Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная организация оболочки дрожжей-деструкторов поверхностно-активных веществ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Файзутдинова, Рушания Ниловна, Пущино

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К.Скрябина

На правах рукописи

ФАЙЗУТДИНОВА Рушания Ниловна

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ОБОЛОЧКИ ДРОЖЖЕЙ-ДЕСТРУКТОРОВ ПОВЕРХНОСТНО-АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ

Диссертация на соискание ученой степени

кандидата биологических наук (специальность 03.00.07. - микробиология)

Научные руководители: Д.б.н., проф. Дуда В.И., к.б.н., с.н.с. Дмитриев В.В.

ПУЩИНО - 1999 г.

ОГЛАВЛЕНИЕ

стр.

Принятые сокращения...........................--5

ВВЕДЕНИЕ----......-......-.................- -7

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ........- - -................11

1.1 Поверхностно- активные вещества как поллютанты

окружающей среды.-------------------------------11

1.1.1. Общие сведения о производстве ПАВ. - -—..........-11

1.1.2. Проблема воздействия ПАВ на окружающую среду- - — -12

1.1.3. Воздействие ПАВ на биологические объекты-----------14

1.1.3.1. Взаимодействие ПАВ с дрожжевыми микроорганизмами -14

1.1.3.2. Механизмы взаимодействия ПАВ с субклеточными структурами...........______...................- - -16

A. ПАВ - мембраны........- - -........................16

Б. ПАВ - поверхностные полисахариды клетки...........—22

B. Механизмы взаимодействия ПАВ с ферментами---------23

1.И. Резистентность микроорганизмов к ПАВ и способность к

биодеградации этих соединений----- - -...............26

1.П.1. Общие представления о резистентности и биоразлагае-

мости..............- -......................- -.....26

1.11.2. Пути микробного метаболизма НПАВ................28

1.111. Клеточная оболочка дрожжевой клетки................32

1.111.1. Организация клеточной оболочки базидиомицетных

дрожжей................-.........................32

1.Ш.2. Ультраструктурная организация клеток дрожжей

рода Сгур1ососсиэ- -........................-.......33

I.Ш.З. Оболочка дрожжей как внешняя метаболическая

зона.......................................-......39

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ- - - - -.............44

Глава II. Материалы и методы исследования--------------------44

II. 1. Материалы и реактивы, используемые в работе.........44

11.2.1. Микроорганизмы и условия культивирования...........45

11.2.2. Условия хранения культур микроорганизмов............46

11.3. Препаративные методы..............................46

11.3.1. Получение гомогенатов клеток.......................46

11.3.2. Экстракция липидов- -..........-.....-..............46

И.З.З. Выделение ДНК..................................- - -47

11.4. Аналитические методы.............................- -47

11.4.1. Определение прироста биомассы......................47

11.4.2. Количественное определение лаурокса-9, лауриновой кислоты и ПЭГ................-...............----......48

11.4.3. Количественное определение свинца..................-48

II.4.4: Определение ферментативных активностей-............48

И.4.5. Определение жизнеспособности клеток.................48

И.4.6. Морфометрический анализ размеров клеточных структур- 49 II.4.7. Статистический анализ экспериментальных данных.....49

11.5. Электронно- микроскопические методы—.............49

11.5.1. Метод ультратонких срезов.....................-.....49

11.5.2. Электронно-микроскопическая криофрактография.......50

11.5.3. Электронно- микроскопическая цитохимия.............51

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ................- - - 53

Глава III. Деструкция лаурокса-9 культурой Cryptococcus humicola

штамм S-...............-........-................53

III. 1. Использование лаурокса-9 в качестве единственного источника углерода и энергии...........-................54

111.2. Деструкция лаурокса-9 - осуществляется внеклеточно - - - 56

111.3. Влияние лаурокса-9 на жизнеспособность С.humicola----61

111.4. Электронно- цитохимическое определение локализации гидролаз -...............................-........66

111.5. Оптимизация методов электронно- цитохимического обнаружения гидролаз..............................69

Ш.5.1. Хлорметилсилатран- новый субстрат для электронно-

цитохимической локализации гидролаз---------------69

III.5.2. Использование Ьо\уюгу1 - низкотемпературной полимеризационной среды..........................73

Глава IV. Особенности ультраструктуры оболочки С. китко1а

при росте на среде с глюкозой.......................-77

IV. 1. Ультраструктура клеточной стенки и капсулы С.Нитко1а 77

IV.2. Ультраструктура плазмалеммы С. китко1а............88

Глава V. Субстрат- зависимые ультраструктурные изменения

С.киткоШ при росте на ПАВ-содержащей среде —......95

V. 1. Ультраструктура клеточной стенки , капсулы и плазмалем-

мы С.Нитко1а при переносе на среду, содержащую

лаурокс-9. Первичное воздействие ПАВ —.............95

У.2. Ультраструктура клеток на стадии активного

гидролиза лаурокса-9. Фаза логарифмического роста. - - 110 У.2.1. Клеточная стенка и протоплазма С.Нитко1а на стадии

логарифмического роста.................-........-110

У.2.2. Плазмалемма С.китко1а в экспоненциальной фазе роста114 У.2.3. Изменение ультраструктуры митохондрий у клеток

С. китко1а, активно гидролизующих лаурокс-9........120

Глава VI. Роль экстрацеллюлярных компонентов в процессе

деструкции лаурокса-9.............................125

ЗАКЛЮЧЕНИЕ - -.........-.......-.............133

ВЫВОДЫ---...............-........---.........136

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ - -------------..........-137

Принятые сокращения

АБС - алкилбензилсульфонаты (АПАВ)

АПАВ - анионные поверхностно- активные вещества

ВМЧ - внутримембранные частицы

ДТДМАХ - диталлоудиметиламмония хлорид (КПАВ)

ККМ - критическая концентрация мицеллообразования

КПАВ - катионные поверхностно- активные вещества

КС - клеточная стенка

JIAC - линейные алкилбензилсульфонаты (АПАВ) ЛАЭ - линейные алкильные этоксилаты (НПАВ) ЛК - лауриновая кислота ЛПС - липополисахариды

НПАВ - неионогенные поверхностно- активные вещества

ПАВ - поверхностно- активные вещества

ПЭГ - полиэтиленгликоль

CMC - синтетическое моющее средство

ХМС - хлорметилсилатран (кремнийорганическое соединение)

ЦПМ - цитоплазматическая мембрана

ЦПХ - цетилпиридиний хлорид

ЦТАБ - цетилтриметиламмония бромид (КПАВ)

ЧАС - четвертичные аммонийные соединения (КПАВ)

ЭДТА - этилендиаминтетраацетат (комплексообразующий агент)

BiAS - Bi- active substances (метод определения концентрации НПАВ)

DBAS - disulfine blue active substances (метод определения

концентрации КПАВ) ЕО -этиленоксид

MBAS - metylen blue active substances (метод определения

концентрации АПАВ) HPLC - метод высокоразрешающей жидкостной хроматографии SDS - sodium dodecyl sulfate, додецил сульфат натрия (АПАВ)

YNB - yeast nitrogen base (дрожжевая безуглеродная среда)

YNB-5G - YNB + 0,5% глюкозы

YNB-3L - YNB + 0,3% лаурокса-9

YNB-1 LA - YNB+0,1% лауриновой кислоты

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы

Одна из приоритетных задач микробиологической науки - решение экологических проблем, которые возникают в результате производства и применения в народном хозяйстве различных органических соединений, в том числе и поверхностно-активных веществ (ПАВ).

Изучение влияния ПАВ на микрофлору позволяет оценить роль этих соединений в качестве загрязнителей окружающей среды, и в свою очередь, исследования микроорганизмов-деструкторов открывают новые возможности в поиске путей интенсификации процесса деструкции ПАВ.

Оболочка клетки - это пограничная область, где происходит первичный контакт клетки с ксенобиотиками, однако, в литературе практически отсутствуют данные относительно взаимодействия клеточной оболочки дрожжей (цитоплазматическая мембрана, клеточная стенка, капсула) и ПАВ в процессе деструкции последних. Не рассматривается участие внецитоплазменных компонентов клетки в деструктивных процессах. Имеющиеся к моменту начала наших исследований методы электронно-цитохимического обнаружения гидролаз сложных эфиров жирных кислот не всегда давали воспроизводимые результаты из-за применения в качестве субстрата реакции поверхностно- активных веществ типа твинов, что, в свою очередь, могло являться источником артефактов.

Кроме того, основная часть исследований по цитологии, метаболизму, ультраструктуре дрожжевых микроорганизмов выполнена на аско-мицетных дрожжах. Однако, по мере возникновения новых практических задач, биотехнологических проблем, круг изучаемых дрожжевых организмов расширялся, в том числе за счет дрожжей, выделенных из различных источников и обладающих свойствами продуцентов биологически активных веществ, деструкторов различных ксенобиотиков и т.д.

Именно таким образом возник интерес к изучению базидиомицетного дрожжевого организма, способного к деструкции ПАВ- СгурЮсоссш Нитко1а. Результаты этих исследований представлены в данной работе. Основная часть диссертации была выполнена в лаборатории структурно- функциональной адаптации микроорганизмов Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, некоторые совместные исследования проводились в Казанском государственном университете: на кафедре микробиологии и в лаборатории биотрансформации органических соединений.

Цель и задачи исследования

Целью данной диссертационной работы являлось исследование адаптационной ультраструктурной перестройки клеточной оболочки дрожжей С.китко1а при деструкции неионогенного поверхностно-активного вещества лаурокс-9. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи.

1. Изучение ультраструктурной организации клеточной оболочки: клеточной стенки и цитоплазматической мембраны базидиомицетных дрожжей СгурЮсоссш Нит1со1а при их культивировании в стандартных условиях.

2. Изучение субстрат-зависимых изменений ультраструктуры клеточной оболочки, обусловленных процессом деструкции лаурокса-9.

3. Выявление локализации первичного этапа деструкции лаурокса-9 цитохимическими методами.

4. Определение роли экзоцеллюлярных компонентов С.Ьмгтсо1а в процессе деструкции ПАВ, возможности влияния экзоцеллюлярных компонентов на эффективность деструкции.

5. Поиск адекватного подхода электронно-цитохимической визуализации ферментов, участвующих в деструкции ПАВ.

Научная новизна исследования

Впервые проведены исследования субстрат-зависимых ультраструктурных перестроек клеток дрожжей-деструкторов неионогенного поверхностно-активного вещества лаурокс-9. В качестве микробного объекта были использованы дрожжи С. китко1а, которые способны осуществлять процесс деструкции лаурокса-9. Установлено, что наиболее существенные ультраструктурные перестройки происходят в клеточной оболочке (капсуле, клеточной стенке и ЦПМ) и цитоплазме. Отмечаются изменения деградативного характера: разрыхление и отслаивание капсулы, уменьшение толщины клеточной стенки и потеря ламел-лярности ее строения, снижение концентрации рибосом. Впервые было показано, что в качестве адаптивной реакции происходит образование петлевидных инвагинаций в ЦПМ. В области клеточной стенки и микрокапсулы показана внеклеточная локализация первичных процессов энзиматической деградации лаурокса-9 при его деструкции. Для электронно- микроскопической локализации фермента гидролиза лаурокса-9 впервые предложен новый цитохимический субстрат - 1-хлорме-тилсилатран, не имеющий поверхностно- активных свойств, и обоснована возможность применения этого субстрата для определения гидролаз широкого спектра действия у дрожжей. Впервые показана возможность переноса и функционирования ферментов гидролиза лаурокса-9 на чужеродных экзоцеллюлярных компонентах за счет иммобилизации гидролаз С.китко1а на капсуле других видов дрожжей. Явление ре-иммобилизации чужеродных ферментов на клеточных компонентах реципиентов важно для понимания взаимоотношений и функционирования природных ассоциаций микроорганизмов и в процессе ко-метаболизма.

Практическая значимость работы

Результаты исследований расширяют представления о субстратза-висимых ультраструктурных перестройках оболочки дрожжевой клетки.

Практическое значение работы также связано с тем, что изученный в качестве основного объекта работы микроорганизм является активным деструктором неионогенного ПАВ, которое используется в возрастающих количествах как один из компонентов чистящих средств. Принцип предлагаемого в работе способа усиления деструкции ПАВ путем количественного изменения содержания экзополисахаридов в смешанной культуре может быть применен на практике: в технологии очистки сточных вод и при составлении сообществ смешанных культур для их интродукции в окружающую среду. Разработанный нами электронно-цитохимический метод определения гидролаз широкого спектра действия у дрожжей отличается высокой воспроизводимостью и отсутствием артефактов (нет солюбилизирующего действия субстрата) и может быть использован цитологами для расширения арсенала их методов. Практическое значение в систематике или идентификации дрожжей может иметь обнаруженный нами факт отсутствия инвагинаций в цито-плазматической мембране у четырех изученных нами штаммов бази-диомицетных дрожжей рода Сгур1ососсш.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ I.I. Поверхностно-активные вещества как поллютанты окружающей среды 1.1.1. Общие сведения о производстве ПАВ

Производство поверхностно-активных веществ (ПАВ), которые в связи с конечной целью своего применения попадают почти в полном объеме в окружающую среду, ставит ряд проблем перед исследователями, в т.ч. в области микробиологии, биотехнологии и экологии. ПАВ (или сурфактанты) применяются в большом объеме в изготовлении детергентов, бытовых чистящих средств, средств личной гигиены и, в меньшей степени, в производстве пестицидов, гербицидов, пластмасс, а также в угольной, нефтяной, текстильной и других отраслях промышленности.

Объем производства и использования сурфактантов ежегодно растет. Производство всех ПАВ в 1982 г. в США, Зап. Европе и Японии составляло 3 920 ООО тонн; из них КПАВ составляли 8 %, АПАВ- 62%, НПАВ - 30% или 1 190 ООО тонн. В том же году выпуск всех мыло- и де-тергент-содержащих продуктов во всем мире составлял 30x106 тонн (Egli, 1988). К 1984 году эта цифра выросла до 4 млн. метрических тонн (Werdelmann, 1984). Ежегодное среднее потребление этих продуктов на душу населения меняется от 3 кг в африканских странах до 30 кг в США (Egli, 1988). В Испании годовое потребление ПАВ на душу населения составляет примерно 21 кг, что является одним из наиболее высоких показателей для Зап.Европы (Moreno et al., 1990). В 1989 г. производство детергентов в ФРГ составило 685 000 тонн (Noll, 1991).

Наиболее широко используемыми ПАВ являются анионные сурфактанты (АПАВ), которые представлены в основном линейными алкилбензилсульфонатами (ЛАС). Они применяются в бытовых и промышленных детергентах (Moreno et al., 1990). Использование анионных ПАВ в 1987 г. в США, Японии и Зап. Европе составило 1 800 000 тонн (Bryan, 1988).

Применение катионных сурфактантов (КЛАВ) в 1987 г. в Зап. Европе составляло 150 ООО тонн, а в США - 390 ООО тонн. При этом ежегодный прирост использования КПАВ составляет 4-5 %, а для остальных классов - 23% (Roes & Groot, 1988).

В последние годы заметно выросло использование неионогенных ПАВ (fflIAB). Их пенообразующая способность может быть вычислена очень точно, что делает их более предпочтительными по сравнению с АПАВ при использовании в промышленности и быту, особенно при низкотемпературной стирке , что очень важно с экономической точки зрения. Благодаря своим эмульгирующим свойствам, они широко применяются в сельскохозяйственных аэрозолях и косметических препаратах (Cain, 1981; Wagener & Schink, 1988). Производство НПАВ в Западной Европе, Японии и США в 1984 г. составляло от 300 до 400 тыс. тонн (Werdelmann, 1984). Данные по применению НПАВ в бытовых детергентах для ФРГ - 50 000 тонн (Brown et al., 1986). В свою очередь, 40 % НПАВ составляют этоксилаты жирных спиртов, которые превосходно очищают искусственные волокна, толерантны к жесткости воде, удовлетворительно функционируют при низкой температуре, их производство достигает 500 000 тонн (Hellstein, 1986; Brown et al., 1986). Объем использования других НПАВ - алкилэтоксилатов и алкилфе-нолэтоксилатов в 1987 году достигал 470 000 и 390 000 тонн соответственно (Richter & Knaut, 1988). В США ежегодное использование НПАВ превышает 250 000 тонн (Cain, 1981).

Таким образом, даже приблизительная оценка объемов производства и широты спектра применения ПАВ, которая представлена в данном разделе, позволяет представить возможные экологические последствия их применения.

1.1.2. Проблема воздействия ПАВ на окружающую среду

Сурфактанты попадают из муниципальных сточных вод в естественные водоемы и обнаруживаются в питьевой воде, почвах. Обычно сточные воды

подвергаются очистке, хотя часто ПАВ попадают в водоемы необработанными. Концентрация JIAC (АПАВ) в реках Германии меняется в пределах 0,001- 0,27 мг/л; концентрация КПАВ в реках США - в пределах 0,001- 0,092 мг/л; для Германии - от 0,004 до 0,092 мг/л. НПАВ обнаружены в реках Британии в концентрации 0,01- 1,0 мг/л; для Германии приводятся цифры: 0,01- 0,05 мг/л (Lewis, 1990).

Например, была тщательно прослежена степень загрязнения реки Рейн, и утверждалось, что уровень JIAC в реке (по данным за 1988 год) значительно ниже того уровня, когда можно ожидать отрицательного эффекта на водный биоценоз (Gilbert & Kleiser, 1988). В другой работе, токсичность ЛАС для водных биоценозов была определена с помощью тестов, в которых использовались бактерии и дафнии (Vives-Rego et al., 1991). Была исследована судьба различных КПАВ в окружающей среде, предложены более точные аналитические методы для определения КПАВ в органических стоках и неорганических осадках, показана возможность биодеградации их в воде и почве (Tauber, 1988).

Взгляд на проблему эко