Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительный анализ экспрессии генов в атеросклеротических поражениях аорты человека и в лейкоцитах периферической крови больных эссенциальной гипертензией

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ экспрессии генов в атеросклеротических поражениях аорты человека и в лейкоцитах периферической крови больных эссенциальной гипертензией"

На правах рукописи

Тимофеева Анжелика Владимировна

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В

АТЕРОСКЛЕРОТИЧЕСКИХ ПОРАЖЕНИЯХ АОРТЫ ЧЕЛОВЕКА И В ЛЕЙКОЦИТАХ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ БОЛЬНЫХ ЭССЕНЦИАЛЬНОЙ ГИПЕРТЕНЗИЕЙ

03.00.04-Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2009

00346218Э

003462189

Работа выполнена в лаборатории генной инженерии НИИ Экспериментальной кардиологии ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий».

Научный руководитель:

Кандидат физико-математических наук, Бибилашвили Роберт Шалвович

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук, профессор, Сломинский Петр Андреевич

Доктор биологических наук, профессор, Ширинский Владимир Павлович

Ведущая организация ГОУ ВПО Российский Государственный

Медицинский Университет им. Н.И. Пирогова МЗ и CP РФ

Защита состоится /У 2009 года в 30 часов на заседании

Диссертационного Совета по присуждению ученой степени кандидата биологических наук (Д 208.073.01) в ФГУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий» по адресу: 121552, Москва, ул.3-я Черепковская. 15А

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского Кардиологического научно-производственного комплекса Росмедтехнологий.

Автореферат разослан « » ji-e-^/CM*-^-_200Й\

Ученый секретарь диссертационного Совета,

д.м.н., профессор В.Е.Синицын

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной летальности населения промышленно развитых стран [Шевченко Ю, 1999; Гусев ЕИ, 2006; Williams В, 2006], поэтому профилактика и лечение болезней системы кровообращения являются важнейшими задачами современной медицины. Подбор лекарственной терапии с целью предупреждения развития ССЗ и их осложнений в настоящее время основан на оценке эффективности устранения факторов риска ССЗ [Органов РГ, 1999]. Для понимания основ взаимосвязи факторов риска и ССЗ необходимо иметь полное представление об их патогенетических механизмах.

В основе развития таких ССЗ, как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, мозговой инсульт и заболевание периферических сосудов, лежит атеросклероз (AT). Массовый xapaicrep распространения AT у населения большинства стран, начало развития заболевания задолго до его клинических проявлений, несомненная зависимость развития AT от многих факторов риска ССЗ - все это определяет целесообразность проведения исследований на молекулярном уровне как самого заболевания, так и факторов, к нему предрасполагающих.

По современным представлениям AT является результатом хронического воспалительного процесса в артериальной стенке, обусловленного иммунными реакциями с участием мигрирующих из кровотока моноцитов, дифференцирующихся в макрофаги и дендритные клетки, и лимфоцитов [Ross R, 1999; Hansson GK, 2005]. В настоящее время полагают, что одним из основных факторов риска возникновения AT является артериальная гипертецзия (AT) [Alexander RW, 1995; Жданов ВС, 2002; Sasamura H, 2005]. Известно, что такие вазоактивные молекулы, как катехоламины, ангиотензин II и эндотелин-1, выбрасываемые в кровь в повышенных количествах при АГ, как и само по себе повышение артериального давления вызывают структурные изменения сосудистой стенки через активацию сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию роста и пролиферации гладкомышечных клеток (ГМК), в процессы воспаления и апоптоза [Olsen МН и др., 2002; Plante GE, 2002; Dao НН и др., 2001; Van Zwieten PA, 2000; Shaw А и Xu Q, 2003; Lu H et al, 2007]. Было показано, что те же самые факторы (химические и механические) воздействуют не только на стенку сосуда, но и на клетки циркулирующей крови [Stevenson JR и др., 2001; Hahn AW и др., 1994; Ohki R и др., 2002; Smedly LA и др., 1986], что приводит к активации лейкоцитов, продукции ими активных форм кислорода и инициации песпецифического воспаления в сосудистой стенке. Таким образом, анализ экспрессии генов лейкоцитов периферической крови (ЛПК) больных АГ может указать на особенности лейкоцитарного микроокружения и быть использован как для оценки тяжести течения заболевания, так и в качестве способа мониторирования эффективности лекарственной терапии, направленной на предупреждение развития осложнений при АГ.

Использование олиго- или кДНК-микрочипов дает возможность оценить количественные изменения в уровне нескольких сотен и даже тысяч индивидуальных мРНК одновременно. Это позволяет, с одной стороны, провести поиск новых генов-участников патологического процесса в дополнение к уже выявленным и достаточно изученным генам, а с другой - дать предположительную оценку их функциональной

взаимосвязи по общности изменения профиля экспрессии этих генов при данной патологии.

В течение последних десятилетий олиго- и кДНК-микрочипы активно используются с целью изучения патогенетических механизмов возникновения и развития как АГ, так и AT. Так, например, при изучении транскриптома лейкоцитов крови больных эссенциальной гипертензией (гипертонической болезнью - ГБ) было отмечено изменение активности 680 генов, в том числе 10-ти цитокиновых генов, 4 генов рецепторов серотонина, гена рецептора ангиотензина II и гена эндотелинпревращающего фермента [Chon Н и др., 2004], хотя достоверность полученных данных сложно было оценить ввиду использования авторами работы пулированных образцов. При исследовании AT на животных моделях и клеточных культурах была выявлена роль атерогенных стимулов (окЛПНП, гомоцистеина, цитокинов воспаления, механического стресса) в регуляции липидного метаболизма, межклеточных взаимодействий, воспаления и ремоделирования внеклеточного матрикса [Shiffman D, 2000; Li Н, 2002; Mikita Т, 2001; Ohura N, 2003]. Результаты анализа различных типов атеросклеротических поражений (АТП) коронарных артерий человека показали, что важным процессом в формировании атеросклеротической бляшки является изменение экспрессии генов, отвечающих за дифференцировку ГМК [King JY, 2005]. Исследование транскриптома образцов грудного отдела аорты человека выявило списки дифференциально экспрессирующихся генов, характеризующих определенный гистологический тип АТП [Seo D, 2004]. Результатом сравнительного анализа стабильных и склонных к разрушению атеросклеротических бляшек было выявление нарушений регуляции синтеза внеклеточного матрикса и метаболизма липидов [Faber ВС, 2001], а также повышенного уровня экспрессии медиаторов апоптоза в ГМК [Martinet et al., 2002].

Несмотря на активное изучение патогенетических механизмов возникновения AT и АГ, до сих пор остаются невыясненными молекулярные механизмы взаимосвязи данных заболеваний, доказанной наличием сходных структурных изменений в сосудистой стенке в виде дисфункции эндотелия, лейкоцитарной инфильтрации, миграции и пролиферации ГМК, а также повышенного образования соединительнотканного матрикса. В связи с этим,

целью настоящей работы было проведение сравнительного анализа экспрессии генов не только в разных типах АТП брюшного отдела аорты человека, включая ранние, выраженные и осложненные типы поражений, относительно макро- и микроскопически нормальных участков аорты, но и сопоставление полученных данных с результатами анализа профилей экспрессии генов в ЛПК больных ГБ и здоровых доноров.

Для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи: 1. Проанализировать влияние качества суммарной РНК и условий проведения реакции ОТ на результаты количественного анализа экспрессии генов на основе кДНК-микрочиповой технологии и метода ОТ-ПЦР. Используя метод гибридизации радиоактивно меченой кДНК, синтезированной в ходе ОТ на образцах суммарной РНК, с кДНК-микрочипами фирмы Clontech, получить и проанализировать профили генной экспрессии:

а) ЛПК от пациентов, страдающих ГБ, и здоровых доноров;

б) образцов интимы брюшного отдела аорты человека, полученных из разных гистологических типов АТП.

2. Проверить данные кДНК-микрочипов методами ОТ-ПЦР и иммуиогистохимии.

3. Провести кластерный и корреляционный анализы полученных данных с целыо выявления степени взаимосвязи между характером экспрессии генов и клиническими (или морфологическими) признаками исследуемых заболеваний - AT аорты и ГБ.

4. Сделать сравнительный анализ списков генов с дифференциальной экспрессией в ЛПК больных ГБ и в ЛТП аорты человека с целью идентификации общих генов-участников двух заболеваний.

5. Провести функциональную оценку выявленных групп генов с точки зрения возможного их участия в процессах ремоделирования сосудистой стенки.

Научная новнзна

Для анализа экспрессии генов в АТИ аорты человека и в ЛПК больных ГБ применен метод кДНК-микрочипов. На основании полученных результатов определены гены, высоко коррелирующие как со стадией ГБ, так и со степенью тяжести ЛТП. Выявленные гены с измененной экспрессией кодируют белки, участвующие в апоптозе клеток, воспалительных и иммунных реакциях, контроле пролиферации и дифференцировки клеток, их направленной миграции и адгезии, внутриклеточном транспорте, клеточном стрессе, катаболизме гликозаминогликанов, поддержании окислительно-восстановительного равновесия в клетке, регуляции транскрипции и трансляции, фенотипических изменениях FMK и эндотелиальных клеток, пространственной организации компонентов внеклеточного матрикса, что согласуется с современными представлениями о патогенетических механизмах возникновения и развития AT. Обнаружена дифференциальная экспрессия не только генов, чья роль в атерогеиезе уже была продемонстрирована другими исследователями, но и получен список новых генов-участников атерогенеза.

Впервые обнаружено увеличение экспрессии гена тетраспанина CD53 в ЛПК больных ГБ и в ЛТП аорты человека с ярко выраженной активностью гена CD53 в антиген-презентирующих клетках, в том числе пенистых клетках, являющихся главными участниками атерогенеза.

На основании выявленных изменений в уровне экспрессии генов при АГ и ЛТ сформулирована гипотеза о молекулярных механизмах предрасположенности больных ГБ к развитию АТП сосудистой стенки. Ключевая роль в этих процессах отводится тетраспанииу CD53 - активатору лейкоцитарной адгезии и пролиферации, участнику иммунных реакций и негативному регулятору апоптотических процессов в гематопоэтических клетках. Впервые выявленное нами повышение экспрессии гена тетраспанина CD53 в ЛПК больных ГБ, по-видимому, индуцированное хроническим окислительным стрессом, характерным для АГ, обуславливает устойчивость лейкоцитов к активированным в них апоптотическим процессам, наличие которых доказано нами дифференциальной экспрессией генов CASP2, CASP4, CASP8, РАС-1, PYST-1, р53, HSPA8, HSP40, RPS3a, UBID4 и NATI. Тем самым формируется проатерогенный фенотип лейкоцитов на фоне измененной экспрессии генов, вовлеченных в процессы хемотаксиса (CX3CR1, FPRL2), адгезии (LCP1), воспалительные (CAGC, OSM, HSPA8) и иммунные реакции (SPP1, FPRL2, SPI1, CTSA, LCP1), образование реактивных форм кислорода (АСР5, SPI1), в целом обуславливающие дисфункцию эндотелия, направленную миграцию активированных

лейкоцитов в сосудистую стенку и развитие сосудистого ремоделирования. По современным представлениям задержка апоптоза лейкоцитов на ранних стадиях развития атеросклероза приводит к дальнейшему его прогрессированию. В связи с этим инфильтрация сосудистой стенки активированными лейкоцитами с нарушенной под действием CD53 реализацией апоптотической программы рассматривается нами как один из основных механизмов предрасположенности больных ГБ к развитию AT в сосудах. Мы полагаем, что подавление повышенной экспрессии гена CD53 у больных прямо (путем действия специфических ингибиторов) и/или опосредованно (с использованием антиоксидантной терапии для предотвращения окислительного стресса или, как будет показано ниже, подавлением медленных кальциевых каналов) обеспечит снижение риска развития AT при АГ.

Практическая значимость

Полученные данные могут дать качественно новую информацию о механизмах развития атеросклеротического процесса, что позволит в дальнейшем идти по пути совершенствования имеющихся и разработки новых методов лечения AT. В частности, поиск специфических ингибиторов экспрессии гена CD53 в моноцитах может привести к созданию нового класса лекарств для предотвращения развития атеросклероза. Повышенная по сравнению с нормой экспрессия генов CD53, LCP1, RPS3A, LIPA, HSPA8, NATI, GDI2 и других коррелирующих с ними генов в лейкоцитах крови может стать диагностическим признаком для назначения терапии с целью подавления медленных кальциевых каналов.

Внедрение результатов исследования в практику

Полученные результаты внедрены в научную практику НИИ Экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехнологий.

Апробация диссертации состоялась 10 ноября 2008 года на межлабораторном семинаре НИИ Экспериментальной кардиологии ФГУ РКНПК Росмедтехнологий.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ. Материалы диссертации доложены на:

1. Международной школе-конференции «FEBS advanced course on RNA biochemistry and biotechnology», Poznan, Poland, October 10-17, 1998

2. Европейской конференции "Cell signaling world 2006. Signal transduction pathways as therapeutic targets, Luxembourg, January 25-28, 2006.

3. Московской международной конференции «Биотехнология и медицина», Москва, 14-17 марта 2006

4. Московской конференции «Перспективы кардиологии в свете достижений медицинской науки», 17-18 мая 2007г, Москва, ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий.

5. Всемирном конгрессе кардиологов 2008, Буэнос-Айрес, Аргентина, 2008г.

Объем il структура диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка цитируемой литературы, который включаетисточников. Работа изложена на«£И7страимцах машинописного текста, содержит 10 таблиц и 16 рисунков.

Материалы и методы

Образцы ткани брюшного отдела аорты. В работе был использован срочный (не позднее 6 часов с момента констатации биологической смерти) аутопсийный материал 53 фрагментов брюшных аорт 23 мужчин и 6 женщин в возрасте 24-94 лет. Одна часть фрагмента аорты была использована для гистологического анализа, другая часть, предназначенная для анализа на кДНК-микрочнпах и количественной ОТ-ПЦР, была отделена от медин и адвентиции. Полученные образцы интимы аорт замораживали в жидком азоте и хранили при t=-&0°C. Для морфологического изучения аутопенйного материала из кусочков ткани аорт были приготовлены криостатные срезы толщиной 7 мкм, нанесенные на стекла с поли-Ь-лизином и фиксированные в 4% формальдегиде на изотоническом фосфатном буфере. После окрашивания срезов жировым красным О и гематоксилин-эозином была проведена идентификация образцов нормальных участков и АТП аорты с использованием классификации, предложенной Stary, 1995. Опытную группу составили 8 липидных полос (ЛП) - II и III типы поражений; 11 фиброатером (ФА) - Va тип поражения; 5 фиброзных бляшек (ФБ) - Ve тип поражения; 4 осложненные фиброатеромы (оФА) -Via и VIb типы поражений; 17 макроскопически нормальных сегментов из аорты, пораженной AT, - образцы условной нормы (уН), среди которых были 4 образца без признаков AT, 3 образца диффузных интимальных утолщения (ДИУ) и 10 образцов I типа поражения. Контрольную группу составили 10 образцов макроскопически нормальных сегментов из аорты, не пораженной AT (абсолютная норма - аН).

Образцы лейкоцитов крови. В исследование были включены 10 доноров в возрасте 24-50 лет без вредных привычек и сердечно-сосудистой патологии и 20 больных ГБ (см. табл. 1). Забор венозной крови в количестве 6 мл осуществляли утром натощак в пробирки Vacuette, содержащие 3,8 % цитрат натрия. Выделите суммарной фракции лейкоцитов проводили в несколько этапов: отделение форменных элементов от плазмы центрифугированием, лизис эритроцитарной массы в буфере, содержащем 155 мМ хлорида аммония, 10 мМ КНСОЗ н 1 мМ ЭДТА, осаждение лейкоцитарной массы и ее ресуснендирование в фосфатном буфере с 0,1 мМ ЭДТА. Супернатант удаляли, а осадок, предназначенный для выделения суммарной РНК, замораживали в жидком азоте и хранили при t= -70°С.

Выделение РНК. Суммарную РНК из образцов ткани брюшной аорты и ЛПК выделяли стандартным фенол-хлороформ-гуанидинизотиоционатным методом и обрабатывали ДНКазой 1 («Roche Molecular Systems») в присутствии экзонуклеазы 1 («United States Biochemicals»). Качество РНК оценивали по соотношению интенсивности полос 28 S и 18S рибосомных РНК после электрофореза в агарозном геле в денатурирующих условиях. Примесь геномной ДНК составляла не более 0.1%.

Приготовление меченой кДНК и гибридизация с кДНК-микрочипами. Проводили реакцию ОТ 2 мкг суммарной РНК, выделенной из образцов интимы

7

Номер обр. Стадия ГБ Возраст Пол САД, мм рт.ст ДАД, мм рт.ст. ОХС, ммолъ/л глюкоза ммоль/л Креати- нин, мкмоль/л Лейкоциты x 109/л ПОМ и АКС Терапия на момент взятия крови

Н1 II 61 ж 160 100 5.0 5.9 79 5.1 ПА, ГЛЖ Валсартан

Н2 III 69 м 130 90 4.2 4.3 107 5.3 ОНМК Амлодипин

НЗ 11 59 м 180 100 6.2 6.3t 108 6.0 ГЛЖ, НТГ Валсартан

Н4 III 68 ж 160 100 6.6t 6.3t 89 6.1 ТИА,ПА, НТГ Валсартан

Н5 III 66 м 124 80 5.0 4.1 94 4.1 ИБС,ДЭ,ПА, ГЛЖ Амлодипин

Н6 III 68 м 140 80 6.1 4.5 103 4.6 ТИА, ГЛЖ Амлодипин

Н7 III 64 м 150 90 4.4 4.5 124t 7.0 ИБС,ДЭ, ПА Амлодипин

Н8 III 66 м 140 80 7.6t 5.3 118t 5.4 ИБС,ПИКС,ДЭ, ТИА,ПА,ГЛЖ Амлодипин

Н9 III 70 ж 140 80 5.5 6.7t 104 6.1 ИБС, ПА, СД Валсартан

Н10 III 69 м 140 90 5.1 5.5 101 5.4 ИБС, ДЭ.ПА Валсартан

Н11 III 62 ж 130 70 6.8t 6.1 79 6.1 ИБС,ДЭ ТИА, ГЛЖ, НТГ Амлодипин

Н12 III 67 м 170 100 8.8t 5.6 103 6.2 ИБС,ПА Валсартан

Н13 II 65 м 140 80 7.4t 4.7 107 4.9 ГАС (II) Валсартан

HI4 I 63 м 180 100 4.1 5.8 80 4.9 нет -

HI5 II 53 м 150 100 6.1 5.9 82 4.1 ПА, ГЛЖ -

Н16 II 60 м 180 100 7.9t 5.7 124t 5.1 ПА -

Н17 I 47 ж 160 100 6.1 5.9 95 5.5 нет -

Н18 III 57 ж 170 110 6.8t 6.5t 92 5 ИБС, НТГ -

Н19 II 39 ж 170 100 5.9 5.4 74 5 ГАС (II) -

Н20 II 61 м 170 90 7.8t 6.5t 104 4.9 ПА, НТГ -

Примечание. Ж - женщины, М — мужчины; САД и ДАД — систолическое и диастолическое артериальное давление на момент взятия крови;

ПОМ - поражения органов-мишеней, АКС - ассоциированные клинические состояния (в соответствии с рекомендациями ВНОК по Л Г);

ГЛЖ - гипертрофия миокарда левого желудочка;ГАС — гипертоническая ангиопатия сетчатки (в скобках — степень по Salus);

ИБС — ишемическая болезнь сердца; ПИКС — постинфарктный кардиосклероз; ТИА — транзиторные ишемические атаки;

ОНМК - острое нарушение мозгового крвообращения;ДЭ - дисциркуляторная энцефалопатия;ПА - периферический атеросклероз

(гемодинамически значимое — более 50% - стснозирование сонных артерий и/или артерий нижних конечностей);

НТГ - нарушение толерантности к глюкозе, СД — сахарный диабет; В соответствующих графах указано содержание лейкоцитов, значения уровня глюкозы, креатинина, общего холестерина (ОХС), креатинина в сыворотке крови натощак на момент взятия крови.

брюшной аорты, в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl буфер, рН 8,3, 75 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 2,5 мкМ случайные девятинуклеотидные праймеры («Биосан», Новосибирск), 500 мкМ каждый из дезоксинуклеозидтрифосфатов (дГТФ, дЦТФ, дТТФ), 5мкМ дАТФ, 50 мкКи [а-32Р]дАТФ (4000 Ки/ммоль, ФГУП «Институт реакторных материалов», Россия), 5мМ дитиотрейтол; 0,3 мкг обратной транскриптазы из вируса лейкемии мышей Молони (MMLV) («Техноген», Россия). Реакцию вели в течение 1 часа при t=37°C и останавливали добавлением 1 мкл 0,1 М ЭДТА, рН 8,0. Меченую кДНК после очистки гельфильтрацией на сефадексе G-50 денатурировали и гибридизовали с кДНК-микрочипами фирмы Clontech Laboratories, Inc. (Human 1.2 Array I, Human 1.2 Array II и Human Cardiovascular Array, Palo Alto, CA) в растворе, содержащем 50%-ный формамид «Sigma», 6-кратный солевой раствор SSPE, 5-кратный раствор Денхардта, 0,2% додецилсульфат натрия, 2 мг/мл гепарина и 0,5 мг/мл денатурированной ДНК спермы сельди, при t=42°C в течение ночи в гибридизационной камере фирмы «Amersham Pharmacia Biotech» с предварительной инкубацией кДНК-микрочипов в гибридизационном растворе в течение 1 часа. После гибридизации кДНК-микрочипы отмывали как рекомендовано фирмой-производителем, экспонировали с экраном в течение 3-7 суток, сканировали в системе Phosphorlmager SI (Molecular Dynamics, USA) и полученные изображения оцифровывали с помощью программы Atlaslmage 2.01 (Clontech).

Математическая обработка гибридизационных данных. Оцифрованные данные после вычитания фона подвергали предварительной нормировке на усредненную величину интенсивности сигналов мало варьирующих генов, включая гены «домашнего хозяйства». Список мало варьирующих генов был получен путем исключения всех сигналов, уровень которых был ниже утроенной величины среднего значения фона, а также всех сигналов, уровень которых был выше утроенного значения медианы всех сигналов, превышающих утроенный средний фон. Полученные таким образом данные повторно нормировали путем наложения кривых линейной регрессии. Для этого строили зависимости логарифмированных значений интенсивности сигналов от каждого гена для одного произвольно выбранного микрочипа против соответствующих сигналов для другого микрочипа того же типа. Варьируемыми параметрами служили аддитивный и мультипликативный факторы регрессии, эквивалентные по физическому смыслу вариации среднего фона микрочипов и степени чувствительности регистрации интенсивности сигнала на разных микрочипах. Оптимизацию коэффициентов регрессии проводили по методу наименьших квадратов. Список дифференциально экспрессирующихся генов был сформирован при построении диаграмм рассеяния нормированных данных, полученных на кДНК-микрочипах одного типа, в виде зависимости логарифмированных значений экспрессии всех генов в опытных образцах против контрольных образцов интимы аорт. Гены, значения уровня экспрессии которых располагались на диаграмме вне 95% доверительной области линии регрессии, рассматривались как вариабельные.

Количественная ОТ-ПЦР. 1,5 мкг суммарной РНК использовали для синтеза кДНК в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl буфер, рН 8,3, 75 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 50 пикомолей случайных девятинуклеотидных праймеров, 10 мМ дитиотрейтол, 1мМ дНТФ (USB) и 0,3 мкг обратной транскриптазы из вируса лейкемии мышей Молони (MMLV) («Техноген», Россия). Реакцию вели в течение 1 часа при t=37°C и останавливали инкубацией реакционной смеси при t=95°C в

течение 10 минут. Объем реакционной смеси доводили до 100 мкл добавлением буфера, содержащего 10 мМ трис-HCl и 1 мМ ЭДТА. Амплификацию проводили в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл кДНК (что соответствовало 15 иг исходной РНК), 10 мМ трис-HCl, pH 8,5, 2 мМ MgCl2, 50 мМ KCl, 10 мкг/мл желатины, 60 мМ хлорид тетраметиламмония (Fluka Chemie), 200 мкМ дНТФ, по 1 мкМ прямого и обратного ген-специфических праймеров, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (Biomaster, Москва), 1 мкг антител "Taq Start" (Clontech). Программа амплификации: предварительная инкубация при 94°С - 5 мин., 20-35 циклов: 94°С - 30 сек., 60°С - 30 сек., 72°С - 40 сек. Дизайн ген-специфичных праймеров осуществляли с использованием программы ОН99 (Техноген, Москва) с последующим анализом программами Fasta34 и Blast уникальности выбранных структур в базах данных Unigene и Genbank (табл. 2). Интенсивность люминесценции продуктов ПЦР после электрофоретического разделения в 1,5 % агарозном геле измеряли с помощью системы AlphalmagerTM (Alpha Innotech Corporation) и программного обеспечения ImageQuant.

Для количественной оценки исследуемых кДНК использовали серийно разведенный внешний стандарт с известной концентрацией. В качестве внешнего стандарта использовали продукт амплификации исследуемого гена, синтезированного в экспоненциальную фазу реакции. Диапазон концентраций внешнего стандарта по величине был сопоставим с определяемой концентрацией анализированной кДНК и подбирался в предварительном эксперименте по одинаковому выходу продуктов ПЦР, полученных на кДНК и внешнем стандарте. Уровни экспрессии генов вычисляли по калибровочным кривым зависимости выхода ПЦР-продукта от внесенного в реакцию количества внешнего стандарта. Данные по экспрессии генов были нормированы на геометрическое среднее уровней экспрессии генов «домашнего хозяйства» - АСТВ, TUBA1B и GAPDH. Для оценки статистической значимости различий опытных и контрольных образцов использовали непарный, двусторонний критерий Стьюдента, считая различия достоверными при р < 0,05.

Кластерный анализ. Двумерное иерархическое кластерирование данных количественной ОТ-ПЦР проводили с использованием программы Gene Cluster 3 и результаты представляли с помощью программы Tree View. Для расчета меры несходства узлов дендрограмм использовалась корреляция по Пирсону и Эвклидово расстояние [Eisen MB, 1998].

Иммуногистохимический анализ. Визуализацию антигенов проводили авидин-биотин иммунопероксидазным методом, используя специфические первичные мышиные моноклональные антитела - анти-С053 (BD Biosciences, разведение 1:200) либо anTH-CD45 (DakoCytomation, разведение 1:200); вторичные биотинилированные козьи антитела против иммуноглобулинов мыши (Amersham Life Science, разведение 1:200); авидин-биотин-пероксидазный комплекс (ABC kit; Vector Laboratories, Burlingame, CA) и 3,3'-диаминобензидин тетрахлорид (Sigma Chemical Со) в качестве субстрата. Ядра клеток докрашивали гематоксилином (Merck). Отрицательным контролем служило использование неспецифических IgG мыши вместо первичных мышиных антител к CD53 или CD45. Для проведения двойного иммуногистохимического окрашивания был использован авидин-биотин иммунопероксидазный метод с последующим добавлением мышиных антител против человеческого CD206, конъюгированного с фикоэритрином (IOTest®, PN IM2741; разведение 1:5), и окрашиванием ядер раствором DAPI (200 нг/мл; Roche, Mannheim,

jermany). Анализ иммуногистохимических данных проводили на микроскопе Leica )М5000В, оборудованным цифровой фотокамерой DFC420 (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Germany).

Результаты исследования и их обсуждение

Прежде чем приступить к изучению транскрипционного профиля генов в ЛПК больных ГБ и в АТП аорты человека, было проведено предварительное исследование по оценке пределов качества препаратов РНК и условий проведения реакции ОТ, необходимых для получения достоверных результатов при количественном анализе содержания мРНК в клетке. Нами было показано, что при условии использования в ОТ случайных праймеров, но не олигоТ-праймера, и анализа фрагмента мРНК длиной не более 700 нуклеотидов, уровень индивидуальной мРНК может быть достоверно 'пределен даже в образце суммарной РНК с соотношением 28S/18S равным 0.39, что соответствует числу случайных разрывов РНК, равным 0.7 на 1000 нуклеотидов. Напротив, использование олигоТ-праймера в ОТ приведет к получению заниженных значений уровня специфической мРНК в образцах суммарной РНК с соотношением 28S/18S меньше 2, причем результат будет зависеть от степени удаленности амплифицируемого участка мРНК от полиА+ хвоста. При этом для большинства исследованных мРНК наблюдалась высокая степень корреляции (г=0.98) числа разрывов РНК с таковым для рРНК на участке длиной 1000 нуклеотидов. Это говорит о том, что общепринятая оценка степени деградации мРНК по соотношению 28S h18S рРНК является правомочной.

Кроме того, в данной работе подобраны условия проведения ОТ, оптимальные для специфичного синтеза кДНК. Нами было показано, что в условиях, рекомендованных фирмами-производителями обратных транскриптаз, MMLV (Gibco-BRL), AMV (Promega, USB) и, в меньшей степени, MMLV (Promega) обратные транскриптазы обладают способностью инициировать синтез кДНК в отсутствие экзогенного праймера (фоновый синтез), сравнимый по эффективности с таковым в присутствии экзогенного праймера. Отсутствие на данный момент способов контроля локализации сайтов инициации фонового синтеза кДНК и учёта эффективности такого вида синтеза делают затруднительным получение достоверных данных по сравнительному анализу различных мРНК в исследуемых образцах. Нами показано, что снижение концентрации обратной транскриптазы, повышение температуры реакции ОТ и использование специальных буферных систем позволяют избавиться от фоновой активности фермента.

Для оценки молекулярных механизмов структурных изменений, происходящих в сосудистой стенке при AT, нами был проведен анализ транскрипционного профиля генов аутопсийного материала нормальной ткани брюшного отдела аорты человека в сравнении с аортальными АТП различных гистологических типов (ЛП, ФА, ФБ, оФА) с использованием кДНК-микрочипов (Clontech) и последующей верификацией данных методом количественной ОТ-ПЦР. Возможность использования аутопсийного материала для анализа экспрессии генов с применением технологии микрочипов была показана ранее [Sluimer J.C., 2007]. При сравнении образцов, взятых интраоперационно и постмортально на фоне одного и того же заболевания, профили экспрессии генов были сходными.

Таблица 2. Нуклеотидная последовательность праймеров для ОТ-ПЦР анализа

Название гена Символ гена Номер мРНК в ГенБанке Последовательность ПЦР-праймеро! (5' - 3')

Рецептор 2 формулированных пептидов FPRL2 NM_002030 GTACTTAGAGCCTGAGTTGCTCCAC CCAGATCACAAGCCCATTGCCCAG

Рецептор 4 хемокина группы СХС CXCR4 NM_003467 CAGCACATCATGGTTGGCCTTATCC CTCGGTGATGGAAATCCACTTGTGC

Регулятор 1 проведения сигнала через G-белок RGS1 NM_002922 AAGGAACCACTCATTCACTTCTAGACG GATTTGTTTAGCAGCATCTGAATGCAC

Рецептор А атрионатрийуретического пептида NPR1 NM_000906 GACCCAGATAATCCCGAGTACTTGG TGGGAAGTCCCATTGTAGTTCAGTAC

Остеопонтин SPP1 NM_000582 ATGGCTAAACCCTGACCCATCTCAG AGTCCATAAACCACACTATCACCTCG

Кавеолин 1 CAVI NM_001753 CAACATCTACAAGCCCAACAACAAGG GAATCTCAATCAGGAAGCTCTTAATGC

Сосудистый эндотелиальный ростовой фактор VEGF NM_003376 GTGTGCCCACTGAGGAGTCCAAC GTCTGCGGATCTTGTACAAACAAATGC

Лейкоцитарный антиген CD53 CD53 NM_000560 GCAAGAATATCACGGCATGGGCATG ATGAAGAACGACATAAGCAGACACTTG

Лейкоцитарный антиген CD37 CD37 NM_001774 AAGACCAGCTTCGTGTCCTTTGTGG TGAGTGGAGATGAGGATTCCCAGG

Устойчивая к тартрату кислая фосфатаза 5 АСР5 NM_001611 CTGTGCGGCCACGATCACAATCTG GGCCTCGATGTAAGTGACAGTCATC

Липаза А, лизосомальная кислая LIPA NM_000235 GGTACCCACGTTTGCACTCATGTC GACATAATCATTGACTTGGTGGTACAC

Скевеиджер рецептор 1 макрофагов MSR1 NM_138715 TGAATACCACATTGCTTGATTTGCAGC TGAGAATGTTCCCAATCTTTCAGTCTG

Лимфоцитарный цитозольный белок 1 LCP1 NM_002298 TTCTGGACCTCATCGATGCCATCC GGAATCTTATAGAGTGTCACCAAGTTG

Транспортный белок фосфолипидов PLTP NM_006227 CATCTCTGTCACTGCTAGCGTCAC GGAATCCCGCATGGTTCGTCACC

Катепсин Б CTSB NM_001908 TGTATTCGGACTTCCTGCTCTACAAG TGATTCGATTCCACAGTGATCCTGTC

Катепсин Д CTSD NM_001909 GGGCCGTGCCGCTGATTCAGG GCGCGGACGCCTTGGGAACTAG

Катепсин А CTSA NM_000308 GCCACTCAAGCGGATGTGGCATC GAGACGGCGGTACTGTAAGTTTACC

Гематопоэтический транскрипционный фактор PU.1 SPIl NM_003120 TGCACAGCGAGTTCGAGAGCTTCG GGGATGGGTACTGGAGGCACATC

Моноцитарный антиген CD14 CD14 NM_000591 GCCGGCCGAAGAGTTCACAAGTG CCTTGACCGTGTCAGCATACTGCC

Предшественник белка бета-амилоида (А4) APP NM_000484 CACACCTCCGTGTGATTTATGAGCG AAAGATGGCATGAGAGCATCGTTTCC

Белок теплового шока 27kDa, тип1 HSPB1 NM 001540 CCCGGACGAGCTGACGGTCAAG GCCCGCGACTCGAAGGTGACTG

Гомолог семейства белков Ras, тип В RHOB NM_004040 TGTTATTTAAGGGTGGTGATGGGTGAG GACAGGCACAAAGTTCGCTTATGGC

Эндотелиальный белок 1, содержащий PAS-домен EPAS1 NM_001430 CGAGAACATGACCAAGAGTCACCAG CACTGCTATCAAAGATGCTGTTCATGG

ЛИМ-доменный белок, тип 1 FHL1 NM_001449 CATATCCAGCCTTTGCCGAATACATC CCAGAAGCGGTTCTTATAGTGCACC

ГТФ-связывающий белок GEM NM_005261 GCCACCGCAACCGCCATTCTGC CGCTCGGTCTGTGATTGAGTAGAC

SPARC-подобный белок 1 типа (mast9, хевин) SPARCL1 NM_004684 AGAGGCCACATCTGTAAGGCAGAC AGATAACCAGCATGTTCAGAGTTGGC

Название гена Символ гена Номер мРНК в ГенБанке Последовательность ПЦР-праймеров (5'-3')

Альфа-8 цепь интегрина ITGA8 Ш_003б38 GATTATGTTGGAATCGAACGCAACAAC GATTTGGAGATCGAAGTTAATGCTCATG

Тяжелая цепь 11 миозина гладкомышечных клеток MYH11 Ш_002474 AAAGGCAATGCCAGGGTCAAGCAG CTGCGTCTCGAGTGTCCGTTTCC

Фосфоламбан PLN ЫМ_002667 CCCAGCTAAACACCCGTAAGACTTC AGCTGAGCGAGTGAGGTATTGGAC

Коллаген XIV типа, альфа-1 (ундулин) COL14A1 ЫМ_021110 ATTGAGTGGGTTGTTGCCCAATACAG CAACCTCATTGATTTCAGTCCCATCTG

Гранулин GRN ЫМ_002087 CCGGCCACTCCTGCATCTTTACC GGTGGCGTTGGGCATTGGGCAG

Коллаген I типа, альфа-1 C0L1A1 NM_000088 CAAGTCGAGGGCCAAGACGAAGAC GTCTCGTCACAGATCACGTCATCG

Коллаген III типа, альфа 1 COL3AI ММ_000090 GGTGCTGAAGGGCAGGGAACAAC GGACTGACCAAGATGGGAACATCC

Третий компонент комплемента СЗ Ш_000064 CAACGTGGAGGCCACATCCTATGC GGATACGGTGGGTGATCTTGGAGC

Тетраспаниновый белок семейства Ь6. тип 1 TM4SF1 ИМ_014220 CCAGTGGAACTACACCTTTGCCAG AGCAGTCATATTGCTGTTGGTGAGAG

И дуронат-2-сул ьфатаза IDS ЫМ_006123 ACAGAGCACTGAGCAAGCCATACAG CCCGTTGCCTGATGTCCATCCAG

Лполипопротснн Е АРОЕ ИМ_000041 GGGATCCTTGAGTCCTACTCAGCC GCGACCCAGTGCCAGTTCCCAG

Алкогольдсгидрогеназа 1Л, класс I, альфа ADU1A NN1 000667 GGGCAGCCAGAATCATTGCGGTG CCAGTCAGTAGCAGCATAGGGTTC

Глутатион-пероксидаза 1 GPX1 N14 000581 TCCCGTGCAACCAGTTTGGGCATC ATCAACAGGACCAGCACCCATCTC

Супероксид-дисмутаза 2, митохондриальная S0D2 NN1 000636 GGGTTGGCTTGGTTTCAATAAGGAAC CATCAAGAAATGCTACAATAGAGCAGC

Бета-изоформа актина АСТВ NN1.001101 GGACTTCGAGCAAGAGATGG AGCACTGTGTTGGCGTACAG

Тубулин,альфа 1Ь TUBA1B ЫМ_006082 TGTTGTACCGTGGTGACGTGGTTC TCAGCAATGGCTGTGGTGTTGCTC

Глинсрал кдсгид-З-фосфат-дегидрогеназа GAPDH NN1.002046 ACCACAGTCCATGCCATCAC TCCACCACCCTGTTGCTGTA

рецептор 1 хемокина группы СХЗС CX3CR1 ММ_001337 ACAGGGTGGCTGACTGGCAGATC GCCAATGGCAAAGATGACGGAGTAG

Калгранулин С CAGC NN1 005621 TCTTCCACCAATACTCAGTTCGGAAG ACCCTCATTGAGGACATTGCTGGG

Онкостатин М OSM ММ_020530 ACAGAGGACGCTGCTCAGTCTGG GGCGCTCCCTGCAGTGCTCTC

Каспаза 4, цистеиновая протеаза CASP4 NN1.001225 GACAGAGGCTGTTCCCTATGG GAAGCATTTGTCCTGCCATACG

Каспаза 2, цистеиновая протеаза CASP2 ЫМ_032982 AGCTGTTGTTGAGCGAATTGTTAGAAC GGAGACTCAAGTCGTAGTCACAGC

Каспаза 8, цистеиновая протеаза CASP8 ИМ_033358 TGGATTTGCTGATTACCTACCTAAACAC ATGTCATCATCCAGTTTGCATTTGGAG

Транскрипционный фактор семейства белков с доменной структурой 04 UBID4 К'М_006263 AACAGTCGAGCGCGAAAGCGGATC AGTGGGCATAGTGGTAACTGAGGC

Гомолог В1 онкогена У-КЛР RAFB1 КМ_004333 TCTTCTAGCCTTTCAGTGCTACCTTC CCAGTAAGCCAGGAA ATATCAGTGTC

Гомолог 1 онкогена У-КЛН RAF1 КМ_002880 AATAGTTCAGCAGTTTGGCTATCAGCG CAATCAAAGACGCAGCATCAGTATTCC

Окончание табл. 2.

Название гена Символ гена Номер мРНК в Генбанке Последовательность ПЦР-праймеров (5'-3')

Ростовой фактор 1 раннего ответа EGR1 NM_001964 GGCGAGCAGCCCTACGAGCAC GGCCGGTGGGTTGGTCATGCTC

Транскрипционны й фактор ег^В FLU NM_002017 AGCCAGTGAGGGTCAACGTCAAGC GGCCCACTCCAGCCATTGCCTC

Онкоген р53 Р53 NM 000546 GAGAGCTGAATGAGGCCTTGGAAC GCTGATTGTAAACTAACCCTTAACTGC

Фосфатаза двойной специфичности, тип 6 PYST1 NM_001946 AGCAGCGACTGGAACGAGAATACG CAGCCAAGCAATGTACCAAGACACC

Фосфатаза двойной специфичности, тип 2 РЛС1 NM_00441S CCCGACAGCCCGGCTCATGTG CGGCCTCCGCTGTTCTTCACCC

Ингибитор 1 диссоциации ГДФ белков КАВ GDI1 NM_001493 CACTGAGACTGAGGCCITGGCTTC GTACAACTTGATGCGGTTGACGGTC

Ингибитор 2 диссоциации ГДФ белков 1ШЗ GDI2 NM_001494 CTTTACAGTGAATCTTTGGCAAGATATGG GACTTGGTTCTGTGGAATAATGATCTG

Глютаредоксин GLRX NM_002064 GGGCTTCTGGAATTTGTCGATATCAC GAAGTGCTGTCATCATTTGCAATGCC

Е1Р4С2, фактор инициации трансляции NATI NM_001418 AGCACTAGACGAGATGACAACTCCG GCATACAGTGAGCTATACTTTGGCTC

М-ацетилглюкозамин-6-сульфатаза G6S NM_002076 CTATCGGTTAATGATGTTACAGTCCTG CTAGCTACAGACACCTACTACAATCAC

Рецептор инсулиноподобного ростового фактора типа2 IGF2R NM_000876 GAAGGCAATAGCTGGAATCTGGGTG CAGCGCTCACGATGGTGTCGTTG

Рибосомальный белок вЗа субъединицы 408 RPS3A NM_001006 GCAGACAATGATTGAAGCTCACGTTG CTACTGCCITCACCATGAAGCrCC

Ядерный антиген дифференцировки миелоидных клеток MNDA NM_002432 AGCTTTCATTTCTCAGCCCTTTACAAG AAGTGATGGCATATCTTTGGCAAGTTC

Белок теплового шока 70 кДа, тип Л8 HSPA8 NM_006597 GTCCAGGCAGCCATCTTGTCTGG CATCTACACTTGGTTGGCTTAATCAAC

Белок теплового шока 40 кДа, тип ) HSP40 NM_006145 CCGCGCAAGCGCGAGATCTTCG CCAAAGTTCACGTTGGTGAAGCCAC

Митоген-активируемая протеинкиназа 2 ERK2 NM_002745 CATCGCCGAAGCACCATTCAAGTTC AAGCCAAGACGGGCTGGAGACAG

Была проведена ОТ образцов суммарной РНК в присутствии [а-32Р]дАТФ с последующей гибридизацией полученной кДНК с тремя видами кДНК-микрочипов (AtlasTM cDNA Expression Arrays, Clontech): Human 1.2 I (1176 генов), Human 1.2 II (1176 генов) и Cardiovascular (588 генов). Было получено 19 профилей генной экспрессии с использованием пяти образцов аН, четырех уН, шести ЛП и четырех ФА на кДНК-микрочипах «Human 1.2 I», 28 профилей генной экспрессии с использованием восьми аН, шести уН, шести ЛП, шести ФА и двух ФБ на кДНК-микрочипах «Human 1.2 II» и 37 профилей генной экспрессии с использованием семи аН, двенадцати уН, девяти ЛП и девяти ФА на кДНК-микрочипах «Cardiovascular». Из 2940 исследованных генов было отобрано 40 генов с дифференциальной экспрессией (способ и критерий отбора - в Материалах и Методах). Среди них 22 гена проявляли повышенную и 18 генов - сниженную экспрессию хотя бы в одном из типов АТП при сравнении с нормальными участками аорты. Для проверки данных кДНК-микрочипов

.етодом количественной ОТ-ПЦР были сконструированы олигонуклеотидные [раймеры (табл.2), специфичные для 40 генов с дифференциальной экспрессией в 1ТП и 3 генов домашнего хозяйства (АСТВ, TUBA1B и GAPDH), чей уровень кспрессии не менялся во всех проанализированных образцах методом кДНК-шкрочипов.

Данные ОТ-ПЦР по уровню экспрессии 40 генов (в виде молярных количеств ДНК) были нормированы на геометрическое среднее уровней экспрессии генов <домашнего хозяйства» - АСТВ, TUBA1B и GAPDH. Для того, чтобы распределить гены на основе аналогичности их экспрессии, определив группы с однонаправленными изменениями регуляции, а также найти соответствия между генами в исследуемых образцах и создать общую картину взаимозависимости между ровнем экспрессии генов и характеристикой образца, было проведено двумерное иерархическое кластерирование данных ОТ-ПЦР с использованием программы Gene Cluster 3 (рис. 1А). Уровни экспрессии каждого гена в образцах ЛП, ФА, ФБ и оФА были нормированы на среднее значение экспрессии того же гена в группе аН, логарифмированы по основанию 2 и центрированы.

Как показано на верхней дендрограмме (рис. 1А), исследуемые образцы поделились на два основных четко различающихся между собой кластера: группа образцов макроскопически нормальной интимы аорты (аН и уН) и группа образцов интимы аорты, пораженной AT, в которой основная часть образцов ЛП и ФА образует отдельные подгруппы. В свою очередь, анализируемые гены разделились на два основных кластера (дендрограмма слева, рис. 1А) - с повышенным и со сниженным уровнями экспрессии в образцах атеросклеротической аорты по сравнению с образцами нормальных участков аорты. При этом наблюдались высокие коэффициенты корреляции (шкала указана на рис. 1А) внутри каждого из кластеров генов, что косвенно могло указывать на тесную функциональную связь этих генов.

Например, гены с повышенным уровнем экспрессии в различных типах АТП аорты, в основном, специфичны для гематопоэтических клеток и вовлечены в процессы хемотаксиса (сопряженные с G-белком хемотаксические рецепторы CXCR4 и FPRL2), в регуляцию проведения сигнала через рецепторы, сопряженные с G-белком, (RGS1), интегрин-опосредованную лейкоцитарную адгезию (LCP1, CD53), иммунный ответ (CD53, CD37, SPI1, CTSA, SPP1, АСР5, CD14) и липидный метаболизм (MSR1, CTSB, CTSD, LIPA, PLTP). Напротив, гены со сниженным уровнем экспрессии в атеросклеротически измененной аорте специфичны для ГМК, фибробластов, эндотелиальных клеток и отвечают за фенотип ГМК (PLN, ITGA8, MYH11, CAVI, FHL1, HSPB1), пространственную организацию внеклеточного матрикса (COL14A1, NPR1), регуляцию перестроек актинового цитоскелета (GEM), клеточную адгезию (SPARCL1) и окислительные процессы в клетке (ADH1, EPAS1). Более полное функциональное описание генов может быть получено в базах данных: SOURCE http://smd.stanford.edu/cgi-bin/source/sourceSearch), GOA http://www.ebi.ac.uk/GOA/, HPDR http://www.hprd.org/, GENElocus http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed.

В настоящей работе обнаружена дифференциальная экспрессия не только генов, чья роль в атерогенезе уже была продемонстрирована другими исследователями, а именно: SPP1 [Ashkar S, 2000], АСР5 [Ráisanen SR, 2005], LIPA [Takahashi К, 2002], MSR1 [Takahashi К, 2002], CXCR4 [Zerneck A, 2008a; Abi-Younes S, 2000; Ocaña E, 2008; SchecterAD, 2003], VEGF [CellettiFL, 2001], PLTP [Lee-Rueckert M, 2006],

1а 1Ь 1с 1с) 1е

Рис. 1. Результаты двумерного кластерирования ОТ-ПЦР данных по экспрессии генов в нормальных и атеросклеротически пораженных участках интимы аорты человека (А) и лейкоцитах больных ГБ (Б). Названия образцов с обозначениями римскими цифрами типа АТП по Стари (рис. 1 А) или стадии ГБ (рис. 1Б) указаны вверху, символы генов — справа от картины кластерирования. Индекс "у" - соответствует пациентам, принимавшим валсартан; индекс "а" - амлодипин. Отсутствие индекса означает отсутствие лечения на момент взятия крови. Красно-зеленая шкала соответствует логарифмированному и центрированному преобразованию уровня экспрессии генов.

CTSB и CTSD [Leake DS, 1981], CD14 [Андреева EP, 1999], HSPB1 [Martin-Ventura JL, 2006], CAVI [Gargalovic P, 2003; Schwencke C, 2005], и MYH11 [Aikawa M, 1993], но и получен список новых генов-участников атерогенеза, а именно: FPRL2, CD37, CD53, RGS1, LCP1, SPI1, CTSA, EPAS1, FHL1, GEM, RHOB, SPARCL1, ITGA8, PLN, и COL14A1. Участие белковых продуктов последней группы генов в таких процессах, как клеточная миграция и адгезия, фенотипические изменения ГМК и эндотелиальных клеток, иммунные и воспалительные реакции, окислительные процессы и пространственная организация коллагеновых волокон, а также выявленная нами направленность изменения экспрессии данной группы генов укладываются в современные представления о процессах, входящих в понятие «сосудистого ремоделирования» при атерогенезе.

Результаты сравнения усредненных уровней экспрессии генов в каждой из опытных групп образцов (уН, ЛП, ФА, ФБ, оФА) и контрольной группы (аН) представлены в табл. 3. Из таблицы видно, что гены разделились на две основные группы: положительно и отрицательно коррелирующие со степенью выраженности АТП (корреляция по Спирману). Среди них 17 генов с повышенной и 15 генов со сниженной экспрессией в атеросклеротически измененной аорте статистически значимо (р<0,0001) коррелируют с данным признаком и имеют коэффициент корреляции по Спирману больше 0,5. При этом основные изменения в уровне экспрессии этих генов происходят в ЛП с увеличением степени их выраженности в ФА без последующих, значительных изменений в ФБ и оФА. Однако для генов, которые демонстрируют сниженную экспрессию в АТП, наблюдается усугубление эффекта падения уровня их экспрессии в оФА по сравнению с другими, менеевыраженными поражениями.

Обнаруженный нами характер изменений экспрессии генов в зависимости от типа АТП может быть объяснен качественными и количественными изменениями клеточного состава при возникновении и дальнейшем прогрессировании атеросклеротических формирований в сосудистой стенке, выявленных в работах Андреевой ЕР и зарубежных авторов [Андреева ЕР, 1999; Kaartinen М.,1994; Katsuda S., 1992]. Андреевой ЕР и соавт. было продемонстрировано колоколообразное, достоверное увеличение клеточности интимы в ряду «непораженная интима -начальное поражение - липидная полоса - фиброатерома - фиброзная бляшка» с максимумом, приходящимся на фиброатерому. При этом на фоне незначительного увеличения клеточности в ФА по сравнению с нормой (увеличение общего числа клеток в 2-3 раза) происходили качественные изменения клеточного состава в виде смены соотношения клеток разных типов - оседлых клеток (увеличение количества в 3 раза), составляющих 80% всей клеточной популяции, и гематопоэтических клеток (увеличение количества в 9 раз), составляющих 20% всей клеточной популяции. Причем, среди оседлых клеток интимы доля ГМК оставалась постоянной, но количество клеток, имеющих одновременно антиген ГМК a-актин и маркер макрофагов CD68, увеличивалось в АТП, что говорило о смене фенотипа ГМК.

При сопоставлении данных, полученных при изучении транскрипционного профиля АТП аорты человека, с результатами анализа экспрессии генов в ЛПК больных ГБ с использованием кДНК-микрочипов «Human 1.2» и «Human 1.2 II» и верификацией данных методом ОТ-ПЦР были выявлены достоверные изменения в уровне экспрессии не только 24-х генов, специфичных для ГБ, но и 11-ти (SPP1, FPRL2, LCP1, LIPA, CD53, АСР5, SPI1, CTSD, CTSA, CXCR4, RGS1) генов,

Таблица 3. Результаты количественной ОТ-ПЦР. Изменения экспрессии генов в группах образцов интимы уН, ЛП, ФА, ФБ и оФА относительно группы образцов аН. Достоверные изменения экспрессии генов (р<0.05) выделены жирным шрифтом. Корреляция экспрессии генов со степенью выраженности АТП посчитана по Спирману (г - коэффициент корреляции, р - достоверность корреляции).

Символ гена Кратность изменения уровня экспрессии гена Достоверность изменения экспрессии гена, Р Корреляция по Спирману

уН ЛП ФА ФБ оФА Ун ЛП ФА ФБ оФА г Р

SPP1 2.6 54.0 482.0 306.2 713.2 0.0819 <0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.91 <0.0001

АСР5 2.5 29.1 33.4 25.3 48.3 0.0205 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0100 0.78 <0.0001

CTSB 1.0 2.9 4.1 3.5 4.9 0.9618 0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0647 0.77 <0.0001

CXCR4 3.0 7.0 12.1 8.2 13.5 0.0077 0.0001 <0.0001 0.0001 <0.0001 0.74 <0.0001

CD37 2.3 5.7 6.9 7.8 9.6 0.0218 0.0001 <0.0001 <0.0001 <0.0001 0.73 <0.0001

LIPA 1.7 6.6 9.0 5.9 7.0 0.0271 0.0003 <0.0001 0.0001 0.0628 0.69 <0.0001

MSR1 1.9 8.1 13.9 14.1 12.9 0.2554 0.0012 0.0002 0.0002 0.0955 0.67 <0.0001

FPRL2 2.9 9.2 15.1 11.5 93 0.0252 0.0001 <0.0001 <0.0001 0.0249 0.67 <0.0001

CD53 1.8 4.2 4.5 4.2 73 0.0929 0.0007 0.0004 0.0007 0.0001 0.66 <0.0001

RGS1 4.0 7.8 17.5 11.6 14.4 0.0221 0.0021 0.0002 0.0007 0.0221 0.66 <0.0001

SPI1 1.3 2.2 2.7 2.9 3.9 0.3525 0.0141 0.0042 0.0073 0.0004 0.64 <0.0001

VEGF 2.6 4.0 7.8 6.7 8.2 0.0249 0.0062 0.0001 0.0003 <0.0001 0.63 <0.0001

LCP1 2.0 3.4 43 4.6 8.1 0.1382 0.0102 0.0034 0.0030 0.0003 0.60 <0.0001

CTSD 1.2 1.8 1.9 1.6 2.5 0.2470 0.0003 0.0023 0.0055 0.0938 0.55 <0.0001

CD14 1.5 3.9 5.9 33 3.2 0.3043 0.0038 0.0004 0.0088 0.0427 0.55 <0.0001

PLTP 1.9 33 4.6 3.4 4.9 0.0903 0.0040 0.0004 0.0029 0.2132 0.53 <0.0001

CTSA 13 1.6 1.7 1.7 2.0 0.0221 0.0008 0.0002 0.0007 0.0027 0.53 <0.0001

SOD2 0.7 1.2 1.6 1.3 2.7 0.0674 0.5818 0.1591 0.3075 0.0078 0.46 <0.0001

СЗ 1.1 3.0 5.5 3.9 0.6 0.8114 0.0606 0.0058 0.0247 0.7816 0.45 <0.0001

GPX1 0.9 1.1 1.6 0.9 33 0.4970 0.4798 0.0157 0.6430 0.0050 0.45 <0.0001

GAPDH 1.0 1.1 1.2 1.1 1.2 0.4768 0.2326 0.0507 0.1137 0.0554 0.43 <0.0001

GRN 1.1 1.6 1.5 1.0 2.1 0.6795 0.0028 0.0140 0.7584 0.0584 0.38 0.0042

АРОЕ 1.7 2.9 1.9 1.3 5.8 0.1040 0.0034 0.0789 0.3660 0.0077 0.30 0.0286

COL1A1 1.6 1.6 2.6 1.8 0.1 0.0713 0.1433 0.0003 0.1458 0.1726 -0.09 0.5066

COL3A1 1.2 1.4 2.0 1.3 0.1 0.4264 0.3555 0.0190 0.2649 0.0787 -0.16 0.2305

АСТВ 1.0 0.9 0.8 0.9 0.8 0.4768 0.2326 0.0507 0.1137 0.1585 -0.18 0.1769

TUBA1B 1.0 1.0 1.1 0.8 0.6 0.9227 0.6698 0.4464 0.4421 0.1987 -0.23 0.0859

IDS 0.9 0.8 0.6 1.1 0.5 0.6631 0.1182 0.0014 0.9000 0.0110 -0.50 <0.0001

PLN 0.6 0.5 0.4 0.6 0.004 0.0318 0.0307 0.0011 0.2256 0.0099 -0.51 <0.0001

АРР 0.8 0.7 0.6 0.8 0.5 0.0223 0.0051 0.0000 0.2428 0.0020 -0.52 <0.0001

TM4SF1 0.8 0.7 0.4 0.6 0.2 0.3444 0.0847 0.0007 0.0216 0.2599 -0.56 <0.0001

ITGA8 0.8 0.6 0.4 0.5 0.01 0.2304 0.0414 0.0002 0.0702 0.0608 -0.56 <0.0001

SPARCL1 0.6 0.6 03 0.4 0.04 0.0610 0.0606 0.0001 0.0759 0.0422 -0.59 <0.0001

COL14A1 0.8 0.5 03 0.4 0.002 0.2298 0.0029 <0.0001 0.0271 0.0133 -0.60 <0.0001

ADH1 1.3 0.7 0.3 0.6 0.01 0.4432 0.3744 0.0019 0.3382 0.0044 -0.60 <0.0001

HSPB1 0.9 0.8 0.6 0.6 0.3 0.4580 0.0905 0,0006 0.0129 0.0875 -0.64 <0.0001

CAVI 0.9 0.6 0.5 0.6 0.1 0.4724 0.0306 <0.0001 0.0010 0.0916 -0.65 <0.0001

RHOB 0.7 0.5 03 03 0.2 0.0268 0.0043 <0.0001 0.0185 0.0674 -0.68 <0.0001

GEM 1.0 0.8 0.4 03 0.04 0.9688 0.2051 0.0003 0.0050 0.0941 -0.72 <0.0001

FHL1 0.8 0.5 03 03 0.03 0.0433 0.0006 <0.0001 0.0057 0.0147 -0.73 <0.0001

EPAS1 0.7 0.6 0.4 03 0.1 0.0002 <0.0001 <0.0001 0.0047 0.0383 -0.74 <0.0001

NPR1 0.6 0.4 0.1 0.1 0.01 0.0108 0.0003 <0.0001 0.0016 0.0082 -0.78 <0.0001

MYH11 0.6 0.3 0.2 0.1 0.01 0.0011 <0.0001 <0.0001 0.0004 0.0469 -0.80 <0.0001

характерных для ЛТП интимы аорты человека (табл. 4). Среди последних наблюдается одинаковая направленность изменения экспрессии (в сторону увеличения) в гематопоэтических клетках больных ГБ и в интиме атеросклеротической аорты. При этом, б генов (SPll, FPRL2, CD53, SPP1, CTSD, АСР5) достоверно положительно коррелировали (г>0.5) как со стадией ГБ, так и со степенью тяжести АТП (табл. 3 и 4). Исключение составляли RGS1 и CXCR4, которые демонстрировали противонаправленные изменения при данных патологиях, а именно: отрицательную корреляцию со стадией ГБ и положительную корреляцию со степенью выраженности атеросклеротичсского процесса в аорте.

Одинаковая направленность изменения экспрессии в лейкоцитах больных ГБ и в АТП аорты была обнаружена нами для генов, вовлеченных в иммунные и воспалительные реакции, процессы клеточной адгезии, а также в процессы, связанные с окислительным стрессом. Например, ген SPP1, называемый также остеопонтином или белком первого типа ранней активации Т-лимфоцитов, играет ключевую роль в развитии иммунного ответа. SPP1, секретируемый активированными Т-лимфоцитами, выступает в роли хемоагграктанта для макрофагов и стимулирует синтез Thl-цитокинов (IL-12 и IFN-y) и ннгибирует синтез ТЬ2-цитокина (IL-10), способствуя, таким образом, преимущественному развитию проатерогенного Thl-типа клеточного иммунного ответа в АТП [Ashkar S, 2000]. При этом, в образовании иммунологического синапсиса и Т-клеточной активации ведущую роль играет L-пластин (LCP1), актин-связывающий белок, участвующий в перестройках актинового иитоскелета и обеспечивающий транспорт молекул активации Т-клеток, CD69 и CD25, на клеточной поверхности [Wabnilz GH, 2007], а также регулирующий миграцию и интегрин-зависимую адгезию лейкоцитов [Boldt К, 2006]. Важная роль в иммунных реакциях принадлежит и тетраспаниновому белку CD53, взаимодействующему с молекулами гистосовместимости первого и второго классов, обеспечивая их кластерирование на поверхности антиген-презентирующих клеток для эффективного взаимодействия с Т-клеточными рецепторами [Tarrant JM, 2003, Yunta М, 2003]. Кроме того, CD53 участвует в активации интегринов разных типов и индуцирует гомотопическую адгезию, характерную для лимфоидных клеток [Lazo РА, 1997]. Что касается SPI1, члена семейства Eís транскрипционных факторов, то ему отводится ключевая роль как в дифференцировке моноцитов в дендритные клетки [Bakri У, 2005], так и в активации тирозиновой фосфатазы SIIP-1 - негативного регулятора многочисленных сигнальных путей в иммунных и других гематопоэтических клетках, опосредуемых активацией рецепторов цитокинов, ростовых факторов и хемокинов, а также рецепторов, напрямую вовлеченных в иммунный ответ [Wlodarski Р, 2007].

Избыточное образование реактивных форм кислорода (РФК) играет важную патогенетическую роль как при АГ, так и в атерогенезе. Нами была обнаружена повышенная экспрессия генов, участвующих в поддержании окислительного стресса при этих заболеваниях. Среди них - устойчивая к действию тартрата кислая фосфатаза АСР5, синтезируемая активированными макрофагами и способная продуцировать РФК [Ráisánen SR, 2005]; SPI1, способный активировать транскрипцию генов, кодирующих различные составляющие НАДФН-оксидазного комплекса - основного источника образования супероксид-анион радикалов и их производных [LiSL, 2002]; и сопряженный с G-белком хемотаксический рецептор

Таблица 4. Сравнительный анализ экспрессии генов в ЛПК больных ГБ и доноров (Д). Жирным шрифтом выделены гены, специфичные для АТП интимы аорты. «ВГБ» - все больные ГБ, взятые в исследование, «НГБ» - лелеченные больные ГБ, «ГБ+А» - леченные амлодипином больные ГБ, «ГБ+В» - леченные валсартаном больные ГБ.

относительный уровень достоверность изменения Корреляция по Спирману

экспрессии гена, ГБ/Д экспрессии гена, р со стадией ГБ

гена ВГБ, НГБ, ГБ+А, ГБ+В, ВГБ, НГБ, ГБ+А, ГБ+В,

п=20 п=7 п=б п=7 п=20 п=7 п=6 п=7 Р

СХЗСК1 5.31 6.62 3.99 5.43 1.6Е-05 4.2Е-06 1.3Е-06 2.9Е-03 0.74 3.2Е-06

ЭРР1 5.05 5.26 2.86 7.89 4.0Е-05 4.6Е-03 1.8Е-03 4.1Е-02 0.54 2.1Е-03

СА8Р8 4.14 5.45 2.40 5.03 1.1Е-07 3.1Е-04 1.4Е-03 1.1Е-02 0.59 6.5Е-04

СЬЮ< 4.07 4.95 2.70 4.75 9.2Е-07 9.3Е-07 2.1Е-04 5.6Е-02 0.66 6.3Е-05

РУБП 3.95 5.36 2.42 4.43 2.9Е-04 5.6Е-05 7.1Е-04 1.0Е-08 0.60 4.9Е-04

САЭР4 3.16 3.39 2.30 3.89 2.3Е-06 6.4Е-03 4.3Е-03 4.7Е-02 0.55 1.8Е-03

С01-2 2.69 3.08 1.79 3.32 2.8Е-05 6.1Е-03 8.3Е-03 5.8Е-02 0.46 9.9Е-03

ШРА8 2.63 4.11 1.29 3.11 3.2Е-04 1.1Е-03 2.4Е-02 2.6Е-02 0.35 5.5Е-02

РРКЬ2 2.58 2.69 2.02 3.07 3.9Е-07 7.7Е-03 4.3Е-04 8.0Е-02 0.60 4.3Е-04

ЯР83А 2.43 2.82 1.47 3.20 4.7Е-04 3.8Е-02 1.3Е-02 5.7Е-02 0.34 6.8Е-02

1.СР1 2.32 2.97 ¡.43 2.73 5.8Е-05 1.7Е-02 1.4Е-02 1.8Е-01 0.37 4.1Е-02

МЬГОА 2.30 2.90 1.69 2.38 1.5Е-04 9.2Е-04 1.1Е-01 5.9Е-11 0.42 2.0Е-02

ЫРЛ 1.94 3.13 1.06 2.01 2.4Е-03 1.2Е-02 9.9Е-02 2.0Е-01 0.20 2.8Е-01

11ВГО4 1.83 1.77 1.72 1.98 1.3Е-05 4.6Е-04 1.1Е-04 5.6Е-03 0.74 2.7Е-06

слое 1.81 1.70 1.74 1.99 5.0Е-03 3.2Е-02 5.3Е-03 2.2Е-01 0.51 4.0Е-03

С053 1.79 2.08 1.38 1.91 1.2Е-06 2.7Е-03 8.0Е-05 7.5Е-02 0.51 4.1Е-03

САБР2 1.77 1.92 1.55 1.83 1.2Е-06 7.0Е-06 4.3Е-03 5.9Е-04 0.65 1.0Е-04

1.72 1.65 1.49 2.04 1.9Е-04 1.3Е-02 7.3Е-03 3.4Е-02 0.53 2.3Е-03

АСР5 1.62 1.83 1.56 1.48 3.2Е-04 1.9Е-03 6.1Е-04 1.8Е-01 0.49 5.3Е-03

р53 1.55 1.73 1.50 1.42 8.0Е-04 6.9Е-03 5.1Е-05 1.5Е-01 0.57 1.0Е-03

ИАРВ1 1.53 1.53 1.28 1.80 2.0Е-03 1.1Е-02 1.1Е-01 3.2Е-10 0.43 1.8Е-02

ЯАН 1.53 1.57 1.30 1.72 1.6Е-04 З.ЗЕ-03 1.1Е-02 4.0Е-02 0.50 4.8Е-03

БРИ 1.52 1.29 1.64 1.69 4.6Е-06 4.3Е-02 7.7Е-05 9.0Е-02 0.67 5.4Е-05

мвш 1.49 2.08 0.90 1.65 1.1Е-01 1.1Е-01 3.1Е-01 3.9Е-01 0.13 5.0Е-01

КЛТ1 1.47 1.82 1.09 1.54 4.8Е-03 3.4Е-03 4.9Е-01 7.2Е-02 0.26 1.6Е-01

ЮР2К 1.42 1.34 1.24 1.68 8.0Е-03 5.2Е-02 4.1Е-02 9.3Е-02 0.43 1.6Е-02

сгео 1.41 1.57 1.32 1.33 3.5Е-05 1.5Е-04 4.3Е-03 1.0Е-01 0.50 5.1Е-03

Ш1 1.40 1.61 1.20 1.40 3.2Е-03 9.8Е-04 1.0Е-01 1.7Е-06 0.40 3.0Е-02

001-1 1.34 1.37 1.29 1.36 4.0Е-03 1.5Е-02 4.8Е-03 8.8Е-02 0.52 3.2Е-03

стел 1.28 1.47 1.15 1.23 1.0Е-03 8.3Е-04 2.4Е-03 9.6Е-02 0.37 4.2Е-02

ЕЯК2 1.24 1.31 1.04 1.37 5.2Е-02 4.2Е-02 2.9Е-01 7.9Е-02 0.22 2.4Е-01

РЬТР 1.14 1.14 1.07 1.23 3.1Е-01 2.9Е-01 9.1Е-01 1.1Е-01 0.14 4.7Е-01

С037 1.12 1.29 0.96 1.12 1.7Е-01 3.4Е-02 3.4Е-01 4.9Е-02 0.11 5.7Е-01

сгев 1.07 1.18 0.97 1.06 3.1Е-01 1.0Е-01 5.2Е-01 5.1Е-01 0.09 6.5Е-01

СШ4 1.03 1.25 0.91 0.93 6.8Е-01 4.2Е-03 2.7Е-04 6.6Е-01 -0.13 4.9Е-01

оэм 0.60 0.35 1.01 0.65 4.3Е-03 1.4Е-03 4.4Е-01 6.1Е-02 -0.22 2.4Е-01

ШР40 0.55 0.50 0.57 0.59 7.0Е-07 7.7Е-06 1.1Е-03 5.0Е-05 -0.67 4.7Е-05

СХСИ4 0.42 0.38 0.43 0.46 5.9Е-09 2.1Е-08 2.7Е-03 2.6Е-02 -0.65 8.8Е-05

КС81 0.36 0.52 0.28 0.31 3.9Е-03 1.9Е-01 1.7Е-06 1.8Е-01 -0.54 2.0Е-03

ЕСЮ 0.29 0.64 0.21 0.17 9.9Е-07 1.0Е-01 8.7Е-05 5.6Е-05 -0.77 5.1Е-07

РАС1 0.21 0.21 0.28 0.18 5.5Е-11 1.5Е-04 5.9Е-06 8.8Е-03 -0.75 1.3Е-06

FPRL2, специфичный для моноцитов, незрелых и зрелых дендритных клеток, стимуляция которого приводит к активации протеинкиназы С, Src-подобных тирозиновых киназ, а также низкомолекулярных G-белков Rho-семейства, что в свою очередь активирует работу НАДФН-оксидазы [Rabiet MJ, 2007].

Среди 24-х генов, не меняющих свою активность в АТП, но демонстрирующих достоверные (р<0.05) отличия в уровне экспрессии в ЛПК больных ГБ, по сравнению с нормой в 1,5-5 раз повышена активность генов, ответственных за апоптоз (р53, CASP2, CASP4, CASP8, UBID4), хемотаксис лейкоцитов (CX3CR1), воспалительный ответ (CAGC, HSPA8), контроль пролиферации и дифференцировки клетки (PYST1, RAFB1, RAF1, UBID4), внутриклеточный транспорт (GDI1, GDI2, IGF2R), клеточный стресс (HSPA8), поддержание окислительно-восстановительного равновесия в клетке (GLRX), регуляцию транскрипции и трансляции (FLI1, UBID4, MNDA, NATI, RPS3A), катаболизм гликозаминогликанов (G6S). Это может служить указанием на общее усиление метаболических процессов и активности клеток крови при ГБ. Противоположно направленное изменение экспрессии внутри пар генов фосфатаз РАС-1 и PYST1, регулирующих активность MAP-киназ, а также белков теплового шока - шаперонов HSPA8 и HSP40, участвующих в укладке новосинтезированных белков, может свидетельствовать об ослаблении процессов дифференцировки поступающих в кровь лейкоцитов, усилении воспалительных процессов и апоптоза.

Важно отметить, что для ряда генов как коррелирующих с ГБ и AT, так и специфичных только для ГБ и не проявивших себя в АТП аорты, прослеживается влияние терапии амлодипином, но не валсартаном, с тенденцией нормализации уровня их экспрессии до величин, наблюдаемых у здоровых доноров (табл. 4). Индивидуальная реакция больных на использованную терапию может быть прослежена по данным, представленным на рис. 1Б. Видно, что разброс уровня экспрессии генов у здоровых лиц значительно меньше, чем у больных. Все пациенты разделяются на семь кластеров в соответствии с наличием или отсутствием заболевания и способом лечения. Здоровые лица относятся к кластеру 2Ь. Нелеченные пациенты - к кластеру 1а, леченные валсартаном - к кластерам Ib и 1с, а леченные амлодипином - к кластерам Id, le и 2а. Все гены, принадлежащие кластеру 7, независимо от лечения характеризуются пониженной экспрессией у больных ГБ, тогда как гены, принадлежащие кластеру 1, - повышенной экспрессией. Экспрессия генов кластеров 2 и 3, повышенная у больных ГБ, имеет ярко выраженную тенденцию к снижению при лечении амлодипином, но не меняется при лечении валсартаном. На основании результатов, полученных в этих исследованиях, можно заключить, что изучение транскриптома клеток крови при ГБ полезно для мониторирования течения болезни и оценки эффективности действия лекарственных средств.

В последнее время активно изучается антиатерогенный эффект амлодипина, проявляющийся в виде ингибирующего влияния на окислительный стресс, процессы воспаления, синтез молекул адгезии и пролиферацию клеток [Yoshii Т, 2006; Stepien О, 2002]. Среди генов, чувствительных к действию амплодипина, нами обнаружен ген тетраспанина CD53, роль которого в атерогенезе и АГ до сих пор не изучена. Действие амлодипина на экспрессию CD53 в ЛПК больных ГБ подтверждается данными таблицы 4 и рисунка 2А. На рис.2А можно видеть, что кривые распределения активности гена CD53 под действием амлодипина занимают промежуточное положение между таковыми для доноров и больных, леченных валсартаном или не подвергавшихся лекарственной терапии.

Недавно было выявлено, что в условиях повышенного окислительного стресса, наблюдаемого у больных ревматоидным артритом, а также индуцированного стимуляцией макрофагов липополисахаридами, происходило увеличение уровня CD53 [Pedersen-Lane JH, 2007; Kim TR, 2004]. Возможно, этими наблюдениями можно объяснить и повышенную экспрессию CD53, обнаруженную нами как у больных ГБ (табл. 4, рис. 2А, В), так и в АТП аорты (табл. 3, рис. 2Б, В), где окислительный стресс имеет первостепенное патогенетическое значение.

1.0

0.8 Г /ш / Л /А

0.6 L L • д ■ ГБ+А А НГБ, ГБ+В

0.4 А/\ /а/ \

0 ifj УÁ \

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 кратность изменения уровня экспрессии гена CD53

В

____ДНК-стандарт

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1314 1516 17 IS 19 20 21 22 23 24 25 26 2 7 2 8 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 4 0 41

Рисунок 2. Данные ОТ-ПЦР по экспрессии гена СЭ53 в ЛПК больных ГБ и АТП аорты человека. А. Кривые распределения активности гена С053 в ЛПК больных ГБ, леченных амлодипином (ГБ+А), леченных валсартаном (ГБ+В), не подвергавшихся лекарственной терапии (НГБ), и доноров (Д). Данные по экспрессии гена СБ53 нормированы и центрированы относительно средневесового значения активности гена для доноров. Б. Гистограмма усредненной кратности изменения уровня экспрессии гена С053 в каждой группе образцов (уН, ЛП, ФА, ФБ, оФА) относительно контрольной группы (аН). Стандартные отклонения от среднего указаны на гистограмме. В. Электрофореграммы продуктов ОТ-ПЦР гена С053 в образцах нормальной (аН, уН) и атеросклеротически измененной аорты человека (ЛП, ФА, ФБ, оФА) и в ЛПК здоровых доноров (Д) и больных ГБ. Нумерация треков верхней электрофореграммы (1-20) соответствует нумерации больных ГБ в табл. 1.

Поскольку в стенке сосуда, пораженного АТ, чрезмерно выражены процессы окисления, в частности в изобилии присутствуют окисленные формы ЛПНП, нам представлялось интересным изучить иммуногистохимически экспрессию белка С053 и локализацию С053-позитивных клеток в разных типах АТП и нормальных участках аорты. Во избежание межиндивидуальных различий в уровне экспрессии С053, мы

22

исследовали аутопсийный материал аорты, взятый от одного и того же человека. Для гистологической классификации полученных образцов ткани аорты, срезы были окрашены масляным красным О и гематоксилином, рис. ЗА. При микроскопическом рассмотрении окрашенных срезов образцы были классифицированы как ДИУ (рис.ЗА - 1), ЛП (рис.ЗА - 2), атерома (рис.ЗА - 3 и 4), ФБ (рис.ЗА - 5). Срезы тех же образцов были окрашены антителами к тетраспанину CD53 АВС-методом (см. Материалы и Методы). Было обнаружено, что С053-положительные клетки беспорядочным образом распределены в протеогликановом и мышечно-эластическом слоях ДИУ (Рис. ЗБ - 1). В ЛП выявлялись локальные скопления СБ53-положительных клеток (моноциты/макрофаги, дендритные клетки, лимфоциты) (Рис. ЗБ - 2). В атероме увеличивалось количество С053-положительных клеток с образованием целых локусов скоплений пенистых клеток и значительного скопления последних по периферии очага атеромы, сформированного внеклеточными липидами (Рис. ЗБ - 3 и 4). Важно отметить, что, по сравнению с ДИУ, в ЛП и атероме увеличивалось не только число СВ53-позитивных клеток, но и количество самого белка CD53 в клетке, о чем можно было судить по большей площади окрашиваемое™ клеток антителами к CD53. Напротив, в ФБ, по сравнению с атеромой, общее количество CD53-положительных клеток уменьшалось. Небольшое количество этих клеток было локализовано в фиброзной покрышке и глубоких слоях бляшки вокруг остатков липидного ядра (Рис. ЗБ - 5).

Гематопоэтическая природа СВ53-положительных клеток была подтверждена выявлением совместной экспрессии тетраспанина CD53 и панлейкоцитарного антигена CD45 в клетках ЛП (Рис. ЗВ). Также мы обнаружили, что часть CD53-положительных клеток экспрессируют CD206 — маркер макрофагов и дендритных клеток моноцитарного происхождения, участвующий в захвате чужеродных антигенов. В пенистых клетках атеромы белок CD206 был локализован вокруг ядра, тогда как CD53 был расположен в цитоплазматической мембране (Рис. ЗГ - 1). В участках интимы, прилегающих к липидному ядру атеромы, были выявлены клетки с перекрёстной локализацией CD206 и CD53 антигенов либо в плазматической мембране (Рис. ЗГ - 2), либо в везикулоподобных структурах (Рис. ЗГ - 3 и 4). Эти данные согласуются с результатами других авторов, обнаруживших такие внутриклеточные структуры, содержащие либо CD206 после интернализации рецептора [Sallusto F, 1995], либо CD53 вместе с молекулами гистосовместимости второго класса [Escola JM, 1998].

Какую роль, про- или антиатерогенную, выполняют тетраспанины по мере развития атеросклеротического процесса пока неизвестно. Отдельные литературные данные могут косвенно указывать на проатерогенную функцию тетраспанина CD53. Известно, что активация CD53 в ответ на окислительный стресс приводит к увеличению концентрации внутриклеточного глутатиона, обеспечивая устойчивость клетки к действию продуктов перекисного окисления и препятствуя ее вхождению в апоптоз [Kim TR, 2004]. В условиях суперэкспрессии CD53 наблюдали снижение активности каспаз, уменьшение фрагментации ДНК, увеличение уровня антиапоптотического белка bcl-X[. и уменьшение уровня белка bax [Yunta М, Lazo РА, 2003]. Более того, при активации CD53 происходила индукция синтеза ДНК через ERK1/ERK2 сигнальный путь [Yunta М, 2003]. В опытах на экспериментальных моделях АТ было отчётливо продемонстрировано, что подавление макрофагального апоптоза на ранних стадиях развития АТ способствует дальнейшему

Рис. 3. Иммуногистохимический анализ аорты человека. А. Окрашивание срезов ткани аорты жировым красным О. Изображение 1 - ДИУ, 2 - ЛП (пенистые клетки указаны стрелками), 3 и 4 - атерома, 5 - ФБ. Б. Иммуногистохимическое выявление экспрессии тетраспанина СЭ53 в нормальном сегменте аорты (изображение 1), ЛП (2), атероме (3 и 4) и ФБ (5). Ядра клеток докрашены гематоксилином. Во вставках каждого из изображений представлено четырехкратное увеличение его участка, выделенного прямоугольником. В. Окрашивание последовательных срезов ЛП антителами к СБ45 (изобр.1) и к СБ53 (изобр. 2) - продукты реакции коричнего цвета. Изображения 1 и 2 были совмещены друг с другом и получено псевдоизображение 3, где окрашивание С045 антителами показано зеленым цветом, а С053 антителами - оранжевым цветом. Красными стрелками указаны клетки, экспрессирующие два антигена одновременно. Г. Экспрессия СЭ53 в антиген-презентирующих клетках. Проведено двойное окрашивание срезов атеромы антителами к СБ53 (коричневый цвет) и С0206 (красный цвет) с последующим окрашиванием ядер раствором ОАР1 (синий цвет) и получены совмещенные изображения 1, 2, 3 и 4<3. Изображения 4а (анти-С053 окрашивание), 4Ь (анти-С0206 окрашивание) и 4с (ОАР1-окрашивание) представлены раздельно и после совмещения всех трёх изображений (изображение 4с)). Везикулярные структуры, окрашенные антителами к С053 и С0206, указаны стрелками. Масштаб изображений указан в микронах. Обозначения: Ь - просвет сосуда, I - интима, М -медия, ЬС - липидное ядро, РС - пенистые клетки, ИСАР - фиброзная покрышка бляшки. Внеклеточные отложения липидов отмечены звездочками.

прогрессированию заболевания [Tabas I., 2005]. Так, в аортах мышей, нокаутных по АроЕ или Ldlr и имеющих пересаженный костный мозг от мышей с делецией генов р53 или Вах, происходило увеличение клеточности и размера АТП. Напротив, результатом делеции гена AIM, ингибитора макрофагалыюго апоптоза, были: 1) высокая чувствительность макрофагов к апоптозу, индуцированному окЛПНП в опытах in vitro; и 2) уменьшение размера АТП у мышей, нокаутных по гену Ldlr.

Усугубление атеросклеротических процессов в сосудистой стенке при задержке апоптоза лейкоцитов объясняется возникновением в таких клетках процессов вторичного некроза. Вторично некротизированные лейкоциты могут 1) напрямую вызывать повреждение ткани за счет высвобождения внутриклеточных протеаз и образования аутоантигенов, обуславливающих иммунную реакцию, или 2) опосредованно вызывать воспаление как следствие их фагоцитоза с последующей индукцией синтеза таких медиаторов воспаления, как тромбоксан В2, ИЛ-8 и фактор некроза опухолей альфа фагоцитами [Tabas I., 2005; Ward С, 1999].

Таким образом, можно предположить, что в условиях повышенного окислительного стресса, характерного для АГ и AT, увеличение уровня CD53 может приводить к повышенной пролиферации лейкоцитов и задержке их апоптоза -процессов, обуславливающих прогрессирование АТП. Выявленная нами в ЛПК больных ГБ повышенная экспрессия каспаз 2, 4 и 8, факторов транскрипции (UBID4, р53) и трансляции (NATI), обнаружение разнонаправленного изменения экспрессии внутри пар шаперонов HSPA8 и HSP40, а также ингибиторов МАР-киназ - PACI и PYST1, в целом обуславливающих активацию апоптотических процессов в лейкоцитах, с одной стороны, и увеличение экспрессии тетраспанина CD53 -негативного регулятора реализации апоптотической программы, с другой стороны, на фоне повышенной экспрессии хемокиновых рецепторов (FPRL2 и CX3CR1), обеспечивающих направленную миграцию лейкоцитов в стенку сосуда, измененной транскрипционной активности генов факторов воспаления (CAGC, OSM, HSPA8), участников иммунных (SPP1, FPRL2, SPI1, CTSA, LCP1) и окислительных (АСР5, SPI1) реакций, обеспечивающих формирование очагов воспаления в сосудистой стенке, могут рассматриваться в качестве одного из возможных молекулярных механизмов предрасположенноста больных ГБ к развитию AT сосудов.

Высказанное нами предположение о значимости негативной регуляции апоптотических процессов в ЛПК больных ГБ в возникновении и развитии AT сосудов подкрепляется фактами обнаружения устойчивости к апоптозу ЛПК больных с нестабильной стенокардией по сравнению со здоровыми донорами [Zurgil N, 2007] и подавления макрофагального апоптоза при гиперинсулинемии - важном факторе риска развития атеросклеротичесюгх заболеваний [lida КТ, 2002].

ВЫВОДЫ:

1. Отработаны условия проведения ОТ для получения достоверных количественных данных при использовании кДНК-микрочиповой технологии и ОТ-ПЦР: выявлен диапазон пределов качества суммарной РНК, подобрана концентрация обратной транскриптазы, температура реакции и состав реакционной смеси для обеспечения специфичного праймер-зависимого синтеза кДНК.

2. Методом кДНК-микрочиповой технологии и последующей верификацией данных методом количественной ОТ-ПЦР обнаружены достоверные различия в уровне экспрессии 40 из 2940 исследованных генов в аутопсийных образцах ранних (ЛП), выраженных (ФА, ФБ) и осложнешшх (оФА) АТП аорты человека по сравнению с нормальной тканью аорты. Обнаружена дифференциальная экспрессия не только генов, чья роль в атерогенезе уже была продемонстрирована другими исследователями, но и получен список новых генов-участников атерогенеза - FPRL2, CD37, CD53, RGS1, LCP1, SPI1, CTSA, EPAS1, FHL1, GEM, RHOB, SPARCL1, ITGA8, PLN, и COL14A1, вовлеченных в процессы клеточной миграции и адгезии, фенотипические изменения ГМК, иммунные и воспалительные реакции, окислительные процессы и пространственную организацию компонентов внеклеточного матрикса. Выявленные нами изменения экспрессии генов укладываются в современные представления сосудистого ремоделирования при атерогенезе.

3. Среди обнаруженных нами 40 генов с измененным уровнем транскрипции -17 генов с повышенной и 15 генов со сниженной экспрессией в атеросклеротически измененной аорте статистически значимо (р<0,0001) коррелировали с тяжестью АТП (коэффициент корреляции по Спирману больше 0,5). Основные изменения в уровне экспрессии этих генов обнаружены в ЛП с увеличением степени их выраженности в ФА без последующих, значительных изменений в ФБ и оФА. Однако для генов, демонстрирующих сниженную экспрессию в АТП, наблюдалось усугубление эффекта падения уровня их экспрессии в оФА по сравнению с другими АТП.

4. Методом кДНК-микрочиповой технологии и количественной ОТ-ПЦР обнаружены достоверные различия в уровне экспрессии 35 из 2352 исследованных генов в лейкоцитах больных ГБ. Выявленные гены с измененной экспрессией кодируют белки, участвующие в апоптозе клеток, воспалительных и иммунных реакциях, направленной миграции и адгезии, контроле пролиферации и дифференцировки клетки, внутриклеточном транспорте, клеточном стрессе, катаболизме гликозаминогликанов, поддержании окислитсльно-восстановитсльного равновесия в клетке, регуляции транскрипции и трансляции.

5. При сравнительном анализе транскриптомов АТП аорты человека и ЛПК больных ГБ обнаружены однонаправленные изменения экспрессии генов CD53, SPI1, FPRL2, SPP1, CTSD, АСР5, LCP1, CTSA и LIPA, и противонаправленные изменения экспрессии генов CXCR4 и RGS1 генов. Для генов CD53, SPI1, FPRL2, SPP1, CTSD и АСР5 выявлена достоверная (р<0.005) положительная (г>0.5) корреляция как со стадиен ГБ, так и со степенью тяжести атеросклеротического процесса в сосудистой стенке.

6. Методом иммуногистохимического анализа нормальных и атеросклеротических сегментов аорты человека обнаружено значительное повышение уровня экспрессии тетраспанииа CD53 в антиген-презентирующих клетках

моноцитарного происхождения, в том числе пенистых клетках, являющихся главными участниками атерогенеза.

7. Продемонстрирована тенденция к нормализации транскрипционной активности дифференциально экспрессирующихся генов, в том числе тетраспанина CD53, в ЛПК больных ГБ под действием лекарственной терапии амлодипином.

8. Сформулирована гипотеза о молекулярных механизмах предрасположенности больных ГБ к развитию АТП сосудистой стенки. Ключевая роль в этих процессах отводится тетраспанину CD53 как участнику не только процессов клеточной адгезии и иммунных реакций, но и регулятору клеточности в атеросклеротической бляшке посредством влияния на пролиферативпый ответ и апоптотические процессы гематопоэтических клеток.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Савочкина Л.П., Скрыпина Н.А., Тимофеева А.В.. Бибилашвили Р.Ш. Количественное определение малых концентраций кДНК с использованием полимеразной цепной реакции и ампликона в качестве внутреннего стандарта. //Молекулярная биология. - 1996.- т.ЗО - №4 - с.786-800.

2. А.В.Тимофеева. Н.А.Скрыпина, Л.П. Савочкина, Р.Ш.Бибилашвили, Метод количественного анализа короткоживущих РНК и продуктов их распада с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции. «Молекулярная биология», 2000, т.34, №1, с. 79-86. A.V. Timofeeva, N. A. Skrypina, L. P. Savochkina, and R. Sh.Beabealashvilli, Quantitative RT-PCR Analysis of Short-lived RNAs and Their Decay Products, Molecular Biology 2000, Vol. 34, No. 1, p. 66 - 73)

3. Timofeeva, A.V. Skrypina, N.A., Background Activity of Reverse Transcriptases, BioTechniques, 2001, 30:22-28

4. Skrypina NA, Timofeeva AV, Khaspekov GL, Savochkina LP, Beabealashvilli RSh. Total RNA suitable for molecular biology analysis. J Biotechnol. 2003 Oct 9; 105( 1 -2): 1 -9.

5. AV Timofeeva. LE Goryunova, GL Khaspekov, DA Kovalevskii, AV Skamrov, OS Bulkina, YuA Karpov, KA Talitskii, VV Buza, VV Britareva, RShBeabealashvilli. Altered gene expression pattern in peripheral blood leukocytes from patients with arterial hypertension. AnnN Y Acad Sci. 2006, 1091:319-335.

6. A.B. Тимофеева, Л.Е. Горюнова, ГЛ.Хаспеков, Д.А.Ковалевский, А.В.Скамров, О.С.Булкина, К.А.Талицкий, Ю.А.Карпов, Р.Ш.Бибилашвили «Фармакогенетика, фармакогеномика в свете проблем, связанных с эссенциальной артериальной гипертонией». Кардиологический вестник. Бюллетень Российского кардиологического научно-производственного комплекса, том II (XIV), №1, 2007, стр. 5-12.

7. А.В. Тимофеева. Л.Е. Горюнова, Г.Л.Хаспеков, О.П. Ильинская, В.Н. Сироткин, Е.Р. Андреева, Э.М. Тарарак, О.С. Булкина, Ю.А. Карпов, P.III. Бибилашвили. Сравнительный анализ транскриптомов атеросклеротических поражений аорты человека и лейкоцитов периферической крови больных эссенциальной гипертензией. Кардиология (в печати).

8. A.Timofeeva, L. Savochkina and R.Bibilashvili "A novel approach to study the decay process of short-lived mRNA", Abstracts of poster presentations at FEBS advanced course on RNA biochemistry and biotechnology, Poznan, Poland, October 10-17, 1998.

9. AV Timofeeva. LE Goryunova, GL Khaspekov, DA Kovalevskii, AV Skamrov, OS Bulkina, RShBeabealashvilli. Gene expression profiling in peripheral blood leukocytes from

patients with arterial hypertension, Abstracts of poster presentations at European Conference "Cell signaling world 2006. Signal transduction pathways as therapeutic targets, Luxembourg, January 25-28, 2006, page 456

10. Тимофеева AB. Бибилащвили P.III. «Анализ экспрессии генов в лейкоцитах периферической крови больных артериальной гипертензией», Тезисы стендового сообщения на Московской международной конференции «Биотехнология и медицина», Москва, 14-17 марта 2006. стр. 175 материалов конференции.

11. Тимофеева А.В.. Горюнова JI.E., Хаспеков Г.Л., Сироткин В.Н., Бибилашвили Р.Ш., Ильинская О.П., Сироткин В.Н., Тарарак Э.М. «Экспрессия генов в интиме аорты человека на разных стадиях атеросклеротического поражеиия».Тезисы конференции «Перспективы кардиологии в свете достижений медицинской науки»,

17-18 мая 2007г, Москва, ФГУ Российский кардиологический научно-производственный комплекс Росмедтехнологий. Раздел 10 «Генетика и фармакогенетика сердечно-сосудистых заболеваний. Клеточные технологии в кардиологии».

12. A. Timofeeva. L. Goryunova, G. Khaspekov, О. Ilyinskaya, V. Sirotkin, E. Tararak, R. Beabealahvilli. Human aorta transcriptome profiles of different atherosclerotic lesions types. Abstracts of poster presentations at World Congress of Cardiology BuenosAires, Argentina

18-21 May, 2008; Circulation 2008, Vol 117, No 19, May 13, P862

Список сокращений:

ОТ - обратная транскрипция ПЦР - полимеразная цепная реакция АГ - артериальная гипертензия ГБ - гипертоническая болезнь AT - атеросклероз

АТП - атеросклеротические поражения

ГМК - гладкомышечные клетки

ЛПК - лейкоциты периферической крови

уН - условная норма

all - абсолютная норма

ДИУ - диффузное интимальное утолщение

ЛП - липидная полоса

ФА - фиброатерома

ФБ - фиброзная бляшка

оФА - осложненная фиброатерома

окЛПНП - окисленные липопротеины низкой плотности

РФК - реактивные формы кислорода

Подписано в печать: 10.12.2008

Заказ № 1370 Тираж -120 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Тимофеева, Анжелика Владимировна

Введение.

Глава I. Обзор литературы.

1.1. АГ и структурные изменения сосудистой стенки.

1.1.1. Нормальная структура артериальной стенки.

1.1.2. Пролиферация и апоптоз ГМК сосудов при АГ.

1.1.3. Межклеточный фиброз сосудов при АГ.

1.1.4. Формирование очагов воспаления в сосудах при АГ.

1.2. Морфологические изменения сосудистой стенки во время атерогенеза.

1.3. Теории патогенеза AT.

1.3.1. Липопротеидная теория.

1.3.2. Теория «реакция на повреждение».

1.3.3. Моноклональная теория.

1.3.4. Иммунная теория.

1.3.4.а. Инициаторы иммунного ответа в АТП.

1.3.4.Ь. Врожденный иммунный ответ при атерогенезе.

1.3.4 Адаптивный иммунный ответ при атерогенезе.

1.4. Экспрессия основных генов-участников атерогенеза.

1.4.1. Гены, влияющие на метаболизм липидов в артериальной стенке.

1.4.2. Молекулы адгезии.

1.4.3. Ростовые факторы.

1.4.4. Цитокины и хемокины.

1.4.5. Матриксные металлопротеиназы.

1.4.6. Оксид азота.

1.4.7. Система окисления/антиокисления в сосудах человека.

1.4.8. Транскрипционные факторы.

1.5. Изучение профиля генетического транскриптома при AT.

1.5.1. Исследование атерогенеза методами DD и SAGE.

1.5.2. Исследование атерогенеза с использованием ДНК-микрочипов.

1.5.2а. Исследование атерогенеза на клеточных моделях.

1.5.2Ь. Исследования атерогенеза на животных моделях.

I.5.2с. Исследование атерогенеза у человека.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ экспрессии генов в атеросклеротических поражениях аорты человека и в лейкоцитах периферической крови больных эссенциальной гипертензией"

Сердечно-сосудистые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смертности населения промышленно развитых стран [Шевченко Ю, 1999; Гусев ЕИ, 2006; Williams В, 2006], поэтому профилактика и лечение болезней системы кровообращения являются важнейшими задачами современной медицины. Подбор лекарственной терапии с целью предупреждения развития ССЗ и их осложнений в настоящее время основан на оценке эффективности устранения факторов риска ССЗ [Органов РГ, 1999]. Для понимания основ взаимосвязи факторов риска и ССЗ необходимо иметь полное представление о патогенетических механизмах данных заболеваний.

В основе развития таких ССЗ как ишемическая болезнь сердца, инфаркт миокарда, мозговой инсульт и заболевание периферических сосудов лежит атеросклероз (AT). Массовый характер распространения AT у населения большинства стран, начало развития заболевания задолго до клинических его проявлений, несомненная зависимость его развития от многих ССЗ факторов риска - все это определяет целесообразность проведения исследований на молекулярном уровне как самого заболевания, так и факторов, к нему предрасполагающих.

По современным представлениям AT является результатом хронического воспалительного процесса в артериальной стенке, обусловленного иммунными реакциями с участием мигрирующих из кровотока моноцитов, дифференцирующихся в макрофаги и дендритные клетки, и лимфоцитов [Ross

R, 1999; Hansson GK, 2005]. В настоящее время полагают, что одним из 6 основных факторов риска возникновения AT является артериальная гипертензия (АГ) [Alexander RW, 1995; Жданов ВС, 2002; Sasamura Н, 2005]. Известно, что такие вазоактивные молекулы, как катехоламины, ангиотензин II и эндотелии-1, выбрасываемые в кровь в повышенных количествах при АГ, как и само по себе повышение артериального давления вызывают структурные изменения сосудистой стенки через активацию сигнальных путей, вовлеченных в регуляцию роста и пролиферации гладкомышечных клеток (ГМК), в процессы воспаления и апоптоза [Olsen МН, 2002; Plante GE, 2002; Dao НН, 2001; Van Zwieten PA, 2000; Shaw А и Xu Q, 2003; Lu H, 2007]. Было показано, что те же самые факторы (химические и механические) воздействуют не только на стенку сосуда, но и на клетки циркулирующей крови [Stevenson JR, 2001; Hahn AW, 1994; Ohki R, 2002; Smedly LA, 1986], что приводит к активации лейкоцитов, продукции ими активных форм кислорода и инициации неспецифического воспаления в сосудистой стенке. Таким образом, анализ экспрессии генов лейкоцитов периферической крови (ЛПК) больных АГ может указать на особенности лейкоцитарного микроокружения и быть использован как для оценки тяжести течения заболевания, так и в качестве способа мониторирования эффективности лекарственной терапии, направленной на предупреждение развития осложнений при АГ.

Использование олиго- или кДНК-микрочипов дает возможность оценить количественные изменения в уровне нескольких сотен и даже тысяч индивидуальных мРНК одновременно. Это позволяет, с одной стороны, провести поиск новых генов-участников патологического процесса в дополнение к уже выявленным и достаточно изученным генам, а с другой -дать предположительную оценку их функциональной взаимосвязи по общности изменения профиля экспрессии этих генов при данной патологии.

В течение последних десятилетий олиго- и кДНК-микрочипы активно используются с целью изучения патогенетических механизмов возникновения и развития как АГ, так и AT. Так, например, при изучении транскриптома лейкоцитов крови больных эссенциальной гипертензией (ЭГ) было отмечено изменение активности 680 генов, в том числе 10-ти цитокиновых генов, 4 генов рецепторов серотонина, гена рецептора ангиотензина II и гена эндотелинпревращающего фермента [Chon Н, 2004], хотя достоверность полученных данных сложно было оценить ввиду использования авторами работы пулированных образцов. При исследовании AT на животных моделях и клеточных культурах была выявлена роль атерогенных стимулов (окЛПНП, гомоцистеина, цитокинов воспаления, механического стресса) в регуляции липидного метаболизма, межклеточных взаимодействий, воспаления и ремоделирования внеклеточного матрикса [Shiffman D, 2000; Li Н, 2002; Mikita Т, 2001; Ohura N, 2003]. Результаты анализа различных типов атеросклеротических поражений (АТП) коронарных артерий человека показали, что важным процессом в формировании атеросклеротической бляшки является изменение экспрессии генов, отвечающих за дифференцировку ГМК [King JY, 2005]. Исследование транскриптома образцов грудного отдела аорты человека выявило списки дифференциально экспрессирующихся генов, характеризующих определенный гистологический тип АТП [Seo D, 2004]. 8

Результатом сравнительного анализа стабильных и склонных к разрушению атеросклеротических бляшек было выявление нарушений регуляции синтеза внеклеточного матрикса и метаболизма липидов [Faber ВС, 2001], а также повышенного уровеня экспрессии медиаторов апоптоза в ГМК [Martinet et al., 2002].

Несмотря на активное изучение патогенетических механизмов возникновения AT и АГ, до сих пор остаются невыясненными молекулярные механизмы взаимосвязи данных заболеваний, доказанной наличием сходных, структурных изменений в сосудистой стенке в виде дисфункции эндотелия, лейкоцитарной инфильтрации, миграции и пролиферации ГМК, а также повышенного образования соединительно-тканного матрикса. В связи с этим, целью настоящей работы было проведение сравнительного анализа экспрессии генов с использованием кДНК-микрочиповой технологии и обратной транскрипции, сопряженной с полимеразной цепной реакцией, (ОТ-ПЦР) не только в разных типах АТП брюшного отдела аорты человека, включая ранние, выраженные и осложненные типы поражений, относительно макро- и микроскопически нормальных участков аорты, но и сопоставление полученных данных с результатами анализа профилей экспрессии в ЛПК больных ЭГ и здоровых доноров.

Поскольку достоверность и воспроизводимость результатов анализа транскриптома клеток с применением кДНК-микрочиповой технологии и ОТ

ПЦР, в основном, зависят от, качества исследуемого образца суммарной РНК и свойств используемой обратной транскриптазы - её процессивности и 9 специфичности, представлялось целесообразным проанализировать влияние степени распада суммарной РНК и условий проведения реакции обратной транскрипции (ОТ) на результаты количественного анализа экспрессии генов.

Таким образом, для достижения намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Проанализировать влияние качества суммарной РНК и условий проведения реакции ОТ на результаты количественного анализа экспрессии генов на основе кДНК-микрочиповой технологии и метода ОТ-ПЦР.

2. Используя метод гибридизации радиоактивно меченой кДНК, синтезированной в ходе ОТ на образцах суммарной РНК, с кДНК-микрочипами фирмы Clontech, получить и проанализировать профили генной экспрессии: а) ЛПК от пациентов, страдающих ЭГ, и здоровых доноров; б) образцов интимы брюшного отдела аорты человека, полученных из разных гистологических типов АТП.

3. Проверить данные кДНК-микрочипов методами ОТ-ПЦР и иммуногистохимии.

4. Провести кластерный и корреляционный анализы полученных данных с целью выявления степени взаимосвязи между характером экспрессии генов и клиническими (или морфологическими) признаками исследуемых заболеваний - ЭГ и AT аорты.

5. Сделать сравнительный анализ списков генов с дифференциальной экспрессией в ЛПК больных ЭГ и в АТП аорты человека с целью идентификации общих генов-участников двух заболеваний.

6. Провести функциональную оценку выявленных групп генов с точки зрения возможного их участия в процессах ремоделировании сосудистой стенки.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Тимофеева, Анжелика Владимировна

ВЫВОДЫ:

1. Отработаны условия проведения ОТ для получения достоверных количественных данных при использовании кДНК-микрочиповой технологии и ОТ-ПЦР: выявлен диапазон пределов качества суммарной РНК, подобрана концентрация обратной транскриптазы, температура реакции и состав реакционной смеси для обеспечения специфичного праймер-зависимого синтеза к ДНК.

2. Методом кДНК-микрочиповой технологии и последующей верификацией данных методом количественной ОТ-ПЦР обнаружены достоверные различия в уровне экспрессии 40 из 2940 исследованных генов в аутопсийных образцах ранних (ЛП), выраженных (ФА, ФБ) и осложненных оФА) АТП аорты человека по сравнению с нормальной тканью аорты.

Обнаружена дифференциальная экспрессия не только генов, чья роль в атерогенезе уже была продемонстрирована другими исследователями, но и получен список новых генов-участников атерогенеза - FPRL2, CD37, CD53,

RGS1, LCP1, SPI1, CTSA, EPAS1, FHL1, GEM, RHOB, SPARCL1, ITGA8, PLN, и COL14A1, вовлеченных в процессы клеточной миграции и адгезии, фенотипические изменения ГМК, иммунные и воспалительные реакции, окислительные процессы и пространственную организацию компонентов

196 внеклеточного матрикса. Выявленные нами изменения экспрессии генов укладываются в современные представления сосудистого ремоделирования при атерогенезе.

3. Среди обнаруженных нами 40 генов с измененным уровнем транскрипции - 17 генов с повышенной и 15 генов со сниженной экспрессией в атеросклеротически измененной аорте статистически значимо (р<0,0001) коррелировали с тяжестью АТП (коэффициент корреляции по Спирману больше 0,5). Основные изменения в уровне экспрессии этих генов обнаружены в ЛП с увеличением степени их выраженности в ФА без последующих, значительных изменений в ФБ и оФА. Однако для генов, демонстрирующих сниженную экспрессию в АТП, наблюдалось усугубление эффекта падения уровня их экспрессии в оФА по сравнению с другими АТП.

4. Методом кДНК-микрочиповой технологии и количественной ОТ-ПЦР обнаружены достоверные различия в уровне экспрессии 35 из 2352 исследованных генов в лейкоцитах больных ГБ. Выявленные гены с измененной экспрессией кодируют белки, участвующие в апоптозе клеток, воспалительных и иммунных реакциях, направленной миграции и адгезии, контроле пролиферации и дифференцировки клетки, внутриклеточном транспорте, клеточном стрессе, катаболизме гликозаминогликанов, поддержании окислительно-восстановительного равновесия в клетке, регуляции транскрипции и трансляции.

5. При сравнительном анализе транскриптомов АТП аорты человека и ЛПК больных ГБ обнаружены однонаправленные изменения экспрессии генов CD53,

197

SPI1, FPRL2, SPP1, CTSD, ACP5, LCP1, CTSA и LIPA, и противонаправленные изменения экспрессии генов CXCR4 и RGS1 генов. Для генов CD53, SPI1, FPRL2, SPP1, CTSD и АСР5 выявлена достоверная (р<0.005) положительная (г>0.5) корреляция как со стадией ГБ, так и со степенью тяжести атеросклеротического процесса в сосудистой стенке.

6. Методом иммуногистохимического анализа нормальных и атеросклеротических сегментов аорты человека обнаружено значительное повышение уровня экспрессии тетраспанина CD53 в антиген-презентирующих клетках моноцитарного происхождения, в том числе пенистых клетках, являющихся главными участниками атерогенеза.

7. Продемонстрирована тенденция к нормализации транскрипционной активности дифференциально экспрессирующихся генов, в том числе тетраспанина CD53, в ЛПК больных ГБ под действием лекарственной терапии амлодипином.

8. Сформулирована гипотеза о молекулярных механизмах предрасположенности больных ГБ к развитию АТП сосудистой стенки. Ключевая роль в этих процессах отводится тетраспанину CD53 как участнику не только процессов клеточной адгезии и иммунных реакций, но и регулятору клеточности в атеросклеротической бляшке посредством влияния на пролиферативный ответ и апоптотические процессы гематопоэтических клеток.

1.6. Заключение

Как следует из описанных выше литературных данных, основная часть исследований молекулярных механизмов развития AT и АГ, как одного из основных факторов риска возникновения и дальнейшего прогрессирования AT, проведена на клеточных культурах и животных моделях. С использованием разнообразных биохимических и молекулярно-биологических методов было обнаружено, что действие различных атерогенных факторов, в основном, опосредуется через изменения пространственной организации и качественного состава компонентов ВКМ, межклеточных взаимодействий и метаболизма липидов, смены клеточного фенотипа ГМК и активации процессов воспаления.

Высказано множество гипотез и концепций патогенеза AT, по сути не взаимоисключающих, а взаимодополняющих друг друга. В возникновении

АТП сосудов доказана роль огромного числа генов, кодирующих ферменты липидного метаболизма клетки, молекулы адгезии и ростовые факторы,

77 регулирующие миграцию, пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток, цитокины и хемокины, участвующие в воспалительных и иммунных реакциях.

Одним из перспективных направлений в изучении патогенетических механизмов возникновения AT и АГ является на данный момент использование олиго- и кДНК-микрочиповой технологии, позволяющей оценить количественные изменения в уровне экспрессии нескольких сотен и даже тысяч генов одновременно. В каждом эксперименте по использованию ДНК-микрочипов в изучении AT и АГ получены списки из нескольких сотен дифференциально экспрессирующихся генов. Несмотря на то, что эти данные подвергали статистической обработке, функциональной классификации или кластерному анализу по схожести профилей экспрессии генов в сравниваемых образцах, такие данные сложно интерпретировать, поскольку зачастую анализ проводили на ограниченном количестве образцов, а специфичность и воспроизводимость результатов ДНК-микрочипов не проверялась в полном объеме другими альтернативными методами. Более того, АГ и AT исследуются как два независимых заболевания без попыток выявления общих биомаркеров с целью выяснения возможных причин схожести структурного ремоделирования сосудистой стенки, характерного для данных патологий. Поэтому мы посчитали необходимым и актуальным проведение сравнительного анализа транскриптома АТП разных гистологических типов из аорты человека и транскриптома ЛПК больных ЭГ с целью поиска новых генов-участников атерогенеза, а также возможных причин высокой предрасположенности больных АГ к развитию АТП сосудистой стенки.

Глава II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ LL.1. Образцы лейкоцитов крови.

В исследование были включены 10 доноров в возрасте 24-50 лет без вредных привычек и сердечно-сосудистой патологии и 20 больных ЭГ в возрасте 39-70 лет (табл. III.6). У 2 больных АГ носила транзиторный характер (ГБ I стадии), у 7 была II стадия ГБ, у 11 больных - III стадия ГБ. На момент взятия крови 7 больных не получали антигипертензивную терапию, остальные 13 принимали либо валсартан - блокатор рецепторов ангиотензина II, либо амлодипин - блокатор кальциевых каналов. Уровень лейкоцитов и лейкоцитарная формула крови у всех пациентов были в пределах нормы. Отличия среди пациентов заключались в уровне глюкозы, общего холестерина и креатинина в сыворотке крови с превышением нормальных показателей у ряда больных.

Осуществляли забор венозной крови в количестве 6 мл утром натощак и собирали ее в пробирки Vacuette, содержащие 3,8 % цитрат натрия. Проводили выделение суммарной фракции лейкоцитов в несколько этапов:

1) отделение плазмы от форменных элементов центрифугированием на центрифуге TJ-6 (BECKMAN) при 1400 грш в течение 30 минут;

2) добавление 45 мл лизирующего эритроциты буфера (155 мМ хлорида аммония, 10 мМ КНС03, 1 мМ ЭДТА) к 5 мл суспензии клеток с последующей инкубацией во льду в течение 10 мин с периодическим встряхиванием лизата;

3) осаждение лейкоцитов центрифугированием на центрифуге TJ-6 (BECKMAN) при 1400rpm в течение 15 минут;

4) ресуспендирование осадка в 20 мл раствора PBS с 0,1 мМ ЭДТА с последующим центрифугированием на центрифуге TJ-6 (BECKMAN) при 1400rpm в течение 15 минут;

5) ресуспендирование осадка в растворе PBS с 0,1 мМ ЭДТА с последующим центрифугированием на центрифуге Eppendorf при 2000 rpm в течение 2 мин. Супернатант удаляли, а осадок замораживали в жидком азоте и хранили при —70°С до выделения РНК.

II.2. Получение и характеристика аутопсийного материала брюшного отдела аорты человека

В работе был использован аутопсийный материал 53 фрагментов брюшных аорт 23 мужчин и 6 женщин в возрасте 24-94 лет, полученных не позднее 6 часов с момента констатации смерти при проведении судмедэкспертизы. Одна часть фрагмента аорты была использована для гистологического анализа, другая часть фрагмента аорты, предназначенная для анализа на кДНК-эрреях и количественной ОТ-ПЦР, была отделена от медии и адвентиции, и полученные образцы интимы аорт замораживали в житком азоте и хранили при -80°С. Для морфологического изучения аутопсийного материала аорт были приготовлены срезы толщиной 7 мкм на криостате, нанесенные на стекла с поли-Ь-лизином, и фиксированы в

80

4% формальдегиде на изотоническом фосфатном буфере. После окрашивания срезов жировым красным и гематоксилином/эозином была проведена идентификация образцов (табл. III.2) нормальных участков аорты и АТП с использованием классификации, предложенной Гербертом Стари [Stary НС, 1995]. Опытную группу составили 8 липидных полос (ЛП, II и III типы поражений), 11 фиброатером (ФА, Va тип поражения), 5 фиброзных бляшек (ФБ, Vc тип поражения), 4 осложненные фиброатеромы (оФА, Via и VIb типы поражений) и 17 макроскопически нормальных сегментов из пораженной атеросклерозом аорты (условная норма, уН, среди которых - 4 образца без начальных признаков атеросклероза, 3 диффузных интимальных утолщения и 10 образцов I типа поражения). Контрольную группу составили 10 образцов макроскопически нормальных сегментов из непораженной атеросклерозом аорты (абсолютная норма, аН).

1.3. Выделение суммарной РНК из лейкоцитов периферической крови человека и из образцов интимы аорты человека.

1. К каждому образцу ткани (либо лейкоцитарной массе, полученной как описано в разделе 2.1, либо интиме аорты весом 0,35-0,50 г) добавляли по 400 мкл 1х денатурирующего буфера (2,7 М гуанидин тиоцианат; 1,3 М аммония тиоцианат; 100 мМ натрия ацетат, рН 4,0; 5 мМ ЭДТА рН 8,0; 0,8 % p-меркаптоэтанол). Образец гомогенизировали с помощью гомогенизатора

Ultraturrax» до полного ресуспендирования ткани.

81

2. Немедленно к гомогенату добавляли 950 мкл закисленной фенольной смеси (Фенол 60%, Глицерин 8%, 100 мМ Натрия ацетат, рН 4.0) и интенсивно встряхивали на вортексе в течение 1 минуты, центрифугировали 1 мин. (+4°С, 15000 rpm) в центрифуге «Eppendorf 5410».

3. К образцам добавляли 300 мкл хлороформа, пробирки интенсивно встряхивали в течение 1-2 минут, инкубировали 10 минут на льду, центрифугировали 15 минут при +4°С, 15,000 rpm, торможение медленное) в центрифуге «Eppendorf 5410».

4. Верхнюю фазу переносили в новые пробирки, добавляли равный объем изопропанола, пробирку интенсивно встряхивали и инкубировали на льду 10 мин, центрифугировали 30 минут при +4°С, 15,000 rpm, торможение медленное) в центрифуге «Eppendorf 5410».

5. Изопропанол отбирали, осадки отмывали два раза 1500 мкл 80% этанола с последующим центрифугированием в течение 5 мин. (+4°С, 15000 rpm, торможение медленное) в центрифуге «Eppendorf 5410».

6. Этанол тщательно отбирали, осадки растворяли в 120 мкл деионизованной воды. К образцам добавляли 1,2 мкл ингибитора РНКаз (6 мг/мл, «Техноген»), 13,5 мкл 10х ДНКазного буфера (0,2 М трис-HCL, 0,1 М MgCL2, 5 мМ CaCL2), 1 мкл ДНКазы I (10 ед/мкл DNase I, RNase-free, «Roche Diagnostics Corporation») и 0,5 мкл экзонуклеазы I (20000 ед/мл Exo I, «New England BioLabsInc»). Образцы инкубировали на шейкере 30 минут при 37°С.

7. К образцам добавляли 265 мкл 1,5х денатурирующего буфера (4,1 М гуанидин тиоцианат; 2 М аммония тиоцианат; 150 мМ натрия ацетат, рН 4,0; 7,5 мМ ЭДТА рН 8,0; 1,25 % (З-меркаптоэтанол), 950 мкл закисленной фенольной смеси, 300 мкл хлороформа и центрифугировали 15 мин. (+4°С, 14,000 rpm, торможение медленное) в центрифуге «Eppendorf 5410».

8. Повторяли пункты 4 и 5 протокола.

9. Этанол тщательно отбирали, осадки растворяли в 15 мкл деионизованной воды

10.Концентрацию суммарной РНК определяли спектрофотометрически при 260 нм

11.4. Проверка качества выделенной суммарной РНК.

Целостность РНК оценивали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле с денатурацией формальдегидом [Т. Маниатис, 1984] по соотношению интенсивностей полос в геле, соответствующих 28S и 18S рРНК. Данные соотношения были не менее 1,0, характеризующие пригодность образцов суммарной РНК к исследованию молекулярно-биологическими методами с использованием кДНК-микрочипов и ОТ-ПЦР.

Степень загрязненности образцов суммарной РНК геномной ДНК оценивали методом ПЦР (пункт 11.10). В качестве матрицы для ПЦР использовали аликвоту образца суммарной РНК и взятую в разных разведениях геномную ДНК из сердца человека с известной концентрацией. В ПЦР использовали праймеры к HLA-антигену I класса, локусу С: смысловой праймер: 5'-GCAAGGATTACATCGCCCTGAACGAG-3\ антисмысловой праймер: 5'-CATCATAGCGGTGACCACAGCTCCAA-3'. Результаты ПЦР оценивали электрофорезом в 1%-ном агарозном геле, окрашенном 0,002% раствором бромистого этидия, по наличию продукта амплификации длиной 1274 п.о. (пункт 11.11). В дальнейшую работу брали образцы суммарной РНК, в которых примесь геномной ДНК составляла не более 0.01%.

II.5. Приготовление кДНК-зондов для гибридизации с кДНК-микрочипами.

Проводили реакцию обратной транскрипции 2 мкг суммарной РНК, выделенной из образцов лейкоцитов периферической крови человека или из образцов интимы аорты человека, в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl буфер, рН 8,3, 75 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 2,5 мкМ случайные девятинуклеотидные праймеры («Биосан», Новосибирск),

500 мкМ каждый из дезоксинуклеозидтрифосфатов (дГТФ, дЦТФ, дТТФ),

5мкМ дАТФ, 50 мкКи [а - 32Р]дАТФ (4000 Ки/ммоль, ФГУП «Институт реакторных материалов», Россия), 5мМ дитиотрейтол; 0.3 мкг обратной транскриптазы из вируса лейкемии мышей Молони (MMLV) («Техноген»,

Россия). Реакцию вели в течение 1 часа при температуре 37°С и останавливали добавлением 1 мкл 0,1 М ЭДТА, рН 8,0. Полученные

84 образцы радиоактивно меченых кДНК-зондов очищали от свободного [а

32

Р]дАТФ методом гель-фильтрации на сефадексе G-50 fine в хроматографической колонке объемом 300 мкл. К очищенным образцам кДНК-зондов (200 мкл, 2 х 106 - 2 х 106 ерш) добавляли 1/10 объема (22 мкл) 10х денатурирующего раствора (1М NaOH, 10 мМ ЭДТА) и инкубировали 20 минут при 68 °С. Затем добавляли равный объем (225 мкл) 1 М NaH2P04 (рН 7,0) и продолжали инкубацию при 68 °С в течение 10 минут. По окончании инкубации кДНК-зонды добавляли в раствор для гибридизации с транскрипционной матрицей.

II.6. Гибридизация кДНК-зондов с кДНК-микрочипами

Проводили предварительную инкубацию кДНК-микрочипов фирмы

Clontech Laboratories, Inc. (Human 1.2 Array I, Human 1.2 Array II и Human

Cardiovascular Array, Palo Alto, CA) в шейкере (Amersham pharmacia biotech) при 42°C в течение 2 часов в 3 мл раствора, содержащем 50%-ный формамид «Sigma», 6-кратный солевой раствор SSPE, 5-кратный раствор

Денхардта, 0,2% додецилсульфат натрия, 2 мг/мл гепарина и 0,5 мг/мл денатурированной ДНК спермы сельди. Затем добавляли образец кДНКзонда и инкубировали в шейкере в течение 12-15 часов при 42 °С. После инкубации проводили двукратную отмывку кДНК-микрочипов в 2х SSPE с добавленным 0,5% додецилсульфатом натрия в течение 20 минут при 42

С; двукратную отмывку в 2х SSPE, 0,5% додецилсульфат натрия в течение 20 минут при 65 °С; двукратную отмывку в 0,2х SSPE, 0,5% SDS в

85 течение 20 минут при 65 °С. После гибридизации и отмывки кДНК-микрочипы экспонировали в кассете с экраном в течение 3-7 суток и сканировали в системе Phosphorlmager SI (Molecular Dynamics, USA) и полученные изображения отцифровывали с помощью программы Atlaslmage 2.01 (Clontech).

II. 7. Математическая обработка гибридизационных данных.

Оцифрованные данные после вычитания фона подвергали предварительной нормировке на усредненную величину интенсивности сигналов мало варьирующих генов, включая гены «домашнего хозяйства». Список мало варьирующих генов (коэффициент вариации сигнала гена по всем образцам на кДНК-микрочипах одного типа - не выше 30 %) был получен путем исключения всех сигналов, уровень которых был ниже утроенной величины среднего значения фона, а также всех сигналов, уровень которых был выше утроенного значения медианы всех сигналов, превышающих утроенный средний фон.

Полученные таким образом данные повторно нормировали путем наложения кривых линейной регрессии. Для этого строили зависимости логарифмированных значений интенсивности сигналов для каждого гена на одном произвольно выбранном кДНК-микрочипе против соответствующих сигналов для другого кДНК-микрочипа. Варьируемыми параметрами служили аддитивный и мультипликативный факторы регрессии, эквивалентные по физическому смыслу вариации среднего фона кДНК-микрочипов и степени

86 чувствительности регистрации интенсивности сигнала на разных кДНК-микрочипах. Оптимизацию коэффициентов регрессии проводили по методу наименьших квадратов.

Список дифференциально экспрессирующихся генов был сформирован при построении диаграмм рассеяния нормированных данных, полученных на кДНК-микрочипах одного типа, в виде зависимости логарифмированных значений экспрессии всех генов в опытных образцах против контрольных образцов. Гены, значения уровней экспрессии которых располагались на диаграмме вне 95% доверительной области линии регрессии, рассматривались как вариабельные.

II. 8. ОТ

Проводили реакцию ОТ с использованием 1,5 мкг суммарной РНК в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ Трис-HCl буфер (рН 8,3), 75 мМ КС1, 5 мМ MgCl2, 2,5 мкМ случайные девятинуклеотидные праймеры («Биосан», Новосибирск), 1 мМ дНТФ (USB), 10 мМ дитиотрейтол; 0,3 мкг обратной транскриптазы из вируса лейкемии мышей Молони (MMLV) («Техноген», Россия). Реакцию вели в течение 60 мин при 37°С и останавливали повышением температуры реакционной смеси до 95°С и инкубацией в течение 10 минут с последующим добавлением 80 мкл 1х ТЕ буфера (10 мМ Трис-HCl; 1 мМ ЭДТА, рН=8). Образцы кДНК хранили при температуре -20°С.

II. 9. ПЦР

ПЦР проводили в 15 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл кДНК (соответствовало 15 нг суммарной РНК), ЮмМ Трис-HCL (рН 8,5 при 25°С), 2 мМ MgCL2, 50мМ KCL, 10 мкг/мл желатины, 60 мМ хлорид тетраметиламмония (Fluka Chemie), 200 мкМ дНТФ (USB), по 1 мкМ прямого и обратного ген-специфических праймеров, 2,5 ед. Taq ДНК-полимеразы (Biomaster, Москва), 1 мкг антител "Taq Start" (Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA). К реакционной смеси добавляли 20 мкл минерального масла (Sigma). ПЦР проводили в амплификаторе - DNA Thermal Cycler (Hybaid). Программа амплификации: предварительная инкубация при 94°С - 5 мин., 13-35 циклов: 94°С - 30 сек., 60°С - 30 сек., 72°С - 40 сек. Дизайн ген-специфичных праймеров осуществляли с использованием следующих программ и баз данных: 1) программное обеспечение OU99 (Technogene, Москва), 2) Fasta34 (http://faculty.virginia.ed u/wrpearson/fasta), 3) Nucleotide blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi), 4) UniGene (http://www.ncbi.nlm.nih.,gov/sites/entrez?db=unigene).

Последовательность ген-специфичных праймеров, число циклов ПЦР, необходимое для получения продукта реакции в экспоненциальную фазу реакции, длина продукта ПЦР, название исследованных генов и идентификационные номера мРНК в базе данных UniGene представлены в табл.Ш.4 и III.9.

11.10. Анализ продуктов ПЦР

По окончании ПЦР отбирали 5 мкл реакционной смеси, смешивали с 3 мкл загрузочного раствора, содержащего 6,5 % Ficoll 400, 297 мМ Трис, 297 мМ Н3ВО3, 20 мМ ЭДТА, 0,024 % бромфеноловый синий, и наносили в

I,5% агарозный гель для проведения электрофореза в трис-боратном буфере (90мМ Трис; 90мМ НЗВОЗ; 6 мМ ЭДТА; рН 8,3), содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия. Интенсивность люминесценции продуктов ПЦР измеряли с помощью системы AlphalmagerTM (Alpha Innotech Corporation) и программного обеспечения ImageQuant.

II. 11. Приготовление внешнего ПЦР-стандарта

В качестве внешнего стандарта использовали продукт амплификации исследуемого гена, синтезированного в экспоненциальную фазу реакции. Концентрацию внешнего стандарта определяли путем сравнительного анализа интенсивности люминесценции полос, соответствующих стандарту и серийно разведенному ДНК-маркеру с известной концентрацией, после электрофоретического фракционирования данных образцов в 1,5% агарозном геле в Трис-боратном буфере, содержащем 1 мкг/мл бромистого этидия. Количества вещества в полосе определяли с помощью системы AlphalmagerTM (Alpha Innotech Corporation) и программного обеспечения ImageQuant.

11.12. Количественная ОТ-ПЦР с внешним стандартом.

Для количественной оценки исследуемых кДНК использовали серийно разведенный внешний стандарт. Диапазон концентраций внешнего стандарта по величине был сопоставим с определяемой концентрацией анализируемой кДНК и подбирался в предварительном эксперименте по одинаковому выходу продуктов ГТЦР, полученных на кДНК и внешнем стандарте. По 1 мкл образца кДНК и серийно разведенного внешнего стандарта было взято в ПТТР для независимой амплификации в одном эксперименте. Продукты амплификации, полученные в экспоненциальную фазу реакции, были проанализированы как указано в пункте 2.10. Уровни экспрессии генов вычисляли по калибровочным кривым зависимости выхода ПЦР-продукта от внесенного в реакцию количества внешнего стандарта. Данные по экспрессии генов были нормированы на геометрическое среднее уровней экспрессии генов «домашнего хозяйства» - АСТВ, TUBA1B и GAPDH. Для оценки статистической значимости различий опытных и контрольных образцов использовали непарный, двусторонний критерий Стьюдента, считая различия достоверными при р < 0,05.

11.13. Иммуногистохимическое окрашивание

Использован авидин-биотин иммунопероксидазный метод для иммуногистохимического окрашивания криостатных срезов аорт человека толщиной 7 мкм, нанесенных на стекла с поли-Ь-лизином, по следующей схеме:

1) фиксация срезов в 4% формальдегиде на PBS в течение 10 минут с последующей инкубацией срезов в растворе PBS в течение 10 минут и в 0,3 % бычьем сывороточном альбумине (БСА), приготовленном на PBS, в течение 1 минуты. Удалить лишнюю жидкость вокруг срезов.

2) добавление первичных мышиных моноклональных антител объемом 50 мкл непосредственно на срез: анти-С053 (BD Biosciences, каталожный номер 555506, разведение 1:200 в 1% БСА на PBS), анти-СБ45 (DakoCytomation, каталожный номер М0701; разведение 1:200 в 1% БСА на PBS) с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 1 часа во влажной камере и промыванием срезов в PBS (три смены по 3 минуты). В качестве отрицательного контроля использовать срез той же ткани, но вместо первичных антител на срез нанести 50 мкл 1% БСА на PBS.

3) блокирование эндогенной пероксидазной активности 0,3 % раствором перекиси водорода в метаноле (инкубация - 10 мин) с последущим промыванием срезов в PBS (три смены по 3 минуты) и инкубацией в 0,3 % БСА на PBS в течение 10 минут. Удалить лишнюю жидкость вокруг срезов.

4) добавление вторичных биотинилированных козьих антител против иммуноглобулинов мыши объемом 50 мкл непосредственно на срез (Amersham Life Science, каталожный номер RPN 1177; разведение 1:200 в 1% БСА на PBS) и инкубация при комнатной температуре в течение 30 минут. Промыть срезы в PBS (три смены по 3 минуты) и инкубировать в 0,3 % БСА на PBS в течение 10 минут. Удалить лишнюю жидкость вокруг срезов.

5) Добавление на срезы авидин-биотин-пероксидазного комплексаАВС-комплекса (ABC kit; Vector Laboratories, Burlingame, С А), приготовленного за 30 мин до использования. Инкубировать во влажной камере 30 минут, промыть срезы в PBS (три смены по 3 минуты) и инкубировать в 0,3 % БСА на PBS в течение 10 минут. Удалить лишнюю жидкость вокруг срезов.

6) выявление активности пероксидазы при добавлении к срезам раствора, содержащего 3,3'-диаминобензидин тетрахлорид (ДАБ) и перекись водорода (Sigma Chemical Со, каталожный номер D-4168) по образованию продукта коричнего цвета. Инкубировать в данном растворе 10 мин, промыть срезы проточной водой (три смены по 3 минуты) и дистиллированной водой (три смены по 3 минуты).

7) окрашивание ядер гематоксилином (Merck) в течение 30 мин. Промыть срезы дистиллированной водой (три смены по 3 минуты).

8) Заключить в бальзам Mowiol® (Aldrich, USA)

Для проведения двойного иммуногистохимического окрашивания необходимо выполнить пункты с 1 по 6, проинкубировать срезы в 0,3 % БСА на PBS в течение 10 минут, удалить лишнюю жидкость вокруг срезов и добавить мышиные антитела против человеческого CD206, конъюгированного с фикоэритрином (IOTest®, PN IM2741; разведение 1:5 в 1% БСА на PBS). Покрасить ядра раствором DAPI (200 ng/mL; Roche, Mannheim, Germany), приготовленном на PBS, в течение 10 мин при +4°С. Промыть дистиллированной водой и заключить в бальзам Mowiol® (Aldrich, USA). Анализ иммуногистохимических данных проводили с использованием микроскопа Leica DM5000B, оборудованного цифровой фотокамерой DFC420 (Leica Microsystems Wetzlar GmbH, Germany).

Глава III. РЕЗУЛЬТАТЫ III.1. Пригодность образцов суммарной РНК для анализа молекулярно-биологическими методами

Анализ транскриптома клеток с использованием кДНК-микрочиповой технологии и ОТ-ПЦР основан на проведении реакции ОТ суммарной РНК, выделенной из исследуемой ткани, и последующем количественном определении синтезированной кДНК либо путем гибридизации с кДНК-микрочипами, либо путем амплификации в ПЦР. Результаты такого рода анализа, в основном, зависят от качества образца суммарной РНК и свойств обратной транскриптазы (ревертазы) - её процессивности и специфичности. Качество суммарной РНК обычно оценивается по соотношению интенсивности флуоресценции полос, соответствующих 28S и 18S рибосомальным РНК, после электрофоретического разделения в денатурирующем агарозном геле. Считается, что это соотношение в интактной РНК равно 2:1. Не вполне ясен вопрос, обусловлено ли снижение соотношения интенсивностей полос рРНК в образцах суммарной РНК естественным распадом РНК в клетках постмортально, или разрушением ее под действием высвобождающихся нуклеаз в процессе выделения и очистки in vitro.

Целью настоящей работы было исследование транскриптома аутопсийного материала брюшного отдела аорты с АТП разных гистологических типов, а также ЛПК больных ЭГ. Известно, что для атероматозных поражений сосудов характерны некротические процессы в области образования липидного ядра. Поэтому выделить интактную суммарную РНК из атеросклеротически измененной аорты не представляется возможным. В связи с этим, перед проведением такого масштабного исследования, как поиск дифференциально экспрессирующихся генов с использованием кДНК-микрочипов и последующей проверкой полученных результатов методом ОТ-ПЦР, представлялось целесообразным проанализировать влияние качества суммарной РНК и условий проведения реакции ОТ на результаты количественного анализа экспрессии генов.

III. 1. а. Моделирование распада РНК

Можно предположить, что распад РНК происходит под суммарным воздействием различных рибонуклеаз равномерно по всей длине. Распад РНК вследствие постмортальных процессов в клетке или во время её выделения и очистки в условиях in vitro был смоделирован обработкой препарата суммарной РНК, выделенной из клеточной линии карциномы мочевого пузыря человека Т24Р, раствором хлорида магния (40 шМ) в нейтральном буфере (50 mM Tris-HCl, рН 7.6) при 37°С. Как было показано ранее, обработка ионами магния суммарной РЕПС катализирует неспецифичный гидролиз РНК [Barshevskaia, T.N., 1987]. После инкубации в течение 2, 4 и 6 часов реакцию останавливали добавлением ЭДТА (конечная концентрация

50 мМ), осаждали РНК 2.5 объемами этанола, осадок дважды промывали

80% этанолом, растворяли в воде и измеряли концентрацию РНК. Образцы деградированной и контрольной РНК подвергали денатурирующему

95 электрофорезу в агарозном геле для определения соотношения 28S и 18S полос рРНК, окрашенных бромистым этидием (Рис.Ш.1). t, часы: 0 2 4 6 28 S

18 S

Длительность инкубации Т24Р РНК с ионами магния, часы 28S/18S рРНК

0 1.9

2 1,3

4 0.67

6 0.39

Puc.IILL Электрофореграмма образцов суммарной Т24Р РНК, подвергнутых обработке ионами магния. Длительность инкубации (t) РНК с ионами магния указана вверху изображения.

Анализировали гель с помощью системы анализа изображения Alphalmiger 2000 (США). Соотношение интенсивностей 28S и 18S полос рРНК варьировало в пределах от 1,9 (в образце РНК, не обработанном хлоридом магния) до 0,39 (в образце РНК после шестичасового воздействия хлорида магния). В идеале данное отношение равно 2,69 и вычисляется по соотношению длин 28S и 18S рРНК (5025 и 1869 нуклеотидов, соответственно), взятых из базы данных ГенБанк (идентификационные номера рРНК - Ml 1167 и Х03205, соответственно).

IILl.b. Анализ изменений количеств индивидуальных мРНК методом ОТ-ПЦР в образцах суммарной Т24Р РНК с различным соотношением 28S и 18SpPHK.

Распад образца суммарной РНК, определяемый по изменению соотношения 28S и 18S рРНК, должен сказаться и на количественном измерении уровня анализируемых индивидуальных мРНК. Для количественной оценки мРНК в образцах суммарной Т24Р РНК, обработанных ионами магния в течение 0, 2, 4 и 6 часов (рис. III. 1),было отобрано 12 генов, кодирующих, в основном, белки раннего ответа на вне- и внутриклеточные стимулы (Табл.III. 1). Анализ проводился с помощью полуколичественной ОТ-ПЦР, причем амплифицируемые участки находились на разных расстояниях от 3'-конца мРНК - от 680 до 3727 оснований.

В пределах экспоненциального участка ПЦР для одной и той же пары праймеров количество продукта реакции пропорционально исходному количеству матрицы, что следует из уравнения: An = Ао(1+Ь)п, где Ап количество продукта реакции, Ао - исходное количество матрицы, b коэффициент эффективности реакции, п - число циклов реакции. Поэтому оценить соотношение количества исследуемых ДНК-матриц можно просто по соотношению продуктов, полученных после одинакового числа циклов амплификации - при условии нахождения на экспоненциальном участке

ПЦР. При проведении ПЦР отбирали несколько проб в условиях экспоненциального размножения матрицы (до стадии достижения «плато»)

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Тимофеева, Анжелика Владимировна, Москва

1. Андреева ЕР, Михайлова ИА, Пугач ИМ, Орехов АН. Клеточный состав атеросклеротических поражений аорты человека // Ангиология и сосудистая хирургия. 1999, № 5. - С. 6-26.

2. Анестиади В., Нагорнев В. Морфогенез атеросклероза. Кишинев, 1982.- 159-160с, 238-240с.

3. Гусев ЕИ, Скворцова ВИ, Мартынов МЮ, Камчатнов ПР. Церебральный инсульт: проблемы и решения // Вестник РГМУ. 2006, № 4. - С.28-32

4. Давыдовский ИВ. Атеросклероз как проблема возраста. Геронтология. -М., 1966. 204-219с.

5. Жданов B.C., A.M. Вихерт, Н.Г. Стернби. Эволюция и патология атеросклероза у человека. М., 2002

6. Зайко НН,. Ю. В. Быць, А. В. Атаман и др. /Патологическая физиология; Учебник/ К.: "Логос", 1996.

7. Климов АН., Синицына Т.А., Нагорнев В.А. Развитие идей НН Аничкова на современном этапе учения об атеросклерозе // Арх пат. -1975. -№11.-С. 3-16.

8. Ланкин ВЗ., Гуревич СН. Системы, ответственные за перекисное окисление полиеновых жирных кислот при экстремальном злокачественном росте. Липиды в организме животных и человека. -Под ред. СЕ Северина. М., - 1974. - 72-77с.

9. Маниатис Т., Методы генетической инженерии. Молекулярное клонирование, 1984, - 197-199с.

10. Оранов РГ. Профилактическая кардиология: от гипотез к практике. // Кардиология. 1999. - №39. - С. 4-9.

11. Соболева ЭЛ., Попкова ВМ. Гемопоэтические клетки-предшественники в интиме атероматозной аорты человека. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед. 1986. - №5. - С. 600-604.

12. Струков АИ, Серов ВВ, Патологическая анатомия. 1993, издание третье, - С. 277-284.

13. Чазов Е.И. Болезни сердца и сосудов. 1992, - Т. 2, С. 136-177.

14. Шевченко Ю, Щепин О, Смертность населения РФ в 1999 г. // Мед. Курьер.-2001,-С. 1-2.

15. Abi-Younes S, Sauty A, Mach F, Sukhova GK, Libby P, Luster AD. The stromal cell-derived factor-1 chemokine is a potent platelet agonist highly expressed in atherosclerotic plaques // Circ Res. 2000. - V. 86. - P. 131-8.

16. Agranovsky, A.A. Exogenous primer-independent cDNA synthesis with commercial reverse transcriptase preparations on plant virus RNA templates //Anal. Biochem. 1992.-Vol. 203.-P. 163-165.

17. Akgul C, Edwards SW. Regulation of neutrophil apoptosis via death receptors // Cell Mol Life Sci. 2003. - Vol. 60. - P. 2402-8.

18. Alexander RW. Theodore Cooper Memorial Lecture. Hypertension and the pathogenesis of atherosclerosis. Oxidative stress and the mediation of arterial inflammatory response: a new perspective // Hypertension. 1995. — Vol. 25.-P. 155-161.

19. Allali-Hassani A, Martinez SE, Peralba JM, Vaglenova J, Vidal F, Richart C, Farres J, Pares X. Alcohol dehydrogenase of human and rat blood vessels. Role in ethanol metabolism // FEBS Lett. 1997. - Vol. 405. -P.26-30.

20. Anger T, El-Chafchak J, Habib A, Stumpf C, Weyand M, Daniel WG, Hombach V, Hoeher M, Garlichs CD. Statins stimulate RGS-regulated ERK 1/2 activation in human calcified and stenotic aortic valves // Exp Mol Pathol.-2008.-Vol. 85.-P. 101-11.

21. Arai S, Shelton JM, Chen M, Bradley MN, Castrillo A, Bookout AL, Male PA, Edwards PA, Mangelsdorf DJ, Tontonoz P, Miyazaki T. A role for the apoptosis inhibitory factor AIM/Sp/Api6 in atherosclerosis development //

22. Cell Metabolism. 2005. - Vol. 1. - P.201-213.

23. Ashkar S, Weber GF, Panoutsakopoulou V, Sanchirico ME, Jansson M, Zawaideh S, Rittling SR, Denhardt DT, Glimcher MJ, Cantor H. Eta-1 (osteopontin): an early component of type-1 (cell-mediated) immunity // Science. -2000. Vol. 287. - P. 860-864.

24. Ashkenazi A, Dixit V. Death receptors: signaling and modulation // Science. 1998.-Vol. 281.-P. 305-8

25. Aslanian AM, Chapman HA, and Charo IF. Transient role for CD Id-restricted natural killer T cells in the formation of atherosclerotic lesions // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005. - Vol. 25. - P. 628-632.

26. Baird A, Durkin T.Inhibition of endothelial cell proliferation by type beta-transforming growth factor: interactions with acidic and basic fibroblast growth factors // Biochem Biophys Res Commun. 1986. - Vol. 138. — P. 476-82.

27. Bakri Y, Sarrazin S, Mayer UP, Tillmanns S, Nerlov C, Boned A, Sieweke MH. Balance of MafB and PU.l specifies alternative macrophage or dendritic cell fate // Blood. 2005. - Vol. 105. - P. 2707-16.

28. Baldus S, Eiserich JP, Mani A, Castro L, Figueroa M, Chumley P, Ma W, et al. Endothelial transcytosis of myeloperoxidase confers specificity to vascular ECM proteins as targets of tyrosine nitration // J Clin Invest. -2001.-Vol. 108.-P. 1759-1770 .

29. Barbier O, Torra IP, Duguay Y, Blanquart C, Fruchart JC, Glineur C, Staels B.Pleiotropic actions of peroxisome proliferator-activated receptors in lipid metabolism and atherosclerosis // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002. -Vol. 22.-P. 717-26.

30. Barshevskaia, T.N., Goriunova, L.E., Bibilashvili, R.S. Non-specific RNA degradation in the presence of divalent magnesium ions // Mol. Biol. 1987. -Vol. 21.-P. 1235-1241.

31. Bath PM, Hassall DG, Gladwin AM, Palmer RM, Martin JF. Nitric oxide and prostacyclin. Divergence of inhibitory effects on monocyte chemotaxis and adhesion to endothelium in vitro // Arterioscler Thromb. 1991. - Vol. 11.-P. 254-60.

32. Baumgarth N, Tung JW, and Herzenberg LA. Inherent specificities in natural antibodies: a key to immune defense against pathogen invasion // Springer Semin Immunopathol. 2005. - Vol. 26. - P. 347-362.

33. Bayes-Genis A, Conover CA, Schwartz RS. The insulin-like growth factor axis: A review of atherosclerosis and restenosis // Circ Res. 2000. - Vol. 86.-P. 125-30.

34. Beckman EM, Porcelli SA, Morita CT, Behar SM, Furlong ST, and Brenner MB. Recognition of a lipid antigen by CD 1-restricted alpha beta+ T cells // Nature. 1994.-Vol. 372.-P. 691-694.

35. Benditt EP and Benditt JM. Evidence for a monoclonal origin of human atherosclerotic plaque // Proc Natl Acad Sci. 1973. - Vol.70. - P. 17531756.

36. Bernstein, L.B., S.M. Mount and A.M. Weiner. Pseudogenes for human small nuclear RNA U3 appear to arise by integration of self-primed reverse transcripts of the RNA into new chromosomal sites // Cell. 1983. - Vol. 32.-P. 461-472.

37. Bevan RD. Effect of sympathetic denervation on smooth muscle cell proliferation in the growing rabbit ear artery // Circ Res. 1975. - Vol. 37. -P. 14-9.

38. Bevilacqua MP, Pober JS, Wheeler ME, Cotran RS, Gimbrone MA Jr. Interleukin-1 activation of vascular endothelium. Effects on procoagulant activity and leukocyte adhesion // Am J Pathol. 1985. - Vol. 121. - P. 394-403.

39. Biesiada E, Razandi M, Levin ER. Egr-1 activates basic fibroblast growth factor transcription. Mechanistic implications for astrocyte proliferation // J Biol Chem.- 1996.-Vol. 271.-P. 18576-81.

40. Bingley JA, Hay ward IP, Campbell JH, Campbell GR. Arterial heparan sulfate proteoglycans inhibit vascular smooth muscle cell proliferation and phenotype change in vitro and neointimal formation in vivo // J Vase Surg. -1998.-Vol. 28.-P. 308-18.

41. Bobik A, Grinpulcel S, Little PJ. et al. Angiotensin II and noradrenaline increase PDGF BB receptors and potentiate PDGF-BB stimulated DNA synthesis in vascular smooth muscle // Biochem Biophys Res Commun. -1990.-Vol. 166.-P. 580-8.

42. Bobryshev YV and Lord RS. Co-accumulation of dendritic cells and natural killer T cells within ruptureprone regions in human atherosclerotic plaques // J Histochem Cytochem. 2005a. - Vol. 53. - P. 781-785.

43. Bobryshev YV and Lord RS. Expression of heat shock protein-70 by dendritic cells in the arterial intima and its potential significance in atherogenesis // J Vase Surg. 2002. - Vol. 35. - P. 368-375.

44. Bobryshev YV and Lord RS. Identification of natural killer cells in human atherosclerotic plaque // Atherosclerosis. 2005b. - Vol. 180. - P. 423-427.

45. Bobryshev YV and Lord RS. Mapping of vascular dendritic cells in atherosclerotic arteries suggests their involvement in local immune-inflammatory reactions // Cardiovasc Res. 1998. - Vol. 37. - P. 799-810.

46. Bobryshev YV and Lord RS. S-100 positive cells in human arterial intima and in atherosclerotic lesions // Cardiovasc Res. 1995. - Vol.29. - P. 689696.

47. Bobryshev, Y.V., Cherian, S.M., Inder, S.J., Lord, R.S.A., Neovascular expression of VE-cadherin in human atherosclerotic arteries and its relation to intimal inflammation // Cardiovasc Res. 1999. - Vol. 43. - P. 10031017

48. Boisvert WA, Santiago R, Curtiss LK, Terkeltaub RA.A leukocyte homologue of the IL-8 receptor CXCR-2 mediates the accumulation of macrophages in atherosclerotic lesions of LDL receptor-deficient mice // J Clin Invest. 1998.-Vol. 101.-P. 353-63.

49. Boldt K, Rist W, Weiss SM, Weith A, Lenter MC. FPRL-1 induces modifications of migration-associated proteins in human neutrophils // Proteomics. 2006. - Vol. 6. - P. 4790-4799.

50. Boman J and Hammerschlag MR. Chlamydia pneumoniae and atherosclerosis: critical assessment of diagnostic methods and relevance to treatment studies // Clin Microbiol Rev. 2002. - Vol. 15. - P. 1-20.

51. Bonthron DT, Morton CC, Orkin SH, Collins T.Platelet-derived growth factor A chain: gene structure, chromosomal location, and basis for alternative mRNA splicing // Proc Natl Acad Sci USA.- 1988. Vol. 85. -P. 1492-6.

52. Bowman EP, Campbell JJ, Druey KM, Scheschonka A, Kehrl JH, Butcher EC.Regulation of chemotactic and proadhesive responses to chemoattractant receptors by RGS (regulator of G-protein signaling) family members // J Biol Chem.- 1998.-Vol. 273.-P. 28040-8.

53. Brand K, Page S, Rogler G, Bartsch A, Brandl R, Knuechel R, Page M, Kaltschmidt C, Baeuerle PA, Neumeier D. Activated transcription factor nuclear factor-kappa В is present in the atherosclerotic lesion // J Clin Invest. 1996. - Vol. 97. - P. 1715-22.

54. Branen L, Hovgaard L, Nitulescu M, Bengtsson E, Nilsson J, and Jovinge S. Inhibition of tumor necrosis factor-alpha reduces atherosclerosis in apolipoprotein E knockout mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004. -Vol. 24.-P. 2137-2142.

55. Brooks, E.M., L.G. Sheflin and S.W. Spaulding. Secondary structure in the. 3'UTR of EGF and the choice of reverse transcriptases affect the detection of message diversity by RT-PCR // BioTechniques. 1995. - Vol. 19. - P. 806-815.

56. Brown MS, Goldstein JL.Receptor-mediated endocytosis: insights from the lipoprotein receptor system // Proc Natl Acad Sci USA.- 1979. Vol. 76. -P. 3330-7. ~ -

57. Broxmeyer FIE, Orschell CM, Clapp DW, Hangoc G, Cooper S, Plett PA, et al. Rapid mobilization of murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with AMD3100, a CXCR4 antagonist // J Exp Med. 2005. -Vol. 201.-P. 1307-18.

58. Burke-Gaffney A, Brooks AV, Bogle RG. Regulation of chemokine expression in atherosclerosis // Vascul Pharmacol. 2002. - Vol. 38. - P. 283-92.

59. Cai H, Harrison DG. Endothelial dysfunction in cardiovascular diseases: the role of oxidant stress // Circ Res. 2000. - Vol. 87. - P. 840-4.

60. Caligiuri G, Nicoletti A, Poirier B, and Hansson GK. Protective immunity against atherosclerosis carried by В cells of hypercholesterolemic mice // J Clin Invest. 2002. - Vol. 109. - P. 745-753.

61. Caligiuri G, Rudling M, Ollivier V, Jacob MP, Michel JB, Hansson GK, and Nicoletti A. Interleukin-10 deficiency increases atherosclerosis, thrombosis, and low-density lipoproteins in apolipoprotein E knockout mice // Mol Med. -2003.-Vol. 9.-P. 10-17.

62. Camejo G, Hurt-Camejo E, Wiklund O, Bondjers G. Association of apo В lipoproteins with arterial proteoglycans: pathological significance and molecular basis // Atherosclerosis. 1998. - Vol. 139. - P. 205-22.

63. Cannon RO. Role of nitric oxide in cardiovascular disease: focus on the endothelium // Clin Chem. 1998. - Vol. 44. - P. 1809-1819.

64. Cattaruzza M, Dimigen C, Ehrenreich H, Hecker M. Stretch-induced endothelin В receptor-mediated apoptosis in vascular smooth muscle cells // FASEB J. 2000. - Vol. 14. - P. 991-998.

65. Celletti FL, Waugh JM, Amabile PG, et al. Vascular endothelial growth factor enhances atherosclerotic plaque progression // Nat Med. 2001. -Vol. 7.-P. 425—429.

66. Chang L, Karin M. Mammalian MAP kinase signalling cascades // Nature. -2001.-Vol. 410.-P. 37-40.

67. Chang MK, Binder С J, Miller YI, Subbanagounder G, Silverman GJ, Berliner JA, and Witztum JL. Apoptotic cells with oxidation-specific epitopes are immunogenic and proinflammatory // J Exp Med. 2004. -Vol. 200.-P. 1359-1370.

68. Chen JK, Hoshi H, McKeehan WL.Transforming growth factor type beta specifically stimulates synthesis of proteoglycan in human adult arterial smooth muscle cells // Proc Natl Acad Sci USA.- 1987. Vol. 84. - P. 5287-91.

69. Chesler NC, Ku DN, Galis ZS. Transmural pressure induces matrix-degrading activity in porcine arteries ex vivo // Am J Physiol. 1999. -Vol. 277. - P. H2002-9.

70. Chinetti G, Fruchart JC, Staels B. Peroxisome proliferator-activated receptors (PPARs): nuclear receptors at the crossroads between lipid metabolism and inflammation // Inflamm Res. 2000. - Vol. 49. - P. 497505.

71. Chon H, Gaillard CA, van der Meijden BB, Dijstelbloem HM, Kraaijenhagen RJ, et al. Broadly altered gene expression in blood leukocytes in essential hypertension is absent during treatment // Hypertension. 2004. - Vol. 43. - P. 947-51.

72. Chong KY, Lai CC, Lille S, Chang C, Su CY. Stable overexpression of the constitutive form of heat shock protein 70 confers oxidative protection // J Mol Cell Cardiol. 1998. - Vol. 30. - P. 599-608.

73. Chu РН, Ruiz-Lozano P, Zhou Q, Cai C, and Chen J. Expression patterns of FHL/SLIM family members suggest important functional roles in skeletal muscle and cardiovascular system // Mech Dev. 2000. - Vol. 95. - P. 259-265.

74. Claesson-Welsh L. Mechanism of action of platelet-derived growth factor // Int L Biochem Cell Biol. 1996. - Vol. 28. - P. 373-385.

75. Claesson-Welsh L. Signal transduction by vascular endothelial growth factor receptors // Biochem Soc Trans. 2003. - Vol. 31. - P. 20-24.

76. Clerc G and Rouz PM. Lymphocyte subsets in severe atherosclerosis before revascularization//Ann Intern Med. 1997.-Vol. 126.-P. 1004-1005.

77. Clowes AW, KarnowskyMJ. Suppression by heparin of smooth muscle cell proliferation in injured arteries // Nature. 1977. - Vol. 265. - P. 625-6.

78. Cohen GM. Caspases: the executioners of apoptosis // Biochem J. 1997. -Vol. 326.-P. 1-16.

79. Collins T. and Cybulsky MI. NF-kappaB: pivotal mediator or innocent bystander in atherogenesis? // J Clin Invest. 2001. - Vol. 107. - P. 255264.

80. Cottrez F and Groux H. Specialization in tolerance: innate CD(4+)CD(25+) versus acquired TR1 and TH3 regulatory T cells // Transplantation. 2004. -Vol. 77. - P. S12-S15.

81. Curry AJ, Portig I, Goodall JC, Kirkpatrick PJ, and Gaston JS. T lymphocyte lines isolated from atheromatous plaque contain cells capable of responding to Chlamydia antigens // Clin Exp Immunol. 2000. - Vol. 121. -P. 261-269. - -

82. Dao, H.H., F.M. Martens, R. Lariviere, N. Yamaguchi, P. Cernacek, J. Champlain, and P. Moreau. Transient involvement of endothelin in hypertrophic remodeling of small arteries // J Hypertens. 2001. - Vol. 19. -P. 1801-1812.

83. Daugherty A, Webb NR, Rateri DL, and King VL. Thematic review series: The immune system and atherogenesis. Cytokine regulation of macrophage functions in atherogenesis // J Lipid Res. 2005. - Vol. 46. - P. 1812-1822.

84. Davies MJ, Richardson PD, Woolf N, Katz DR, Mann J. Risk of thrombosis in human atherosclerotic plaques: role of extracellular lipid, macrophage, and smooth muscle cell content // Br Heart J. 1993. - Vol. 69. - P. 377-81.

85. Derynck R, Rhee L, Chen EY, Van Tilburg A. Intron-exon structure of the human transforming growth factor-beta precursor gene // Nucleic Acids Res. 1987.-Vol. 15. - P. 3188-9.

86. Diep QN, Li JS, Schiffrin EL. In vivo study of ATI and AT2 angiotensin receptors in apoptosis of rat blood vessels // Hypertension. 1999. - Vol. 34.-P. 617-624.

87. Diguid J. Trombosis as a factor in the pathogenesis of coronary atherosclerosis // J Pathol Bacterid. 1946. - Vol. 58. - P. 207-212.

88. Dinarello CA. Interleukin-1 // Cytokine Growth Factor Rev. 1997. - Vol. 8.-P. 253-265.

89. Doevendans PA, Jukema W, Spiering W, Defesche JC, Kastelein JJ. Molecular genetics and gene expression in atherosclerosis // Int J Cardiol.2001.-Vol. 80.-P. 161-72.

90. Dorffel Y, Latsch C, Stuhlmuller-B, et al. Preactivated peripheral blood monocytes in patients with essential hypertension // Hypertension. 1999. -Vol. 34.-P. 113-7.

91. Dustin ML, Rothlein R, Bhan AK, Dinarello CA, Springer TA.Induction by IL 1 and interferon-gamma: tissue distribution, biochemistry, and function of a natural adherence molecule (ICAM-1) // J Immunol. 1986. - Vol. 137.-P. 245-54.

92. Edfeldt K, Swedenborg J, Hansson GK, and Yan ZQ. Expression of toll-like receptors in human atherosclerotic lesions: a possible pathway for plaque activation//Circulation. 2002.-Vol. 105.-P. 1158-1161.

93. Eisen MB, Spellman PT, Brown PO, Botstein D. Cluster analysis and display of genome-wide expression patterns // Proc Natl Acad Sci US A.-1998. Vol. 95. - P. 14863-14868.

94. Elhage R, Jawien J, Rudling M, Ljunggren HG, Takeda K, Akira S, Bayard F, and Hansson GK. Reduced atherosclerosis in interleukin-18 deficient apolipoprotein E-knockout mice // Cardiovasc Res. 2003. - Vol. 59. - P. 234-240.

95. Enari M, Sakahira H et al. A caspase-activated Dnase that degrades DNA during apoptosis and its inhibitor ICAD // Nature. 1998. - Vol. 391. - P. 43-50.

96. Endemann G, Stanton LW, Madden KS, Bryant CM, White RT, Protter AA. CD36 is a receptor for oxidized low density lipoprotein // J Biol Chem. -1993.-Vol. 268.-P. 11811-6.

97. Ferrara N, Gerber HP, LeCouter J. The biology of VEGF and its receptors // Nat Med. 2003. - Vol. 9. - P. 669-76.

98. Fiebeler A.and F.C.Luft. The mineralcorticoid receptor and oxidative stress

99. Heart Failure Reviews. 2005. - Vol. 10. - P. 47-52.

100. Folkman J. and Shing Y. Angiogenesis. // J Biol Chem. 1992. - Vol. 267.-P. 10931-10934.

101. Fox JC, Shanley JR. Antisense inhibition of basic fibroblast growth factor induces apoptosis in vascular smooth muscle cells // J Biol Chem. 1996. -271.-P. 12578-84.

102. Frenette PS, Wagner DD.Adhesion molecules-Part 1 // N Engl J Med. -1996.-Vol. 334.-P. 1526-9.

103. Frostegard J, Kjellman B, Gidlund M, Andersson B, Jindal S, and Kiessling R. Induction of heat shock protein in monocytic cells by oxidized low density lipoprotein // Atherosclerosis. 1996. - Vol. 121. - P. 93-103.

104. Gabig TG, Mantel PL, Rosli R, Crean CD. Requiem: a novel zinc finger gene essential for apoptosis in myeloid cells // J Biol Chem. 1994. - Vol. 269.-P. 29515-29519.

105. Galis ZS, Sukhova GK, Lark MW, and Libby P. Increased expression of matrix metalloproteinases and matrix degrading activity in vulnerable regions of human atherosclerotic plaques // J Clin Invest. 1994b. - Vol. 94. -P. 2493-2503.

106. Gargalovic P, Dory L.Caveolins and macrophage lipid metabolism // J Lipid Res. -2003.- Vol. 44.-P. 11-21.

107. Geisterfer AT, Peach MJ, Owens GK. Angiotensin II induces hypertrophy, not hyperplasia, in cultured rat aortic smooth muscle cells // Circ Res. -1988.-Vol. 62.-P. 749-56.

108. George J, Afek A, Gilburd B, Blank M, Levy Y, ron-Maor A, Levkovitz H, et al. Induction of early atherosclerosis in LDL-receptor-deficient mice immunized with beta2-glycoprotein I // Circulation. 1998. - Vol. 98. - P. 1108-1115.

109. George J, Shoenfeld Y, Afek A, Gilburd B, Keren P, Shaish A, Kopolovic J, Wick G, and Harats D. Enhanced fatty streak formation in C57BL/6J mice by immunization with heat shock protein-65 // Arterioscler Thromb Vase

110. Biol. 1999b. - Vol. 19. - P. 505-510.

111. George SJ. Tissue inhibitors of metalloproteinases and metalloproteinases in atherosclerosis // Curr Opin Lipidol. 1998. - Vol. 9. - P. 413-23.

112. Gerard G. F. Making effective use of cloned M-MLV reverse transcriptase // Focus. 1987. - Vol. 9. - P. 5-6.

113. Gerszten RE, Mach F, Sauty A, Rosenzweig A, Luster AD.Chemokines, leukocytes, and atherosclerosis // J Lab Clin Med. 2000. - Vol. 136. - P. 87-92.

114. Ghosh S, St Clair RW, Rudel LL. Mobilization of cytoplasmic CE droplets by overexpression of human macrophage cholesteryl ester hydrolase // J Lipid Res. 2003. - Vol. 44. - P. 1833-40.

115. Girard JP, Springer ТА. High endothelial venules (PIEVs): specialized endothelium for lymphocyte migration // Immunol Today. 1995. - 16. — P. 449-57.

116. Girard JP, Springer TA.Modulation of endothelial cell adhesion by hevin, an acidic protein associated with high endothelial venules // J Biol Chem. -1996.-Vol. 271.-P. 4511-7.

117. Goldstein JL., Brown MS. Lipoproteins receptors, cholesterol metabolism and atherosclerosis // Arch Pathol. 1975. - Vol. 99. - P. 181-184.

118. Gordon D, Reidy MA, Benditt EP, Schwartz SM. Cell proliferation in human coronary arteries // Proc Natl Acad Sci USA.- 1990. Vol. 87. -P. 4600-4.

119. Grainger DJ, Reckless J, McKilligin E. Apolipoprotein E modulates clearance of apoptotic bodies in vitro and in vivo, resulting in a systemic proinflammatory state in apolipoprotein E-deficient mice // J Immunol. -2004. Vol. 173. - P. 6366-6375.

120. Greaves DR and Gordon S. Thematic review series: the immune system and atherogenesis. Recent insights into the biology of macrophage scavenger receptors // J Lipid Res. 2005. - Vol. 46. - P. 11-20.

121. Gregory CD, Devitt A.The macrophage and the apoptotic cell: an innate immune interaction viewed simplistically? // Immunology. 2004. -Vol. 113.-P. 1-14.

122. Grimsley C, Ravichandran KS.Cues for apoptotic cell engulfment: eat-me, don't eat-me and come-get-me signals // Trends Cell Biol. 2003. -Vol. 13. -P. 648-56.

123. Groom LA, Sneddon AA, Alessi DR, Dowd S, Keyse SM. Differential regulation of the MAP, SAP and RK/p38 kinases by Pystl, a novel cytosolic dual-specificity phosphatase // EMBO J. 1996. - Vol. 15. - P. 3621-32.

124. Gutterman, D.D. Adventitia-dependent influences on vascular function. // Am. J. Physiol. 1999. - Vol. 277. - P. H1265-H1272.

125. Guyton JR, Klemp KF.Development of the lipid-rich core in human atherosclerosis // Arterioscler Thromb Vase Biol. 1996. - Vol. 16. - P. 411.

126. Hahn, A.W., U. Jonas, F.R. Buhler, and T.J. Resink. Activation of human peripheral monocytes by angiotensin II // FEBS Lett. 1994. - Vol. 347. -P. 178-180.

127. Hamet P, deBlois D, Dam TV, Richard L, Teiger E, Tea BS, Orlov SN, Tremblay J. Apoptosis and vascular wall remodeling in hypertension // Can J Physiol Pharmacol. 1996. - Vol. 74. - P. 850-861

128. Han KH, Hong КН, Ко J, Rhee KS, Hong MK, Kim JJ, Kim YH, Park SJ.Lysophosphatidylcholine up-regulates CXCR4 chemokine receptor expression in human CD4 T cells // J Leukoc Biol. 2004. - Vol. 76(1). -P. 195-202.

129. Hansson GK, Holm J, and Jonasson L. Detection of activated T lymphocytes in the human atherosclerotic plaque // Am J Pathol. 1989. -Vol. 135.-P. 169-175.

130. Hansson GK, Jonasson L, Seifert PS, Stemme S. Immune mechanisms in atherosclerosis // Arteriosclerosis. 1989. - Vol. 9. — P. 567-78.

131. Hansson GK. Immune Mechanisms in Atherosclerosis // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2001. - Vol. 21. - P. 1876-1890.

132. Hansson GK. Inflammation, atherosclerosis, and coronary artery disease // N Engl J Med. 2005. - Vol. 352. - P. 1685-1695.

133. Hara Y, Kusumi Y, Mitsumata M, Li XK, Fujino M. Lysophosphatidylcholine upregulates LOX-1, chemokine receptors, and activation-related transcription factors in human T-cell line Jurkat // J Thromb Thrombolysis. 2008. - Vol. 26. - P. 113-8.

134. Harada M, Habata Y, Hosoya M, Nishi K, Fujii R, Kobayashi M, et al. N-formylated humanin activates both formyl peptide receptor-Like 1 and 2 // Biochem Biophys Res Commun. 2004. - Vol. 324. - P. 255-61.

135. Harrison D, Griendling KK, Landmesser U, Hornig B, Drexler H.Role of oxidative stress in atherosclerosis // Am J Cardiol. 2003. - Vol. 91. - P. 7 A-11 A.

136. Hashimoto S, Suzuki T, Dong HY, Yamazaki N, Matsushima K. Serial analysis of gene expression in human monocytes and macrophages // Blood. 1999. - Vol. 94. - P. 837-44.

137. Hatzoglou A, Ader I, Splingard A, Flanders J, Saade E, Leroy I, Travel" S, Aresta S, de Gunzburg J. Gem associates with Ezrin and acts via the Rho-GAP protein Gmip to down-regulate the Rho pathway // Mol Biol Cell. -2007.-Vol. 18.-P. 1242-52.

138. Hayashi K, Madri JA, Yurchenco PD. Endothelial cells interact with the core protein of basement membrane perlecan through beta 1 and beta 3 integrins: an adhesion modulated by glycosaminoglycan // J Cell Biol. -1992.-Vol. 119.-P. 945-59.

139. Hayes IM, Jordan NJ, Towers S, Smith G, Paterson JR, Earnshaw JJ, et al. Human vascular smooth muscle cells express receptors for CC chemokines // Arterioscler Thromb Vase Biol. 1998. - Vol. 18. - P. 397-403

140. Heldin CH, Westermark B.Mechanism of action and in vivo role of platelet-derived growth factor // Physiol Rev. 1999. - Vol. 79. - P. 1283-316.

141. Heldin CH. Structural and functional studies on platelet-derived growth factor // EMBO J. 1992. - Vol. 11. - P. 4251 -9.

142. Henis-Korenblit S, Strumpf NL, Goldstaub D, Kimchi A. A novel form of DAP5 protein accumulates in apoptotic cells as a result of caspase cleavage and internal ribosome entry site-mediated translation // Mol Cell Biol. -2000. Vol. 20. - P. 496-506.

143. Hiltunen MO, Tuomisto TT, Niemi M, Brasen JH, Rissanen TT, Toronen P, Vajanto I, Yla-Herttuala S.Changes in gene expression in atherosclerotic plaques analyzed using DNA array // Atherosclerosis. 2002. - Vol. 165. -P. 23-32.

144. Hinek A., Rosnowsky A. Comparison of morphology of isolated cells obtained from aortas of normal and cholesterol fed rabbits // Arterial Wall. -1975.-Vol. 3. P. 17-29.

145. Hochberg Z, Hertz P, Maor G, Oiknine J, Aviram M.Growth hormone and insulin-like growth factor-I increase macrophage uptake and degradation of low density lipoprotein // Endocrinology. 1992.-Vol. 131.-P. 430-5.

146. Hofmann, M.A., S. Drury, C. Fu, W. Qu, A. Taguchi, Y. Lu, et al. RAGE mediates a novel proinflammatoryaxis: a central cell surface receptor for S100/calgranulin polypeptides // Cell. 1999. - Vol. 97. - P. 889-901.

147. Holmgren A. Thioredoxin and glutaredoxin systems // J Biol Chem. 1989. -Vol. 264.-P. 13963-13966.

148. Horkko S, Binder CJ, Shaw PX, Chang MK, Silverman G, Palinski W, Witztum JL. Immunological responses to oxidized LDL // Free Radic Biol Med. 2000. - Vol. 28.-P. 1771-1779.

149. Huh HY, Pearce SF, Yesner LM, Schindler JL, Silverstein RL.ReguIated expression of CD36 during monocyte-to-macrophage differentiation: potential role of CD36 in foam cell formation // Blood. 1996. - Vol. 87. -P. 2020-8.

150. Ibrahim Al, Obeid MT, Jouma MJ, Moasis GA, Al-Richane WL, et al. Detection of herpes simplex virus, cytomegalovirus and Epstein-Barr virus DNA in atherosclerotic plaques and in unaffected bypass grafts // J Clin Virol. 2005. - Vol. 32. - P. 29-32.

151. Ihle JN, Kerr IM. Jaks and Stats in signaling by the cytokine receptor superfamily // Trends Genet. 1995. - Vol. 11. - P. 69-74.

152. Ikeda M, Kohno M, Yasunari К, Yokokawa К, Horio T, Ueda M, Morisaki N, Yoshikawa J. Natriuretic peptide family as a novel antimigration factor of vascular smooth muscle cells // Arterioscler Thromb Vase Biol. 1997. -Vol. 17.-P. 731-6.

153. Imataka, H., H. S. Olsen, and N. Sonenberg. A new translational regulator with homology to eukaryotic translation initiation factor 4G // EMBO J. -1997.-Vol. 16.-P. 817-825

154. Intengan HD, Schiffrin EL.Structure and mechanical properties of resistance arteries in hypertension: role of adhesion molecules and extracellular matrix determinants // Hypertension. 2000. - Vol. 36. - P. 312-8.

155. Intengan HD, Schiffrin EL.Vascular remodeling in hypertension: roles of apoptosis, inflammation, and fibrosis // Hypertension. 2001. - Vol. 38. -P. 581-7

156. Irani K. Oxidant signaling in vascular cell growth, death, and survival: a review of the roles of reactive oxygen species in smooth muscle and endothelial cell mitogenic and apoptotic signaling // Circ Res. 2000. -Vol. 87.-P. 179-183

157. Irizarry RA, Bolstad BM, Collin F, Cope LM, Hobbs B, Speed TP. Summaries of Affymetrix GeneChip probe level data // Nucleic Acids Res. -2003,-Vol. 31.-P. el5.

158. Jackson CL, Schwartz SM. Pharmacology of smooth muscle cell replication // Hypertension. 1992. - Vol. 20. - P. 713-36

159. Janicke RU, Sprengart ML et al. Caspase-3 is required for DNA fragmentation and morphological changes associated with apoptosis // J Biol Chem. 1998. - Vol. 273. - P. 9357-60

160. Jonasson L, Holm J, Skalli O, Bondjers G, and Hansson GK. Regional accumulations of T cells, macrophages, and smooth muscle cells in the human atherosclerotic plaque // Arteriosclerosis. 1986. - Vol. 6. - P. 131138.

161. Kaartinen M, Penttila A, and Kovanen PT. Accumulation of activated mast cells in the shoulder region of human coronary atheroma, the predilection site of atheromatous rupture // Circulation. 1994. - Vol. 90. - P. 16691678.

162. Kaartinen M, Penttila A, and Kovanen PT. Mast cells accompany microvessels in human coronary atheromas: implications for intimal neovascularization and hemorrhage // Atherosclerosis. 1996. - Vol. 123. — P. 123-131.

163. Kaartinen M, van der Wal AC, van der Loos CM, Piek JJ, Koch KT, Becker AE, and Kovanen PT. Mast cell infiltration in acute coronary syndromes: implications for plaque rupture // J Am Coll Cardiol. 1998. - Vol. 32. - P. 606-612.

164. Kintscher U. et al. Angiotensin II induces migration and Pyk2/paxillin phosphorylation of human monocytes // Hypertension. 2001. - Vol. 37. -P. 587-593

165. Kishino J et al. Endothelin-induced intracellular Ca2+ mobilization through its specific receptors in murine peritoneal macrophages // FEBS Lett. -1991. Vol. 280.-P. 103-106

166. Kobayashi K, Kishi M, Atsumi T, Bertolaccini ML, Makino H, Sakairi N, et al. Circulating oxidized LDL forms complexes with beta2-glycoprotein I: implication as an atherogenic autoantigen // J Lipid Res. 2003. - Vol. 44. -P. 716-726.

167. Kockx MM, De Meyer GR, Buyssens N, Knaapen MW, Bult H, Herman AG. Cell composition, replication, and apoptosis in atherosclerotic plaquesafter 6 months of cholesterol withdrawal // Circ Res. 1998. - Vol. 83. - P. 378-387.

168. Kodali R, Hajjou M, Berman AB, Bansal MB, Zhang S, Pan JJ, Schecter AD. Chemokines induce matrix metalloproteinase-2 through activation of epidermal growth factor receptor in arterial smooth muscle cells // Cardiovasc Res. 2006. - Vol. 69. - P. 706-15

169. Kodama T, Freeman M, Rohrer L, Zabrecky J, Matsudaira P, Krieger M.Type I macrophage scavenger receptor contains alpha-helical and collagen-like coiled coils // Nature. 1990.-Vol. 343.-P. 531-5.

170. Kolodgie FD, Gold HK, Burke AP, Fowler DR, Kruth HS, Weber DK, et al. Intraplaque hemorrhage and progression of coronary atheroma // N Engl J Med. -2003.-Vol. 349.-P. 2316-2325.

171. Kovanen PT, Kaartinen M, and Paavonen T. Infiltrates of activated mast cells at the site of coronary atheromatous erosion or rupture in myocardial infarction// Circulation. 1995. - Vol. 92. - P. 1084-1088.

172. Kovanen PT, Pentikainen MO.Secretory group II phospholipase A(2) : a newly recognized acute-phase reactant with a role in atherogenesis // Circ Res.-2000.-86.-P. 610-2.

173. Kovanen PT. Mast cells in human fatty streaks and atheromas: implications for intimal lipid accumulation // Curr Opin Lipidol. 1996. - Vol. 7. - P. 281-6.

174. Krakauer T. IL-10 inhibits the adhesion of leukocytic cells to IL-1-activated human endothelial cells // Immunol Lett. 1995. - Vol. 45. - P. 61-5.

175. Kramer P. The CD95 (APO-l/Fas) receptor/ligand system death signals and diseases // Cell Death Differ. - 1996. - Vol. 3. - P. 159-60

176. Krieglstein CF, Granger DN.Adhesion molecules and their role in vascular disease // Am J Hypertens. 2001. - Vol. 14. - P. 44S-54S.

177. Krishnaswamy G, Kelley J, Yerra L, Smith JK, Chi DS.Human endothelium as a source of multifunctional cytokines: molecular regulation and possible role in human disease // J Interferon Cytokine Res. 1999. - Vol. 19. - P. 91-104.

178. Kucia M, Jankowski K, Reca R, Wysoczynski M, Bandura L, Allendorf DJ, Zhang J, Ratajczak J, Ratajczak MZ. CXCR4-SDF-1 signalling, locomotion, chemotaxis and adhesion // J Mol Histol. 2004. - Vol. 35. -P. 233-45.

179. Kuhn H, Chan L. The role of 15-lipoxygenase in atherogenesis: pro- and antiatherogenic actions // Curr Opin Lipidol. 1997. - Vol. 8. - P. 111-7.

180. Kuhn H, Heydeck D, Hugou I, Gniwotta C.In vivo action of 15-lipoxygenase in early stages of human atherogenesis // J Clin Invest. 1997. -Vol. 99.-P. 888-93.

181. Laitinen К, Laurila A, Pyhala L, Leinonen M, and Saikku P. Chlamydia pneumoniae infection induces inflammatory changes in the aortas of rabbits // Infect Immun. 1997. - Vol. 65. - P. 4832-4835

182. Lalli J, Harrer JM, Luo W, Kranias EG, Paul RJ. Targeted ablation of the phospholamban gene is associated with a marked decrease in sensitivity in aortic smooth muscle // Circ Res. 1997. - Vol. 80. - P. 506-13.

183. Laukkanen J, Yla-Herttuala S.Genes involved in atherosclerosis // Exp Nephrol. 2002. - Vol. 10.-P. 150-63.

184. Laurat E, Poirier B, Tupin E, Caligiuri G, Hansson GK, Bariety J, and Nicoletti A. In vivo downregulation of T helper cell 1 immune responses reduces atherogenesis in apolipoprotein E-knockout mice // Circulation. -2001.-Vol. 104.-P. 197-202.

185. Lazo PA, Cuevas L, Gutierrez del Arroyo A, Orue E. Ligation of CD53/OX44, a tetraspan antigen, induces homotypic adhesion mediated by specific cell-cell interactions // Cell Immunol. 1997. - Vol. 178. - P. 13240.

186. Leake DS, Peters TJ. Proteolytic degradation of low density lipoproteins by arterial smooth muscle cells: the role of individual cathepsins // Biochim Biophys Acta. 1981.-Vol. 664.-P. 108-16.

187. Lee TS, Yen HC, Pan CC, and Chau LY. The role of interleukin 12 in the development of atherosclerosis in ApoE-deficient mice // Arterioscler Thromb Vase Biol. 1999. - Vol. 19. - P. 734-742.

188. Lee-Rueckert M, Vikstedt R, Metso J, Ehnholm C, Kovanen PT, Jauhiainen M. Absence of endogenous phospholipid transfer protein impairs ABCA1-dependent efflux of cholesterol from macrophage foam cells // J Lipid Res. 2006. - Vol. 47. - P. 1725-32.

189. Li H, Cybulsky MI, Gimbrone MA Jr, Libby P.Inducible expression of vascular cell adhesion molecule-1 by vascular smooth muscle cells in vitro and within rabbit atheroma//Am J Pathol.- 1993. -Vol. 143.-P. 1551-9.

190. Li H, Freeman MW, Libby P. Regulation of smooth muscle cell scavenger receptor expression in vivo by atherogenic diets and in vitro by cytokines // J Clin Invest. 1995. - Vol. 95. - P. 122-33.

191. Li N, Karin M.Is NF-kappaB the sensor of oxidative stress? // FASEB J. -1999.-Vol. 13.-P. 1137-43.

192. Li PF, Maasch C, Haller H, Dietz R, von Harsdorf R. Requirement for protein kinase С in reactive oxygen species-induced apoptosis of vascular smooth muscle cells // Circulation. 1999. - Vol. 100. - P. 967-973

193. Li S, Sims S, Jiao Y, Chow LH, Pickering JG. Evidence from a novel human cell clone that adult vascular smooth muscle cells can convert reversibly between noncontractile and contractile phenotypes // Circ Res. -1999.-Vol. 85.-P. 338-48

194. Li SL, Valente AJ, Qiang M, Schlegel W, Gamez M, Clark RA. Multiple PU.l sites cooperate in the regulation of p40(phox) transcription during granulocytic differentiation of myeloid cells // Blood. 2002. - Vol. 99. -P. 4578-4587.

195. Liang P, Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by means of the polymerase chain reaction // Science. 1992. - Vol. 257. - P. 967-71.

196. Libby P. Inflammation in atherosclerosis // Nature. 2002. - Vol. 420. - P. 868-74.

197. Liles WC, Broxmeyer HE, Rodger E, Wood B, Hubel K, Cooper S, et al. Mobilization of hematopoietic progenitor cells in healthy volunteers by AMD3100, a CXCR4 antagonist//Blood. -2003. Vol. 102. - P. 2728-30.

198. Lim DS, Roberts R, and Marian AJ. Expression profiling of cardiac genes in human hypertrophic cardiomyopathy: insight into the pathogenesis of phenotypes // J Am Coll Cardiol. 2001. - Vol. 38. - P. 1175-1180

199. Lindner V, Lappi DA, Baird A, Majack RA, Reidy MA. Role of basic fibroblast growth factor in vascular lesion formation // Circ Res. 1991. — Vol. 68.-P. 106-13.

200. Lindner V, Majack RA, Reidy MA.Basic fibroblast growth factor stimulates endothelial regrowth and proliferation in denuded arteries // J Clin Invest.1990.-85.-P. 2004-8.

201. Lindstedt KA and Kovanen PT. Mast cells in vulnerable coronary plaques: potential mechanisms linking mast cell activation to plaque erosion and rupture // Curr Opin Lipidol. 2004. - Vol. 15. - P. 567-573

202. Lipke DW, Couchman JR. Increased proteoglycan synthesis by the cardiovascular system of coarctation hypertensive rats // J Cell Physiol.1991. Vol. 147.-P. 479-86

203. Liuzzo G, Giubilato G, Pinnelli M. T cells and cytokines in atherogenesis // Lupus. 2005. - Vol. 14. - P. 732-5.

204. Lockhart DJ, Dong H, Byrne MC, Follettie MT, Gallo MV, Chee MS, Mittmann M, et al. Expression monitoring by hybridization to high-density oligonucleotide arrays // Nat Biotechnol. 1996. - Vol. 14. - P. 1675-80.

205. Lord RS and Bobryshev YV. Clustering of dendritic cells in athero-prone areas of the aorta // Atherosclerosis. 1999. - Vol. 146. - P. 197-198

206. Lu H, Cassis LA, Daugherty A. Atherosclerosis and arterial blood pressure in mice // Curr Drug Targets. 2007. - Vol. 8. - P. 1181-1189.

207. Lyall F, Morton JJ, Lever AF, Cragoe EJ. Angiotensin II activates Na H exchange and stimulates growth in vascular smooth muscle cells // J Hypertens Suppl. - 1988. - Vol. 6. - P. S43 8-41.

208. Macario AJ, Conway de Macario E. Sick chaperones, cellular stress, and disease //N Engl J Med. -2005. -Vol. 353.-P. 1489-501.

209. MacMicking J, Xie QW, Nathan C. Nitric oxide and macrophage function // Annu Rev Immunol. 1997.-Vol. 15.-P. 323-350

210. Majesky MW, Daemen MJ, Schwartz SM. Alpha 1 adrenergic stimulation of platelet - derived growth factor A - chain gene expression in rat aorta // J Biol Chem. - 1990.-Vol. 265.-P. 1082-8.

211. Mallat Z and Tedgui A. The role of transforming growth factor beta in atherosclerosis: novel insights and future perspectives // Curr Opin Lipidol. -2002.-Vol. 13.-P. 523-529.

212. Mallat Z, Besnard S, Duriez M, Deleuze V, Emmanuel F, Bureau MF, et al. Protective role of interleukin-10 in atherosclerosis // Circ Res. 1999a. -Vol. 85.-P. el7-e24.

213. Mallat Z, Corbaz A, Scoazec A, Besnard S, Leseche G, Chvatchko Y, and Tedgui A. Expression of interleukin-18 in human atherosclerotic plaques and relation to plaque instability // Circulation. 2001a. - Vol. 104. - P. 1598-1603.

214. Mallat Z, Gojova A, Marchiol-Fournigault C, Esposito B, Kamate C, et al. Inhibition of transforming growth factor beta signaling accelerates atherosclerosis and induces an unstable plaque phenotype in mice // Circ Res. 2001c.-Vol. 89.-P. 930-934.

215. Mallat Z, Heymes C, Ohan J, Faggin E, Leseche G, and Tedgui A. Expression of interleukin-10 in advanced human atherosclerotic plaques: relation to inducible nitric oxide synthase expression and cell death //

216. Arterioscler Thromb Vase Biol. 1999b. - Vol. 19. - P. 611-616.

217. Marcus, S.L. and M.J. Modak. Observations on template-specific conditions for DNA synthesis by avian myeloblastosis virus DNA polymerase // Nucleic Acids Res. 1976. - Vol.3. - P. 1473-1486.

218. Martin C, Burdon PC, Bridger G, Gutierrez-Ramos JC, Williams TJ, Rankin SM. Chemokines acting via CXCR2 and CXCR4 control the release of neutrophils from the bone marrow and their return following senescence // Immunity. 2003. - Vol. 19. - P. 583-93.

219. Matsumoto A, Naito M, Itakura H, Ikemoto S, Asaoka H, Hayakawa I, et al. Human macrophage scavenger receptors: primary structure, expression, and localization in atherosclerotic lesions // Proc Natl Acad Sci USA.- 1990. -Vol. 87.-P. 9133-7.

220. Maurer M, Theoharides T, Granstein RD, Bischoff SC, Bienenstock J, Henz B, et al. What is the physiological function of mast cells? // Exp Dermatol. -2003.-Vol. 12.-P. 886-910.

221. McCaffrey TA.TGF-betas and TGF-beta receptors in atherosclerosis // Cytokine Growth Factor Rev. 2000. - Vol. 11. - P. 103-14.

222. McCormick SM, Eskin SG, Mclntire LV, Teng CL, Lu CM, Russell CG, Chittur KK. DNA microarray reveals changes in gene expression of shear stressed human umbilical vein endothelial cells // Proc Natl Acad Sci USA. -2001.-Vol. 98.-P. 8955-60.

223. McEver RP, Moore KL, Cummings RD.Leulcocyte trafficking mediated by selectin-carbohydrate interactions // J Biol Chem. 1995. - Vol. 270. - P. 11025-8.

224. Melnick JL, Ни C., Burek J et al. Cytomegalovirus DNA in arterial walls of patients with atherosclerosis // J Med Virol. 1994. - Vol. 42. - P. 170-174.

225. Michelsen KS, Doherty TM, Shah PK, and Arditi M. TLR signaling: an emerging bridge from innate immunity to atherogenesis // J Immunol. -2004a. Vol. 173. - P. 5901-5907.

226. Migeotte I, Riboldi E, Franssen JD, Gregoire F, Loison U, Wittamer V, et al. Identification and characterization of an endogenous chemotactic ligand specific for FPRL2 // J Exp Med. 2005. - Vol. 201. - P. 83-93.

227. Mii S, Ware JA, Kent КС.Transforming growth factor-beta inhibits human vascular smooth muscle cell growth and migration // Surgery. 1993. -Vol. 114.-P. 464-70.

228. Mikita T, Porter G, Lawn RM, Shiffman D. Oxidized low density lipoprotein exposure alters the transcriptional response of macrophages to inflammatory stimulus // J Biol Chem. 2001. - Vol. 276. - P. 4572945739.

229. Miller YI, Chang MK, Binder CJ, Shaw PX, and Witztum JL. Oxidized low density lipoprotein and innate immune receptors // Curr Opin Lipidol. -2003a. Vol. 14. - P. 437-445.

230. Millonig G, Malcom GT, and Wick G. Early inflammatory-immunological lesions in juvenile atherosclerosis from the Pathobiological Determinants of Atherosclerosis in Youth (PDAY)-study // Atherosclerosis. 2002. - Vol. 160.-P. 441-448.

231. Mizoguchi A, Mizoguchi E, Takedatsu H, Blumberg RS, and Bhan AK.-Chronic intestinal inflammatory condition generates IL-10-producing regulatory В cell subset characterized by CD Id upregulation // Immunity. -2002.-Vol. 16.-P. 219-230.

232. Moazed TC, Campbell LA, Rosenfeld ME, Grayston JT, and Kuo CC. Chlamydia pneumoniae infection accelerates the progression of atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice // J Infect Dis. 1999. -Vol. 180.-P. 238-241.

233. Moratz C, Kang VH, Druey KM, Shi CS, Scheschonka A, Murphy PM, Kozasa T, Kehrl JH. Regulator of G protein signaling 1 (RGS1) markedly impairs Gi alpha signaling responses of В lymphocytes // J Immunol. -2000.-Vol. 164.-P. 1829-38.

234. Mosorin M, Surcel HM, Laurila A, Lehtinen M, Karttunen R, Juvonen J, et al. Detection of Chlamydia pneumoniae-reactive T lymphocytes in human atherosclerotic plaques of carotid artery // Arterioscler Thromb Vase Biol. -2000. Vol. 20. - P. 1061-1067.

235. Murakami M, Kudo I.New phospholipase A(2) isozymes with a potential role in atherosclerosis // Curr Opin Lipidol. 2003. - Vol. 14. - P. 431-6.

236. Muzykantov VR.Targeting of superoxide dismutase and catalase to vascular endothelium // J Control Release. 2001. - Vol. 71. - P. 1 -21.

237. Naghavi M et al. From vulnerable plaque to vulnerable patient: a call for new definitions and risk assessment strategies: Part I // Circulation. 2003. -Vol. 108.-P. 1664-1672.

238. Nahmod KA, Vermeulen ME et al. Control of dendritic cell differentiation by angiotensin II // Faseb J. 2003. - Vol. 17. - P. 491 -493.

239. Nakahashi TK, Hoshina K, Tsao PS, Sho E, Sho M, ICarwowski JK, Yeh C, et al. Flow loading induces macrophage antioxidative gene expression in experimental aneurysms // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002. - Vol. 22.-P. 2017-22.

240. Nakai Y, Iwabuchi K, Fujii S, Ishimori N, Dashtsoodol N, Watano K, et al. Natural killer T cells accelerate atherogenesis in mice // Blood. 2004. -Vol. 104.-P. 2051-2059.

241. NakajimaT, Schulte S, Warrington KJ, Kopecky SL, Frye RL, Goronzy JJ, Weyand CM. T-cell-mediated lysis of endothelial cells in acute coronary syndromes // Circulation. 2002. - Vol. 105. - P. 570-5.

242. Naora H. Involvement of ribosomal proteins in regulating cell growth and apoptosis: translational modulation or recruitment for extraribosomal activity? // Immunol Cell Biol. 1999. - Vol. 77. - P. 197-205.

243. Naruko T, Ueda M, Haze K, van der Wal AC, van der Loos CM, Itoh A, et al. Neutrophil infiltration of culprit lesions in acute coronary syndromes // Circulation. 2002. - Vol. 106. - P. 2894-2900.

244. Nelken NA, Coughlin SR, Gordon D, Wilcox JN. Monocyte chemoattractant protein-1 in human atheromatous plaques // J Clin Invest. -1991.-Vol. 88.-P. 1121-7.

245. Newman PJ, Berndt MC, Gorski J, White GC 2nd, Lyman S, Paddock C, Muller WA. PECAM-1 (CD31) cloning and relation to adhesion molecules of the immunoglobulin gene superfamily // Science. 1990. - Vol. 247. - P. 1219-22.

246. Nhan TQ, Liles WC, Schwartz SM. Role of caspases in death and survival of the plaque macrophage // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005. - Vol. 25.-P. 895-903.

247. Nicoletti A, Caligiuri G, Tornberg I, Kodama T, Stemme S, and Hansson GK. The macrophage scavenger receptor type A directs modified proteins to antigen presentation // Eur J Immunol. 1999. - Vol. 29. - P. 512-521.

248. Nilsson J and Kovanen PT. Will autoantibodies help to determine severity and progression of atherosclerosis? // Curr Opin Lipidol. 2004. - Vol. 15. -P. 499-503.

249. Norata GD, Pirillo A, Callegari E, Hamsten A, Catapano AL, Eriksson P.Gene expression and intracellular pathways involved in endothelial dysfunction induced by VLDL and oxidised VLDL // Cardiovasc Res. -2003.-Vol. 59.-P. 169-80.

250. O'Callaghan CJ, Williams B. Mechanical strain-induced extracellular matrix production by human vascular smooth muscle cells: role of TGF-beta(l) // Hypertension. 2000. - Vol. 36. - P. 319-24.

251. Ocana E, P6rez-Requena J, Bohorquez JC, Brieva JA, Rodriguez C.Chemokine receptor expression on infiltrating lymphocytes from abdominal aortic aneurysms: Role of CXCR4-CXCL12 in lymphoid recruitment // Atherosclerosis. 2008. - Vol. 200. - P. 264-70.

252. Ohashi K, Burkart V, Flohe S, and Kolb H. Cutting edge: heat shock protein 60 is a putative endogenous ligand of the toll-like receptor-4 complex // J Immunol. 2000. - Vol. 164.-P. 558-561.

253. Ohki, R., K. Yamamoto, H. Mano, R.T. Lee, U. Ikeda, and K. Shimada. Identification of mechanically induced genes in human monocytic cells by DNA microarrays // J Hypertens. 2002. - Vol. 20. - P. 685-691.

254. Ohura N, Yamamoto K, Ichioka S, Sokabe T, Nakatsuka H, Baba A, et al. Global analysis of shear stress-responsive genes in vascular endothelial cells //J Atheroscler Thromb.-2003.-Vol. 10.-P. 304-313.

255. Okuda M, Nobutaka Inoue, Hiroshi Azumi, et al. Expression of Glutaredoxin in Human Coronary Arteries Its Potential Role in Antioxidant Protection Against Atherosclerosis // Arterioscler Thromb Vase Biol. -2001.-21.-P. 1483-1487.

256. Olsen, M.H., K. Wachtell, K.L. Hermann, E. Frandsen, H. Dige-Petersen, J. et al. Is cardiovascular remodeling in patients with essential hypertension related to more than high blood pressure? // Am Heart J. 2002. - Vol. 144. -P. 530-537.

257. Ouhammouch, M. and E.N. Brody. Temperature-dependent template switching during in vitro cDNA synthesis by the AMV-reverse transcriptase // Nucleic Acids Res. 1992. - Vol. 20. - P. 5443-5450

258. Owens GK, Schwartz SM, McCanna M.Evaluation of medial hypertrophy in resistance vessels of spontaneously hypertensive rats // Hypertension. -1988.-Vol. 11.-P. 198-207.

259. Owens GK. Influence of blood pressure on development of aortic medial smooth muscle hypertrophy in spontaneously hypertensive rats // Hypertension. 1987. - Vol. 9. - P. 178-87.

260. Palinski W, Miller E, Witztum JL. Immunization of low density lipoprotein (LDL) receptor-deficient rabbits with homologous malondialdehydemodified LDL reduces atherogenesis // Proc Natl Acad Sci USA.- 1995. Vol. 92. - P. 821-825.

261. Palinski W., Rosenfeld ME., Yla-Herttuala S. et al. Low density lipoprotein undergoes oxidative modification in vivo // Proc Nat Acad Sci USA. 1989. -Vol. 86.-P. 1372-1376.

262. Pampou SYu., Gnedoy SN, Bystrevskaya VB et al. Cytomegalovirus genome and the immediate-early antigen in cells of different layers of human aorta // Virchows Arch. 2000. - V. 436. - P. 539-552.

263. Papaspyridonos M, Smith A, Burnand KG, Taylor P, Padayachee S, et al. Novel candidate genes in unstable areas of human atherosclerotic plaques // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2006. - Vol. 26. - P. 1837-44.

264. Parker F. An electron microscopic study of experimental atherosclerosis // Amer J Pathol. 1960. - Vol. 36. - P. 19-53.

265. Pedersen-Lane JH, Zurier RB, Lawrence DA. Analysis of the thiol status of peripheral blood leukocytes in rheumatoid arthritis patients // J Leukoc Biol. -2007.-Vol. 81.-P. 934-941.

266. Peiser L, Mukhopadhyay S, and Gordon S. Scavenger receptors in innate immunity // Curr Opin Immunol. 2002. - Vol. 14. - P. 123-128.

267. Pentikainen MO, Oorni K, Ala-Korpela M, Kovanen PT. Modified LDL -trigger of atherosclerosis and inflammation in the arterial intima // J Intern Med. 2000. - Vol. 247. - P. 359-70.

268. Pillarisetti S, Рака L, Obunike JC, Berglund L, Goldberg IJ. Subendothelial retention of Iipoprotein(a) evidence that reduced heparan sulfate promotes lipoprotein binding to subendothelial matrix // J Clin Invest. 1997. - Vol. 100.-P. 867-74.

269. Pillarisetti S. Lipoprotein modulation of subendothelial heparan sulfate proteoglycans (perlecan) and atherogenicity // Trends Cardiovasc Med. -2000.-Vol. 10.-P. 60-5.

270. Pinderski LJ, Hedrick CC, Olvera T, Hagenbaugh A, Territo M, Berliner JA, and Fyfe AL Interleukin-10 blocks atherosclerotic events in vitro and invivo // Arterioscler Thromb Vase Biol. 1999. - Vol. 19. - P. 2847-2853.

271. Pislaru; SV, Van RM, Pislaru C, Szelid Z, Theilmeier G, Ossewaarde JM, et al. Chlamydia pneumoniae induces neointima formation in coronary arteries of normal pigs // Cardiovasc Res. 2003. - Vol. 57. - P. 834-842.

272. Plante G.E. Vascular response to stress in health and disease // Metabolism. -2002.-Vol. 51.-P. 25-30.

273. Pliyev BK. Activated human neutrophils rapidly release the chemotactically active D2D3 form of the urokinase-type plasminogen activator receptor (uPAR/CD87) // Mbl Cell Biochem. 2009. - Vol. 321. - P. 111.-22.

274. Pober JS, Cotran RS. Cytokines and endothelial cell biology // Physiol Rev. -1990.- Vol. 70.-P. 427-51.

275. Pockley AG, De Faire U, Kiessling R, et al. Circulating heat shock protein and heat shock protein antibody levels in established hypertension // J Hypertens. 2002. - Vol. 20. - P. 1815-20.

276. Pollman MJ, Naumovski L, Gibbons GH. Vascular cell apoptosis: cell type-specific modulation by transforming growth factor-betal in endothelial cells versus smooth muscle cells//Circulation.- 1999. Vol. 99. - P. 2019-26.

277. Pollman MJ, Yamada T, Horiuchi M, Gibbons GH. -Vasoactive substances regulate vascular smooth muscle cell apoptosis: countervailing influences of nitric oxide and angiotensin II // Circ Res. 1996. - Vol. 79. - P. 748 -756.

278. Prebeck S, Kirschning C, Durr S, Da CC, Donath B, Brand K, Redecke V, Wagner H, and Miethke T. Predominant role of toll-like receptor 2 versus 4 in Chlamydia pneumoniae-induced activation .of dendritic cells // J Immunol.-2001.-Vol. 167.-P. 3316-3323.

279. Price DT, Loscalzo J. Cellular adhesion molecules and atherogenesis // Am J Med. 1999. - Vol. 107. - P. 85-97.

280. Rabiet MJ, Huet E, Boulay F. The N-formyl peptide receptors and the. ' anaphylatoxin C5a receptors: an overview // Biochimie. — 2007. — Vol. 89: -P. 1089-1106.

281. Rader DJ. Regulation of reverse cholesterol transport and clinical implications//Am J Cardiol. 2003.-Vol. 92. - P. 42J-49J.

282. Radomski MW, Moncada S. The biological and pharmacological role of nitric oxide in platelet function // Adv Exp Med Biol. 1993. - Vol. 344. -P. 251-64.

283. Raines EW and Ferri N. Thematic review series: The immune: system andatherogenesis. Cytokines affecting endothelial and smooth muscle cells in vascular disease // J Lipid Res. 2005. - Vol. 46. - P. 1081-1092.

284. Raines EW, Ross R. Smooth muscle cells and the pathogenesis of the lesions of atherosclerosis // Br Heart J. 1993. - Vol. 69. - P. S30-7.

285. Randolph GJ, Beaulieu S, Lebecque S, Steinman RM, and Muller WA. Differentiation of monocytes into dendritic cells in a. model of transendothelial trafficking // Science. 1998. - Vol. 282. - P. 480-483.

286. Ranzolin A, Bohn JM, Norman GL, Manenti E, Bodanese LC, von Muhlen CA, and Staub HL. Antibeta2-glycoprotein I antibodies as risk factors for acute myocardial infarction // Arq Bras Cardiol. 2004. - Vol. 83. - P. 141144.

287. Reape TJ, Rayner K, Manning CD, Gee AN, Barnette MS, Burnand KG, Groot PH. Expression and cellular localization of the CC chemokines PARC and ELC in human atherosclerotic plaques // Am J Pathol. 1999. -Vol. 154.-P. 365-74.

288. Renier G, Clement I, Desfaits AC, Lambert A. Direct stimulatory effect of insulin-like growth factor-I on monocyte and macrophage tumor necrosis factor-alpha production // Endocrinology. 1996. - Vol. 137. - P. 4611-8.

289. Riddle EL, Rau'l A. Schwartzman, Meredith Bond, Paul A. InselMuIti-Tasking RGS Proteins in the Heart. The Next Therapeutic Target? // Circ. Res. 2005. - Vol. 96. - P. 401-411.

290. Risau W, Drexler H, Mironov V, Smits A, Siegbahn A, Funa K, Heldin CH.

291. Platelet-derived growth factor is angiogenic in vivo // Growth Factors. -1992.-Vol. 7.-P. 261-6.

292. Robertson AK, Rudling M, Zhou X, Gorelik L, Flavell RA, and Hansson GK. Disruption of TGF-beta signaling in T cells accelerates atherosclerosis // J Clin Invest. 2003. - Vol. 112. - P. 1342-1350.

293. Robertson AL, Hansson GK. T cells in atherogenesis. For better or for worse? // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2006. - Vol. 26. - P. 2421-2432.

294. Robertson J. The influence of mechanical factors on the structure of the peripheral arteries and the localization of atherosclerosis // J Clin Pathol. -1960.-Vol.13. P. 199-204.

295. Rodriguez C, Raposo B, Martinez-Gonzalez J, Casani L, Badimon L. Low density lipoproteins downregulate lysyl oxidase in vascular endothelial cells and the arterial wall // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002. - Vol. 22. -P. 1409-14.

296. Ross R. Atherosclerosis an inflammatory disease // N Engl J Med. - 1999. -Vol. 340.-P. 115-126.

297. Ross R. The pathogenesis of atherosclerosis: a perspective for the 1990s // Nature. 1993.-Vol. 362.-P. 801-9.

298. Ross R., Glomset JA. Atherosclerosis and the arterial smooth muscle cell: Proliferation of smooth muscle is a key event in the genesis of the lesions of atherosclerosis // Science. 1973. - V.180. - P. 1332-1339.

299. Roth, J., T. Vogl, C. Sorg and C. Sunderkotter. Phagocyte-specific SI00 proteins: a novel group of proinflammatory molecules // Trends Immunol. -2003. Vol. 24.-P. 155-158.

300. Sack M. Tumor necrosis factor-alpha in cardiovascular biology and the potential role for anti-tumor necrosis factor-alpha therapy in heart disease // Pharmacol Ther. 2002. - Vol. 94. - P. 123-35.

301. Sainz J, Sata M. Open sesame! CXCR4 blockade recruits neutrophils into the plaque // Circ Res. 2008. - Vol. 102. - P. 154-6.

302. Saouaf R, Takasaki I, Eastman E, Chobanian AV, Brecher P. Fibronectin biosynthesis in the rat aorta in vitro. Changes due to experimental hypertension // J Clin Invest. 1991. - Vol. 88. - P. 1182-9.

303. Sasamura H, Shimizu-Hirota R, Saruta T. Extracellular matrix remodeling in hypertension // Current Hypertension Reviews. 2005. - Vol. 1. - P. 5160.

304. Savill J, Dransfield I, Gregory C, Haslett C. A blast from the past: clearance of apoptotic cells regulates immune responses // Nat Rev Immunol. 2002. -Vol. 2.-P. 965-75.

305. Sawamura T, Kume N, Aoyama T, Moriwaki PI, Hoshikawa H, Aiba Y, et al. An endothelial receptor for oxidized low-density lipoprotein // Nature. -1997. Vol. 386.-P. 73-7.

306. Schecter AD, Berman AB, Taubman MB. Chemokine receptors in vascular smooth muscle // Microcirculation. 2003. - Vol. 10. - P. 265-72.

307. Schena M, Shalon D, Davis RW, Brown PO. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA microarray // Science. 1995. - Vol. 270. - P. 467-70.

308. Schmitz G, Langmann T, Heimerl S.Role of ABCG1 and other ABCG family members in lipid metabolism // J Lipid Res. 2001. - Vol. 42. - P. 1513-20.

309. Schuppan D, Cantaluppi MC, Becker J, Veit A, Bunte T, Troyer D, et al. Undulin, an extracellular matrix glycoprotein associated with collagen fibrils // J Biol Chem. 1990. - Vol. 265. - P. 8823-32.

310. Schwartz SM, deBlois D, O'Brien ER. The intima. Soil for atherosclerosis and restenosis // Circ Res. 1995. - Vol. 77. - P. 445-65.

311. Schwencke C, Schmeisser A, Walter C, Wachter R, Pannach S, Week B, et al. Decreased caveolin-1 in atheroma: loss of antiproliferative control of vascular smooth muscle cells in atherosclerosis // Cardiovasc Res. 2005. -Vol. 68.-P. 128-35.

312. Scortegagna M, Ding K, Oktay Y, Gaur A, Thurmond F, Yan LJ, Marck ВТ, et al. Multiple organ pathology, metabolic abnormalities and impaired homeostasis of reactive oxygen species in Epasl-/- mice // Nat Genet.2003.-Vol. 35.-P. 331-40.

313. Seko Y, Sato O, Takagi A, Tada Y, Matsuo H, Yagita H, Okumura K, and Yazaki Y. Perforin-secreting killer cell infiltration in the aortic tissue of patients with atherosclerotic aortic aneurysm // Jpn Circ J. 1997. - Vol. 61.-P. 965-970.

314. Sela S. et al. Primed polymorphonuclear leukocytes, oxidative stress, and inflammation antecede hypertension in the Sabra rat // Hypertension.2004. Vol. 44. - P. 764-769.

315. Seo D, Wang T, Dressman H, Herderick EE, Iversen ES, Dong C, Vata K, et al. Gene expression phenotypes of atherosclerosis // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004. - Vol. 24. - P. 1922-1927.

316. Seth R, Yang C, Kaushal V, Shah SV, Kaushal GP. p53-dependent caspase-2 activation in mitochondrial release of apoptosis-inducing factor and its role in renal tubular epithelial cell injury // J Biol Chem. 2005. - Vol. 280. -P. 31230-9.

317. Shaulian E, Karin M. AP-1 as a regulator of cell life and death // Nat Cell Biol. 2002. - Vol. 4. - P. E131-6.

318. Shaw, A., and Q. Xu. Biomechanical stress-induced signaling in smooth muscle cells: an update // Curr Vase Pharmacol. 2003. - Vol. 1. - P.41-58.

319. Shiffman D, Mikita T, Tai JT, Wade DP, Porter JG, Seilhamer JJ, Somogyi R, Liang S, Lawn RM. Large scale gene expression analysis of cholesterol-loaded macrophages // J Biol Chem. 2000. - Vol. 275. - P. 37324-32.

320. Sidawy AN, Mitchell ME, Neville RF. Peptide growth factors and signal transduction//Semin Vase Surg. 1998.-Vol. 11.-P. 149-55.

321. Siegbahn A, Hammacher A, Westermark B, Heldin CH. Differential effects of the various isoforms of platelet-derived growth factor on chemotaxis of fibroblasts, monocytes, and granulocytes // J Clin Invest. 1990. - Vol. 85. -P. 916-20.

322. Smedly, L.A., M.G. Tonnesen, R.A. Sandhaus, C. Haslett, L.A. Guthrie, R.B. Johnston, P.M. Henson, and G.S. Worthen. Neutrophil-mediated injury to endothelial cells // J Clin Invest. 1986. - Vol. 77. - P. 1233-1243.

323. Sohma Y, Sasano H, Shiga R, Saeki S, Suzuki T, Nagura H, Nose M, and Yamamoto T. Accumulation of plasma cells in atherosclerotic lesions of Watanabe heritable hyperlipidemic rabbits // Proc Natl Acad Sci USA. -1995.-Vol. 92.-P. 4937-4941.

324. Song D, Sakamoto S, Taniguchi T. Inhibition of poly(ADP-ribose) polymerase activity by Bcl-2 in association with the ribosomal protein S3a // Biochemistry. 2002. - Vol. 41. - P. 929-34.

325. Spaet TH, Stemerman MB, Veith FJ, Lejnieks I. Intimal injury and regrowth in the rabbit aorta; medial smooth muscle cells as a source of neointima // Circ Res. 1975. - Vol. 36. - P. 58-70.

326. Sporn MB, Roberts AB, Wakefield LM, de Crombrugghe B. Some recent advances in the chemistry and biology of transforming growth factor-beta // J Cell Biol. 1987. - Vol. 105. - P. 1039-45.

327. Springer ТА. Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm//Cell. 1994.-Vol. 76.-P. 301-14.

328. Stanton LW. Methods to profile gene expression // Trends Cardiovasc Med. -2001.-Vol. 11.-P. 49-54.

329. Thromb Vase Biol. 1995.-Vol. 15.-P. 1512-1531.

330. Stary HC, McMillan GC. Kinetics of cellular proliferation in experimental atherosclerosis. Radioautography with drain counts in cholesterol-fed rabbits//Arch Pathol. 1970.-Vol. 89.-P. 173-183.

331. Steinberg D, Parthasarathy S, Carew ТЕ, Khoo JC, Witztum JL. Beyond cholesterol. Modifications of low-density lipoprotein that increase its atherogenicity // N Engl J Med. 1989. - Vol. 320. - P. 915-24.

332. Steinberg D. At last, direct evidence that lipoxygenases play a role in atherogenesis//J Clin Invest. 1999.-Vol. 103.-P. 1487-8.

333. Steinberg D. Lipoproteins and pathogenesis of atherosclerosis // Circulation. 1987. - Vol. 76. - P. 508-514.

334. Stemme S, Faber B, Holm J, Wiklund O, Witztum JL, and Hansson GK. T lymphocytes from human atherosclerotic plaques recognize oxidized low density lipoprotein // Proc Natl Acad Sci U S A. 1995. - Vol. 92. - P. 3893-3897.

335. Stemme S, Holm J, Hansson GK. T lymphocytes in human atherosclerotic plaques are memory cells expressing CD45RO and the integrin VLA-1 // Arterioscler Thromb. 1992. - Vol. 12. - P. 206-11.

336. Stepien O, Zhang Y, Zhu D, Marche P. Dual mechanism of action of amlodipine in human vascular smooth muscle cells // J Hypertens. 2002. -Vol. 20.-P. 95-102.

337. Storey JD, Tibshirani R.Statistical methods for identifying differentially expressed genes in DNA microarrays // Methods Mol Biol. 2003. - Vol. 224.-P. 149-57.

338. Stouffer GA, Owens GK. Angiotensin II induced mitogenesis of spontaneously hypertensive rat derived cultured smooth muscle cells is dependent on autocrine production of transforming growth factor-b // Circ Res. - 1992. - Vol. 70. - P. 820-8.

339. Sturn A, Quackenbush J, Trajanoski Z. Genesis: cluster analysis of microarray data // Bioinformatics. 2002. - Vol. 18. - P. 207-8.

340. Sukhanov S, Hua Song Y, Delafontaine P.Global analysis of differentially expressed genes in oxidized LDL-treated human aortic smooth muscle cells // Biochem Biophys Res Commun. 2003. - Vol. 306. - P. 443-9.

341. Sutcliffe MC, Davidson JM. Effect of static stretching on elastin production by porcine aortic smooth muscle cells // Matrix. 1990. - Vol. 10. - P. 14853.

342. Suzuki H, Kurihara Y, Takeya M, Kamada N,Kataoka M, Jishage K, Ueda O, Sakaguchi H, Higashi, et al. A role for macrophage scavenger receptors in atherosclerosis and susceptibility to infection // Nature. 1997. - Vol. 386.-P. 292-296.

343. Tabas I. Apoptosis and plaque destabilization: the role of macrophage apoptosis induced by cholesterol // Cell Death & Differentiation. 2004. -Vol. 11.-P. S12-S16.

344. Tabas I. Consequences and therapeutic implications of macrophage apoptosis in atherosclerosis: the importance of lesion stage and phagocytic efficiency // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2005. - Vol. 25. - P. 22552264.

345. Takahashi K, Takeya M, Sakashita N. Multifunctional roles of macrophages in the development and progression of atherosclerosis in humans and experimental animals // Med Electron Microsc. 2002. - Vol. 35. - P. 179203.

346. Tall AR, Jiang X, Luo Y, Silver D.1999 George Lyman Duff memorial lecture: lipid transfer proteins, HDL metabolism, and atherogenesis // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2000. - Vol. 20. - P. 1185-8.

347. Taniyama Y, Griendling KK. Reactive oxygen species in the vasculature: molecular and cellular mechanisms // Hypertension. 2003. - Vol. 42. - P. 1075-81.

348. Tarrant JM, Robb L, van Spriel AB, Wright MD. Tetraspanins: molecular organisers of the leukocyte surface // Trends Immunol. 2003. - Vol. 24. -P. 610-7.

349. Tedgui A, Mallat Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall // Circ Res.-2001.-Vol. 88.-P. 877-87.

350. Tedgui A, Mallat Z. Cytokines in atherosclerosis: pathogenic and regulatory pathways // Physiol Rev. 2006. - Vol. 86.-P. 515-81.

351. Terpstra V, van Amersfoort ES, van Velzen AG, Kuiper J, van Berkel TJ. Hepatic and extrahepatic scavenger receptors: function in relation to disease // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2000. - Vol. 20. - P. 1860-72.

352. Tertov V.V., Sobenin IA., Gabbasov ZA et al., Multiple-modified desialylated low density lipoproteins that cause intracellular lipidaccumulation. Isolation, fractionation and characterization // Lab Invest. -1992. Vol. 67. - P. 665-675.

353. Thomas KA.Vascular endothelial growth factor, a potent and selective angiogenic agent // J Biol Chem. 1996. - Vol. 271. - P. 603-6.

354. Thyberg J., Nilsson J., Palmberg L., Sjolund M. Adult human arterial smooth muscle cells in primary culture. Modulation from contractile to synthetic phenotype // Cell Tissue Res. 1985. - Vol. 239. - P. 69-74.

355. Tobias P and Curtiss LK. Thematic review series: The immune system and atherogenesis. Paying the price for pathogen protection: toll receptors in atherogenesis // J Lipid Res. 2005. - Vol. 46. - P. 404-411.

356. Tontonoz P, Nagy L, Alvarez JG, Thomazy VA, Evans RM. PPARgamma promotes monocyte/macrophage differentiation and uptake of oxidized LDL // Cell. 1998. - Vol. 93. - P. 241-52.

357. Tran PK, Agardh HE, Tran-Lundmark K, Ekstrand J, Roy J, Henderson B, et al. Reduced perlecan expression and accumulation in human carotid atherosclerotic lesions // Atherosclerosis. 2007. - Vol. 190. - P. 264-70.

358. Tsunawaki S, Sporn M, Ding A, Nathan C.Deactivation of macrophages by transforming growth factor-beta // Nature. 1988. - Vol. 334. - P. 260-2.

359. Tupin E, Nicoletti A, Elhage R, Rudling M, Ljunggren HG, Hansson GK, and Berne GP. CD ld-dependent activation of NKT cells aggravates atherosclerosis // J Exp Med. 2004. - Vol. 199. - P. 417-422.

360. Umehara, H., E.T. Bloom, T. Okazaki, Y. Nagano, O. Yoshie, and T. Imai. Fractalkine in Vascular Biology // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2004. -Vol. 24.-P. 34-40.

361. Van Zwieten, P.A. The role of angiotensin II receptors and their antagonists in hypertension // Ann Ital Med Int. 2000. - Vol. 15. - P. 85-91.

362. Vanderlaan PA and Reardon CA. Thematic review series: the immune system and atherogenesis. The unusual suspects:an overview of the minor leukocyte populations in atherosclerosis // J Lipid Res. 2005. - Vol. 46. -P. 829-838.

363. Velculescu VE, Madden SL, Zhang L, Lash AE, Yu J, Rago C, Lai A, Wang CJ, et al. Analysis of human transcriptomes // Nat Genet. 1999. -Vol. 23.-P. 387-8.

364. Vellaichamy E, Khurana ML, Fink J, Pandey KN. Involvement of the NF-kappa B/matrix metalloproteinase pathway in cardiac fibrosis of mice lacking guanylyl cyclase/natriuretic peptide receptor A // J Biol Chem. -2005. Vol. 280. - P. 19230-42.

365. Vemuganti R, Dempsey RJ. Increased expression of genes that control ionic homeostasis, second messenger signaling and metabolism in the carotid plaques from patients with symptomatic stroke // J Neurochem. 2006. -Vol. 97.-P. 92-6.

366. Virgili F, Ambra R, Muratori F, Natella F, Majewicz J, Minihane AM, Rimbach G. Effect of oxidized low-density lipoprotein on differential gene expression in primary human endothelial cells // Antioxid Redox Signal. -2003.-Vol. 5.-P. 237-47.

367. Wabnitz GH, Kocher T, Lohneis P, Stober C, Konstandin MH, Funk B, et al. Costimulation induced phosphorylation of L plastin facilitates surface transport of the T cell activation molecules CD69 and CD25 // Eur J Immunol. 2007. - Vol. 37. - P. 649-662.

368. Walczak R, Tontonoz P. PPARadigms and PPARadoxes: expanding roles for PPARgamma in the control of lipid metabolism // J Lipid Res. 2002. -Vol. 43.-P. 177-86.

369. Waltenberger J, Lundin L, Oberg K, Wilander E, Miyazono K, Heldin CH,

370. Funa К. Involvement of transforming growth factor-beta in the formation of fibrotic lesions in carcinoid heart disease // Am J Pathol. 1993a. - Vol. 142.-P. 71-8.

371. Waltenberger J, Wanders A, Fellstrom B, Miyazono K, Heldin CH, Funa K. Induction of transforming growth factor-beta during cardiac allograft rejection//J Immunol. 1993b.-Vol. 151.-P. 1147-57.

372. Waltenberger J. Modulation of growth factor action: implications for the treatment of cardiovascular diseases // Circulation. 1997. - Vol. 96. - P. 4083-94.

373. Wang X, Reape TJ, Li X, Rayner K, Webb CL, Burnand KG, Lysko PG. Induced expression of adipophilin mRNA in human macrophages stimulated with oxidized low-density lipoprotein and in atherosclerotic lesions // FEBS Lett. 1999. - Vol. 462. - P. 145-50.

374. Wang X, Yue TL, Ohlstein EH, Sung CP, Feuerstein GZ. Interferon-inducible protein-10 involves vascular smooth muscle cell migration, proliferation, and inflammatory response // J Biol Chem. 1996. -Vol. 271. -P. 24286-93.

375. Wang XQ, Panousis CG, Alfaro ML, Evans GF, Zuckerman SH. Interferon-gamma-mediated downregulation of cholesterol efflux and ABC1 expression is by the Statl pathway // Arterioscler Thromb Vase Biol. -2002.-Vol. 22.-P. e5-9.

376. Ward C, Dransfield I, Chilvers ER, Haslett C, Rossi AG.Pharmacological manipulation of granulocyte apoptosis: potential therapeutic targets // Trends Pharmacol Sci. 1999. - Vol. 20. - P. 503-9.

377. Ward Y, Kelly K. Gem protein signaling and regulation // Methods Enzymol. 2006. - Vol. 407. - P. 468-83.

378. Weis M, Schlichting CL, Engleman EG, and Cooke JP. Endothelial determinants of dendritic cell adhesion and migration: new implications for vascular diseases // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002. - Vol. 22. - P. 1817-1823.

379. Whitman SC, Ravisankar P, and Daugherty A. IFNgamma deficiency exerts gender-specific effects on atherogenesis in apolipoprotein E-/- mice // J Interferon Cytokine Res. 2002a. - Vol. 22. - P. 661-670.

380. Whitman SC, Ravisankar P, and Daugherty A. Interleukin-18 enhances atherosclerosis in apolipoprotein E(-/-) mice through release of interferon-gamma // Circ Res. 2002b. - Vol. 90. - P. E34-E38.

381. Whitman SC, Ravisankar P, Elam H, and Daugherty A. Exogenous interferon-gamma enhances atherosclerosis in apolipoprotein E-/- mice // Am J Pathol.-2000.-Vol. 157.-P. 1819-1824.

382. Wick G, Romen M, Amberger A, Metzler В, Mayr M, Falkensammer G, and Xu Q. Atherosclerosis, autoimmunity, and vascular-associated lymphoid tissue // FASEB J. 1997. - Vol. 11. - P. 1199-1207.

383. Williams B. The year in hypertension // J Am Coll Cardiol. 2006. - Vol. 48.-P. 1698-711.

384. Williams KJ. Arterial wall chondroitin sulfate proteoglycans: diverse molecules with distinct roles in lipoprotein retention and atherogenesis // Curr Opin Lipidol. 2001. - Vol. 12. - P. 477-87.

385. Wissler RW. The arterial medial cell, smooth muscle or multifunctional mesenchyme // J Atheroscler Res. 1968. - Vol.8. - P. 201-213.

386. Wissler RW., Moskowitz M., Hunghes R., Petrie L. A study of the gistogenesis of atherosclerosis in man // Circulation. 1958. - Vol.18. - P. 497-503.

387. Wlodarski P, Zhang Q, Liu X, Kasprzycka M, Marzec M, Wasik MA. PU.l activates transcription of SHP-1 gene in hematopoietic cells // J Biol Chem. -2007.-Vol. 282.-P. 6316-23.

388. Xia Z, Dickens M, Raingeaud J, Davis RJ, Greenberg ME. Opposing effects of ERK and JNK-p38 MAP kinases on apoptosis // Science. 1995. -Vol. 270.-P. 1326-31.

389. Xie B, Dong Z, Fidler IJ. Regulatory mechanisms for the expression of type IV collagenases/gelatinases in murine macrophages // J Immunol. 1994. -Vol. 152.-P. 3637-44.

390. Xu C, Zarins CK, Bassiouny HS, Briggs WH, Reardon C, Glagov S. Differential transmural distribution of gene expression for collagen types I and III proximal to aortic coarctation in the rabbit // J Vase Res. 2000. -Vol. 37.-P. 170-82.

391. Xu Q, Dietrich H, Steiner HJ, Gown AM, Schoel B, Mikuz G, Kaufmann SH, and Wick G. Induction of arteriosclerosis in normocholesterolemic rabbits by immunization with heat shock protein 65 // Arterioscler Thromb. 1992.-Vol. 12.-P. 789-799.

392. Xu Q. Role of heat shock proteins in atherosclerosis // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2002. - Vol. 22. - P. 1547-1559.

393. Xu XH, Shah PK, Faure E, Equils O, Thomas L, Fishbein MC, et al. Tolllike receptor-4 is expressed by macrophages in murine and human lipidrich atherosclerotic plaques and upregulated by oxidized LDL II Circulation. -2001.-Vol. 104.-P. 3103-3108.

394. Yamada T, Horiuchi M, Dzau VJ. Angiotensin II type 2 receptor mediates programmed cell death // Proc Natl Acad Sci USA.- 1996. Vol. 93. - P. 156-160.

395. Yamada Y, Doi T, Hamakubo T, Kodama T. Scavenger receptor family proteins: roles for atherosclerosis, host defence and disorders of the centralnervous system // Cell Mol Life Sci. 1998. - Vol. 54. -P. 628-40.

396. Yang J, Moravec CS, Sussman MA, DiPaola NR, Fu D, Hawthorn L, et al. Decreased SLIM1 expression and increased gelsolin expression in failing human hearts measured by high-density oligonucleotide arrays // Circulation. 2000. - Vol. 102. - P. 3046-3052.

397. Yap AS, Kovacs EM. Direct cadherin-activated cell signaling: a view from the plasma membrane // J Cell Biol. 2003. - Vol. 160. - P. 11-6.

398. Yilmaz A, Lochno M, Traeg F, Cicha I, Reiss C, Stumpf C, Raaz D, et al. Emergence of dendritic cells in rupture-prone regions of vulnerable carotid plaques // Atherosclerosis. 2004. - Vol. 176. - P. 101-110.

399. Yla-Herttuala S, Palinski W, Butler SW, Picard S, Steinberg D, and Witztum JL. Rabbit and human atherosclerotic lesions contain IgG that recognizes epitopes of oxidized LDL // Arterioscler Thromb. 1994. - Vol. 14.-P. 32-40.

400. Yla-Herttuala S, Palinski W, Rosenfeld ME, Parthasarathy S, Carew ТЕ, et al. Evidence for the presence of oxidatively modified low density lipoprotein in atherosclerotic lesions of rabbit and man // J Clin Invest. -1989.-Vol. 84.-P. 1086-95.

401. Yla-Herttuala S, Salonen JT. Role of lipid oxidation in the development of atherosclerosis // Duodecim. 1994. - Vol. 110. - P. 1643-52.

402. Yoshii T, Iwai M, Li Z, Chen R, Ide A, Fukunaga S, Oshita A, Mogi M, Higaki J, Horiuchi M. Regression of atherosclerosis by amlodipine via antiinflammatory and anti-oxidative stress actions // Hypertens Res. 2006. -Vol. 29.-P. 457-466.

403. Yunta M, Lazo PA. Apoptosis protection and survival signal by the CD53 tetraspanin antigen // Oncogene. 2003a. - Vol. 22. - P. 1219-1224.

404. Yunta M, Lazo PA. Tetraspanin proteins as organisers of membrane microdomains and signalling complexes // Cell Signal. 2003. - Vol. 15. -P. 559-64.

405. Yunta M, Rodri'guez-Barbero A, Arevalo MA, Lopez-Novoa JM, Lazo PA. Induction of DNA synthesis by ligation of the CD53 tetraspanin antigen in primary cultures of mesangial cells // Kidney Int. 2003b. - Vol. 63. - P. 534-542.

406. Zargham R, Thibault G. Alpha 8 integrin expression is required for maintenance of the smooth muscle cell differentiated phenotype //

407. Cardiovasc Res.-2006.-Vol. 71.-P. 170-8.

408. Zernecke A, Bot I, Djalali-Talab Y, Shagdarsuren E, Bidzhekov K, Meiler S, et al. Protective role of CXC receptor 4/CXC ligand 12 unveils the importance of neutrophils in atherosclerosis // Circ Res. 2008b. - Vol. 102. -P. 209-17.

409. Zernecke A, Shagdarsuren E, Weber C. Chemokines in Atherosclerosis. An Update // Arterioscler Thromb Vase Biol. 2008a. - Vol. 28. - P. 1897-908.

410. Zhou D, Yang PY, Zhou B, Rui YC. Fibrin D-dimer fragments enhance inflammatory responses in macrophages: role in advancing atherosclerosis // Clin Exp Pharmacol Physiol. 2007. -Vol. 34. -P. 185-90.

411. Zhou X and Hansson GK. Detection of В cells and proinflammatory cytokines in atherosclerotic plaques of hypercholesterolaemic apolipoprotein E knockout mice // Scand J Immunol. 1999. - Vol. 50. - P. 25-30.

412. Zhu W, Roma P, Pellegatta F, and Catapano AL. Oxidized-LDL induce the expression of heat shock protein 70 in human endothelial cells // Biochem Biophys Res Commun. 1994. - Vol. 200. - P. 389-394.

413. Zhu WM, Roma P, Pirillo A, Pellegatta F, and Catapano AL. Oxidized LDL induce hsp70 expression in human smooth muscle cells // FEBS Lett. -1995.-Vol. 372. P. 1-5.

414. Zurgil N, Afrimzon E, Shafran Y, Shovman O, Gilburd B, Brikman H, Shoenfeld Y, Deutsch M. Lymphocyte resistance to lysophosphatidylcholine mediated apoptosis in atherosclerosis // Atherosclerosis. 2007. - Vol. 190. - P. 73-83.