Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СРАВНИТЕЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ ИЗБЕГАЮЩИХ ИНАКТИВАЦИИ ГЕНОВ Х-ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА НА ХРОМОСОМАХ ПЯТИ ВИДОВ ПОЛЕВОК РОДА MICROTVS (ARVICOLINAE, RODENTIA)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "СРАВНИТЕЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ ИЗБЕГАЮЩИХ ИНАКТИВАЦИИ ГЕНОВ Х-ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА НА ХРОМОСОМАХ ПЯТИ ВИДОВ ПОЛЕВОК РОДА MICROTVS (ARVICOLINAE, RODENTIA)"



На правах рукописи УДК 576.316.74

ЛНОПРИЕНКО Ольг» Вялентияовня

СРАВНИТЕЛЬНОЕ КАРТИРОВАНИЕ ИЗБЕГАЮЩИХ ИНАКТИВАЦИИ ГЕНОВ Х-ХРОМОСОМЫ ЧЕЛОВЕКА НА ХРОМОСОМАХ ПЯТИ ВИДОВ ПОЛЕВОК РОДА м/сяотиз (АЯМСОЬтАЕ, КОВЕ!ЧТ1А)

Генетика-03.00,15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск 2004

Работа выполнена в лаборатории биохимической генетики животных Инспггутез цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор С.М. За кия и Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

член-корреспондент РАН И.Ф. Жимулев

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск,

кандидат биологических наук, доцент О. В. Сабли и а Новосибирский государственный университет, СУИЦ, г. Новосибирск.

Ведущее учреждение: Томский государственный

университет, г. Томск

Защита диссертации состоится 24 марта 2004г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-mnc Инспгпт? - ;у: 630090, г. Новосибирск, проспект Лаврентьева, 10. Факс: .'J-1^-, о; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ■ ")J ? j библиотеке Института цитологии и генетики СО г*

Автореферат р.- . ■ _2004г.

Ученый cc~peian дисссрт' ю доктор I —■'СЛ...

А,Д. Груздев

ВВЕДЕНИЕ

АКТУАЛЬНОСТЬ. Организация, функционирование н эволюция Х-хромосомы плацентарных млекопитающих неразрывно связаны с уникальным механизмом регуляции экспресс ни генов - инактивацией одной m Х-хромосом у гомогаметных самок (Х-инактлвацней). Несмотря на зна'Пггельный прогресс, достигнутый за последнее десятилетие в понимании механизма инактивации Х-хромосомы, ряд ключевых моментов остается неясным.

Выявление избегающих инактивации генов у плацентарных млекопитающих позволило заключить, что Х-ннактвання не носит тотального характера. Разные виды могут отличаться по статусу X-инастивации генов. Изменение функциональных параметров генов X-хромосомы, в том числе и статуса их экспрессии на неактивной Х-хромосоме, можег Сыть вызвано эволюционным!! изменениями ее структурной организации (Disteehe, 1999; Brown, Greally, 2003).

В плане разнообразия структурной организации половых хромосом отряд трызунов является интересной группой, представляюшей широкий спектр кариоптических вариантов. Х-хромосома мыши, которая может оказаться самой перестроенной среди Х-хромосом плацентарных, имеет значительно меньше избегающих Х-инактивации генов, чем у человека (Diuechc et al„ 2002). Однако остается неясным насколько изменение порядка геноз или различие в морфологии Х-хромосоч человека и мыши ответственны за отличня в статусе инактивации генов у этих видов. Привлечение в сравнительные исследования Х-хромосомы новых видов поможет ответить на этот и другие актуальные на современном этапе вопросы: какие генетические и эпигенетические факторы вызывают изменение статуса экспрессии генов; какова роль гетерохроматиновых блоков в распространении Х*инакгивации; и чем существенно различается конденсированное состояние конститутивного и факультативного гстерохромашна Х-хромосомы? Практический и теоретический интерес представляет изучение специфических способов регуляции экспрессии гонов у разных видов, закрепившихся у них случайно или в результате отбора в ходе эволюции.

Перспективным подходом для изучения комплекса вопросов, связанных с эволюцией хромосом, механизмами хромосомных перестроек, эволюцией механизмов регуляции экспрессии генов и регуляторных элементов является исследование групп близкородственных видов. Серые полевки рола Microtus

ЦНБ MOXA

фом*

относятся к Gucipo эволюционирующий линиям. Пять близкородственных видов полевок рола Microtia — М.rossiaemeridionalis, M.arvalis, M.kirgisorum, M.transcaspicus >i M.agrestis — имеют отличные по размеру и морфологии X-хромосочы, и были выбраны нами для юления эволюционных преобразований их Х-хромосом с помощью сравнительного картирования методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) из метафазиых хромосомах. Представленность генов, избегающих Х-ннакгивашш у человека, по всех эволюционных стратах Х-хромосомы, делает их хорошими кандидатами для сравнительного картирования и изучения эволюционных .преобразований Х-хромосом других видов.

Цели и задачи исследования. Цель данной работы - определение степени и характера реорганизации Х-хромосом пят близкородственных видов полевок (рол Aficrotus) в сравнении с Х-хрочосомами человека и мышевидных грызунов.

Для достижения цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Получить зонды генов, избегающих Х-инактивации у человека и мыши.

2. Выделить геномные клони полевок, содержащие ортолош избегающих инактивации генов человека и мыши.

3. Осуществить с помощью FISH локализацию клонов полевок, содержащих гены, ортологичные избегающим инактивации генам человека н мыши, на метафазных хромосомах полевок Л/ross iacmeridionalis, M.arvalis, MMrgtsomm, M. transcaspicus и M.agrestis.

4. Проанализировать порядок расположения генов на Х-хромосомах пяти видов полевок it определить прелковый для труппы *arvalis' тип хромосомы.

5. Провести сравните порядка генов предковой Х-хромосомы обыкновенных полевок с порядком генов Х-хромосом человека и мышевидных грызунов (мыши, крысы). Проанализировать распределение избегающих Х-инактивации генов на хромосомах этих видов.

Научная новизна. Впервые на хромосомах пяти видов полевок рола Microtia локализованы восемь избегающих Х-инактивашш генов человека Eiße, Rab9, Zfit, Crsp2, Utxl, Xel69, SblÄ NapIO, и два гена второго псевдоаутосомного района человека Sybil и Sp/уЗ. Сравнительный анализ локализации десяти новых и пяти картированных ранее генов у обыкновенных полевок позволил выявить новые перестройки и уточнить

границы определенных ранее ннверслП, имевших месго в ходе ооолгошш X-хромосом полевок. Впервые установлено, что по порядку генов Х-хромосомы M.kirgisorum и M.arvalis наиболее близки к предковому для группы 'arvalis' типу Х-хромосомы. Впервые проведено сравнение порядка генов на X-хромосомах обыкновенных полевок с порядком генов па Х-хрочосочах мыши, крысы, других грызунов. Выведена предковая Х-хромосома семейства Muridae к предложена схема возможных перестроек, разделивших X-хромосомы человека, полевок и крысы.

Практическая ценность. Полученные в работе результаты лягут в основу изучения статуса Х-инактивашш картированных генов н механизма осуществления регуляции экспрессии этих генов. Проведенный анализ про доставил дополнительную информацию о консервативных кластерах на X-хромосомс, и позволил более точно оценить степень реорганизации X-хромосоми у близкородственных видов полевок, что в целом, вносит вклад в понимание закономерностей эволюции половых хромосом и всего генома.

Апробация работы н публикации. Материалы диссертации былн прел ставлены на 6-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых "Биология - наука XXI века", Пушино, 2002, Международном симпозиуме по проблемам мейоза, Санкт-Петербург, 2003. По материалам диссертации автором опубликованы две научные статьи в отечественной и зарубежной печати.

оклад автора. Основная часть экспериментальных работ и анализ полученных данных проводился автором самостоятельно. Л.Кэррол (UMMS, Worcester, USA), М.Матараззо (IGB, Naples, Italy) и С.Павловой были выбраны и предоставлены прайчеры для части генов. Скрининг геномной библиотеки, анализ полученных клонов, их cjtfклонирование и частичное секвснирование проводились совместно с А.П.Шевченко. Препараты для FISH получены Н.В.Рубцовой. Основная часть гибрилизацнонных in situ экспериментов проведена Н.Л.Мазурок. Совместно с Н„Л.Мазурок автором проводилась обработка данных FISH экспериментов. Контекстный анализ нуклеогндиых последовательностей проводился совместно с Е-Л.Елисафенко.

структура и объем диссертации. Диссертация включает разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы (251 ссылка); изложена на 136 страницах машинописного текста, иллюстрирована 20 рисунками и содержит 7 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Животные, В работе были использована! [ы 5 видов полевок рола Microlut: 4 вида полевок труппы "arvalis" - Marvalis. Mktrgborum, AirossiaemeriJíonaiis, н M.transcmplcus к озли вид из группы "agrestis" - Magre stís. Животные были отловлены в разных регионах бывшего СССР н содержались в виварии Института цитологии и генетики СО РАН.

Мтеку.гярные методы, связанные со скринингом геномной библиотеки, выделением, очисткоП. клонированием, амплификацией и сиквенсом НК выполнялись ло стандартным протоколам (Мзяиатие и лр., 1984; Sanibrook el al., 1994; Promega guide 1990) или протоколам фирм-производителей.

Флуоресцентная in situ гибридизация (FISH). Циго генетически е препараты мстафазных хромосом готовили из клеточных линий и первичных кулыур фпбробластов левого. Клетки получали методом трипсиикзапии от одно- или двухмесячных животных (Nestcrova et ü/., 1994). FISH и детекцию меченых ДНК-проб проводили по методу, описанному у Pinkel et al., 19S6 и Lichter et al., 1988. Для окрашивания хромосом применяли DAPI.

А о ипьютерный анашг последовательности выполнен с помощью пакетов программ BLAST (Altschul et al., 1990, ht^://www,ncb¡ .nlm.nih.gov/). RepeatMasker (A. Smit, http^/www.gciwme.washingtoaedu^^TiC/analysbtoolsr'repeatinaskJitm), FASTA (Pearson, Lipman, 1988), DNAStar (DNASTAR Inc.) а также программ на серверах http ://£enome.uc sc.edu/, http ://www.ensembl .org/. Для выявления повторяющихся элементов использовалась Саза данных повторов в геномах человека и грызуноа (Juita et al., 1992; Jurka.1995). Выбор олигонуклеотидов проводился с помошью программы PrimerSelect нз пакета DNAStar,

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 1.Получение зондов для избегавших инактивация генов.

Для сравнительного картирования у близкородственных видов обыкновенных полевок были выбраны следующие гены: ШС2, локализованный в первом пссвлоаутомомном районе (ПАР1) Х-хромосомы человека; гены короткого плеча EIF4C, MIDI, RAB9, ZFX, CRSP2, UTX1, VBE1, РСТК1, SB1.8, ХЕШ; гены NAPÍL3 н RPS4X, локализованные в длинном плече Х-хромосомы человека; и гены ПАР2 человека ЯРЛУЗ, SYBLI, IL9R, CXYorfl.

С помощью ПЦР на кД!1К были получены зонды для последующего скрининга фаговой геномной библиотеки полевки Л/.rossiaemeridtonalis. ИраЙмеры для ПЦР были выбраны по известным последовательностям генов человека и мыши в базе данных http://www.ncbi.nlrn.nih.gov/entrez. В качестве источника кДНК использоишш мРНК, выделенную из печени

Лтм1астсг'нИопа}1з> либо мРНК 1» перевиваемой культуры клеток человека НЕЬЛ (Рис. I). Соответствие ПЦР-продуктов выбранным генам проверялось секвенированием продустов амллификашш.

Рисунок 1. Варианты 111 У длв некоторых генов,

использованных в качестве зондов при скрининге геном uoft библиотеки. Дорожки: 1 - ген UTXI, а - кДНК ЛI roí 5 ¡acmeriJionatis, б — кДИК клеток HELA; М - маркер lkb ladder; 2 - геи 2FX, а - кДНК HELA,

б - кДНК M.rotsiaemerUliomtlir, 3 - геи SBI.8, а - кДНК М rossiacmeriJionalis, внешняя пара праймеров 11/14, б — кДНК /rassiaemeridtonalts, пара праЯмеров 11/13. На дорожках 4 и 5 кДНК St.rosúaemeridionaUs гены MIDI и RAB9\ дорожки б - 8 в качестве исто'Шика кДНК была использована кулера клеток DELA. 6 - геи ХЛРШ; 7 - тек CRSP2-, 8 -ген EÍF4C.

Для шести генов MIC2,ХЕ169, SPRY3, SYBLIJL9R nCXYorß в качестве зондов для скрининга геномной библиотеки использовали клонированные фрагменты кДНК человеха юн мыши.

Для большинства зоилов в результате скрининги геномной библиотеки M.rosslaemeridionalls был получен более чем один позитивный фаговый клоп, дающий сигнал гибридизации. Фаговые клоны анализировали с ломошью рестрикции и блот-гибридизации (Рис. 2). Совместный рестрикиионнын и гибрндизашюнныП анализ позволял разделить фаговые клоны, соответствующие одному зонду, на группы, содержащие либо идентичные фаги, либо клоны, составляющие коитигн. Из i рун и и выбирался один фаговый клон, с которым проводилась FISH на метафазиых хромосомах Д l.rosaiacmcrlciionalis.

Таким образом, в ходе работы были предварительно проанализированы 59 фаговых клонов, полученных при скрининге геномной библиотеки М, rossiacmcridionalis зондами 16 генов: М1С2, EIF4C, ZFX, UTXI, UBE, RPS4X, MIDI, ХЕ169, SBI.8, NAP1L3, CRSP2, RAD9, SYBL1, SPRV3, JL9R. CXYorfl,

л

Б

Рисунок 2. ГестрнкционныП знали; ■■ блог-гнбрнянэаиня фаговые клонов, отобранных в результате скрининга геномной библиотеки М, roitiaemtruHanalis, зондами: А - RAB9; Б - SYBLI. На первой дорожке нанесен маркер "Ikb ladder" (стрелками указано положение полос 3kb и Ikb). tía следующих дорожках нанесены и иди атоллы lue фаговые клоны, обработанные рестрнхтазой EcoíU.

2, FISH фаговых клопов на мстяфазных хромосомах пяти видов полевок

рода Aficrotus,

В результате проведенной in situ гибридизации на Х-хрочосомах полевок Mrossiaemcrldionalis, Mtranscasplcm, JlfMrgborum, Marvalis, и Magre st is была установлена локализация фаговых клонов для 11 генов: EIF4C, ZFX UTXÍ, MIDI, ХЕШ, SB 1.8, CRSP2, NAPÍL3. RAB9, SYBL1 и SPRY3. Фаговые клоны двух генов CRSP2 и SYBLI одновременно с локализацией на X-хромосоче выявили аутосочную локализацию. Только аутосомную локализацию вы я bilí н фаговые клони гена ПАР1 человека - М1С2 к генов IIAP2 - 119R и CXYorfi (анализ трех последних клонов в данной работе не проводился). Фаговый клон гена ХЕ169 выявлял слабые множественные сигналы гибридизации на Х-хромосоме и аутосочах М.rossiacmcriJionalts. Но ряду других признаков был сделан вывод о том, что клон, возможно, содержит псевдогенную или дуплнцированную последовательность и его локализация в дальнейшем не учитывалась,

В качестве зоила при скрининге геномной библиотеки для гена ХЕ169 использовалась мышиная кДНК размером 2.3 тпи. Такой размер позволяет использовать клон кДНК в качестве самостоятельного зонда для FISH. Удовлетворительный си тал FISH был получен на Х-хромосоме Magrestis. Локализация кия Хе 169 установлена в районе Хр3.5 Х-хромосомы Af.agrestis.

АО

il

ш

)

{

9

I

its I

щм

Рисунок 3. Фл>оресцснгная in situ г и ("филиация фаговых клонов на X-зрочосочах ЛГ,roisiaemerUtonalis (R), M.trottscaspieus (T), M.kirgitorum (K) M.analit (Л), н if.asreitn (Mi). Слева: окрашенные DAPI Х-хромосомы с сигналами зондов двух фаговых клопов. Справа: инвертированный О-полоСниЛ DAPI бэидинг тех же хромосом. Верхний сип (ал — фаговый клон тепа RAD9, ни жни ft —NAP1L3.

Таблпиа I. Локалнмция фаговых клопов Л f.rot s iaemtridlonaJis н мышиного кЛ11К-к.10иа AW 6 9 на Х-хромосочах четырех видов полевок.

Клоки Нозхиня кдоноь на Х-хромосоим палево*

теное

At.rosx. Stlramcaip. Л/ kirfcuorij/i MarvoJa Magr&ns

LIF4 Xql.7 Xq}.4 Xql.l Xpl.J-p2.1 Xp3 4

RAB9 Xql.6-ql.9 • Xq1.4-ql.J Xq2.l — ql.tl Xp2.1 -p22 XpJ 4-piJ

БЫ,8 XqlJ XqiJ Xql.lt-qU2 Xp2,2 Xp).s

Хе1й9 - - - - Xp3.i

(кДНК)

C/(Sr2 Xql.4-qt.S XqJ6 Xql,10 X[0 6

UTXI Xql^-qU XqZ.7 Xql.9 Xpl.A Xp37

ZFX Xq2J-q2.4 Xq2.16-q3.1 Xq2.4-q2.S Xpl.3-pl.4 Xp3,l — p2.13

SAPL XqUS Xq2.1 XqJ.3 — qJ4 Xql.l-ql.2 Xp2,9-p2.IO

MID} ХЧ2Д5-42.16 Xq2J X<f42 Xq2.3 Xp2,5-p2 6

SYßU Xql.« Xq?.i Xq4_J Xq2,6 Xp2.9

SPRY3 Xql. 18 Xql. 1 Xq(5 Xq2 6 Xpl9

В целой, в результате проведенной in situ П1брилизацнн на хромосомах пяти видов полевок была установлена локализация на Х-хромосомах всех пяти видов 10 индивидуальных фаговых клопов и клопа кДНК гена Ле/69 на Х-хромосоме Magres tis (Табл. 1).

3. Контекстный анализ нуклеопшных последовательностей фаговых

клонов.

Для подтверждения наличия в фаговых клонах гомологичных генам последовательностей и локализации соответствующих генов в определенных районах Х-хромосом было проведено частичное секвенирование клонов. Последовательности анализировали с помощью программ на серверах http ^/www.ncbi.nlm.mh.gov/, http://geRome.ucsc.edu/, http://www.eroembl.org/. Фрагменты для 9 генов (кроме гена MIDI) содержали гомологичные соответствующим генам Х-хромосомы человека и мыши последовательности. Для 8 генов (кроме Eif4c) были выявлены фрагменты, содержащие белок-кодирующие поелсдователы гости. Все кодирующие последовательности имели непрерывные рамки считывания. Секвенированный субклон для гена Et/4c показывал гомологию 5'-нетранслируемой области транскрнпта. Высокая степень гомологии с соответствующим и генами была установлена для большинства кодирующих и некодируюших последовательностей (Табл. 2), Сиквенсы, не выявлявшие значимой гомологии с последовательностями мыши или человека, в основном содержали специфические для полевок SINE повторы.

Большинство секвениро ванных субклонов фага гена MIDI показало высокую степень гомологии с различными участками последовательности шггрона 1 гена HS6ST2 (гепарин сульфат б-О-сульфотрансфераза 2) человека и ортологичного гена мыши. Сравнительный анализ района локализации клона и высокая гомология последовательностей позволили нам обозначить его как истинный ннтронный фрагмент гена HS6ST2 (сокращенно inlHsi2).

Таким образом, результаты FISH и анализа нуклеотидных последовательностей 10 фаговых клонов дают основание обозначать районы их локализации на Х-хромосомах полевок как районы локализации соогветствующих им генов Eif-tc, Zfic, Rab9, Crsp2, Uixl, Sbl.8, NapIlS, Sybil, SpryS и интрона 1 гена Hs6st2 (inlHst2). Локализация клона «ДНК гена Хе169 мыши на Х-хромосоме M.agrestis непосредственно свидетельствует о локализации в районе Хр3.5 соответствующего гена. Аутосомные сигналы FISH фаговых клонов генов Crsp2 и Sybil указывают на наличие в этих аутосомах высоко гомологичных последовательностей. По результатам FISH на хромосомах мыши зонд гена Sybil также дает сигнал гибридизации как на Х-хромосоме, так и на аутосоме (Charchar et al., 2003).

Таблица 2. Данные сравнительного анализа нуклеогидных последовательностей субклонов фагов Xf.ross'taemeridionaHs, локализованных на

Х-хромосомах полевок (сохращенно).

JTWOitOrtOtC if; J,';, ' СЯПСВСШН Mro&SJ -CHXBCIKUV1' ^igOKH1-;'"' тюлевки'-;*^. 'j^-v v . . ' - • - i ^ . ■AWtOlWCv^ (чм^ипа)"? ГоморЛЯ»;.-WHTvSJ/i: '■»•Г -4**7^' <4eJWM!Jioi>7> , I^wortwoiiw^K.?:: • Я Я-ttf *■■};.,

1. SRRY3 STRY3 -e>tj pMrSj-RI NM 005840 / хм" 142351 85 6%/93% 94,9%/95.5%

2. tlflA EIFIA - ini-v «7 (3'-uti) pMrEXt NM 001412/ NMJHS437 69.6%/74% -

- dr. pMrH2-t7 -/ 73.7% —

J. МАРШ НЛРШ -рГ-*еХ 1 exl pMrNl3-v NM 004538/ N4_l 38742 7g А'.'ЛУА'Л 80.7%/81,8% (gi^ii/SI.Wil

4. RAB9 KW -e*3 PMrR42-3t NM 004251/ NM~019773 91%/91 5% 9SU / 97%

-in2 pMiR4-23(7 -

5. SB1-S SB 1-3 • in 19-»ех24 -ex pMrSb10-t7 NM 006106/ NM_019710 95%/97% 9i.96%'94-9?U

- in 7 pMrSM-t7 -/71.2% -

6. SYBLI SYBU -inl->io2 -exl pMiSy21 NM 005638/ XM_13J737 46V./ 100*4 100%/100%

-i'-utr pMrdSy20 57%/63% —

- in 1 pMr$yi6-t7 -/77% -

7.ZFX ZFX -ex 3 NM 003410/ NMJH1768 9215/93% 92%/95*4

8.UTXI UTXt pMrb'tx 1 v NM 021140/ XM 135790 91% / 95.6°; 99%/99%

>in26 pMrUi2-40 73.9%,77.8% -

9. CRSP2 CKSfJ • in5—in7 pMrCrt-c NM 004229 NM 012003 89%/9 m 97W97.8%

-inl рМгСгб.-«? -/ 74,414 -

10. MIDI Hstui -feat 10 pan. етеьенсоа -/ 64ii-80% -

сх — эюон; ¡а—и ктрон; рг—промотор; dr - область за геном (downstream region); Дтя и тронных последовательностей и последовательностей за пределами генов (dr) указывается только гомология с мышиной последовательностью. Для гена NaplU в скобках указана гомология кодирующих областей с поправкой на делению.

4. Анализ порядка расположения генов » возможных путей эволюции Х-хромосомы полевок рода \ficrotus.

Картирование 10 новых генов позволило равномерно маркировать Х-хромосомы полевок группы 'arvalis' (Рнс. 5). Районы Х*хромосом, содержащие 5 генов Utxll, Crsp2, Sbl.8, Rab9 п Eiße, у всех видов полевок группы 'arvalis' и полевки M.agrestis сохраняют идентичный порядок генов на фоне очень схожего GTG-foiцинга, расположение же остальных 10 маркеров в различной степени отличается у всех видов. Это позволяет сделать предположение о локализации гена Хс169 в Х-хрочосочах полевок группы 'arvalis'. Локализация гена Хе169 установлена в районе Хр3.5 Х-хромосомы M.agreslis, где также картировал ген SbJ.8. Поскольку эти два гена у человека и у мыши находятся в небольшом кластере размером около 370kb, it у всех пяти видов налево к pail он локализации Sbl.8 выглядит неперестроенным, вероятность совместной локализации генов Хе169 и 56/. S и в Х-хромосомах полевок группы 'orvafa' достаточно высока. Равномерное расположение выбранных leiios позволяю, во-первых, дополнить и уточнить картину перестроек Х-хромосом полевок труппы 'arvalisВо-вторых, были определены предполагаемые перестройки, разделяющие Х-хромосомы M.agrcstis, как представителя аутгруппы, и остальных четырех видов. А это, в свою очередь, позволило уточнить характер иредковоП формы Х-хромосомы труппы 'arvalis'.

Анализ порядка расположения генов на Х-хромосомах полевок подтверждает выпады, основанные на большом количестве современных данных о том, что транспозиция центромер может проходить независимо ог других внутрнхромосомных перестроек (Zhdanova et al., 2000; Ventura et al., 2001; Bond et al., 2001). У всех четырех видов полевок группы 'arvalis* при различном иоложешш центромер сохранены идентичные кластеры генов (Utxl-Eißc и Sybil Spry3), фланюфуюнше эухроматиповые районы X-хромосомы.

4.1, Реорганизации Х-хромосом пяти видов полевок рола Microtus.

При анализе возможных путей реорганизации Х-хромосомы полевок был сделан выбор в пользу инверсионных перестроек, так как при делениях и последующих инсерциях хромосомных фрагментов необходимо большее число актов разрывов-воссоединений. Наряду с локализацией генных маркеров во внимание принималось изменение GTG-рисунка Х-хромосом.

Рисунок 4. Цктогенегкческме карты -jyiроч атоновых районов Х-зрочосоч пяти исследован пыж видов полевок: Л/,rottinemeridlonalls (R), ,\f,transcaspkus (Т), if.kirgisorum (К), M.arvaiis (А), н M.agrestif (AG) по совокупности результатов картирования генов и райопоспсцифичсскнх ДНК-проб. Слева обозначенными районами локализации генов и справа - предполагаемыми инверсиями, разделяющими Х-хромосомы MarvaHs и остальных видов; * -центромера, înv-инверсии.

Ранее, на основе анализа целого ряда цитогенетических данных был сделан вывод о том, что наиболее близкой к нредковой форме в группе обыкновенных полевок является Х-хрпчосома Л/,transcaspicus (Nesterova et а)„ 1998; Mazurok et al., 2001). Сравнение порядка генов Х-хромосомы M.transcasptcus и Х-хромосомы представителя аутгрушш Magrestis показало, >гто на уровне картирования 15 маркеров существующие между ними различия можно вывести с помощью, как минимум, четырех инверсий. Существенным для анализа реорганизации хромосом является взаиморасположение генов Napll3 и Gla, На "нут" между Х-хромосомами M.transcaspicm и Sf.agrestts двумя промежуточными формами являются формы, схожие по порядку генов с Х-хромосочамн Mkirglsomm и M.arvalis. Следовательно, Х-хромосомы последних двух видов по порядку генов ближе к предковой форме Х-хромосомы группы 'arvaîis', чем Х-хромосома \f.tratucaspicus.

Район локализации генов Napili и Gla вовлекался в независимые ин перечн, по-видимому, у всех исследованных видов. Возможно, существование "горячих точек" перестроек, в частности, локализованных в

кластерах повторенных последом тел ы I остей ответственно за этот факт (КиЪвоу е( а!,, 2002).

Анализ преобразований Х-хромосом полевок был лополнен данными о локализации на Х-хромосомах пята видов полевок четырех перекрывающихся районоспецнфичных ДНК-проб Х-хромосомы №гои1аетсп(31опа1к (КиЬиоу е( а1„ 2002). Различия в локализации сигналов районоспецифических ДНК-проб на Х-хрочосомах полевок полностью соответствовали различиям хромосом, установленным на основе локализации 15 генных маркеров. На основе локализации районспсшфичсских ДНК-проб и изменении СТО-Сэнди и га было сделано предположение о небольшой инверсии в районе гена г/х в Х-хрочосоме Ма/гаШ, Однако и в этом случае от гипотетической предковой формы Х-хромосомы группы 'аггаНз' хромосомы \f.arvalis и \i.kirguorum может отделять по одной независимой инверсии.

В целом, шесть различных инверсий, отличающих между собой X-хромосомы видов полевок группы 'ап-аИз', бшн выявлены в результате анализа локализации 15 генных маркеров н четырех рай он с не пифических ДНК-ироб. 7 кластеров консервативной еннтешш могут быть выделены в X-хромосочс в пределах группы обыкновенных полевок: кластеры генов £/«/-Ег/4с, г/х, Хиг-Р$к, КарПЗ, С1а, тШл2-С6РО, ХуЬИ-ЪргуЗ. С учетом относительно небольшого эволюционного возраста труппы (0.5-0.6 млн лет) это представляет довольно высокую скорость реорганизации и закрепления перестроек на Х-хромосоме у ее видов. Анализ реорганизации Х-хромосом полевок группы 'агуаШ' с использованием в качестве ауттр}нпы хромосомы \f.agrestis позволяет прийти к заключению, что Х-хромосомы МИг^когшп и Мап'аШ могут быть в равной степени близки к предковой форме X-хромосочы группы 'ап-аШОт Х-хромосомы \tagrestis хромосомы М.агкйЬ и \tkirgisonan отделяют две нли три независимые инверсии, минимум четыре инверсии отделяют от хромосомы Мар-езШ Х-хромоеочы М.штссар1сш и \lrosiiaemtridlonaHs. Две из этих инверсий у .\ltranscasptcus и Мгои1аетегиИопа1й1 я&тяюгея общими (Рис. 4). Следовательно, анализ реорганизации Х-хромосомы в группе 'агх-аШ' подтверждает выводы, сделанные на основе других цитогенетическнх данных, об объединении М.1гагисаьр1сиз и \f.roMtaemetUIiomiUs в общую эволюционную линию.

Нанш данные демонстрируют, что Х-хромосомы А/. агуаШ и МгожизетепЛопаШ не являются наиболее близкими по порядку генов хромосомами. Этот факт заставляет более внимательно отнестись к несовпадению для группы 'апгаНз' филогенетических построений при

разных подходах (Mazurok et al., 2001; Shevchenko et al., 2002; Малыши, Лунш Иантелейчук, 2003). На наш взгляд одной из самых интересных н перспективных гипотез является предположение об осуществлении в прошлом гибридизации между симпатрнчсскимн видами Mar\ ails и Mrossiaemeridionalis.

4.2. Сравнительный анализ Х-\ромосом полевок и другик видов млекопитающих.

9 генных маркеров большого плеча Х-хрочосочы человека имею г сходное расположение на Х-хромосомах человека, M.kirghonm и M.an-aUs. На данном этапе мы можем заключить, что в гипотетической предков ой форме Х-хромосомы группы larvalis' порядок генов большого плеча X-хромосомы человека в значительной степени был сохранен. В дальнейшем сравнительном анализе в качестве предковой формы по расположению ichob в группе 'arvalis ' мы рассматриваем Х-хромосому M.kirgisorum. Взаиморасположение 6 генов малого плеча Х-хромосомы человека претерпело изменения в гипотетическом прелковом варианте Х-хромосомы полевок.

Реконструкция предковой Х-хромосомы семейства Afurtdae,

Картирование с помощью FJSH 26 мышиных кДНК-клонов на X-хромосомах пяти видов мышевидных грызунов было предпринято ранее с целью определения предкового для грызунов типа Х-хромосомы (Kuroiwa et al., 2001). На основе этих данных был сделан вывод о том, что порядок генов крысиной Х-хромосомы может быть нредковым для Х-хромосом мышевидных грызунов.

Однако проведенный нами детальный анализ локализации границ предполагаемых инверсий у крысы (Rattus nonvglcus) tt мыши (Mus musculus), а также анализ ПАР мышевидных >рызунов не подтверждают этот вывод. Вероятно, для сем. Muridae предковой формой Х-хромосомы был вариант Солее схожий с Х-хромосомой человека и содержащий, но крайней мере, часть прого-ИАР плацентарных млекопитающих.

При реконструкции порядка генов, локализованных на Х-хромосомах полевок, от Х-хромосомы человека с помощью инверсий, которые были предложены для крысиной хромосомы, мы получили порядок, установленный на предковой Х-хромосоме полевок. Однако, на наш взгляд, сходство расположения генов в Х-хромосомах крысы, полевок и некоторых других грызунов (Kuroiwa et al., 2001) является либо случайным совпадением из-за

недостаточной плотности локализованных маркеров, либо примером конвергентных событий, произошедших в результате значительных преобразований Х-хромосом у мышевидных грызунов, и отражающих наличие "горячих точек" перестроек. На рисунке 5 с учетом всех проанализированных данных приведен возможный путь реорганизации X-хромосом некоторых мышевидных грызунов.

ЛГм »»»геи/д Ддеги*

Рисунок 5. Гипотетический путь реорганизации Х-хромосомы крысы и предковой Х-хромосомы полевок группы 'агуаШ' в} обшей предковой хромосомы. Огибающими стрелками обозначены предполагаемые инверсии, изменившие порядок генов на хромосомах мьяви, крысы, полевок к человека.

4.3. Анализ расположения избегающих ннактивашш генов на X-

хромоеомах полевок. Семь картированных в данной работе генов (Е!/4с, 2}х, СЛх/, БЫ.8, Спр2, Хе169) представляют гены короткого плеча Х-хромосомы человека, обогащенного избегающими Х-инакшвации генами. Проведенный сравнительный анализ реорганизации Х-хромосомы у мышевидных грызунов позволяет прийти к выводу, что по отношению к положению избегающих X-

инактивации теноп человека в предковой Х-хромосоме приматов к грызунов, изменения в расположении их ортологов у полевок и мыши происходили независимо.

Анализ реорганизации Х-хромосомы мыши показывает, 'по в ней есть как избегающие инактивации гены, которые расположены в районах, многократно вовлекавшихся в переелроПки (например, С/ос/), так и гены, незначительно изменившие свое положение по сравнению с X человека, но изменившие статус экспресии на ннактивируемый (например, БЬ 1.8).

На Х-хромосомах пяти исследованных видов полевок представлен довольно широкий спектр вариантов взаиморасположения ортологов шбегающих Х-инактивации генов человека с одной стороны и центра инактивации X!с, центромер и блоков С-1етерохроманша с другой. Общим и отличным свойством Х-Хромосом пяти близкородственных видов полевок и мыши является то, что центр инактивации Лхс, содержащий ген Хки не отделен центромерой от района, обогащенного генами, избегающими Х-инактивации у человека.

Анализ реорганизации Х-хромосоч няш исследованных видов полевок, а также ряда других видов мышевидных грызунов, выявил довольно распространенные у них перестройки в районе гена ХШ. Мы налагаем, что такие преобразования либо не критичны для системы Х-инактивации, либо нарушения каким-то образом компенсируются у разных видов. Реорганизация Х-хромосом грызунов также может огражать более гомогенный профиль инактивации их Х-хромосом (по типу мыши). С другой стороны, перестройки в районе гена ХЫ и в целом но Х-хромосоме м01уг вызывать у особей возникновение специфических отличий, которые, в свою очередь, могут способствовать обособлению нового вила.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Картирование 10 новых генов на Х-хромосомах пяти близкородственных видов полевок позволило соотнести порядок генов эухроматиновых районов Х-хромосом полевок с порядком на базовой Х-хромосоме человека и перестроенных хромосомах представителей семейства Мил<!ае и предложить схему возможных перестроек, разделивших Х-хромосомы человека, обыкновенных полевок н некоторых мышевидных грызунов. Х-хромосомы иолевок, в целом, перестроены в меньшей степени, чем Х-хромосома мыши, но по крайней мере три вида — М. гоагаетег1<ИопаШ, М, {гатссч,ркш и

Xf.agreslis имеют значительно перестроенные Х-хромосомы и характеризуются наличием инверсий, уникальных для каждого вида.

Проведенный сравнительный анализ реорганизации Х-хромосомы у мышевидных грызунов позволяет ирийти к выводу о том, что изменения в расположении ортологов избегающих Х-инахтивапии генов человека у полевок и мыши происходили независимо относительно их расположения на предковой хромосоме приматов и грызунов. Общим и отличным свойством X-хрочосом пяти близкородственных видов полевок и мыши является то, что центр инактивации Xic, содержащий ген Xist, не отделен центромерой от района, обогащенного генами, избегающими Х-ниактивации у человека.

Выделенные в ходе скрининга геномной библиотеки М.rossiaemeridionalis фаговые клоны, содержащие фрагменты картированных генов, позволят в дальнейшем определить последовательность и структуру иirrepecyioiitcго гена и его регуляторных областей. Эти данные, дополненные известной для четырех видов обыкновенных полевок структурой гена Xtst (Nesterova et al„ 2001). помогут установшь дополнительные факторы, объясняющие механизм передачи сигнала инактивации от основного гена центра инактивации к инактивируемым генам.

ВЫВОДЫ

1. Выделены и секвенированы последовательности различных структурных элементов (экзоны, нитроны, нетранслируемые участки) 9 генов полевки А1. rossiaemendionalbi Ei/4c, Zfx, Rab9, Crsp2, Utxl, Sbl.8, Nap 113, Sybil, Spryi и inlfhl6$t2. Степень гомологии сиквснсов кодирующих районов полевки с соответствующими районами генов человека и мыши в среднем составляет 96% по нуклеогияным и 95.3% по аминокислотным последовательностям, некодирую тих районов - в среднем гомологии с последовательностями мыши.

2. Впервые установлена локализация 9 генов; Etf4c, Zfx, Rab9, Crsp2, Utxl, Sbl.8, Nap 113, Sybil, SpryS и молекулярного маркера SnlHst2 в X-хромосомах пяти видов полевок рода Mterotus. Локализация гена Хе169 определена в районе Хр3.5 Х-хромосомы M.agrestis.

3. На основе сравнительною анализа локализации 14 генов и одного молекулярного маркера в Х-хромосомах четырех видов полевок группы 'arvalis' выявлены четыре новые инверсии и уточнены 1раннцы двух определенных ранее инверсий. Выявлено 7 кластеров консервативной синтении в Х-хромосомах обыкновенных полевок.

4. Сравнительным анализом порядка генов Х-хромосом ы M.agrestis показано, что хромосомы M.arvaUs и M.kirgisorum являются наиболее близкими к предковой Х-хромосоме ipynnw 'arvalis ': от Х-хромосомы M.agrestis хромосомы M.arvaUs л M.kirgisorum отделяют две или три инверсии и хромосомы M.transcaspicus и M.rossiaemeridionalis - четыре инверсии.

5. На основе сравтггельного анализа структуры Х-хромосом мышевидных грызунов и человека выведена предковая Х-хромосома семейства Muridae и предложена схема возможных перестроек, разделивших порядок генов Х-хромосом человека, полевок и крысы,

6. Установлено, что изменение расположения ортологов избегающих X-инактивации генов человека у полевок и мыши происходили независимо относительно их расположения на предковой Х-хромосоме приматов и грызунов. Общим и отличным свойством Х-хромосом пяти близкородственных видов полевак и мы щи является то, что центр инактивации Xic не отделен центромерой от районов, обогашеиных ортологами избегающих Х-инактнвации генов человека.

Список работ, on уели кованных по те me диссертации

]. Анопрпенко О.В., Шевченко А.И. Картирование генов, избегающих инактивации, у обыкновенных полевок рола Microtia Н 6-я Путинская школа-конферепцля молодых ученых "Биология - наука XXI века". Пушяно (Россия), 20-24 мая 2002. С. 212.

2. Rubtsov N.B., Rubtsova N.V., Anopriyeako O.V., Kararaysheve T.V., Shevcbenko A.I., Mazurok N.A., Nesterova T.B, and Zakian S_M. Reorganization of the X chromosome in voles of the genus Microlut // Cytogenet Genome Res. 2002. V. 99. P. 323-329.

3. Апоприеяко O.B., Шевченко А.И., Рубцова H.B., Мазурок H.A., Закиян СМ. Изучение эволюционной судьбы генов псешюаутосомных районов у полевок рода Microtus // Международный симпозиум по проблемам мейоза. Санкт-Петербург (Россия), 17 октября 2003. Цитология, T. J5. №. 9. С, 954.

4. Анопрпенко O.I)., Закиян СМ. Эволюция половых хромосом млекопитающих: взаимодействие генетических и эпигенетических факторов // Генетика 2004. в печати.

Подписало к печах* 30.01.2004.

Формат бумаги 60 х 90 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 19.

Роталриит Института цитологии в генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. аг. Лаврентьева, 10.