Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структурно-функциональная характеристика "мышиного" токсина чумного микроба

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Структурно-функциональная характеристика "мышиного" токсина чумного микроба"

• О г С'! г "7 На правах рукописи

Мишанькнн Михаил Борисович

СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА "МЫШИНОГО" ТОКСИНА ЧУМНОГО МИКРОБА

03.00.04. - биохимия 14.00.36. - аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертация на сонскапне ученой степени кандидата медицинских паук

Ростов-иа-Доиу 1997 г.

Работа выполнена в Ростовском-на-Дону ордена Трудового Красного Знамени научно-исследовательском противочумном институте

Научные руководители: Доктор медицинских наук,

старший научный сотрудник Г.И. Васильева

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник Л.Е. Асеева

Официальные оппоненты: Заслуженный деятель науки РФ,

доктор медицинских наук, профессор В.И. Ефременко

кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник В.А. Федорова

Ведущая организация: Волгоградский научно-исследовательский

противочумный институт

Защита состоится "23 "декабря 1997 г. в_часов на заседании

диссертационного специализированного совета К 074 32 01 при Российском научно-исследовательском противочумном институте "Микроб" Министерства

здравоохранения РФ (410005, г.Саратов, Университетская ул., 46) С диссертацией можно ознакомится в научной библиотеке института

"Микроб".

Автореферат разослан " 2£>" ] 997 г

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук ЗЛ. Девдариапи

Актуальность проблемы

По данным ВОЗ, уровень заболеваемости и смертности от чумы в последние годы не имеет тенденции к снижению. Наличие природных очагов этой инфекции в России и опасность ее заноса из других стран обусловливают необходимость совершенствования специфической профилактики и лечения чумы. Успешное решение указанных проблем невозможно без знания механизмов пато- и иммуногенеза чумы и роли отдельных антигенов Yersinia pestis в этих процессах. Особый интерес в данном плане представляет "мышиный" токсин (МТ), который, несмотря на давность его открытия и длительность изучения, остается малопонятным для исследователей, занимающихся вопросами вирулентности и иммуногенности чумного микроба (Brubaker, 1979; Ефременко, 1983; Исин, Тугумбаев, 1987; Наумов и др., 1995; Куклева и др., 1996). Обширные исследования Т.С. Montie et al. (1970-1982) по структурной организации токсина не привели к окончательному решению затронутых вопросов. Исследования Т.Д. Черкасовой и др. (1988-1992) и П.А. Черепанова и др. (1991) указывают на необходимость уточнения многих моментов патогенетического действия МТ и его структурно-функциональной характеристики.

Одним из серьезных препятствий на пути углубленного изучения биологических свойств МТ, выяснения его физиологической значимости для бактериальной клетки и поиска мишеней его действия является отсутствие в распоряжении исследователей необходимых количеств гомогенного препарата токсина Использование препаратов различной степени очистки затрудняет понимание механизмов патогенетического действия МТ из-за возможного потенцирующего влияния других факторов вирулентности возбудителя. В связи с этим большой интерес представляют генноинженерный путь конструирования штамма-продуцента МТ, его характеристика, а также подбор условий выделения и очистки, обеспечивающих получение МТ в препаративных количествах.

Благодаря доказательству внехромосомной локализации гена, детерминирующего синтез МТ на собственной плазмиде pYT чумного микроба (Проценко и др., 1983), его клонированию в составе различных векторов и изучению особенностей экспрессии в разных хозяевах (Марченков и др., 1989; Черепанов и др., 1991; Дармов и др., 1992), а также секвенированию нуклеотидной (НК) последовательности гена МТ (Черепанов и др., 1991) появилась возможность более углубленного изучения этого биологически активного вещества с использованием современных молекулярно-биологических подходов. Одним из таких подходов, широко используемых в последние годы для характеристики различных белков, является исследование их первичной НК и соответствующей аминокислотной (АК) последовательностей для предсказания биологических свойств с последующей экспериментальной проверкой. Однако в отношении МТ такой анализ не проводился.

Достигнутые в последние годы успехи в изучении молекулярной организации гена МТ позволяют подойти к этому биологически активному веществу с позиций его априорной полифункциональности. В частности, молено предположить наличие у него нескольких ферментативных активностей. Од нако исследования, подтверждающие точку зрения на МТ как полифункциональный белок, до настоящего времени не проводились. Друпш современным бодходом к пониманию роли МТ в патогенезе чумы является поиск у него супер антигенных свойств, которыми обладают многие бактериальные экзотоксины: Pseudomonas aeruginosa, токсины Staphylococcus aureus (А,В,С 1, С 2, С 3, D, Е), toxic shock syndrome toxin I (TSST-I), staphylococcal exfoliative toxin, streptococcal pyrogenic toxin А и др. (Yagi, 1990; Callahan, 1990; Carlsson, 1988; Fl usher, 1989; Bauer, 1989). Суперантигены оказывают мощное воздействие на иммунную систему, дезорганизуя ее работу, что приводит к формированию иммунопатологических реакций, в том числе токсического шока Выявление суперантигенных свойств у МТ позволило бы по-новому взглянуть на механизмы его участия в патогенезе чумы.

В связи с тем, что исход заболеваний, вызываемых внутриклеточными паразитами, к которым относится и У. реБЙэ, во многом зависит от взаимодействия возбудителя с клетками фагоцитарной системы, представляет интерес влияния МТ на этот процесс, что до сих пор остается малоизученным.

Новейшие технологические достижения в области сиквенса первичных нуклеотидных последовательностей в сочетании с мощным информационным и про1раммныи обеспечением, позволяют создавать тест-системы на основе пояимеразной цепной реакции (ПЦР) с высокоспецифичными праймералш не только для идентификации различных инфекционных агентов, но и известных детерминант и маркеров вирулентности. Однако до настоящего времени не разработан метод тестирования гена МТ при помощи ПЦР, который мог бы стать существенным дополнением схемы идентификации и характеристики атипичных бесфракционных штаммов У. рея^.

Изучение перечисленных выше вопросов представляется актуальным, гак как позволяет уточнить структурную характеристику МТ, прояснить его физиологическую значимость для бактериальной клетки, определить вклад в развитие чумной инфекции, предложить высокочувствительный и специфический тест для выявления генаМТ.

Цель работы.

Структурно-функциональная характеристика МТ чумного микроба, выяснение его роли и механизмов участия в патогенезе чумы, а также разработка метода тестирования гена МТ в системе ПЦР.

Задачи исследования.

1.Провести компьютерный анализ НК и соответствующей АК последовательностей белка МТ для прогнозирования и возможного объяснения его биологических свойств.

2.Получить очищенный гомогенный препарат МТ.

3.Исследовагь ферментативные свойства МТ.

4.Выявить факторы, влияющие на летальный эффект МТ.

¿.Определить влияние МТ на клетки фагоцитарной системы

экспериментальных животных с разной восприимчивостью к этому биологически активному веществу.

б.Изучить действие МТ на клетки перевиваемых клеточных линий экспериментальных животных и человека.

7.Оценить наличие суперантигенной активности у МТ.

8.Сконструировать высокоспецифичные праймеры для тестирования гена МТ при помощи ПЦР.

Научная повита.

—Впервые выполнен компьютерный анализ НК и соответствующей АК последовательностей белка МТ Y. pestis, на основании которого предсказаны его ферментативные свойства и суперантигенная активность.

—Предложены продуцент МТ — штамм Escherichia coli DH 5а, несущий рекомбинантную плазмиду рМВ 188 с клонированным геном МТ, и выделенный из него очищенный препарат МТ.

—Доказано, что МТ представляет собой полифункциональный белок, обладающий несколькими ферментативными активностями.

—Выявлен ряд факторов, модулирующих летальный эффект МТ.

—Доказано, что МТ обладает суперантигенными свойствами и оказывает мощное воздействие на иммунную систему, дезорганизуя ее работу.

—Показано, что в патогенезе обусловленных МТ иммунопатологических реакций существенная роль принадлежит цитокинам (ИЛ-1 и ИЛ-2).

—Выявлен антифагоцигарный эффект МТ в организме чувствительных к нему экспериментальных животных.

—Предложен высокочувствительный и специфичный метод определения гена МТ при помощи ПЦР, позволяющий идентифицировать его наличие у типичных и атипичных штаммов Y. pestis.

Практическая значимость.

Впервые осуществлен компьютерный анализ НК и АК последовательностей гена и белковой молекулы МТ, позволивший составить представление о его пространственной структуре и локализации функциональных сайтов на полипептиде, провести моделирование взаимодействия отдельных доменов молекулы, объяснить ее поведение в различных условиях, а также предсказать ряд свойств МТ. Компьютерный прогноз дал возможность осуществить целенаправленный поиск наиболее существенных для МТ свойств. Экспериментально подтверждено, что МТ представляет собой белок, обладающий несколькими ферментативными активностями, и является суперантигеном, что важно для расшифровки неизвестных ранее механизмов участия этою биологически активного вещества в патогенезе чумы. Установлен антифагоцитарньш эффект МТ в организме чувствительных к нему экспериментальных животных, играющий существенную роль в развитии чумной инфекции. Заложен теоретический фундамент для поиска новых подходов к профилактике и лечению чумы.

Практическая ценность работы заключается в получении высокоочищенного препарата МТ с использованием штамма-продуцента Б. coli DH 5а, несущего рекомбинантную плаз ми ду рМВ 188 с клонированным геном МТ, а также в разработке и внедрении в практику научных исследований высокочувствительного и специфичного метода тестирования гена МТ при помощи ПЦР. Предложенный метод может быть использован для идентификации гена МТ у типичных и атипичных (в том числе бесфракционных) штаммов Y. pestis, часто появляющихся в природе на спаде эпизоотии (Кудинова, 1968). Материалы исследований легли в основу "Методических рекомендаций по выявлению "мышиного" токсина с помощью полимеразной цепной реакции" (утверждены Ученым Советом РПЧИ, 19.06.97, протокол №3).

Положения, выносимые на защиту:

1. Компьютерный анализ нуоеотидной и соответствующей аминокислотной последовательностей белка МТ позволяет прогнозировать его биологические свойства.

2. МТ является полифункциональным белком, обладающим несколькими ферментативными активностями.

3. МТ относится к группе суперантигенов и оказывает мощное воздействие на иммунную систему, дезорганизуя ее работу в организме чувствительных экспериментальных животных.

4. В патогенезе обусловленных МТ иммунопатологических реакций существенная роль принадлежит цитокинам.

5. Высокочувствительный и специфичный метод тестирования гена МТ при помощи ПЦР.

Апробация работы.

Изложенные в диссертации материалы доложены и обсуждены на конкурсе и конференции молодых ученых (1995, 1996) РНИПЧИ, а также представлены на объединенном конгрессе научных обществ (Кейптаун, ЮАР, 1997); 8-ом Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным болезням (Лозанна, Швейцария, 1997); 13-ом Европейском иммунологическом съезде (Амстердам, Нидерланды, 1997).

Структура диссертации.

Работа изложена на 172 стр. машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы, посвященной материалам и методам исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация иллюстрирована 20 таблицами и 21 рисунком. Библиография включает 276 источников, из них 106 отечественных, 170 иностранных авторов.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Материалы н методы.

В работе использовано 28 штаммов Yersinia pestis, 6 штаммов Yersinia pseudotuberculosis, 7, штаммов Yersinia enterocolitica, 5 штаммов Escherichia coli, 24 штамма других патогенных микроорганизмов, полученных из музея живых культур Ростовского-на-Дону противочумного института.

Работа выполнена на 60 беспородных морских свинках массой 250-300 г и 1470 беспородных мышах массой 16-18 г из питомника РНИПЧИ.

Материалом дая исследований служили перитонеальные макрофаги и лейкоциты, Т-лимфоциты, а также перевиваемые клеточные линии экспериментальных животных и человека различного происхождения: Jurkat, Нер-2, L 929, P3-X63/Ag 8.653.

Объектом исследования являлся препарат МТ, полученный из клеток штамма Е. coli DH 5 а, несущего рекомбинантную плазмиду рМВ 188 с клонированным геном МТ. При проведении работ, связанных с очисткой МТ, использовали комплект хромагографического оборудования фирмы LKB (Швеция). Чистоту и гомогенность препаратов МТ анализировали в системе HPLC (Gilson, Франция).

Белок определяли по методу О.Н. Lowry et al.(1951) или В. Ehresmann (1973).

Препарат МТ оценивали на наличие ферментативных активностей: амидазной (Асатиани, 1969), NAD-гликошдролазной (Barbieri et al., 1989), фосфатазной (Smilowitz et al., 1991; Асатиани, 1957), фосфодиэсгеразной (Шалот, 1968), аутофосфорилирование МТ регистрировали с помощью 32Р-АТФ (Amersham, Англия).

Выделение ДНК и постановку полимеразной цепной реакции проводили общепринятыми методами.

Летальную активность препаратов МТ оценивали по LD50 при их подколотом или внугрибркшшнном введении мышам (Ашмарин, Воробьев, 1962).

Антитоксическую сыворотку против МТ получали иммунизацией кроликов калифорнийской породы. Цикл иммунизации продолжительностью в 2 месяца включал 4 подкожных инъекции токсина (100 мкг на инъекцию) с 2-нсдельными интервалами. Забор крови осуществляли из ушной вены через 10 дней после последнего введения токсина. Титр сывороток в реакции преципитации составлял 1:16 -1:32.

Для выявления суперантигенных свойств у МТ определяли его Т-митогенную активность по интенсивности пролиферации Т-клеток в РБТЛ (Хоробрых и др., 19ВЗ), зависимость Т-акгивирующего действия МТ от экспрессии антигенов главного комплекса гистосовместимости (ГКГ) II класса методом блокады этих антигенов с помощью МКАт, а также цитокининдуцирующую активность МТ по его способности стимулировать продукцию ИЛ-1, ИЛ-2 и ФНО-а. ИЛ-1 тестировали по комитогенному эффекту — усилению пролиферации тимоцитов, стимулированных субоптимальной дозой шггогена (Клаус, 1990). Об уровне ИЛ-2 судили по усилению пролиферации 96-часовых Кон А - Т-клеточных бластов (Martensen, 1987). Активность ФНО-а определяли по цитотоксическому действию на клетки перевиваемых фибробласггов мыши L 929 модифицированным методом Н. Fish et al. (1983).

Цитотоксические свойства МТ изучали на первичной культуре перитонеальных макрофагов и лейкоцитах микроскопией окрашенных по Романовскому-Гимзе мазков (Васильева с соавт., 1984), а также на перевиваемых клеточных линиях экспериментальных животных и человека радиоизотопным методом по снижению уровня включения ^Н тимидина в ДНК клеток с помощью жидкостно-сцинтилляционного счетчика Mark II (США).

При изучении взаимодействия препаратов МТ с фагоцитами определяли поглотительную и переваривающую активности макрофагов и лейкоцитов;

шггопатическмй эффект чумного микроба при его персистенции в этих клетках (Васильева и др., 1983), а также люминол-зависимую хемилюминесценцию макро- и микрофагов (Асеева и др., 1987)

Нуклеотидная последовательность гена и аминокислотный состав белка МТ (Черепанов и др., 1991) были изучены при помощи IBM РС-совместимого компьютера и авторских алгоритмов программ DNA-sis (Hitachi ), GenePro (Hoefer Sci.instr.), результаты изображали в графическом редакторе Meta Design 4.0 (Cambridge, USA, 1989-1993) и PhotoFinish 3.0 (Zsoft, 1993, World Star Technology Center. Inc.).

Статистический анализ цифрового материала осуществляли преимущественно с помощью статистических таблиц для экспресс-обработки экспериментального и клинического материала (Стрелков, 1982): определяли значения доверительных интервалов (L), среднего арифметического (М) для уровня достоверности (Р) 99%. LD}0 определяли по модифицированной формуле Кербера (Ашмарин, Воробьев, 1962).

Результаты исследования в их обсуждение.

Одной из задач, решение которой было необходимо для достижения поставленной цели, являлся компьютерный анализ НК и АК последовательностей белка МТ для прогнозирования и возможного объяснения его биологических свойств.

Проведенное нами изучение участка НК и соответствующей АК последовательностей белковой субъединицы МТ с молекулярной массой 61кД, взятых из работы П. А. Черепанова и др. (1991), позволило получить новые данные и подтвердить ряд уже известных свойств этой биологически активной молекулы.

Субъединица тетрамерной гликопротеиновой молекулы МТ представляет собой глобулярную, в цепом гидрофильную структуру, в которой чередуются 12 участков а-спирали, 8-9 областей типа Р-складчатого листа и 23 потенциальных p-поворота пошшепгадной цепи.

Помимо обычных антигенных сайтов в молекуле МТ обнаружено несколько амфипатических структур, которые по данным С. DeLisi & J.A. Berzofski (1985), являются основной чертой антигенных сайтов для активации Т-клеток. Предсказанные эпитолы предположительно находятся между 80120,230-250,290-300 и 490-520 остатками. В составе первого и второго из них прослеживается структурный мотив X(D)(Q)NXXXXXP(I)(S)X, характерный для последовательностей, распознающих сайты связывания ГКГ II класса (Rudensky et al, 1991; Cole et al., 3995), что позволяет предположить наличие у МТ свойств, характерных для суперантигенов. Кроме того, присутствие амфипатических структур в молекуле МТ дает основание для предположения о его способности встраиваться в липидный бислой клетки с формированием трансмембранных гидрофильных пор, необходимых для транслокации полипептидных цепей или движения ионов (Титов, 1996; Montecucco et al.,1992). .

Сравнение МТ с известными аминокислотными последовательностями других белков позволило выявить между 330 и 475 аминокислотными остатками молекулы токсина фосфоэстеразный мотив XDLHX...XGDX...XGNHX, характерный для широкого спектра описанных в литературе ферментов, в том числе и для всех типов (1, 2А и 2В) фосфопротеш5-(серин/треонин)-фосфатаЗ(51опе, Dixon, 1994). Выявленный мотив подразумевает способность С-половины МТ гидролизовать фосфоэфирные связи различных субстратов, тогда как своеобразной меткой N-конца может явиться присутствие обнаруженных сайтов гликозилирования (окраска фрагмента на углеводы).

Таким образом, результаты анализа АК последовательности белка МТ позволяют рассматривать его как биологически активную молекулу, обладающую помимо летального эффекта ферментативными и суперантигенными свойствами, возможно, обусловливающими и само токсическое действие этого белка

Для экспериментальной проверки выдвинутых предположений был получен препарат высокоочшценного токсина из сконструированного нами (Гончаров и др., 1991) штамма Е. coli DH 5 а, несущего рекомбинантную плазмиду рМВ 188 с клонированным геном МТ. Плаз «.«ада рМВ 188 представляет собой обработанный рестриктазами Sma I- и Cía I- и нуклеазой SI вариант укороченного до 7.5 т.п.н. фрагмента плазмиды рМВ 12 (Марченков и др., 1989) перекпонироваяный в составе векторов pUC 18 и pUC 19 после совместной обработки эндонухлеазами Hind ID и Pst I. Отобранный вариант Б. coli DH5a характеризовался повышенным уровнем синтеза токсина. Максимальный уровень образования МТ составлял до 20-30 % от пула водорастворимых белков клетки.

Этапы очистки препарата включали сбор клеток центрифугированием и их ультразвуковую дезинтеграцию, высаливание белков из полученных лизатов сульфатом аммония при 40-60 % насыщения и кислотное осаждение белков при pH 4.6, их гель-фильграцию на колонке с ультрагелем АсА 34 и последующую хроматографию на ДЕ-52 целлюлозе.

Предложенная схема выделения и очистки токсина из штамма Б. coli DH5ot, несущего рекомбинантную плазмиду рМВ 188 с клонированным геном МТ, позволила достигать 99 % чистоты препаратов. Высокая степень гомогенности нашего рекомбинангного препарата МТ, установленная в системе HPLC и при электрофорезе в ПААГ, позволила использовать его для изучения ферментативных свойств токсина чумного микроба.

В результате проведенных исследований мы пришли к выводу, что МТ является полифункциональным белком, обладающим несколькими ферментативными активностями: аутокиназной, фосфатазной, фосфоднзстеразной, фосфолипазной, NAD-гликопидролазной и амидазной.

Аутокиназная активность заключалась в фосфорилировании остатков треонина собственной белковой молекулы.

Обнаружение неорганического фосфата в реакции с малахитовым зеленым по Smilowitch в результате воздействия МТ на разнообразные

фосфорсодержащие соединения, преимущественно при кислых значениях рН, дало основание предположить и впоследствии экспериментально подтвердить наличие фосфатазной, фосфодиэстеразной и фосфолипазной активностей.

МТ проявлял амидазную активность в отношении различных субстратов. Наибольшую способность к дезаминированшо МТ проявлял в отношении никотинамвда при щелочных значениях рН.

Большое значение, с нашей точки зрения, имеет обнаружение ]\тАО-гликогидролазной активности, которая является обязательной составной частью более сложной реакции АДФ-рибозилирования, характерной для многих токсинов.

В настоящее время описано уже большое число белков, наделенных подобными свойствами. Особенностью этой группы белков является сочетание в пределах единой полипептидной цепи супердоменов, катализирующими такие противоположнонапраленные реакции как фосфорилирование и дефосфоршшрование (Ермаков, 1993).

Профили некоторых обнаруженных нами ферментативных активностей носят обратно пропорциональный дозозаввсимый характер, свойственный для бактериальных продуктов, отнесенных к иммуномодулятсрам или модификаторам биологического ответа (СхаЫгога-Огаки, вгЕ^, 1985). Можно предположить, что МТ влияет на каскад реакций, сопровождающий начальные этапы его взаимодействия с клеткой-мишенью

Таким образом, наличие нескольких самостоятельных ферментативных активностей у молекулы МТ позволяет рассматривать его как полифункциональный белок. Дополнительным свидетельством полифункциональносги МТ является изменения в уровне присущих ему активностей при различных значениях рН среды, что объясняется важностью конформационного состояния его белковой молекулы

Обнаружение в составе двух амфипатических участков полипептидной цепи мотива, характерного для последовательностей, распознающих сайты связывания ГКГ П .класса, послужило основанием для экспериментальной

проверки выдвинутого предположения о наличии суперантигенных свойств у МТ. Анализ результатов выполненных исследований позволяет утверждать, что МТ чумного микроба является суперантигеном.-

Как и другие суперантигены, МТ индуцирует неспецифическую поликлональную активацию Т-лимфоцитов в дозе 0,01 мкг/мл, которая на несколько порядков ниже, чем у таких известных митогенов, как ФГА и Кон А. По своей Т-митогенной активности МТ превосходит Кон А в 1 200 раз, а ФГА — в 2 ООО раз. Т-активирующее действие МТ зависит от экспрессии антигенов ГКГ П класса на поверхности макрофагов и блокируется МКАт к этим антигенам, что отличает суперантигены от классических митогенов. Т-митогенная активность Кон А и ФГА в отличие от МТ не блокируется МКАт к 1а-антигенам.

Кроме того, подобно другим суперантигенам МТ является мощным индуктором синтеза и продукции цитокинов ИЛ-1, ИЛ-2 и ФНО-а.

Полученные результаты позволяют утверждать, что основными клетками-мишенями макроорганизма для МТ являются Т-лимфоциты. Обладая свойствами суперантигена, МТ вызывает поликлональную активацию этих клеток и оказывает мощное дезорганизующее воздействие на иммунную систему. Одним из возможных последствий такого воздействия могут быть острая токсичность и шок, вызываемые высокими концентрациями ИЛ-1 или ФНО-а, обладающих ауготоксичностью. Можно предположить, что летальный эффект МТ опосредован ИЛ-ном-1, высокие концентрации которого создаются в макроорганизме за счет ИЛ-1-индуцирующей активности самого МТ, а также в результате стимуляции его синтеза ИЛ-ном-2.

Вместе с тем результаты наших исследований дают основание преполагать, что и другие иммунокомпетеятные клетки, а именно макрофаги восприимчивых к МТ экспериментальных животных, могут служить мишенями для действия данного антигена Благодаря антигенпредставляющей, иммуностимулирующей и эффекторным функциям, макрофаги участвуют во всех формах иммунного ответа (Фрейдлин, 1984; Козлов, Громыхина, 1983).

Повреждение макрофагов в результате цитотоксического действия МГ дезорганизует работу иммунной системы, что приводит к формированию иммунопатологических реакций. Возможно, что одной из причин различной чувствительности мышей и морских свинок к МТ является разная устойчивость макрофагов этих животных к его действию. Так, МТ резко угнетает переваривающую способность макрофагов мышей, усиливает шггопатический эффект персистирующего в них чумного микроба и обладает выралсенным цитогоксическим действием на эти клетки, не оказывая аналогичного влияния на макрофаги морских свинок По-разному реагируют на МТ и микрофаги животных, отличающиеся между собой восприимчивостью к этому антигену. Антифагоцитарный эффект МТ в организме чувствительных к нему животных, по-видимому, является одним из механизмов участия МТ в патогенезе чумы. Наличие нескольких клеток-мишеней для действия МТ согласуется с данными о том, что МТ относится к разряду полифункциональных белков.

Таким образом, результаты наших экспериментальных исследований и данные компьютерного анализа АК последовательности белка МТ, свидетельствуют о том, что токсин чумного микроба — полифункциональная биологически активная молекула, способная вызывать нарушение метаболических процессов в клетках эукариотов и изменение их функциональной активности. .Являясь суперантигеном и обладая антифагоцитарной активностью, МТ дезорганизует работу иммунной системы, индуцируя формирование иммунопатологических реакций, определяющих его роль в патогенезе чумы, что позволяет рассматривать МТ как одну из детерминант вирулентности чумного микроба.

Патогенетическая значимость МТ определяет необходимость его тестирования в штаммах У.ревПэ, однако до настоящего времени такой метод разработан не был. Секвенирование первичной НК последовательности гена МТ (Черепанов и др., 1991) в сочетании со специализированным

программным обеспечением ("Oligo") позволили создать тест-систему на основе ПЦР с высокоспецифичными праймерами для обнаружения гена МТ.

Нам удалось сконструировать две пары праймеров Mi и Мг, в также Мз и М4, обеспечивающих амплификацию фрагментов расчетной величины в 914 и 438 пар нуклеотидов. Разработанные нами праймеры были синтезированы сотрудниками Института прикладной микробиологии МО РФ (г. Киров). Подбор оптимальных условий амплификации осуществлялся нами на модели ДНК EV-76 и рекомбинантной плазмиды рМВ 188, которые впоследствии использовали в качестве положительного контроля. Сравнительная оценка чувствительности метода при использовании внутренней и наружной пары праймеров показала, что она выше в случае применения пары внутренних М3 и М4 праймеров. "Гнездовой" вариант постановки ПЦР позволяет обнаруживать десятки-сотни микробных клеток в пробе. Специфичность этих праймеров была доказана при исследовании 41 штамма йерсшшй и 24 штаммов других микроорганизмов из музея живых культур РПЧИ.

Установлена также возможность выявления с помощью разработанного нами варианта постановки ПЦР возбудителя чумы в органах экспериментальных животных. В связи с возможностью доставки в специализированную лабораторию проб биологического материала, подлежащего исследованию методом ПЦР, в сухом и обеззараженном виде на полосках фильтровальной бумага, разработанный метод может быть использован в практике эпизоотологического обследования природных очагов чумы и, возможно, стать существенным дополнением схем идентификации бесфракционных штаммов Y. pestis, часто появляющихся в природе на спаде эпизоотии (Кудинова, 1967).

Резюмируя, представленные в диссертации, материалы следует подчеркнуть важность изучения нуклеотидной и АК последовательностей биополимеров, предшествующее экспериментальным исследованиям. В случае изучения МТ нами экспериментально подтверждены данные компьютерного анализа, позволяющие рассматривать токсин чумного микроба как

полифункциональную биологически активную молекулу, наделенную рядом ферментативных активностей и суперантигенными свойствами. Экспериментальные исследования позволили также уточнить структурную характеристику МТ, прояснить его физиологическую значимость для бактериальной клетки, определить вклад в развитие чумной инфекции и предложить высокочувствительный и специфический тест для обнаружения гена МТ,

Результаты исследований дают основание считать, что МТ является одной из детерминант вирулентности чумного микроба

ВЫВОДЫ

1. Компьютерный анализ нуклеотидной и аминокислотной последовательностей "мышиного" токсина чумного микроба позволил спрогнозировать и объяснить ряд свойств этого белка, что дало основание рассматривать его как биологически активную полифункциональную молекулу.

2. Сконструированный штамм Escherichia coli ДН5а,несущий рекомбянантную плазмиду рМВ 188 с клонированным геном "мышиного" токсина, является удобным продуцентом токсина чумного микроба, который благодаря использованной в работе схеме выделения и очистки позволяет получать препараты с высокой (97-99 %) степенью гомогенности.

3. "Мышиный" токсин обладает множественными ферментативными активностями: кияазной, фосфагазной, фосфодиэстеразной, фосфолипазной, амидазной и NAD-гликогидролазной, существенных для проявления его летальных свойств.

4. "Мышиный" токсин является суперангигеном чумного микроба, оказывающим мощное дезорганизующее воздействие на иммунную систему чувствительного животного.

5. В патогенезе индуцированных "мышиным" токсином иммунопатологических реакций у чувствительных животных ведущая роль принадлежит ИЛ-1 и ИЛ-2.

6. Антифагощттарная активность МТ в оргшшзме восприимчивых животных является одним из механизмов его участия в патогенезе чумы.

7. Разработанный способ обнаружения ДНК гена "мышиного" токсина чумного микроба с помощью ПЦР с "гнездовыми" праймерами является высокочувствительным и специфичным тестом, позволяющим идентифицировать атипичные бесфракционные штаммы Y. pestis.

Список работ, опублпконаппых по теме днссертацнк:

1. Мишанькин М.Б. Поиск возможных антигенных детерминант у "мышиного" токсина чумного микроба при помощи компьютерного анализа первичной аминокислотной последовательности. // В сб.: 48-я итоговая конференция, Ростовский медицинский институт. - 1994. - С. 15.

2.Мшнанысин М.Б. Фосфорилирующая и дефосфорилирующая активности "мышиного" токсина чумного микроба. И В сб.: 48-я итоговая конференция, Ростовский медицинский институт. - 1994. - С. 15.

3.Мишаныаш М.Б., Мишанькин Б.Н. Компьютерный анализ первичной нуклеотидной и аминокислотной последовательностей белка "мышиного" токсина Y. pestis. // Акт. пробл. проф. ООИ и природноочаг. инф. бол. -Иркутск, 1994.-С. 112-113.

4.Асеева Л.Е., М1ппанькин М.Б., Гончаров Е.К, Шевченко Л.А. Некоторые особенности действия "мышиного" токсина и антигена фракция 1 Yersinia pestis на клетки чувствительных к чуме животных. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1995. - № 2. - С.193-195.

5.Мишанькин М.Б., Асеева Л.Е., Гончаров Е.К, Мишанькин М.Б.Н> "Мышиный" токсин Yersinia pestis: некоторые ферментативные активности. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 1995. - № 12. - С.602-

б 05.

6.Гончаров E.K, Алутин И.М., Мишанькин М.Б. Штамм Ecsherichia coli

— суперпродуцент "мышиного" токсина Yersinia pestis. // Биотехнология. -1996. - №1. - С. 13-16.

7.Мишаныаш М.Б., Васильева Г.И., Козловский В.Н., Ермоленко Т.Д., Мишанькин Б.Н. Т-митогенная активность рекомбинантного "мышиного" токсина чумного микроба. // Биотехнология. - 1996. - №12. - С.27-30.

8.Mishankin М.В., Kozlovsky V.N., Mishankin B.N., Vasiljeva G.I., Verkina L.M. Proliferative response of T-lymphocytes stimulated in vitro with "murine" toxin of Yersinia pestis. // Joint Congress: FAIS/SAIS/SASFRR/ALLSA. Cape Town, South Africa, March 1997, P. 55.

9.Mishankin B.N., Vasiljeva G.I., Yeremenko T.D., Mishankin M.B., Alexejeva L.P., Kozlovsky V.N., Verkina L.M. "Murine" toxin of Yersinia pestis as a possible superantigen. // Joint Congress: FAIS/SAIS/SASFRR/ALLSA. Cape Town, South Africa, March 1997, P. 55.

10.Mishankin В., Mishankin M., Vasiljeva G., Kozlovsky V. Superantigen activity of Yersinia pestis "murine" toxin submits. // CMI. - 1997. - Vol.3. - Suppl. 2.

- P. 204. (8й1 European Congress of Clinical Microbiol and Infectious Disease; Lausanne, Switzerland, May 25-28,1997).

Отпечатано копировально-множительным центром "Колибри" Б. Садовая, 79. Тираж 100. Заказ № 65