Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сопряженность ядерного и центриолярного циклов в поликарионах

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Сопряженность ядерного и центриолярного циклов в поликарионах"

московский ордена ленина, ордена трудового красного знамени и ордена октябрьской революции государственный университет имени м. в. ломоносова

На правах рукописи

МАНАНДХАР Гаурн Шанкпр

УДК 576.356

сопряженность ядерного И

центриолярного циклов

в поликарионах

03.00.11 —Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1991

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии биологического факультета МГУ им. М. В. Ломоносова.

Научный руководитель доктор биологических наук Г. Е. Онищенко.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук М. Е. Аспиз, кандидат биологических наук В. Б. Быстрепская.

Ведущее учреждение — Институт морфологии человека АМН СССР.

Защита состоится 17 октября 1991 г. в 15.30 часов на заседании специализированного совета Д 053.05.68 при Московском государственном университете им. М. В. Ломоносова (Москва, 119899, Ленинские Горы, МГУ, Биологический факультет).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан 17 сентября 1991 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е. Н. Калистратова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Взаимодействий . между ядерным и центриолярннм циклами до сих пор остается не достаточно изученным. В нормальных делящихся клетках эти циклы сопряжены друг с другом. Подобно ядерному циклу, сч.стоящему из' удвоения хромосом в интарфазэ, их расхождения в ходе митоза и образования дочерних ядер в последующей интерфазе, центриолярный цикл состоит и? репликации центриолей и образования диплосом в интерфазе, распределения диплосом между дочерними клетками в митозе и разъединения материнской и дочерней центриолей в интерфазе следующего клеточного цикла. Структурные изменения центриолей в цикле сопровождаются изменениями их функциональной активности, состоящей из учаотия в образовании- сети цитоплазматичеоких микротрубочек в течение интерфазы и полисов митотического веретена в процессе деления клеток.

Представления о взаимосвязи ядерного и центриолярного циклов возникли в основном в результате экспериментов, проводимых на яйцах и клетках раннего ембрионального развития. Эти исследования показывали, что центриолярный и ядерный циклы на зависят друг от друга. Удвоение центриолей (центросом) и их разъединение, как оказалось, не прекращаются при енуклеации клеток (siuder ®t ai. , 1986) или экспериментальном блокировании ядерного цикла (Uazia. <*l- , I960; Sluder, Rieder, 1985). В таких клеточных системах центриоли (центросома) многократно репродуцируются даже в тех условиях, когда клетки не вступают в митоз. Это происходит при подавлении цикла активации ракторов отимуляции митоза (ФСМ; «tPf - Maturation Promoting Faotor), которое в свою очередь может быть вызвано ингибированчем синтеза циклинов (Gard et at. , 1990; Sluder <?t ai., 1990). Из таких нвблюдениий следует , что в яйцах, и в клетках ранних стадий эмбриогенеза, которые содержат резервный пу:.' строительного материала, цикл удвоения цонтриолой на контролируется ядром. Напротив, доказано, что в культуре клеток удвоение цонтриолой подавляется при блокировании синтеза 'IK (Rattner, PhillipE, 1973) ИЛИ РНК И бвЛКОВ (Stubblefeld, De Poor, 1972; De Poor, Stubblefeld, 1974; Phillips, Rattner,

1976). Сопоставление данных, полученных не культивируемых соматических клетках, с данными, полученными на яйцах и ембриональных клетках, показывает, что ядро осуществляет контроль над центриолярным циклом» контролируя синтез предшественников пооле очередного раунде митотичеокий вктивности. Когда клетка содержит избыток строительного материала, могут происходить многодетные циклы , удвоения центриолей даже при отсутствии их митотичеокой активации.

Исследования функционального состояния центриолей в экспериментах, включающие микрошгьокшя центриолей (центросом)

В ООЦИТЫ Хепорие (Кагвеп<;± в£ с.1. , 1 }, ПОНвШВвЮТ, ЧТО введенные центриоли образуют ввезды или веретено в вовиоимооти от того, в каком периоде клеточного цикла находится яйцо. Период клеточного цикла, в свою очородь, определяется ФСЯ» (ИетфохЧ, К1гво1шег, 1984), КОТОрнв ЩШЛИЧОСКИ ВКТКВИруются циклинами (м!пвЬи11 «*1. ,1999). , '

Таким образом, существующие в литература данные свидетельствуют, что разные собнтия шштриеяярного цикла могут быть сопряжены с различными ооШтиями клеточного цикла, такими, как ядерный цикл и цикл активации ФСМ, с помощью разных механизмов. .. •'

Поликарповы, образующиеоя при слиянии клеток, являются удобной клеточной системой для изучения взаимосвязи ядерного и центриолярйого . циклов' Путем слияния гетерофавных клеток возмокно получить такие поликариош, в которых центриоли оказываются . под непосредственным воздействием факторов, относящихся к различным периодам клеточного цикла.

В слившихся клетках гетерофазные ядра синхронизируются различными путями. Синхронизация интерфазных ядер происходит за счет индукции преждевременного синтеза ДНК в ядрах с1-периода, т.е. укорочения продолжительности сI-периода (йао, оыгпеоп, 1970;1972)# и ва счет удлинения продолжительности а2-периода для ядер , находящихся в етом периоде (сьовь, 1984).

При слиянии митотических и интерфазных клеток возможна индукция образования преждевременно конденсированных хромосом (ПКХ -пеоп, 'йад, 1970) интерфазними ядрами, либо формирование

- з~

телофазоподобных ядер (ТПЯ - ikeuohi et ai. ,1970) из митотических хромосом. Наггравлониа процоосп зависит от соотношения интерфазных ядер и митотических фигур (Ikeuohi al- .1971). Характер течения ядерных циклов в слившихся клетках в значительной степени изучен (обо.Рингерц^, Сэвидж, 1979).

До настоящего времени исследования цонтриолярного цикла в экспериментально полученных поликарионах носят предварительный характер и не позволяют сделать фундаментальных заключений. Ранние исследования показывают, что в олившихся клетках центриоли группируются , образуя общий центр организации микротрубочек (ЦОМТ; Wang et al. ,1979; Taeein et al. ,1985). Ho до сих пор оставалось неясным, как протекают центриолярные циклы гетерофазных центриолей, оказавшихся в общей цитоплазме поликариоиа в результате слияния гетерофазных клеток. Также было на иоолэдовано, как факторы, индуцирующие ПКХ или ТПЯ, ВЛИЯЮТ На структуру и функцию центриолей. Исследование взаимосвязи центриолярного и ядерного циклов в слившихся клетках покавывает но только влияние ядерных или цитоплазматичоских факторов на центриолярный цикл, но также позволяет выяснить особенности взаимоотношений цонтриолярного цикла с другими составляющими клеточного цикла, например, ядерным циклом и циклом активации ФСМ.

Цель и основные задачи работы. Основными задачами настоящего исследования являлись: ,

1. разработка метода получения большого числа поликариснов, способных к митотической активности;

2. . изучение особенностей протекания митоза в поликарионах, полученных методом, разработанным в данной работе;

3. изучение отруктурно-функиионалышх изменений центриолей в слившихся клетках, содержащих ПКХ и ТПЯ;

4. изучение структуры митотичеекого веретена и кшнзтохоров в' поликарионах, содержащих ПКХ и ТПЯ.

Науная новизна. В настоящей работе предложен новый метод слияния клеток, который состоит в обработке клеток раствора, содержащим 15% диметилсульфоксида (ДМСО) в сыворотка крупного

рогатого скота, перед и после обработки. клеток ПОЛИЭТИЛ9НГЛИКОЛ9М (ПЭГ) . Этот метод позволяет получить большое число слившихся клеток о высоким уровнем митотической активности.

Исследование митотической активности слившихся клеток показало, что при вотуплашш в митоз поликврионов в них чвото наблюдаются асинхронные митотические фигуры, ПКХ и ТЛЯ. Митоз таких поликврионов , как правило, не завершается цитокинезом и образованием дочерних клеток, В самих поликарионах в процессе митоза часто образуются микроядра, либо происходит пикнотизяция отдельных ядер и хромосомных наборов.

В настоящей работе впервые изучена ультраструктурв центриолей слившихся клеток. Показано, что объединение в составе поликариона цитоплазматяческого содержимого гетерофазных клеток оказывает заметное влияние на циклические изменения структуры и функции тех центриолей, -которые вошли в состав поликариона. Клеточные партнеры 01 и 02-периодов влияют противоположным образом на цикл репликации центриолей, что выражается в подавляющем етот процесс воздействии 01 партнера и стимулирующем - 02 партнера.

Далее показано, что при 'переходе интерфазных ядер в состояние ПКХ происходит митотичаская активация интерфазных центриолей. И наоборот, формирование Й1Я ив митотических хромосом - сопровождается утратой центриолями признаков митотической активности. Аналогичным ббрвзом ведут себя кинетохоры, трехслойная структура которых появляется при образовании ПКХ и раврушается при образовании ТЛЯ.

Научно-првктиче окое значение работы. Настоящая работе имеет значительный теоретический интерес для понимания характера взаимосвязи различных ообытий клеточного цикла. Полученные данные показывает, как цеитриолярный цикл изменяется одновременно'о ядерным циклом. Можно предположить, что ето проиоходит под влиянием, оходных факторов, возникших в поликарионе после объединения гетерофазных клеток.

Эти георетичеокие выводы могут быть использованы в курсах

по цитологии и кл9точной биологии, читосмой в университетах, медициноких и педагогических институтах.

Предлагаемый в настоящей работе повий мотод слияния клеток имеет практическое значение, так как позволяет полутать гибридные клетки, формирующиеся в результате второй волны митотической активности поликорионов. Таким образом, данный мотод может быть полезен для клеточно-инженорных работ также, как хороша опробованные методы слияния клоток с помощью ПЗГ или ПЭГ в сочетании с ДМСО.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали конфлуентно растующую монослойную культуру клеток СПЭВ. Слияние проводили в чашкох Петри при температуре 37°С. Клетки трижды промывали 15% раствором диметилсульфоксиди (ДМСО) 'в 8БЯ сыворотке крупного рогатого скота. Затем клетки обрабатывали 50% раствором полиэтиленгликоля (ПЭГ) (м.в.4000, рН8,0). Через I мил раствор ГГЭГ разводили в два раза средой 199 и еще через 1Б сек раствор ПЭГ сливали, обрабатывали клетки тремя сменами 1БЖ раствора ДМСО в сыворотке (по 16-20 сок) и помещали' клетки в полную ростовую среду. Поело слияния клетки фиксировали раствором Буэна (пикриновая, кислота: формалин: уксусная кислота 15:5:1) и окрашивали смесью сафранина, генцианового фиолетового и оранжевого. G.

В качестве контроля служили кратки, которые обрабатывали 1БЯ> раствором ДМСО в сыворотке или ВЬ% сывороткой по I мин и фиксировали через 0,Б ч и 2,0 ч. Для сопоста' ¡ения с оригинальным методом слияния в работе также проводили слияние клеток о помощью ПЭГ и о помощью ДМСО+ПЭГ.

Перед слиянием маркировали клетки G1, s и G2 периодов методом, двойного мечония (Оншденко и др., 1978). Клетки инкубировали с Зн-тимидшюм (концентрация 40 КБк/мл) в течение-' 15 мин, промывали триады и инкубировали в среде, содержащей 1СГ°М нерадиоактивного тимидина в течение 4,5 час.. Затем клетки инкубировали с ,4С-тимидшюм (концентрация 160 КБк/mj. в течение 16 мин, промывали трижды средой и проводили слиянио

- б -

клеток. Покрытые емульсией препвраты экспонировали .7 суток при 4°С.

Для электронной микроскопии клетки фиксировали 2,5% раствором глютарового альдегида, дофиксировали 1% раствором 0в04 и заключали в эпоне 812 по стандардной методике. После отделения стекол препараты покрывали радиоавтографичеокой эмульсией. Автографы анализировали с помощью фазово-контрастного микроскопа, отбирали слившиеся клетки с определенным метением ядер или хромосом, их отмечали метчиком и оерийно резали на ультрамикротоме ькв. Серийные орезы интэрфазных и митотических поликартюнов (в полном объеме клетки) анализировали в електрошшх микроскопах Ни IIB, Ни 12 и , JEM 100В.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Таблица I. Относительное содержание одно- и многоядерных клеток i интерфазе и митозе при различных способах обработки культур! клеток (Ж на 1000 клеток). Фиксация через 0.5 и 2 ч подл< обработки.

Клетки контроль 8558 сыворотки + 15Ж среды 15« ДМСО 85* ÖHBO-ротки 50$ ПЭГ * ПЭГ ДМСО * * по дан ному методу

0.5 2 0.5 2 0.5 о 0.5 о л с \J* S

Одноядерные \

в интерфазе 95.7 94.6 95-3 94.4 94.4 92.5 91 .8 88.6 88.4 80.1 76

в митозе •-3.6 5.2 4.3 4.7 4.9 1.9 2.6 1.7' 3.8 1.8 2

Многоядерн.

в интерфазе 0.7 0.2 о.э 0.7 0.6 5.4 5.5 9.0 7.3 14.9 20

в митозе 0 0 0.1 0.2 0.1 0.2 0.1 0.7 0.5 3.2 1

» Мерсер, Баоерга 1982 »» GhoBh, Paweletz 1984

I.Пролиферация слившихся клеток.

Как показано в таблице I, мэтод, предлагаемый е настоящей работе, позволяет получить высокий уровень слияния клеток и приводит к стимуляции митотической активности образовавшихся

поликарионов. Комбинированное воздействие на клзтки ПЭГ, ДИСО и сыворотки е высокой концентрации е 2 раза более эффективно для слияния клеток, чем обработка клеток только ПЭГ или ПЭГ в сочетании о ДМСО.

Два факта доказывают, что при обработках, вызывающих слияние клеток, происходит стимуляция митозов в поликарионах. Во-перЕЫХ, частота встречаемости митотических фигур е культура клеток после проведения процедур слияния в 1,7 раза больше, чем митотический 1шдекс контрольной культуры. Во-вторых, увеличение митотичеокого индекса в слившихся клетках происходит в основном за счет возрастания числа профаз. Это, вероятно, обеспечивается быстрым переходом а2 ядер в профазу. Частота других фаз митоза при проведении слияния на меняется.

Радиоавтографический метод двойного мечения ядер показал, что число профазных ядер, меченных 3Н, в слившихся клетках в 3,5 раза больше, чем в контроле, а намеченных - в 6,2 раза (Табл.2). Это означает, что меньшая часть профазных ядер образовалась из ядер, относящихся к раннему о2-пвриоду, но большая часть - из ядер, относящихся к позднему С2-периоду, в результата их более быстрого перехода в профазу.

Таблица 2.Относительное содержание митотичеоких фигур в одно- и мйогоядерных клетках (% на 1000 ядер). Клетки маркировали методом двойного мечения с помощью ■'н- и 4С- тимидина.Фиксация через 0,5 ч. после слияния.

Клетки тип ' ( митотические фигуры пкх ТПЯ

мечения профаза метафа-за анафаза телофа- за+ци- токинез

немеченые 4,0 3,0 0 1,0 4 0 0

контроль 3Н+14С % 0 15,0 0 12,0 0 1,0 0 2,0 0 0 0 Л

немеченые 24,а 5,5 0 0 10,9 5,8

голикарионы 3Н+14С 0 0 0 0 8,0 0

н3 57,1 13,0 0,3 2,1 15,5 ¡0,9

Таким образом,предлагаемая в настоящей работе'модификация метода олияшя клеток моноолойной культуры имеет свои особенности. Она позволяет получить более "высокий уровень слияния клеток, чем исходные методы, лежащие в основе данной модификации. Другой особенностью этого опособа являетоя индукция в процессе обработок митотической активности слившихся клеток. Уровень митотической активности, как оказалось, не связан с преимущественностью слияния интерфаэных и

митотических клеток. Интенсивное слияние клеток и стимуляция митозов в поликарионах вызваны, вероятно, сложным воздействием раствора ДМСО в сыворотке виоокой концентрации и ПЭГ. Только обработка ПЭГ или ПЭГ в комбинации с ДМСО менее эффективны, как для слияния клеток, ток и в отношении митотической активности поликарионов.

Слившиеся клетки проявляют два пика митотической активности. Первая волна митозов, которая начинается вскоре после слияния клеток, представлена в основном поликарионами с асинхронными митотическими фигурами, в том числе и такими, как ПКХ и ТПЯ (рис.1). Маркировка клеток перед слиянием методом двойного мечения клеток с помощью 3Н- и 14С-тимидина показывает, что ПКХ могут быть • меченными 3И-, 3нП4С или 1*Ь-тимидином, в то время как ТПЯ оказываются немеченшми или меченными только 3Н-тимидином (табл.г).

Данные литературы показывают, что интерфазные ядра всех периодов способны'переходить в состояние ПКХ (Rao <*г ai. , 1976; Obara «i ai. , 1974). Выполненное в настоящей работе двойное меченио клеток перед их слиянием подтвердило эти данные. Но, как оказалось, ядра в-периода, в меньшей степени способны к .такому переходу, чем ядра других периодов интерфазы. Вероятно, ток как хроматин в ядер наиболее диспергирован (Goliins ai. , 1984; Напкв et ai. , 1983), он менее, чем хроматин ядер других периодов, подвержен действию индукторов ПКХ, присутствующих в Поликарпове благодаря слиянию интерфазного партнера с митотическим.

ТПЯ чаще обнаруживаются в поликарионах, содержащих большое число инторфааных ядер. Эти наблюдения согласуются с ранее

Рио.1. Изменение содоржшшя поликарионов, включающих различные митотические фигуры, микроядра, шкнотизировашшй хроматин и шкнотизировшшые ядра. По оси абсцисс - длительность культивирования после слияния, по оси ординат - доля поликарионов, % . Вертикальные отрезки у точек - 95%-вде доверительные интервалы средних значений долей.

извеотними данными о том, что при низком • соотношении митотических и интерфазшх партнеров вокруг метафазных хромосом индуцируется образование ядерной оболочки (ОЬага ©I а[., 1974). Увеличение числа поликорионов с ТПЯ через 1,5 часа после слияния клеток объясняется, по-видимому, тем, что к этому моменту в асинхронных митотических клетках из профазных ядер сформировались метафавные хромосомы, которые и перешли в состояние ТПЯ под влиянием факторов, исходящих от интерфазного партнера.

Вслед за первой волной митозов в популяции поликарионов наблюдается увеличение числа поликарионов о пикнотизированным хроматином. Телофазы и цитокинез в этот период являются крайне редкими.Также редкими при первой волне митозов являются синхронные митотические фигуры в поликарионах. Отсутствие многополюсных телофаз и цитокинеза поликарионов во время первой волны митозов означает, что асинхронное вступление в митоз отдельных ядер поликариона и патологические процессы конденсации и деконденсации хроматина (ПКХ и ТПЯ) ведут к незавершенности деления поликарионов. ТПЯ могут далее деконденсироваться и из них формируются полиплоидные ядра или микроядра. '

Появление большого числа поликарионов с пикнотизированным хроматином показывает, что при асикхроннооти митотических фигур в поликарионе возможна гибель части хроматина и самих клеток.

Вторая волна митотической активности поликарионов наблюдается • через период времени, равный примерно продолжительности периода генерации данной культуры (14-20 часов). Во время второй волны слившиеся клетки делятся главным образом синхронно (рис.1), митозы в таких клетках являются многополюсными, завершаются анафазным расхождением хромосом, телофазой и цитокинезом.

Преобладание синхронных делений при второй волне митозов в популяции поликарионов указывает на то, что к этому моменту могут завершаться процессы синхронизации геторофазиых компонентов.Такие митозы ¡заканчиваются делением поликарионов и обрасювш&ем одноядерных гибридных клеток.

В то же время в этот период можно видеть небольшое число поликариояов о асинхронными митотическими фигурами, включающими ГООС. ТГО и гипнотизированный хроматин встречаются крайне редко. Но после второй волны заметно возрастает число поликарионов, содержащих микроядра. Эти микроядра имен paзJшчннe• размеры, т.к., вероятно, при их образовании разное число хромосом может быть окружено ядерной оболочкой.

Как после первой волны митозов, так и после второй, растет число поликарионов с пшшотизировашшми ядрами. Пикнотизация ядер, по-видимому, является результатом патологии митозов поликарионов, а не непосредственного воздействия на интерфазше ядра ДМСО, сыворотки и ПЭГ. Об этом говорит тот факт, что увеличение числа поликарионов о пикнотическими ядрами наблюдается пооле каадой волны митозов.

2. Центриоли в интерфазных слившихся клетках.

Электронномикроскопическое изучение слившихся клеток (преимущественно дикарионов), содержащих гетерофазше ядра, показывает, что центриоли, принадлежавшие клеткам партнеров, находившихся в разных периодах _ клеточного цикла, синхронизируются также, как и ядра. Содержимое цитоплазмы гэтерофазных партнеров оказывает противоположное действие на структурно-функциональные изменения гетерофазных центриолей.

В С1~в слившихся клетках е центриоли реплицируются нормально, либо не реплицируются (клетки 3 и в, табл. 3). В одной клетке, содержащей 4 центриоли, реплицируется только одна (клетка 4), которая, возможно, является дочерней цен^иолыо и относится к з-периоду.

В «1-в сдавшихся клетках с1~ партнер, по-видимому, обладает доминирующим влишшом на цоитриолярный цикл. В течение 1,Б часа сосуществования центриолей раз1шх периодов в 01-3-поликарионе наблюдается подавление репликации центриолей, либо7 асинхронность их репликации- аГ-партнер, по-видимому, оказываот антагонистическое воздейстьиа на продвижение н-центриолэй по циклу. Такой ингйбнрующий эффект может иметь две прич.-ли.

ТаОлица 3. Центриоли слившихся клеток, содержавших-разные комбинации интерфззных ядер. Фиксация через 0.5 ч после слияния.

Клетки ядра число одиночных центриолей чиоло цетриолей с процентриол. ЧИСЛО дишюсом

1 101-18 1с+1 1+1сп -

г • 101-1 в 2 1+1°

3 1G1-1S 2+1 СП+10ПВ - -

4 101-18 1+2сп , 1 ■ -

5 1Q1-1S 2 1+1° -

6 1Q1-1S 2+10П+1° - -

7 101-102 5+1сп - -

а 101-102 1+1П - 1+1п

9 101-102 1е 1 1+1п

10 101 -102 - 1+1сп 2

11 101 -102 5+1сп -

12 2G1-1G2 6 - 1

13 1S -102 .,сп 3 -

14 1S -102 3+1п 2 -

15 1Б -102 1 i спв 2

16 1Б -102 1+1п . 2 1

17 2S -2G2 4 6 -

с- сателлит; п- придатки; в- вакуоль

Вогпервых, факторы репликации цеитриолей или .строительный материвл для этого перераспределяются в цитоплазме слиешихся клеток и таким образом могут разводиться до концентрации, недостаточной для репликации. Во-вторых, процесс синхронизации •ядер слившихся партнеров может быть связан с обменом регулярными белками между гетерофаэными партнерами (Johnson, Rao, 1971) и в результате те гены ядер s-периода, которые ответственны за- репликацию центриолей, могут оказаться выключенными до тех пор, пока не завершатся процессы оинхронизации гетерофа-эных ядер.

Асинхронность репликации только одной • из центриолей комплексе, включающего 201 и 2S центриоли, может быть также

связана с разведением факторов репликации. В норме в делящихся клетках, как правило, репликация центриолей происходит строго синхронно (УогоЬде?, СЪег^воу, 1992; А1 теу, 1985), вероятно, потому, что обе центриоли взаимодействуют с достаточным количеством рогуляторцнх факторов. Но в работе Такера и соавторов (Тикег «I <ч. , тдв1) среди клеток культуры РШ2 обкаружены некоторые клетки, в которых репликация центриолей происходит в самом начале в-периода и, как оказалось, такие центриоли реплицируются асинхронно. Это может говорить о том, что в самом начала 3-периода количество факторов репликации еще не достаточно для репликации обеих центриолей.

В одних 01-а2 слившихся клетках, как и ожидалось, обнаруживаются две пары рештцированннх центриолей -и две одиночные центриоли. В других а!-02 слившихся клетках наблюдаются взаимные влияния пертнеров на цантриолярние циклы. Это выражается в том, что 32 партнёр может индуцировать репликацию 01 центриолей. Преждевременная репликация' 01 центриолей обнаружена в двух слившихся клетках. Репликация таких центриолей может быть как синхронной (клетка 10), так и асинхронной (клетка 9), что, по-видимому, также происходит из-за недостатка факторов репликации в таких клетках. Но оам факт стимуляции репликации 01-центриолей 02-паргнером говорит о том, что в клетках о2-периода еще сохраняются факторы репликации центриолей, хотя и в недостаточном .количестве. О другой стороны, 01 партнер может оказывать влияний на 02 центриоли, индуцируя преждевременное разъединение и дезориентацию центриолей диплосомы (клетка 7 я II). Такое поведение центриолей, Фактически, характерно для 01-периода (ИоЪЫпв ее а1. ,1968; УогоЬ^еу, СЬеМвоу, 1982). Таким ОбрВЗОМ, в я1-02 слившихся клетках партнеры воздействуют на состояние центриолей, продвигая их по циклу, что проявляется в индукции репликации 01 центриолей и в индукции разъединения центриолей диплосом о2~дариода.

Асинхронность репликации в центриолей наблюдается также в некоторых е-02 слившихся клетках. Но при атом асинхронно реплицироваться может как дочерняя (клетка 13), так и

материнская (клетка 1Б) центриоли. В других S-G2 слившихся клетках соотав центриолей не отличаотся от нормального, за исключением того, что центриоли некоторых g2 даплосом дезориентированы.

Сходный стимулирующий эффект G2 партнеров на репликацию центриолей обнаружен в S-G2 слившихся клетках. В таких клетках также наблюдается как синхронная, так и асинхронная репликация '. s-цетриолей. Присутствие асинхронно реплицирующихся s центриолей в B-G2 слившихся клетках указывает на то, что в момент слияния в партнер не имел реплицирующихся центриолей. После же объединения s клетки с' G2 клеткой произошла индукция преждевременной репликации, но, как уже обсуждалось, вероятно, ив-ва нехватки факторов репликации центриоли реплицировались асинхронно. Интересным является факт, что при асинхронности репликации нет предпочтительного включения в этот процесс материноко0 или дочерней центриолей. Это означает, что для репликации материнская и дочерняя центриоли готовы в равной степени.

В слившихся клетках, включающих различные комбинации партнеров, центриоли в меньшей степени способны к ассоциации со структурами» участвующими в образовании микротрубочек, ножели . центриоли контрольных клеток СПЭВ. По-видимому, происходящая после слияния реконструкция цитосколета, б том 'гасло его компонента, состоящего из микротрубочек, сопровождается дисперсией структур, инициирующих сборку микротрубочек. Сходное отделение от центриолей ЦОМТ, описано ранее для друщх клеток (Кагуег et ai., 1984; Tasein et' ai. , 1985). Нельзя исключить,' . '.го нарушение ассоциации центриолей с ЦОМТ может иметь отношение к процессам, ведущим к раохоадению cl центриолей на значительное расстояние или к разъединение центриолей g2 диплосом. Так, показано, что деполимеризация микротрубочек может препятствовать агрегации центриолей в общую группу (Wang et <*l. , 1979î Buendia =-t al. , 1990).

3. Центриоли, киыетохоры и веретено при индукции пкх и тпя.

ИнтерфаэниЕ? центриоли при индукции I1KX. ЦбНТрИОЛИ Gl,S И

02- пэриодов становятся митотически активными при переходе интерфазшх ядер в состошше ПКХ. Как материнская, так и дочерняя центриоли 01 партнеров, решшцированные в центриоли и разъединенные материнская и дочерняя центриоли 02 диплооом ассоциируются с фибриллярным гало и формируют митотические веретена. Даже короткие дочерние центриоли э-диплосом, . как оказалось, могут отделяться от материнских центриолей и организовывать полюса полуверетен (клетка 6, Табл.4). Кроме того, в некоторых слившихся клетках, содержащих 61 или <31-02 ПКХ, обнаружены неактивные центриоли. В одной из клеток такая неактивная центриоль располагалась рядом с хромосомами (клетка 15), в другой клетке (клетка 14) - рядом с полюсом веретена, содержащим активную диплосому. • • г

Митотически активные 01, в и 02 центриоли организуют собственные области митотического веретена, часто окруженные пучками промежуточных филаментои.

В митотических слившихся метках многополюсное веретено является сложным комплексом полуверетен, которые включают в свой состав ПКХ интерфазного или хромосомы митотического партнера.

Маркировка ПКХ в составе полинариона радиоввтографическим методом двойного мочения клеток перед слиянием и последующее электрошюмикроскопическое изучение тех же поликарионов позволили получить прямые доказательства, что центриоли 01, Б и аз-периодов становятся митотически активными тогда, когда ядра этих же периодов переходят в состаяниэ ПКХ. Материнская и дочерняя центриоли 01 и И2-периодов и даже короткие дочерние центриоли в-периода опособны к ассоциации о фибриллярным гало в том случае, если они находятся в разъединенном состоянии. Согласно данным литературы, отделение дочерней центриоли от материнской можно экспериментально индуцировать воздействием на митотические клетки, при этом происходит митотическая активация дочерних центриолей, и они наряду о материнскими участвуют в-организации собственных полюсов митотического . веретена (Онищенко И др.,1979,- Кегувг а1.,. 1984! В1ис1ег, Шеаог, 1985).

Таблица.4. Центриоли слившихся клеток, содорык:разные типы ПКХ. Фиксация через 0.5 ч поело слияния.

число

митогически активных

ЧИСЛО

Клет тип диплосом одиночных митогически неак-

ки. ПКХ центриолей тивных центриолей

1 01 2- 2 _

2 01 2 1 1

3 С1 2 2 -

4 . в 4 __

5 в 4 - -

6 3 1 б -

7 8 4 - -

8 Б 4 , - -

9 02 4 — „

10 С2 4 - -

11 02 2 4 -

12 02 - 8 -

13 01- (¡2 2 б _

14 01- -02 3 3 1

15 01- -02 3 3 1

16 01- -С2 - 9 1

Но, в изучаемых нами поликарионах не все цеытриоли оказывались активированными. Некоторые центриоли, лежащие рядом о .'хромосомами или полюсами веретена, обнаружены нвми поликарионах, которые обязательно содержат с! ПКХ. Ранее были сообщения о существовании митотически неактив!шх центриолей, лежащих _ вне полюсов веретена при делении цоликарионов .(Pвteгвon, Бегпв, 1979; 1>еу «£ аг..1989). В экспериментах Петерсона и Бориса были использованы при слиянии культура РШ и культура 'человеческих клеток в состоянии покоя." Также показано, что при слиянии тимоцитов (аО-пэреход) с ооцитами мыши, ядро тимоцита переходит в состояние ПКХ, дашюсомы ассоцируются с фибриллярными гало, но на участвуют в организации митотического веретена (БгоПов! са. , 1986). Вполне вероятно, что и в наших экспериментах часть клеток, которые мы идентифицировали как клетки 01-периода, на самом деле находились в аО-периоде и повтому их центриоли оказывались

митотически неактивными. В поликарионах, которые включают только 02 ПНХ, центриоли, е том числе и отделившиеся от материских дочерние 02 центриоли, митотически активны. Вероятно, 01/60 партнер может оквзывать антагонистическое влияние на митотический аппарат. Об атом говорят наши данные о дезорганийзции г.итотического веретена и его полюсое в некоторых поликарионах, содержащих 01 ПЮС. - ■

Кинетохорн пкх. Кинетохоры, имеющие четко. выраженнуй трехслойную структуру и ассоциированные с кинетохорными шжротрубочками, обнаружены при .исследовании ПКХ позднего э-периода (меченные %+14С) и 02-периода (меченные 3Н). У некоторых ПКХ кинетохоры имели трехслойную структуру, но кинвтохорные микротрубочки отсутствовали.' При изучении' б ПКХ диски трехслойных нинетохоров обнаруживались только в той чвоти ПКХ, которые были более конденсированы. У 61 ПКХ трехслойные кинетохоры не обнаружены. • , '

Мито-тичвскиа цянтриолн прм индукции ТПЯ. В О ЛИВШИХСЯ

клетках, образованных интерфазными и митотическими партнера*®, при формировании из митотических хромосом ТПЯ центриоли митотического партнера теряют свою активность. Вокруг таких центриолей исчезает фибриллярное гало и митотическое веретено дезорганизуется. Около отдельных митотических диплосом можно Ейдеть остатки фибриллярного гало. В некоторых клетках

Таблица б. Центриоли слившихоя клеток, содержавших ТПЯ. Фиксация через 0.5 ч после слияния.

Клэт ки. ядра 'гасло одиночных центриолей число центриолей с процэнтриолыо число диплосом

1 Ю1-13 5+1сп+1с+1п - ■ -

2 101-102 П1п - 4

3 13 -102 5+1ПВ а 1

4 - 2в2 3+1п - 2+2П

5 301-18-102 б+1спв+2сп1С 1+1 СП 2

с- сателлит; п- придатки; . е- вакуоль

дишюсода, расположенные рядом с ТПЯ, дезорганизуется, на их разъединившихся центриолях появляются сателлиты, придатки (клетка I, Табл.Б) и даже контактирующие с ними вакуоли (клетка 3).

Цоитрмоли «нтерфааного партнера в слившихся клетках,

содержания тпя но претерпевают заметных изменений. В некоторых клетках наблюдается.дезориентация центриолей С2 диплосом. Чаще •всего центриоли располагаются по цитоплазме слившейся клетки случайным образом, что указывает на отсутствие фиксированного геометрического клеточного центра в таких клетках.

Кинетохори тпя. При индукции Т1Ш происходит дезорганизация трехслойной структуры кинвтохоров митотичвских хромосом. Остатки кинвтохоров обнаруживаются в виде сгустков фибриллярного материала, локализованных в инвагинациях ТПЯ. К таким остаточным кинетохорам может подходить небольшое число микротрубочек, которые, по-видимому, являются остатками кинетохорных фибрилл веретена. Такие пучки микротрубочек остаются ориентированными к ближайшим диплосомам. Структура кинвтохоров, н&блюдавмая в ТПЯ, аналогична той, которая описана на стадии телофазы в клетках куль туш р*,К2 в норме (Лоов, 1973).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Полученные в настоящей работе и представленные в литературе данные об особенностях центриолярного цикла в слившихся клетках, в вкспериментах по ингибированию ядерного цикла, при микроинъекциях центриолей в ооцити позволили' г делать заключение, что центриолярный цикл может быть сопряжен с другими событиями клеточного цикла различными способами. Если в ооцитах ядерный. и центриолярный циклы могут протекать независимо друг от друга, то в соматических клетках на события цонтриолярнопо цикла ядро влияет посредством контроля над синтезом строительного материала. Митотические факторы, которые контролируют ядерный (хромосомный) цикл, оказывают влияние на • центриолярный цикл, регулируя функциональный переход центриолей от интерфаэного к митотическому состоянию и обратно.

Тот факт, что переход интерфэзных ядер в состояние ПКХ сопровождается митотической активацией центриолей, позволяет преположить, что факторы, индуцирующие ПКХ, также вызывают митотическую активацию центриолей. В таком качестве могут служить ФСМ, которые в комбинации с циклинами активируются в делящихся клетках (Draetta et ui. , 1989). Повышение уровня. ФСМ прк вступлении в митоз, как показано, вызывает распад ядерной оболочки и конденсацию хромосом (Surikara. et al., 1979; Miake-Ъуе et al. , 1983; Newport, KirBOhner, 1984). Индукция ПКХ митотиче скими факторами, присутствующими в цитоплазме, продемонстрирована в экспериментах по слиянию митопластов с инторфазными клетками (Sunkara о* ai. , 1979; Рао и др., 1986). Карсенти и соавторы, показали, что центриоли СцентрЬсомы), инъецированные в ооцит, участвуют в организации веретена, если ооцит находится в стадии метвфаоы второго деления оозревания, и если центриоли оказываются волязи конденсированных хромооом (Kareenti et al. , 1984). АНВЛОГИЧШМ ОбрЭЗОМ МОЖНО ОбЪЯСНИТЬ наблюдаемое нами сопряжение индукции ПКХ и митотической активации интерфазных центриолей в слившихся клетках.

Кроме того, настоящее исследование прямо показывает, что митотическая активация центриолей не зввиоит от цикла репродукции центриолей. Центриоли могут становиться митотичеоки активными, минуя синтетический период.

Но, вероятно, что сама по себе активация ФСМ не достаточна для функциональной митотической активации центриолей GO-периода и части центриолей GI-периода. Это предположение согласуется о данными о существовании в клетках al-периода ингибитора ФСМ (Adlakha »1 ai., 198З; Garhart, Kireohner, 1984). По-видимому, появление в поликарионах факторов, содержащихся в GI/co партнерах, может не только нарушать структуру митотического веретена, но и препятствовать митотической активации центриолей, которые могут служить мишенями для этих факторов.

По данным литературы ФСМ также прямо или, косвенно участвуют в формировании и разрушении трехслойной структури кинетохора (Ghosh, Faweleta, 1937). Трансформация

преэумптивного кинетохора в трехслойную пластинку может бить сложным процессом, включающим конденсацию и требующим участия нескольких типов белков, которые, как показано, присутствуют в кинетохора (o63.Kingwell, Rat trier, 1989), и некоторые из них характерны только для митотических кинетохоров (Hadiaczky «?t с.i. , 1989). Нельзя исключить, что при переходе в период ранней интерфазы клетки лишены таких белков и в слившихся клетках '. митотический партнер но может полностью компенсировать этот дефицит. Поытому кинетохоры GI-ПЮС лишены трехслойной отруктуры. Другим объяснением может быть предположение о том, что в ПКХ 01 и раннего s периодов хроматин болоо диспергирован, чем в ПКХ других периодов (Hanks <?t at. , 1983; GoXI.ins «?£ , 1904), и поэтому для формирования трехслойного кинетохора требуется более высокий уровень критической концентрации ■ необходимых факторов, который ц существует, по-видимому, в партнерах позднего В- и с2-периодов, проявляясь в трехслойной структуре кинетохоров ПКХ этих периодов.

■ В слившихся клетках формирование ТПЯ является процессом, полностью противоположным образованию IIKX (Mbtuui et at , 1972). События, происходящие с хромосомами при возникновении ТПЯ сходны, с теми, которые наблюдаются в талофозе и при переходе в Gl-период. В нормальном клеточном цикле телофазе предшествует падение уровня активности ФСМ (Gar-hart, KirBohner, 1984), вызванное деградацией циклшюв (uinahuii «t. ai. , 1939; Ыихтау Kircohner, 1989). Вероятно, в слившихся клетках появлению ТПЯ предшествует быстрое падение активности ФСМ, которое может происходить под влиянием содержимого интерфазных i iQTOK, в особенности GI и ршпю'го в-периодов (Adlakha -t <»1. , 1983)• Природа ' активных факторов интерфазшх клеток пока остаеоя неясной, но есть данные, что их образование в интерфавных клетках требует синтеза РНК и белков (obara -i ai. ,1975). • •

Потеря митотической активности центриолнми, дезорганизация веретена и трехслойных кинетохоров при индукции ТПЯ может • совпадать со снижением уровня активности ФСМ.

вывода

1. Предложен модифицированный метод слияния клеток о помощью комбинированного воздействия ПЭГом, ДМСО и сывороткой в высокрй концентрации, по числу образующихся поликарионов в 2-3 раза более эффективный, чем стандартные методы. В популяции слившихся клеток вскоре после слияния наблюдается большое чиоло по!ликарионов с асинхронными митоппескими фигурами, ПЮС и ТЛЯ , а через период времени, равный периоду генерации, митоз поликарионов является синхронным.

2. Центриолярный цикл в интерфазных' слившихся клетках (дикарйонах) имеет следующие особенности:

а) на репликацию центриолей гетерофазиые клеточные партнеры оказывают противоположное влияние - 00/01 партнеры подавляют репликацию в центриолей, а 02 партнеры индуцируют .образование процентриолей на 01 центриолях или на еще не реплицировавшихся Б центриолях; '

б) асинхронность репликации 01 или 8 центриолей возможна в 01-в, 01-аг.и.8-сг слившихся клетках;

в) 00/01 партнеры индуцируют дезориентацию центриолей 02 диплооом.

3. Центриолярный цикл в поликарионах о асинхронными митотичаскими фигурами, ПКХ и ТЛЯ имеет следующие особенности:

а) центриоли интврфазных партнеров становятся миготйчаски активными, когда их ядра переходят в состояние ПЮС;

б) дочэрние центриоли 01, в и 02-периодов способны к митотической активации, если они отделяются от материнской центриоли»

в) отдельные центриоли могут быть митотичеоки неактивными, если в Поликарпове присутствуют 01(СО) или 01-02 ПКХ.

г) центриоли митотических партнеров становятся неактивными, когда хромосомы переходят в состояние ТЛЯ.

4. Исследование митотической веретена показало, что при индукции ПЮС трехслойные кгаютохоры и кинетохорные" • микротрубочки присутствуют только в Е и С2 ПКХ, при индукции ТПЯ трехслойные кинетохоры и веретено раопвдаютоя, оствточныо кинетохоры имеют фибриллярную структуру.

По материалам диаоертвции опубликоваш следующие работы:

I. Ыштндхар Г., Ходяков А.Л. Исследование миготичоской активности поликарионов// 29-ая конференция молодых ученых МГУ (I983D.

й. Манавдхар Г., Ходяков А.Л., Оншцошга Г.Е. Особошюсти пратвкашш митоза в шлтшрионах образующихся при слиянии КЛеТоК// Цитологи« ~ 1991 - 1.33 - N.3 - С.39-47.

a. Utuiundhar U., Khodjakov i.L., Gniehohenko G.E. Modified РШ-ЙкЙО-йегши methoa inditooS high rate of fusion// Cell Biol'.Int.Rep. - 1990 - V.14a - 1482.

4. Maiianclliar 0., OniBliohenko G.E. Oentriolee oynohrotlize as nuclei in /used cells. Submitted to Ear.J.Cell Biol.

5. Uanandhar G., Onichohenko G.E. Centriolas aro mitotieally activated or inactivated when nuclei are induoed to PCG or TIN formations. Submitted to Eur.J.Oell Biol.

i

v