Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Структура и полиморфизм района t-комплекса хромосомы 17 мышей P.Mus: генетический и молекулярный анализ

ВАК РФ 03.00.26, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Структура и полиморфизм района t-комплекса хромосомы 17 мышей P.Mus: генетический и молекулярный анализ"

S Д^рССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

? з ш

Направах рукописи УДК 575.11:699.323.4

ШУСТРОВА Инна Владимировна

СТРУКТУРА И ПОЛИМОРФИЗМ РАЙОНА t-КОМПЛЕКСА ХРОМОСОМЫ 17 МЫШЕЙ P. MUS: ГЕНЕТИЧЕСКИЙ И МОЛЕКУЛЯРНЫЙ АНАЛИЗ

(Специальность 030026 -молекулярная генетика)

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степйни кандидата биологических на/к

Москва - 1994

Работа выполнена в лаборатории Организации генома Института Биологии Гена

РАН

Научный руководитель : доктор биологических наук член-корреспондент РАН АП.Рысюв

кандидат биологических неук Л.Д Сафронова

Официальные оппоненты: доктор биологических наук член-корреспондент РАН, профессор Л. И. Корочйм каНдицат биологических наук АМ.Малашенто

Ведущая организация - Институт Молекулярной Биологии им. ВАЭнгельгардта РАН

Заиута диссертации сострили * У' У-^НЛ; 1994г.в -/О час. ■ ОО мин, на «седании специалиаиро&анного совета &200.30.(л при Институте биологии Гена РАН. 117334 Москва, ул. Вавилова 34.5

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ИнстнтупГБиологии Гена РАН

Автореферат разослан 1994г.

Ученый секретарь Специализированного кандидат ферм, наук

Актуальность проблемы. Сложная генетическая система, локализованная в проксимальной трети хромосомы 17 домовой мыши -t-комплеко - в наиболее общем виде может быть охарактеризована как серия микроаберрраций по отношению к "дикому типу" организации данной хромосомы, занимающая генетическую дистанцию около 20 сМ, что составляет примерно 0.7% от всего генома домовой мыши. В данном районе генома локализованы сайты,' определяющие многочисленные специфические эффекты t-комплекса: нарушение различных стадий эмбрионального развития, влияние на гаметогенез, нарушение менделевского наследования, влияние на поведенческие особенности и др. Благодаря такому характерному свойству, как преимущественная передача t-несущей хромосомы потомству гетерозиготных самцов, t-комплекс широко распространен в популяциях домовых, мышей. Помимо собственно t-специфичных генов, в области t- комплекса локализована такая генетически значимая структура, как главный комплекс гистосовместимости мыши - МНС. Благодаря • наличию уншсальных свойств и структуры t-комплекс представляет собой эффективную модель для изучения эволюционного процесса в популяциях.

Рекомбинация между t-гаплотипами и гомологичной хромосомой 17 "дикого типа" супрессирована вследствие наличия в t-комплексе четырех неперекрывающихся инверсий. Процессы неравного кроссинго-вера, генной конверсии и внутрихромосомной рекомбинации могут служить основным источником ьариабельности проявления характерных фенотипических особенностей t-гаплотипов и структурного полиморфизма данной области генома. Как для t-комплекса, так и для соответствующего участка хромосомы 17 "дикого,типа" обнаружено присутствие йекоторых полиморфных последовательностей (Schimenti е.а., 1987; Hammer е.а., .1991). Существование тандемных дупликаций и обилие псевдогенов в ряде фрагментов t-комплекса.дают возможность предположить, что данный район хромосомы 17 домовой мыши эволюционирует быстрее, чем большинство других геномных областей у этого вида (Shin е.а., 1984; Schlmenti е.а., 1987), поэтому анализ полиморфизма структуры района t-комплекса и определяемых им генетических свойств представляется крайне актуальным.

Цель и задачи исследования. Делью данной работы являлось изучение полиморфизма структуры проксимальной части района t-комплекса и эффектов, определяемых генами, локализованными в этом районе. Задачи исследования были следующими: англиз компле-ментационных эффектов t-гаплотипов; изучение рекомбиначтного процесса у t-гаплотипов лабораторной популяции, мышей; определение изменчивости эффекта преимущественной передачи t-несущей хромосо-

t

мы гетерозиготными самцами; анализ полиморфизма проксимального фрагмента t-комплекса у галлотипов природного . и рекомбинантного (лабораторного) происхождения, а также соответствующего фрагмента хромосомы 17 "дикого типа" у лабораторных и диких мышей видов Mus domesticus и Mus musculus; анализ структуры данного района генома видов Mus abbotti и Mus hortulanus с использованием t-специфичес-ких ДНК-проб и определение наличия гомологии к данным пробам в геномах представителей других родов грызунов.

Научная ноййана.Впервые изучены генетические свойства 6 новых рекомбинантных t-галлотипов, выявленных в лабораторной популяции мышей. Выделены-два новых t-гаплотипа из природных популяций мышей Mus domesticus Кубы и Перу, изучен ряд их'генетических свойств и осуществлен.молекулярный анализ с применением t-специ-фических проб. С помощью блот-гибридийации с t-специфическими пробами впервые изучена структура проксимальной части 17 хромосомы у мышей Mus musculus musculus s,str. Северного КавКаза, ' Mus' musculus tataricus s.str. Азербайджана-, Mus hortulanus из популя-.: ций Молдовы и Mus abhotti из Армении. Обнаружено наличие гомологии к t-специфическим пробам Tu66 и Tull9 в геноме серой крысы Rat tus norvegicits.

Научно-практическая значимость результатов. Выделенные в самостоятельные линии t-галлотйпы- рекомбинантного и природного происхождения могут быть использованы в последующих исследованиях • особенностей структуры, .' ■ функций и путей эволюции t-комплекса. ' Возможно применение результатов, молекулярного анализа проксимального фрагмента хромосомы 17 При разработке внутривидовой систематики мышей p. Mus. Обнаруженное влияние генотипа матери на жизнеспособность эмбрионов- tx/tv и соотношение', полов в потомстве могут быть использованы при исследованиях системы взаимоотношений "мать-плод". Факты влияния гомологичной хромосомы на величину передачи t-гаплотипов потомству гетерозиготных самцов могут быть применены при дальнейшей разработке проблемы взаимного влияния гомологов на экспрессию' генов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на И Всесоюзной конференции по проблемам эволюции (Москва, 1988),-на международном, совещании по структуре и функции t-комплекса (Москва, 1990), на курсах "Experimental Genetics of. the Laboratory Mouse"(Баг Harbor, 1993). ". .. V .

Публика«»«. По теме работы имеется В публикаций.

Объем работи. чДиссертация состоит.из введения, обзора литературы, описания материала и методов, . 6 глав й выводов. ■ Работа выполнена на 121 странице и содержит 12 рисунков и 29 таблиц.

МАТЕРИМ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Материал. В работе были' использованы мши, принадлежащие к' лабораторным линиям (стокам) T/t6, T/t12, T/t*5, T/tw12, T/tw18, ,T/tw7® и. T/t"^"1,. а также к линии, гомозиготной по робертсоновс-кой транслокации Rb iô, 1?) 1 lern (иначе. Rbl) йа коллекции линий, принадлежащей лаборатории проблем - микрозволюции и . доместикации ЙЭМЭК РАН.Также использовали мышей щ инбредных лабораторных линий CBAC/Lac (иначе СВА) И С57В1/6 (В16) из питомника ' ЦНИЛЗБМ РАМН "С-толбовая" и динии Balb/cJ'H3 ИБР РАН.

Дикие мыши представлены в работе четырьмя видами рода Mus и были отловлены в различных географических точках; Mus domesticus (Перу, Куба); M.musculus (Московская обл. (Се_в. Кавказ, Азербайджан), M. abbotti (Армения) и Mus hortulanus (Молдова).Были использованы также грызуны из родов Rattus и Apodemus. Крысы Rattus norvegicus инбредной линии Wistar и нелинейные были получены из ИБР РАН. Желтогорлые мыши Apodemus flavicollis отловлены на Украине (Киевская обл.), полевые мыши Apodemus' agrarius - в Московской области .• "

Генетический анализ

Выявление животных*носителей t-гаплотипов в выборках миией иа природных .популяций. Метод' выявления носителей ■t-гаплотипов природного' происхождения основан на взаимодействии мутаций tct, входящих в состав проксимальной части •t-комплекса, с маркерной микроделециеи 1 (Brachyuri) -в транс-положении.. 'Гетеровиготы T/t(tct) не имеют хвоста '(Oobrovolskaia- Zavadskaia, Kobozi-eff, 1932; Dunn, „(org-ал, 1953). Тестируемые мыши и'э природных популяций скрещивались с короткохвостыми особями Т/+; появление в пометах у тестируемого щвотного бесхвостых потомков свидетельствует о носи'тельстве t-гаплотипа.

Выявление рекомбинантных t-галлотипов в лабораторных популяциях основано также на взаимодействии маркерных мутаций Т и tct. Для летальных галлотипов были определены частоты рекомбинации в интервале между T/tct и факторами летальности tel . Из' 2 возможных классов рекомбинантов' в балансированных по леталям линиях бесхвостых мышей Т +/tct tel фенотйпически регистрируется лишь один - длиннохвостые tct tel/tet +.

Другая использованная система -выявления рекомбинантных гаплотипов основана на использовании рецессивной маркерной мутации tf - tufted, -или частичного облысения. В этом случае регистрируется частота рекомбинации, в интервале между T/tct и tf. Мыши генотипа T.tf/tçt + могут образовывать обычные гаметы Т tf и tct +, 'yi рекомбинантные Т + и tettf. В случае, если изучаемый гаплотип

сохраняет гены летальности, регистрируется два класса рекомбинан-тов (длиннохвостые и бесхвостые лысеющие), если же к жизнеспособным - только один класс, т.к. гомозиготы по tct + и гетерозиготы tct +/tot tf имеют одинаковый фенотип.

Выделение обнаруженных природных и рекомбинантных гаплотипов в самостоятельные линии (стоки). Природные t-гашютипы выделяли в форме T/tw; мыши данного' генотипа скрещивались между собой или с особями генотипа Т/+, в последнем случае из потомства были отобраны бесхвостые.T/t". Выделение в самостоятельную линию рекомби-нантных гаплотипов состояло в скрещивании обнаруженных рекомби-нантов t*/ty с особями Т/+; отобранные из полученного потомства бесхвостые T/t7 были использованы в возвратных скрещиваниях с особями из исходной линии T/t*, В случае обнаружения в этих скрещиваниях длиннохвостых • потомков t*/ty, родители, несущие рекомби-нантный гаплотип ty, использовались для спаривания T/tv х T/t11.

Определение соотношения 'передачи t-Несущей хромосомы гетерозиготными самцами. Для определения величины соотношения передачи (TRD) t- и +-несущих хромосом гетерозиготными самцами T/t данные мыши спаривались- с самками из стандартных линий лабораторных мышей: СБА, В1б и межлинейными гибридами fi.Величину TRD вычисляли как отношение длиннохвостых потомков +/t к общему количеству потомков (короткохвостых Т/+ и длиннохвостых +/t), полученных при данном типе скрещиваний. При определении величины TRD у сложных гетерозигот Rbl+/+t был использован цитогенетйческий метод. Кари-отип эмбрионов, полученных от вышеописанных скрещиваний, определяли на 14-15 день - развития на основе анализа митозов в клетках эмбриональной печени в условиях кратковременного культивирования in vitro (Демин,. Сафронова,1981) и изготовления воздушно-сухих препаратов по общепринятой методике. Эмбрионы, содержащие 40 хромосом, имеют, генотип ++/+t; содержащие 39 хромосом, одна из которых - субметацентрик В17, генетически являются Rbl-v/++. Величина TRD вычислялась как отношение количества эмбрионов, несущих t-комплекс, к общему числу эмбрионов при данном типе скрещивания. Достоверность различий TRD t-несущей- хромосомы между самцами Rbl+/+t и T/t на генетическом фоне двух различных линий определяли по критерию к2. ' • ..

Определение TRD у неполных гетерозигот tx/ty. проводилось с использованием скрещиваний самцов данного генотипа с самками исходной линии Т/t*. Среди полученных потомков были отобраны бесхвостые особи T/t7, и проведено определение их гаплотипов в возвратных скрещиваниях с особями T/t*. TRD определяли как отношение количестрд клхдого из классов потоков (T/t* и T/ty) к общему .ко-

л'ичеству потомства, полученного в данном скрещивании.

Степень влияния t-гаплотипов на жизнеспособность гомозигот определяли в скрещиваниях T/t х T/t как процентное отношение наблюдаемого в потомстве количества длиннохвостых гомозигот t/t к их теоретически ожидаемому количеству. Последнее еычисляли, исходя из наблюдаемого- количества бесхвостых потомков T/t, на основе менделевского расщепления и. с учетом TRD данного гаплотипа.

Комплементационный анализ t-гаплйтипов проводили с помощью скрещиваний мышей-носителей гайлотипов с особями из линий T/t1, где t1 - гаплотип с известной комплементационной принадлежностью.' Два раалич.. ¡х летальных гаплотипа считаются принадлежащими к одной комплементационной группе,' если в скрещивании- T/tx -х T/t1 рождаются исключительно бесхвостые потомки, что обусловлено эмбриональной гибелью зигот tx/t1. Если в потомстве при данном типе скрещиваний отмечается еще один фенотипический класс -длиннохвостые мыши, это свидетельствует о комплементарности данных гал-лотипов. Эффективность комплементации, или жизнеспособность tVt1' зигот оценивается с помощью коэффициента комплементации, т.е.. доли выживших t1/ty зигот от- теоретически ожидаемого количества аи~ гот данного типа.■ Коэффициент комплементации определялся по формуле k=n:(mxTRD),• где п - наблюдаемое количество длиннохвостых потомков iL/tv, ш - обш,ее количество бесхвостых потомков T/t1 и T/ty, TRD - соотношение передачи гетерозиготным самцом T/ty данного гаплотипа '(Демин и др., 1902).

Анализ плодовитости в спариваниях и фертильностк самцов. Плодовитость ха[ ктеризовали следующими показателями: 'количество потомков,приходящееся на 1 самку за 1 месяц, и средняя величина помета, с учетом среднего квадратического отклонения. Фертиль-ность самца проверялась в спариваниях не менее чем с двумя рожавшими ранее самками.при сроке совместного оодержания не менее двух месяцев. В случае отсутствия потомства в течение данного времени самца признавали стерильным.

Анализ проявления комплеыентационных эффектов. Наличие материнского эффекта оценивалось по I-критерию для малых выборок и методу х2 в реципрокных скрещиваниях по показателям эффективности комплементации и величины помета. Соотношение полов при скрещиваниях особей, несущих t-гаплотипы различной комплементационной принадлежности (T/t* х T/ty), оценивался с помощью метода х/1 при теоретически ожидаемом соотношении 1:1.

Молекулярный анализ

Блот-гибридизация. В качестве проб для'блот-гибридизации были использованы плазмиды pBFi322, содержащие четыре t-специфичес-

иае последовательности - Tu48,' Tu66, Tull9 и Tul22, полученные путем микродиссекции метафазных хромосом (Roehme et.al.,1984) и предоставленные нам X. Лерахом,

ДНК выделяли из. замороженной жидким азотом Печени мышей при помощи гомогенизации в буферном растворе и инкубации при 42° с в течение 16.часов. Экстракция ДНК. и ее очистка проводились согласно Мэтью (Mat hei» ,1984). 10 дг каждого образца ДНК были гидролизо-ваны с эндонуклеазами Taq 1 или ВашН1 в соответствующем буфере. Электрофорез проводили в 0.0% агарозн'ом Геле в течение. 17 часов при 45 V Или 14 часов при 60 V. Гибридизацию проводили согласно Сауэерну (Southern, 19.75). . Рекомбинантные плазмиды, содержащие t-специфичные последовательности, выращивали согласно Куртисо (CUrtiss et.al.,1877). Метку в рекомбинантные ДНК вводили методом ник-трансляции до получения специфической "активности 4хЮ0 имп/мин на 1 мкг ДНК. Авторадиографию проводили., с использованием усиливающих экранов при -70°С в. течение 7 дней;.Сканирование'про-, явленных рентгеновских пленок было проведено на денситометре LKB Ultroscan и сделан обсчет площади пиков, наблюдаемых на деннси-тограмме. Относительную интенсивность пиков, соответствующих полосам гибридизации, для каждой из дорожек определяли в % отношению к.суммарной площади пиков.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Глава 1.Генетический анализ вариабельности свойств летальных t-гаплотююв из лабораторной Популяции.

Зависимость TRO t-гаплотипа от гомологичной хромосомы -и генотипа самки. Для дальнейшего генетического анализа было проведено предварительное определение величины преимущественной передачи ' t-несущей хромосомы (TRD) у самцов шшей иа линий T/t, несущих летальные гаплотипы t6,t12,tw5,twl?>t,'18)tw73 H t*^"1. В ряде опытов в качестве контроля были использованы Показатели TRO сам-, цов T/t, полученные в скрещиваниях с самками Fi от межлинейного скрещивания В16 х CBÁ. Данные показатели TRD самцов T/t отличаются средней величиной по отношению к показателям, полученным в скрещиваниях с самками ррдительскйх линий - СБА' й' E¡16 (Демин, Сапронова, 1981). Величины TRD составляют: t6 - 0.62, t1E - 0.82, tw5 - 0.92, twlB -0.44, twlz - 0.84, tw73 - 0.54 И twPa_1 -0.82.

Для выявления зависимости TRD от гомологичной хромосомы были использованы полные tlz, tw5 и частичные t6 и twl8 гаплотипы.

Показано существенное снижение Величины TRD у' самцсв Rbl+/+t12 и Rbl+/+t*ie rio сравнению с TRD самцов T/t, несущих со-

ответствуюшие гапдотипы (см. тайл.1 и 2). У самцов Rbl+/+t6 и T/t6 величина преимущественной передачи t6-несущей хромосомы потомству практически одинакова. В наших опытах с использованием

Таблица 1

TRD самцов T/t и Т/+ в скрещиваниях с самками двух линий

Генотипы Испытано Получено Расщепление TRD

самцов потомства t/t . Т/+

самок самцов (+/+) (Т/+)1

СВА T/tg T/t® r/t.1? 8 263 212 : 51 0.71

В16 10 260 139 : 121 0.53

СВА •8 ?б 70 г 5 0.93

BIß T/t1" Т/tw® 9 196 157 : 39 0.79

СВА .7 64 • 63 : . 1 0.96

В16 T/twf„ 9 71 63 : ' В 0.88

СВА r/twjs 6 78 43 : 35 0.54

В16 T/t 8 92 39 : 53 0.42

СВА T/+ 4 50 25 ; 25. 0.50

BIS T/+ 4 46 22 : 23 0.49

1 Для самцов генотипа Г/+

. ■ ■ Таблица 2

Различия TRD у самцов мышей с генотипами Rbl/t й . T/t

Генотипы Испы- Потомство TRD*- P

тано

самки самцы сам- ■ Все-- +/t:Rbl/+

цов го Rbi/t T/t

наблюд. ожид.1

СВА Rbl/t® 8 102 69:33 72:30 0.68 , 0.71 >0.05

ВЗб Rbl/t® Rbl/t12 8- 104 56:48 55:47 0.54 0.53 >0.05

СВА 8 80 56:24 74: 6 0.70. 0.93 <0.001

В1б Rbl/t1? Rbl/t"5 RM/tw?„ Rbl/t"1® Rbl/t 10 170 122:48 134:36 0.71 0.79 <0.05

СВА 7 68 50:18 65: 3 0.73 0.96 <c.ooi

В16 8 104 78:26 91:13 0.75 0.88 <0.01

СВА ' 5 80 14:66 ' 43:37 0.18. 0.54 <0.001

В16 6 69 19:60 30; 39 0.27 0.42 <0.01

СВА Rbl/T 4 . 67 32:35 33:34 0.47 0.50 >0.05

В16 Rbl/T 6 62 32:30 31:31 O.Bi 0.49 >0.06

1 - по отношению к TRD самцов T/t

самок разных 'линий наблюдалось большее снижение TRD у самцов Rbl+/+t при использовании самок линии СБА по сравнению о самками В16. Большинство исследователей t-комплекса представляет систему факторов преимущественной гередачи как ряд аддитивно действующих генов-дистортерпв (Ted), расположенных, в. проксимальном, медиальном и дистадьном районах t-комЧлекса. Дистортеры обеспечивают преимущественную передачу только в присутствии респондера (Тег) лок?лизлванного'медиально (Silver,198a; Lyon,1944,1966). Известно, что общая длина плеч метацеитрика Р17 меньше суммарной длины акроцентриков," образующих Rbl (Демин и др., 198t). Изменение дли-

ны метацентрика связано с его проксимальным участком, что согласуется с транслокационной схемой образования центрического (ро-бертсоновского) слияния (Демин и др.,1984).Начало наиболее проксимальной, или прицентромерной, инверсии t-гаплотипов, находится на расстоянии около 3-4 сантиморганид от центромеры (Sanchez, Erickson,1988; Condaniine et'al., 1983) . Можно предположить,'что образование метацентрика 817 приводит к изменению активности генов Ted (ва счет эффекта положения), .расположенных в проксимальной части t-гачлотипа гомолога хромосомы 17; вследствие чего гап-лотип t6, лишенный'проксимальной инверсии, сохраняет неизменный уровень TRD. • •

Возможным механизмом нарушения TRD у гетерозигот по роберт-соновским транслокациям является генетическая трансвекциа. Bsтом случае, на экспрессию генов, контролирующих TftD, может оказать влияние структурная гетерозиготнос-ть гомологичных .хромосом и нарушение синапсиса гомологов. Этот мехайизм вполне вероятен,' поскольку в данном случае сочетаются 2' типа структурных перестроек:• транслокация Робертсоновского типа и комплекс инверсий t-гаплоти-па. Вогможность подобной регуляции активности факторов TRD-систе-' мы неменделевсксго наследования из транс-положения подтверждается сложной картиной избирательной экспрессии в пахитенных спермато-цитах ряда последовательностей,, рассматриваемых в качестве канди-. датов на роль дистортеров, как в составе t-комплекса, так и в гомологичном участке хромосомы 17 "дикого типа" (Hae-Soqk Н. et.al.,1989).

Анализ комплеменгационных эффектов.В большинстве поставленных скрещиваний T/tx х T/ty количество потомков tK/ty ниже ожидаемого. В ряде реципрокчых скрещиваний наблюдается неслучайные различия е эффективности комплементации (см. .табл.3).Стойкий материнский эффект отмечается для самок с генотипами T/t6 и T/twi>ä"1. Скрещивания особей из данных линий характеризуется минимальной величиной комплементации. Данный эффект может иметь два возможных объяснения: влияние гаплотипа.матери на жизнеспособность неполных гетерозигот tx/ty или же модифицирующее.влияние генетического фона лини» самки на TRD самцов. Против данного предположения свидетельствуют. то, что в работе были использованы самки T/t6 двух ■ различных линий. Отмечается значительное перекрывание низкой эффективности комплементации и снижения плодовитости в реципрокных скрещиваниях с участием оачок T/t6 и отчасти T/twFa_1.

Соотношение полов ср<?дй неполных гетерозигот tK/ty в ряде скрещиьнннй значительно нарушено в пользу самок. Данный эффект на&!ВДс»!>тся в скрещиваниях самок'генотипа' T/t6 с самцами T/tlz,

s

Таблица 3

Эффективность комплементации в скрещиваниях между линиями, несущими различные гаплотипы в форме T/t

Гапл'отип.

самки самца

Потомство

всего T/t : t*/tv.

202 149 51 4.592

202 . 145 57 2.375

276 188 88 0.262

235 169 66' 2.910

316 244 72 15.817

263 169 94 0.667

147 100 47 0.841

139 S5 •44 0.170

62 50 12 5.467

71 49 22 0.175

41 40 1 26.82

. 62 59 3 22.68

393 269 •124 ■ 0.561

274 190 84 0.882

230 164 66 2.224

254 150 104 6.613

145 • 112 33 7; 292

104 64 20 ' 9.333

113 94. 19 13.880

105 86 19 10.971

.134 112- 22 17.258

64 • 59 5 18.754

244 176 68 3.275

207 112 95 4.380

238 199 . 39 30.750

115 85 30 13.141

54 42 12 3.000

66 36 30 9.812

65 44 .21 . 0.033

62 54 8 11.641

. 110 . 68 42 1.162

77 ■59 18 6.255

80 67 23 0.769

36 25 И 0.124

43 26 17 0.744

54 44 10 5.326

55 38 17 0.192'

. 48 26 22 3.375

48 84 14 0.375

90 74 16 10.493

65 45 20 0.899

62 ■ 55 10 9.427

v2 1

Коэффициент комплементации X

Г18

hW5

¡>18

t6 t>12

t6

i>73 t6

¡>Pal

t w5

t12 twie

bz tWlZ

hz

w?3 12

wFa-1

i. w5

twl8 (. w5

twlZ * w5

t>73 j. w5

t. wPa-1

twl 8

twl2

t>18

t>73

t>18

£wPa-1

>12

t. w73 twl 2 fr WFa-1 fW?3 £wPa-1

-1

t-w5 t6

Уз t6

1-wPa-t6,

t12 f>18

t1?-twl2

tlz f>73

t1Z (. vrPa

HB

twl2 i. w5 {>73 t

£wPa' (■ w5 f>12 twl8 i>73

t>18 t- wPa-

r>18

t>73

twl2

£>Pa-l

Ul2.

1 wPa-'l f w73

-1

-1

43.41 63.33 50.89 62.89 57.05 89.71 55.95 74.70 4.4.44 72.41

4.04 2.61 3.09*

3.13 1.85* 0.63 Й.49*

2.14 6.99 4.12

0.03 +17.81 . 0.08 +15.79 50.10 T 2.89 53.91 + 2.78 91.46 T 0.56 111.82 + 6.74 35.08 + 5.39 29.03 + 6,16 37.43+~5.88 '20.94+ 7.93 ' 23.-9Г+ 6.56* 10.33 ? 9.23

87. ßO 90.44 23.33 36.36 52.46 90.57 58.20

0.78 0.66 4.97 3.85, 5..56 0.79 6.18*

18.06 + 9.43 73.75 +-2.50 69.40 + 5,11 74.67 + 3.07 100.00 + 0.00 80.99 T.3.16'

51.86 82.84 100.73 48.42 £6.37 54.20 27.70

6. 56 6.06* 0.10 8.45' 7.74 3.86" 8; 97

6

l - по отношению к менделевскому'расщеплению _ - различия в реципрокних скрещиваниях неслучайны (Р<0.05)

T/twS, T/tw12 и T/twl8¡ самок T/t12 с самцами I/twS, самок T/t"5' - с самцами T/tw12 и самок T/twPa_1 - с самцами T/twlz и T/tw5 Среди гетерозиготного потомства T/t не наблюдалось существенного отклонения, от соотношения полов 1:1. Наблюдаемая связь между эффективностью ■ комплементации, плодовитостью и эффектом Холдейна подтверждает значительное влиянии генотипа салки на жизнеспособность компаундов по t-галлотипам.

Глава 2.Генетический и молекулярный анализ t-гаплотипов, выделенных из природных популяций.

Выделение гаплотипов у особей мышей из природных популяций и их генетические свойства. Гаплотип twMF1 , найденный у.мыши из: перуанской популяции, был выделен в самостоятельную линию бесх-■ востых мышей T/twMP1. Исходя из отсутствия в данной линии хвостатого потомства, следует предполагать, что этот гаплотип содержит как tct-факторы, так и фактор летальности. Гаплотип twMcl был обнаружен у мыши с о. Куба. При скрещивании бесхвостых особей T/twMC1 между собой хвостатые потомки не были обнаружены, из чего возможно'заключить, что twMcl также относится к летальным, сохраняющим tct-факторы гарлотипам. Согласно данным комплементационно-' го анализа, гатлотип twf,ípl содержит летальную мутацию, относящуюся к группе t"5 и не включает летальных факторов других компле-ментационных групп, использованных в данной работе. Величина TRD у гетерозиготных по данному гаплотипу самцов составляет 91% в скрещиваниях с самками линии СБА. ..'■•'.

Сравнительный молекулярный., анализ проксимального района t-гаплотипов из лабораторных линий и природных популяций. Гапло-типы tw5, twl2, tw73 , twFa_1 относятся к полным гаплотипам природного происхождения, t полный t1S! и протяженный частичный twl8 (проксимальный) гаплотипы были обнаружены, у лабораторных мышей (Bennett, 1975; Fox et.al., 1985). Блот-гибридизации ДНК Мншей, несущих указанные гаплотипы, проведенная с пробами Ти48, Тибб, Ти119 и Ти122, показала наличие t-специфичных полос, одинаковых для всех использованных гаплотипов. K t-специфическим относятся Taql-полосы с молекулярными весами 2.3 т.п.н. (проба Ти119, табл.4); 2Л т.п.н. (проба Ти122, рис.1); 6.5 т.п.н. и'0.8 т.п.н. (.проба Тибб, рис.2, табл:4) и ,3.3 т.пл... (проба Ти48, • табл.4). Гаплотипы 1шс:1 и t*^1 показывают наличие всех перечисленных t-специфических..полос, т.е...также относятся к полным или, по крайней мере, сохраняют три из четырех, инверсий t-комплекса.

Рес- 1-гаплотипы Хромосома 17 "дикого типа" МиБ 1тог-1:и1а-паэ Миз аЬЬо1 • 11 ¡гаНиэ погуе-д1сиэ

Пробы трик- ЬМ8 Лабораторные мыши М. ,<1отез1лси5 Миз шизси1из

ция с В16 СВА ' Т/+ ва1Ь Ш1 1 . Куба 2 Перу- 1 Зев.Кавтаз 2 Аае[ . 1 2

Ти 4? Тас1 3.3 3.3 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8 0.8' . 0.8 0.8 0.8

Ти 119 таа1 2.3 ■2.3 1.9' 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 1.9 ' 1.9 2.7 0.9

Ти 122 Тац! 2.1 4.4 2.1 4.4 4.4 4.4 4.4 4.4 4.4 4.4 4.4 ■ 4.4

Ти 66 Тад1 6.5 4.5 2.5 .1.5 ' 0.6 6.5 4.5 2.5 .1.5 0.8 . 9.4 4.5 2.5 1.5 9.4 4.5 2/5 1.5 9.4 4.7 4.5 2.5 1.5 4.5 2.5 1.7 1.5 4.7 4.5 2.5 1.7 1.5 9.4 4.7 4.5 2.5 1.7 1.5 9.4 4.7 4.5 2.5 1.5 4.5 2.5 1.5 4.5 - 2.5 . ■ "1 .-5 4.5' 2.5 ' 1.5 4.5 2.5 1.5 1.0 0.3 1.0 0.3

ВаиШ 23.0 17.5 15.26.6 5.8 23.0 17.5 15.2 6.0 5.8 23.0 20.1 15.2 - . 23.0 20.1 15.2 6.6 3.8 20.1 15.2 5.8 3.8 20.1 5.8 3.8 ! ' 20.1 15.2 5.3 "

глт.п.н.

i а а ♦ 6 в 7 s Рис,1. Блюг-гибшимзация с пшбой Tul22 тад 1-рестрицирован-ной ДНК мышей: 1) T/t™?1; 2) T/t®0; 4)0Rbli/+t; 5)

Balb/cJ; 6) Mus dornest leus (Куба) ; 7) t*5/twlz; 8) t12/tn9

Глава 3. Изучение полиморфизма рекоыбннантных гаплотипов из лабораторной популяции мышей

Обнаружение рекомбицантных гаплотипов в лабораторных линиях мышей T/t1. Данные, показывающие частоту появления рекомбинантов в балансированных по деталям линиях T/t,представлены в таблице 5. • В проведенных нами .опытах фактически учитывалась частота рекомбинации для семи летальных гаплотипов в интервале T/tct-tcl. Из 20 обнаруженных рекомбинантных гаплотипов в самостоятельные линии T/t и Ttf/t+ было выделено 6:. 4 происходили из линии t/t6:1 tM1, tM2,tM3 и tM4; 1 - tMS - из линии T/t*12, и 1- T/tM9 - из, линии Г/t12. _ • •

Генетический анализ рекомбинантных t-гаплотипов. Величина передачи t-несущей хромосомы самцами T/tM, ■ у животных с гаплоти-пами tM1,tMZ и tM4 была значительно понижена относительно менде-левского расщепления и в скрещиваниях с самками линии СВА составляла от 21 до 33% (см. табл.6). У самцов мышей, гетерозиготных по гаплотипу, отмечалась преимущественная передача t-несущей хромосомы. Величина TRD составляла 7¿s%, что почти равно TRD самцов, гетерозиготных по исходному гаплотипу t6. в аналогичных скре-' щиваниях- 71%. Для мышей с гаплотипом t118 передача t-несущей хромосомы была близка к менделевской - 54%.

При тестировании бесхвостого потомства, полученного при скрещивании t6/tM самцов И самок T/t6, было обнаружено наличие преимущественной передачи t-несущей.хромосомы для tM1,tMZ и tM4 -гаплотипов, и пониженной - для tM3-raiuoTiina (см. табл. 7), то есть распределение величий TRD, обратное к .наблюдаемому для 'самцов генотипа T/tM.

Животные, гомозиготные по. рекомбинантным t-гаплстипам, были фертидьны, как и мыши-компаунды по рекомбинантным и исходным гап-дотипам (табл.8). Плодовитость самцов tM3/tM3 была значительно ниже плодовитости гомозигот по -остальным четырем гашютипам в скрещиваниях с особями T/t6 и T/tM.Вместе с тем плодовитость го-

моэиготиых по tM3 самцов менее отличается от таковой у гомозигот по другим гаплотипам tM3 при. скрещивании с самками +/+. Очевидно, снижение плодовитости с скрещиваниях с участием гомозигот tM3/tM3 и самок T/t связано в. большей степени с эмбрйонал!ной смертностью гомозигот по tM3 и компаундов tM3/tM3, чём-с,понижением фертиль-ности.самцов. В целом плодовитость особей tM/tHCXW,m'a обоего пола для всех гаплотипов ниже плодовитости гомозигот tM/tM

blst.n.«.

1 г » H S ' « 7 8 S «в 1< là t» П I* M 17П 19

Рис.2. Блот^гибридиэацир с пробой Tu66 laq 1-рестрищюрван-НОЙ ДНК: 1) T/t ■, 2} I/t , 3; 7/1», 4) T/t»6!^) l^/t*"1", 6) RM+/+T, .7) Rbl+/,&£ > 8) T/t*®1, ЭК+^Г (+=Mus..domesti-cus.nepy), ¿СП T/tM9, 11) T/t^8, 12) Î/É*»** 13) +,ЛШс5Г (+=Mus demesticus. Куба), 14) +/twb (+=816), 15) ЧШЛМ8, 16) +/tw5 (+=Balb/cJ), 17.) Baib/cJ, 18) крыса' Rattus norvegicus, 19) +/tw C+=Mus domesticus, Перу)

Таблица 5 ■

Частота рекомбинации в интервале. T/tct - tel в линиях, несужих летальные t-галлотипы

Гаплотип Группа комплементации Количество животных Частота рекомбинаций XlO J

общее рекембииантов

t6 tlz t.w5 iwl8 iwl2 t*73 ^wFa-1 t° ' t12 twb, •t9 f »1 t*73 |.wPa-l 4256 39 08 . 3589 3210 2996' 2843 1189 S 3 . ■ 3 1 5 0 0 1.379 0.756 0.835 ' 0.311 1.666

Таблица 6

Величина TRD у самцов T/t. в скрепдаваниях с самками линии CP А

Гаплотип Изучено самцов Количество потомков TRD

общее Т/+ +/t

ГМ2 fM3 Ьм • tM0 10 8 8 6 5 186 ■ 136 : 103 92 ■ 136 139 ■ 102 28 72 62 47 34 75 20 74 0.33 0.25 ■ 0.73 0.21 0.54

v м Таблица 7

Величина TRD у самцов t°/tf в скрещиваниях с самками из исходной линии T/t°

Гаплстип самца 'Потомство генотипов . T/t.7 TRDM ■ р* - ■

всего r/tM Т/£а

1-М1 tM3 ' tM4 25 13 ' 39 ' 11 18 9 12 8 . 7 4 27 3 ' 0.75 0.69 0.31 0.72 <0.05 >0.05 <0.05 >0.05

* - относительно мендёлевского расщепления

Таблица 8

Плодовитость самцов, гомозиготных по частичным гаплотипам в скрещиваниях с самками линии СВА

Гаплотип самца Протестировано самцов Количество Средняя величина помета+т Количество потомков на самку в месяц

потомки пометы

всего фертильны

(М1 Ь.!2 • 11 Й 9 8 . 6 11 ' 9 7 ■ * 8 6 186 136 103 . 92 •91 ' 34 26. ■ 21 13 • 13 5.47+0.189 5.23+0.215 4.90+0.230 5.11+0.333 5.69+0.358 1.78 1.12 ' 0.93 1.68 1.70

Анализ жизнеспособности мышей, гомозиготных по рекомпшеит-ным гаплотипам, показал высокую выживаемость гомозигот - почти 100Х - по tM2, tM4 и tM8, слегка пониженнув - 72.04Х - по tM1, и низкую - 20.60% - то 1мз-гаплотилу. Гаплотипы 1М1Д,/2ДМЛ и tM3 можно отнести к жизнеспособным, a tM3, - к полулетальным.

Частота рекомбинации между частичными гаплотипами t% хромосомой 17 "дикого типа" в линии учитывалась в интервале T/tct-tf. Данный интервал по своей ■ протяженности сопоставим с расстоянием между tct-генами и дистально расположенным;! tel" и tel^12 -факторами летальности. Частота рекомбинации между tM1,tKZ,tM4. и t*®-гаплотипами и хромосомой 17 "дикого типа" на порядок превышает величину рекомбинации, характерную для полных гаплотиг.ов с дистальным положением летальных факторов (табл.9). Не обнаружено случаев рекомбинации только в линий Ttf/tM3+, при выборке, близкой к остальным гаплотипам,что свидетельствует или о большей протяженности гаплотипа tM3 по сравнению с другими, ' или о' наличии дополнительных аберраций внутри самого гаплотипа.

Геяетическое определение локализации точек рекомендации при образовании частичных галдотипов. Как правило, рекомбинантные самцы мышей, несущие проксимальный участок t-комплекса в гетеро-зиготе, показывают менделевское соотношение передачи хромосом или нарушение TRD в пользу хромосомы 17 "дикого типа", а сохраняющие медиальный и дистальный фрагменты t-комплекса - повышенную в'ариа-бельную передачу t-несущей 'хромосомы- (SДver,1985jSchimenti et'.al., 1968). Из полученных нами данных следует, что гаплотипы tM1;tM2 и tM4 сохраняют лишь центральный участок родительского гаплотипа, несущий Тсг-фактор. и лишены дистального фрагмента со входящими в его состав дистортерамй Tcd-2 и Tcd-3 (рис.3),как и проксимального дистортера Tcd-1, отсутствующего у родительского гаплотипа.t6 (Lyon, 1984). Гаплотип tM3, судя по величине его TRD, может сохранять более дистальный фрагмент ^-гаплотипа со входящими в его состав Ted-генами. В отличие от рекомбинантных гаплотипов, происходящих от неполного t6, гаплотип tMe, по-видимому, содержит дистсртер Tcd-1 родительского гаплотипа twlfc и не содержит более дистальных, активных дистортеров'Tcd-2 и Tcd-3. Основьйачсь только на данных' генетического анализа, невозможно сказать, присутствует ли Тсг-фактор у гаплотипа tM8. Эффект изменения TRD tM-несущих хромосом у компаундов tM/t6 по сравнения с гетерозиготами T/t,M может быть объяснён тем, что конечное сегрегационное соотношение■хромосом определяется не только системой Ted-Тег факторов в составе t-галлотнла. но и взаимным влиянием [гомологов. ■

Î5

Таблица 9

Частота рекомбинации частичных галлотипов в интервале T-tf

Гаплотип

4-М1

^мг

h.i3 h,i4

[на

Общее количество

животных

176 ' '

■131 121 74 298

Количество рекомбинантов

Частота рекомбинации хЮ"3

17 15

27 21

«

1IÇ4 Ш ff9-2 ВвР _&

—ftp^pr-r-f— +

;> i V» t

7K

~H

«

m 6$ abc

m» ы' -ut*

и

m 86ABC

IH

~Jt»*

o*

«IX

It

у-пз

ft? SfAâC m

/22

É"

Рис.з. Схема происхождения рекомбинантных галлотипов tM. (А)■ рекомбинация между t- и +-хромосомами 17. Инверсии ¿-комплекса показаны блоками, кеинвертированная ДНК - сплошной линией, вероятные пути рекомбинаций - пунктиром. Показано положение генетического маркера Т, Факторов летальности tel, факторов tet гена- респондера Тег и последовательностей. ДНК D17Leh48, D17LehU9. D17Uhl22 и D17Leh66 (АгВ и С - семейства). На рис. (А) как t* обозначен рекомбинантныи гаплотип. ,предшествующий обравованию t1'10. (Б) рекомбинация Менаду t*- и .Р-^-гаплотипали, приведшая к образованию гашютипа tM .

Данные о'д.'носительно-жизнеспособности гомозигот по гаплотипам tM подтверждают поедположение об их протяженности, сделанные на осисвании величин TRD. Низкая жизнеспособность гомозигот tM3/tW3 1 позволяет считать, что протяженность t.M3 гаплотипа больше, чем у остальных рейомбинантных галлотипов. tM, если принять предположение о существовании генов "полулетальности", снижающих жизнеспособность (Silver, 1985). Другим возможным' объяснением этого явления может, быть образование вследствие нёравного кроссингооера хромосомной микроаберрации, влияющей-на жизнеспособность гомозигот ш tM3.

ib

Большинство исследователей отождествляет гены стерильности t-комплекса ( Tes) с факторами-дистортерами Ted (Lyon, 1985, Silver, 1985, Schimenti et.al., 1988). Фертильность й плодовитость самцов и жизнеспособность гомозигот tM3/tM3 в сочетании с высоким TRD гетероэигот по 1мз-гаплотету, да»т возможность предположить, что- фактор летальности tel6 ке является Жестко сцепленном с наиболее активным дистальным дистсртером Ted-2. Согласно данным Лайон (Lyon, 1986), гомозиготность по Tcd-2 соответствует гомози-готности по Tes-2, что приводит к полной стерильности самцов с подобным.генотипом, особенно при наличии.в гомо- или даже гетерозиготной форме других дистортеров. Исходя.из данных, полученных в отношении гаплотипа tM3 , .можно высказать следующее предположения: 1) Tccl-2 и Tes-2 -факторы не являр-ся идентичными или жестко сцепленными и между ними возможна крайне редкая рекомбинация; чли 2) гаплотип tM3 произошел вследствие нераьной рекомбинации, сопровождавшейся дупликацией или иной хромосомной микро-аберрацией района, содержаи.его более слабые дисЯорти-ры - Tcd-3,4 и та1 5. Подобная дупликация могла существенно noi ■ кгь передачу tM3 -хромосомы потомству , не приводя к полной" стерильности сймцое-гомозигот, хотя-и понижая-их плодовитость.

Рекомбинантные гаплотипы tM1,tM2 И tM4 в гомозиготе дают фе-яогипкчеекм нормальных животных, а в гетерозиготе с Т-несущей хромосомой - бесхвостых, т.е. проявляются как типичные проксимальные гаплотипы, несущие tct-гены. В ряде скрещиваний с участием мыией, несущих ^,,13-гаплотип в различных сочетаниях, было отмечено появление короткохвостых потомков (Табл. 10). Подобный фенотип обычно соответствует генотгну Т/+, однако в проведенных скрещиваниях ожидалось появление только потомков с генотипами t6/tM:\ tM3/tM3, T/t6 и T/tM3. Дачный эффект может быть объяснен, образованием новой хромосомной микроаберрации в медиальном районе t-комплекса,захватывающей один из предполагаемых факторов tet, расположенных проксималькее и дистальнее гена Тег (Nadeau et. al., 1987) (рис.3). -

Особи с генотипом ТЛм8,как й мыши из исходной линии T/tw17', не имели хвоста, из чего можно сделать еыеод о сохранении у них tct-генов. Поскольку положение генов летальности tclwl" картируется в дистальной части t-комплекса (Artst,1984), а tct-факторов - в -проксимальной (Nadeau et.al., 1987), tM8 -гаплотип дел,«ел включать ■прицектромеркуи и проксимальную инверсим и не сохранять дистальной. что подтверждается результатами генетического англеза TR0 и дакнкми относительно жизнеспособности гомозигот tJ-^/tJ'^.

Частичный гаплотип tMg, происходящий от-t1'', содержит деталь-.

Таблица lû

Выщекление короткохвостых особей в скрещиваниях с участием мышей, несущих t' -гашютип "

ГЕНОТИПЫ - родителей Потомство

Общее количество расщепление по фенотипу

наблюдаемое M ожидаемое

б/х Д/Х к/х б/х д/х к/х**

T/tM3 щб Т/+„ t»3/!."3 T/t® T'tM3 T/t* . T/tf T/t T/i™3 43 48 -76 156 34 4? 35 • 15 52 125 0 15 а .24 22 -ZQ . 22 23 0 g 2 1Q 12 ; 9 га.? 24.0 50.7 104,0 ■17,0 23.6 14.3 24.0 26,3 52.0 17.0 23.5 ооооао

без учета TRD самцов и неполной жизнеспособности гомозигот * -б/х - бесхвостые, д/х - длиннохвостые, к/х - короткохвостые - короткохвостые мыши, полученные в указанных скрещиваниях кую мутацию, отличную от исходной и относящуюся к другой комме-мектациойной группе,, что доказывается 1) жизнеспособностью особей, гетерозиготных по исходному t12 и новообразованному tM9 гап-лотипгм и 2) отсутствием хвостатых потомков в линии бесхвостых м-шеА и», -СамцЫ генотипа tM9/t12 оказались стерильными. Исходя из генетических данных о положении летального фактора tel12, (Artst,1984) и сохранения у tM9 tGt-.Генов, можно предполагать',' что точка рекомбинационного события, приведшего к образованию и входящей в его состав новой рецессивной летальной мутации, находится дастапънеё медиального -неинвертирозанного' участка t-комп-лекса - возможно, в .области дистальной инверсии•( рис.3).

Молекулярный анализ частичных галдотипов. Елот-гибридизация ■ ДНК мышей, несущих гаилотин tM9, с каждой из.четырех использованные проб не доказала его отличий от исходного и других полных t-гаг.лотипов (рисЛ,2) „что подтверждает'предположение о его про-«с.хоздзнии вследствие рекомбинации в области, расположенной дис-тальнее медиальной инверсии. | Картина гибридизации Д1!К мышей, несущих tMS-ramidTi,ii в гомозиготном состоянии, о пробами Tu48, ТибВ и Ги119, покапывает-наличие ¿.-специфических и отсутствие +-специ-Фическлх полос (рис 1,2,табл.4).. При денситометрии можно отметить лишь более высокую по сравнению с другими t-гзплотипами интеноив-•ность 0.8 т.н.п. Taq 1 полосы,- соответствующей дистальному элементу семейства D17Leh66 - Сх. . Однако гибридизация ДНК гомозигот tM3/tM8 и компаундов tM:3/twlz с пробои TU1.22 показывает наличие полос, характерных как для + -(2.1 т.п.п.ïajl-полоса), так и

1В

t-несущей хромосомы 17 (4.4 т.п.н. Taql-полоса), (рис.1,дор.2 и 3). Элемент D17Lehl22 локализован в медиальной инверсии (Fox et.al., 1985)' (рис.3). Данные молекулярного анализа дают возможность картировать точку рекомбинации, приведшей к. образованию tM8-гаплотипа, в области окончания медиальной инверсии за D17Lehl£2-t ДНК-элементом -На t*lz-несущей хромосоме й перед Di7Lehl£2rf- ДНК-элемен-Лм ца хромосоме "дикого типа" .(рис.ЗА). Однако данная схема неравного крорсииговера не может объяснить дупликации" или амплифйкацйи D17Leh66-Cx элемента. Можно выдвинуть два вероятных предположения о происхождении данной структуры. Первое предполагает■существование второй точки рекомбинации, независимой от расположенной в области 017ЬеМ2?-злементов. Против данного Предположения свидетельствует 1} крайне малая вероятность такого события, . как двойной. кроссииговер между t-галлотипом и +-хромосомой и 2) отсутствие у гаплотипа tM6 +-- форм последовательностей ДНК, расположенных проксимально по отношению к D17Leh66-элементам.; Второе предположение состоит в том. что t-гаплотип образовался в результате двух последовательных реком-бинационных событий, первое иг которых - описанный выше неравный кроссинговер в области Dl^Lehl22 ДНК-элементов между +-хромосомой и ^аплотипом t*-12. Второй случай кроосинговера мог иметь место прй вцделении новообразованного рекомбинантного гаплотипа (обозначенного далее как npe-tMe) в самостоятельную линию. Данный ре-комбинантный гаплотип был обнаружен впервые у слбжной гетероаиго-ты'npe-t^/t"12. Рекомбинация между двумя родственными ганлотипа-ми в области D17Leh66 ДНК-элементов представляется весьма вероятным событием, При подобном кроссинговере могла произойти не обнаруживаемая фототипически амплификация D17Leh66-Cx элементов, причем особь с новообразованным t1*18 гаплотипом стала родоначальником линии T/tM8'(рис. ЗБ). • ■ :

Глава 4.Молейулярннй анализ проксимального района хромосомы 17 "дикого типа" мышей из лабораторных линий и популяций Mus do-mestlcijs.

Для хромосомы 17 "дикого типа:1 характерно присутствие 9.4 т.п.н. Taql- полосы (проба Тибб),показанной на рис.2; 4.4 т.п.н. Taql- Полосы (проба Ти122; рие.1) и 1.9 т.п.н. Taqi-полосы (проба ÎU119). ДНК мышей различного происхождения, несушцх хромосомы 17 "дикого типа", при использовании проб Tu 48, Tul'19 и Tul£2, показали одинаковые, картины, гибридизации: ' +-специфичные полосы 1.9 т.п.н., при использовании пробы TU119 (табл.4).;. • 4.4 т. и. н. (проба Tui22,• рис.1, табл.4); 0.8 т.п.н. (проба Ти43, табл.4). Однако При гибридизация- этих ДНК с,пробой Тибб были обнаружены заметнче

различия в распределении гибридиаацийшшх полос (рис.2,4, табл.4). Полиморфный характер носили следующие -(--специфические полосы. 9.4 т.н.п. Taql-полооа отсутствовала у мышей нинии Balb/oJ в отличие от особей из других инбредных линий и природных популяций (рис.2). 4.7 т.н.п.Taql-полоса была обнаружена при более длительном электрофорезе, чем применявшийся нами ранее, когда данная полоса могла сливаться с 4.5 т.н.п.' Taql-полосой, не имеющей ни +-,ни t-специфичного характера. 4.7 т.н.п. Тац1-полоса была характерна для мышей из лабораторных линий T/t,несущих +-хро-мосому общего происхождения с маркерной мпкроделецией Т (Brachyu-ri); для не обследованных ранее мышей, несущих робертсоновскую транслокацию Rh(8,17)llem, а также-особей "дикого типа" из попу-ляций*Перу и Кубы {рис.2; .табл.4). 1.7 т.н.л. Taql-полоса, также не описанная ранее, была обнаружена у мышей, несущих .транслокацию pb(,8.17)1 lern, мышей из линии Balb/cJ, и особей из кубинской популяции (рис.2; табл.4).

Полиморфизм обнаруживается также и при гибридизации пробы Tuöß о BamHl-рестрициравашюй ДНК- мышей "дикого -типа" (рис.5,табл.4). t-слецифичный характер носит, по-видимому, лишь 17.6 т.п.н. полоса. Остальные полосы носили полиморфный характер, что показало в табл.4. В целом можно сделать вывод о харак-, терной для ДНК-элементов семейства DJ7Leh66 нестабильности в количестве и распределении копий на хромосоме 17^ "дикого типа". Гибридизация ' с пробой Тибб EamHl-рестрицированной ДНК одной из особей Mas do.Tiesticus (гетерозиготной по гаплотипу twMcl) из кубинской поиулядии показала крайне высокую интенсивность 5.8 т.н. п. Bamiil-полосы, служащую указанием на амплификацию ГЛ71.еЬ0б-злементиВ на+-хромосоме данной Особи (рис.5,дор.3).

Глава 5. Молекулярный анализ структуры проксимальной-части хромосомы 17 у представителей других видов рода Mis.

Гибридизация ДНК мышей Mas-muscuius, m. abbotti и M. hortulanus и пробой lulls показала наличие 1.9 т.п.н. полосы, характерной для "дйкогг типа" организации хромосомы 17 Mus dornesticus (таол. 4). Влот-гибридизация с пробой Тибб Taql-рестрицированной ДЧК представителей вида Mus muscuius и других показала, что распределение ДНК-элемонтов D17Leh66 я D17Lehll9 на хромосоме 17 .у мышей ридое Mus muscuius, , M. hortulanus и M. abbotti сходно с такоюм у хромосомы 17 "дикого типа"- Mus domesticus. Согласно гипотезе Ы.Хаммера, популяции мышей, предковые для М. muscuius, M. domesticus, M. hortulimus и M. abbotti, были полиморфны по структуре хромосомы 17. Проьеденный нами молекулярный анализ не обнаружил среди представителей видов M. 'hortulanus (Молдова) и M. ab-

Рис.4'. Блот-гибридизация с пробой 7uô6 Taq I-рестрицированной ДНК: 1) СВА G/Lac, 2) Т/+, 3).T/tM8, 4) twl£/tw5, Б) Mus hortulanus. б) крыса Rattus norvégiens линии Ylistar

botti (Армения) носителей Е-комплекса или проксимальной инверсии.

Денситометрия рентгеновских пленок, соответствующих гибридизации пробы Тибб с Taql- рестрицированной ДНК мышей указанных видов показана заметные межвидовые различия в относительной интенсивности полос 9.4-4.5, 2.5 и 1.5 т.н.п..обусловленные, по-видимому, разницей в количестве копий каждого из типов D17Leh66-noc-ледовательностей (табл.11). У представителей вида Mus musculus обнаружена относительно большая интенсивность 2.5 т.н.п. Taql-no-лосы, соответствующей ДНК элементам D17Leh66-p, по сравнению с таковой у мышей Mus domesticus и в еще большей степени - M.abbot-ti И M.hortulanus. У двух последних видов количество копий в-эле-ментов, по-видимому, значительно ниже, чем у M.domesticus и M.musculus,. Кроме того, 4.5 т.н.п. Taql- полоса, соответствующая D17Leh66-ci последовательностям, у особей вида M.abbotti также обладает крайне низкой' интенсивностью по сравнению с мышами трех других видов. Ввиду того, что выборка мышей видов M. hortulanus и M.abbotti была невелика и ограничивалась только 2 географическими точками, нельзя окончательно утверждать, что обнаруженные различия носят стойкий видовой характер, однако наблюдаемая'тенденция к дивергенции по количеству копий каждого типа 1317ЬеЬб0-последо-вательностей между видами p.Mus представляется весьма вероятной.

распределение интенсивности гибридизаЦионных полос, и, вероятно, количественное распределение копий ■ D17Leh56-axeMeHTOB у особей M. musculus иа Азербайджана отличается от характерного для представителей вида M. domesticus и более сходно с таковым у осо-

v. аз-°

к s.

4 17.5

1 "

V 5.8 т.п.н

Б

i з

2 3

Рис.5. Енот-гибридизация с пробой Тибб-ВатН 1-рестрщшрованной

ЗНК: i) RbtVRbl, 2) Mus musculus (Сев. Кавказ), 3)+/EWHCT (+=Mus omestleus,Куба). (A) экспозиция фильтра в течение 3 суток; (Б) экспозиция- 7 суток

бей M. musculus Северного Кавказа. Вдот-гибридиаационный анализ с использованием Пробы Тибб не обнаружил каких-либо следов обмена генетическим . материалом между видами M.domesticus и M.musculus в районах Азербайджана и Северного Кавказа(рис е).

Глава 6. Обнаружение последователь ностей, гомшюгичкик ^специфическим пробам у представителей других родов гриаунов.

Проведенная гибридизация Taql-рестрицированной ДНК крысы Rat-tus norvegicus с пробами Tull9 и. Тибб показала присутствие последовательностей, гомологичных, соответствующим t-специфичным ДНК-элементам (рис.2 и 4; табл.4). Геном желтогорлой мыши Apode-nus flavicollis ч полевой мыщи A. agrarius не выявил наличия гомологии к указанным пробам. Поскольку ДНК-элементы D17Leh66 семейства вносят•существенный вклад в разнообразие геномного района t-комплекса хромосомы 17., а также; согласно данным Чименти, и Бул-лардэ (Schimenti, Bullard, 1989) содержат последовательность гена- респондёра ', играющую существенную роль в процессах сперматогенеза и нарушения соотношения передачи t-несущей хромосомы, об-

«1 f.5

<â t.*

«0 M

А. f.5 т.п.и.

H í Ä 4

M M V

ot« u м т.п.H

ДНК: lus

Риб. бДОБлот-гибридизация с пробой Тибб Taq I-рес^рицированной

;: 1) Mus musculus {Сев. Кавказ)* 2} Mus abbotti, 3) Mus muscu-¡ tatarlcus (Азербайджан), 4) t^/t1^ (Б) данн^^енседоиеррии

Интенсивность гибридизации с пробой Tu 66 Ts -рестрицированной ДНК мышей различных видов

8 X)

f. СВА

2. Balb

3. M.domesticas

С Куба)

*.T/tH« s.twe/tM'

в. М.ПШ8Сц1и$ ^ (Сеа.Кавка»}

7. M.hortularius

8. Й.abbotti 8

rveqicua

есТ(эи

енс ца

*Rattnfr

• Тип D17Leh66 элементов лабораторн. M.' dornest leus M," müsculus M. hortu-lanus M. abbotti

СВА Balb 1 2 3. 4

ci 26. Б' 20.1 18.1 21.2 19.2 13.3 29.4 7.3

. В 18.3 20.1 16.1 18.4 29.3 40.3 11.2 7.3

r 55.2 59.8 65.0 60.4 . Б1.5 46.4 ' 59.4 85.4

1-Кубз, 2-Перу, З-Сев.Кавказ, 4-Азербайджан наружение гомологичных D17Leh66 последовательностей ДНК в геноме

крысы представляет особый интерес. .Судя по относительно низкой интенсивности и малому количеству гибридизационных полос (рис. 2 и 4, табл.6), Тибб-подобная последовательность крысы представлена 1-2 копиями, или, feo всяком случае,. ' значительно меньшим числом копий, чем D17Leh66-элементы домовой мьши.

Полученные.данные позволяют предположить, чтб D17Leh66-последовательность существовала у общего предка родов Mus и Rai fus.

выводы

1.В реципрокных скрещиваниях с использованием мышей, несущих летальные t-гаплотипы, обнаружено влияние генотипа матери на выживаемость сложных гетерозигот tx/ty и на соотношение полов-, среди Данного класса потомков.

2.Проведен генетический анализ 6 новых ' рекомбинантных t-ran-лотипов.На основании . данных генетических исследований и молекулярного анализа определены пути рекомбинации между t-комплексом и хромосомой 17 "дикого типа", приведшие к образованию данных гап-лотипов.

3.На основании изучения соотношения передачи t- и +-несущих хромовом у структурных гетерозигот Rbl+/+t и tM/t6 обнаружено, что этот эффект является результатом взаимного влияния гомологичных хромосом.

4.Проанализированы некоторые генетические свойства и структура проксимальной области галлэтипов t*1^1 и twMc:l, выделенных из природных популяций мышей Перу и Кубы. Результаты гибридизации .(.-специфических проб Ти48, Тибб, Ти119 и Тц122 с ДНК мышей, несущих полные t-гаплотипы различного природного происхождения, говорят об отсутствии полиморфизма соответствующих последовательное-, тей на широкой географической выборке форм t-комплекса. , Б.Обнаружен полиморфизм количества и распределения копий ^специфических ДНК-элементов D17Leh66 для хромосомы 17 "дикого типа" лабораторных и диких мышей вида Mus domesticus.

6.Обнаружены различия по числу копий элементов D17Leh66 между мышами видов Mus domesticus, M.musculus, M. abbotti и M. hor-tulanus. Показано, что структура проксимального фрагмента хромосомы 17 двух последних видов близка к "дикому типу" хромосомы 17 Mus domesticus и не содержит инвертированных участков, характерных для t-комплекса. • • .

7.Обнаружено наличие гомологии к. ^специфическим пробам Тибб и Ти119 в геноме серой крысы Rattus norvegicus.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Сафронова Л. Д., Шустрова И.В., Орлов В.Н., Митрофанов В.Г. Генетический анализ комплементации t-гашготипов мышей.(1989). Генетика. 25. Стр.1619-1628.

2.Сафронова Л.Д., Шустрова И.В., Орлов В.Н., Митрофанов В.Г. Генетический аналиа фертильности самцов млаей, несущих различные t-гаплотипы. (1989).Генетика. 25. Стр.1836-1842.

3.СафроНова Л.Д.; Шустрова И.В., Орлов В.Н., Митрофанов В.Г., Куликов A.M. Эволюционное значение . генетической изменчивости t-комплекса у мышей й SD-локуса у дрозофилы.(январь,1989). Тез. докл.I¡Всесоюзной конференции по проблемам эволюции.Москва. 2. Стр. 99.

4.Шустрова И.В., Сафрснова Л.Д., Митрофанов В.Г. Характеристика новых частичных гаплотипов tMl*M2-M3'M4. (1991). Генетика. 27.Стр.1000-1012.

Б.Сафронова Л.Д.; Шустрова И.В., Митрофанов В.Г. Нарушение соотношения передачи у самцсв мышей, несущих трапслокахрпо Rb (8,17) Нет в сочетании с t-гашютипами. (1993). Генетика. 29. Стр.1992-1999.