Структурная организация субдоменов интерфазных ядер и митотических хромосом

Шеваль, Евгений Валерьевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Структурная организация субдоменов интерфазных ядер и митотических хромосом
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Структурная организация субдоменов интерфазных ядер и митотических хромосом"

На правах рукописи

Шеваль Евгений Валерьевич

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СУБДОМЕНОВ ИНТЕРФАЗНЫХ ЯДЕР И МИТОТИЧЕСКИХ ХРОМОСОМ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

18 НОЯ 2013

005540био

Москва - 2013

005540608

Работа выполнена на базе НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

Научный консультант:

Доктор биологических наук, профессор

Поляков Владимир Юрьевич

Официальные оппоненты:

Заведующий лаборатории экспериментальной нейробиологии ФГБУН «Институт биологии развития имени Н.К. Кольцова» РАН, доктор биологических наук

Александрова Мария Анатольевна

Ведущий научный сотрудник лаборатории анализа изображений клеточных структур и тканей факультета фундаментальной медицины ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова», доктор медицинских наук

Буравков Сергей Валентинович

Заведующий лабораторией экспериментальной нейроцитологии Отдела исследований мозга ФГБУ «Научный центр неврологии» РАМН, доктор биологических наук

Хаспеков Леонид Георгиевич

Ведущее учреяздение: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Защита диссертации состоится « » ¿^».А^ри 2013 г. в Срна заседании диссертационного совета Д 001.004.01 "при ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы, д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН

Автореферат разослан «I \ » уи-^-Ь уА 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Михайлова Лилия Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение структурной организации субдоменов интерфазных ядер и митотических хромосом является одним из наиболее важных и активно развивающихся разделов современной биологии. Однако до настоящего времени остаются не решенными многие ключевые вопросы. Прежде всего, речь идет о проблеме компактизации ДНК в составе митотических хромосом (Q. Bian et al., 2012). За более чем столетнюю историю изучения сменилось несколько общепринятых и, как казалось, окончательных гипотез, однако уровень наших сегодняшних знаний в этом чрезвычайно важном вопросе явно недостаточен.

Наибольшее распространение получили две модели, принципиально по-разному трактующие морфологию хромосом (рис. 1). Первая из них, радиально-петельная модель, была сформулирована группой У. Лэммли (U.K. Laemmli et al., 1977), и в течение двух десятилетий эта модель была общепринятой (J.R. Swedlow, Т. Hirano, 2003). Ключевая идея данной модели состоит в том, что в интерфазных и митотических хромосомах имеются скелетные структуры - ядерный матрикс (nuclear matrix) в интерфазе и хромосомный скэффолд (chromosome scaffold) в митозе, устойчивые к экстракции 2 М NaCl или полианионами. В составе митотических хромосом негистоновые белки, которые формируют скэффолд, локализуются в аксиальных областях. К скэффолду прикрепляется ДНК, формируя петлевые домены, компактизирующиеся при участии гистоновых белков (рис. 1 А).

Вторая модель, получившая широкое распространение в последнее десятилетие,

- хромонемная модель или модель иерархического фолдинга (рис. 2Б). Современная интерпретация хромонемной модели отталкивается от многократно повторенных наблюдений о существовании в составе митотических хромосом 100-130 нм фибрилл

- элементарных хромонем (Е. Sparvoli et al., 1965; Ю.С. Ченцов, В.Ю. Поляков, 1974; A.S. Belmont et al., 1989; A. Matsuda et al., 2010). Недавно было показано, что кроме хромонем в составе хромосом можно выявить еще один уровень компактизации ДНК

- фибриллы толщиной около 250 нм (Y.G. Strukov et al., 2003) или профазные хроматиды (N. Kireeva et al., 2004). Таким образом, в хромонемной модели хромосома трактуется как система иерархически соподчиненных уровней последовательной

нуклеосомнаяфибрилла(-10 нм)

нуклеомерная фибрилла(~30 нм) элементарная хромонема (-100 нм)

- профазная хроматида (~250 нм)

Рис. 1. Актуальные модели структурной организации митотических хромосом. (А) -радиально-петельная модель. Хромосомный скэффолд локализуется в осевой области хромосом и играет роль белкового скелета. Фибриллы ДНК периодически взаимодействуют со скэффолдом, образуя петлевые домены. (Б) — хромонемная модель (модель иерархического фолдинга). Данная модель рассматривает митотическую хромосому как результат последовательного сворачивания молекулы ДНК в ряд иерархически соподчиненных фибриллярных структур - нуклеосомная фибрилла, фибрилла диаметром 30 нм, элементарная хромонема, профазная хроматида.

компактизации хроматина (нуклеосомная фибрилла —► 30 нм фибрилла —» элементарная хромонема —» профазная хроматида —> метафазная хроматида).

По-видимому, различия между этими двумя моделями являются отражением экспериментальных подходов, использовавшихся для изучения структуры хромосом (A.S. Belmont, 2002). Так, хромонемная модель основана на изучении нативных хромосом при фиксации in situ, причем, основной массив информации получен при анализе структуры компактизирующихся профазных и деконденсирующихся телофазных хромосом (Ю.С. Ченцов, И.Ю. Поляков, 1974). Важные наблюдения сделаны при искусственной деконденсации метафазных хромосом (O.V. Zatsepina et al., 1983). Данные о радиально-петельной организации хромосом получены на модели обработанных экстрагирующим раствором метафазных хромосом (J.R. Paulson, U.K. Laemmli, 1977). В этом контексте чрезвычайно актуальным представляется получение экспериментальных данных о структуре ключевого компонента радиально-петельной модели, хромосомного скэффолда, на разных этапах митоза с использованием электронно-микроскопических и иммуноцитохимических методов анализа (т.е. методов, которые оптимальны для анализа нативных хромосом).

В последние десятилетия накоплен огромный объем экспериментальных данных о еще одном структурообразующем компоненте ядра - ядерной оболочке, которая во многом определяет трехмерную упорядоченность клеточного ядра и протекающих в нем процессов (V. Вийп-ЬгаеН, 2012). Механизмы формирования этого "внешнего скелета" ядра изучены слабо. Изучение этого вопроса представляется крайне актуальным, так как формирование ядерной оболочки является одной из предпосылок последующего формирования трехмерной упорядоченности внутреннего пространства интерфазного ядра.

Цель исследования

Целью настоящей работы является изучение морфологической организации и механизмов формирования и поддержания структурной целостности субдоменов интерфазных ядер и митотических хромосом.

Задачи исследования

1. Исследовать структурную организацию хромосомного скэффолда с использованием методов световой и электронной микроскопии.

2. Охарактеризовать морфологию промежуточных уровней компактизации хромосом с использованием методов полной и частичной экстракции белков хроматина.

3. Определить характер взаимодействия компонентов перихромосомного слоя с остаточными структурами на протяжении митоза.

4. Изучить эффекты гиперэкспрессии белков ламина В1, ламина А, рот 121, пс1с1 и Ьар2р на формирование ядерной оболочки и связанных с ней структур.

5. Выявить влияние высокой концентрации антигена на доступность внутренних районов ядрышка для специфических антител.

Научная новизна и практическая значимость работы

топоизомеразу На, периферический домен содержит белки перихромосомного слоя (рКл-67, фибрилларин, В23/нуклеофозмин).

Разработан и апробирован оригинальный воспроизводимый метод изучения морфологии остаточных (устойчивых к экстракции) структур на всех этапах митоза. Впервые детально охарактеризована ультраструктурная организация компонентов ядерного матрикса и хромосомного скэффолда, образованных белками перихромосомного слоя. Показано, что на всех этапах митоза существуют остаточные структуры, содержащие белки В23/нуклеофозмин и рКл-67, напротив, диффузно-распределенный нуклеоплазматический белок, не связанный со своими функциональными сайтами, под действием солевого раствора экстрагируется. Это позволяет использовать процедуры экстракции для выявления фракций белков, связанных с функциональными сайтами.

Представлены экспериментальные данные в пользу упорядоченной упаковки петлевых доменов, и получены свидетельства участия в их компактизации негистоновых белков, не входящих в состав остаточных структур. На основании полученных результатов предложена оригинальная модель организации митотических хромосом, учитывающая как существование хромосомного скэффолда и петлевых доменов, так и высших уровней компактизации хроматина (хромонем и хромомеров).

Впервые установлено, что остаточные структуры конститутивного гетерохроматина, формирующего в интерфазных ядрах фибробластов мыши хромоцентры, обладают особой ультраструктурной организацией, позволяющей отличать их от остальной сети ядерного матрикса. Ядерный матрикс фибробластов мыши состоит из четырех морфологически различимых структурных компонентов -ламина, остаточные ядрышки, внутренняя сеть ядерного матрикса и матрикс хромоцентров.

Установлено, что гиперэкспрессия отдельных белков ядерной ламины (ламина В1 и ламина А), нуклеопоринов (рот121 и пёс1) и внутренней мембраны ядерной обололочки (Ьар2Р) влияет на формирование клеточных структур. При этом могут изменяться морфологические признаки не только тех структур, в состав которых входят изучаемые белки в норме, но и связанные с ними структуры. Влияние

отдельных белков на биогенез структур свидетельствует в пользу того, что формирование ядерной оболочки происходит по пути самоорганизации.

Предложен оригинальный метод выявления белков в клеточных структурах малодоступных для антител в силу высокого содержания в них антигенов. Показана его совместимость с одновременным анализом флуоресцентных белков и с иммуноэлектронной микроскопией.

Результаты работы используются в практическом курсе "Цитогенетика" и лекционных курсах "Клеточная биология" и "Гистология" Факультета биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Хромосомный скэффолд состоит из двух структурно-обособленных доменов -аксиального и периферического.

2. Петлевые домены в составе хроматина компактизируются в упорядоченные надмолекулярные комплексы.

3. Компоненты перихромосомного слоя входят в состав остаточных структур (ядерного матрикса и хромосомного скэффолда) на протяжении всего клеточного цикла.

4. Формирование ядерной оболочки как интегрированной надмолекулярной системы происходит по типу самоорганизации.

Апробация работы

Результаты диссертационной работы были представлены на семинарах отдела электронной микроскопии НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ, на Московском семинаре по клеточной биологии, семинаре в Институте общей генетики имени Н.И. Вавилова РАН, семинаре в Институте молекулярной генетики РАН, Съездах общества клеточных биологов (2003, 2007, 2012), Всероссийских совещаниях "Структура и функции клеточного ядра" (2005, 2010), Всероссийской конференции "Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет" (2011), Российских конференциях по электронной микроскопии (2008, 2010), Всероссийском конгрессе "Симбиоз-2009", международной конференции с элементами научной школы

"Современные проблемы бионаноскопии" (2011), совещаниях по структуре клеточного ядра (The Wilhelm Bernhard Workshop, 2005,2011, 2013), конференциях по молекулярной биологии пикорнавирусов (Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picomaviruses, 2006, 2008), международной летней школе "Взаимодействие патогена и хозяина" (International Summer School "Pathogen-Host Interplay", 2008), симпозиумах Американского общества клеточных биологов (ASCB, 2010,2012).

Публикации по теме диссертации

По результатам диссертационной работы опубликовано 24 статьи в журналах из списка ВАК РФ, 1 статья в сборнике, 22 материала конференций.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 245 страницах и состоит из следующих основных разделов: Введение, Обзор литературы, Материалы и методы, Результаты и обсуждение, Заключение, Выводы и Список литературы. Иллюстративный материал включает 76 рисунков. Библиографический список включает 220 публикаций.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы

Объекты исследования

Основным объектом исследования были культивируемые клетки карциномы человека HeLa. Культивирование клеток вели в среде DMEM с добавлением 8% сыворотки, 1-глутамина и антибиотиков при температуре 37°С и 5% С02. Также в работе использовали культуры фибробластов мыши (L929), фибробластов шпорцевой лягушки (XL-2) и клеток эмбриональной почки свиньи (СПЭВ).

Метод экстракции белков из культивируемых клеток

Для изучения морфологической организации хромосомного скэффолда нами был разработан метод экстракции белков из клеток, культивируемых в прикрепленном состоянии. Клетки пермеабилизировали 10 мин в трех сменах раствора, содержащего 50 мМ Трис-HCl рН 7,6, 5 мМ MgCI2, 1 мМ CuS04, 1 мМ PMSF (Merck) и 1 % Тритона Х-100. Затем клетки промывали в трех сменах того же буфера без детергента, после чего буфер замещали на экстрагирующий раствор. Использовали два экстрагирующих буфера: (1) 2 М NaCl, 10 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-HCl (рН 7,6); (2) 2 мг/мл сульфата декстрана, 0,2 мг/мл гепарина, 10 мМ ЭДТА и 20 мМ Трис-HCl (рН 7,6). За время экстракции (10 мин) раствор дважды заменяли на свежий. Чтобы добиться полной экстракции на одну чашку Петри диаметром 40 мл тратили 10 мл каждого из растворов. В некоторых случаях клетки после отмывки инкубировали в присутсвии 250 мкг/мл ДНКазы I (Sigma) или 250 мкг/мл РНКазы I (Sigma) (или их смеси) в течении 10 мин при 37°С. Для того, чтобы конденсировать остаточные структуры, клетки инкубировали в растворе, содержащем 50 мМ Трис-HCl (рН 7,6), 5 мМ MgCl2 и 1 мМ PMSF в течении 5 мин на льду.

Иммуноцитохимическое исследование локализации белков

При проведении иммуноцитохимического исследования организации хромосомного скэффолда использовали антитела против pKi-67 (клон MIB-1, DAKO), В23 (Sigma) и топоизомеразы Па (любезно предоставлены К. Tsutsui). Для световой

микроскопии применяли вторые антитела, конъюгированные в красителями AlexaFluor 488 или AlexaFluor 555 (Invitrogen). Препараты изучали с использованием флуоресцентного микроскопа AxioVert 200М (Carl Zeiss). Деконволюцию полученных изображений проводили с помощью программы AxioVision (Carl Zeiss).

Иммуноэлектронная микроскопия

Для проведения иммуноэлектронной микроскопии мы использовали метод мечения с помощью нанозолота с последующим серебряным усилением. Для этого в качестве вторых антител использовали анти-мышиные Fab-фрагменты, конъюгированные с нанозолотом (NanoProbe). Разведение 1:250, время инкубации 16 часов при температуре +4°С. После отмывки клетки фиксировали в 1%-ом глутаровом альдегиде в течение 1 часа. Реакцию серебряного усиления проводили по стандартной методике (H.G. Gilerovitch et al., 1995).

Корреляционная световая и электронная микроскопия

Клетки культуры HeLa выращивали на маркированных покровных стеклах (Electron Microscopy Sciences). Стекла переносили в 4%-ый глутаровый альдегид на 0,1 М буфере Зеренсена, после чего стекла быстро монтировали в камеры Attofluor (Invitrogen). Клетки, экспрессирующие экзогенные белки, находили в режиме флуоресценции на микроскопе Axiovert 200М и фотографировали, используя два объектива PlanNeofluar 5Х/0.13 и 40х/0.75. Первый объектив позволял получить изображение, в котором кроме клеток были видны линии и буквы на стекле, что позволяло в дальнейшем находить сфотографированные клетки в заливках. Второй объектив давал изображение, которое потом использовали для поиска интересующих структур внутри клеток. Окружающие клетки выступали в качестве контроля, т.е. контролем служили клетки как не экспрессирующие экзогенные белки, так и экстрессирующие их на уровне, который не мог быть определен в использовавшемся режиме съемки. После фотографирования в световом микроскопе стекла переносили в чашки Петри со свежей порцией глутарового альдегида, затем препараты заливали в Эпон 812 (Fluka) по стандартной методике. Ультратонкие срезы контрастировали цитратом свинца и изучали в электронном микроскопе HU-12 (Hitachi).

Результаты исследования и их обсуждение

Идентификация стадий митоза в экстрагированных клетках

Для того чтобы иметь возможность анализировать хромосомный скэффолд методом электронной микроскопии на всех стадиях клеточного деления, необходимо точно выявлять после экстракции клетки всех фаз митоза при световой микроскопии. С этой целью нами был разработан метод экстракции гистонов из культивируемых клеток in situ. Суть подхода состоит в том, что клетки, растущие на покровном стекле, пермеабилизировали в буфере, содержащем 5 мМ MgCl2, а затем инкубировали в экстрагирующем растворе. Экстракцию проводили по методам, принятым для анализа скэффолда и ядерного матрикса.

В ходе солевой экстракции морфологическая организация клеток изменяется: происходит общее набухание клеток, деконденсируются хроматин и хромосомы и т.д. Чтобы анализировать клетки с использованием электронной микроскопии (включая иммуноэлектронную микроскопию), необходимо точно выявлять клетки интересующих стадий митоза с использованием только фазового контраста, т.е. относительно малоинформативного метода. С целью разработки критериев распознавания клеток разных стадий митоза после экстракции в режиме фазового контраста мы провели эксперименты по визуальному наблюдению процесса экстракции. Митотические клетки сразу после пермеабилизации фотографировали, затем проводили солевую (2 М NaCl) экстракцию, после чего клетки фотографировали повторно (рис. 2). Интерфазные ядра после экстракции слегка набухают. Особенности организации ядрышка позволяют достаточно точно дифференцировать интерфазу и профазу, но отличить разные этапы профазы на основе одного только фазового контраста невозможно. Хромосомы внутри экстрагированных профазных ядер, метафазных и анафазных клеток не выявляются. Центральная область метафазных клеток занята зоной деконденсированных хромосом. В анафазных клетках можно видеть две такие зоны. Разные этапы телофазы и ранней Gi легко различаются на основании анализа формы клеток и структуры остаточных ядрышек.

Таким образом, уже на основании одного метода наблюдения (фазового контраста) удается выявить все основные стадии митоза после солевой экстракции.

интерфаза профаза метафаза анафаза телофаза

к S 1Г га м s С S

ю га а> 2

, w ¿(К/

HHsilHI V

} щШ « V

ШШШ, ^щ

Рис. 2. Определение структурных особенностей обработанных экстрагирующим раствором клеток различных стадий митоза (фазово-контрасная микроскопия). Клетки фотографировали дважды: сразу после пермеабилизации (верхний ряд) и повторно после экстракции (нижний ряд). Ядрышки интерфазных, профазных и телофазных клеток обозначены стрелками; хромосомы профазных, метафазных и анафазных клеток — маленькими треугольными стрелками; остаточное тельце телофазной клетки -большой треугольной стрелкой (ув. 500).

Более дробное определение этапов митоза возможно в случае проведения иммуноцитохимического анализа, т.е. на основании анализа распределения исследуемых антигенов.

Предложенный способ экстракции in situ апробирован на фибробластах мыши L929 (рис. 2), на клетках XL-2 (фибробласты Xenopus laevis), HeLa (карцинома человека) и СПЭВ (эмбриональная почка свиньи). В перечисленных культурах удается идентифицировать клетки всех стадий митоза.

Таким образом, разработан метод, позволяющий анализировать скэффолд митотических хромосом на различных стадиях митоза с использованием современных методов анализа.

Изучение ультраструктурной организации хромосомного скэффолда метафазных хромосом

Перед экстракцией пермеабилизированные клетки можно обработать нуклеазами (ДНКаза I или смесь ДНКазы I и РНКазы А), удалив таким образом материал петлевых доменов. Остаточные хромосомы на стадии метафазы представляют собой сложно организованные структуры, включающие два компонента - периферический и аксиальный (рис. ЗА). Периферический домен, который в виде сплошного слоя окружает аксиальный, обладает высокой плотностью, аксиальный элемент имеет более диффузную структуру. Для идентификации природы этих двух компонентов использована иммуноэлектронная микроскопия. В работе анализировали два белка: (1) белок аксиального хромосомного скэффолда -топоизомеразу IIa и (2) белок перихромосомного слоя - pKi-67.

В клетках, фиксированных in situ, исследуемые белки выявляются либо на периферии хромосом - pKi-67 (рис. ЗБ), либо в аксиальных районах метафазных хроматид - топоизомераза IIa (рис. ЗВ). Аксиальный домен остаточных хромосом (устойчивого к экстракции компонента хромосом) содержит топоизомеразу IIa (рис. ЗГ), т.е. соответствует аксиальному хромосомному скэффолду. Периферический домен остаточных хромосом метится антителами к pKi-67, т.е. является результатом агрегации компонентов перихромосомного слоя (рис. ЗД). Учитывая, что оба элемента, периферический и аксиальный, обладают общим свойством, а именно, устойчивостью к солевой экстракции, термин хромосомный скэффолд формально справедлив для обоих компонентов остаточных хромосом. В тоже время, полученные нами данные позволяют выделить ранее не идентифицированную субструктуру остаточных хромосом - периферический хромосомный скэффолд.

В радиально-петельной модели постулируется, что со скэффолдом взаимодействуют специфические участки хромосом - основания петлевых доменов, которые в зависимости от способов выявления носят название SARs (scaffold associated regions) или MARs (matrix associated regions) (S.V. Razin et al., 1995). Важно определить, взаимодействуют ли основания петлевых доменов с периферическим доменом остаточных хромосом или только с аксиальным. Для этого клетки перед экстракцией обрабатывали ДНКазой I, добиваясь, чтобы в хромосомах осталось минимально детектируемое количество ДНК. Остатки ДНК выявляются

Рис. 3. Периферический хромосомный скэффолд. (А) Электронная микроскопия экстрагированной метафазной клетки (аксиальный скэффолд обозначен стрелкой, периферический - треугольной стрелкой). (Б) Локализация pKi-67 в метафазной клетке. Гранулы серебра распределены преимущественно на периферии хромосом (треугольные стрелки). (В) Топоизомераза IIa локализуется в аксиальном районе метафазных хроматид (стрелки). (Г) Аксиальный домен хромосом, обработанных 2 М NaCl, содержит топоизомеразу IIa (стрелки). (Д) Периферический хромосомный скэффолд содержит pKi-67 (треугольные стрелки). (Е) Локализация фрагментов ДНК, ассоциированных с хромосомным скэффолдом. Масштабная линейка — 1 мкм.

преимущественно в аксиальной области остаточных хромосом, меченной топоизомеразой Па (рис. ЗЕ). Это свидетельствует о том, что периферический

хромосомный скэффолд не участвует в организации петлевых доменов, как это свойственно белкам аксиального скэффолда.

Следует отметить, что известны экспериментальные данные, которые косвенно свидетельствуют в пользу существования периферического домена хромосомного скэффолда. Так, включение белков перихромосомного слоя в состав хромосомного скэффолда было описано в литературе (N.D. Belyaev et al., 1992; R. Verheijen et al., 1989; D.E. Vega-Salas et al., 2002). Недавно были опубликованы результаты протеомного изучения белков хромосомного скэффолда (R. Gassmann et al., 2005). Среди выявленных 79 белков 9 локализуются в митозе на периферии хромосом (среди них В23/нуклеофозмин, фибрилларин и др.).

Существование периферического хромосомного скэффолда ни в коей мере не снижает ценность экспериментальных данных, накопленных в рамках радиально-петельной модели. Но, нельзя однозначно полагать, что белки устойчивые к экстракции обязательно являются структурными или что экстрагируемые белки не играют такой роли. Теоретически, некоторые структурные негистоновые белки могут взаимодействовать с хроматином не образуя солеустойчивые комплексы, как гистоновые белки.

Исследование динамики периферического скэффолда в митозе

Для анализа ассоциации белков перихромосомного слоя с остаточными структурами в митозе мы использовали клетки, обработанные 2 М NaCl без предварительной нуклеазной обработки. Анализ проводился с использованием световой иммуноцитохимии, стандартной электронной и иммуноэлектронной микроскопии. Последний метод позволяет составить наиболее полную картину, поэтому ниже приводятся результаты выявления pKi-67 в экстрагированных клетках всех стадий митоза на ультраструктурном уровне.

В экстрагированных интерфазных ядрах pK.i-67 выявляется в периферическом слое ядрышка и в составе небольших агрегатов на периферии ядра в контакте с остаточной ядерной оболочкой (рис. 4А, Б). На этапе ранней профазы pKi-67 обнаруживается в агрегатах неправильной формы, иногда удлиненных, которые могут соответствовать скэффолду профазных хромосом (рис. 4В, Г). В некоторых профазных клетках (поздние профазы) pKi-67 связан с дискретными агрегатами, формирующими

% /• ■ ■* ;Л

■ Л"'' '- ■ '

- /Л V

. *

в 'Г Г

& -г* " й"

* * & г '

«л*-:'!*«

к м

йч

V „5-

>■•■' .у4

чУ'-Ж^М-- г

•Л*« *5г «КИ'

■V

Мл *

3Я&фФ&гл*' -

■ /зр&Т*-. Ч .

3?*

-4

•Г.'.

* А^^ЛА А'. ■

V; ».-Ж

Ея?' '

' ^ л ■ -- кг.

■ л

г-

ч.

■у л ■У""

«V

ЭЖ .Ж Л •

' > ' А

Ш ыи

Щ V " V к

4 —

X:- V' - - ' -

•л •'•. ^

г, \\ \ пя

"х

/»V ; г,

ь&эт

* Л .: * ^

Рис. 4. Иммуноэлектронное выявление рК]-67 в экстрагированных клетках НеЬа. (А) Интерфазное ядро и (Б) его фрагмент при большем увеличении. Остаточные ядрышки (ядрышковый матрикс) обозначены буквой Я, скопления рЮ-67 в нуклеоплазме стрелкой. (В,

Г) Ранняя профаза. Остаточные хромосомы (маленькие стрелки) содержат гомогенно-распределенный рЮ-67. (Д, Е) Поздняя профаза. Кольцевидные рКл-67-содсржащие структуры, по-видимому, соответствуют остаточному перихромосомному слою, т.е. периферическому хромосомному скэффолду (маленькие стрелки). (Ж) Общий вид экстрагированной метафазной клетки. рКл-67 выявляется в многочисленных плотных тельцах (маленькие стрелки на панели 3). (3) Также удается выявить скопления материала, окруженные радиально расходящимися фибриллами дегистонизированной ДНК (маленькие треугольные стрелки). Предположительно эти комплексы являются фрагментами аксиального скэффолда. (И) Окрашивание антителами к топоизомеразе На подтверждает это предположение. (К, Л) Фрагментация периферического хромосомного скэффолда. (К) Участок метафазной клетки с поперечными срезами остаточных хромосом разной степени разрушенности (большие треугольные стрелки) и (Л) серийные срезы (1-6) одной из этих хромосом. (М) Анафазная клетка и (Н) фрагмент этой клетки при большем увеличении. Остаточные хромосомы обозначены большими треугольными стрелками, отдельные скопления материала периферического хромосомного скэффолда - маленькими стрелками, аксиальный скэффолд - маленькими треугольными стрелками. (О) Ранняя и (П) поздняя телофаза. На вставках представлены увеличенные изображения остаточных проядрышек (пя). Масштабная линейка: А, В, Д, Ж, К, М, О, П - 2 мкм, Б, Г, Е, 3, И, Л, Н - 0,5 мкм.

кольцевидные структуры (рис. 4Д, Е). Вероятнее всего, в данном случае удается видеть остаточные хромосомы, в которых произошло формирование перихромосомного слоя. В метафазных клетках выявляются многочисленные агрегаты, содержащие pKi-67 (рис. 4Ж, 3). На первый взгляд, эти комплексы бессистемно заполняют всю зону деконденсированных хромосом. Похожие комплексы выявляются и после окрашивания антителами к топоизомеразе IIa (рис. 4И). Однако от комплексов, содержащих топоизомеразу IIa, радиально расходятся фибриллы ДНК. На некоторых срезах можно наблюдать, как комплексы, содержащие pKi-67, окружают агрегаты с радиально-расходящимися фибриллами ДНК (рис. 43). Изредка удается обнаружить неразрушенные фрагменты скэффолда (рис. 4К), которые выявляются преимущественно на периферии зоны деконденсированных хромосом. На серийных ультратонких срезах видно, что при приближении к центру клетки скэффолд становится фрагментированным (рис. 4JI). По-видимому, в ходе экстракции выпетливающиеся фибриллы ДНК оказывают давление на хромосомный скэффолд (и на аксиальный, и на периферический его домены), что ведет к распаду

единой структуры на дискретные элементы. Как будет показано ниже, такой же распад наблюдали и в ходе изучения блоков прицентромерного гетерохроматина интерфазных ядер фибробластов мыши, т.е. эта особенность является общей для всех комплексов конденсированного хроматина как в митозе, так и в интерфазе.

Аналогичные комплексы выявлены и в анафазных клетках, но на этой стадии чаще, чем в метафазе выявляются неразрушенные фрагменты остаточных хромосом, в большинстве случаев - дистальные участки плечей анафазных хроматид (рис. 4М, Н). Если фрагменты достаточно протяженные, то можно видеть, что периферический скэффолд неоднороден (стрелки на рис. 4Н).

В ядрах телофазных клеток метка выявляется в формирующихся ядрышках и проядрышках. Для ранней телофазы характерны проядрышки удлиненной или неправильной формы (рис. 40), на завершающих этапах телофазы выявляются округлые проядрышки (рис. 4П). Важно отметить, что проядрышки являются частью внутренней сети ядерного матрикса и морфологически ничем не отличаются от окружающего материала.

При анализе ассоциацию рКь67 с остаточными структурами в нескольких экспериментальных системах, во всех случаях наблюдали ассоциацию части белка с остаточными структурами. По-видимому, периферический домен хромосомного скэффолда представляет собой результат индуцированной солевым раствором агрегации белков перихромосомного слоя. Причем, компоненты перихромосомного слоя входят в состав остаточных структур на протяжении всего клеточного цикла.

Ассоциация белков с остаточными структурами

В данном разделе приведены данные об остаточных структурах интерфазного ядра (ядерном матриксе). Учитывая важную роль, которая приписывается в радиально-петельной модели этому образованию, белки ядерного матрикса должны быть хорошо изучены. Во фракции ядерного матрикса выявляется всего несколько процентов суммарного ядерного белка, т.е. большая часть негистоновых белков не является белками ядерного матрикса. В то же самое время, в литературе чрезвычайно редки упоминания о негистоновых белках, не входящих в состав ядерного матрикса. Последнее косвенно свидетельствует о редкости таких белков, что противоречит данным о количественном преобладании нематриксных белков над матриксными.

Для работы использовали один из белков репликационного аппарата клеток -PCNA. В нереплицирующихся клетках PCNA гомогенно распределен по нуклеоплазме, в реплицирующихся клетках накапливается в сайтах репликации. Во время репликации только часть PCNA (20-30%) входит в состав репликационного аппарата, большая же часть белка остается распределенной по нуклеоплазме (Bravo, Macdonald-Bravo, 1987). Мы показали, что с ядерным матриксом связан только белок, входящий в состав репликационных сайтов. Нуклеоплазматический белок (т.е. весь белок нереплицирующихся клеток и 70-80% белка реплицирующихся клеток) экстрагируется. Таким образом, ассоциация белка с ядерным матриксом есть свойство не столько самого белка, сколько тех комплексов, в состав которых белок входит.

Еще большее значение имеет другое наблюдение. Коровые гистоны, как известно, не входят в состав ядерного матрикса. Обычно большая часть коровых гистонов входит в состав нуклеосом. Однако, если экспрессировать гистон Н2В, то в течение некоторого времени в клетке существует заметная фракция белка, не успевшего войти в состав нуклеосом. Измерение содержания гистона Н2В в ядерном матриксе таких клеток показало, что если в контрольных клетках ядерный матрикс содержит 2,5±1,49 от суммарного содержания гистона Н2В, то в клетках, в которых гистон не включился в состав нуклеосом в неэкстрагируемой фракции находится уже 23,4±15,15 белка (большой разброс объясняется тем, что количество белка в свободной фракции неодинаково в разных клетках). Т.е. коровый гистон Н2В "становится" белком ядерного матрикса. В этом также можно видеть свидетельство того, что устойчивость белка к экстракции определяется преимущественно свойствами его окружения.

Важно, что во всех случаях только часть белка связана с ядерным матриксом. Т.е. даже типичный матриксный белок только частично устойчив к действию солевого раствора, а частично экстрагируется. Вероятно, этим и объясняется относительно небольшое количество белка во фракции ядерного матрикса.

В заключение следует отметить, что за последние годы получены многочисленные экспериментальные данные, свидетельствующие в пользу динамичного поведения белков в живой клетке (см. обзор: Т. Misteli, 2008). Большинство исследованных белков связывается со своими функциональными сайтами лишь на крайне короткое время, после чего начинает свободно перемещаться

по ядру. Полученные нами данные об особенностях ассоциации с ядерным матриксом нескольких исследованных белков (PCNA, В23, pKi-67 и топоизомераза IIa) позволяют предположить, что с матриксом ассоциируют белки, взаимодействующие со своими функциональными сайтами связывания. Белок, свободно диффундирующий по ядру, экстрагируется солью. Это позволяет трактовать ядерный матрикс как некий мгновенный снимок всех белков, которые в момент пермеабилизации клеток взаимодействуют со своими сайтами связывания. Иначе говоря, остаточные структуры могут служить для идентификации сайтов связывания, даже самого кратковременного при условии солеустойчивости образующихся комплексов.

Структура митотических хромосом после экстракции 2 МNaCl и полианионами

С использованием разработанного метода получения хромосомного скэффолда in situ мы предприняли попытку одновременно выявить компоненты, которые постулируются разными моделями. Идея состояла в следующем. Если проводится максимально сильную экстракцию, мы должны выявить только хромосомный скэффолд и развернутые петлевые домены. Учитывая, что при использовании разработанного протокола мы не разрушаем гипотонией высшие уровни компактизации хроматина, можно надеяться, что промежуточная по силе деконденсация позволит выявить одновременно и хромосомный скэффолд, и какие-то промежуточные мотивы компактизации хроматина. Добиться такого эффекта можно двумя способами: (1) использовать протокол экстракции, удаляющей только часть белков хроматина, (2) предварительно стабилизировать хроматин, что позволит сохранить дополнительные белки хроматина даже после сильной экстракции.

Первый подход был реализован с использованием непродолжительной (10 мин) экстракции полианионами (смесью сульфата декстрана и гепарина), которая приводит к значительному набуханию, но не к полному разрушению хромосом. При этом топоизомераза IIa выявляется в осевых районах набухших хромосом. Весь дальнейший анализ проводили с использованием электронной микроскопии.

В обработанных 2 М NaCl клетках хромосомные скэффолды выявляются, как правило, в виде небольших комплексов (нитчатых или глобулярных), содержащих топоизомеразу IIa (рис. 5). От остаточных хромосом радиально расходятся фибриллы

' - А 'А « ■

Г . » 51« _

Рис. 5. Электронная микроскопия клеток после экстракции 2 М NaCl. (А) Иммуноэлектронное выявление топоизомеразы IIa в экстрагированной метафазной клетке; (Б) увеличенный фрагмент клетки (обведен контуром на А). (В) Иммуноэлектронное выявление топоизомеразы IIa в экстрагированной анафазной клетке; (Г) увеличенный фрагмент клетки (обведен контуром на В). Стрелки указывают на остаточные центромеры (предположительно), большие треугольные стрелки - на хромосомный скэффолд, меленькие треугольные стрелки - на остатки цитоплазмы. Остаточные хромосомы, помеченные звездочкой (*), разделены на дискретные фрагменты. Масштабные линейки - 2 мкм (А, В); 0,5 мкм (Б, Г).

дегистонизированной ДНК.

Метафазные клетки, обработанные смесью полианионов, устроены принципиально сходно, но вся зона деконденсированных хромосом пронизана сетью фибрилл ДНК, в составе которой легко угадываются отдельные элементарные комплексы, состоящие из расходящихся фибрилл ДНК (рис. 6А, Б). Особенно хорошо эти комплексы видны после конденсации фибрилл ДНК, индуцированной инкубацией экстрагированных клеток в буфере, содержащем 5 мМ (рис. 6В, Г).

Иммуноэлектронная микроскопия продемонстрировала, что топоизомераза IIa содержится в фрагментах хромосомного скэффолда, но не выявляется в составе описанных выше комплексов радиально-расходящихся фибрилл ДНК. Это позволяет сформулировать следующее предположение: выявленные комплексы представляют собой результат неполной экстракции петлевых доменов, причем после частичной экстракции хроматин имеет розеточную организацию.

Второй подход, использованный для выявления комплексов компактизированных петлевых доменов, состоит в предварительной стабилизации хроматина облучением видимым светом в присутствии бромистого этидия. Стабилизация хроматина делает его более устойчивым к экстракции, после которой удается выявить многочисленные комплексы хроматина, образованные радиально-расходящимися фибриллами дегистонизированной ДНК (т.е. также имеющими розеточную организацию).

Известно, что в частично деконденсированных in vitro хромосомах элементарные хромонемы представляют собой цепочку глобул - элементарных хромомеров (O.V. Zatsepina et al., 1983). Деконденсированные элементарные хромомеры выглядят как розетки, образованные электронно-плотной сердцевиной и окружающими ее петлями. После частичной деконденсации конденсированного хроматина с последующим распластыванием хроматина на поверхности воды удается выявить розеточные комплексы хроматина, образованные плотной центральной гранулой и расходящимися от нее петлями ДНК (J. Sonnenbichler, 1969; A.N. Prusov et al., 1983; C.A. Ascoli et al., 1988). Общая длина ДНК в составе одной розетки 15-30 мкм, что сопоставимо со средней длиной петлевого домена (21.4 мкм согласно рассчетам K.J. Pienta, D.S. Coffey, 1984). Таким образом, в литературе представлены данные, которые косвенно свидетельствуют в пользу упаковки ДНП-фибриллы в упорядоченные комплексы, имеющие после деконденсации/слабой депротеинизации розеточную организацию. Мы отождествляем выявленные нами промежуточные структуры с элементарными хромомерами и трактуем их как результат упорядоченной упаковки петлевых доменов. Можно предположить, что в этой компактизации принимают участие белки, не входящие в состав остаточных структур митотических хромосом.

Рис. 6. Электронная микроскопия клеток, обработанных смесью сульфата декстрана и гепарина. (А) Общий вид экстрагированной метафазной клетки; (Б) - фрагмент при большем увеличении. На врезке можно видеть дискретные элементы (треугольные стрелки) сети фибрилл ДНК, пронизывающей зону деконденсированных хромосом. Стрелками обозначены элементы, которые являются либо остаточными хромосомами, либо остатками цитоплазмы. (В) Конденсация дискретных элементов сети в буфере, содержащем ионы (Г) - фрагмент при большем увеличении. Врезка

демонстрирует особенности структурной организации элементов хроматиновой сети после конденсации. Масштабные линейки - 2 мкм (А, В); 0,2 мкм (Б, Г); 0,1 мкм (врезки на панелях Б и Г).

Как уже было указано, в настоящее время наиболее распространены две модели организации митотических хромосом - радиально-петельная и хромонемная модели. В основе этих моделей лежат две различные группы наблюдений. Радиально-петельная модель основывается на данных, полученных в ходе изучения комплексов, получающихся после жесткой экстракции белков из хроматина. В рамках этой экспериментальной стратегии накоплена информация, которая должна учитываться при построении любой модели. Однако не менее обоснованные результаты получены

и в рамках хромонемной модели. Эта модель строится преимущественно на результатах анализа нативных (т.е. фиксированных in situ) хромосом или частично деконденсированных in vivo или in vitro хромосом. Представляется, что каждая модель описывает только один из аспектов организации хроматина, но не универсальный принцип. Однако кроме точных эмпирических наблюдений обе модели содержат значительное число допущений.

Хромонемная модель, отрицая существование хромосомного скэффолда как основы построения митотической хромосомы, игнорировала факт обогащения аксиального района белками аксиального скэффолда. В одном из вариантов хромонемной модели (N. Kireeva et al., 2004), предполагается, что белки скэффолда обеспечивают сворачивание 250 нм профазной хроматиды в метафазную, действуя в виде некоего "клея".

Экстракция полианионами в наших условиях, по-видимому, не вызывает полного разрушения петлевых доменов (рис. 6), что макроскопически выражается в относительно слабом набухании хромосом (сравнительно с солевой экстракцией). Это позволяет выявлять промежуточные комплексы компактизации петлевых доменов, которые мы трактуем как деконденсированные хромомеры. Рисунок 7 иллюстрирует вероятные шаги деконденсации хромомера при экстракции полианионами и 2 М NaCl. В данной модели хромонема имеет прерывистую структуру и состоит из хромомеров, которые соответствуют петлевым доменам. Деконденсация хромонемы ведет к формированию двух типов структур - розеток, как результат частичной деконденсации полианионами, или петлевых доменов, как результат полной деконденсации 2 М NaCl. Таким образом, можно предполагать, что и петлевые домены и розетки являются структурами, возникающими вследствие разной степени деконденсации хроматина.

На рисунке 7Ж приведена схема, которая учитывает сделанные в нашей работе наблюдения и одновременно обобщает некоторые положения радиально-петельной и хромонемной моделей. Хромосома формируется как результат конденсации петлевых доменов в упорядоченные структуры (возможно, при участии негистоновых белков, не входящих в состав ядерного матрикса/хромосомного скэффолда). При сближении конденсировавшихся петлевых доменов формируется фибрилла 100-130 нм (хромонема). При этом основания петлевых доменов и белки скэффолда, их

элементарная хромонема (100-130 нм)

элементарная хромонема

260 нм фибрилла

элементарные хромомеры

метафазная хроматида

элементарные хромомеры

основания петлевых доменов (SARs/MARs)

петлевые домены

Рис. 7. Общая схема организации митотической хромосомы. (А-В) Этапы деконденсации хромосомы. (А) Конденсированная хромосома с аксиальным скэффолдом. (Б) Набухшая хромосома после экстракции смесью сульфата декстрана и гепарина. (В) Хромосома, экстрагированная солевым раствором. Красным обозначен аксиальный скэффолд, содержащий топоизомеразу Па, голубым - хроматин. (Г-Е) Этапы деконденсации хромонемы. (Г) Конденсированная 100-130 нм хромонема. (Д) Частичная экстракции смесью сульфата декстрана и гепарина позволяет выявить интермедиа™ компактизации петлевых доменов, имеющие розеточную организацию. (Е) Петлевые домены после солевой экстракции. Красные прямоугольники - основания петлевых доменов (БАК^/МАЯв). (Ж) Гипотетическая схема организации митотической хромосомы. Компактизация петлевых доменов ведет к формированию 100-130 нм хромонемы. Элементы скэффолда, участвующие в формировании оснований петлевых доменов, включаются в состав конденсированной хромонемы. Хромонема сворачивается в 200-250 нм фибриллу, которая упаковывается в метафазную хроматиду. Аксиальный скэффолд участвует в упаковке 200-250 нм фибриллы в метафазную хроматиду, но не в формирование хромонемы.

организующие, лежат внутри хромонемы.

Белки аксиального скэффолда не только участвуют в организации петлевых доменов, но и, согласно идее A.C. Белмонта (N. Kireeva et al., 2004), отвечают за упаковку 250 нм фибриллы в метафазную хроматиду. Таким образом, в хромосоме

сосуществуют два скэффолда: диффузный и аксиальный, причем первый участвует в компактизации хромонем, а второй - в компактизации 250 нм фибриллы.

Представленная схема не устраняет всех противоречий, которые можно найти в литературе, поэтому ее следует рассматривать, как рабочую модель, которая позволяет наилучшим образом трактовать результаты настоящего исследования, а также некоторые литературные данные.

Особенности организации ядерного матрикса хромоцентров культивируемых фибробластов мыши

Конститутивный гетерохроматин - локусы хромосомы, которые не содержат транскрибирующихся генов и не декомпактизуются в интерфазе. В ядрах клеток мыши конститутивный гетерохроматин сблочен в дискретные структуры, в цитологической литературе называемые хромоцентрами. Показано, что хромоцентры представляют собой блоки гетерохроматина, локализованного в прицентромерных районах митотических хромосом.

Хромоцентры в культивируемых клетках мыши отчетливо видны при окрашивании ДНК-связывающим красителем Хекст 33258 как округлые блоки, более яркие на фоне основной массы диффузного хроматина. Необходимо отметить, что если при окрашивании Хекстом 33258 крупные хромоцентры имеют гомогенную структуру, т.е. ДНК распределена в составе хромоцентров гомогенно, то большой сателлит распределен в них неравномерно. Неоднородность распределения большого сателлита в хромоцентрах может определяться тем, что это не единственный тип сателлита, описанный в составе прицентромерного гетерохроматина (I.S. Kuznetsova et al., 2005), причем, показано, что разные сателлиты сгруппированы в кластеры (I.S. Kuznetsova et al., 2006).

В работе использовано два способа экстракции клеток - 2 М NaCl и смесь полианионов (сульфата декстрана и гепарина). Гибридизация in situ показала, что оба протокола вызывают разрушение плотных хромоцентров, и сателлитная ДНК выявляется в виде многочисленных точек, плотность распределения которых уменьшается на периферии. В качестве основного маркера на хромоцентры были использованы антитела к топоизомеразе На - одному из наиболее изученных белков ядерного матрикса. Хромоцентры в контрольных клетках окрашиваются антителами

практически гомогенно. После солевой экстракции клеток (без дополнительной нуклеазной обработки) интенсивность окрашивания нуклеоплазмы по сравнению с интенсивностью окрашивания хромоцентров уменьшается, что говорит о частичной экстракции белка. После экстракции морфология маленьких хромоцентров не изменяется, в то время как крупные хромоцентры сильно набухают и теряют гомогенность структуры - в их составе выявляются отдельные гранулы, обычно связанные в цепочки. ДНК после экстракции выходит за пределы ядер, однако в районах хромоцентров интенсивности флуоресценции Хекст 33258 остается повышенной. Таким образом, хромоцентры могут быть идентифицированы на основании распределения ДНК даже после экстракции. Однако размеры зоны повышенной яркости больше, чем размеры остаточных хромоцентров, выявляемых на основании окрашивания антителами к топоизомеразе IIa. Важно отметить, что интенсивность флуоресценции Хекст 33258 в районах остаточных хромоцентров не коррелирует с интенсивностью окрашивания антителами.

Окрашивание клеток, экстрагированных 2 М NaCl после предварительной обработки ДНКазой I, также показывает, что топоизомераза На входит в состав ядерного матрикса хромоцентров, однако набухания хромоцентров, столь типичного для экстракции без предварительной нуклеазной обработки, не происходит.

Кроме солевой экстракции была использована экстракцию смесью полианионов (сульфата декстрана и гепарина). Экстракция без нуклеазной обработки приводит к набуханию хромоцентров, однако характер этого набухания резко отличается от набухания хромоцентров после солевой экстракции. В последнем случае концентрация ДНК снижается по мере удаления от центра остаточных хромоцентров, и зоны повышенной концентрации ДНК не имеют четкой границы. Набухшие в результате экстрации полианионами хромоцентры сохраняют равномерность распределения ДНК и четкие контуры. Топоизомераза IIa выявляется во всем объеме набухших хромоцентров, но распределение белка не равномерно. Если экстракции предшествует обработка ДНКазой I, то выявляются плотные остаточные хромоцентры, локализация топоизомеразы IIa в которых идентична наблюдаемой после солевой экстракции.

Таким образом, анализ локализации топоизомеразы IIa в экстрагированных клетках показывает, что два разных типа экстракции приводят к различным

результатам, если не проводилась обработка ДНКазой I. При солевой экстракции формируются структуры, которые можно назвать "мини-нуклеоидами". Эти образования состоят из центральной области, содержащей топоизомеразу IIa, которую окружает ореол из петель сателлитной ДНК. Центральная часть (т.е. собственно ядерный матрикс) незначительно деконденсируется, что позволяет выявить содержащие топоизомеразу IIa гранулы и цепочки гранул, в то время как структура неэкстрагированных хромоцентров практически гомогенна. Экстракция полианионами ведет к заметному набуханию хромоцентров, но "мини-нуклеоиды" не формируются. Это косвенно свидетельствует о том, что и полной экстракции белков петлевых доменов и полной релаксации ДНК в данном случае не происходит. Если экстракции предшествовала обработка нуклеазой, то структура ядерного матрикса не зависит от использовавшегося для экстракции раствора.

Для изучения морфологии остаточных структур мы провели электронно-микроскопическое изучение экстрагированных клеток. В клетках экстрагированных 2 М NaCl без нуклеазной обработки внутри остаточных ядер выявляются остаточные ядрышки и отдельные фрагменты внутренней сети ядерного матрикса (рис. 8А). Выявить остаточные хромоцентры не удается. С помощью иммуноэлектронной микроскопии в ядрах, обработанных 2 М NaCl без нуклеазной обработки, выявляются скопления топоизомеразы IIa, которые соответствуют хромоцентрам (рис. 8Б). От этих скоплений радиально расходятся нити дегистонизированной ДНК, которые могут являться частью "мини-нуклеоидов", выявляемых при гибридизации in situ (рис. 8В). Обращает на себя внимание, что топоизомераза IIa выявляется не в составе плотного материала (остаточных ядрышек или внутренней сети ядерного матрикса), а в составе отдельных, небольших, агрегатов устойчивого к экстракции материала, морфологически не связанных друг с другом.

В клетках, обработанных ДНКазой I перед экстракцией, остаточные ядрышки плотные, внутренняя сеть ядерного матрикса сформирована толстыми фибриллами, образующими плотную сеть (рис. 8Г). Рядом с ядрышками и на периферии ядер обнаруживаются менее плотные округлые образования, локализация которых совпадает с локализацией хромоцентров в нативных клетках (рис. 8Д). Используя антитела к топоизомеразе IIa, мы показали, что это - остаточные хромоцентры (рис. 8Е). Важно подчеркнуть, что обычно ядерный матрикс состоит из трех различимых в

Рис. 8. Электронная микроскопия клеток после экстракции 2 М №С1 без предварительной обработки ДНКазой I (А-В) или после нуклеазной обработки (Г-Е). Для иммуноэлектронной микроскопии использовали антитела к топоизомеразе Па (Б, В, Е). Стрелки - остаточные хромоцентры, треугольные стрелки - ядрышки. Масштабные линейки - 2 мкм (А, Б, Г), 0,5 мкм (В), 1 мкм (Д, Е).

Рис. 9. Электронная микроскопия клеток после экстракции полианионами без предварительной обработки ДНКазой I (А-В) или после нуклеазной обработки (Г). Для иммуноэлектронной микроскопии использовали антитела к топоизомеразе Па (В, Г). Стрелки - остаточные хромоцентры, треугольные стрелки - ядрышки. Масштабные линейки - 2 мкм (А), 0,25 мкм (В-Д).

электронном микроскопе компонентов - ядерной ламины, остаточных ядрышек и внутренней сети ядерного матрикса. В данном случае выявляется еще один компонент - матрикс хромоцентров (т.е. блоков конститутивного гетерохроматина).

После экстракции смесью полианионов ядра резко набухают (рис. 9А). Внутри остаточных ядер хромоцентры легко выявляются как округлые скопления тонкофибриллярного материала (рис. 9Б). Такие образования содержат топоизомеразу Па (рис. 9В). Анализ материала остаточных хромоцентров на большом увеличении показывает, что они образованы многочисленными фокусами радиально-сходящихся хроматиновых фибрилл. Если клетки предварительно обрабатывают ДНКазой, то морфология остаточных ядер сходна с таковой для случая солевой экстракции (рис. 9Г).

Таким образом, показано, что солевая экстракция клеток без предварительной нуклеазной обработки ведет к резкому набуханию остаточных хромоцентров. Сходное набухание было описано выше для целых хромосом метафазных и анафазных хромосом. Неожиданной оказалась невозможность выявить ядерный матрикс хромоцентров в такой ситуации, тем более что в клетках, обработанных ДНКазой I, остаточные хромоцентры выявляются очень четко. Вероятнее всего, мы имеем дело именно со сложностью выявления, так как, судя по результатам иммуноцитохимического исследования, эти элементы остаются. Выше мы описали, что набухание хромосомного скэффолда в ходе экстракции, выражающееся, в частности, в том, что длина остаточных хромосом в несколько раз больше, чем длина неэкстрагированных нативных хромосом, сопровождается его распадом на отдельные элементы. По-видимому, это происходит в ходе экстракции под давлением петель дегистонизированной ДНК.

В случае экстракции полианионами выявить материал, который можно было бы надежно отождествить с ядерным матриксом, не удается. Однако зона остаточных хромоцентров пронизана фибриллами ДНК, формирующими плотную сеть. В составе сети можно было выделить отдельные комплексы радиально-сходящихся фибрилл. Это наблюдение может свидетельствовать о том, что в случае такой обработки экстрагируются не все белки и, как следствие, петлевые домены полностью не разворачиваются. Т.е. таким способом визуализируются промежуточные структуры компактизации петлевых доменов.

Исследование самоорганизации клеточных структур, индуцированной гиперэкспрессией некоторых белков ядерной оболочки

Роль ядерной оболочки в качестве структурного компонента, организующего внутреннее пространство клеточного ядра, достаточно хорошо изучена. Но, как и в случае с митотическими хромосомами, процессы формирования (биогенеза) ядерной оболочки понятны плохо. В настоящее время обсуждаются два механизма, посредством которых могут формироваться клеточные органеллы - упорядоченная самосборка и стохастическая самоорганизация. Последний путь предполагает, что структуры формируются за счет многочисленных взаимодействий молекулярных компонентов системы друг с другом без какой-либо программы, детерминирующей этапы ее формирования. В случае большинства ядерных телец, по-видимому, реализуется именно этот сценарий, в пользу чего свидетельствует высокая динамика компонентов (белков и РНК), их образующих. Ядерная оболочка образована преимущественно малодинамичными компонентами, и какой способ формирования -самосборка или самоорганизация - реализуется при ее формировании остается неясным.

Для решения этой проблемы мы исследовали эффекты гиперэкспрессии некоторых белков ядерной оболочки на формирования структуры клетки в целом. При этом предполагали, что если формирование ядерной оболочки происходит согласно некоторой программы (т.е. путем самосборки), тогда избыточная экспрессия отдельных белков не окажет значимого эффекта на формирование структуры в целом.

Мы исследовании эффекты гиперэкспрессии двух белков ядерной ламины (ламина В1 и ламина А), двух интегральных белков ядерных пор (рот121 и ndcl) и белка ядерной оболочки Lap2p. Были получены следующие результаты.

1) Гиперэкспрессия ламина В1 приводила к избыточной продукции ядерной оболочки, которая формировала многочисленные инвагинации (рис. 10). При этом формирование других компонентов оболочки (ядерных пор) не происходило, и в составе оболочки выявлялись протяженные участки, лишенные ядерных пор.

2) Избыточно экспрессированный ламин А встраивался в локальные участки ядерной оболочки, что иногда приводило к формированию выпячиваний ядра (в литературе такие образования принято называть почками, buds). Кроме того,

Рис. 10. Корреляционная световая и электронная микроскопия клетки, гиперэкспрессирующей ламин В1. Слева - фотографии клетки в световом микроскопе (флуоресценция ОРР и фазовый контраст), справа - в электронном. Избыточное формирование ядерной оболочки приводит к возникновению большого числа глубоких инвагинаций.

обнаруживались достаточно многочисленные выросты внутренней мембраны ядерной оболочки внутрь ядра.

3) Гиперэкспрессия нуклеопорина рот 121 приводила к появлению в цитоплазме многочисленных телец, содержащих избыточно экспрессированный белок. В литературе было показано, что эти тельца являются пористыми пластинками (lamellae annulata), т.е. содержат цитоплазматические поры (N. Daigle et al., 2001). Однако с помощью корреляционной световой и электронной микроскопии и иммуноцитохимии мы показали, что рот121-содержащие цитоплазматические комплексы на содержат пор и представляют собой скопления тубул эндоплазматического ретикулума. Т.е. избыточно экспрессированный рот 121 не способен сразу же встраиваться в состав ядерной оболочки, но способен кардинально модифицировать структуру эндоплазматического ретикулума. С помощью прижизненных наблюдений показано, что после митоза гиперэкпрессированный рот 121 встраивается в состав оболочки и пористых пластинок (lamellae annulata), крайне немногочисленных в культуре HeLa.

Рис. 11. Морфология клеток, экспрессирующих Ьар2(5-СРР. А - после трансфекдии в популяции выявляются клетки с разным уровнем экспрессии Ьар2|3-ОРР, в цитоплазме части из них выявляются гранулы, содержащие экспрессируемый белок (стрелки). Также белок накапливается в ядерной оболочке - треугольные стрелки. Для изучения морфологии этих гранул была проведена корреляционная световая и электронная микроскопия (Б, В). Большими черными стрелками обозначены скопления материала, содержащего Ьар2(3-ОРР, большими черными треугольными стрелками отдельные комплексы мембран. Масштабные линейки - 10 мкм (А), 1 мкм (Б) и 0,1 мкм (В).

При этом в составе ядерной оболочки рот121 преимущественно находился не в составе ядерных пор, а в составе многочисленных выростов внутренней мембраны ядерной оболочки. Т.е. этот белок в избыточном количестве вызывал формирование новых субструктур ядерной оболочки.

4) Нуклеопорин ndcl при гиперэкспрессии подобно рот 121 локализуется в многочисленных цитоплазматических гранулах, которые представляют собой скопления мембран эндоплазматического ретикулума. Избыточные количества этого белка не перераспределяются в ядерную оболочку даже после прохождения клетками митоза.

5) При гиперэкспрессии белка ядерной оболочки Lap20 в цитоплазме выявлялись скопления мембран эндоплазматического ретикулума (содержали белок кальнексин), которые представляли собой вакуоли, образованные циркулярно расположенными и чрезвычайно плотно упакованными мембранами (рис. 11). Несмотря на такую плотную упаковку, Lap2p внутри этих структур обладал высокой латеральной подвижностью, а также, как показали эксперименты с использованием метода восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания (FRAP), свободно обменивался между этими новообразованными структурами и окружающей сетью эндоплазматического ретикулума. Т.е. формирование данных крайне плотных и упорядоченных структур зависело от взаимодействий высокодинамичного белка.

Таким образом, гиперэкспрессия отдельных белков способна кардинально менять ядерную оболочку и структуры, связанные своим генезисом с ядерной оболочкой. Полученные данные свидетельствуют в пользу того, что формирование ядерной оболочки происходит скорее путем самоорганизации, чем самосборки.

Изучение влияния концентрации антигена внутри структуры на возможность выявления белков с использованием специфических антител

Метод иммуноцитохимии остается одним из основных для выявления локализации различных белков в клетке. Одно из важных достоинств этого метода -возможность изучать локализацию не только в световом, но и в электронном микроскопе (ультраструктурная иммуноцитохимия). Однако этот метод имеет и ряд ограничений, которые должны учитываться при проведении исследований. Одно из них касается использования антител к некоторым белкам ядрышка, таким как

В23/нуклеофозмин. Во многих случаях (но не всегда) антитела выявляют В23/нуклеофозмин только на периферии ядрышка, хотя альтернативные методы показывают, что этот белок локализуется во всем объеме гранулярного компонента и в плотном фибриллярном компоненте ядрышка.

Полученные нами данные свидетельствуют в пользу того, что кольцевое окрашивание антителами к некоторым ядрышковым белкам является артефактом метода иммуноцитохимического исследования, связанным с недоступностью для антител зон с высокой концентрацией антигена. В пользу этого свидетельствует несколько наблюдений. Так, после экспрессии в клетках фибрилларина, слитого с GFP, антитела к этому белку выявляют белок во внутренних районах ядрышка только в клетках с низким уровнем экспрессии экзогенного белка. В клетках с высоким уровнем экспрессии антитела выявляют белок только в периферических районах ядрышка.

В случае с В23/нуклеофозмином антитела выявляют эндогенный белок только в периферических участках ядрышка. При экспрессии экзогенного белка, слитого с GFP и FLAG, антитела к В23/нуклеофозмину выявляют белок только в периферических районах ядрышка, хотя экзогенный белок локализуется во всем объеме ядрышка, что видно по флуоресценции GFP. При этом, если экспрессия экзогенного белка находится на низком уровне, то антитела к GFP и к FLAG выявляют белок во всем объеме ядрышка, но если белок экспрессируется на высоком уровне, то эти антитела, подобно антителам к В23/нуклеофозмину, выявляют антигены только в периферической области ядрышка. Таким образом, высокая концентрация антигена внутри структуры препятствует выявлению белков во внутренних районах ядрышек.

Мы разработали простой метод, позволяющий выявлять антигены во всем объеме ядрышка. Суть подхода состоит в том, что после фиксации и пермеабилизации клетки обрабатываются протеазой (одинаковые результаты получены при обработке пепсином, протеазой К и трипсином, но для работы наиболее удобна последняя протеаза). После такой обработки антитела к В23 выявляют белок уже во всем объеме ядрышка, а не только в периферических районах. Этот метод совместим с одновременным выявлением белков, слитых с флуоресцентными белками, а также с электронной иммуноцитохимией.

выводы

1. Хромосомный скэффолд состоит из двух структурно-обособленных доменов -аксиального и периферического. Периферический домен хромосомного скэффолда содержит белки перихромосомного слоя хромосом - pKi-67, фибрилларин, В23/нуклеофозмин)

2. Неполная экстракция белков из хроматина позволяет одновременно выявлять в составе хромосом и остаточные структуры, и частично деконденсированные петлевые домены. Предложена модель организации хромосом, в которой петлевые домены компактизируются в упорядоченные надмолекулярные комплексы, соответствующие элементарным хромомерам, т.е. учитывающую как существование хромосомного скэффолда и петлевых доменов, так и высших уровней компактизации хроматина (хромонем и хромомеров).

3. Установлены морфологические критерии, основанные на анализе структуры клетки в режиме фазового контраста, которые позволяют идентифицировать клетки всех стадий митоза, после экстракции белков с использованием разработанного метода экстракции in situ.

4. На примере белков В23/нуклеофозмина и pKi-67 продемонстрировано, что компоненты перихромосомного слоя входят в состав периферического скэффолда на протяжении всего клеточного цикла. С остаточными структурами связан белок, входящий в состав различных ядерных структур и локализующийся в цитоплазме. Диффузно распределенный нуклеоплазматический белок под действием солевого раствора экстрагируется. Процедура экстракции позволяет выявлять белок, связанный с функциональными сайтами.

5. Показано, что остаточные структуры конститутивного гетерохроматина, формирующего в интерфазных ядрах фибробластов мыши хромоцентры, обладают особой ультраструктурной организацией. Ядерный матрикс фибробластов мыши состоит из четырех морфологически различимых компонентов (ламина, остаточные ядрышки, внутренняя сеть ядерного матрикса и матрикс хромоцентров), что отличает его от описанной для других клеток организации ядерного матрикса, содержащего только три компонента.

6. Гиперэкспрессия белков ядерной оболочки ламина В1, ламина A, poml21, ndcl и Lap2p приводит или к избыточному формированию ядерной оболочки и ее компонентов, или к формированию структур de novo на основе мембран эндоплазматического ретикулума. Представленные данные свидетельствуют в пользу того, что формирование ядерной оболочки как интегрированной надмолекулярной системы протекает по типу самоорганизации.

7. Установлено, что высокая концентрация антигенов во внутренних районах ядрышек является препятствием для проникновения специфических антител в ходе проведения иммуноцитохимического окрашивания, что может приводить к появлению артефактов. Обработка клеток протеазами после фиксации позволяет выявлять белки во внутренних областях структур, малодоступных для антител в силу высокой концентрации в них антигена.

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в журналах из списка ВАК РФ

1. Sheval E.V., Prusov A.N., Kireev I.I., Fais D., Polyakov V.Yu. Organization of higherlevel chromatin structures (chromomere, chromonema and chromatin block) examined using visible light-induced chromatin photo-stabilization // Cell Biology International. -2002. - V. 26.-P. 579-591.

2. Sheval E.V., Kireev I.I., Polyakov V.Yu. Stabilization of macromolecular chromatin complexes in mitotic chromosomes by light irradiation in the presence of ethidium bromide // Cell Biology International. - 2004. - V. 28. - P. 835-843.

3. Sheval E.V., Churakova J.V., Dudnik O.A., Vorobjev I.A. Examination of the proliferative activity of tumor cells in human lymphoid neoplasms using a morphometric approach // Cancer. - 2004. - V. 102. - P. 174-185.

4. Шеваль E.B., Курчатова С.Ю., Тимирбулатова Э.Р., Поляков В.Ю. Получение и характеристика препаратов ядерного матрикса и хромосомного скэффолда in situ // Цитология. - 2005. - Т. 47. - С. 77-82.

5. Sheval E.V., Polzikov М.А., Olson M.O.J., Zatsepina O.V. A higher concentration of an antigen within the nucleolus may prevent its proper recognition by specific antibodies // European Journal of Histochemistry. - 2005. - V. 49. - P. 117-124.

6. Поляков В.Ю., Зацепина O.B., Киреев И.И., Прусов А.Н., Фаис Д., Шеваль Е.В., Коблякова Ю.В., Голышев С.А., Ченцов Ю.С. Структурно-функциональная модель митотической хромосомы // Биохимия. - 2006. - Т. 71. - С. 6-16.

7. Lidsky P.V., Hato S., Bardina M.V., Aminev A.G., Palmenberg A.C., Sheval E.V., Polyakov V.Yu., van Kuppeveld F.J.M., Agol V.I. Nucleocytoplasmic traffic disorder induced by cardioviruses // Journal of Virology. - 2006. - V. 80. - P. 2705-2717.

8. Шеваль E.B., Поляков В.Ю. Роль хромосомного скэффолда в поддержании структурной целостности митотических хромосом // Онтогенез. - 2006. - Т. 37. -С. 405-418.

9. Karpova O.V., Zayakina O.V., Arkhipenko M.V., Sheval E.V., Kiselyova O.I., Poljakov V.Yu., Yaminsky I.V., Rodionova N.P., Atabekov J.G. Potato virus X RNA-mediated assembly of single-tailed ternary 'coat protein-RNA-movement protein' complexes И Journal of General Virology. - 2006. - V. 87.-P. 2731-2740.

10. Sheval E.V., Polyakov V.Y. Visualization of the chromosome scaffold and intermediates of loop domain compaction in extracted mitotic cells // Cell Biology International. - 2006. - V. 30. - P. 1028-1040.

11. Sheval E.V., Polyakov V.Y. The peripheral chromosome scaffold, a novel structural component of mitotic chromosomes // Cell Biology International. - 2008. - V. 32. - P. 708-712.

12. Григорьев A.A., Булычева Т.И., Шеваль E.B., Калинина И.А., Зацепина О.В. Цитологические признаки подавления общего уровня синтеза белка, выявляемые с помощью новых моноклональных антител // Цитология. - 2008. - Т. 50. - С. 338-346.

13. Голышев С.А., Вихрева П.Н., Шеваль Е.В., Кирьянов Г.И., Поляков В.Ю. Роль метилирования ДНК и посттрансляционных модификаций гистонов в организации и поддержании структуры гетерохроматиновых доменов (хромоцентров) // Цитология. - 2008. - Т. 50. - С. 972-982.

14. Sheval E.V., Dudnik О.А., Abramchuk S.S., Polyakov V.Y. Perichromosomal layer proteins associate with chromosome scaffold and nuclear matrix throughout the cell cycle // Биологические мембраны. - 2009. - T. 26. - С. 126-142.

15. Волкова Е.Г., Курчашова С.Ю., Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. Самоорганизация агрегатов мембран эндоплазматического ретикулума в клетках с гиперэкспрессией нуклеопорина РОМ121 // Биологические мембраны. - 2009. -Т. 26.-С. 401-407.

16. Bardina M.V., Lidsky P.V., Sheval E.V., Fominykh K.V., van Kuppeveld F.J., Polyakov V.Y., Agol V.I. Mengovirus-induced rearrangement of the nuclear pore complex: hijacking cellular phosphorylation machinery // Journal of Virology. - 2009. -V. 83. -P. 3150-3161.

17. Брагина E.E., Замятнина В.А., Гаврилов Ю.А., Шеваль Е.В., Волкова Е.Г., Курило Л.Ф., Шилейко JI.B., Левчук Т.Н., Кузьмичев Л.Н., Поляков В.Ю. Упаковка хроматина и фрагментация ДНК: два типа нарушений наследственного материала сперматозоидов // Медицинская генетика. - 2009. - Т. 8. - С. 29-35.

18. Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. Структурная организации ядерного матрикса хромоцентров культивируемых фибробластов мыши // Цитология. - 2010. - Т. 52.-С. 412-419.

19. Krupina K.A., Sheval E.V., Lidsky P.V. Variability in inhibition of host RNA synthesis by entero- and cardioviruses // Journal of General Virology. - 2010. - V. 91. -P. 1239-1244.

20. Musinova Y.R., Lisitsyna O.M., Golyshev S.A., Tuzhikov A.I., Polyakov V.Y., Sheval E.V. Nucleolar localization/retention signal is responsible for transient accumulation of histone H2B in the nucleolus through electrostatic interactions // Biochimica et Biophysica Acta - Molecular Cell Research. - 2011. - V. 1813. - P. 27-38.

21. Volkova E.G., Kurchashova S.Y., Polyakov V.Y., Sheval E.V. Self-organization of cellular structures induced by the overexpression of nuclear envelope proteins: a correlative light and electron microscopy study // Journal of Electron Microscopy (Tokyo). - 2011. - V. 60. - P. 57-71.

22. Volkova E.G., Abramchuk S.S., Sheval E.V. The overexpression of nuclear envelope protein Lap2p induces endoplasmic reticulum reorganization via membrane stacking // Biology Open. -2012 -V. 1. - P. 802-805.

23. Svistunova D.M., Musinova Y.R., Polyakov V.Y., Sheval E.V. A simple method for the immunocytochemical detection of proteins inside nuclear structures that are inaccessible to specific antibodies H Journal of Histochemistry & Cytochemistry. -2012.-V. 60.-P. 152-158.

24. Арифулин E.A., Брагина E.E., Замятнина B.A., Волкова Е.Г., Шеваль Е.В., Голышев С.А., Кинцурашвили JI.H., Кирьянов Г.И., Прусов А.Н., Поляков В.Ю. Компактизация ДНК в сперматогенезе человека. I. Динамика компактизации нуклеогистонного и нуклеопротаминового хроматина в дифференцирующихся сперматидах // Онтогенез. -2012. - Т. 43. - С. 143-153.

Статья в сборнике

25. Sheval E.V., Musinova Y.R. Nucleolar localization/retention signals // Proteins of the Nucleolus: Regulation, Translocation, & Biomedical Functions. Eds. D.H. O'Day and A. Catalano. -2013. - P. 175-196.

Материалы конференций

26. Шеваль E.B., Курчатова С.Ю., Тимирбулатова Э.Р., Поляков В.Ю. Получение и характеристика остаточных структур интерфазных ядер и митотических

хромосом культивируемых клеток in situ // Материалы 1-го Съезда Общества клеточной биологии. - Цитология. - 2003. - Т. 45. - С. 947.

27. Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. Хромосомный скэффолд и высшие уровни компактизации митотических хромосом // Структура и функции клеточного ядра: Тезисы докладов и сообщений XV Всероссийского совещания. -Цитология. - 2005. - Т. 47. - С. 842.

28. Голышев С.А., Шеваль Е.В., Вихрева П., Поляков В.Ю. Гетерогенность структуры и состава хромоцентров в клетках линии L929 // Структура и функции клеточного ядра: Тезисы докладов и сообщений XV Всероссийского совещания. - Цитология. - 2005. - Т. 47. - С. 804.

29. Jarskaja О.О., Kunafina E.R., Sheval E.V., Olson M.O.J., Zatsepina O.V. Premature induction of nucleolus derived foci at metaphase of mitosis by inhibition of CDK-type kinases // 19th International Workshop on the Cell Nucleus (The Wilhelm Bernhard Workshop) - Miinsterschwarzach Abbey, Germany. - 2005. - P. 33-34.

30. Bardina M.V., Lidsky P.V., Sheval E.V., Fominykh K.V., Lindberg A.M., Kurinnov V.V., van Kuppeveld F.J., Polyakov V.Y., Agol V.I. Picornaviruses differently affect nuclear envelope: evidences for mitotic kinase(s) involvmet in cardiovirus-induced nuclear pore complex disorganization // XIV Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses, Saariselka, Inari, Finland. - 2006. - D17.

31. Шеваль E.B., Поляков В.Ю. Периферический домен хромосомного скэффолда -новый парадокс клеточной биологии // Материалы II Съезда Общества клеточной биологии. - Цитология. - 2007. - Т. 49. - С. 807.

32. Шеваль Е.В., Волкова Е.Г., Голышев С.А., Курчатова С.Ю., Поляков В.Ю. Особенности формирования ядерной оболочки при гиперэкспрессии ламина В1 // Материалы II Съезда Общества клеточной биологии. - Цитология. - 2007. Т. -49. С. - 806-807.

33. Шеваль Е.В., Волкова Е.Г., Голышев С.А., Курчатова С.Ю., Поляков В.Ю. Избыточная экспрессия белков ламины и поровых комплексов позволяет влиять на отдельные этапы формирования ядерной оболочки // Тезисы докладов XXII Российской конференции по электронной микроскопии. — 2008. - С. 329.

34. Bardina M.V., Lidsky P.V., Sheval E.V., van Kuppeveld F.J., Polyakov V.Y., Agol V.I. Mechanism of nucleoplasms transport disorder induced by cardioviruses // First

International Summer School "Pathogen-Host Interplay". - Berlin-Potsdam, Germany. -2008.-P. 73.

35. Bardina M.V., Lidsky P.V., Sheval E.V., van Kuppeveld F J., Polyakov V.Y., Agol V.I. Futher characterization of mechanisms of nucleocytoplasmic transport disorder induced by cardiovireses: a key role of nucleoporin phosphorylation? // XV Meeting of the European Study Group on the Molecular Biology of Picornaviruses. - Sitges Barselona, Spain. -2008. - P. 28.

36. Волкова Е.Г., Шеваль E.B. Избыточная экспрессия белков ламины и поровых комплексов позволяет влиять на процесс формирования ядерной оболочки. // Материалы II Всероссийского с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов "Симбиоз-2009". - 2009. - С. 203-204.

37. Мусинова Я.Р., Лисицына О.М., Шеваль Е.В. Несопряженное с функционированием удержание белков в ядрышке: к вопросу о механизме действия сигналов ядрышковой локализации // XXIII Российская конференция по электронной микроскопии. - Черноголовка. - 2010. - С. 394.

38. Мусинова Я.Р., Шеваль Е.В., Поляков В.Ю. Сигнал ядрышковой локализации в гистоне Н2В // Структура и функции клеточного ядра: Тезисы докладов и сообщений XVI Всероссийского совещания. - Цитология. - 2010. - Т. 52. - С. 675-676.

39. Musinova Y.R., Lisitsyna О.М., Golyshev S.A., Polyakov V.Y., Sheval E.V. Nonspecific retention as a possible mechanism for histone H2B accumulation in the nucleolus // American Society for Cell Biology 50th Annual Meeting. - P. 1133.

40. Шеваль E.B. Изучение молекулярных взаимодействий белков в живой клетке с использованием микроскопических методов // Пятая международная конференция с элементами научной школы "Современные проблемы бионаноскопии". - 2011. - С. 70.

41. Мусинова Я.Р., Кананыхина Е.Ю., Лисицына О.М., Шеваль Е.В. Количественный анализ выраженности действия естественных и искусственных сигналов ядрышковой локализации // XVII Российский симпозиум по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел. -2011.-С. 254.

42. Musinova Y.R., Lisitsyna O.M., Kananykhina E.Y., Polyakov V.U., Sheval E.V. The region of histone H2B with potential nucleolar localization (NoLS) activity // 22nd Wilhelm Bernhard Workshop. - 2011. - P. 96.

43. Volkova E.G., Sheval E.V. Self-organization of cellular structures induced by the overexpression of nuclear envelope proteins // 22nd Wilhelm Bernhard Workshop. -2011.-P. 120.

44. Мусинова Я.Р., Лисицина O.M., Кананыхина Е.Ю., Поляков В.Ю., Шеваль Е.В. Механизмы накопления белков в ядрышке за счет неспецифических сигналов ядрышковой локализации // I Всероссийская конференция "Внутриклеточная сигнализация, транспорт, цитоскелет". - Цитология. - 2011. - Т. 53. - С.709.

45. Musinova Y.R., Svistunova D.M., Sheval E.V. Nucleolar localization signals interact electrostatically with nucleolar components // The American Society for Cell Biology Annual Meeting. - 2012

46. Свистунова Д.М., Мусинова Я.Р., Шеваль E.B. Некоторые новые свойства сигналов ядрышковой локализации // Тезисы докладов и сообщений III конференции Общества клеточных биологов - Цитология. - 2012. - Т. 54. - С. 704-705.

47. Musinova Y.R., Svistunova Y.R., Sheval E.V. Charge-dependent dynamic retention of proteins in the nucleoli via nucleolar localization signal // 23rd Wilhelm Bernhard Workshop on the cell nucleus. - 2013. - P. 109.

Соискатель E.B. Шеваль

Заказ № 17-Р/10/2013 Подписано в печать 07.10.13 Тираж 100 экз. Усл. пл. 2,2

ООО "Цифровичок", тел. (495) 797-75-76 www.cfr.ru; e-mail:info@cfr.ru

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Шеваль, Евгений Валерьевич, Москва

Научно-исследовательский институт физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова»

На правах рукописи

05201450079 £ гу?

Шеваль Евгений Валерьевич

СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ СУБДОМЕНОВ ИНТЕРФАЗНЫХ ЯДЕР И МИТОТИЧЕСКИХ ХРОМОСОМ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научный консультант: доктор биологических наук, профессор В.Ю. Поляков

Москва - 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ........................................................................................................................6

Актуальность проблемы........................................................................................6

Цель исследования...................................................................................................8

Задачи исследования................................................................................................8

Научная новизна работы........................................................................................8

Теоретическая и научно-практическая значимость работы.......................10

Основные положения, выносимые на защиту..................................................10

Апробация работы.................................................................................................11

Публикации по теме диссертации.....................................................................11

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.................................................................................................12

Радиально-петельная модель организации митотической хромосомы......13

Экспериментальные подходы к визуализации хромосомного скэффолда....14 Идентификация белков хромосомного скэффолда и их топология в

митотических хромосомах.................................................................................16

Радиальные петли и спирализация хром ant ид.................................................19

Структурная роль белков хромосомного скэффолда......................................21

Хромосомный скэффолд как система дискретных сшивок...........................25

Подвижность белков скэффолда........................................................................27

Высшие уровни компактизации хроматина в митотических

хромосомах..............................................................................................................28

Молекулярная организация элементарных хромонем....................................29

Заключение..............................................................................................................32

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ........................................................................................37

Культура клеток....................................................................................................37

Получение ядерного матрикса/хромосомного скэффолда in situ...................37

Иммуноцитохимическое окрашивание..............................................................38

Хромосомные препараты.....................................................................................39

Электронная микроскопия...................................................................................40

Иммуноэлектронная микроскопия.....................................................................40

Корреляционная световая и электронная микроскопия................................41

\\ 41 \ I

М"

fr1

\ л,

Выявление фокусов транскрипции.....................................................................41

Выявление эу- и гетерохроматина в составе митотических хромосом ....42

Синхронизация культуры клеток..................................................................42

Фиксация клеток с использованием конденсирующего буфера.................42

Иммуноцитохимическое выявление реплицирующегося хроматина,

включившего ВЫи..........................................................................................42

Введение флуоресцентно меченного нуклеотида в клетки........................43

Генная инженерия.................................................................................................44

Плазмиды.........................................................................................................44

Фuбpuллapuн-TagRFP.....................................................................................45

Ьар2/3-ГЬАО.....................................................................................................45

РЕЗУЛЬТАТЫ................................................................................................................46

Глава 1. Идентификация стадий митоза в экстрагированных клетках.............46

Глава 2. Изучение структуры митотических хромосом после экстракции 2М

и полианионами....................................................................................................52

Результаты.............................................................................................................52

Обсуждение.............................................................................................................5 7

Глава 3. Исследование динамики формирования хромосом в профазе митоза 76

Результаты.............................................................................................................76

Морфология хромосом в митозе...................................................................76

Проверка синхронизации культуры клеток и периодизация Б-фазы........78

Продольная дифференциация хромосом в метафазе.................................79

Динамика рано и поздно реплицирующихся фракций хроматина в

профазе и метафазе.......................................................................................80

Обсуждение.............................................................................................................82

Глава 4. Исследование ультраструктурной организации хромосомного

скэффолда........................................................................................................................95

Результаты.............................................................................................................95

Обсуждение.............................................................................................................9 7

Глава 5. Изучение динамики структурной организации периферического

скэффолда в митозе.....................................................................................................101

Результаты..........................................................................................................101

'^У1 *<л

1 I1)

Локализация В23 и pKi-67 клетках HeLa на разных стадиях митоза... 101 Ассоциация pKi-67 и В23 с остаточными структурами на разных

этапах митоза.............................................................................................103

Локализации pKi-67 в ходе митоза (иммуноэлектронная микроскопия) 104 Ультраструктурная организация остаточных структур на разных

стадиях митоза...........................................................................................105

Белки Ki-67 и В23 не экстрагируются солью из сформированных de

novo комплексов...........................................................................................107

Обсуждение..........................................................................................................111

Глава 6. Изучение организации ядерного матрикса хромоцентров

культивируемых фибробластов мыши..................................................................136

Результаты..........................................................................................................136

Обсуждение..........................................................................................................139

Глава 7. Разработка метода выявления малодоступных для специфических

антител ядрышковых антигенов.............................................................................147

Результаты..........................................................................................................148

Обсуждение..........................................................................................................152

Глава 8. Изучение самоорганизации клеточных структур, индуцированной

гиперэкспрессией некоторых белков ядерной оболочки....................................164

Результаты..........................................................................................................166

Основные структурные компоненты ядерной оболочки, выявляемые

при ультраструктурном исследовании клеток линии HeLa-B...............166

Гиперэкспрессия ламина В1 приводит к избыточной продукции

ядерной оболочки.........................................................................................166

Мембраны в областях инвагинаций ядерной оболочки не содержат

поровых комплексов.....................................................................................167

Гиперэкспрессия ламина А индуцирует формирование почек и

выростов внутренней мембраны ядерной оболочки................................169

Гиперэкспрессия нуклеопорина рот121 индуцирует формирование

комплексов эндоплазматического ретикулума........................................169

Гиперэкспрессия нуклеопорина ndcl индуцирует формирование кластеров мембран эндоплазматического ретикулума в цитоплазме. 172

Гиперэкспрессия Ьар2[3 индуцирует формирование модифицированных

комплексов мембран эндоплазматического ретикулума........................172

Обсуждение..........................................................................................................174

ЗАКЛЮЧЕНИЕ...........................................................................................................205

ВЫВОДЫ......................................................................................................................210

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ...............................................212

СПИСОК ОСНОВНЫХ ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.........233

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы

Изучение структурной организации субдоменов интерфазных ядер и митотических хромосом является одним из наиболее важных и активно развивающихся разделов современной биологии. Однако до настоящего времени остаются не решенными многие ключевые вопросы. Прежде всего, речь идет о проблеме компактизации ДНК в составе митотических хромосом (Bian et al., 2012). За более чем столетнюю историю изучения сменилось несколько общепринятых и, как казалось, окончательных гипотез, однако уровень наших сегодняшних знаний в этом чрезвычайно важном вопросе явно недостаточен.

Наибольшее распространение получили две модели, принципиально по-разному трактующие морфологию хромосом. Первая из них, радиально-петельная модель, была сформулирована группой У. Лэммли (Laemmli et al., 1978), и в течение двух десятилетий эта модель была общепринятой (Swedlow, Hirano, 2003). Ключевая идея данной модели состоит в том, что в интерфазных и митотических хромосомах имеются скелетные структуры - ядерный матрикс (nuclear matrix) в интерфазе и хромосомный скэффолд (chromosome scaffold) в митозе, устойчивые к экстракции 2 М NaCl или полианионами. В составе митотических хромосом негистоновые белки, которые формируют скэффолд, локализуются в аксиальных областях. К скэффолду прикрепляется ДНК, формируя петлевые домены, компактизирующиеся при участии гистоновых белков.

Вторая модель, получившая широкое распространение в последнее десятилетие, - хромонемная модель или модель иерархического фолдинга. Современная интерпретация хромонемной модели отталкивается от многократно повторенных наблюдений о существовании в составе митотических хромосом 100—130 нм фибрилл - элементарных хромонем (Sparvoli et al., 1965; Ченцов, Поляков, 1974; Belmont et al., 1989; Matsuda et al., 2010). Недавно было показано, что кроме хромонем в составе хромосом можно выявить еще один уровень компактизации ДНК - фибриллы толщиной около 250 нм (Strukov et al., 2003) или профазные хроматиды (Kireeva et al., 2004). Таким образом, в хромонемной

I ч

I 1

'1 Ч'

модели хромосома трактуется как система иерархически соподчиненных уровней последовательной компактизации хроматина (нуклеосомная фибрилла —> 30 нм фибрилла —► элементарная хромонема —► профазная хроматида —* метафазная хроматида).

По-видимому, различия между этими двумя моделями являются отражением экспериментальных подходов, использовавшихся для изучения структуры хромосом (Belmont, 2002). Так, хромонемная модель основана на изучении нативных хромосом при фиксации in situ, причем, основной массив информации получен при анализе структуры компактизирующихся профазных и деконденсирующихся телофазных хромосом (Ченцов, Поляков, 1974). Важные наблюдения сделаны при искусственной деконденсации метафазных хромосом (Zatsepina et al., 1983). Данные о радиально-петельной организации хромосом получены на модели обработанных экстрагирующим раствором метафазных хромосом (Paulson, Laemmli, 1977). В этом контексте чрезвычайно актуальным представляется получение экспериментальных данных о структуре ключевого компонента радиально-петельной модели, хромосомного скэффолда, на разных этапах митоза с использованием электронно-микроскопических и иммуноцитохимических методов анализа (т.е. методов, которые оптимальны для анализа нативных хромосом).

В последние десятилетия накоплен огромный объем экспериментальных данных о еще одном структурообразующем компоненте ядра — ядерной оболочке, которая во многом определяет трехмерную упорядоченность клеточного ядра и протекающих в нем процессов (Butin-Israeli, 2012). Механизмы формирования этого "внешнего скелета" ядра изучены слабо. Изучение этого вопроса представляется крайне актуальным, так как формирование ядерной оболочки является одной из предпосылок последующего формирования трехмерной упорядоченности внутреннего пространства интерфазного ядра.

Цель исследования

Задачи исследования

4. Изучить эффекты гиперэкспрессии белков ламина В1, ламина А, рош121, пс1с1 и Ьар2р на формирование ядерной оболочки и связанных с ней структур.

Научная новизна работы

Впервые установлено, что хромосомный скэффолд состоит из двух структурных доменов - периферического и аксиального. С использованием иммуноэлектронной микроскопии показано, что аксиальный домен хромосомного скэффолда содержит топоизомеразу Па, периферический домен содержит белки перихромосомного слоя (рКл-67, фибрилларин, В23/нуклеофозмин).

Разработан и апробирован оригинальный воспроизводимый метод изучения морфологии остаточных (устойчивых к экстракции) структур хромосом на всех этапах митоза. Впервые детально охарактеризована ультраструктурная организация компонентов ядерного матрикса и хромосомного скэффолда, образованных белками перихромосомного слоя. Показано, что на всех этапах митоза существуют остаточные структуры, содержащие белки

В23/нуклеофозмин и рКл-67, напротив, диффузно-распределенный нуклеоплазматический белок, не связанный со своими функциональными сайтами, под действием солевого раствора экстрагируется. Это позволяет использовать процедуры экстракции для выявления фракций белков, связанных с функциональными сайтами.

Впервые установлено, что остаточные структуры конститутивного гетерохроматина, формирующего в интерфазных ядрах фибробластов мыши хромоцентры, обладают особой ультраструктурной организацией, позволяющей отличать их от остальной сети ядерного матрикса. Ядерный матрикс фибробластов мыши состоит из четырех морфологически различимых структурных компонентов - ламина, остаточные ядрышки, внутренняя сеть ядерного матрикса и матрикс хромоцентров.

Установлено, что гиперэкспрессия отдельных белков ядерной ламины (ламина В1 и ламина А), нуклеопоринов (рош121 и пс!с1) и внутренней мембраны ядерной обололочки (Ьар2(3) влияет на формирование клеточных структур. При этом могут изменяться морфологические признаки не только тех структур, в состав которых входят изучаемые белки в норме, но и связанные с ними структуры. Влияние отдельных белков на биогенез структур свидетельствует в пользу того, что формирование ядерной оболочки происходит по пути самоорганизации.

Предложен оригинальный метод выявления белков в клеточных структурах, малодоступных для антител в силу высокого содержания в них антигенов. Показана его совместимость с одновременным анализом флуоресцентных белков и с иммуноэлектронной микроскопией.

, „I ( ,1

Теоретическая и научно-практическая значимость работы

Настоящая работа является фундаментальным научным исследованием, в котором получены новые данные о структурной организации хромосомного скэффолда, о существовании в его составе двух обособленных доменов -аксиального и периферического. Представлены экспериментальные данные в пользу упорядоченной упаковки петлевых доменов. Предложена оригинальная модель структурной организации митотических хромосом. Обосновано положение о том, что формирование ядерной оболочки как интегрированной надмолекулярной системы происходит по типу самоорганизации. Полученные результаты расширяют существующие представления о структурной организации хроматина и хромосом.

Разработанный автором метод экстракции клеток in situ и метод выявления антигенов в малодоступных для антител клеточных структурах могут быть использованы при изучении биологии клетки.

Результаты работы внедрены в практический курс «Цитогенетика» и лекционные курсы «Клеточная биология» и «Гистология» Факультета биоинженерии и биоинформатики Московского государственного университета имени М.В. Ломоносова.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Хромосомный скэффолд состоит из двух структурно-обособленных доменов - аксиального и периферического.

2. Петлевые домены в составе хроматина компактизируются в упорядоченные надмолекулярные комплексы.

3. Компоненты перихромосомного слоя входят в состав остаточн

Информация о работе

Шеваль, Евгений Валерьевич
доктора биологических наук
Москва, 2013
ВАК 03.03.04

Диссертация

Структурная организация субдоменов интерфазных ядер и митотических хромосом - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы