Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Формирование единого клеточного центра и реорганизация цитоскелета в поликарионах

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Формирование единого клеточного центра и реорганизация цитоскелета в поликарионах"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

На правах рукописи

ЯРОВАЯ Наталья Олеговна

УДК 576.314

ФОРМИРОВАНИЕ ЕДИНОГО КЛЕТОЧНОГО ЦЕНТРА И РЕОРГАНИЗАЦИЯ ЦИТОСКЕЛЕТА В ПОЛИКАРИОНАХ

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1996 г.

Работа выполнена на кафедре цитологии и гистологии Биологического факультета МГУ.

Научный руководитель - доктор биологических наук

Г.Е.ОНИЩЕНКО

Официальные оппоненты: - доктор биологических наук

И.А.ПРУДОВСКИЙ - кандидат биологических наук м.Н.БОЛТОВСКАЯ

Ведущее учреждение - Институт биологии развития им.А.Н.Кольцова РАН

у-3"'

Защита состоится " (Ь " 1(АСц,ь\ 1996 г. в / ^_часов

на заседании специализированного совета Д 053.05.68 при Московском государственном университете им. М.В.Ломоносова (Москва, 119899, Воробьевы Горы, МГУ, Биологический факультет) .

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан " " 1996 г.

Ученый секретарь специализированного совета кандидат биологических наук

Е.Н.Калистратова

общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Многоядерные клетки встречаются как в нормальных тканях растений и животных, так и при ряде патологических процессов, например, при опухолевом росте и воспалении. Для экспериментальной индукции многоядерности в настоящее время используют различные агенты, нарушающие прохождение цитокинеза в клетках, а также метод клеточной гибридизации, в основе которого лежит спонтанное или искусственно вызванное слияние клеток с образованием клеточного гибрида.

Наряду с объединением геномов, при слиянии происходит перемешивание мембранных органелл и объединение всех элементов цитоскелета. Цитоскелет представляет собой совокупность белковых фибриллярных структур, ответственных за пространственную организацию клетки. За счет основных компонентов цитоскелета - микротрубочек, промежуточных филаментов и микро-филаментов - клетка осуществляет такие процессы, как движение, прикрепление к субстрату, поддержание формы, эндо- и эк-зоцитоз, внутриклеточный транспорт органелл и закрепление их в цитоплазме, формирование митотического веретена и цитокинез.

Существует ряд работ, посвященных участию отдельных элементов цитоскелета в процессе слияния и их организации в по-ликарионах различного происхождения (Wang et al., 1979; Лясс, 1986; Zheng, Chang, 1991; Онищенко, Петращук, 1994а). Однако ни в одной работе не изучалась динамика становления единой цитоскелетной системы поликариона. Неясно, какие изменения претерпевают отдельные элементы цитоскелета в поликарионах, образовавшихся в результате слияния, с момента слияния до митоза, т.е. в ходе жизненного цикла многоядерной клетки.

Известно, что в одноядерных клетках вблизи ядра располагается структура, получившая название клеточного центра. Понятие клеточного центра иногда отождествляется с понятием "центросома" (Mazia, 1984), однако показано, что в центре клетки, помимо центриолей и перицентриолярного материала, содержатся такие мембранные органеллы, как комплекс Гольджи и пузырьки, происходящие из него (Thyberg, Moskalewski, 1985).

В литературе нет данных о том, существует ли в многоядерной клетке структура, соответствующая клеточному центру одноядерных клеток. В некоторых работах рассматривается пове-дени в многоядерных клетках отдельных элементов, входящих в состав клеточного центра. Известно, что в одних поликарионах происходит объединение центриолей и центров организации мик-

- г -

ротрубочек (ЦОМТ) слившихся клеток, но в других такого объединения не наблюдается (Matthews et al., 1967; Watt et al., 1980; Tassin et al., 1985a; Онищенко, Петращук, 19946). Для некоторых многоядерных клеток показано перемешивание элементов комплекса Гольджи и лизосомных балков (Ktistakia et al., 1990; Storrie et al., 1990). Однако, неясно, на каком этапе жизненного цикла поликарионов происходит объединение орга-нелл, входящих в состав клеточного центра, связано ли его возникновение, с преобразованиями элементов цитоскелета и изменяется ли его состояние в жизненном цикле поликариона.

Известно, что все компоненты цитоскелета тесно взаимосвязаны .(Griffith, Pollard, 1978; Lemerrier et al, 1982; Stei-nert, Roop, 1988). Нарушая организацию одного из цитоскелет-ных компонентов, возможно изменить и распределение двух других компонентов. Так, разборка микрофиламентов цитохалазином В вызывает, с одной стороны, перераспределение промежуточных филаментов (Wolf, Mullins, 1985), с другой стороны, увеличение числа микротрубочек, отходящих от центросомы (Онищенко, 1993). Возникает вопрос, скажется ли обработка поликарионов цитохалазином В на процессе реорганизации в них цитоскелета.

Вместе с тем, согласно данным литературы, перемещение внутриклеточных органелл, входящих в состав клеточного центра, определяется различными компонентами цитоскелета (Wang et al.,. 1979; Thyberg, Moskalewski, 1985; Eckert, 1986; Kuznet-sov et al., 1992). Следовательно, обработка клеток цитохалазином В может повлиять не только на организацию цитоскелета многоядерной клетки, но и на судьбу ее клеточного центра.

Цель и основные задачи работы. Целью данной работы явилось изучение этапов формирования клеточного центра в многоядерных клетках, возникших в результате слияния; выявление тех преобразований цитоскелета, которыми сопровождается формирование единого клеточного центра, а также изучение поведения мембранных органелл (ядер и лизосом), тесно связанных с клеточным центром. В настоящей работе были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Исследовать в многоядерных клетках в период между слиянием и началом первых митозов, т.е. в течение жизненного цикла поликариона:

- организацию микротрубочак и виментиновых филаментов;

- организацию центриолярного аппарата;

- распределение ядер;

- 3 -

- организацию комплекса Гольджи;

- распределение лизйсом.

2. Исследовать влияние цитохалазина В на процесс формирования единого клеточного центра и характер реорганизации цитоскелета в жизненном цикле поликарионов.

Научная новизна результатов исследования. В настоящей работе впервые детально описана динамика преобразований клеточного центра и различных элементов цитоскелета (микротрубочек и промежуточных филаментов) в жизненном цикле поликарио-на. Охарактеризовано поведение мембранных органелл, входящих в состав клеточного центра или тесно связанных с ним (ядра, Комплекс Гольджи и лизосомы). Впервые установлено, что в жизненном цикле поликарионов объединенная центросома дважды становится активной в качестве ЦОМТ и однократно в качестве центра организации промежуточных филаментов (ЦОПФ). Это означает, что клеточный центр поликариона в разные периоды жизненного цикла имеет не только различную структуру, но и разные функциональные свойства.

Показано, что обработка поликарионов цитохалазином В, разрушающим актиновый компонент цитоскелета, вызывает, во-первых, перестройку других элементов цитоскелета, во-вторых, влияет на динамику формирования единого клеточного центра и характер его функционирования, инактивируя центросому в качестве ЦОПФ.

Научно-практическое значение работы. Теоретическое значение работы заключается в установлении взаимосвязи между преобразованиями цитоскелета и изменениями в локализации мембранных органелл, приводящими к формированию единого клеточного центра многоядерной клетки.

Результаты работы могут быть использованы при исследовании взаимодействий между различными компонентами цитоскелета, а также между цитоскелетом и различными мембранными органел-лами; при изучении процессов активации в клетках центра организации промежуточных филаментов (ЦОПФ); при анализе цитоскелета многоядерных клеток, образующихся при различных формах патологии; при изучении процесса митотического деления поликарионов, образовавшихся в результате слияния, в норме и при разрушении в них микрофиламентов, а также для исследования структурной организации потомков таких многоядерных клеток.

Практическое применение результаты работы могут найти при исследовании поликарионов, возникающих в тканях в ходе

различных патологических процессов, таких как воспаление, опухолевый рост, вирусные и другие виды инфекций. Результаты работы показывают, что единый клеточный центр возникает в по-ликарионах, жизненный цикл которых завершается митозом. Поэтому присутствие в поликарионах активно функционирующего клеточного центра может служить косвенным свидетельством проли-феративных возможностей поликарионов, обнаруживаемых при разных формах патологии.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на конференции молодых ученых России, посвященной 50-летию Ака1 демии медицинских наук (1994); на международном симпозиуме "Биологическая подвижность" (Пущино, 1994); на 4-м Европейском конгрессе по клеточной биологии (Прага, 1994); на заседании кафедры цитологии и гистологии Биофака МГУ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на машинописных страницах и, состоит из следующих глав: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты, обсуждение, выводы. Иллюстративный материал представлен 2 таб-

3 с,

лицами и 47 рисунками. Список литературы включает работ на русском языке и-^¿работы на иностранных языках.

материал« и методы

В работе использовались клетки культуры СПЭВ. Для получения поликарионов клетки сливали с помощью полиэтиленгликоля по стандартной методике (Ghosh, Paweletz, 1984).

Для проведения иммунофлуоресцентных исследований клетки окрашивали при помощи моноклональных антител к тубулину (Sigma, Т-9026) для выявления микротрубочек или к виментину (Sigma, V 6630) для выявления промежуточных филаментов. Для выявления пизосом клетки окрашивали витальным красителем нейтральным красным. Для изучения распределения центриолей, локализации комплекса Гольджи и вторичных лизосом проводили анализ ультраструктуры поликарионов на серийных ультратонких срезах. Приготовление материала для электронно-микроскопических исследований проводилось по стандартной методике.

Фиксацию клеток в контрольных культурах для иммунофлуоресцентных исследований и выявления лизосом при помощи нейтрального красного проводили через 2, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 и 30 ч после слияния. Для анализ^ ультраструктуры контрольные поликарионы фиксировали через 2, 5, 18 ч после слияния.

Для разрушения микрофипаментов в опытные культуры через 2 ч после слияния добавляли цитохалазин В в конечной концент-

рации 2 мкг/мп с одновременной сменой среды культивирования. Опытные культуры фиксировали для иммунофлуоресцентных исследований и выявления лизосом через 2.5, 3, 4, 5, 6, 12, 18, 24 и 30 ч после проведения слияния. Для анализа ультраструктуры клетки фиксировали через 2.5, 5, 6 и 18 ч после слияния.

результаты исследования 1. организация цитоскелета в поликарионах

Мы выделили три основных варианта распределения микротрубочек и промежуточных филаментов в поликарионах: 1) радиальная организация - фибриллярные элементы расходятся ради-ально от околоядерного фокуса к периферии клетки; 2)- концентрическая организация - фибриллярные элементы образуют кольцо вокруг ядер, сгруппированных в центре клетки; 3) беспорядочное распределение - нет никакой преимущественной ориентации пучков фибрилл и фокусов схождения. На Рис. 1 представлены графики изменения численности 'клеток с различной организацией элементов цитоскелета в ходе жизненного цикла поликарионов.

Организация микротрубочек в поликарионах в контроле. Через 2-4 ч после проведения слияния в большинстве поликарионов наблюдается беспорядочная сеть микротрубочек без выраженных ЦОМТ. Распределение'микротрубочек неравномерно: в некоторых участках клетки проходят многочисленные пучки микротрубочек, в других же частях цитоплазмы микротрубочки практически не встречаются. Через 4 ч появляются поликарионы с радиальным расположением микротрубочек (21.5%). ЦОМТ, как правило, довольно рыхлые и располагаются в центральной части клетки.

Через 5 ч после проведения слияния в большинстве поликарионов расположение пучков микротрубочек радиальное (72.7Ж). Микротрубочки отходят от 1-2 рыхлых ЦОМТ, располагающихся в центре поликарионов. В некоторых клетках нет выраженных ЦОМТ, но и в этом случае микротрубочки располагаются радиально.

Через 6 ч в большинстве поликарионов (80.9%) микротрубочки располагаются беспорядочно. Лишь в некоторых клетках есть ЦОМТ и радиальное расположение микротрубочек (19.1%).

Через 12 ч после проведения слияния большая часть поликарионов имеет радиальную ориентацию микротрубочек с хорошо выраженными ЦОМТ (вз.7%). В некоторых клетках расположение микротрубочек концентрическое (2.3%). Часть клеток имеет беспорядочное распределение микротрубочек (16.ОХ).

Через 18 ч после проведения слияния в преобладающем большинстве поликарионов расположение микротрубочек радиаль-

Л'НОН

(Ы»)

Рис. 1. Изменение численности клеток с различной организацией цитоскелета в ходе жизненного цикла многоядерных клеток. По оси абсцисс - время, прошедшее после проведения слияния (ч); по оси ординат - процент поликарио-нов с беспорядочным (.), радиг.льным ( + ) или концентрическим (д) расположением микротрубочек или промежуточных филаментов. А - микротрубочки, контроль; В - микротрубочки, цитохалазин В; С - промежуточные филаменты, контроль; Р - промежуточные филаменты, цитохалазин В.

ное (95.8%). ЦОМТ в таких поликарионах имеются, либо отсутствуют, пучки микротрубочек могут доходить или не доходить до периферии клетки. Число поликарионов с концентрическим или беспорядочным распределением микротрубочек незначительно.

Через 24-30 ч после проведения слияния в поликарионах наблюдается беспорядочная сеть микротрубочек ('54.5% и 55.2%, соответственно),, в некоторых клетках на периферии проходят радиальные пучки микротрубочек. В некоторых поликарионах выявляются митотйческие ЦОМТ, сеть микротрубочек в таких клетках беспорядочная. Схема преобразований сети микротрубочек в контрольных поликарионах представлена на Рис. 2А.

Организация микротрубочек в поликарионах при действии цитохалазина В. Через 2.5-3 ч после слияния в большинстве поликарионов (82.8% и 94.6%, соответственно) наблюдается интенсивное диффузное свечение в области расположения ядер. На периферии клеток выявляются короткие радиально расположенные микротрубочки. Такое распределение микротрубочек мы считали радиальным, хотя в данном случае выявить ЦОМТ в многоядерных клетках не представлялось возможным. Через 4 ч после проведения слияния локализация микротрубочек сходна.с той, которая наблюдается через 2,5-3 ч после слияния, но в ряде клеток видны более толстые пучки микротрубочек, отходящие от центральной части поликариона и проходящие между ядрами.

Через 5 ч после слияния в большей части поликарионов выявляются толстые, грубые пучки микротрубочек, расходящиеся радиально от одного или нескольких ЦОМТ на периферию (80.3%). Диффузное свечение в центре поликарионов отсутствует.

Через 6 ч после слияния сеть микротрубочек в поликарионах беспорядочная, тонкофибриллярная; грубых пучков микротрубочек и ЦОМТ не обнаруживается (84.130. В центре поликарионов часто наблюдаются области диффузного свечения, однако, не такие значительные, как через 2.5-4 ч после слияния.

Через 12 ч после слияния беспорядочную сеть микротрубочек имеют 24.6% поликарионов, в 73.9* многоядерных клеток микротрубочки располагаются радиально. В некоторых поликарионах выявляются 1-2 ЦОМТ, локализованные в центральной части клеток. Встречаются также поликарионы с диффузным свечением в центре и беспорядочным распределением пучков на периферии.

Через 18 ч после слияния практически во всех исследованных поликарионах выявляются хорошо выраженные ЦОМТ, от которых радиально отходит большое количество микротрубочек на пе-

Рис. 2. Схема преобразований сети микротрубочек в многоядерных клетках в контроле (А) и при действии цитохала-эина В (Б), а - 2 ч; а' -2.5 ч; 6,6' -5ч; в,в' - 6 ч; г,г' - '12-18 ч; д,д* -24-30 ч после проведения слияния.

риферию клетки (96.4%). Число в' клеток с беспорядочным или концентрическим распределением микротрубочек незначительно. Через 24-30 ч в большинстве клеток наблюдается беспорядочная, тонкофибриллярная сеть микротрубочек (71.0% и 78.6%, соответственно). Есть также клетки с расположением микротрубочек, близким к концентрическому (10.ОХ) и с радиальной ориентацией микротрубочек (11.4%). Схема преобразований сети микротрубочек в обработанных цитохалази-ном В многоядерных клетках представлена на Рис. 2Б.

Организация промежуточных филаментов_в поликарионах в

контроле■ Через 2-5 ч после проведения слияния в поликарионах выявляется беспорядочная тонкофибриллярная сеть промежуточных ■ филаментов. Промежуточные филаменты через 2-3 ч после слияния часто располагаются неравномерно: в некоторых участках цитоплазмы проходят крупные пучки промежуточных филаментов, в то время как в других частях клетки промежуточных филаментов практически нет. Через 4-5 ч сеть промежуточных филаментов выглядит более равномерной, чем через 2-3 ч после слияния. Ядра обычно окружены плотным кольцом промежуточных филаментов, но вокруг некоторых ядер такого кольца не образуется.

Через 6-12 ч после слияния в большинстве поликарионов сеть промежуточных филаментов беспорядочная (94.4% и 92.5%, соответственно), однако появляются отдельные поликарионы с

радиальной ориентацией фибрилл (5.6% и 7.5%, - ответственно).

Через 18 ч после проведения слияния бо, •• нство клеток имеют радиальный характер расположения промежуточных филамен-тов (94.8%). В околоядерной области часто видны фокусы схождения промежуточных филаментов, их количество может быть различным. Впервые появляются отдельные поликарионы с концентрическим расположением промежуточных филаментов (2.6%), а также сохраняюся немногочисленные многоядерные клетки с беспорядочным распределением промежуточных филаментов (2.6%).

Через 24 и 30 ч после проведения слияния поликарионы обычно имеют радиальную ориентацию промежуточных филаментов (67.6 и 80.8%, соответственно), но встречаются также поликарионы с беспорядочным (26.5% и 11.5%, соответственно) и концентрическим -расположением виментиновых филаментов (5.9% и 7.7%, соответственно). Схема преобразований сети виментиновых филаментов в поликарионах в контроле представлена на Рис. ЗА.

Организация промежуточных Филаментов в поликарионах при действии цитохалазина В. Через 2.5 ч после слияния промежуточные филаменты выявляются в виде беспорядочной, неравномерной сети. В арборизированных клетках пучки промежуточных филаментов видны в цитоплазматических отростках. Через 3-5 ч в поликарионах сохраняется малоупорядоченное расположение промежуточных филаментов, но в ламеллярной цитоплазме некоторых клеток образуются отдельные радиальные пучки промежуточных филаментов. Фокусов схождения промежуточных филаментов в клетках не наблюдается. Через 5 ч во многих поликарионах выявляются более грубые пучки промежуточных филаментов.

Через 6 ч после слияния распределение промежуточных филаментов в поликарионах (94.9%) остается беспорядочным, но промежуточные филаменты сливаются в толстые протяженные пучки, распределенные по всей цитоплазме поликарионов. Отдельные ядра не всегда окружены сетью виментиновых филаментов: иногда ядра тесно сближены, между ними нет промежуточных филаментов, но есть общее кольцо промежуточных филаментов вокруг всех ядер. На периферии клеток тяжи промежуточных филаментов сливаются и располагаются параллельно клеточному краю. В образовавшихся в результате арборизации цитоплазматических отростках, проходят мощные пучки виментиновых филаментов.

Через 12-18 ч выявляется лишь небольшое число толстых пучков промежуточных филаментов, характерных для предыдущего срока фиксации. Сеть виментиновых филаментов, как правило,

з-нщ

Рис. 3. Схема преобразований сети виментино-вых филаментов в многоядерных клетках в контроле (А) и при действии цитохалазина В (Б), а - 2 ч; а' -2.5 ч; б, б* - 6 ч; в, в' - 12-18 ч; г, г' - 24-30 ч после проведения слияния.

беспорядочная (95.7% и 97.7Я>, соответственно), густая и тонкофибриллярная без выраженных фокусов схождения. Часто выраженного околоядерного кольца промежуточных филаментов не наблюдается. В единичных клетках распределение промежуточных филаментов близко к радиальному (4.3Ж и 7.356, соответственно) .

Через 24-30 ч после слияния в поликарионах сохраняется беспорядочное расположение промежуточных филаментов (97.7% и 98.0%, соответственно). В ламеллярных участках поликарионов свечение диффузное или тонкофибриллярное. Иногда толстые тяжи промежуточных филаментов проходят по краю клетки. В области некоторых ядер сеть промежуточных филаментов отсутствует. Схема преобразований сети промежуточных филаментов в поликарионах при действии цитохалазина В представлена на Рис.ЗБ.

2. ХАРАКТЕРИСТИКА СОСТОЯНИЯ КЛЕТОЧНОГО ЦЕНТРА И СВЯЗАННЫХ С НИМ ОРГАНЕЛЛ 2.1. Расположение ядер в поликарионах Расположение ядер в контрольных поликарионах. Через 2-4 ч после проведения слияния ядра беспорядочно разбросаны по всей цитоплазме поликарионов. Через 5 ч в большинстве клеток все ядра располагались в центральной части клетки в виде

кольца или полукольца, либо группой. Компактнее расположение ядер в контрольных поликарионах наблюдается и на более поздние сроки (6-30 ч). Через 18-30 ч после слияния выявлялись многоядерные клетки, содержащие интерфазные и профазные ядра, и многочисленные многополюсные митотические клетки.

Расположение ядер в поликарионах при действии цитохала-зина В. Через 2-4 ч после слияния ядра были разбросаны по всей цитоплазме многоядерной клетки. Через 5-6 ч ядра располагались кольцом, либо в виде компактной группы в центре по-ликариона. Такая локализация ядер сохранялась через 12-18 ч после слияния. Через 24-30 ч в клетках с небольшим числом ядер, ядра часто были смещены на периферию поликарионов, но встречались и клетки, в которых ядра еще были сгруппированы в центральных участках цитоплазмы. Через 18-30 ч после слияния выявлялись поликарионы с асинхронными (интерфазными и профаз-ными) ядрами и многополюсные митотические клетки.

2.2. Ультраструктурная организация поликарионов 2.2.1. Ультраструктура контрольных поликарионов.

2 ч после слияния. Центриоли, как правило, были разбросаны по всей цитоплазме поликаринов и располагались по-оди-ночке, либо парами, вблизи от какого-либо ядра поликариона. В трех клетках были обнаружены кластеры центриолей. Область расположения центриолярного кластера не отличалась по составу органелл от остальной части цитоплазмы поликарионов. Во всех поликарионах число центриолей было вдвое больше числа ядер.

Центриоли по своей морфологии не отличались от центриолей одноядерных клеток культуры СПЭВ. Каждая центриоль была окружена тонко-фибриллярным материалом, На дистальном конце отдельных центриолей выявлялись 2-3 сателлита. Микротрубочки отходили как от тонко-фибриллярного материала, так и от некоторых сателлитов. Число микротрубочек, отходящих от центриолей, было незначительным. Во многих клетках были обнаружены первичные реснички или мембранные пузырьки. На дистальном конце таких центриолей может быть видна втулка и придатки, обращенные к мембранному пузырьку. От отдельных центриолей поликарионов отходили исчерченные корешки. На проксимальном конце некоторых центриолей обнаруживались процентриоли.

Аппарат Гольджи выявлялся в виде небольших стопок цистерн, часто вблизи какого-либо ядра, а также вблизи отдельных центриолей поликариона. Митохондрии и вторичные лизосомы были беспорядочно разбросаны по всей цитоплазме поликарионов. Вто-

ричные лизосомы имели электронно-плотное содержимое. Выявлялись как ортодоксальные, так и конденсированные митохондрии.

Промежуточные филаменты были многочисленны в базальных участках поликарионов, где они образовывали густую неупорядоченную неравномерную сеть. Иногда промежуточные филаменты располагались вокруг ядер и отдельных центриолей. С промежуточными филаментами часто были ассоциированы митохондрии.

5 ч после слияния. Во всех исследованных поликарионах центриоли были собраны в кластер. В составе центриолярного кластера центриоли располагались по-одиночке, либо парами. Диплосомы выявлялись в единственной 2-ядерной клетке, содержащей 8 центриолей. Центриоли были окружены тонко-фибриллярным материалом. Некоторые центриоли имели на дистальном конце 1-2 сателлита, от которых отходили отдельные микротрубочки. Микротрубочки, , обнаруживаемые вокруг центриолей, были многочисленны. Мощные пучки микротрубочек прохидили в некоторых случаях между ядрами поликарионов. В четырех клетках одна или больше центриолей формировали первичную ресничку, либо имели на своем дистальном конце мембранный пузырек. Центриоли, образующие ресничку, имели придатки, обращенные к мембранному пузырьку и втулку на своем дистальном конце. На проксимальном конце некоторых центриолей присутствовали процентриоли. Вблизи отдельных центриолей наблюдались исчерченные корешки.

Область расположения центриолей мало отличалась по составу органелл от остальной части цитоплазмы: в ней выявлялись цистерны шероховатого эндоплазматического ретикулума, многочисленные свободные рибосомы, микротрубочки и промежуточные филаменты, но вблизи от центриолярного кластера не было крупных мембранных органелл - митохондрий и вторичных лизосом. Комплекс Гольджи был представлен, во-первых, небольшими стопками цистерн, расположенными как вблизи от центриолей, так и в других участках цитоплазмы, и, во-вторых, протяженными стопками цистерн, расположенными между ядрами, либо недалеко от одного из ядер. К цистернам комплекса Гольджи подходили отдельные микротрубочки и промежуточные филаменты. Вторичные лизосомы имели электронно-плотное содержимое, либо включали в себя мембранные элементы. Выявлялись как ортодоксальные, так и конденсированные митохондрии, которые часто располагались параллельно промежуточным филаментам или микротрубочкам.

Промежуточные филаменты были многочисленны в периферических участках поликарионов, где они образовывали пучки, ли-

бо густую сеть. Сеть промежуточных филаментов наблюдалась и в области расположения центриопярного кластера. Промежуточные филаменты присутствовали также вокруг ядер поликарионов.

18 ч после слияния. Все центриоли в поликарионах через 18 ч после слияния были объединены в едином клеточном центре, который при фазово-контрастном исследовании выглядел как область "пенистой" цитоплазмы. Единая центросома занимала геометрический центр многоядерной клетки. Во всех исследованных клетках число центриолей было вдвое больше числа ядер. Центриоли в составе центриолярного кластера находились друг от друга на расстоянии 0.4-3 мкм и располагались по-одиночке, иногда - парами, под произвольным углом друг к другу. Во всех клетках одна или больше центриолей формировали первичную ресничку, либо примыкали к мембранному пузырьку и имели на своем дистальном конце втулку и придатки. Сателлиты, выявляемые на боковой поверхности центриолярных цилиндров, имели ножку и головку. Микротрубочки отходили как от сателлитов, так и непосредственно от окружающего каждую центриоль фибриллярного материала. Число микротрубочек, отходящих от сателлитов, было различным: иногда на одном срезе выявлялось 6-8 микротрубочек, отходящих от сателлита, в других же случаях число таких микротрубочек было значительно ниже. На проксимальном конце отдельных центриолей присутствовали процентриоли. В состав единого клеточного центра, помимо центриолей, входили многочисленные везикулы, отдельные стопки цистерн аппарата Гольджи, свободные рибосомы. Вокруг центриолей наблюдались многочисленные микротрубочки и отдельные пучки промежуточных филаментов.

Комплекс Гопьджи обнаруживался в виде небольших стопок цистерн в области единого клеточного центра. Иногда внутри-цистернальное пространство было расширено, а цистерны комплекса Гольджи были окружены многочисленными везикулами, что позволяет предположить, что пузырьки, расположенные вокруг центриолей, являются производными комплекса Гольджи. Неболь--шие стопки цистерн комплекса Гольджи наблюдались вблизи ядер, вне связи с областью единого клеточного центра.

Митохондрии и вторичные лизосомы в поликарионах располагались вокруг зоны единого клеточного центра, а также между ядрами поликарионов. Вторичные лизосомы, как правило, содержали мембранные элементы. С вторичными лизосомами могли контактировать отдельные микротрубочки. Митохондрии имели орто-

доксальное строение и часто контактировали с пучками промежуточных филаментов. В периферических участках поликарионов выявлялись митохондрии и липидные включения. Микротрубочки в периферических участках поликарионов часто располагались ра-диально. Промежуточные филаменты образовывали сеть в базаль-ных участках многоядерных клеток и были видны как в самых периферических участках, так и вблизи ядер поликарионов.

2.2.2. Ультраструктуса поликарионов при действии цитохалазина В.

2.5 ч после слияния. Ядра в поликарионах находились на значительном расстоянии друг от друга, за Исключением некоторых двуядерных клеток. В некоторых клетках мы наблюдали пик-нотические ядра, которые были меньше нормальных ядер и имели неправильную форму. Некоторые поликарионы были арборизирова-ны, другие же сохраняли нормальную распластанность. Отростки арборизированных клеток содержали пучки микротрубочек и промежуточных филаментов, а также вторичные лизосомы.

Центриоли были, как правило, беспорядочно разбросаны по всей цитоплазме поликарионов и располагались по-одиночке, либо парами, под произвольным углом друг к другу. Центриоли были окружены тонко-фибриллярным материалом, от которого единичные микротрубочки отходили на периферию клетки. В некоторых клетках отдельные центриоли формировали 1-3 сателлита, от головок которых отходили 1-3 микротрубочки. Число микротрубочек, обнаруживаемых вокруг центриолей, было незначительно. Во многих клетках центриоли формировали первичную ресничку или имели на своем дистальном конце мембранный пузырек. У таких центриолей выявлялись придатки и втулка на дистальном конце.

В одной 3-ядерной клетке центриоли были частично объединены - из 6 центриолей, 5 располагались в центральной части клетки, на расстоянии 0.2-0.4 мкм друг от друга, а шестая центриоль лежала вне центриолярного кластера. В одной 2-ядерной клетке все центриоли были сгруппированы вместе и располагались между ядрами. Расстояние между отдельными центриолями в кластере не превышало 0.2 мкм. Две из центриолей были обращены к мембранному пузырьку и имели придатки и 1-2 сателлита; одна из них формировала процентриоль. Число микротрубочек вокруг центриолярного кластера было незначительным. Ориентация центриолей по отношению друг к другу была произвольная.

Область расположения центриолей во всех случаях по составу органелл не отличалась от остальной части цитоплазмы.

Комплекс Гольджи в виде небольших стопок цистерн выявлялся лишь изредка, недалеко от какого-либо ядра поликариона. Вторичные лизосомы имели электронно-плотное содержимое. Цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума, вторичные лизосомы, митохондрии и липидные включения были распределены по всей цитоплазме многоядерных клеток. В поликарионах присутствовали ортодоксальные и конденсированные митохондрии.

Вокруг центриолей выявлялась сеть промежуточных филамен-тов, но непосредственно к центриолярным цилиндрам промежуточные филаменты не подходили. Сеть промежуточных филаментов была особенно густая в базальных участках поликарионов.

5 ч после слияния. Ядра в поликарионах были сближены и находились в центральной части цитоплазмы. Центриоли не формировали кластеров, располагались по-одиночке, либо парами и были разбросаны по всей цитоплазме поликарионов. В паре центриолей одна часто формировала первичную ресничку и имела на своем проксимальном конце процентриоль, другая же могла иметь процентриоль, но не образовывала реснички. Центриоль, образующая ресничку, имела на дистальном конце втулку и придатки. Вблизи отдельных центриолей выявлялись исчерченные корешки. Центриоли были окружены тонко-фибриллярным материалом. Сателлиты были обнаружены в единственной клетке на двух центрио-лях. Число микротрубочек, выявляемых в области расположения центриолей было незначительным. Иногда вокруг центриолей находились промежуточные филаменты. В целом организация центри-олярного аппарата в многоядерных клетках не отличалась от таковой поликарионов через 2 ч после проведения слияния.

Комплекс Гольджи в виде небольших стопок цистерн располагался как вблизи от некоторых центриолей, так и вне связи с центриолями, по всей перинуклеарной зоне поликарионов. Рядом с комплексом Гольджи часто находились микротрубочки. Мы не выявили никакой преимущественной локализации вторичных лизо-:ом и митохондрий в поликарионах. Вторичные лизосомы имели электронно-плотное содержимое. Митохондрии находились в ортодоксальном, либо в конденсированном состоянии.

В периферических участках цитоплазмы и между ядрами наудились толстые, протяженные пучки микротрубочек и промежуточных филаментов, с которыми были связаны многочисленные митохондрии. Промежуточные филаменты часто окружали липидные включения. Некоторое количество пучков промежуточных филаментов наблюдалось и вокруг ядер многоядерных клеток.

6 ч после слияния. С тем, чтобы выяснить, когда происходит полная агрегация центриолей в поликарионах, мы исследовали многоядерные клетки через 6 ч после проведения слияния. Во всех исследованных клетках мы наблюдали кластеры центриолей, расположенные в центральной части многоядерных клеток. Расстояние между отдельными центриолями не превышало 0.5-1 мкм. Центриоли хмели стандартные размеры. Во всех исследованных клетках несколько центриолей формировали ресничку, либо имели на своем дистальном конце мембранный пузырек. Центриоли, формирующие ресничку, имели придатки на дистальном конце и про-центриоль на проксимальном. Процентриоли выявлялись и у не-формирующих реснички центриолей. Сателлиты были обнаружены в двух клетках на двух из четырех центриолей. Вокруг центриолей были видны пучки микротрубочек и промежуточных филаментов.

В некоторых многоядерных клетках выявлялась хорошо выраженная зона клеточного центра, которая содержала, помимо центриолей, отдельные элементы комплекса Гольджи, некоторое количество везикул, свободные рибосомы и пучки промежуточных филаментов и отличалась от остальной части цитоплазмы тем, что не содержала крупных митохондрий, вторичных лизосом и жировых включений. Иногда область расположения центриолей не отличалась по составу органелл от остальной части цитоплазмы.

Комплекс Гольджи выявлялся в виде отдельных небольших стопок цистерн в области общего клеточного центра и в других частях цитоплазмы, а также в виде протяженных стопок цистерн, расположенных между ядрами. Вторичные лизосомы находились вокруг единого клеточного центра и имели, как правило электронно-плотное содержимое, хотя могли включать в себя и мембранные элементы. Митохондрии располагались в тех же участках цитоплазмы, что и вторичные лизосомы, а также в более периферических районах поликарионов. Обнаруживались как ортодоксальные, так и конденсированные митохондрии. Вблизи митохондрии проходили микротрубочки и пучки промежуточных филаментов.

Промежуточные филаменты формировали толстые лучки на периферии клеток и плотную неравномерную сеть в околоядерных участках поликарионов. С промежуточными филаментами, помимо митохондрий, были ассоциированы вторичные лизосомы и жировые включения. Промежуточные филаменты были особенно многочисленны в районе объединенного клеточного центра поликарионов.

18 ч после слияния. Центриоли были сгруппированы в центре поликарионов, при этом ядра, расположенные на равном расс-

тоянии от единой центросомы, были несколько смещены из центра клетки. При фазово-контрастном исследовании область расположения центриолей выявлялась, как область "пенистой" цитоплазмы. Число пар центриолей во всех случаях было равно числу ядер. В составе центриолярного кластера центриоли располагались по-одиночке, либо - парами, под произвольным углом друг к другу, и находились друг от друга на расстоянии 0.2-2.0 мкм. Каждая центриоль был^ окружена толстым слоем перицентри-олярного материала. Некоторые центриоли имели сателлиты, состоящие из ножки и головки. Ножка сателлитов часто была поперечно исчерчена. Микротрубочки отходили как от сателлитов, так и непосредственно от перицентриолярного материала.

Одна или несколько центриолей в составе центриолярного. кластера формировали первичную ресничку, либо имели на дис-тальном конце мембранный пузырек. На дистальном конце таких центриолей выявлялась втулка и придатки, обращенные к мембранному пузырьку. Дочерние центриоли имели на проксимальном конце структуру типа "ось со спицами". Некоторые центриоли имели процентриоли разной степени зрелости на своем проксимальном конце. Вблизи отдельных центриолей выявлялись исчерченные корешки. В состав единого клеточного центра, помимо центриолей, входили многочисленные пузырьки, небольшие стопки цистерн комплекса Гольджи, незначительное число цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума и свободных рибосом. Число вакуолей в районе клеточного центра было более значительным, чем в контрольных клетках на тот же срок фиксации.

Вторичные лизосомы располагались вокруг единого клеточного центра поликарионов; они содержали мембранные элементы, либо имели зернистое строение. Ортодоксальные митохондрии выявлялись вокруг центриолярного кластера и на периферии поликарионов. Такие же единичные митохондрии выявлялись в районе расположения центриолей. Промежуточные филаменты в незначительном количестве находились в области клеточного центра поликарионов, вблизи центриолей. Промежуточные филаменты, как правило, отсутствовали вокруг ядер многоядерных клеток. В периферических участках поликарионов выявлялись многочисленные толстые пучки промежуточных филаментов.

2.3. Организация лизосомного аппарата в поликарионах

Распределение лизосом в контрольных поликарионах■ С тем чтобы составить общую картину распределения лизосом, мы проводили выявление лизосом в поликарионах при помощи нейтраль-

А

Рис. 4. Схема преобразований комплекса Гольджи и лизосомного аппарата в контрольных поликарионах. А - 2 - ч; Б - 6 - ч; В- 18-30 ч после слияния. КГ - комплекс Гольджи; Л - лизосомы

ного красного. Через 2-4 ч после слияния область, занимаемая лизосомами, достаточно обширна; многочисленные лизосомы можно видеть на периферии поликарионов. Через 5 ч после слияния расположение лизосом становится более компактным, с меньшим содержанием гранул на периферии. В ряде клеток уже формируется центр расположения гранул красителя. К 6 ч после слияния

такой центр выявляется во всех поликарионах. Позднее (12-30 ч) центр расположения гранул сохраняется и становится более компактным. Схема преобразований лизосомной системы в жизненном цикле поликарионов представлена на Рис. 4.

Распределение лизосом в поликарионах при действии цито-халазина В. Через 2.5-4 ч после слияния лизосомами•зангта обширная область цитоплазмы поликарионов. Через 5 ч формируется единая зона расположения лизосом, которая позднее (6-30 ч) становится более компактной. В случае кольцевого расположения ядер гранулы занимают центр кольца. В поликарионах со смещенными на периферию ядрами, распределение гранул рыхлое, а область, занимаемая гранулами, довольно обширна. Т.о., преобразования лизосомной системы поликарионов при действии цигоха-лазина В сходны с таковыми контрольных многоядерных клеток.

ОБСУЖДЕНИЕ

В одноядерных клетках вблизи ядра располагается структура, получившая название клеточного центра. В литературе отсутствуют сведения о том, что представляет собой клеточный центр многоядерной клетки и меняется ли его структура в зависимости от изменения состояния цитоскелета поликариона. С тем, чтобы ответить на эти вопросы, мы, в первую очередь, провели иммунофлуоресцентные исследования состояния цитоске-

лета поликарионов на различных этапах после слияния, а затем на электронно-микроскопическом уровне анализировали состояние клеточного центра в определенные периоды жизни поликарионов. Проведенные нами исследования показали, что в ходе жизненного цикла поликарионов дважды образуется радиальная система микротрубочек с выраженными ЦОМТ в околоядерной области: через 4-5 ч и через 12-18 ч после слияния. Это может быть связано, во-первых, с объединением ЦОМТ слившихся клеток и, во-вторых, с периодической активацией ЦОМТ поликарионов. В ходе жизненного цикла поликаринов беспорядочная на ранних этапах после слияния (2-12 ч) сеть промежуточных филаментов сменяется сетью с радиальной ориентацией фибрилл (18-30 ч). Возникает вопрос, чем объясняются такие преобразования этих компонентов цитоскелета в многоядерных клетках.

Известно, что формирование многоядерных клеток связано не только с определенной реорганизацией элементов цитоскелета (Wang et al., 1979а; Bershadsky et al., 1981; Онищенко, Пет-ращук, 1994а), но и с некоторыми преобразованиями мембранных органелл, входящих в состав клеточного центра (Sapp, 1976; Ktistakia et al., 1990, Storrie et al., 1990). Оставалось неясным, с какими преобразованиями элементов цитоскелета сопряжено объединение мембранных органелл при образовании поликарионов. Ставя своей задачей изучение строения клеточного центра и динамику его становления в многоядерных клетках, мы исследовали: 1. организацию центриолярного аппарата и пери-центриолярного материала, составляющих цёнтросому поликарионов, а также характер функционирования центросомы в качестве ЦОМТ; 2. организацию комплекса Гольджи и лизосомного аппарата многоядерных клеток на различных этапах после слияния.

Электронно-микроскопические исследования показали, что центриоли, на ранних этапах после слияния (2 ч) разбросанные по всей цитоплазме поликариона, через 5 ч объединяются в центриолярный кластер, а через 18 ч единая центросома представляет собой -обширную зону цитоплазмы, содержащую все центриоли поликариона и многочисленные вакуоли.

Через 5-6 ч после слияния ядра поликарионов, ранее разбросанные по цитоплазме, сближаются и располагаются в центре клетки, что, вероятно, связано с первой активностью ЦОМТ поликариона. Кроме того, при первой активации ЦОМТ в поликарио-нах происходит, видимо, и перемешивание некоторых других клеточных органелл. Так, в контрольных поликарионах через 2 ч

посла слияния отдельные диктиосомы комплекса Гольджи разбросаны по всей цитоплазме многоядерных клеток, а через 5 ч после слияния выявляются протяженные стопки цистерн комплекса Гольджи, которые могут иметь гибридное происхождение и образовываться в результате слияния цистерн комплекса Гольджи родительских клеток без этапа их разборки, как это происходит в случае слияния клеток линии Vero (Но et al., 1990). Через 18 ч после слияния, отдельные небольшие стопки цистерн комплекса Гольджи располагаются в районе единого клеточного центра, содержащего все центриоли поликариона и многочисленные вакуоли.

Окрашивание контрольных поликарионов нейтральным красным показало, что на ранних этапах лосле слияния (2-5 ч) лизосомы разбросаны по всей цитоплазме поликарионов, а через 6 ч они группируются в районе клеточного центра и на периферии практически не встречаются. В дальнейшем (12-30 ч после слияния) область, занимаемая лизосомами, компактизуется.

Т.о., клеточный центр является динамичной структурой, которая отстутствует на ранних этапах после слияния. Начало формирования единого клеточного центра связано с первой активацией ЦОМТ в поликарионах, которая приводит к объединению центриолей, сближению ядер, образованию протяженных цистерн комплекса Гольджи и агрегации лизосом многоядерной клетки.

Вторая активация ЦОМТ в поликарионах (12-18 ч после слияния) может быть связана с необходимостью образования сети стабильных микротрубочек, которые, в свою очередь, направляют радиальный рост промежуточных филаментов (Gurland, Gundersen, 1994). Так как промежуточные филаменты участвуют не собственно в транспорте, а скорее в фиксации органелл в цитоплазме, можно предполагать, что образование радиальной системы промежуточных филаментов связано с необходимостью закрепления сложившейся внутриклеточной структуры поликариона. Перераспределение промежуточных филаментов в ходе жизненного цикйа многоядерных клеток, наряду с преобразованиями промежуточных филаментов, наблюдаемыми при распластывании" (Eckert et la., 1984) и после центрифугирования прикрепленных к субстрату клеток (Надеждина, Вайсберг, 1987), при дифференцировке предшественников астроцитов в культуре (Kalnins et al., 1985) и при микроинъекциях биотинилированного виментина (Vikstrom et al., 1989), представляет собой еще одну удобную модель для исследования функционирования ЦОПФ в клетках.

* * *

- 21 -

При действии цитохалазина В в жизненном цикле поликарио-нов также наблюдается двукратная активация ЦОМТ, причем на те же сроки, что и в контроле, но при первой активации (5 ч) ЦОМТ образует более толстые пучки микротрубочек, а при второй активации (18 ч) ЦОМТ образует значительно большее число микротрубочек, чем в соответствующие ЦОМТ в контроле. Образование грубых пучков микротрубочек при действии цитохалазина В описывается и другими авторами (Britch, Allen, 1981) и может быть связано с необходимостью поддержания определенной степени распластанности клетки после разрушения в ней актиновых филаментов. Тот факт, при второй активации ЦОМТ образует значительно большее, чем в контроле число микротрубочек, согласуется с' имеющимися данными о возможности 10-кратного увеличения числа микротрубочек в районе клеточного центра одноядерных клеток при действии цитохалазина В (Онищенко, 1993).

Мы выделили 4 основные этапа преобразования сети промежуточных филаментов в обработанных цитохалазином В поликарио-нах: 1) 2.5-4 ч после слияния - беспорядочная неравномерная сеть промежуточных филаментов; 2) 5-6 ч - толстые, беспорядочно расположенные пучки промежуточных филаментов; 3) 12-18 ч - тонко-фибриллярная сеть промежуточных филаментов; 4) 24-30 ч - промежуточные филаменты смещены на периферию и практически отсутствуют в области расположения ядер.

Возможно, в норме микрофиламенты обеспечивают растяжение сети промежуточных филаментов в клетке, и после разборки актиновых филаментов, разнесенные ранее на некоторое расстояние фибриллы промежуточных филаментов сближаются, образуя толстые тяжи. В связи с этим интересно, что недавно был выявлен белок гиронемин, ассоциированный с цитокератином и виментином в клетках HeLa и гомологичный филамину - белку, связанному с. актиновыми филаментами (Brown, Binder, 1992). Агрегация промежуточных филаментов может происходить и в том случае, если цитохалазин В взаимодействует с белками, образующими мостики между отдельными филаментами. Интересно, что толстые пучки промежуточных филаментов выявляются и на первой стадии коллапса, вызываемого антитубулинами (Hollenbeck et al., 1989).

Через 24-30 ч при действии цитохалазина В, наряду с появлением больших зон диффузного свечения в ламеллярных областях клеток, наблюдается полное исчезновение сети в районе некоторых ядер. Т.о., при действии цитохалазина В в поликарио-нах происходит перемещение существующей сети промежуточных

филаментов на периферию клеток, но не формируется новая сеть, вероятно, вследствие нарушения функционирования цопф, т.е. цйтохалазин В вызывает блокирование функционирования клеточного центра, как цопф.

Создается впечатление, что после разрушения микрофила-ментов промежуточные филаменты начинают играть определенную роль в поддержании распластанности и осуществлении контакта клетки с субстратом, т.е. берут на себя некоторые функции микрофиламентов, а мощная сеть микротрубочек обеспечивает внутриклеточный транспорт. К митозу поликарионы в контроле и при действии цитохалазина В подходят с различным состоянием цитоскелета. Это касается, в первую очередь, промежуточных филаментов. Возможно, и митоз в таких многоядерных клетках будет проходить по-разному. Т.о., разборка микрофиламентов приводит к перераспределению других элементов цитоскелета. Возникает вопрос, какое влияние окажут такие преобразования цитоскелета на судьбу единого клеточного центра поликариона.

Электронно-микроскопические исследования центриолярного аппарата показали, что цитохалазин В не препятствует миграции центриолей, но вызывает задержку их перемещения: агрегация центриолей при действии агента наблюдается через 6ч, а не через 5 ч, как в контрольных поликарионах. В связи с этим интересны имеющиеся в литературе данные о возможном участии микрофиламентов в миграции ЦОМТ (Gotlieb et al., 1983). Учитывая, что центросома в обработанных цитохалазином В поликарионах через 5 ч после слияния активна как ЦОМТ, можно говорить о том, что при действии цитохалазина В происходит временное разъединение центросомного материала и центриолей. Возможно, при действии цитохалазина В объединение центросомного материала и активация единой центросомы в качестве ЦОМТ является необходимым этапом для перемещения и включения собственно центриолей в состав уже сформированной единой центросомы поликариона. Через 18 ч после слияния центросома в обработанных цитохалазином В клетках не отличается от центросомы контрольных поликарионов.

Как и в контроле, при действии цитохалазина В через 5 ч после слияния происходит сближение ядер в поликарионах, что, видимо, также связано с первой активацией ЦОМТ многоядерной клетки. Позднее (18-30 ч) ядра в поликарионах часто смещены к клеточному краю. Вероятно, в контроле ядра, собравшиеся в центре поликариона, заякориваются там сетью промежуточных фи-

ламентов. При действии цитохалазина в подавляется активность клеточного центра, как ЦОПФ, и старая сеть промежуточных фи-ламентов вместе с ядрами при второй активации ЦОМТ вытесняется микротрубочками на периферию клетки. Энуклеация клеток при действии цитохалазина В (Carter, 1967) в таком случае объясняется тем, что этот агент, помимо разрушения актиновых фила-ментов, изменяет и распределение промежуточных филаментов, обычно определяющих положение ядра в клетке.

Преобразования комплекса Гольджи при действии цитохалазина В сходны с тем, что происходит в контрольных поликарио-нах. Однако, при действии цитохалазина В через 2.5 ч после слияния стопки цистерн комплекса Гольджи практически не выявляются. В это же время наблюдается диффузное свечение микротрубочек в поликарионах, т.е. микротрубочки претерпевают частичную разборку. Это еще раз подтверждает необходимость целостности микротрубочек для поддержания нормальной структуры комплекса Гольджи. Кроме того, образование обширных стопок цистерн комплекса Гольджи при действии цитохалазина В совпадает по времени с агрегацией центриолей в поликарионах, т.е. эти события запаздывают при действии цитохалазина В на 1 ч, по сравнению, с контролем. Можно предполагать, что для целостности аппарата Гольджи необходимо существование центрио-лярной центросомы. Это предположение косвенно подтверждается тем, что в бесцентриолярных цитопластах (Ходяков, 1990) и при формировании центриолей de novo (Абумуслимов, 1994) аппарат Гольджи выявляется лишь в виде отдельных диктиосом.

Преобразования лизосомного аппарата в обработанных цито-халазином В поликарионах, сходны с преобразованиями, наблюдаемыми в контрольных клетках, но агрегация лизосом в области единого клеточного центра наблюдается несколько раньше - через 5 ч после слияния, а не через 6 ч, как в контроле. Более раннее перемещение лизосом в центр поликариона при действии цитохалазина В может объясняться сохранением некоторого количества периферических радиально расположенных микротрубочек, по которым возможно центростремительное перемещение лизосом.

Таким образом, вызывая значительные изменения цитоске-летных элементов многоядерных клеток, цитохалаэин В не препятствует событиям, приводящим к формированию в поликарионах единого клеточного центра, аналогичного по своей структуре клеточному центру одноядерных клеток, но вызывает нарушения в характере его функционирования, инактивируя центросому в ка-

честве ЦОПФ.

ВЫВОДЫ

1. Клеточный центр поликарионов, образованных при слиянии отдельных, клеток, включает: (1) объединенную центросому, которая состоит из сгруппированных в единый кластер центриолей и ассоциированого с ними фибриллярнго материала; (2) цистерны комплекса Гольджи; (3) многочисленные пузырьки.

2. В жизненном цикле поликарионов формирование единого клеточного центра проходит поэтапно: первоначально агрегируют центриоли, формируется объединенная центросома, и образуется единый комплекс Гольджи, затем появляются многочисленные пузырьки.

3. Формирование единого клеточного центра поликариона связано со сближением ядер и агрегацией вторичных лизосом вокруг клеточного центра.

4. В жизненном цикле поликарионов происходят динамичные преобразования цитоскелета, которые сопровождаются двукратной активацией ЦОМТ (через 5 ч и 18 ч после слияния) и однократной активацией ЦОПФ (18 ч после слияния).

5. Начапо формирования единого клеточного центра приурочено к первой активации объединенной центросомы в качестве ЦОМТ, в период второй активации ЦОМТ единый клеточный центр включает все присущие ему элементы.

6. Нарушение целостности микрофиламентов в.поликарионах цитохалазином В приводит к (1) задержке формирования единого клеточного центра, что выражается в задержке кластеризации центриолей и формирования центриолярной центросомы, а также в задержке образования протяженных цистерн комплекса Гольджи; (2) инактивации единой центросомы в качестве ЦОПФ; (3) смещению ядер и промежуточных филаментов на периферию поликарионов.

7. Клеточный центр поликарионов является динамичным образованием, меняющимся в жизненном цикле по составу входящих в него элементов и характеру функционирования.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Золотова (Яровая) И.О., Ерохина М.В., Онищенко Г.Е. Изучение локализации элементов цитоскелета и лизосом в жизненном цикле поликарионов в норме и патологии (при действии цитохалазина В). Научная конф. молодых ученых России, посвященная 50-летию Академии медицинских наук. 1994. Стр. 54-56.

2. Онищенко Г.Е., Яровая Н.О., Ерохина М.В. Лизосомы и