероны. Меньшую активность имели масла, содержавшие 1-3 % производных фенолов. Низкую активность показали масла, содержавшие 10-40% моно- и сесквитерпиненов с двумя двойными связями в цикле. Самой низкой АРА обладали эфирные масла, в составе которых было не более 5% а-и у-терпиненов. Для ЭМ тимьяна, орегано и чабера выявлено наличие синергетического влияния тимола и карвакрола.

3. Найдено, что ЭМ орегано являлось эффективным ингибитором автоокисления природных полиненасыщенных ЖК. В его присутствии в модельной системе в течение 3 месяцев не происходило окисления moho-, ди-, три- и тетраеновых кислот, в течение 6 месяцев это масло ингибировало окисление тетраеновых кислот на 50%, гексаеновых- на 30%.

4. Впервые в экспериментах in vivo с мышами линии Balb/c найдено, что ЭМ гвоздики, орегано или лимона в смеси с экстрактом имбиря при их систематическом приеме в малых дозах в течение 6 месяцев проявляли свойства активных БАО. Они увеличивали устойчивость мембран эритроцитов к механическому гемолизу, снижали величины ТБК-АП в мембранах эритроцитов на 41% (ЭМ гвоздики), 24%(ЭМ орегано) и 22%(смесь лимона и имбиря), в печени мышей на 29%, 6% и 39%, соответственно, в мозге - на 25%, 8% и 29%, соответственно. Устойчивость к окислению липидов печени и мозга мышей, принимавших ЭМ, была в 2-4 раза выше по сравнению с контролем. Максимальным АО действием по отношению к полиненасыщенным ЖК в эритроцитах обладало масло гвоздики, в мозге и печени мышей - смесь ЭМ лимона и экстракта имбиря.

5. Найдено, что прием малых доз ЭМ приводил к модуляции АО ферментативной системы печени мышей. Все ЭМ увеличивали активность СОД в 1,3-1,5 раза, но активность глутатионпероксидазы возрастала в 1,3 раза только при приеме эфирного масла гвоздики. Самое сильное действие ЭМ оказывали на глутатион-8-трансферазу: масла гвоздики и лимона с имбирем увеличивали ее активность в 2 раза, орегано - в 1,6 раза.

6. Найдено, что длительный прием ЭМ не препятствовал и не изменял естественно протекающие процессы в иммунокомпетентных органах мышей - тимусе и селезенке. Облучение мышей в дозе 1 Гр приводило к снижению величины основного показателя иммунитета - концентрации АОК в селезенке. У мышей,

принимавших ЭМ, этот показатель был в 1,6-2 раза выше, чем в контроле, максимальной эффективностью обладало ЭМ гвоздики. Эффективность действия ЭМ была пропорциональна их АРА. Совокупность полученных данных демонстрирует перспективность дальнейших исследований индивидуальных ЭМ и их композиций различного состава в качестве биоантиоксидантных, геропротекторных, профилактических и терапевтических средств при различных патологиях, вызываемых окислительным стрессом или вредным воздействием свободных радикалов.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах и главы в книгах:

1. Теренина М. Б., Мишарина Т. А., Крикунова Н.И., Алинкина Е.С, Фаткулина Л. Д., Воробьева А. К. Эфирное масло орегано как ингибитор окисления высших жирных кислот. // Прикладная биохимия и микробиология. 2011. Т.47. №4. С. 490-494.

2. Мишарина Т.А.. Алинкина Е.С, Фаткуллина Л.Д., Воробьёва А.К., Бурлакова Е.Б. Влияние состава смесей эфирных масел на их антиоксидантные и антирадикальные свойства. // Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т. 48, № 1. С. 117-123.

3. Алинкина Е.С, Воробьева А.К., Мишарина Т.А., Фаткуллина Л.Д., Бурлакова Е.Б., Хохлов А Н. Цитогеронтологические исследования биологической активности эфирного масла орегано.// Вестник МГУ. 2012. № 2. С. 13-18.

4. Алинкина ЕС., Мишарина ТА., Фаткуллина Л.Д., Бурлакова Е.Б. Сравнение антирадикальной активности ионола, компонентов свежего имбиря и его экстрактов.// Прикладная биохимия и микробиология. 2012. Т. 48, №4. С. 450-458.

5. Бурлакова Е.Б., Мишарина Т.А., Воробьева А.К., Алинкина Е.С, Фаткуллина Л.Д.. Теренина М.Б., Крикунова Н.И.Н Торможение процессов старения мышей при приеме композиции эфирных масел. //Доклады АН. 2012. Т. 444, № 6. С. 676-679.

6. Алинкина Е.С, Мишарина Т.А., Фаткуллина Л Д. Антирадикальные свойства эфирных масел орегано, тимьяна и чабера. // Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т. 49, № 1. С.82-87

7. Мишарина Т.А., Бурлакова Е.Б., Фаткуллина Л Д., Алинкина ЕС, Воробьева А.К., Медведева И.Б., Ерохин В.Н., Семенов В.А., Наглер Л.Г., Козаченко А.И. Влияние эфирного масла орегано на прививаемость и развитие карциномы Льюис у мышей-гибридов F1 DBA С57 Black. // Прикладная биохимия и микробиология. 2013. Т. 49, № 4. С. 423-428.

8. Мишарина Т.А.. Алинкина ЕС, Фаткуллина Л.Д., Медведева И.Б. Природные биоантиоксиданты. Антирадикальные свойства эфирных масел орегано, тимьяна и чабера. // Изв. ВУЗов. Прикладная химия и биотехнология. 2012. Т. 2, № 3. С. 174-176.

9. Алинкина ЕС., Воробьева А.К., Мишарина Т.А., Медведева И.Б., Фаткуллина Л.Д., Бурлакова Е.Б. Оценка антиоксидантных свойств эфирных масел различными методами. // Прикладная аналитическая химия. 2011. Т. 2, №2(4). С. 28-36.

10. Алинкина Е.С, Мишарина Т.А., Фаткуллина Л.Д., Медведева И.Б. Сравнение антирадикальных свойств ионола и эфирных масел душицы, тимьяна и чабера. // Прикладная аналитическая химия. 2012. Т. 3, № 1(7). С. 50-55.

11. Vorobyova А.К., Alinkina ES., Misharina Т.А., Fatkullina L.D., Terenina M.B., Krikunova N.I., Burlakova E.B. Effect of long-term administration of essential oils on the fatty acid composition of mice organs. // Modern Problems in Biochemical Physics: New Horizont.- Ed.: G.E. Zaikov, S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova & A.A. Popov. 2012 . Ch. 31. P. 247-254.

12. Alinkina E.S., Ziller A., Vorobyova A.K., Misharina T.A., Fatkullina L.D., Burlakova E.B. Inhibition of methyl linoleate oxidation by components of essential oils. // Modern Problems in Biochemical Physics: New Horizont.- Ed.: G.E. Zaikov, S.D. Varfolomeev, E.B. Burlakova & A.A. Popov. 2012. Ch. 31. P. 309-316.

13. Misharina T.A., Alinkina E.S., FatkuIIina L.D. Antiradical properties of essential oils from orégano, thyme and savory. // Pharmaceutical and Medical Biotechnology./ Eds.: R.Orlicki, C.Cienciala, L.P.Krylova, J.Pielichowski, G. E. Zaikov. Nova Sei. 2013. Ch.30. P.323-329.

Тезисы докладов:

1. Алинкина E.C., Теренина М.Б., Крикуноеа Н.И., Фаткуллина Л.Д., Воробьева А.К., Мишарина Т.А. Ингибирование авгоокисления ненасыщенных жирных кислот смесью эфирных масел: Сб. тезисов VIH межд. конф. «Биоантиоксидант». М.: РУДН, 2010. С. 18-19.

2. Воробьева А.К., Алинкина Е.С., Фаткуллина Л.Д., Бурлакова Е.Б. Теренина М.Б., Крикуноеа Н.И., Ерохин В.Н., Семенов В.А., Мишарина Т.А., Голощапов А.Н. Различия в параметрах ПОЛ в органах и тканях мышей при длительном приеме композиции эфирных масел с антиоксидантными свойствами: Сб. тезисов VIII межд. конф. «Биоантиоксидант». М.: РУДН. 2010. С. 95-96.

3. Алинкина ЕС., Ziller А., Воробьева А.К.,. Т.А.Мишарина, Фаткуллина Л.Д., Бурлакова Е.Б. Ингибирование окисления метиллиноленоата компонентами эфирных масел: Тр. X ежегодн. молодежной конф. ИБХФ РАН- ВУЗы «Биохимическая физика». М.: PAH. ОХНМ. 2010. С. 13-16.

4. Воробьева А.К., Алинкина Е.С., Мишарина Т.А., Фаткуллина Л.Д., Теренина М.Б., Крикуноеа H.H., Бурлакова Е.Б. Влияние длительного употребления эфирных масел на состав жирных кислот в органах мышей. Тр. X ежегодн. молодежной конф. ИБХФ РАН -ВУЗы «Биохимическая физика». М.: РАН, ОХНМ. 2010. С. 41-45.

5. Воробьева А.К, Алинкина Е.С., Фаткуллина Л.Д., Мишарина Т.А., Бурлакова Е.Б. Действие эфирных масел на антиоксидантный статус и продолжительность жизни мышей: Сб. трудов XI межд. ежегодн. молодежной конф. ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». М.: РАН, ОХНМ. 2011. С. 73.

6. Алинкина Е.С., Воробьева А.К., Мишарина Т.А., Фаткуллина Л.Д., Бурлакова Е.Б. Антирадикальные свойства эфирного масла и олеорезина имбиря в модельных системах: Сб. трудов XI межд. ежегодной молодежной конф. ИБХФ РАН-ВУЗы «Биохимическая физика». -М.: РАН. ОХНМ. 2011. С. 34.

7. Vorobyova А.К., Alinkina E.S., FatkuIIina L.D., Misharina T.A., Terenina M.B., Erohin V.N., Burlakova E.B. Biological activity of savory essential oil in in vivo experiments: Proceedings of the Int. Conference "Renewable Wood and Plant Resources: Chemistry, Technology, Pharmacology, Medicine". S.Petersburg. 2011. C. 245.

8. Алинкина E.C., Мишарина T.A., Л.Д. Фаткуллина, Бурлакова Е.Б. Оценка биологической активности эфирных масел лимона и орегано в экспериментах на лабораторных животных: Материалы Моск. Межд. научно-практ. Конф. «Фармацевтические и медицинские биотехнологии». М.'.ЗАО «Экспо-биохим-технологии». РХТУ им. Д.И. Менделеева. 2012. С. 170-171.

9. Воробьева А.К., Алинкина Е.С., Фаткуллина Л.Д., Мишарина Т.А., Бурлакова Е.Б. Влияние приема малых доз эфирного масла орегано на устойчивость мышей к онкологическим процессам: Матер. Моск. Межд. Научно-практ. Конф. «Фармацевтические и медицинские биотехнологии»,- М.:ЗАО «Экспо-биохим-технологии». РХТУ им. Д.И. Менделеева. 2012 . С. 176-177.

10. Бурлакова Е.Б., Мишарина Т.А., Фаткуллина Л.Д., Воробьева А.К, Алинкина Е.С. Оценка эффективности и безопасности длительного приема мышами эфирного масла орегано: Матер. Моск. Межд. Научно-практ. Конф. «Фармацевтические и медицинские биотехнологии»,- М.:ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им, Д.И. Менделеева. 2012. С. 182-183.

11. Алинкина Е.С., Воробьёва А.К, Мишарина Т.А., Фаткуллина Л.Д., Бурлакова Е.Б. Влияние приема малых доз эфирных масел на показатели окислительного стресса у мышей:

Матер.V Всеросс. конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». Барнаул. 2012. С. 322-324.

12. Бурлакова Е.Б., Мишарина Т.А, Воробьева А.К., Фаткуллина Л.Д. Алинкина Е.С. Противораковое и профилактическое действие малых доз эфирных масел на мышей: Матер. V Всерос. Конф. «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья». Барнаул. 2012. С. 324-326.

13. Алинкина Е.С., Мишарина Т.А., Фаткуллина Л.Д., Медведева И.Б. Антирадикальные свойства эфирных масел, содержащих карвакрол и тимол: Матер, докладов VIII межд. симпозиума «Фенольные соединения: фундаментальные и прикладные аспекты». М.: ИФР РАН. РУДН. 2012. С. 22-26

14. Мишарина Т.А., Фаткуллина Л.Д., Воробьева А.К., Алинкина Е.С., Бурлакова Е.Б. Профилактическое действие малых доз ЭМ на мышей: Науч. труды VI Межд. конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». СПб., 2012. С. 82

15. Фаткуллина Л.Д., Мишарина Т.А., Воробьева А.К., Алинкина Е.С., Бурлакова Е.Б. Противораковое действие малых доз ЭМ на мышей: Науч. труды VI Межд. конгресса «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине». СПб., 2012. С. 252

16. Фаткуллина Л.Д., Воробьёва А.К., Алинкина Е.С., Мишарина Т.А, Теренина М.Б., Крикунова Н.И, Бурлакова Е.Б. Регуляция возрастных изменений жирнокислотного состава мозга мышей с помощью растительных препаратов. «Современные проблемы системной регуляции физиологических функций». Бодрум. НИИНФ РАМН. 2012. С. 176-178.

Подписано в печать: 09.09.2013 Объем: 1,4усл.п.л. Тираж: 100 экз. Заказ № 909 Отпечатано в типографии «Реглет» 101000, г. Москва, Пл. Мясницкие Ворота д. 1, стр.3 (495) 971-22-77 www.reglet.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Алинкина, Екатерина Сергеевна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ ИНСТИТУТ БИОХИМИЧЕСКОЙ ФИЗИКИ им. Н.М. ЭМАНУЭЛЯ РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК

На правах рукописи -—

04201361482

АЛИНКИНА ЕКАТЕРИНА СЕРГЕЕВНА

АНТИОКСИДАНТНЫЕ И АНТИРАДИКАЛЬНЫЕ СВОЙСТВА ЭФИРНЫХ МАСЕЛ IN VIVO И IN VITRO

03.01.02 Биофизика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители Мишарина Т.А., д.х.н., Фаткуллина Л.Д., к.б.н.

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ............................................................................................................................2

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.............................................................4

ВВЕДЕНИЕ...................................................................................................................................6

ГЛАВА I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР...................................................................................11

Антиоксидантные свойства эфирных масел и методы их определения............................11

Методы оценки антиоксидантных и антирадикальных свойств ЭМ.................................13

Ингибирование образования диеновых коньюгатов.........................................................18

Ингибирование обесцвечивания /?-каротина.....................................................................19

Оценка ингибирования ПОЛ по содержанию ТБК активных продуктов......................20

Ингибирование образования летучих низкомолекулярных продуктов ПОЛ..................21

Ингибирование окисления низших альдегидов эфирными маслами................................23

Методы исследования антирадикальной активности....................................................25

ГЛАВА II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ...........................................42

2.1.Эфирные масла. Реактивы и стандарты...................................................................42

2.2. Лабораторные животные..........................................................................................42

2.3. Газохроматографический (ГЖХ) и хромато-масс-спектрометрический анализ (ГХ-МС) эфирных масел и метиловых эфиров высших жирных кислот...................43

2.4. Получение метиловых эфиров жирных кислот......................................................44

2.5. Методика определения антиоксидантных свойств эфирных масел в модельной системе ингибирования автоокисления гексаналя.......................................................44

2.6. Методика определения антиоксидантных свойств эфирных масел по степени ингибирования обесцвечивания (3-каротина..................................................................45

2.7. Методика определения антиоксидантных свойств эфирных масел по степени ингибирования образования диеновых конъюгатов в модельной системе автоокисления метиллинолеата......................................................................................45

2.8. Методика определения антирадикальных свойств эфирных масел по реакции восстановления дифенилпикрилгидразил радикала....................................................46

2.9. Методика определения степени спонтанного гемолиза эритроцитов.................47

2.10. Методики определения интенсивности перекисного окисления липидов (ПОЛ) в биологических образцах по содержанию ТБК-АП продуктов................................48

Определение содержания ТБК-АП в мембранах эритроцитов..............................48

Определение содержания ТБК-АП в гомогенатах тканей печени и мозга ...........49

2.11. Методики определения микровязкости липидных слоев мембран эритроцитов методом ЭПР-спектроскопии..........................................................................................50

2.12. Определение активности ферментов антиоксидантной защиты в гомогенате печени мышей..................................................................................................................52

Методика определения активности супероксиддисмутазы ( СОД)......................52

Методика определения активности глутатионпероксидазы (ГП)........................54

Методика определения активности глутатион-Б-трансферазы (ГТ)..................55

2.13. Определение влияния эфирных масел на состояние иммунной системы.........56

2.14. Определение цитотоксичности эфирного масла орегано....................................57

ГЛАВА III. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ...........................................................58

3.1. Изучение антиоксидантних и антирадикальных свойств эфирных масел в мрдельных системах..............................................................................................................58

3.1.1. Изучение антиоксидантних свойств индивидуальных эфирных масел...............59

и их смесей в модельных системах....................................................................................59

3.1.2. Ингибирование окисления природных жирных кислот ЭМ орегано...................66

3.1.3. Определение антирадикальных свойств эфирных масел.......................................70

3.2. Биологическое действие эфирных масел. Влияние приема малых доз эфирных масел на биохимические показатели органов мышей.................................................100

3.2.1. Влияние эфирного масла орегано на рост и развитие культуры трансформированных клеток почки китайского хомячка.............................................101

3.2.2. Влияние эфирных масел на биохимические параметры эритроцитов................103

3.2.3. Влияние приема эфирных масел на биохимические показатели печени и мозга мышей.................................................................................................................................105

3.2.4. Влияние приема эфирных масел на активность антиоксидантных ферментов в печени мышей....................................................................................................................107

3.2.5. Влияние приема эфирных масел на состав жирных кислот в липидах печени и мозга мышей.......................................................................................................................111

3.2.6. Влияние эфирных масел на иммунную реактивность и устойчивость мышей к воздействию ионизирующей радиации...........................................................................123

ВЫВОДЫ..................................................................................................................................130

ЛИТЕРАТУРА.........................................................................................................................132

БЛАГОДАРНОСТИ................................................................................................................132

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ААРН - (2,2'-azobis(2-amidinopropane) dihydrochloride) - 2,2-азобис(2-амидинопропан) дихлорид

ABTS+ - (2,2'-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid)) - (2,2-азинобис(З-этилбензотиазолин-б-сульфонат)

АЕ - (antiradical efficiency) - антирадикальная эффективность

AMVN - (2,2'-azobis(2,4-dimethylvaleronitrile)) - 2,2-азобис(2,4-диметилвалеронитрил)

ВНТ - (butylhydroxytoluene) - ионол DCFH- (2',7' - dichlorfluorescein diacetate) -DA 2',Т - дихлорфлюоресцеина диацетат

DPPH - (2,2-diphenyl-l-picrylhydrazyl) - 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил

ЕС50 - (efficient concentration) - величина эквивалентная количеству

антиоксиданта способного восстановить радикал на 50%

FRAP - (ferric reducing antioxidant power) - антиоксидантний тест по железо-восстанавливающей способности

GSH - (glutathione) - глутатион

GSSG - (glutathione disulfide) -глутатион дисульфид IOU - (inhibited oxygen uptake) - метод ингибирования поглощения

кислорода

NADPH - (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate) - восстановленный никотинамидадениндинуклеотидфосфат

ORAC - (oxygen radical absorbance capacity) - адсорбционная емкость по отношению к кислородным радикалам

ТЕАС - (Trolox equivalent antioxidant capacity) - величина отражающая количество милимолярного раствора тролокса, имеющего ту же «антиоксидантную емкость» , что и 1,0 шМ раствор исследуемого вещества

TRAP - (total reactive antioxidant potential) - общая потенциальная активность антиоксиданта

TAR - (total antioxidant reactivity) - общая антиоксидантная

AO - антиоксидант

AOA - антиоксидантная активность

АОК - антителообразующая клетка

АРА - антирадикальная активность

БАО - биоантиоксидант

ДК - диеновые конъюгаты

ДМСИ - (Дюльбекко модифицированная среда Игла) - питательная среда для культивирования клеток

ДФПГ - 2,2-дифенил-1-пикрилгидразил радикал

ГЖХ - газо-жидкостная хроматография

ГХ-МС - хромато-масс-спектрометрический анализ

ГП - глутатионпероксидаза

ГПТБ - гидропероксид трет-бутила

ГР - глутатионредуктаза

ГТ - глутатион-8-трансфераза

ЖК - жирная кислота

ИУ - индекс удерживания

КО - ксантиоксидаза

МДА - малоновый диальдегид

МНЖК - мононенасыщенная жирная кислота

МЭЖК - метиловый эфир жирной кислоты

НСТ - нитросиний тетразолий

ПАВ - перенос атома водорода

ПНЖК - полиненасыщенная жирная кислота

ПОЛ - перекисное окисление липидов

ПЭ - перенос электрона

ТБК-АП - активные продукты, реагирующие с ТБК

ТБК - тиобарбитуровая кислота

ТХУ - трихлоруксусная кислота

СОД - супероксиддисмутаза

СЭМ - смесь эфирных масел

ХДНБ - 1-хлор-2,4-динитробензол

ХЛ - хемилюминесценция

ЭМ - эфирное масло

ЭМО - эфирное масло орегано

ЭПР - электронный парамагнитный резонанс

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Одной из острейших проблем настоящего времени является возрастающее негативное действие вредных факторов окружающей среды, которое приводит к развитию патологических состояний, «омоложению» многих заболеваний, ускорению старения. Немаловажную роль в развитии таких процессов играет избыток активных свободных радикалов, которые в малых количествах всегда присутствуют в организме и выполняют ряд жизненно необходимых функций. В 50-е годы прошлого столетия была предложена теория свободнорадикального старения, получившая признание и развитие в многочисленных работах зарубежных и отечественных исследователей, в первую очередь Н.М. Эмануэля и его школы [1]. Эта теория до настоящего времени считается одной из самых перспективных, объясняющей механизмы старения и связанных с ними патологических процессов. Согласно этой теории, старение организма вызвано ростом молекулярных повреждений, вызываемых свободными радикалами, а также нарушением функции системы антиоксидантной защиты организма [2]. С участием свободных радикалов осуществляется огромное число нужных организму химических превращений, но при их избытке происходит нарушение жизненно необходимых процессов и разрушение важных связей и структур. Они могут изменять свойства биологических мембран, их проницаемость, структуру, влиять на функциональное состояние клеток и поддержание гомеостаза организма в целом. В основе этих нарушений лежат процессы окислительной модификации белков и ДНК, а также перекисного окисления липидов (ПОЛ), которые носят каскадный характер.

Управление окислительно-восстановительными реакциями в организме осуществляется системой антиоксидантной защиты, включающей ферменты, витамины, пептиды и другие эндогенные антиоксиданты. Благодаря таким системам в здоровом организме подавляющее большинство «излишних» свободных радикалов нейтрализуется еще до того, как они успеют повредить те или иные компоненты клетки. Так, из каждого миллиона образующихся супероксидных радикалов от ферментной защиты ускользает не более четырех [3]. Избыточное образование радикалов и снижение активности защитных антиоксидантных систем способствует развитию окислительного стресса. Решением проблемы может быть употребление эффективных и безопасных дополнительных экзогенных антиоксидантов (АО) [1,4]. Интересным и перспективным классом природных биологически активных соединений являются эфирные масла (ЭМ) пряно-ароматических растений, употребляемых в пищу. Их безопасность и полезные для здоровья свойства

были известны еще с древних времен. В ряде работ было показано, что многие масла содержат АО и способны ингибировать окислительные процессы в модельных системах [5-7]. Однако выявление реальной антиоксидантной эффективности эфирных масел на основе обобщения имеющихся литературных данных является сложной задачей, так как это свойство зависит от состава модельных систем, от природы субстрата и метода определения. Проведенная в научных кругах в начале 21 века дискуссия не решила проблему стандартизации методов определения АО свойств веществ, поэтому было рекомендовано проводить оценку их антиоксидантной эффективности в одних и тех же условиях и несколькими методами [8,9]. Поэтому экспериментальное изучение современными методами АО свойств эфирных масел и механизма их действия в модельных системах является актуальной задачей. Крайне важным вопросом является экспериментальная оценка влияния приема эфирных масел на биохимические процессы, протекающие в живых организмах. Таких исследований крайне мало, но только они могут выявить наличие биологической активности у препаратов и их реального влияния на организм. Более того, комплексное изучение свойств эфирных масел в модельных системах и живых организмах позволит выявить связи между составом масел, их антиоксидантными и антирадикальными свойствами, способностью проявлять биологическую активность, оказывать влияние на биохимические процессы в живых организмах, изучить возможные механизмы реализации биологического действия ЭМ, что представляет значительный научно-практический интерес.

Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось изучение антиоксидантных и антирадикальных свойств эфирных масел в модельных системах, определение влияния регулярного длительного приема малых доз эфирных масел на биохимические показатели мышей линии Ва1Ь/с, на их иммунитет, а также изучение биоантиоксидантного действия эфирных масел.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

1) Определение кинетических параметров реакции компонентов эфирных масел со свободным стабильным радикалом - дифенилпикрилгидразилом.

2) Изучение механизма антирадикального действия эфирного масла и его отдельных компонентов.

3) Сравнение АО свойств композиций ЭМ различного состава в модельных реакциях ингибирования:

• автоокисления природных полиненасыщенных ЖК,

• автоокисления гексаналя,

• обесцвечивания (3-каротина в системе автоокисления метиллинолеата,

• образования диеновых конъюгатов.

4) Исследование цитотоксичности эфирного масла орегано на культуре трансформированных клеток почки китайского хомячка линии В11-dii FAF28.

5) Изучение влияния эфирных масел при их длительном систематическом приеме в малых дозах мышами линии Balb/c in vivo на следующие параметры:

• степень спонтанного гемолиза эритроцитов;

• микровязкость липидов мембран эритроцитов;

^ интенсивность ПОЛ в эритроцитах и гомогенатах тканей печени и мозга;

• состав жирных кислот (ЖК) в печени и мозге;

• активность антиоксидантных ферментов печени;

• иммунную реактивность и устойчивость мышей к воздействию ионизирующей радиации.

Научная новизна

Впервые в экспериментах in vivo получены данные о действии систематического приема малых доз эфирных масел гвоздики, орегано и смеси масла лимона и экстракта имбиря на биохимические показатели в тканях и органах мышей линии Balb/c. Установлено, что ЭМ действовали как эффективные биоантиоксиданты: их прием увеличивал устойчивость мембран эритроцитов к гемолизу, снижал интенсивность ПОЛ в мембранах эритроцитов и в тканях печени и мозга мышей, увеличивал активность эндогенных антиоксидантных ферментов в печени мышей. Впервые установлено, что изученные эфирные масла увеличивали устойчивость липидов печени и мозга мышей к окислению. Приоритетными являются исследования, проведенные в области изучения иммуностимулирующих и радиопротекторных свойств ЭМ в экспериментах in vivo. Установлено, что изученные ЭМ незначительно влияли на иммунокомпетентные органы интактных мышей, но проявляли себя как эффективные иммуномодуляторы, поддерживающие иммунный статус мышей при повреждающем действии ионизирующей радиации.

Практическое значение работы

В результате исследований установлены зависимости между составом эфирных масел и их антирадикальным и антиоксидантным действием, эти данные могут быть основой для получения композиций с заранее заданными свойствами. Выявлена прямая корреляция между антирадикальными свойствами ЭМ в модельных экспериментах и их влиянием на биохимические показатели органов мышей, принимавших малые дозы ЭМ.

Установлено, что максимальной эффективностью в качестве радиопротектора и активатора ферментного звена антиоксидантной защиты обладало эфирное масло гвоздики, содержавшее около 78% эвгенола. Найдено, что самым эффективным ингибитором перекисного окисления липидов в тканях печени и мозга являлась композиция, содержавшая экстракт имбиря. Проведенное исследование не выявило токсического действия ЭМ при их систематическом приеме в малых дозах с питьевой водой в течение 6 месяцев, это подтверждает безопасность выбранных доз ЭМ и позволяет рассматривать ЭМ, как новый класс перспективных биоантиоксидантов. Данные, полученные при изучении in vivo и in vitro свойств индивидуальных эфирных масел и их композиций различного состава, могут быть использованы при разработке специальных пищевых добавок для профилактики различных патологий, вызываемых окислительным стрессом или вредным воздействием свободных радикалов, а также для увеличения продолжительности жизни. При вдыхании, при нанесении на кожу или при употреблении с водой или едой компоненты эфирных масел попадают в кровь и во внутренние органы, где и проявляют свое благотворное действие, поэтому результаты исследований могут стать научной базой такого эмпирического направления народной медицины как ароматерапия.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1) Эфирные масла и экстракт имбиря, содержащие фенолы, обладали высокой антирадикальной эффективностью в модельной реакции со свободным радикалом.

2) Прием малых доз эфирных масел снижал интенсивность ПОЛ в органах и тканях мышей и увеличива