Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Соколова, Елена Павловна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Факторы, влияющие на вирулентные свойства чумного микроба.•.

1.2. О токсине чумного микроба.

1.3. Структура и функция "мышиного" токсина (МТ) Yersinia pestis.

1.4. Структура и функция липополисахарида

ЛПС) Y. pestis.

1 .-5. Образование комплекса ЛПС-протеин как способ регуляции биологической активности бактериальных

ЛПС in vivo.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Глава 2. Материалы и методы.

2.1. Использованные штаммы бактерий, химические реактивы и питательные среды.

2.2. Методы получения препаратов капсульной субстанции

Y. pestis.

2.3. Методы получения биологически активных препаратов.

2.3.1. Получение гемолизированных эритроцитов.

2.3.2. Получение биологически активных экстрактов из селезенки свиньи.

2.3.3. Получение биологически активных диализатов из селезенки свиньи.

2.4. Метод повышения вирулентности вакцинного ' штамма Y. pestis EV 76.

2.5. Методы физико-химического анализа.

2.5.1. Количественное определение белка.

2.5.2. Электрофорез в полиакриламидном геле.

2.5.3. Гель-фильтрация.

2.6. Методы иммуноблоттйнга и дот-блоттинга.

2.7. Методы идентификации биологически активного вещества.

2. 8. Статистическая обработка данных.

Глава 3. Выяснение химической природы биологически активного вещества, присутствующего в организме млекопитающих и усиливающего вирулентные свойства бактерий чумы.

Глава 4. Биологически активное вещество как активатор токсических субстанций чумного микроба.

4.1. Значение капсульной субстанции в реализации токсических свойств Y. pestis.

4.2. Влияние биоактиватора на молекулярную организацию биополимеров капсульной субстанции чумного микроба и проявление её токсичности.

4.3. Действие биологически активного вещества на МТ и ЛПС

Глава 5. Изучение возможности образования комплекса МТ-ЛПС Y. pestis.

5.1. Оценка токсичности МТ и ЛПС Y. pestis при совместном введении препаратов экспериментальным животным.

5.2. Доказательства образования комплекса МТ-ЛПС.

5.3. Значение нативности химической структуры ЛПС чумного микроба в установлении физико-химических связей с МТ.

5.4. Изучение возможности образования комплексов ЛПС Y. pestis с различными белковыми молекулами и их функциональная активность.

5.5. Изучение возможности образования комплексов МТ с ЛПС различных грамотрицательных бактерий и их функциональная активность.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Механизмы активации токсических субстанций чумного микроба"

Актуальность проблемы.

Патогенные свойства чумного микроба, подобно иным вирулентным бактериям, зависит от способности образовывать токсин, который нарушает гомеостаз чувствительного к нему организма. Однако с момента открытия чумного микроба A. Yersin в 1894 году и до настоящего времени вопрос о том, что собою представляет чумной токсин, остается открытым. Установленным фактом является наличие у бактерий чумы двух токсических субстанций -"мышиного" токсина (МТ) белковой природы и липополисахарида (ЛПС). При этом патогенез чумной инфекции соответствует действию бактериальных эндотоксинов. Роль же специфического компонента - МТ - в этом процессе не понятна. В литературе также отсутствуют сведения о биологических механизмах регуляции этих токсических субстанций в условиях in vivo. Детальное изучение химической структуры, генетической организации и достаточно полное - биологической активности МТ и ЛПС, к сожалению, не дают возможности ответить на ряд принципиальных вопросов, а именно: изменяется ли токсичность МТ и ЛПС в организме чувствительного животного при развитии инфекции; какие биомолекулы и каким образом осуществляют их модификацию; следует ли рассматривать МТ и ЛПС чумного микроба как независимо существующие друг от друга структуры или же в условиях in vivo между ними возможно образование физико-химической и функциональной взаимосвязи.

Из многочисленных подходов, позволяющих дать ответ на интересующие нас вопросы, мы акцентировали внимание на двух направлениях исследований, которые, с нашей точки зрения, имели теоретическое и экспериментальное обоснование. Одно из них основано на общебиологическом принципе регуляции действия эндотоксинов и предполагает модуляцию токсичности бактериальных ЛПС посредством образования комплексов ЛПС с соответствующими биомолекулами (Аполлонин А. В., Schumann R. R. et al, 1990, Wrights et al., 1990, Baer M. E. et Welch R. A., 1997, Li J. er Clinkenbeard K. D., 1999). В ос8 нову второго положены экспериментальные данные, полученные А. Н. Кравцовым с соавторами (1993), о повышении вирулентных свойств бактерий чумы в условиях in vitro под влиянием вещества, присутствующего в организме млекопитающих. Молекулярные механизмы, лежащие в основе указанного феномена не изучены. Анализ работы этих авторов с большой долей вероятности позволил предположить, что факт повышения вирулентности может быть связан с усилением токсических свойств бактерий чумы. Однако, молекулярные механизмы, лежащие в основе указанного феномена, не выяснены и требуют дальнейшего изучения.

Ответы на указанные вопросы приблизят нас к пониманию природы полного токсина чумного микроба и специфичности патогенетического процесса при чумной инфекции.

Цель исследования:

Изучение возможности активации токсических субстанций Yersinia pes-tis (ЛИС и МТ) биологически активным веществом, присутствующим в организме млекопитающих, и посредством образования комплекса МТ-ЛПС. Задачи исследования:

1. Идентифицировать биологически активное вещество, присутствующее в организме млекопитающих и усиливающее вирулентность чумного микроба.

2. Изучить влияние активатора на капсульное вещество и токсические субстанции чумного микроба - МТ, ЛПС.

3. Изучить возможность образования комплекса МТ-ЛПС Y. pestis.

4. Оценить токсичность комплекса МТ-ЛПС для экспериментальных животных и роль каждого компонента комплекса- в реализации феномена токсичности

Y. pestis.

5. Экспериментально доказать образование химических связей между ЛПС и МТ и их влияние на структуру и функцию образованного комплекса. 9

6. Оценить специфичность взаимодействия ЛПС грамотрицательных бактерий и МТ чумного микроба.

Научная новизна.

Установлено, что биологически активное вещество, присутствующее в организме млекопитающих и способное повышать вирулентные свойства чумного микроба, представляет собой низкомолекулярное соединение с выраженными полярными свойствами и относится к классу гликолипидов. Доказано, что повышение вирулентности бактерий чумы под влиянием биологически активного гликолипида связано с активацией токсических субстанций, при которой изменяется молекулярная организация капсульного вещества и ЛПС Y. pestis. Впервые установлено, что МТ и ЛПС чумного микроба in vitro взаимодействуют между собой с образованием комплекса МТ-ЛПС, который обладает высокой токсичностью для экспериментальных животных (как для белых мышей, так и для морских свинок). Образование физико-химических связей между МТ и ЛПС сопровождается изменением конформации и биологической активности молекул ЛПС. В модельных экспериментах с использованием бактериальных ЛПС, МТ и ряда белков различного происхождения выяснено, что МТ является регулятором токсической активности некоторых ЛПС грамотрицательных бактерий при максимально специфичной активации ЛПС чумного микроба.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Биологически активное вещество, присутствующее в организме млекопитающих и способное повышать вирулентные свойства чумного микроба, представляет собой низкомолекулярное соединение с выраженными полярными свойствами и относится к классу гликолипидов.

2. Повышение вирулентности бактерий чумы под влиянием биологически активного гликолипида связано с усилением токсических свойств Y. pestis, которое обусловлено изменением молекулярной организацией капсульного вещества клеток и его токсических компонентов - МТ и ЛПС.

10

3. МТ и ЛПС чумного микроба in vitro могут взаимодействовать между собой с образованием комплекса, который высокотоксичен как Для белых мышей, так и для морских свинок.

4. Образование физико-химических связей между МТ и ЛПС имеет специфический характер и сопровождается изменением конформации молекул ЛПС.

5. МТ, являясь специфическим регулятором токсической активности ЛПС

Y. pestis, может образовывать комплексы и усиливать токсичность ЛПС некоторых грамотрицательных бактерий (Escherichia coli, Salmonella typhosa, Serratia marcescens), но не ЛПС Francisella tularensis. Теоретическая и практическая значимость.

Результаты выполненных экспериментов могут быть использованы при изучении молекулярных основ структурно-функциональной организации токсина чумного микроба и механизмов регуляции его активности.

Способы активации токсических субстанций бактерий чумы, описанные в работе, могут найти применение в экспериментах по этиотропной терапии при моделировании скоротечных форм чумы, а также для усовершенствования лабораторной диагностики чумной инфекции.

Материалы исследований легли в основу:

1. «Методические рекомендации по получению препаратов, повышающих вирулентность чумного микроба in vitro» / Утв. Уч. Советом РПЧИ, протокол №9 от 23.08.95./

2. «Методические рекомендации по активации токсических свойств • капсульной субстанции бактерий Y. pestis EV 76» / Утв. Уч. Советом

РПЧИ, протокол №1 от 6.02.97./

3. «Методические рекомендации по повышению эффективности биологического обогащения проб в условиях in vitro для ускоренной лабораторной диагностики чумы» / Утв. Уч. Советом РПЧИ, протокол №1 от 25. 02. 2000./

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 10 научных работ.

11

Структура диссертации.

Материал изложен на 114 страницах, иллюстрирован 10 таблицами и 14 рисунками. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, изложенйя собственных исследований, состоящих из 3 глав, заключения и выводов. Список использованной литературы содержит 152 наименований источников, в том числе 99 в отечественной, и 53 в зарубежной печати.

Диссертационная работа выполнена в рамках плановой научно-исследовательской работы "Изучение феномена повышения вирулентности чумного микроба в условиях in vitro", № гос. регистрации 003262 01. 93. 0.

Апробация работы.

Результаты работы неоднократно докладывались на научных конференциях института - конкурсах молодых учёных РПЧИ (1999, 2000), на Всероссийской конференции по современным аспектам природной очаговости, эпидемиологии и профилактике особо опасных и других заболеваний (Ставрополь, 1993.), Всероссийской научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения видного гигиениста России, профессора JI. И. Лося (Саратов, 1999.), международной конференции по инфекциям, обусловленным иерсиниями: иерсиниоз, псевдотуберкулёз и др., (С.-Петербург, 2000).

12

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Соколова, Елена Павловна

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что биологически активное вещество, присутствующее в организме млекопитающих и способное повышать вирулентные свойства чумного микроба, представляет собой низкомолекулярное соединение с выраженными полярными свойствами и относится к классу гликолипидов.

2. Выяснено, что повышение вирулентности Y. pestis под влиянием биологически активного гликолипида связано с активацией токсических субстанций - МТ и ЛПС. Показано, что под воздействием биоактиватора изменяется молекуляр

99

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В доступной нам литературе отсутствуют сведения о биологических механизмах регуляции токсичности ЛПС и МТ чумного микроба. Настоящая работа - первая попытка изучения этого вопроса. Из многочисленных подходов, позволяющих дать ответ на интересующий нас вопрос, мы акцентировали внимание на двух направлениях исследования, которые, с нашей точки зрения, имели теоретическое и экспериментальное обоснование. Одно из них основано на общебиологическом принципе регуляции эндотоксинов и предполагает модуляцию токсичности бактериальных ЛПС посредством образования комплексов ЛПС с соответствующими биомолекулами. В основу второго положены экспериментальные данные, полученные Кравцовым А. Н. с соавторами (1993). Исследователи описали феномен повышения вирулентности бактерий чумы в условиях in vitro под влиянием биологически активного вещества, присутствующего в организме млекопитающих. Анализ результатов этих экспериментов с большой долей вероятности позволил предположить, что факт повышения вирулентности может быть связан с усилением токсических свойств чумного микроба. Одна из задач нашей работы заключалась в изучении молекулярных механизмов, лежащих в основе указанного феномена. Для этого необходимо было выяснить, что собой представляет биологически активное вещество, усиливающее вирулентные свойства бактерий чумы, и какие изменения претерпевает бактериальная клетка Y. pestis под его влиянием.

Для выяснения химической природы биоактиватора были использованы различные методы препаративной и аналитической биохимии. Учитывая, что это вещество представляет собою низкомолекулярное соединение (Тынянова В. И. и др., 1994), в качестве субстрата для его выделения были использованы диализаты, полученные из экстрактов селезёнки свиньи. Сложный органический состав исходного сырья предполагал присутствие в диализате химических соединений различных классов, что и было подтверждено экспериментально. Важным шагом в понимании природы интересующего нас соединения послу

90 жили эксперименты, которые доказали, что биологически активное вещество не образует прочных химических связей с клетками бактерий, то есть, ведёт себя как амфипатические соединения, активность которых связана с перераспределением заряда на поверхности биомолекул или же с изменением фобных взаимодействий. Из низкомолекулярных веществ, присутствующих в диализате, такими свойствами могли обладать вещества липидной природы. Используя метод обращенно-фазной хроматографии, мы отделили фракцию гидрофильных веществ от гидрофобных. Как оказалось, биологически активными свойствами обладала фракция, содержащая гидрофобные соединения. Липиды этой фракции далее были экстрагированы по методу Фольча, который заключается в последовательной обработке исходного материала полярным растворителем, разрушающим липид-белковые связи и неполярным растворителем, экстрагирующим гидрофобные соединения. Анализ петролейной фракций методом ТСХ в системе растворителей для нейтральных и липидов показал, что в ней присутствовали шесть липидных компонентов. Один из них, остающийся на старте, окрашивался дифениламиновым реагентом. Различная растворимость этих липидов в органических растворителях позволила провести разделение и дальнейшую идентификацию активного вещества. Как выяснилось, фракция, растворимая в гексане, биологически не активна. Напротив, фракция, растворимая в воде, обладала чётко выраженной биологической активностью: её использование в качестве среды инкубации для клеток вакцинного штамма Y. pestis EV76 приводило к гибели 100% животных. В этой фракции методом ТСХ было идентифицировано одно вещество, которое перемещалось в системе растворителей для гликолипидов, имело значение Rf-0,64 и окрашивалось специфическим реагентом на сахара - дифениламином.

Результаты этих экспериментов позволили сделать вывод о том, что вещество, обладающее биологически активными свойствами, относится к классу гликолипидов. Дальнейшее изучение химической структуры этого соединения может быть предметом специальных исследований.

91

Следующий вопрос, на который мы попытались дать ответ - это выяснение причин повышения вирулентности бактерий чумы под влиянием биоактиватора. Данные А. Н. Кравцова (1993) о том, что эффект усиления вирулентности Y. pestis характеризуется быстротой генерализации инфекционного процесса, а инокулят, которым заражают биопробных животных, обладает выраженным токсическим действием по отношению к клеткам ПЯЛ и МФ, дали основание полагать, что в основе изучаемого феномена лежит усиление токсических свойств Y. pestis. В свою очередь, причины, приводящие к усилению токсичности, могут быть различными. Так, под влиянием биоактиватора может произойти как активация уже имеющихся токсических субстанций, так и осуществляться их синтез de novo. В любом случае общий уровень токсичности бактерий повышается, что приводит к подавлению иммунитета и беспрепятственному размножению бактерий чумы в организме чувствительного животного.

Для того, чтобы подтвердить или опровергнуть высказанное предположение о роли токсического компонента в изучаемом феномене, мы воспроизвели опыты Кравцова А. Н. с соавт. (1993) и изучили динамику гибели белых мышей на фоне генерализации инфекции и в её отсутствие. Бактериологическое исследование органов погибших животных показало, что приблизительно 50% белых мышей погибает без генерализации инфекции. Кривая, описывающая динамику гибели мышей, имеет два максимума: 1-2 сут и 5-6 сут, - что типично для токсин-цитотоксического шока. Правильность посылки о роли токсического компонента в изучаемом феномене подтверждали также результаты опытов, выполненных с мёртвыми клетками Y. pestis EV 76. В этих экспериментах установлено, что в отличие от контроля инокулят, полученный после инкубации убитых бактерий чумы в гёмолизированных эритроцитах, вызывает гибель 40 -50 % животных в течение первых двух суток. Опыты с убитыми клетками свидетельствовали также в пользу того, что роль биоактиватора заключается не в индукции, а в активации уже синтезированной токсической субстанции бактерий чумы.

92

По данным исследователей, впервые описавших этот феномен, обязательным условием его воспроизведения является использование бактерий чумы, предварительно выращенных при 37° С. Это навело нас на мысль о возможной роли капсульной субстанции в проявлении токсического эффекта Y. pestis. Известно, что капсульное вещество чумного микроба не имеет жесткой связи с поверхностными структурами бактериальных клеток, легко отделяется от них и диффундирует во внешнюю среду. С другой стороны, известно также, что в состав капсульного вещества входят токсические компоненты - МТ и ЛПС. Однако, несмотря на присутствие обоих токсических компонентов, внут-рибрюшинное введение биопробным животным капсульного вещества даже в очень высоких дозах: 100-200 мкг (по белку) на белую мышь и 1-3 мг (по белку) на морскую свинку, - не приводило к их гибели. Если же на капсульную субстанцию, отделённую от клеток, воздействовать биоактиватором, то иноку-лят становится токсичным для обоих видов животных. В отличие от кривой, описывающей гибель белых мышей при использовании интактных клеток, в данном случае максимальное количество погибает не на 1 - 2 сут, а на 5 - 6 сут. Количество павших животных при введении им активированной капсульной субстанцией бактерий чумы несколько ниже, чем при использовании целых клеток Y. pestis, и составляет 30-50%. Однако её токсичность можно усилить, воздействуя различными физико-химическими методами, которые приводят к деструкции компонентов капсульного вещества. Эффект 100%-ной гибели животных в течение первых суток наблюдается также при количественном обогащении инокулята капсульным веществом бактерий чумы. Результаты этих опытов свидетельствовали о том, что под влиянием биоактиватора капсульная субстанция может принимать участие в реализации токсических свойств Y. pestis. Амфипатические свойства биоактиватора, описанные ранее, позволили предположить, что механизм его воздействия на капсульную субстанцию заключается в изменении архитектоники биополимеров, входящих в её состав. Результаты специально выполненных экспериментов подтвердили это предположение. Так, установлено, что под действием активатора увеличивается в 2-2,5 раза вязкость

93 капсульной субстанции. При гель-фильтрации меняется профиль элюции, отмечается перераспределение пиков веществ, входящих 6 её состав, изменяются их высота и площадь. Типично появление дополнительного пика в области, соответствующей биополимерам с высокой молекулярной массой.

Возникал вопрос, ограничивается ли действие биоактиватора только этими изменениями капсульной субстанции или же он оказывает влияние непосредственно на токсические компоненты, входящие в её состав. Для проверки этого предположения с помощью биохимических методов было изучено влияние биоактиватора на МТ и ЛПС бактерий чумы. Методом гель-фильтрации в системе HPLC регистрировали конформационные изменения в молекуле ЛПС. При гель-фильтрации наблюдается увеличение в 2-2,5 раза пика, соответствующего агрегированной форме ЛПС. Методом электрофореза выявлено влияние биологически активного вещества на подвижность субъединиц ЛПС в геле. В отличие от ЛПС, подобные изменения в препарате МТ указанными методами обнаружены не были. Модельные эксперименты на животных, выполненные на белых мышах и морских свинках, показали, что биологически активное вещество усиливает токсичность как МТ, так и ЛПС. LD5o активированного ЛПС (в зависимости от серии используемого препарата) снижается в 5-10 раз, a LD50 активированного МТ уменьшается в 3-10 раз.

Капсульное вещество, как мы уже отмечали, содержит и МТ, и ЛПС. По данным денситометрического анализа содержание МТ в нём составляет 1,01,3% от общего количества белка, что подтверждено иммуноблоттингом. Количество ЛПС, рассчитанное на сухой вес капсульного вещества, равно 2,0-2,5%. Теоретический расчет показал, что под влиянием*1 биоактиватора летальным эффектом обладает инокулят, содержащий 0,052 [0,042 4- 0,063] мкг МТ и 36 [24 4- 48] мкг ЛПС для белых мышей, для морских свинок эти количественные соотношения составляют 0,5 [0,42 ч- 0,63] мкг и 360 [240 45] мкг соответственно. Столь низкие концентрации токсических веществ Y. pestis, вызывающие гибель биопробных животных, в доступной литературе не описаны. Объяснить действие нелетальных доз МТ и ЛПС только сочетанием этих двух токсических

94 субстанций не представляется возможным, поскольку заражение капсульным веществом биопробных животных в количестве, превышающем по белку обычную нагрузку в 30-50 раз (без предварительной активации), не вызывает гибель животных. Логично было предположить, что между МТ и ЛПС возможно образование структурно-функциональной взаимосвязи. В связи с этой посылкой было изучено сочетанное действие МТ и ЛПС на белых мышей и морских свинок. Установлено, что нелетальные дозы МТ и ЛПС, введенные биопробным животным после совместной инкубации, приводят к их гибели. Так, на фоне нетоксичных доз МТ нижний порог количества ЛПС, который приводит к гибели 50% белых мышей, равен 20 мкг. По мере увеличения содержания ЛПС в смеси процент гибели животных возрастает и при нагрузке 100-200 мкг составляет 100%. Нетоксичное количество ЛПС (200 мкг) для морских свинок в сочетании с нелетальными дозами МТ также приводит к гибели 50-80% животных. В зависимости от количественных соотношений токсических субстанций морские свинки погибают в течение первых 2-х сут, или же на 4-6 сут.

Примечательно, что присутствие в смеси обеих токсических субстанций оказалось существенным для гибели как белых мышей, так и морских свинок. Этот факт был подтвержден иным способом. Приём, который мы использовали, заключался в блокировании активности МТ и ЛПС в токсической смеси и в оценке их действия на биопробных животных. Для подавления активности МТ препарат прогревали в течение 5 мин при 80° С. Для блокирования ЛПС был применен известный ингибитор липида А - полимиксин В. Оказалось, что смесь МТ и ЛПС, в нативном состоянии вызывающая гибель 80-100%) биопробных животных, после прогревания становилась не токсичной для белых мышей и морских свинок. Добавление полимиксина В к смеси МТ и ЛПС также приводило к полному подавлению её токсичности.

Многочисленные научные публикации последних лет доказывают, что модуляция токсичности ЛПС в условиях in vitro осуществляется посредством образования комплексов ЛПС с соответствующими белками. Нельзя было исключить, что между МТ и ЛПС существует не только функциональная, но и

95 физико-химическая связь. Правильность этого предположения была продемонстрирована двумя способами: иммуноблоттингом и гель-фильтрацией. Методом иммуноблоттинга с применением специфических сывороток к МТ и ЛПС мы доказали связывание их между собой. Метод гель-фильтрации позволил нам не только доказать образование комплекса МТ-ЛПС, но и оценить их количественное соотношение (1:100). Установлено, что динамика изменения площадей профиля элюции ЛПС под влиянием МТ описывается логарифмической кривой, аналогичной кривой Михаэлиса, что служит прямым доказательством установления физико-химических связей между МТ и ЛПС.

Как известно, ЛПС Y. pestis относится к R-хемотипу, то есть не имеет О-специфической антигенной цепи и состоит из двух структурных единиц - коровой части и липида А. Представляло интерес выяснить, с какой частью ЛПС связывается МТ, и какую роль в образовании связей с МТ играют фосфатные и ацильные группы. С этой целью мы изучили возможность образования комплекса МТ с модифицированными формами ЛПС (ДЛПС, ЛПСР"), а также ли-пидом А чумного микроба. Детекцию комплексов проводили. методами дот-блоттинга (в нашей модификации) и иммуноблоттинга. Анализ результатов экспериментов, полученных с липидом А и с модифицированными формами ЛПС Y. pestis, показывает, что в установлении физико-химических связей между МТ и ЛПС принимает участие, по-видимому, коровая часть ЛПС, а влияние фосфатных групп не обнаружено. Из результатов экспериментов с дезацелиро-ванньщ. ЛПС следует, что для формирования антиген - антительного взаимодействия у ЛПС существенную роль играют ацильные и ацилоксиацильные группы липида А. Более того, установленный нами ранее факт, что МТ, соединяясь с ЛПС, способен изменять конформацию его молекул, нашёл подтверждение в данном исследовании.

Далее мы попытались выяснить, насколько специфична взаимосвязь между МТ и ЛПС. В этих экспериментах, помимо МТ, были использованы коммерческие препараты различных белков: бычий и человеческий сывороточные альбумины, цитохром С и мышиный у- глобулин. Как было выяснено, смеси

96

ЛПС чумного микроба со всеми перечисленными белками в концентрациях, превышающих таковую МТ в 15 раз для белых мышей и в 2 раза для морских свинок, не токсичны.

В следующей серии экспериментов мы изучили возможность образования комплекса МТ с ЛПС различных видов бактерий. В работе были использованы коммерческие препараты ЛПС: Е. coli, S. typhosa, S. marcescens, а также ЛПС F.tularensis 3-х типов (R-, SR- и S- хемотипов). О возможности образования комплексов между МТ и бактериальными ЛПС судили по результатам дот-блоттинга (в нашей модификации). Присутствие МТ в комплексе выявляли с помощью специфических сывороток к МТ. Проведенные исследования показали, что МТ способен образовывать комплексы как с ЛПС R- хемотипа Y. pestis, так и с S-ЛПС других видов грамотрицательных бактерий. При этом О-антигенная цепь S-ЛПС не препятствует формированию физико-химических связей между МТ и ЛПС. Исключение составлял ЛПС F. tularensis, который не образует связь с МТ. Соединение ЛПС Е. coli, S. typhosa, S. marcescens с МТ, подобно ЛПС Y. pestis, сопровождалось усилением токсичности образующихся комплексов. Наименьшей токсичностью, по нашим данным, обладал комплекс МТ-ЛПС S. marcescens, а наибольшей - МТ-ЛПС Y. pestis.

Нельзя исключить, что ЛПС-белковые взаимодействия являются общим принципом реализации эндотоксической активности ЛПС грамотрицательных бактерий в условиях in vivo. При образовании комплекса ЛПС с соответствующими модулирующими белками изменяется конформация ЛПС, что, по-видимому, отражается на токсичности комплекса. Это предположение согласуется с мнением Mayer К. P. et al. (1990), которые считают, что для проявления эндотоксической активности мономеры ЛПС должны иметь определённую "эн-дотоксическую" конформацию. Образование такой "активной" конформации могут обеспечивать не только определённые химические группы блоков ЛПС, но и специфические белки, образующие с ним комплекс (Bauer М. Е. et Welch R. А., 1997). К таким белкам для ЛПС чумного микроба можно отнести МТ. Его

97 соединение с ЛПС Y. pestis, по-видимому, высокоспецифично и обеспечивает максимально возможную "эндотоксическую" конформацию молекул ЛПС.

Таким образом, в результате проведенной работы было установлено, что токсические субстанции бактерий чумы могут быть активированы двумя способами: воздействием биологически активного гликолипида, присутствующего в организме млекопитающих, и посредством образования комплекса МТ-ЛПС. Весьма вероятно, что оба механизма активации в условиях in vivo имеют причинно-следственную связь. Так, экспериментальные данные, полученные нами, позволяют предположить, что МТ и ЛПС, присутствующие в капсульном веществе бактерий чумы, пространственно разобщены. Если же допустить, что МТ-ЛПС существуют в природно-агрегированной форме, то вероятнее всего их активные центры экранированы или же нейтрализованы связями с соседними молекулами. Для образования функционально активного комплекса необходим разрыв слабых связей, изменение конформации биополимеров в той пространственной ориентации, которая позволяет установить иные слабые взаимодействия между. МТ и ЛПС, обеспечивающие максимально токсическую конформацию ЛПС. При развитии инфекционного процесса под влиянием биоактиватора, видимо, изменяется молекулярная организация поверхностных структур клеток, в результате чего становится возможным образование функционально активного комплекса МТ-ЛПС, который, с нашей точки зрения, можно рассматривать как полный токсин чумного микроба.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Соколова, Елена Павловна, Ростов-на-Дону

1. Авроров В. П., Герасюк Л. Г., Бардых И. Д. Продолжительность циркуляции и выведения мышиного токсина чумных микробов почками чувствительных и резистентных к нему животных // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1970.-Вып. 5.-С. 61-65.

2. Анисимов А. П. Молекулярно-генетические механизмы образования и функциональная значимость капсулы Yersinia pestis: Автореф. дис. . д-ра мед. наук Саратов, 2000. - 38 с.

3. Анисимов П. И., Можаров О. Т., Шведун Г. П., Савостина Е. П. Генетические элементы патогенности и молекулярные механизмы фенотипического выражения вирулентности йерсиний // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1993. -№1-2. -С. 57-66.

4. Анисимов П. И., Сердобинцев Л. Н., Иванов Ю. В. и др. Некоторые физико-химические особенности капсульного белка чумного микроба // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1987. -№2. - С. 24-27.

5. Апарин Г. П., Голубинский Е. П, Микробиология чумы: Руководство. Ир-, кутск: Изд-во Иркутского ун-та, 1989. -91 с.

6. Аполлонин А. В., Яковлев М. Ю., Рудик А. А., Лиходед В. Г. Эндотоксин-связывающие системы крови // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммуноби-ол.- 1990-№11.-С. 100- 106.

7. Атчабаров Б. Б. Естественная изменчивость чумного микроба: Автореф дис. . д-ра мед. наук. — Алматы, 1995. -46 с.

8. Ашмарин И. П., Воробьев А. А. Статистические методы в микробиологических-исследованиях. М., 1962. - 180 с.

9. Балаховский С. Д., Балаховский И. С. Методы химического анализа крови. -М.: Медгиз, 1953. 746 с.

10. Ю.Бахрах Е. Э. О структуре соматических антигенов чумного микроба // Вестн. АМН СССР. 1973. - №11. - С. 71 - 76.100

11. Бейер А. П., Грижебовский Г. М., Евченко Ю. М., Брюханова Г. Д. Изучение психрофильности возбудителя чумы // Матер, межгос. науч. конф. «Проф. и меры б-бы с чумой», посвящ. 100-лет. откр. возбуд. чумы. Алматы, 1994. -С. 74.

12. Белов JI. Г. Системные функциональные расстройства при эндотоксикозе // Матер, науч.-практ. конф., посвящ. 100-лет образов, противочум. службы России. Саратов, 1997. - Т. 1. - С. 183 - 184.

13. Белов JL Г. Токсикология бактериального липополисахарида // Там же С. 184-185.

14. Берлин A. JI. Краткое руководство по борьбе с чумой для медицинских работников- М.: Медгиз, 1944. 76 с.

15. Беспалова И. А., Пустовалов В. JL, Львов В. Л. и др. Получение и некоторые свойства модифицированного производного липополисахарида чумного микроба // Биотехнология 1995. - № 9-10. - С. 31 - 34.

16. Беспалова И. А. Выделение и исследование некоторых свойств липополисахарида чумного микроба //Вестн. Всесоюз. микробиол. об-ва. (Рост, отд.) -Ростов-на-Дону, 1989.-Вып.1.-С.114-117.

17. Беспалова И. А. Иммунохимическая и биологическая характеристика модифицированных производных липополисахарида чумного микроба: Авто-реф.: дис. . канд. биол. наук. Ростов-на-Дону, 1995.-23 с.

18. Биохимические методы исследования в клинике (справочник) /Под ред. А. А. Покровского. М.: Медицина, 1969. - 652 с.

19. Бондаренко В.М., Шахмарданов М.З. Современные представления о моле-кулярно-биологических основах патогенеза шигеллёзов // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1998. - №6. - С. 88 - 92.

20. Брандзишевский Ю. В., Космаенко О. М., Пономарёв Н. Г., Филиппов А. Ф. Использование метода диализного культивирования для получения фракции чумного микроба // Биохимия, патофизиол. и микробиол. особо опасн. инф. Саратов, 1983. - С. 43 - 47.101

21. Васильева Г. И., Беспалова И. А., Киселева А, К., Ермоленко Т. Д. Моноки-ниндуцирующая активность липополисахарида и его детоксицированных производных//Биотехнология-1995. -№9-10. С. 27-30.

22. Васильева Г. И. Роль взаимодействия чумного микроба с клетками системы мононуклеарных фагоцитов в реализации вакцинного и инфекционного процессов: Автореф. дис. . д-ра мед. наук. Саратов, 1990. - 40 с.

23. Вейнблат В. И. Антигены Yersinia pestis (биохимические и иммунологические аспекты): Автореф. дис. . д-ра мед. наук Саратов, 1974 - 36 с.

24. Вертиев Ю. В. Токсин-опосредованная обусловленность инфекционных заболеваний // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1987. - №3. -С.86 - 93.

25. Голубинский Е. П., Борсук Г. И., Зонова И. В. .и др. Активность ферментов полиморфноядерных лейкоцитов при фагоцитозе чумы // Проф. природно-очаг. инф. Ставрополь, 1983. - С. 183 - 185.

26. Гончаров Е. К., Алутин И. М., Мишанькин М. Б. Штамм Escherichia coli -суперпродуцент «мышиного» токсина Yersinia pestis // Биотехнология. -1996.-№1.-С. 13-16.

27. Грачёв С. В., Якунин Г. А., Новачадов В. В., Ярошенко И. Ф. Гемостаз и лимфостаз при эндотоксемии (обзор литературы) // Клин. лаб. диагностика. -1992.-№7-8.-С. 6-10

28. Гремякова Т. А., Фомченков В. М., Фурсова Н. К., Волковой К. И. Сравнительная характеристика физико-химических свойств липополисахаридов Yersinia pestis и R-мутантов энтеробактерий // Микробиология. 1996. - Т. 65, №6. - С. 763 -767.

29. Дальвадянц С. М., Земцова И. Н., Белобородов Р. А. и др. Биологическая активность эндотоксина чумного микроба // Проф. особо опасн. инф. Саратов, 1980. - С. 31 - 33.

30. Дальвадянц С. М. Характеристика соматических антигенов чумного микроба, изолированных по методу Буавена и Вестфаля-Людерица: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1968. - 16 с.

31. Дмитровский А. М. Токсический компонент патогенеза чумного инфекционного процесса: инфекционно-токсический шок // Матер, межгосуд. научн. конф. "Проф. и меры б-бы с чумой", посвящ. 100-лет. откр. возб. чумы. -Алматы, 1994.-С. 15- 16.

32. Дмитровский А. М. Токсический компонент патогенеза чумного инфекционного процесса: синдром диссеминированного внутрисосудистого свёртывания // Там же. С. 16 - 17.

33. Домарадский И. В. Очерки патогенеза чумы М.: Медицина, 1966. - 271 с.

34. Домарадский И.В. Чума. М.: Медицина, 1998 - 176 с.

35. Дорошенко Е. П., Васильева Г. И., Киселёва А. К. Вирулентность штаммов Yersinia pestis, прошедших культивирование в перитонеальных макрофагах морских свинок // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1996. -№1.-С. 14-16.103

36. Дробышева Т. М. Факторы, влияющие на установление в популяции чумного микроба вирулентных вариантов // Проф. особо опасн. инф. Саратов, 1976. - №1. - С.39 -48.

37. Евстегнеев В. И., Чичерин Ю. В., Бывалов А. А. и др. Иммуногенная активность «мышиного» токсина чумного микроба в эксперименте на животных // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1981. - №3. - С. 39 - 42.

38. Езепчук Ю. В. Биомолекулярные основы патогенности бактерий М.: Наука, 1977. - 215 с.

39. Ефременко В. И., Метлин В. Н., Рыбкин В. С. Молекулярная организация термолабильных токсинов возбудителя чумы // Иммунол. и иммунопроф. чумы и холеры: Тез. докл. Всесоюз. конф. Саратов, 1980. - С. 34 - 36.

40. Желтенков А. И. О токсине чумного микроба и антитоксических противочумных сыворотках // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 1946. -№3.-С. 81-82.

41. Иннокентьева Т. И. Повышение вирулентности и изменение других свойств чумного микроба при пассировании его через организм монгольских пищух Горного Алтая: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Иркутск, 1969. - 22 с.104

42. Иннокентьева Т. И., Тарасова В. Е. Изменение вирулентности чумного микроба при пассировании на монгольских пищухах // Носители и переносчики возб. особо опасн. инф. Сибири и Д. Востока. Иркутск: Изд-во Иркутского ПЧИ, 1968. - Т. 27. - С. 439 - 449.

43. Кейтс М. Техника липидологии. Выделение, анализ и идентификация липидов. -М.: Мир, 1975, 322 с.

44. Книрель Ю. А., Кочетков Н. К. Строение липополисахаридов грамотрица-тельных бактерий. I Общая характеристика липополисахаридов и структура липида А. (Обзор) // Биохимия 1993. - Т. 58. - Вып. 2.-е. 166-181.

45. Кравцов А. Н., Тынянова В. И., Зюзина В. П. Повышение вирулентности бактерий Yersinia pestis при инкубации клеток в гемолизированных эритроцитах крови человека. // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. -1993-№4.-С. 3-6.

46. Криваченко К. Б. Биосинтез некоторых антигенов при лимитировании роста Yersinia pestis // Журн. микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 2000. - №1. -С. 86-88.

47. Кроткова М. Р. К методике изучения фагоцитарной реакции в культуре ткани // Лаб. дело 1971. -№7. - С. 421 - 423.

48. Куклева Л. М. Фагоцитоз перитонеальными и альвеолярными макрофагами штаммов возбудителя чумы, отличающихся по вирулентности и антигенному составу: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1989. - 24 с.

49. Куклева Л. М., Кутырев В. В., Проценко О. А. Молекулярно-генетические аспекты инвазивных и антифагоцитарных свойств патогенных йерсиний // Мол. генет., микробиол. и вирусол. 1996. - №1. - С.11 - 16105

50. Кулыиин В. А., Яковлев А. П., Аваева С. Н., Дмитриев Д. А. Улучшенный метод выделения липополисахаридов из грамотрицательных бактерий // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1987. - №5. С. 44 - 46.

51. Ледванов Ю. М., Карниел Э., Тихонов С. Н. и др. Изучение экспрессии генов, получение и иммунобиологические свойства железорегулируемых мембранных белков чумного микроба // Мед. паразитол. и паразитар. бол. -1995.-№4.-С. 23-26.

52. Малинина 3. Е. Изучение возбудителя чумы с различным набором детерминант вирулентности в организме белых мышей, обработанных сернокислым закисным железом // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1972. - №3 (25) -С. 99-103.

53. Марченков В. И., Скопич А. А., Алутин И. М., Бородина Т. Н. Выделение «мышиного» токсина чумного микроба методом иммуносорбции // Генетика и биохимия вирулент. возб. особо опасн. инф.: Тез. докл. Волгоград, 1992. -С. 111.

54. Мельников И. Ф. О судьбе Р+ и Р" вариантов возбудителя чумы в организме больших песчанок и блох Xenopsylla gerbilli caspica // Пробл. особо опасн. инф. Саратов, 1970. - Вып 2 (12) - С. 55 -57.

55. Метлин В. Н. Изучение токсинообразуюгцей способности различных штаммов P. pestis с помощью моноспецифической антитоксической сыворотки. // Генетика, биохимия и иммунохимия особо опасн. инф. Ростов-на-Дону, 1967.-С. 297-304.

56. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике М.: Мир, 1976. - 436 с.106

57. Мишанькин Б. Н. Интегративный характер вирулентности Yersinia pestis // Журн .микробиол., эпидемиол. и иммунобиол. 198?. - №2. - С. 102 - 108.

58. Мишанькин М. Б. Структурно-функциональная характеристика «мышиного» токсина чумного микроба: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Ростов-на-Дону, 1997. - 20 с.

59. Наумов А. В., Кузьмиченко И. А., Тараненко Т. М. и др. Биохимические аспекты патогенности возбудителя чумы // Медицинская паразитол. и паразит, бол.-1995.-№4.-С. 17-22.

60. Наумов А. В., Ледванов М. Ю., Дроздов И. Г. Иммунология чумы: Руководство. Саратов, 1992. - 172 с.70.0стерман Л. А. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот. Электрофорез и ультрацентрифугирование. Практическое пособие. Наука, 1981,-286 с.

61. Практикум по биохимии / Под ред. С. Е. Северина, Г. А. Соловьева. М.: Изд-воМГУ, 1989.-С. 73.

62. Практическая химия белка / Под ред. Л. Дарбе. М.: Мир, 1989. - 623 с.

63. Препаративная биохимия липидов. -М.: Наука, 1981.-С. 212.

64. Проценко О.А., Анисимов П.И., Можаров О.Т. и др. Выявление и характеристика плазмид чумного микроба, детерминирующих синтез пестицина 1, антигена Ф1 и экзотоксина "мышиного" токсина // Генетика. 1983. —Т. 19, №7.-С. 1081-1090.

65. Рожков К. К., Киселёва А. К., Гамлешко X. П., Марченков В. И. Влияние «мышиного» токсина чумного микроба на культуру макрофагов экспери107ментальных животных // Вестн. Всесоюз. Микробиол. об-ва (Рост. отд.). -Ростов-на-Дону, 1989. Вып. 1. — С. 110—113.

66. Руднев Г. П. Клиника чумы М.: Медгиз, 1940. - 270 с.

67. Рябиченко Е. В., Бондаренко В. М. Механизмы синергического летального действия липополисахарида энтеробактерий и стафилоккокового энтероток-сина типа А // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1998. - №4. -С. 80-85.

68. Самыгин В. М., Зыкин JI. Ф., Степанов В. М. и др. Газохроматографический анализ жирнокислотного состава Yersinia pestis // Журн. микробиол. эпиди-миол. и иммунобиол. 1994. - №4 - С. 10 - 13.

69. Сердобинцев Л. Н., Тараненко Т. М., Терентьев С. А., Наумов А. В. К вопросу о макромолекулярной организации капсульного антигена // Диагн. и проф. особо опасн. инф. Саратов, 1983. - С. 39 - 44.

70. Справочник по клиническим лабораторным методам исследований // Под ред. Е. А. Кост. М.:Медицина, 1975. - 383 с.

71. Степин А. А., Самыгин В. М., Черченко И. И. Жирнокислотный состав клеток и липидсодержащих компонентов вакцинных штаммов чумного микроба // Акт. вопр. проф. опасн. инф. забол.: Тез. докл. к Межвед науч. конф. -Киров, 1991.-С. 166-167.

72. Стукова Н. Ю. Изменения функциональной активности кислородзависимых бактерицидных систем фагоцитов при взаимодействии с чумным микробом и его антигенами: Автореф. дис. канд. мед. наук. Саратов, 1991 - 26 с.

73. Тараненко Т. М., Ермакова Т. В., Андреева И. П. и др. Структурно-функциональное изучение гликолипидного токсина чумных и псевдотубер108кулёзных иерсиний // Микробиол., биохимия и спец. проф. карантин, инф. -Саратов, 1990.-С. 49-51.

74. Тараненко Т. Т., Вейнблат В. И. Современные представления о структуре О-соматических антигенов чумного микроба // Иммунохимия и лаб. диагностика особо опасн. инф. Саратов, 1985. - С. 10-17.

75. Тараненко. Т. М. Углеводсодержащие антигены чумного и псевдотуберкулезного микробов ( теоретические и прикладные аспекты): Автореф. дис. . д-ра биол. наук. Саратов, 1988. - 41 с.

76. Тынянова В. И., Кравцов А. Н., Зюзина В. П. Изучение феномена повышения вирулентности бактерий Yersinia pestis в условиях in vitro // Генетика и биохимия вирулент. возб. особо опасн. инф.: Тез. докл. Волгоград, 1992. -С. 138.

77. Фёдорова В. А., Девдариани 3. JI, Изучение антигенных детерминантов ли-пополисахарида Yersinia pestis с помощью моноклональных • антител // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. -1998. -№3. -С. 22 26.

78. Хроматографии в тонких слоях / Под ред. Э. Шталь. М.: Мир, 1965. - 508 с.

79. Хроматография. Практическое приложение метода / Под ред. Э. Хефтман. -М.: Мир, 1986.-Т. 1.-336 с.109

80. Черепанов П. А., Михайлова Т. Т., Каримова Г. А. и др. Клонирование и детальное картирование Fra утГ-области плазмиды pFra Yersinia pestis // Мол. генетика, микробиол. и вирусол. 1991. - №12. - С. 19-26.

81. Черкасова Т. Д., Юркив В. А., Покровский В. И. Регуляция аденилатциклаз-ной системы лёгких крыс при чумной интоксикации // Бюл. экспер. биол. и медицины. 1994. -№3. - С. 278 - 280.

82. Шанина JI. Н. Характеристика вариантов чумного микроба, не продуцирующих капсульного антигена и "мышиного" токсина: Автореф. дис. . канд. мед. наук. Саратов, 1967. - 23 с.

83. Шеремет О. В., Бошнаков Р. Б., Харабаджахян Г. Д. и др. Жирнокислотный состав Yersinia pestis при выращивании на различных питательных средах в условиях 28° и 37° С // Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол. 1994. -№6.-С. 16-18.

84. Яровая JI. М., Алёшкин В. А. Новые данные о химической структуре липополисахаридов и практические перспективы // Журн. микробиол. эпидемиол. и имммунобиол. 1991. - №3. - С. 73 - 78.

85. Albizo J. М., Surgalla М. J. Isolation and biological characterization Pas-teurella pestis endotoxin // Infect. Immun. 1970. - Vol. 2, №3. - P. 229 - 236.

86. Baker E., Sommer H., Foster L. et al. Studies on immunisation against plague. I The isolation and characterization of the soluble antigen of Pasteurella pestis // J. Immunol. 1952. - Vol. 68, №2. - P. 131 - 145.

87. Bauer M. E. et Welch R. A. Pleiotropic effects of a mutation in rfac on Escherichia coli hemolisin //Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, №6. - P. 2218 -2224.

88. Brown S. D., Montie Т. C. Beta-adrenergic blocking activity of Yersinia pestis murine toxin // Infect. Immun. 1977. - Vol. 18, №1. - P. 85 - 93.110

89. Brubaker R. Factors promoting acute and chronic diseases caused by Yersiniae //Clin. Microbiol. Rev. 1991.-Vol. 4,№3.-P. 309 -324.

90. Burrows Т. M. Virulence of Pasteurella pestis and immunity to plague // Er-gebnisse Mikrobiol. Immunitatsforch Exp. Therapia 1963. - Bd. 37. - S. 59 -113.

91. Buttler T. Plague and other Yersinia infections // Plenum Med. Book. Company New York and London 1983. Chapter 5. Pathogenesis and Toxins - P. 100 -159.

92. Carniel E., Mazigh D., Mollaret H. H. Expression of iron- regulated proteins in Yersinia species and their relation to virulence // Infect. Immun. 1987. - Vol. 55, №1.-P. 277-280.

93. Dalla Venezia N., Minka S., Bruneteau M. et al. Lipopolysaccharides from Yersinia pestis. Studies on lipid A. lipopolysaccharides I and II // Eur. J. Bio-chem. 1985. - Vol. 151, №2. - P. 399 - 404.

94. Davies D. A. A specific polysaccharide of Pasteurella pestis // Biochem J. -1956. Vol. 63, №1. - P. 105 - 116.

95. Drozdov I. G., Anisimov A. P., Samoilova S. V. et al. Virulent non-capsulate Yersinia pestis variants constructed by insertion mutagenesis // J. Med. Microbiol. 1995. - Vol. 42. - P. 264 -268.

96. Dubois M., Gilles K. A., Hamilton J. K. et al. // Anal. Chem. Vol. 28, №3, -P. 350-356.

97. Ehresmann В., Inibault P., Weil J. H. Spectrophotometric determination of protein concentration in cell extracts containing t-RNA's and r-RNA's // Anal. Biochem. 1973. - Vol. 54, №2. - P. 454 - 463.1.l

98. Elass-Rochard E., Legrand D., Salman V. S. et al. Lactoferrin inhibits the endotoxin interaction with CD-14 by completion with lipopolysaccharide binding protein // Infect. Immun. - 1998. - Vol. 66, №2. - P. 483 - 491.

99. Farley M. M., Shafer W. M., Spitznagel J. K. Lipopolysaccharid structure determines ionic and hydrophobic binding of a cationic antimicrobial neutrophil granule protein // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, №6. - P. 1589 - 1592.

100. Feingold K. R., Funk J. L., Moser A. N. et al. Role for circulating lipoproteins in protection from endotoxin toxicity // Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, №5. -P. 2041-2046. :

101. Glosnicka В., Gruszkiewicz E. Chemical composition and biological activity of the Yersinia pestis envelope sibstance // Infect. Immun. 1980. - Vol. 30, №2. -P. 506-512.

102. Goodner K., Pannel L., Bartell P. et al. Toxic end products from P. pestis. I. A comparison of lysate toxin with obtained from the action of bile salts // J. Infect. Dis. 1955. - Vol. 96, №l - p. 82 - 87.

103. Guan K. and J. E. Dixon Protein tyrosine phosphatase activity of an essential virulence determinant in Yersinia // Science. 1990. - Vol. 249, №4968. - P. 553 -556.

104. Hartley J. L., Adams G. A., Tornabene T. G. Chemical and physical properties of lipopolysaccharide of Yersinia pestis // J. Bacteriol. 1974. - Vol. 118, №3. -P. 848- 854.

105. Hinnebusch J., Cherepanov P., Du Y. et al. Murine toxin of Yersinia pestis shows phospholipase D activity but is not required for virulence in mice // Int. J. Med. Microbiol. 2000. - №290. - P. 483 - 487.

106. Kitchens R. L., Munford R. S. CD-14 dependent internalization of bacterial lipopolysaccharide (LPS) is strongly influenced by LPS aggregation but not by cellular responses to LPS // Immunol. - 1998. - Vol. 160, №4. - P. 19.20 - 1928.

107. Laemmli U. K. Most commonly used discontinuous buffer system for SDS electrophoresis // Nature. 1970. - Vol. 227. - P. 680.112

108. Leung К., Straley S. The Yop M gene of Yersinia pestis encodes a released protein having homology with the human platelet surface protein GPIba // J. Bacterid. 1989. - Vol. 171, №9. - P. 4623 - 4632.

109. Li J., Clinkenbeard K. L. Lipopolysaccharide complex with Pasteurella haemolytica leukotoxin // Infect. Immun. 1999. - Vol. 67, №6. - P. 2920 -2927.

110. Lowry О. H. Rosebrough N. J., Farr A.Z., Randall R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent // J. Biol. Chem. 1951. - Vol. 193, №1 - P. 265 -275.

111. Mayer K. R., Truchot А. Т., Ward J. et al. // Cellular and molecular aspects of endotoxin reactions. Amsterdam: Elsevier. 1990. - P. 145-156

112. Merrie C. R., Goldman D., Sednan S. A, Ebert M. H. Ultrasensitive stain for proteins in polyacrylamid gels shows regional variation in cerebrospinal fluid protein // Science. 1981. - Vol. 211, №4489. - P. 1437 - 1438.

113. Montie Т. C. Preparation of Yersinia pestis plague murine toxin // Methods in enzymology- 1988.-Vol. 165.-P. 162-168.

114. Montie Т. C., Ajl J. I. The anatomical distrubution of murine toxin in sphero-plasts of Pasteurella pestis // J. Gen. Microbiol. 1964. - Vol. 34, №2. - P. 249 -258.

115. Montie Т. C., Ajl S. J. Nature and synthesis of murine toxins of Pasteurella pestis // Microbiol toxins / Ed. Т. C. Montie, S. J. Kadism New York, 1971 -Vol.3.-P. 1-37.

116. Montie Т. C., Montie D. B. Selective detoxification of murine toxin from Yersinia pestis. Reaction of heavy metals with essential surfhydryl and triptophan residues // Biochemistry (Wach) 1973. - Vol. 12, №24. - P. 4958 - 4965.

117. Montie Т. C., Montie D.B., Ajl J. I. The identification and isolation of two mouse toxic proteins from Pasteurella pestis // J. Exp. Med. - 1964. - Vol. 120, №6.-P. 1201-1213.113

118. Munford R. S. Enzymatic deacylation of bacterial lipopolysaccharides by human neutrophils and murine macrophages // Bacteria host cell interaction. -New York, 1988. - P. 123 - 140.

119. Prior J. L., Hitchen P. G., Williamson E. D. et al. Characterization of the lipo-polysaccharide of Yersinia pestis // Microbial Pathogenesis 2001. - Vol. 30. -P. 49 -57.

120. Reisner B.and Straley S. Yersinia pestis Yop M: trombin binding and over expression // Infect. Immun. 1992. - Vol. 50, №60. - P. 5242 - 5252.

121. Rosquist R., Bolin I., Wolf-Watz H. Inhibition of phagocytosis in Yersinia pseudotuberculosis: a virulence plasmid-encoded ability involving the Yop 2b protein // Infect. Immun. 1988. - Vol. 56, №8. - P. 2139 - 2143.

122. Rosquist R., Forsberg A., Wolf-Watz H. Intracellular targeting of the Yersinia Yoh E cytotoxin in mammalian cells induces actin microfilament disruption // Infect. Immun. 1991. - Vol. 59. - P. 4562 - 4569.

123. Rudolph A. E., Stuckey J. A., Zhao Y. et al. Expression, characterization, mutagenesis of the Yersinia pestis murin toxin, a phospholipase D superfamily member //J. Biol. Chem. 1999, №274 (17). - P. 11824 - 11831.

124. Samoilova S. V., Samoilova L. V., Yezhov I. N. Et al. Virulence of pPst+ and pPsf strains of Yersinia pestis for guinea-pigs // J. Med. Microbiol. 1996. -Vol. 45,-P. 440-444. :

125. Sandstrow G., Sjostedt A., Johansson, T. et al. Immunogenicity and toxicity of lipopolysaccharide from Francisella tularensis LVS // FEMS Microbiol. Immunology. 1992. - Vol. 105. -P. 201 -210.114

126. Schumann R. R., Leong S. R., Flaggs et al. Structure and function of lipopoly-saccharidt binding protein // Science 1990. - Vol. 249, №4975. - P. 1429 -1431.

127. Straley S. C. The low-Ca response virulence regulon of human pathogenic Yersinia // Microb. Pathogen. - 1991 - Vol. 10, №2. - P. 87 - 91

128. Su D., Roth R. J., Joshida M., Levin F. Hemoglobin increases mortality from bacterial endotoxin // Infect. Immun. 1997. - Vol. 65, №4. - P. 1258 - 1266.

129. Tobias P. S., J., Meadam K., Ulevitch R. Interactions of bacterial lipopolysac-charide with acute-phase rabbit serum and isolation of two forms of rabbit serum amyloid A 1 //J. Immunal. 1982. - Vol. 128, №3. - P. 1416 - 1427."

130. Towbin H., Stachelin Т., Gordon J. Electroforetic transfer of proteins from polyacrilamide gels nitrocellulose sheets: Procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - Vol. 76, №9. - P. 4350 - 4354.

131. Vogel S., Marshall S., D. Rosenstreich D. Analysis of effects of lipopolysac-charide on macrophages: differential phagocytic responses of C3H/HeN and C3H/HeJ macrophages in vitro // Infect. Immun. 1979. - Vol. 25, №1. - P. 328 -336.

132. Wake A., Morgan H. R. Host-parasite relationships and the Yersinia model // New York: Springer Verlag - 1986. - 329 p.

133. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharides extraction with phenol-water and further applications of the procedure // Methods carbohydr. Chem. -1965. Vol. 5. - P. 83 - 91.

134. Wright S. D., Ramos R. A., Tobias P. S. et al. CD-14, a receptor for complexes of lipopolysaccharide (LPS) and LPS binding protein // Science, 1990. - Vol. 249, №4975. -P 1431 - 1433.

135. Zav'yalov V., Abramov V., Cherepanov P. et al. PH 6 antigen (Psa A protein) of Yersinia pestis, a novel bacterial Fc-receptor. // FEMS Immunol. Med. Microbiol. 1996. - Vol. 14. - P. 53 - 57.