Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Миграция лейкоцитов и способы ее регуляции при атеросклерозе

ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Миграция лейкоцитов и способы ее регуляции при атеросклерозе"

На правах рукописи

Арефьева Татьяна Игоревна «Миграция лейкоцитов и способы ее регуляции при атеросклерозе»

03.03.04. - Клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

1 9 СЕН 2013

МОСКВА-2013

005533193

Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунологии Института экспериментальной кардиологии и в отделе хронической ишемической болезни сердца НИИ Кардиологии им А.Л.Мясникова ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный комплекс» МЗ РФ

Научные консультанты: доктор биологических наук

Красникова Татьяна Леонидовна,

академик РАН, РАМН Чазов Евгений Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник лаборатории механизмов канцерогенеза Института канцерогенеза ФГБУ "Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина" РАМН

Александрова Антонина Юрьевна

доктор биологических наук, старший научный сотрудник лаборатории клеточной пролиферации Института биологии развития им Н.К.Кольцова РАН Воротеляк Екатерина Андреевна

доктор биологических наук, руководитель отдела электронной микроскопии НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова Киреев Игорь Игоревич

Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный Исследовательский медицинский университет им Н.И.Пирогова» МЗ РФ

.....

Защита состоится......заседании диссертационного

совета Д208.073.01 по присуждению ученой степени доктора наук при ФГБУ «РКНПК» МЗ СФ (121552, Москва, 3 Черепковская ул., д. 15а).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ

Автореферат разослан.. .0.^)..........2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, д.м.н.

Сергиенко И.В.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Сердечно-сосудистые заболевания, в частности, ишемическая болезнь сердца (ИБС), представляют собой одну из основных причин преждевременной смертности населения экономически развитых стран (Харченко с соавт., 2005). Морфологической основой ИБС более чем в 95% случаев является атеросклероз коронарных артерий {Чазов, 1997). Согласно общепринятому мнению, в основе атерогенеза лежат воспалительные и аутоиммунные реакции, развивающиеся в стенке артерий на фоне нарушения липидного обмена и повреждения эндотелия. Воспаление сопровождается накоплением лейкоцитов в интиме и продукцией широкого спектра цитокинов и других биологически активных веществ, способствующих формированию атеросклеротического поражения. Обострение воспалительного процесса в атеросклеротической бляшке может вызвать ее повреждение и последующий тромбоз, что проявляется клинически как острый коронарный синдром. При атеросклерозе, как и при системных воспалительных заболеваниях, в кровотоке увеличивается содержание белков острой фазы и цитокинов, появляются активированные лейкоциты и тромбоциты. В клинических исследованиях у пациентов с ИБС выявлена связь между высокой концентрацией «маркеров» воспаления в крови и негативным прогнозом заболевания (Ross, 1999; Libby, 2000; Hansson, Libby, 2006).

Ключевую роль в инициировании и поддержании воспалительного процесса в стенке сосуда играют моноциты. В атероме моноциты дифференцируются в пенистые клетки, нагруженные липидами, и в макрофаги, участвующие в иммунных реакциях и продуцирующие воспалительные медиаторы. Многие из этих веществ оказывают хемотаксическое и митогенное действие на гладкомышечные клетки сосудистой стенки, повреждающее действие на эндотелий, способствуя локальной вазоконстрикции и пристеночному тромбообразованию. Помимо моноцитов в «зрелых» атеросклеротических бляшках обнаружены клетки адаптивного иммунитета, среди которых преобладают Т-хелперные клетки 1 типа. Т-лимфоциты «узнают» аутоантигены (окисленные липопротеиды низкой плотности, белки теплового шока и др.), представленные макрофагами и дендритными клетками, и продуцируют цитокины, в частности, интерферон-у, которые вызывают активацию моноцитов, лимфоцитов и гладкомьппечных клеток, стимулируют продукцию хемокинов и способствуют дальнейшему привлечению лейкоцитов в стенку сосуда (Andersson et al, 20/0/Регуляторные Т-клетки являются основной субпопуляцией Т-лимфоцитов, угнетающих реактивность эффекторных клеток иммунной системы в отношении собственных и чужеродных антигенов (Ярилин, 2007). В ряде исследований, выполненных на животных, доказана «антиатерогенная» роль регуляторных Т-клеток (Mallat et al., 2003; Мог et al., 2007; Ait-Oufella et al., 2006; Feng et al., 2009). Оценка состояния данного звена клеточного иммунитета при атеросклерозе у человека и анализ терапевтического потенциала иммуномодуляторных воздействий при

ИБС являются на сегодняшний день задачами исследований ведущих мировых лабораторий.

Воспаление является неотъемлемым звеном восстановления целостности ткани при ее повреждении, в том числе при ишемическом некрозе миокарда. Современные достижения в лечении больных с инфарктом миокарда связаны с разработкой способов быстрого восстановления кровотока в коронарной артерии. Клинических подходов, действующих на процесс восстановления миокарда, на сегодняшний день нет. Моноциты/макрофаги необходимы для ранозаживления. Благодаря способности к фагоцитозу эти клетки принимают участие в очищении раны от продуктов распада ткани. Основной вклад моноцитов/макрофагов в восстановление тканей заключается в продукции широкого спектра цитокинов и факторов роста; эти медиаторы вызывают хемотаксис и пролиферацию фибробластов, эндотелиальных клеток, синтез белков внеклеточного матрикса и т.о. играют триггерную роль в репарации ткани {Wahl, 1985; Barbul, 1990). Подавление воспалительной реакции в поврежденном миокарде может привести к несостоятельности рубца и образованию аневризмы. С другой стороны, чрезмерная воспалительная реакция может оказать дополнительное повреждающее действие на миокард (Matsui ei al., 2010). Таким образом, модулирование воспаления дает уникальную возможность для оптимизации процесса заживления и предупреждения отрицательного ремоделирования желудочка сердца в отдаленные сроки после инфаркта.

Выход лейкоцитов из кровотока и миграция в тканях - многоступенчатый процесс, зависящий от уровня активации клеток цитокинами и особенностей их взаимодействия с другими клетками и белками межклеточного матрикса (Fabbri et al., 1999). Молекулы адгезии лейкоцитов способны связываться с лигандами эндотелиальных и гладкомышечных клеток, фибробластов, тромбоцитов, с сывороточными белками и белками внеклеточного матрикса. Наиболее значимую роль в миграции лейкоцитов в очаг воспаления/повреждения тканей играют специфические для лейкоцитов ß2-интегрины, т.к. они взаимодействуют с поверхностными молекулами эндотелия и тромбоцитов, а также с фибрин(оген)ом (Hynes, 1992). Способность мигрирующих клеток преодолевать барьеры из белков внеклеточного матрикса зависит от активности протеолитических ферментов на поверхности клеток. Система активации плазминогена, которая включает плазминоген, активаторы и ингибиторы плазминогена, а также связывающие их поверхностные белки и рецепторы, играет центральную роль в клеточной инвазии (Andreasen et al., 2000). Направление движения лейкоцитов в тканях определяется градиентом концентрации хемотаксических цитокинов — хемокинов.

Семейство хемокинов объединяет ряд небольших по молекулярной массе (около 10 кДа) оснбвных белков. Хемокины вырабатываются практически всеми типами клеток и контролируют миграцию лейкоцитов в условиях гомеостаза (распределение клеток в лимфоидных органах) и при воспалении. Помимо хемоаттрактантных свойств хемокины участвуют в активации клеток,

сопровождающейся продукцией активных форм кислорода, цитокинов и протеолитических ферментов, влияют на апоптоз и другие клеточные процессы. Действие хемокинов опосредовано Gi-белок сопряженными рецепторами. Для стимуляции хемотаксиса клеток в условиях крово - и лимфотока необходимо создание концентрационного градиента хемокинов за счет их связывания с гликозаминогликанами (ГАГ), гепарином/гепарансульфатом, на поверхности клеток и в составе внеклеточного матрикса. В связи с этим, молекулы, препятствующие связыванию хемокинов с ГАГ, также могут оказывать влияние на миграцию лейкоцитов in vivo (Baggiolini, 1998; Murdoch, Finn, 2000; Mackay, 2001¡Handel et al, 2005).

Моноцитарный хемотаксический белок — 1 (МСР-1) является ключевым хемокином в приложении к хроническому воспалительному процессу, в частности, атерогенезу (Weber С et al., 2004; 2008). МСР-1 продуцируется в очаге воспаления различными типами клеток, основной мишенью МСР-1 являются моноциты, МСР-1 также стимулирует миграцию активированных лимфоцитов и эндотелиальных клеток (Boring et al., 1998). Ведущая роль МСР-1 в формировании атеросклеротических поражений продемонстрирована в экспериментах с использованием мышей, «нокаутированных» по генам МСР-1 или его рецептора CCR2, а также при введении животным блокирующих МСР-1 антител (Boring et al., 1997; Kuziel et al., 1997; Kurihara et al., 1997; Gu et al., 1998, Dawson et al., 1999). В ряде клинических исследований подтверждена неблагоприятная прогностическая роль высокого содержания МСР-1 в крови в развитии осложнений ИБС, показана связь повышенного уровня циркулирующего МСР-1 с «надрывом» атеросклеротической бляшки у пациентов с острым коронарным синдромом (Kang et al., 2007). Получены генетические подтверждения участия МСР-1 в обострении ИБС - гаплотип с аллелью гена МСР-1 -2518G оказался ассоциирован с увеличенным риском развития инфаркта миокарда (Tabara et al., 2003). Значительная роль МСР-1 в инициировании и поддержании воспаления стимулировала исследования по получению антагонистов МСР-1 и его рецептора CCR2 (Alegretti et al., 2012). В настоящее время ведущими научно-исследовательскими лабораториями и фармакологическими компаниями разрабатываются препараты на основе химических антагонистов рецептора МСР-1, антител к МСР-1 и его рецептору, мутантных форм МСР-1, а также пептидных фрагментов хемокина. Некоторые из них прошли или проходят клинические испытания у пациентов с системными аутоиммунными воспалительными заболеваниями, однако данные о позитивном клиническом эффекте их применения пока не опубликованы.

Цель настоящего исследования состояла в определении молекулярных мишеней для воздействия на миграцию лейкоцитов при сердечно-сосудистой патологии, в получении веществ с активирующим и ингибирующим действием на клеточную подвижность.

Задачи исследования включали следующее.

1. Анализ клеточного состава и спектра цитокинов, экспрессируемых в атеросклеротических бляшках коронарных артерий человека. Определение

содержания хемокина MCP-I в крови больных ишемической болезнью сердца.

2. Оценка фенотипа мононуклеарных лейкоцитов периферической крови при ИБС. Идентификация циркулирующих активированных эффекторных и регуляторных Т-лимфоцитов. Изучение экспрессии моноцитами крови молекул адгезии и компонентов фибринолитической системы.

3. Оценка роли молекул из семейства р2-интегринов в адгезии и миграции моноцитов в присутствии МСР-1.

4. Изучение внутриклеточных каскадов, активируемых хемокинами и участвующих в миграции моноцитов, лимфоцитов и эндотелиальных клеток.

5. Тестирование пептидных фрагментов МСР-1 по их влиянию на миграцию клеток in vitro и in vivo у различных экспериментальных животных. Изучение механизма действия пептидных фрагментов на клеточную подвижность. Оценка возможности использования целевых пептидов в клинической практике.

Научная новизна и практическая значимость работы. Основные результаты исследования имеют приоритетный характер. Методами прямой иммунофлуоресценции и поточной цитометрии исследован фенотип лейкоцитов, выделенных из атеросклеротических бляшек коронарных артерий человека; с помощью обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР) выполнен комплексный анализ экспрессии генов цитокинов, в том числе хемокинов, в атеросклеротических бляшках, обнаружена мРНК маркерного для регуляторных Т-клеток белка foxp3. У пациентов с ИБС показано увеличение содержания активатора плазминогена урокиназного типа (урокиназы) в крови и на мембране циркулирующих моноцитов, при нестабильной стенокардии выявлено повышение концентрации МСР-1 в плазме. Получены данные об отрицательной связи между количеством циркулирующих регуляторных Т-лимфоцитов и степенью атеросклеротического поражения коронарных артерий. С использованием выделенных из крови доноров моноцитов, лимфоцитов и нейтрофильных гранулоцитов, эндотелиальных клеток пупочной вены человека, а также клеточных линий и их клонов, различающихся по уровню экспрессии лейкоцитарных Р2-интегринов, изучены механизмы хемокин-стимулированной миграции клеток, определены «критические» участники среди молекул адгезии и внутриклеточных сигнальных молекул. Показано, что ведущую роль в МСР-1-зависимой миграции моноцитов на фибриногене играют р2-интегрины CDllc/CD18, в то время как молекулы CDllb/CD18 ответственны за прочное прикрепление клеток к данному матриксу. Обнаружено, что сигнальные каскады, участвующие в миграции клеток в присутствии МСР-1, различаются в моноцитах и эндотелиальных клетках: в хемотаксисе моноцитов задействована митоген-активируемая киназа р38 и киназы семейства src, подвижность эндотелия контролируется фосфатидилинозитол-3-киназой и митоген-активируемыми киназами р42/44 (ERK1/2). Выявлено ингибирующее действие блокатора протеинкиназы mTOR рапамицина на миграцию С04+лимфоцитов, находящихся в стадии бласттрансформации. По действию на клеточную подвижность в культуре

протестировано 15 пептидных фрагментов, соответствующих различным участками первичной структуры молекулы МСР-1; выбраны пептиды с МСР-1 -ингибирующим (65-76, пептид X) и стимулирующим (29-40, пептид IX) действием на миграцию моноцитов in vitro. Противовоспалительная активность пептида X (Инграмона) продемонстрирована в моделях у грызунов и приматов, а также при введении пациентам с ИБС. Определен механизм подавления миграции клеток в присутствии пептида X: он связан с вытеснением хемокинов, в частности МСР-1 и ИЛ-8, с сайтов связывания с ГАГ. Показано, что пептид IX стимулирует миграцию моноцитов in vivo, способствует ранозаживлению и обладает кардиопротекторным действием при введении в зону инфаркта у экспериментальных животных.

Результаты исследования способствуют получению новых знаний о механизмах атерогенеза. На основании данных об изменении субпопуляционного состава лимфоцитов крови при ИБС, коронарном атеросклерозе, возможна разработка диагностической системы для выявления пациентов с увеличенным риском прогрессии заболевания. Исследования механизмов миграции лейкоцитов и получение препаратов, влияющих на клеточную подвижность, могут лежать в основе новых подходов к лечению больных ИБС, связанных с регуляцией поступления клеток в очаг воспаления.

Апробация диссертационной работы состоялась 28 марта 2013г. на заседании Ученого совета Института экспериментальной кардиологии ФГБУ «РКНПК» МЗ РФ. Диссертация рекомендована к защите.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 26 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных журналах. Получено 2 патента на изобретение. Различные разделы исследования были представлены и опубликованы в виде тезисов докладов на отечественных и зарубежных конгрессах, в том числе: International Society of Thrombosis and Hemostasis Meeting (1997), ESC (European Society of Cardiology) Congress (1997, 2004, 2010), Xth World Congress of Heart Failure (1997), 70th Congress of European atherosclerosis Society (1998), Annual Scientific Meeting of the British Society for Hematology (1998), 8th International Congress on Cardiovascular Pharmacotherapy (1999), European Meeting on Hypertension (1999, 2004a, 2004b, 2005, 2006a, 2006b, 2009a, 2009b), 16th International Congress on Thrombosis (2000), International Congress on Coronary Artery Disease (2000, 2009), Симпозиум «Экспериментальные и клинические проблемы атеросклероза (2000), Abstracts of International Young Medics' Conference "Young Doctors on the threshold of the third Millennium" (2001), XXXVIII European Renal Association Congress (2001), International Symposium "Biological motility: new trends in research" (2001), Российский Национальный Конгресс Кардиологов (2003), Российский симпозиум по химии и биологии пептидов (2003, 2005), Bioscience (2006), Российский симпозиум "Белки и пептиды" (2007а, 20076, 2009, 20096, 2011, 2013), Симпозиум "Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств" (2008), 20th European Meeting on

Hypertension and Cardiovascular prevention (2010), 81 EAS (European Atherosclerosis Society) Congress (2013).

Структура работы. Диссертация изложена на 290 страницах, содержит 20 таблиц и 55 рисунков, состоит из введения, списка сокращений, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов, обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы (652 источника).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследование выполнено на образцах периферической крови 145 пациентов с ИБС, стабильной и нестабильной стенокардией, проходивших лечение в отделе хронической ИБС НИИКК им. А.Л.Мясникова, а также 24 условно здоровых донора. Фенотипирование лейкоцитов проводили с использованием флуоресцентно-меченных моноклональных антител (мкАТ, BD Biosciences, R&DSystems и BeckmanCoulter), специфичных к антигенам лейкоцитов человека: CD3, CD4, lin (коктейль мкАТ к лейкоцитам), CD lib, CDllc, CD 14, CD25, CD127, CD25, CD45, CXCR3, CCR2, - а также реактивов для лизиса эритроцитов и фиксации клеток (BD Biosciences). Активированные хелперные CD4+CD25lowCD 127high и регуляторные CD4+CD15highCD1271ow Т-лимфоциты типировали в соответствии с международными рекомендациями {Hoffman, 2007). Для выявления внутриклеточного белка foxp3 использовали набор фирмы eBioscience, включающий флуоресцентно-меченные антитела крысы к foxp3 человека, изотипический контроль, реактивы для фиксации и пермеабилизации клеток. Для оценки количества мембранных рецепторов урокиназы и урокиназы на поверхности лейкоцитов использовали мкАТ мыши к рецепторам урокиназы (American Diagnostica) и к урокиназе (лаб. иммунохимии НИИЭК) человека, анти-мышиные флюоресцеинизотиоционат-меченные AT козы (BD Biosciences). Для предупреждения диссоциации урокиназы из комплексов с мембранными сайтами связывания образцы крови фиксировали параформальдегидом. Флюоресценцию клеток измеряли методом цитофлюориметрии в потоке на приборах FACSCan и FACSCalibur (Becton Dickinson Immunocytometry Systems). Для активации лейкоцитов в «цельной» крови в аликвоту периферической крови в цитратном антикоагулянте добавляли 0.5 мкг/мл липополисахарида (ЛПС E.coli 055 :В5, Sigma-Aldrich), образцы инкубировали 1 час при 37°С и 5% С02.

Количество насыщаемых рецепторов урокиназы определяли по связыванию меченой 1251 рекомбинантной про-урокиназы (лаб. генной инженерии НИИЭК) по методике, описанной Kirchheimer et al.(¡988).

Содержание МСР-1 в плазме крови определяли с помощью наборов для ИФА (BioSource, Bender MedSystems), уровень С-реактивного белка (СРБ) -методом латексной агглютинации (Люкова с соавт., 1999) и нефелометрическим методом на анализаторе белков крови (Bering Marburg GmbH, Dade). Содержание фибриногена в плазме крови измеряли коагулогическим методом по Клауссу.

Образцы интимы, содержащие атеросклеротические бляшки (п=18), были получены в ходе эндартерэктомии в отделении сердечно-сосудистой хирургии НИИКК. Выделение клеток из ткани бляшек проводили по ранее описанной методике с использованием коллагеназы I типа (Вопаппо et al., 2000). Сегменты, предназначенные для морфологического анализа, заключали в среду для замораживания (Tissue-Tek, Sakura) и помещали в жидкий азот. На криостате готовили гистологические срезы толщиной 6 мкм, которые окрашивали по Май-Грюнвальду. Иммуногистохимическое выявление лейкоцитарных антигенов проводили по стандартной методике для замороженных срезов с применением мышиных мкАТ к антигенам лейкоцитов человека (CD45, CD11с и CD4, Dako Cytomation). Для визуализации связывания антител использовали наборы Vector Laboratories. Образцы бляшек, предназначенные для выделения РНК, замораживали в жидком азоте либо хранили в растворе RNA-later® (Ambion). Выделение мРНК проводили методом кислой фенол-хлороформной экстракции с применением набора «РИБО-золь-А» (АмплиСенс). Концентрацию РНК определяли спектрофотометрически. Для получения комплиментарной ДНК (кДНК) проводили реакцию обратной транскрипции с использованием набора «РЕВЕРТА» (АмплиСенс). Для ПЦР использовали амплификатор Eppendorf Mastercycler Personal и наборы для амплификации (Силекс, Синтол). Подбор оптимальной температуры отжига праймеров осуществляли на образцах контрольной кДНК из лизатов лейкоцитов крови и эндотелиальных клеток пупочной вены человека на амплификаторе с градиентом температур Mastercycler GRADIENT (Eppendorf). Количество пар оснований ампликона проверяли с помощью программы Blast

(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi). Нормирование количества циклов и концентрации кДНК в пробе проводили по отношению к уровню экспрессии р2-микроглобулина. Результаты ПЦР анализировали электрофоретически в 2% агарозном геле с добавлением бромистого этидия.

Мононуклеарные клетки из лейкомассы или крови доноров получали центрифугированием в градиенте плотности Histopaque (Sigma-Aldrich) по методике Воуит (¡968). Обогащенную моноцитами суспензию клеток получали с помощью центрифугирования в ступенчатом градиенте перколла (Sigma-Aldrich) по методу (Al-Sumidaie et al., ¡984). Суспензию моноцитов получали с помощью магнитных бус, конъюгированных с антителами к CD 14, и колонок для магнитной сепарации клеток (MiltenyiBiotec). Для выделения нейтрофильных гранулоцитов в образцы крови добавляли раствор декстрана (5%) для осаждения эритроцитов. Обогащенную лейкоцитами плазму центрифугировали в градиенте плотности Histopaque, отбирали прошедшие через градиент плотности клетки (гранулоциты). Для оценки экспонирования моноцитами и гранулоцитами молекул адгезии под влиянием хемокинов в суспензию клеток вносили рекомбинантный МСР-1 или интерлейкин-8 (ИЛ-8) человека (R&DSystems) в концентрации 5 нМ на 15 мин при 37°С. CD4+ лимфоциты получали из фракции мононуклеарных клеток крови с помощью наборов для «позитивной» и «негативной» иммуномагнитной сепарации

(MiltenyiBiotec, CD4+ T Cell Isolation Kit I, И). Клетки культивировали в среде, содержащей 5 % инактивированной пулированной сыворотки человека (СЧ) и рекомбинантный ИЛ-2 человека (Cysl45Ser, R&D Systems, 4 нг/мл). Для активации клеток использовали антитела CD3/CD28 (BD Biosciences). Эндотелиальные клетки (ЭК) выделяли из пупочной вены человека и культивировали согласно методике (Антонов с соавт., 1981). Перед проведением экспериментов по оценке миграции и индукции фосфорилирования внутриклеточных протеинкиназ клетки 1-2 пассажа выдерживали 24 ч в среде со сниженным количеством эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС, 1 %).

Промоноцитарная клеточная линия ТНР-1 была получена из Американской коллекции клеточных культур (АТСС), лимфоцитарные клетки Jurkat были предоставлены лабораторией клеточной инженерии НИИЭК. Подавление экспрессии генов CD1 lb и CD 18 в клетках ТНР-1 осуществляли методом малых интерферирующих РНК (миРНК, лаб. клеточной инженерии). Для целевых последовательностей каждого гена рассчитывали последовательности миРНК. Для инфицирования клеток ТНР-1 использовали псевдовирусные частицы (ПВЧ) на основе вируса иммунодефицита человека, несущие в своём составе миРНК; для каждой миРНК упаковывали отдельный пул ПВЧ. Эффективность подавления синтеза белков проверяли прямым окрашиванием антителами к CD lib, CD 11с и CD 18. Для получения гомогенных по уровню подавления экспрессии генов популяций проводили клонирование трансдуцированных клеток.

Адгезию клеток определяли колориметрическим методом (Wong et al., 1996). Для стимуляции адгезии клеток ТНР-1 и клонов использовали МСР-1 (5нМ). Для ингибиторного анализа применяли блокирующие моноклональные антитела к CDllb (BDBiosciences) и CDllc (BenderMedSystems) человека. В серии экспериментов лунки планшетов предварительно покрывали фибриногеном, конечными продуктами деградации фибриногена или фибронектином (Sigma-Aldrich, Имтек). Для протеолиза фибриногена использовали плазмин (Sigma), состав образовавшихся продуктов оценивали с помощью электрофореза в 7.5% полиакриламидном геле с добавлением додецилсульфата натрия (ДСН-ПААГ) в невосстанавливающих условиях.

Анализ клеточной миграции в модифицированной камере Бойдена проводили согласно методике (Falk et al., 1980). В нижние ячейки камеры помещали раствор хемоаттрактанта. В верхние ячейки камеры вносили суспензию клеток, 2 млн/мл, в среде для миграции (раствор Хэнкса с добавлением 20 мМ HEPES и 0.5% БСА или 1% СЧ). Верхние и нижние ячейки разделяли пористой мембраной (Osmonics) с размером пор 8 мкм для клеток ТНР-1, клонов клеток ТНР-1 и ЭК и 5 мкм для лейкоцитов. В некоторых экспериментах мембрану покрывали фибриногеном, фибронектином или конечными продуктами деградации фибриногена; при изучении миграции ЭК -коллагеном типа I (Celtrix Pharmaceuticals). Камеру помещали в С02-инкубатор на 1 час (при изучении миграции лейкоцитов, клеток ТНР-1 и клонов) или на 2-

3 часа (при исследовании миграции ЭК). Непромигрировавшие клетки счищали с верхней части мембраны, оставшиеся клетки фиксировали в метаноле и окрашивали красителем Гимза (Sigma-Aldrich). Мембрану сканировали (HP ScanJet 5300С) и анализировали с использованием программного обеспечения Scion Image для Windows Alpha 4.0.3.2 (Scion Corporation). В качестве хемоаттрактантов использовали МСР-1, 5 нМ (для оценки миграционного ответа моноцитов) и 10 нМ (для клеток ТНР-1, клонов ТНР-1 и ЭК), 5нМ ИЛ-8 (для нейтрофильных гранулоцитов). Миграцию лимфоцитов оценивали в системе TransWell для 24-луночных планшет с диаметром пор 5 мкм (CorningNY). Клеточную суспензию помещали в верхнюю часть системы TransWell, в нижнюю часть вносили среду, содержащую хемоаттрактанты (10 нМ МСР-1 или 1 нМ фактора из клеток стромы -1, SDF-1, R&Dsystems). Планшеты помещали в С02-инкубатор на 2 часа. Промигрировавшие в нижнюю часть системы клетки подсчитывали в камере Горяева. Ингибиторы киназ добавляли к суспензии клеток и к растворам хемоаттрактантов в концентрации 20 мкМ для LY 294002, ЮмкМ - SB 202190 , SKF 86002, РР2 (Calbiochem) и генистеина (Sigma-Aldrich), 50 мкМ - PD98059 (Calbiochem), рапамицин использовали в диапазоне концентраций 100 нМ - 3 мкМ. В указанных концентрациях ингибиторы не оказывали влияния на жизнеспособность клеток.

Для определения уровня фосфорилирования протеинкиназ под действием МСР-1 клетки инкубировали 1-30 мин с МСР-1, 5 нМ для активации моноцитов, 10 нМ - клеток ТНР-1 и ЭК. Ингибиторы киназ добавляли в суспензию клеток за 30 мин до стимуляции. Клетки лизировали в буфере для образцов для электрофореза с 4% меркаптоэтанола. Лизаты подвергали электрофорезу в 10% ДСН-ПААГ. Перенос белков с геля на нитроцеллюлозную мембрану осуществляли полусухим методом. Мембраны окрашивали антителами кролика к киназам человека p44/42(ERKl/2) МАРК, р38 МАРК, Akt, ser и их фосфорилированным формам - pThr202/pTyr204 р44/42 МАРК, pThrl80/pTyrl82 р38, pSer473 Akt, pTyr418 sre (Cell Signaling Technology, New England Biolabs). В качестве вторых антител использовали антитела осла к иммуноглобулинам кролика, конъюгированные с пероксидазой хрена (Amersham). Для выявления белковых полос применяли хемилюминесцентный метод (набор ECL, Amersham).

Расчет и синтез пептидных фрагментов хемокина МСР-1 были проведены сотрудниками лаб. синтеза пептидов НИИЭК. Первичная структура молекулы была проанализирована с помощью программы Peptide Companion, предсказывающей линейные эпитопы в белках, одновременно удовлетворяющие параметрам «гидрофильность», «доступность» и «антигенность». Синтез пептидов был осуществлен автоматическим твердофазным методом с использованием Fmoc-технологии на пептидном синтезаторе Applied Biosystems. Продукты очищали с помощью препаративной высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) до 95-98%-ной чистоты. Гомогенность полученных соединений подтверждали методом аналитической ВЭЖХ, структуру синтезированных пептидов - спектрами 'Н-

ЯМР и данными масс-спектрометрии. Были синтезированы ранее описанный в литературе пептид 51-62 (пептид V, Reckless, Grainger, 1999; Reckless at al., 2001) и его аналоги (пептиды I-VIII, XI), пептид последовательности 29-40 МСР-1 (пептид IX) и пептид последовательности 65-76 МСР-1 (пептид X), пептид IX (S), в котором цистеин был заменен серином, ретро-энантио-аналот пептида X (пептид XII) и два составляющих его коротких гексапептида XIII и

XIV.

H-Glu-Ile-Cys(Acm)-Ala-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Val-Gln-NH2 (I)

Ac-Glu-Ile-Cys(Acm)-Ala-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Val-Gln-NH2 (И)

H-Glu-Ile-Cys(Acm)-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln-NH2 (III)

Ac-Glu-Ile-Cys(Acm)-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln-NH2 (IV)

H-Glu-Ile-Cys-Ala-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Val-Gln-NH2 (V)

Ac-Glu-Ile-Cys-Ala-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Val-Gln-NH2 (VI)

H-Glu-Ile-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln-NH2 (VII)

Ac-Glu-Ile-Cys-Leu-Asp-Pro-Lys-Gln-Lys-Trp-Ile-Gln-NH2 (VIII)

H-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Lys-Cys-Pro-Lys-Glu-Ala-OH (IX)

H-Arg-Arg-Ile-Thr-Ser-Ser-Lys-Ser-Cys-Pro-Lys-Glu-Ala-OH (IX(S))

H-Asp-His-Leu-Asp-Lys-Gln-Thr-Gln-Thr-Pro-Lys-Thr-OH (X)

Н-Р-Су5-Р-01п-Р-11е-Р-Тгр-Р-Ьу5-Р-01п-Р-Ьу5-Р-Рго-Р-А5р-Р-Ьеи-Р-Су5-0Н

Н-Р-ТЬг-Р-Ьуз-Р-Рго-Р-Т11г-Р-С1п-Р-ТЬг-Р-С1п-Р-Ьуз-Р-Азр-Р-Ьеи-Р-Н1з-Р Аяр-ОН

Н-Азр-РНз-Ьеи-Азр-Ьуз-йп-ОН Н-ТЪг-ОЬ-ТЬг-Рго-Ьуз-ТЬг-ОН (XIV)

Способность пептидов к образованию димеров в растворе за счет -5-8-связей оценивали по подвижности в 15% ДСН-ПААГ +/- 4% меркаптоэтанола. Мечение пептида X радиоактивным технецием (99шТс -пептид X) и радиометрическая оценка поступления пептида в очаг ЛПС-индуцированного воспаления у крыс были проведены в НИФХМ им. Л.Я. Карпова и в отд. радионуклидных методов исследования НИИЭК. Устойчивость пептидов к деградации в плазме крови человека была оценена методом 'Н-ЯМР-спектроскопии в лаб. физико-химических методов исследования НИИЭК.

12

(XII)

(XIII)

Изучение действия пептидов на миграцию клеток проводили с использованием камеры Бойдена (см. выше). Пептиды в концентрации 10-1000 мкг/мл добавляли в нижние ячейки камеры и/или к суспензии клеток в верхние ячейки. При исследовании механизмов действия пептида IX в нижние и верхние ячейки камеры вносили коклюшный токсин (Pertussis toxin, Sigma-Aldrich, 1 мкг/мл) или антагонист рецептора CCR2 (BMS CCR2 22, CAS 445479-97-0, Santa Crus, 10 нМ). Для исключения возможности вытеснения пептидом IX с клеточной мембраны эндогенных факторов, клетки перед оценкой миграции пре-инкубировали с 1 мг/мл гепарина (Sigma-Aldrich).

Для анализа содержания внутриклеточного Са++ клетки ТНР-1 ресуспендировали в среде с 2.5 мМ пробенецида (водорастворимая форма) и 2 мкМ Fluo-4 (AM, Molecular Probes). Клетки инкубировали 30 мин при at 37°С, отмывали и инкубировали еще 30 мин при комнатной температуре в среде с 2.5 мМ пробенецида до полной деэтерификации метки. К суспензии клеток добавляли МСР-1 (5 нМ) и/или исследуемые пептиды. Флуоресценцию клеток измеряли в режиме «реального времени» на поточном цитофлуориметре FACSCalibur, используя программное обеспечение CellQuestPro.

Для анализа действия пептида X на экспозицию моноцитами молекул адгезии в аликвоты периферической крови здоровых доноров в цитратном антикоагулянте вносили 5 нМ МСР-1 ± пептид X, 1 мкг/мл (714 мкМ). Пробы инкубировали 10 мин при 37°С, лейкоциты окрашивали антителами к CD14 и CD1 lb, связывание антител оценивали на поточном цитофлуориметре.

Изучение димеризации МСР-1 в растворе проводили с помощью электрофореза в 15% ДСН-ПААГ с предшествующим кросс-линкингом с помощью дисукцинимидного эфира субериновой кислоты (ДСС), как это было описано (Zhang, Rollins, 1995). Использовали рекомбинантный МСР-1 человека (carrier free МСР-1, R&Dsystems), 5 и 0.6 мкМ, пептид X добавляли к раствору МСР-1 в колчестве 100 мкМ. Гели окрашивали серебром, либо осуществляли электроперенос белков с гелей на нитроцеллюлозную мембрану. Мембраны инкубировали с биотинилированными антителами кролика к МСР-1 человека (BDPharmingen) и конъюгатом стрептавидин-пероксидаза (Sigma-Aldrich). Для выявления белковых полос использовали хемилюминесцентную детекцию (ECL, Amersham). В качестве контрольного белка был использован апротинин, близкий по молекулярному весу к МСР-1.

Биотинилирование гепарина проводили путем присоединения к гепарину биотинил-е-аминокапроновой кислоты с использованием карбодиимида (отд. радионуклидных методов исследования НИИКК). Взаимодействие МСР-1 с гепарином изучали с помощью биосенсорного прибора «Пикоскоп» (лаб. биофотоники Института общей физики им. А.М.Прохорова РАН) и иммуноферментного анализа (ИФА). При биосенсорном анализе после посадки стрептавидина на подложку наносили биотинилированный гепарин, затем -МСР-1 в различных концентрациях. Связывание МСР-1 с гепарином подтверждали нанесением антител к МСР-1 (клон 5D3-F7, BD Pharmingen). Пептид X, 100 мкМ, добавляли вместе с МСР-1. Результаты измерения в

режиме реального времени толщины молекулярного слоя последовательно наносимых соединений представляли в виде сенсограмм. Микрофотографии зон нанесения МСР-1 и МСР-1 с пептидом X получали с помощью сканирующего микроскопа. Для ИФА использовали 96-ти луночные планшеты, покрытые стрептавидином (Sigma-Aldrich), на который наносили биотинилированный гепарин. Далее в ячейки планшета помещали либо МСР-1, либо смесь МСР-1 с пептидом X. Проявление МСР-1 выполняли антителами к МСР-1 человека (BDPharmingen) и конъюгатом поликлональных антитела кролика к иммуноглобулинам мыши с пероксидазой хрена (Имтек), в качестве субстрата использовали раствор о-фенилендиамина с перекисью водорода. Оптическую плотность измеряли при длине волны 492 нм на планшетном спектрофотометре Униплан (Пикон). В серии экспериментов вместо МСР-1 использовали ИЛ-8 и антитела к ИЛ-8 человека (BDPharmingen), соответственно.

Для оценки действия пептида IX на подвижность ЭК использовали метод «зарастания царапины», нанесенной наконечником для автоматического дозатора. Восстановление монослоя клеток контролировали микроскопически при культивировании клеток в среде с 1% ЭТС +/- пептид IX, 100 мкг/мл, или в присутствии 10% ЭТС.

При исследовании влияния пептидов на миграцию лейкоцитов in vivo использовали мышей (самцов F¡ СБ A/Lac х С57В1/6 массой 25 г), крыс (самцов Wistar, масса 300-400 г, питомник «Столбовая») и яванских макаков (самцов Macacus fascicularis, масса 2.5-3 кг, ФГБУ НИИ Медицинской Приматологии РАМН). «Воздушные мешки» на спине у мышей создавали путем двукратного подкожного введения стерильного воздуха (Bass, 1975). В полость «мешка» вводили 100 нг рекомбинантного мышиного МСР-1 (JE/CCL2, R&D Systems) или 1 мкг ЛПС (LPS 055:В5, Sigma-Aldrich) в 1 мл стерильного физ. раствора. Пептид X (1-1000 мкг) инъецировали в «мешок» или внутримышечно. Через 4 ч полости промывали раствором Версена, лаважную жидкость отбирали, подсчитывали количество клеток в камере Горяева. Типирование моноцитов/макрофагов проводили по связыванию антител крысы к антигену моноцитов/макрофагов мыши (клон F4/80, Abeam) и с помощью поточной цитофлуориметрии. В модели «подкожного воспаления» в спинную область животных подкожно вводили ЛПС (LPS 055:В5, Sigms-Aldrich): 2 мкг/кг для крыс и 3,3 мкг/кг для обезьян. Пептид X вводили внутримышечно крысам в концентрации 40 мкг/кг веса, обезьянам - внутривенно однократно (сразу после инъекции ЛПС) или двукратно (сразу после инъекции ЛПС и через 4 ч) в концентрации 33 мкг/кг веса. В качестве контроля использовали смесь аминокислот, входящих в состав пептида. Через 24 ч вырезали подкожную соединительнотканную пленку. Препараты окрашивали красителем Гимза, подсчитывали количество фибробластов и лейкоцитов. Часть пленочных препаратов от обезьян анализировали иммуногистохимически с использованием мышиных мкАТ к лейкоцитарному антигену приматов CD45 (DakoCytomation).npn исследовании действия пептида IX на миграцию клеток пептид (1-100 мкг в 100 мкл физ. раствора) инъецировали подкожно в спинную

область (между лопатками) крыс, стерильный физиологический раствор - в крестцовый отдел. Через 5 часов выделяли подкожную соединительнотканную плёнку из участков инъекций, фиксировали и окрашивали набором «DiffQuick» (ПанЭко). Количество клеток считали под микроскопом, для нормирования клеток количество моноцитов/макрофагов соотносили с количеством фибробластов (м/фб).

При баллонной ангиопластике артерии крыс через наружную сонную артерию с помощью 3 пассажей эмболоэктомического баллонного катетера <t>orapra-2F (Baxter) полностью удаляли эндотелий левой общей сонной артерии. Пептид X вводили 1 раз в сутки внутримышечно в количестве 10 мкг в 100 мкл физиологического раствора. Через 4, 7, 14 и 28 суток после операции иссекали левую общую сонную артерию и контрольный контралатеральный сосуд, фрагменты сосудов замораживали. На криостате готовили срезы артерий толщиной 6 мкм. Для визуализации клеточных маркеров эндотелия и моноцитов/макрофагов использовали антитела мыши к фактору фон-Виллебранда (vWF) и CD68 (клон EDI, Serotec) крысы и меченные биотином антитела лошади к иммуноглобулину G (Vector Laboratories), конъюгат авидин-пероксидаза хрена (Vector Laboratories) и диаминобензидин (Sigma-Aldrich) в качестве субстрата. Клеточные ядра окрашивали водным раствором гематоксилина Майера. Морфометрический анализ гистологических срезов левой общей сонной артерии крыс (измерение площадей неоинтимы, медии и просвета сосуда) проводили с помощью программного обеспечения Optimas 6.1 (Optimas VSG, U.K.).

При изучении влияния пептида IX на образование грануляционной ткани использовали самцов крыс линии Sprague-Dawley (220-240 г, «Столбовая»). Из 1% раствора агарозы в стерильном ФБ готовили имплантаты объемом 1 мл, пептид IX добавляли к раствору агарозы в количестве 1 мг/мл. Имплантаты после затвердевания вводили подкожно между лопатками крыс в области трапециевидной мышцы спины. Через 4 суток рану вскрывали и выделяли имплантат вместе с окружающей его грануляционной тканью. Образцы замораживали в среде Tissue-Tek в жидком азоте. На криостате готовили срезы толщиной 6 мкм, проводили морфометрические, гистологические и иммуногистохимические исследования полученных препаратов с использованием моноклональных антител мыши к CD45 крысы (BD Biosciences).

При изучении влияния пептида IX на ангиогенез использовали модель ишемии нижней конечности крысы. Самцов крыс Wistar (300-400 г, «Столбовая») анестезировали, делали разрез в области бедра, выделяли и перевязывали левую бедренную артерию в проксимальном и дистальном отделах. В течение 7 дней после операции животным подкожно вводили пептид (100 мкг в 100 мкл стерильного фосфатного буфера), животным контрольной группы вводили стерильный буфер. Через 14 дней под общей анестезией выделяли тибиальную мышцу, образцы замораживали в жидком азоте и готовили гистологические срезы толщиной 6 мкм. Количество капилляров в

срезах мышцы оценивали после иммуногистохимического окрашивания антителами к CD31 (BD Biosciences).

Для изучения действия пептида IX на ранозаживление использовали самцов мышей линии BALB/c (20-22 г., «Столбовая»), Под наркозом состригали шерсть между лопатками, с помощью трафарета обводили контуры раны (круг площадью ~ 1 см2), хирургическими ножницами вырезали соответствующий лоскут кожи. На следующий день мышей делили на 2 группы: опытным животным каждые 3 часа на рану наносили 50 мкл раствора пептида IX (1 мг/мл в стерильном физиологическом растворе), в контрольной группе использовали физиологический раствор, содержащий смесь аминокислот, составляющих пептид IX. Пептид/смесь аминокислот наносили в течение двух дней (до образования струпа), всего было выполнено по 8 аппликаций. На 7 и 10 сутки после вмешательства мышей наркотизировали эфиром, на раны накладывали прозрачную пленку, контуры ран обводили. Пленки сканировали, размер ран определяли в отн. ед. с помощью программы Photoshop.

Эксперименты по моделированию инфаркта миокарда были выполнены сотрудниками кафедры физиологии и общей патологии Факультета фундаментальной медицины МГУ им М.В.Ломоносова. В работе использовали самцов белых беспородных крыс (Rattus norvegicus) начальным весом 412±40 г. Животных наркотизировали, на груди состригали шерсть и делали разрез. Мышцы слева от грудины отделяли от ребер, делали прокол в том межреберье, в котором ощущался верхушечный толчок. Сердце выталкивали в рану и накладывали лигатуру на левую коронарную артерию, расположенную в области, границами которой являются правый желудочек миокарда и ушко предсердия. Пептид IX, 35 мкг/кг, вводили внутрисердечной инъекцией в зону риска в момент перевязки левой коронарной артерии. Через 2.5 часа кровоток в миокарде восстанавливали. Морфологическое и иммуногистохимическое исследование миокарда проводилась через 12, 24, 72 часа и через 28 суток после начала окклюзии. На микротоме делали поперечные срезы толщиной 5 мкм, которые фиксировали и окрашивали гематоксилин-эозином. Дифференцированно оценивали три зоны: зону некроза, околоинфарктную, а также не затронутый ишемией миокард. Описательно и полуколичественно анализировали частоту поперечной исчерченности кардиомиоцитов, выраженность повреждения клеток, количество и размеры кровоизлияний, количество немиоцитарных клеток и число контрактур кардиомиоцитов. Иммуногистохимическое окрашивание миокарда проводили на парафиновых срезах толщиной 5 мкм с использованием мышиных моноклональных антител к CD68 крысы (Abcam). Оценка плотности CD68+ клеток в ткани производилась по количеству окрашенных клеток, попадающих на узлы решетки, наложенной на микрофотографию, при помощи программы PaintNET 3.5.8., данные представляли в виде относительной плотности (количество клеток на 100 узлов решетки). Размер некроза оценивали через 72 часа после ишемии-реперфузии планиметрически в срезах сердца толщиной 1.5 мм, окрашенных трифенилтетразолием хлоридом. Рассчитывали процент площади пораженной

ткани к общей площади левого желудочка на каждом срезе с двух сторон. Через 28 суток в срезах аналогичным способом определяли размер рубцовой зоны.

Для статистической обработки данных был использован пакет программ 81ай$иса 6. Нормальный характер распределения данных подтверждали критерием Шапиро-Уилка. Распределение содержания СРВ, фибриногена в крови не соответствовало нормальному закону - для описания их распределений использовались медиана и квартили. При исследовании динамики показателей относительно исходных уровней в случае нормальных распределений использовался ^критерий Стьюдента для зависимых выборок, при межгрупповых сравнениях - ^критерий Стьюдента для независимых выборок. При использовании параметрических критериев для подтверждения однородности дисперсий распределений признаков использовался критерий Левена. Для анализа данных, распределение которых не соответствовало нормальному закону, а также в малочисленных выборках при исследовании динамики показателей относительно исходных уровней использовался W-критерий Уилкоксона, для межгрупповых сравнений - и-критерий Манна-Уитни. Корреляционный анализ связи между относительным содержанием регуляторных Т-лимфоцитов и количеством пораженных коронарных артерий у пациентов проводился с использованием метода Спирмена. Для сравнения результатов балльной полуколичественной оценки основных морфологических признаков, а также количества С068+клеток в ткани сердца в разные сроки после ишемии-реперфузии использовали непараметрический и-тест Манна-Уитни. Различия считались статистически значимыми при р<0,05. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение, среднее ± стандартная ошибка среднего или как медиана (25-й - 75-й процентиль).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Для подтверждения участия клеток иммунной системы в развитии атеросклероза у человека был проведен анализ клеточного состава и экспрессии цитокинов в образцах атеросклеротических бляшек коронарных артерий человека, в крови пациентов с ИБС было измерено содержание «маркеров воспаления» и определен фенотип циркулирующих лейкоцитов. Образцы интимы коронарных артерий человека содержали преимущественно «стабильные», липофиброзные и фиброзные бляшки, большинство имели участки кальцинирования. Во всех образцах обнаружены очаговые скопления мононуклеарных лейкоцитов. Иммуногистохимическое окрашивание выявило наличие СЕ)45+клеток (лейкоцитов), в том числе моноцитов/макрофагов (С011с+) и СЭ4+ Т-лимфоцитов. Образцы атеросклеротических бляшек крупного размера подвергали обработке коллагеназой для выделения клеточной суспензии. В ней были идентифицированы лейкоциты (Нп+), в основном Т-клетки (СЭЗ+), большинство из которых - с фенотипом С04+. Многие СЭ4+ Т-лимфоциты имели на поверхности хемокиновые рецепторы ССЯ2, что свидетельствует об активации клеток, практически все экспрессировали

характерные для Т-хелперных клеток 1 типа рецепторы СХСКЗ. Были также выявлены клетки моноцитарно-макрофагального ряда (Ііп+СОІ 1с+).

ФНОа ТФРр МСР-3 80Р-1 (ЪШТЕЭ МСР-1 МСР-2 ИЛ-13 1-309 МІР-1а М1Р-1р МЮ мое

ТАЯС ИЛ-10 ІР-10

ИОХРЗ

Рисунок 1. Экспрессия генов в образцах атеросклеротических бляшек (п—18) коронарных артерий человека.

С помощью ПЦР с обратной транскрипцией в большинстве образцов была обнаружена мРНК индуцибельных («провоспалительных»)

хемокинов/цитокинов ФНОа, МСР-3, 1-309, МЮ, М1Р-1р, а также 8БР-1, ИЛ-13; многие образцы содержали мРНК хемокинов МСР-1, ТАЯС, М1Р-1а. В некоторых образцах выявлялась экспрессия генов хемокинов 1Р-10, КАЫТЕ8, МСР-2, МОС, а также ИЛ-10. мРНК маркера регуляторных клеток фактора йэхрЗ и «противовоспалительного» цитокина ТФРр детектировались практически во всех образцах (рис.1). Полученные данные говорят о наличии в интиме артерий иммунных клеток, моноцитов/макрофагов и Т-лимфоцитов, экспрессии в стенке сосуда генов цитокинов, участвующих в привлечении

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

% образцов с экспрессией гена

лейкоцитов, их активации и дифференцировке, что подтверждает вклад воспалительного и иммунного процессов в формирование атеросклеротических поражений коронарных артерий человека. Следует, однако, отметить, что нами были проанализированы в основном «стабильные» фиброзные бляшки, в которых воспалительный процесс может быть не столь ярко выражен, как в синдром-ассоциированных поражениях, и поэтому они могут отличаться по набору экспрессируемых цитокинов от «нестабильных» образований. Для разработки подходов к предотвращению прогрессии атеросклероза и развития осложнений необходимо исследование порядка и продолжительности по времени экспрессии цитокинов, связи между набором экспрессируемых генов и морфологическими характеристиками атеросклеротического поражения. Получение таких данных у человека представляется сложной, но актуальной задачей.

Одним из доказательств участия воспаления в обострении атеросклеротического процесса в стенке артерии является обнаружение в крови пациентов с острым коронарным синдромом т.н. маркеров воспаления. Мы измерили концентрацию СРБ и хемокина МСР-1 в плазме больных ИБС, стабильной стенокардией напряжения и нестабильной стенокардией без признаков инфаркта миокарда. Содержание МСР-1 и СРБ в крови было достоверно выше у пациентов с нестабильной стенокардией по сравнению с больными со стабильной стенокардией напряжения (табл. 1). Особенностью нашего исследования содержания МСР-1 в крови при ИБС являлся тщательный подбор пациентов и формирование групп, сходных как по клиническим показателям, так и по распространенности поражения коронарного русла. Мы исключили из исследования пациентов с любыми проявлениями некроза миокарда, т.к. ишемическое повреждение миокарда само по себе приводит к развитию воспалительной реакции в ткани сердца и подъему уровня маркеров воспаления в крови. Выраженность межгрупповых различий в уровне МСР-1 в крови позволяет надеяться на то, что определение данного показателя может служить дополнительным критерием для дифференциальной диагностики нестабильной стенокардии.

Системная воспалительная реакция при ИБС может сопровождаться появлением в кровотоке активированных лейкоцитов, в частности, моноцитов и Т-клеток. Мы проанализировали количество «активационно-зависимых» молекул - интегринов Мас-1 (CDlib/CD 18) и рецепторов урокиназы (CD87), а также относительное количество мембраносвязанной урокиназы на поверхности моноцитов крови у пациентов с ИБС (стабильной стенокардией) и доноров, не страдающих ИБС. Экспозиция поверхностных антигенов была определена как до, так и после активации клеток «в цельной крови». Нами не было выявлено значимых различий в экспрессии молекул адгезии и CD87 в исследуемых группах. Содержание урокиназы в периферической крови и на поверхности моноцитов было достоверно выше при ИБС. В соответствии с этим, абсолютное количество свободных рецепторов урокиназы на поверхности клеток было в 2 раза ниже в группе больных по сравнению с донорами (табл. 1).

Учитывая данные о важной роли системы урокиназа/рецептор урокиназы в регуляции адгезии и миграции клеток в тканях, можно предположить, что при ИБС моноциты имеют более высокий потенциал к накоплению в очагах воспаления, в частности, в атеросклеротических бляшках.

Таблица I. Концентрация МСР-1 в плазме пациентов с ИБС. *р<0,05 по сравнению с группой «стабильная стенокардия», Лр<0,05 по сравнению с группой «доноры».____

Стабильная стенокардия Нестабильная стенокардия Доноры

МСР-1 в крови, пг/мл 62+11, п=!1 109+14», п=12

СРБ в крови, мкг/мл 0,44 (0,21 -1,19) п=11 1,99 (0,92-3,22)* п=12

Урокиназа в крови, пм 10,4+0,7* п=24 8,3+0,5 п=14

Урокиназа на мембране моноцитов, O.E. 33+0,7* п=13 10+9 п=10

Кол-во свободных рецепторов урокиназы на моноците 4810+3450® п=13 10770+5570 п=10

Относительное количество активированных Т-хелперных клеток и регуляторных Т-лимфоцитов было определено в образцах периферической крови больных ИБС, стабильной и нестабильной стенокардией, а также доноров, не имеющих ангиографических признаков коронарного атеросклероза. Содержание активированных Т-хелперов оказалось достоверно повышено у больных с нестабильной стенокардией по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией напряжения (табл. 2). Различий в содержании регуляторных Т-лимфоцитов и в общем количестве С04+С03+клеток в исследуемых группах выявлено не было. Таким образом, при нестабильной стенокардии количество активированных С04+ лимфоцитов в крови повышено, и соотношение активированные/регуляторные С04+Т-лимфоциты изменяется в пользу первых.

Мы предположили, что атеросклеротический процесс в стенке артерий может быть ассоциирован с нарушением регуляторной функции лимфоцитов. Для подтверждения этого мы включили в исследование больных ИБС со стенозирующим коронарным атеросклерозом, стабильной стенокардией И-Ш функциональных классов, которые ранее не имели вмешательств на коронарных артериях. В зависимости от количества пораженных атеросклерозом коронарных сосудов больные были разделены на группы. Содержание СОЗ+С04+лимфоцитов в крови не различалось. Была выявлена умеренная обратная корреляционная связь между относительным содержанием регуляторных Т-лимфоцитов и количеством пораженных коронарных артерий (рис. 2). Следует отметить, что связи между количеством регуляторных Т-лимфоцитов в крови и известными факторами риска ИБС выявлено не было. По

нашему мнению, дефицит регуляторных Т-клеток является независимым фактором, способствующим прогрессированию коронарного атеросклероза.

Таблица 2. Количество СВЗ+С04+Т-клеток, активированных Т-хелперов и регуляторных Т-клеток в периферической крови пациентов и доноров. Данные представлены как % от лимфоцитов. ССН - стабильная стенокардия напряжения, НС- нестабильная стенокардия. *р=0.005 по сравнению с больными стабильной стенокардией и #р=0.07 по сравнению с донорами.

ССН (n=l 1) HC (n=15) Доноры (n=10)

CD3+CD4+ 39,6+8,3 42,9+5,0 40,9+6,0

CD4+CD25 lowCD 127high (акт) 13,6+7,2 22,2+6,8*# 17,4+5,5

CD4+CD25highCD 1271ow (per) 1,6+0,8 2,1+0,5 1,7+0,6

количество пораженных КА

Рисунок 2. Корреляционная взаимосвязь между относительным содержанием регуляторных Т-лимфоцитов и количеством пораженных коронарных артерий у пациентов с ИБС, п=48. Спирмен R=- 0,43, р=0,002. Т-рег - регуляторные Т-лимфоциты, КА - коронарные артерии.

Анализируя данные, полученные при анализе клинического материала, можно резюмировать следующее. Атеросклеротические бляшки коронарных артерий предоставляют собой очаги хронического воспаления с характерными скоплениями мононуклеарных лейкоцитов, продукцией цитокинов. Системные проявления воспалительного процесса в сосудистой стенке, наряду с повышением концентрации СРБ в крови, включают увеличенное содержание хемотаксических цитокинов (в том числе МСР-1), появлении активированных

циркулирующих

моноцитов и лимфоцитов, снижении количества «противовоспалительных» регуляторных Т-клеток.

Ограничение поступления лейкоцитов, в частности, моноцитов, в очаг воспаления может лежать в основе новых подходов к лечению пациентов с ИБС, имеющих высокую вероятность развития острого коронарного синдрома. В качестве потенциальных мишеней для воздействия на миграцию моноцитов мы выделили молекулы адгезии, внутриклеточные сигнальные каскады, задействованные в миграции клеток, и хемокины, в частности, MCP-1

Вклад основных лейкоцитарных молекул адгезии - ß2 интегринов - в адгезию и миграцию клеток был изучен с помощью блокирующих антител и с использованием клонов промоноцитарной клеточной линии ТНР-1 с различным уровнем экспрессии интегриновых субъединиц CD IIb, CDllc и CD 18. По сравнению с клетками «дикого» типа, клон ТНР-1-CD 18-low характеризовался низким мембранным содержанием всех субъединиц. Мембранная плотность CD11Ь в клетках клона ТНР-1-CD 1 lb-low была избирательно снижена, при этом количество молекул CDllc и CD 18 было сопоставимо с таковым у клона «дикого» типа. В качестве подложки был использован «патологический» матрикс из фибриногена, общий для изучаемых интегринов, который характерен для очагов воспаления и повреждения тканей. Адгезия на фибриногене клеток ТНР-1-CD 18-low была низкой. Адгезия клеток «дикого типа» на фибриногене подавлялась антителами к CD11Ь и CD11с на 47 и 26 %, соответственно; одновременное внесение данных антител приводило к снижению адгезии более чем на 60 %.

O.E.

ТНР-1 THP-1-CD1 lb-low THP-l-CD18-low

Рисунок 3. Миграция клеток ТНР-1 «дикого типа» и клонов на фибриногене в присутствии хемокина МСР-1. Белые столбцы - спонтанная миграция клеток (принята за «1»), серые столбцы - МСР-1 -стимулированная миграция клеток ТНР-1. ОЕ — относительные единицы. *р<0.01 по сравнению со спонтанной миграцией.

При изучении миграционной способности клеток на фибриногеновой «подложке» было обнаружено, что МСР-1 стимулирует миграцию контрольных клеток ТНР-1 и ТНР-1 -CD 1 lb-low, но не влияет на миграцию клона ТНР-1 -CD18 low (рис.3). Полученные результаты свидетельствуют о том, что спонтанная адгезия моноцитарных клеток на фибриногене опосредована в основном молекулами CDllb/CD18, в то время как в стимулированной хемокином адгезии и миграции участвуют преимущественно интегрины CD1 lc/CD18.

Известно, что моноциты и нейтрофильные гранулоциты различаются по уровню экспрессии изучаемых молекул адгезии. Мы сопоставили экспрессию моноцитами и нейтрофильными гранулоцитами крови интегринов CD lib/CD 18 и CDllc/CD18 и миграционный ответ лейкоцитов на фибриногене. В качестве хемоаттрактантов были использованы МСР-1 (для моноцитов в составе мононуклеарной фракции клеток крови) и интерлейкин-8 (ИЛ-8) (для гранулоцитов). Экспозиция р2-интегринов клетками была измерена после активации соответствующими хемокинами. Экспрессия CDllb активированными моноцитами и нейтрофилами оказалась соизмеримой, в то время как экспрессия CD 11с моноцитами была в несколько раз выше. МСР-1 стимулировал миграцию моноцитов на фибриногене, в тех же условиях ИЛ-8 практически не оказывал действия на миграцию нейтрофильных гранулоцитов. Следует отметить, что при использовании в качестве «подложки» фибронектина (лиганда ßl-интегринов) мы наблюдали выраженный миграционный ответ обоих типов клеток в присутствии соответствующих хемоаттрактантов.

фибриноген —-. ПДФ

Миграция, O.E.

4

3

2

Спонтанная

миграция 7У/Р-/ Мо

Рисунок 4. Зависимость MCP-1 -стимулированной миграции моноцитарных клеток ТНР-1 и моноцитов крови (Мо) от используемых в качестве подложки матриксных белков. ПДФ - продукты деградации фибриногена. *р<0.05, #р=0.05 по сравнению с миграцией на фибриногене; O.E. - относительные единицы. Уровень спонтанной миграции принят за единицу.

-*—

II

Мы полагаем, что молекулы С011Ь/С018 обеспечивают прочное прикрепление клеток к фибриногену. Интегрины СБ Пс/СБ 18 активируются при действии хемокинов и участвуют в хемокин-стимулированной адгезии и миграции клеток. Сниженный хемотаксис нейтрофилов на фибриногене может быть связан с ограниченной экспрессией клетками молекул СВПс/СБ 18. Из литературных данных известно, что аффинность интегринов С011с/С018 существенно возрастает при протеолизе фибриногена (Уогир^етеп е1 а!., 2005). Действительно, при использовании в качестве «подложки» продуктов деградации фибриногена, миграционный ответ моноцитарных клеток возрастал (рис.4).

Таким образом, можно предположить, что интегрины СВ11с/С018 обеспечивают продвижение моноцитов в тканях, сопровождающееся протеолизом матриксных белков. Подавление активности СВ11с/СВ18, например, с помощью блокирующих антител, могло бы избирательно подавить рекрутирование моноцитов в очаг воспаления.

ТНР-1 эк

а«» вшг *»• р-р42/44 """**' •"""■* »

^ Р42*44

Зтп* РШ059

■дни I—II ИИИ ии р-р38

ж ш* р38

Зтю+ SD2CS190

чф-<ішт

МСР-1 О 1 3 15ггап 0 1 3 15ГП1П

Рисунок 5. Фосфорилирование киназ в моноцитарных клетках ТНР-1 и ЭК пупочной вены человека. Приведены характерные результаты одного их 3-х независимых экспериментов.

Связывание хемоаттрактанта с поверхностными рецепторами клеток вызывает активацию внутриклеточных сигнальных молекул, и ингибиторы «ключевых» участников миграции лейкоцитов можно рассматривать как потенциальные противовоспалительные агенты. Показано, что под действием МСР-1 в ССЯ2-экспрессирующих клетках происходит активация тирозиновых киназ, мобилизация внутриклеточного Са++ и изменение в концентрации цАМФ (Dubois et al., 1996, Myers et al., 1995), активация МАР-киназ (Cambiem et al., 2001; Yen et al., 1997), PI-3-киназ (Ogilivie et al., 2004; Fruman et al., 1998).

Данные о взаимодействии этих сигнальных путей и об их вкладе в миграционную активность клеток на момент начала наших исследований были весьма противоречивы. Механизмы миграции ЭК в градиенте МСР-1 изучены не были. Werle et al. (2002) сообщили, что динамика активации МАРК в ЭК под действием MCP-1 в целом соответствует таковой в моноцитах.

Мы оценили вклад внутриклеточных сигнальных путей киназ в хемотаксис моноцитарных и эндотелиальных клеток в присутствии МСР-1. Добавление МСР-1 в суспензию клеток моноцитарной линии ТНР-1 и ЭК пупочной вены человека приводило к транзиторной активации всех МАР-киназ, scr-киназ и Akt (мишени PI-3-киназы) в обоих типах клеток (рис.5).

Максимальное ингибирование МСР-1-стимулированной миграции клеток ТНР-1 и моноцитов крови достигалось в присутствии ингибитора тирозиновых протеинкиназ генистеина (рис. 6). Существенное снижение миграционной активности клеток также получали с помощью ингибиторов р38 МАР-киназы SB202190 и SKF86002. Ингибитор PI-3-киназы LY294002 подавлял МСР-1-стимулированную миграцию моноцитов. При одновременном внесении SB202190 и LY294002 ингибирующий миграцию моноцитов эффект не усиливался. Наибольшее влияние на подвижность ЭК оказывали LY294002 и ингибитор МАР-киназ р42/44 (ERK1/2) PD98059. Добавление генистеина вызывало снижение миграции клеток в меньшей степени, SB202190 и SKF86002 не оказывали значимого эффекта. Мы не смогли оценить миграцию ЭК в присутствии нескольких ингибиторов из-за существенного действия растворителя диметилсульфоксида.

На основании данных ингибиторного анализа нами были дополнительно проведены эксперименты по определению уровня фосфорилирования МАР-киназ в присутствии ингибиторов PI-3-киназы LY29002 и киназ семейства src РР2 в моноцитарных клетках ТНР-1. МСР-1-стимулированное фосфорилирование р38 МАР-киназы подавлялось в присутствии РР2, но не LY29002, что свидетельствует о преимущественном вовлечении src-киназ в фосфорилирование р38 МАР-киназы. В то же время LY29002 ингибировал фосфорилирование р42/44 (ERK1/2) более эффективно по сравнению с РР2, т.о. в активацию данных МАР-киназ вовлечена, по-видимому, PI-3-киназа.

Таким образом, несмотря на то, что МСР-1 вызывает одновременную активацию нескольких сигнальных каскадов как в моноцитах, так и в ЭК, вклад этих каскадов в миграцию зависит от типа клеток. В хемотаксисе моноцитов задействована р38 МАР-киназа и киназы семейства src, подвижность клеток эндотелия контролируется PI-3-киназой и МАР-киназами р42/44 (ERK1/2). Наши данные подтверждают исследования (Arai et al., 1996, Al-Aonkaty 1996), в которых выявлен различный внутриклеточный сигнальный «ответ» разных клеток на один и тот же хемокин. В литературе имеются указания на то, что ERK1/2 (р42/44) МАР-киназы и PI-3-киназа играют существенную роль в миграции ЭК при стимуляции фактором роста фибробластов и инсулиноподобным фактором-1 (Pintucci et al., 2002). Данные об участии МАР-киназ в миграции моноцитов противоречивы. Так, в мононуклеарных клетках

моноцитарные клетки линии ТНР-1

\г

МСР-1

MCP-] + PD9S059

МСР-1 + SB202190

МСР-1 + SKF86002

МСР-1 + гснистеин

МСР-1 + LY294002

31-*

моноциты периферической крови i

МСР-1

МСР-1 -»- PQ98059 МСР-1 -»-S3202 3 90

МСР-1 ->- SKPS6002 МСР-1 + гснистггин

МСР-1 "-LY2940Q2

эндотелиальные клетки пупочной вены

I_

МСР-1

МСР-1 +PD98059 МСР-1 + SB202190 МСР-1 + SKF86002 МСР-1 + генистеин МСР-1 + LY294002

41

0,8 0.9 1 1.1 1.2 1,3 1.4 1.5

Рисунок 6. Ингибиторный анализ MCP-¡-стимулированной миграции клеток. * р < 0.05; #р=0.07 по сравнению с миграцией в градиенте МСР-1. По горизонтали - миграция, отн. ед. Стрелка - спонтанная миграция.

крови и в клетках, трансфицированных рецептором МСР-1 CCR2B, МСР-1 вызывал активацию МАР-киназ ERK1/2 (р42/44), и ингибиторы данных киназ подавляли хемотаксис клеток в градиенте МСР-1 (Wain et al, 2002). Yen et al. (1997) подтвердили, что ERK1/2 (p42/44) МАР-киназы задействованы в хемотаксисе моноцитов под действием МСР-1. С другой стороны, по данным Fine et al. (2001), ни PI-3-киназа, ни ERK1/2 (р42/44) МАР-киназы не обязательны для миграции моноцитов в присутствии МСР-1. Cambien et al. (2001) обнаружили активацию МАР-киназных каскадов под действием МСР-1 в клетках моноцитарной линии МопоМасб, при этом основную роль в миграции этих клеток играла МАР-киназа р38.Ингибитор src-подобных киназ предупреждал активацию р38 МАР-киназы, что свидетельствует о более ранней активации src-киназ по сравнению с р38 МАР-киназой. По мнению Yamasaki et al. (2001), активация р38 МАР-киназы в стимулированных МСР-1 моноцитах опосредована тирозиновыми киназами Рук2 и Lyn. Наши результаты подтверждают преимущественное участие тирозиновых киназ и р38 МАР-киназы в миграции моноцитов. Механизм участия МАР-киназ в регуляции клеточной подвижности может быть связан с их способностью фосфорилировать цитоскелет-ассоциированные белки и таким образом принимать участие в регуляции актомиозинового сокращения (Goncharova et al, 2002). Известными мишенями для фосфорилирования МАР-киназами являются кальдесмон (Adam et al., 1993; Gerthoffer et al.. 1997), киназа легких цепей миозина и белок теплового шока HSP27 (Klemke et al., 1997). Активация киназы легких цепей миозина может привести к фосфорилированию регуляторных цепей миозина, и, как следствие, к стимуляции миграции клеток. HSP27 участвует в «стабилизации» актинового цитоскелета и также задействован в регуляции подвижности клеток.

МАР-киназа р38 является основным регулятором синтеза «провоспалительных» цитокинов (ИЛ-1, -6, ИНФу и др.) в различных клетках СLee et al., 2000). Синтетические ингибиторы р38 МАР-киназы показали свою высокую терапевтическую эффективность в различных воспалительных моделях на животных (Badger et al., 1996). Селективное ингибирование р38 МАР-киназы подавляло рост неоинтимы в модели рестеноза после механического повреждения артерии крысы (Ohashi et al., 2000). Согласно нашим данным, высокая противовоспалительная эффективность ингибиторов р38 МАР-киназы может быть обусловлена как ингибированием синтеза цитокинов, так и подавлением миграции моноцитов. Лекарственные вещества на основе ингибиторов МАР-киназы р38 при локальном применении, например, в составе коронарного стента, могли бы избирательно подавить миграцию моноцитов, не оказывая существенного влияния на подвижность ЭК сосудистой стенки.

В настоящее время в качестве покрытия коронарных стентов широко используются антипролиферативный и иммуносупрессорный агент рапамицин (сиролимус) и его аналоги. Рапамицин предупреждает рестенозирование -повторное сужение просвета артерии в месте ангиопластики. Рапамицин-

чувствительный Р1-3-киназа/тТ(Ж-сигнальный путь принимает участие в регуляции экспрессии хемокиновых рецепторов и непосредственно в хемотаксисе клеток, в частности, опухолевого происхождения (Liu et al., 2008). В нашей системе оценки клеточной миграции рапамицин не оказывал действия на миграцию моноцитов крови человека, стимулированную МСР-1. Так как основной мишенью иммуносупрессорного действия рапамицина являются активированные лимфоциты, мы оценили действие рапамицина на миграцию лимфоцитарных клеток. В качестве хемоаттрактанта был выбран SDF-1 как более эффективный стимулятор миграции данных клеток. Мы выявили подавление рапамицином миграции лимфобластных клеток линии Jurkat и С04+лимфоцитов, находящихся в стадии бласттрансформации вследствие активации антителами CD3/CD28 и ИЛ-2 (рис.7). Увеличение содержания ДНК в клетках было подтверждено окрашиванием красителем ДНК-специфичным красителем 7-AAD. Таким образом, чувствительные к рапамицину сигнальные пути вовлечены в регуляцию подвижности пролиферирующих Т-клеток. Ингибирующее действие рапамицина на рост неоинтимы в месте установки сосудистого стента, по крайней мере, частично, может быть обусловлено подавлением миграции активированных лимфоцитов.

кол-во промигрировивших клеток, тыс

900

700

500

300

100

контроль SDF-1 SDF-1+рапа, ЮОнМ

Рисунок 7. Действие рапамицина (рапа) на миграцию клеток, стимулированную SDF-1 (1 нМ). Приведены результаты, полученные для С04+лимфоцитов, активированных антителами CD3/CD28 и ИЛ-2. По оси Y -количество клеток в нижней части Transwell.

Разработка пептидных антагонистов миграции клеток, по нашему мнению, является также перспективной: в отличие от антител и химических ингибиторов, пептиды не вызывают иммунных реакций и нетоксичны, могут использоваться многократно. Сотрудниками лаб. синтеза пептидов НИИЭК были просчитаны и синтезированы пептиды, соответствующие различным участками молекулы MCP-1. Мы протестировали полученные соединения по их

28

действию на миграцию моноцитарных клеток в камере Бойдена и для дальнейших испытаний выбрали 2 пептида - пептид X и пептид ГХ - с МСР-1-ингибрующим и стимулирующим действие на миграцию клеток.

Пептид X (65-76 MCP-11 - ингибитор хемотаксиса лейкоцитов. Перед проведением испытаний пептида X у животных, мы оценили его устойчивость к деградации и способность проникать в очаг воспаления. Анализ фрагментов резонансных спектров 'Н-ЯМР пептида X в D20 и в плазме крови человека показал, что распад начинается более чем через сутки, что свидетельствует об относительной стабильности пептида. С помощью сцинтиграфии было показано накопление пептида, меченного радиоактивной меткой шТс, в очаге индуцированного ЛПС воспаления у крысы.

Для проверки действия пептида X на хемотаксис клеток in vivo было выбрано несколько моделей: миграция лейкоцитов в «воздушный мешок» у мышей при инъекции МСР-1 и ЛПС; миграция лейкоцитов в область инъекции ЛПС у крыс и приматов. Введение 100 нг JE (мышиного аналога МСР-1) в «воздушный мешок» сопровождалось усилением миграции моноцитов (F4/80+ клеток) в полость мешка. Содержание клеток (тыс.) в лаважной жидкости в присутствии хемокина превышало в 2 раза контрольный уровень (210±73 и 100±56, соответственно). Одновременное введение в «мешок» JE и пептида X, 1мг, приводило к снижению числа моноцитов в лаважной жидкости (96±43, р<0.05 по сравнению с миграцией в присутствии JE). Инъекция в сформированный «воздушный мешок» ЛПС вызывала миграцию гранулоцитов, которые в контроле отсутствовали. При одновременном введении в «мешок» ЛПС и пептида X наблюдалось подавление миграции гранулоцитов (контроль: 83 ± 43; ЛПС: 1778 ± 870; ЛПС+пептид: 970 ± 446 тыс. клеток; ¿>=0.056 по сравнению с миграцией в присутствии ЛПС). Таким образом, пептид X ингибировал миграцию не только моноцитов, но и гранулоцитов. Эффективность пептида X сохранялась при внутримышечном введении, минимально действующая доза оказалась равной 33-40 мкг/кг веса животного. В дальнейших экспериментах пептид применяли в указанном диапазоне доз.

Для индукции подкожного воспаления у крыс и приматов использовали ЛПС. Пептид X вводили крысам внутримышечно, приматам - внутривенно. Анализ пленочных препаратов крыс через 24 часа после инъекций показал, что в зоне введения ЛПС накапливались лейкоциты, нейтрофильные гранулоциты и моноциты (рис. 8). В контрольной группе (при введении физиологического раствора) или в группе с введением пептида X лейкоциты отсутствовали. При введении ЛПС и пептида X количество гранулоцитов и моноцитов снижалось на 70 и 25 %, соответственно, количество фибробластов практически не изменялось (табл. 3).В отличие от крыс у обезьян через 24 часа после подкожной инъекции ЛПС происходило накопление главным образом гранулоцитов. Пептид вводили в то же время, что и ЛПС, либо двукратно -одновременно с ЛПС и через 4 ч. Однократное внутривенное введение пептида сопровождалось таким же ингибирующим влиянием на миграцию

гранулоцитов, как и двукратное (рис. 9, табл. 4). Иммуногистохимическое окрашивание подкожной соединительнотканной пленки обезьян антителами к лейкоцитарному антигену CD45 подтвердило результаты морфологического анализа. Контрольная смесь аминокислот, составляющих пептид X, не оказывала ингибирующего эффекта на миграцию гранулоцитов. Полученные данные свидетельствуют о том, что пептид X обладает противовоспалительными свойствами, подавляя хемотаксис лейкоцитов в ответ на МСР-1 и ЛПС.

А Б В Г

Рисунок 8. Фрагменты подкожной соединительнотканной пленки крыс в месте инъекции (А) физ.раствора, (Б) пептида X, (В) ЛПС, (Г) ЛПС+пептид X. Окраска красителем Романовского-Гимза. Увеличение х100.

Таблица 3. Количество клеток в пленочных препаратов у крыс с ЛПС-индуцир о ванным подкожным воспалением. *р<0.05 по сравнению с группой «ЛПС».

Кол-во клеток в поле зрения фибробласты гранулоциты моноциты

ЛПС 190 ± 5 34 ±4 43 ±4

ЛПС + пептид X 175 ±4 10±3* 33 ±6

В

Д

Рисунок 9. Фрагменты подкожной соединительнотканной пленки обезьян в месте инъекции (А) физ.раствора, (Б) пептида X, (В) ЛПС, (Г) ЛПС+пептид X, (Д) ЛПС+смесь аминокислот, составляющих пептид. Окрашивание красителем Романовского-Гимза. Увеличение х 100.

Таблица 4. Количество фибробластов и лейкоцитов в пленочных препаратах у приматов, смесь а. к. - смесь аминокислот, составляющих пептид, *р<0.05 по сравнению с «ЛПС».

Действующие агенты Схема введения пептида X Кол-во фибробластов в поле зрения Кол-во лейкоцитов в поле зрения

ЛПС - 142 ± 5 90 ± 10

ЛПС + пептид X 0 и через 4 ч 142 ± 13 50 ±24*

ЛПС + пептид X 0ч 136±6 36 ±9*

ЛПС + смесь а.к. 0 ч 140 ±6 89 ± 10

Действие пептида X на рост неоинтимы после повреждения сосуда было изучено в модели экспериментальной ангиопластики сонных артерий крыс. С помощью баллонного катетера удаляли эндотелий левой общей сонной артерии крыс, что подтверждали по отсутствию окрашивания антителами к фактору фон Виллебранда. Через 4 суток после вмешательства в месте повреждения интимы у контрольных животных (получавших только физиологический раствор) наблюдали адгезию лейкоцитов - т.н. первичные скопления клеток в начале формирования неоинтимы (рис. 10). Их площадь составляла 0.25±0.05 мм2. На данном сроке наблюдения в сосудах крыс, получавших пептид, на месте поврежденного интимального слоя первичные скопления клеток практически отсутствовали, и их площадь составляла 0.04 ± 0.04 мм2 (р = 0.037 по сравнению с контролем). Через 7 суток в обеих группах животных люминальную поверхность сосуда покрывали расположенные в несколько слоев клетки, образующие неоинтиму. У крыс, получавших пептид, формирование неоинтимы было замедлено (рис. 11).

* Б

Рисунок 10. 4 суток после баллонного повреждения сонной артерии крыс. Иммуногистохимическое окрашивание с использованием антител к маркеру моноцитов/макрофагов СЭ68. А. Контрольная группа, стрелкой указано первичное скопление клеток. Б. Группа с пептидом X. Клеточные ядра окрашены гематоксилином Майера. Увеличение хбОО.

А Б

Рисунок 11. Формирование неоинтимы через 7 суток после баллонного повреждения сонной артерии крыс. Окрашивание по Романовскому-Гимза. А. Контрольная группа. Б. Группа с пептидом X. Увеличение х400.

Микроскопический анализ, проведенный на 4 и 7 сутки после вмешательства, выявил существенное снижение количества ядер в формирующейся неоинтиме и меньший размер площади неоинтимы в группе животных с пептидом X по сравнению с контролем. Площадь просвета сосуда через 7 суток после баллонного повреждения была выше в группе с пептидом, площадь медии не изменялась. Отношение площади неоинтимы к площади медии достоверно различалось на 4 и 7 сутки (табл. 5). Через 14 и 28 суток после вмешательства в контрольной группе и группе с получением пептида X наблюдали выраженную интимальную гиперплазию. Морфометрические показатели не имели достоверных отличий. Таким образом, пептид X подавлял формирование неоинтимы на ранних сроках после баллонирования сонных артерий крыс, когда активными участниками процесса ранозаживления являются клетки воспаления.

Таблица 5. Площадь просвета сосуда и отношение площади неоинтимы к площади после баллонного повреждения сонной артерии крыс. * р<0.05 по сравнению с контролем._

сутки после вмешательства группа площадь просвета сосуда, мм" площадь интимы/ площадь медии

4 контроль 7,30±0,56 0,130±0,045

пептид X 7,35±0,07 0,020±0,014*

7 контроль 5,17±0,10 0,86±0,10

пептид X 6,86±0,34* 0,29±0,05*

Данные, полученные в экспериментах in vitro и in vivo, позволили рекомендовать пептид X для проведения клинических испытаний. В лаборатории токсико-фармакологических исследований НИИЭК были изучены свойства пептида пептида X, зарегистрированного как товарный знак -Инграмон (ингибитор миграции гранулоцитов и моноцитов); исследования показали безопасность препарата. На проведение изучения действия Инграмона

у здоровых добровольцев и при проведении стентирования коронарных артерий у пациентов со стенозирующим атеросклерозом коронарных артерий (I и II фазы) были получены все разрешительные документы. В первой фазе исследований была показана безопасность применения Инграмона у добровольцев.

Клиническое исследование применения препарата «Инграмон» при проведении стентирования коронарных артерий у пациентов со стенозирующим атеросклерозом коронарных артерий выявило противовоспалительное действие пептида у пациентов с ИБС (табл. 6, рис. 12). Как видно из представленных данных, терапия Инграмоном приводила к менее выраженному повышению уровня СРБ и фибриногена на 1-е, 2-е и 7-е сутки в крови у больных после коронарного стентирования. Через 6 месяцев после вмешательства в обеих группах больных было отмечено значимое снижение концентрации СРБ в крови относительно исходного уровня. В группе лечения Инграмоном также отмечалось значимое снижение уровня МСР-1 в крови пациентов на следующие сутки после начала терапии.

Рисунок 12. Динамика концентраций СРБ (А) и фибриногена (Б) у больных после коронарного стентирования (КС) на фоне стандартного лечения и терапии Инграмоном. *р<0.05 по сравнению с данными в группе КС на фоне стандартной терапии.

В последующей серии экспериментов был изучен механизм ингибирующего влияния пептида X на миграцию моноцитов и гранулоцитов. Известно, что взаимодействие хемокинов с рецепторами сопровождается мобилизацией внутриклеточного Са++, быстрой реорганизацией цитоскелета и активацией молекул адгезии. Так, под действием МСР-1 значительно возрастает экспозиция р2-интегринов, в том числе, Мас-1 (CD1 lb/CD18), моноцитами и гранулоцитами крови. Действительно, МСР-1 вызывал повышения содержания Са^ в клетках ТНР-1, а также стимулировал р2-интегрин-зависимую адгезию этих клеток (но не клона с дефицитом CD 18) на фибриногене. После

33

до 1 сут. 2 сут. 7 сут. 1 мес. 3 мес. 6 мес.

СРБ, пг/мл

КС + Инграмон 1,28 (0,83-1,85) 1,96 (1,36-2,24)** 2,32 (1,95-3,36**) 1,61 (1,07-2,11)** 0,98 (0,73-1,19) 1,10 (0,96-1,48) 0,99* (0,79-1,3)

КС стандартное лечение 1,93 (1,41-2,70) 3,99 (2,93-5,57)** 6,08 (4,72-7,35)** 3,60 (2,72-4,26)** 1,56 (0,99-2,12) 1,38 (0,56-1,85) 0,91* (0,44-1,07)

Фибриноген, г/л

КС + Инграмон 3,5 (3,3-3,6) 3,6 (3,5-3,9)* 3,8 (3,7-3,97)** 3,7 (3,70-4,0)* 3,4 (3,3-3,5) 3,5 (3,38-3,58) 3,4 (3,3-3,4)

КС стандартное лечение 3,60 (3,4- 3,8) 4,1 (3,9-4,2)* 4,2 (4,0-4,4)** 4,0 (3,9-4,1)* 3,5 (3,4- 3,6) 3,5 (3,4- 3,6) 3,3 (3,2- 3,5)

МСР-1, пг/мл

КС+Инграмон 98,9+/-48,3 83,2,0+/-33,2* 85,2+/- 46,4* 95,6+/- 45,4 90,7+/- 53,8 96,3+/- 53,0 92,7+/-47,1

КС стандартное лечение 100,7+/-30,4 92,5+/- 34,9 91,4+/-40,8 99,9+/- 33,5 97,4+/- 36,8 100,6+/-30,4 96,0+/-31,0

Таблица б. Содержание СРБ, фибриногена и МСР-1 в крови больных после коронарного стентирования (КС) на фоне стандартного лечения и дополнительного введения Инграмона. Значения р (*р<0.05, **р<0.01) получены при сравнении показателей в каждой временной точке относительно исходных данных. Анализ сравнения данных между группами представлен на рисунке 12.

стимуляции МСР-1 мембранная плотность молекул Мас-1 (детектируемая по связыванию антител к CD IIb) на поверхности моноцитов крови существенно возрастала. Мы не обнаружили влияния пептида X на данные показатели функционального состояния клеток как в присутствии МСР-1, так и без него, следовательно, пептид X не препятствовал взаимодействию МСР-1 с клеточными рецепторами.

Противовоспалительный эффект пептида X может быть опосредован блокадой связывания МСР-1 с гепарином и с подавлением олигомеризации молекул хемокина. Было изучено влияние пептида X на образование димеров МСР-1 в растворе с помощью ПААГ-электрофореза и иммуноблоттинга и на взаимодействие МСР-1 с гепарином с помощью биосенсора и ИФА. На электрофореграмме и блоте проб МСР-1 без сшивающего агента наблюдали одну полосу, соответствующую мономерной форме нативного белка (~ 9 кДа). При добавлении ДСС появлялась вторая полоса, соответствующая димерной форме МСР-1 (-18 кДа). Контрольный белок апротинин оставался в форме мономера. После электропереноса на Вестерн-блоте МСР-1 наблюдали полосы, соответствующие электрофореграмме. При добавлении пептида X к раствору МСР-1 достоверных изменений на электрофореграмме и блоте не выявлено, т.е. пептид X не влиял на димеризацню МСР-1. ИФА показал, что в присутствии пептида X связывание МСР-1 (576нМ) с гепарином подавляется. Максимальное ингибирование (на 40 %) происходило при концентрации пептида 100 мкМ, и дальнейшее увеличение содержания пептида не сопровождалось усилением ингибиторного влияния на связывание MCP-1-гепарин. Активность пептида сохранялась в тех случаях, когда пептид вносили в лунки с гепарином до внесения МСР-1, что свидетельствует о предпочтительном взаимодействии пептида с гепарином, а не с МСР-1. Пептид X также подавлял, хотя и менее эффективно, связывание с гепарином ИЛ-8 - хемоаттрактанта нейтрофильных гранулоцитов. С помощью биосенсорного прибора Пикоскоп было обнаружено, что по мере увеличения концентрации МСР-1 происходит возрастание оптической толщины молекулярного слоя Ad в нанометрах (нм), образованного комплексом гепарин - МСР-1 - мкАТ к МСР-1; Ad возрастала по мере увеличения концентрации МСР-1 (рис. 13, верхняя кривая). Константа диссоциации связывания МСР-1 с гепарином, рассчитанная в координатах Скэтчарда, составила 0.44 мкМ, что согласуется с данными о низкоаффинном связывании МСР-1 с ГАГ (Lau et ей., 2004). При добавлении пептида X, 100 мкг/мл, регистрировали очень низкие ответы на посадку MCP-1 практически во всех концентрациях хемокина (рис. 13, нижняя кривая). Смесь аминокислот, составляющих пептид X, не влияла на связывание МСР-1 с гепарином. По степени ингибирования пептидом связывания МСР-1 с гепарином имеются некоторые различия между результатами ИФА и биосенсорного анализа, что, по-видимому, связано с различиями в площади (30 мм2 и 1 мм2, соответственно) и сорбционных свойствах сенсорных поверхностей, а также в разных режимах нанесения веществ (стационарном и проточном). С помощью сканирующего микроскопа были получены снимки поверхности нанесения MCP-1 (576 нМ) и антител и поверхности нанесения МСР-1 в той же концентрации в присутствии

пептида, 100 мкг/мл (~ 70 мкМ), и антител (рис. 13, правая часть). Плотно расположенные структуры на верхнем снимке, являются, по всей вероятности, агрегатами антител, связавшихся с МСР-1. В зоне пропускания МСР-1 с пептидом X (нижний снимок) присутствуют только одиночные белковые молекулы.

•3 о.® •

ос g

о

ЛС °-6 '

s 3 с

2 О..

сс

«О

600 700

(МСЯ-1) нМ

МСР-1 -4- ß пептид X

Рисунок 13. Изменения в связывании МСР-1 с гепарином в зависимости от концентрации МСР-1 без пептида (верхняя кривая) и при добавлении пептида в концентрации 100 мкг/мл (нижняя кривая) по данным, полученным с помощью Пикоскопа. Справа - фото зон посадки на чип моноклональных антител к МСР-1: А - при нанесении на чип МСР-1, Б - при нанесении МСР-1 с пептидом X. Угол сканирования 0 увеличение - 5000х.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что противовоспалительное действие пептида X не вызвано нарушением взаимодействия МСР-1 с клеточными рецепторами, а обусловлено вытеснением MCP-1 и, вероятно, других хемокинов с сайтов связывания с ГАГ.

Пептид IX (29-40) стимулирует миграцию моноцитов.

Среди пептидных фрагментов МСР-1 пептид IX (последовательность 29-40 МСР-1) активировал миграцию моноцитарных клеток в камере Бойдена. Максимальный эффект наблюдался при концентрации пептида 100-500 мкг/мл (70-350 мкМ). При внесении пептида в верхние ячейки камеры миграционный ответ клеток возрастал в той же степени, что при внесении в нижние ячейки, т.е. пептид стимулировал миграцию за счет активации хемокинеза. Биологический эффект хемокинов опосредован их взаимодействием с мембранными рецепторами, принадлежащими к семейству семидоменных Gi-белок-сопряженных рецепторов. Известным ингибитором Gi-белков является коклюшный токсин (Pertussis toxin), который подавляет хемокин-стимулированную миграцию клеток. Активация хемокиновых рецепторов сопровождается мобилизацией внутриклеточного Са~\ В нашей системе исследования миграции клеток Pertussis toxin не оказывал существенного

влияния на спонтанную и пептид IX -зависимую миграцию моноцитов крови человека in vitro, но ингибировал миграцию клеток, стимулированную МСР-1. Аналогичным действием обладал химический антагонист рецептора CCR2, т.н. BMS CCR2 22. Нами не обнаружено быстрого повышения концентрации внутриклеточного Са++ под действием пептида в моноцитарных клетках ТНР-1, в то время как МСР-1 вызывал данный эффект. Следовательно, стимулирующий миграцию эффект пептида, по-видимому, не связан с активацией «классических» Gi-белок-сопряженных рецепторов, в том числе рецепторов МСР-1 CCR2. Предварительная обработка суспензии мононуклеарных клеток гепарином не оказывала влияния на последующую миграцию, следовательно, эффект пептида не был связан с вытеснением с клеточной мембраны эндогенных факторов, связанных с ГАГ. Пептид IX не активировал миграцию нейтрофильных гранулоцитов в камере Бойдена и не оказывал влияния на подвижность ЭК в модели «зарастания царапины».

Пептид IX содержит в 8-ом положении остаток цистеина. При электрофоретическом анализе пептида в присутствии ДСН выявлялись димеры, стабилизированные за счет образования -S-S- связей, которые разрушались в присутствии меркаптоэтанола. Аналог пептида IX с заменой цистеина на серии, т.н. пептид IX (S), при электрофорезе перемещался как мономер. В диапазоне концентраций 100 - 1000 мкг/мл пептид IX (S) не влиял на миграционную способность моноцитов в камере Бойдена. Следовательно, наличие остатка цистеина в структуре пептида IX обязательно для проявления его влияния на подвижность клеток.

кол-во клеток, тыс.

контроль

пептид IX 10 мкг

о всего клеток в лаваже

I мононуклеарных клеток в лаваже

пептид IX 100 мкг

Рисунок 14. Пептид IX стимулирует миграцию клеток в «воздушный мешок» у мышей. *р<0.05.

Действие пептида на миграцию клеток in vivo было изучено в моделях «воздушного мешка» у мышей и при подкожной инъекции у крыс. У мышей через 4 часа после введения пептида было выявлено дозо-зависимое усиление миграции клеток, в том числе мононуклеарных лейкоцитов, в полость «мешка» (рис. 14). Морфологический анализ пленочных препаратов, полученных от крыс с подкожной инъекцией пептида, также выявил скопления мононуклеарных клеток крови в местах введения препарата, которые отсутствовали в местах инъекций физиологического раствора (рис. 15). Соотношение моноциты/фибробласты в пленках возрастало при увеличении количества локально вводимого пептида от 1 до 100 мкг.

У* #

VU *

т ,, & ' 1

ш

»-

г

контроль

пептид IX, 100мкг

0,12

мо/фб

пептид IX

+

1 мкг

+

10 мкг

+

100 мкг

Рисунок 15. Пептид IX вызывает привлечение лейкоцитов при подкожной инъекции крысам. Вверху - фрагменты пленочных препаратов, красными стрелками показаны ядра мононуклеарных клеток. Окрашивание препаратов красителем Романовского-Гимза. Увеличение 100х. Внизу - гистограмма, отражающая соотношение моноциты/фибробласты (мо/фб) в препаратах, *р<0.05.

Влияние пептида IX на миграцию лейкоцитов и формирование грануляционной ткани было оценено при подкожной имплантации инородного биоматериала (агарозы) у линейных крыс. Морфометрический анализ показал, что толщина грануляционной ткани вокруг имплантата, содержащего пептид (1

мг), была большей по сравнению с контрольной группой - 626 и 556 мкм, соответственно. По данным гистологического анализа, ткань вокруг имплантатов с пептидом IX характеризовалась более высоким содержанием мононуклеарных лейкоцитов. Контрольные имплантаты были покрыты рыхлой волокнистой тканью, практически не содержащей лейкоцитов (рис. 16). Обогащение СВ45+клетками соединительной ткани вокруг имплантата, содержащего пептид, было подтверждено иммуногистохимически.

Действие пептида IX на образование капилляров было исследовано в модели ишемии нижней конечности у крыс. У животных, получавших пептид, среднее количество капилляров в поле зрения было выше, по сравнению с контрольной группой, оно составляло, соответственно 67+10 и 41 + 12, р<0.05.

Рисунок 16. Действие пептида IX на формирование грануляционной ткани вокруг агарозного имплантата. Правая часть - капсула агарозного имплантата с добавлением пептида IX, слева - образец ткани капсулы контрольного образца. Окраска гематоксилином-эозином, увеличение 100х.

В модели восстановления кожного покрова у мышей аппликации пептида IX в остром периоде, т. е. в первые двое суток после нанесения травмы, способствовали ускоренному ранозаживлению: у животных, получавших пептид, размер раны сокращался быстрее по сравнению с животными с аппликацией раствора смеси аминокислот, входящих в состав пептида (рис. 17). Таким образом, у животных введение/аппликации пептида способствовали формированию грануляционной ткани, росту капилляров и ускоренному заживлению раны. Наблюдаемый эффект, по нашему мнению, связан с привлечением моноцитов, играющих триггерную роль в восстановлении целостности тканей.

Сотрудниками ФФМ МГУ было оценено действие пептида IX на репаративные процессы в сердечной мышце у крыс после ишемии-реперфузии (инфаркта миокарда). Существенного влияния пептида на размер поражения миокарда обнаружено не было. Так, размер зоны некроза, представленный в процентном отношении к общему размеру левого желудочка, на 3 сутки после моделирования ишемии-реперфузии составил 39,2+7,2% в группе с введением пептида и 34,9+7,8% в контрольной группе. Соответственно, размер рубца через 28 суток после окклюзии коронарной артерии составил 22,7+5,7% в группе с инъекцией пептида и 25,0+7,2% в контрольной группе. При микроскопическом

анализе препаратов сердца у крыс, получавших пептид, на сроке 12 часов после инфаркта наблюдали большее число немиоцитарных клеток в условно интактном миокарде по сравнению с группой без препарата. Через 24 и 72 часа после инфаркта существенного влияния пептида на морфологические показатели отмечено не было, однако на 28 сутки отмечались лучшая сохранность условно интактного миокарда и меньшее количестве немиоцитарных клеток в зоне рубца (рис. 18).

9000 8000 7000 6000 5000 4000 3000 2000 1000 о

размер раны, ОЕ

□ пептид □ смесь а.к.

10 сутки

7 сутки

смесь а.к.

10 сутки пептид IX

Рисунок 17. Пептид IX стимулирует заживление кожного дефекта у мышей. Смесь а.к. - смесь аминокислотных составляющих пептид. *р<0.05 по сравнению с контролем на 10 сутки. Внизу - фотографии ран, сделанные на разные сроки после нанесения травмы.

Для уточнения описательной морфологии миокарда была проведена ранжировка основных качественных признаков. На раннем сроке (12 часов), в группе животных с введением пептида было выявлено уменьшение количества

кровоизлияний и контрактур в околоинфарктной зоне, при этом в условно интактном миокарде степень повреждения кардиомиоцитов и количество немиоцитарных клеток была несколько выше, а контрактуры кардиомиоцитов ослаблены. На 28 сутки после окклюзии коронарной артерии в группе с введением препарата в не затронутом ишемией миокарде число немиоцитарных клеток было ниже, отмечено уменьшение степени повреждения кардиомиоцитов в той же зоне.

Контроль Пептид IX

Рисунок 18. Область рубца на 28 сутки после инфаркта; гематоксилин-эозин, х400.

Инфарктная зона Зона рубца

Контроль Пептид IX Контроль Пептид IX

Рисунок 19. Инфарктная зона через 12 ч и рубцовая зона через 28 сут после ишемии-реперфузии миокарда. Иммуногистохимическое окрашивание антителами к СОб8. х400 .

При иммуногистохимическом окрашивании срезов сердца антителами к СБ68 (маркёру макрофагов) на сроке 12 ч после окклюзии коронарной артерии в группах с введением пептида IX наблюдали увеличение количества СБ68+клеток (моноцитов/макрофагов), как в зоне инфаркта, так и в условно интактном миокарде; на сроке 24 ч было отмечено снижение количества клеток с экспрессией СЭ68 в периинфарктном и условно интактном миокарде при введении пептида; через 72 ч - значительное увеличение количества СБ68

позитивных клеток в инфарктной зоне. На 28 сутки после окклюзии коронарной артерии введение препарата было ассоциировано со снижением количества окрашенных клеток в зоне рубца (рис. 19). По-видимому, увеличение количества CD68 позитивных клеток через 12 часов после инфаркта во всех зонах миокарда связано с хемоаттрактантным действием препарата. Накопление моноцитов/макрофагов приводит к ускорению протекания воспалительной реакции, и, как следствие, меньшему содержанию CD68 позитивных клеток в рубце миокарда на 28 сутки, т.е. в отдаленные сроки после вмешательства.

Таким образом, нами идентифицированы пептиды, соответствующие фрагментам аминокислотной последовательности МСР-1 человека, которые способны оказывать действие на миграцию лейкоцитов. Пептид X (последовательности 65-76 МСР-1) ингибирует миграцию лейкоцитов в очаг воспаления, обладает противовоспалительной активностью у животных и человека. Механизм действия пептида X опосредован конкуренцией с МСР-1 и, возможно, другими хемокинами за связывание с гликозаминогликанами. Пептид IX (последовательности 29-40 МСР-1) при локальном введении животным вызывает привлечение моноцитов, стимулирует образование грануляционной ткани и ангиогенез и увеличивает скорость ранозаживления. Показано кардиопротективное действие пептида IX в модели экспериментального инфаркта миокарда у крыс.

ВЫВОДЫ

1. В атеросклеротических бляшках коронарных артерий больных ишемической болезнью сердца детектирована мРНК ряда «про-» и «противовоспалительных» цитокинов. Показано наличие в бляшках мононуклеарных лейкоцитов, моноцитов и Т-клеток, экспрессирующих рецепторы хемотаксических цитокинов (хемокинов).

2. Концентрация хемокина МСР-1 в плазме крови и количество циркулирующих активированных Т-хелперных лимфоцитов у пациентов с ИБС, нестабильной стенокардией, достоверно повышены по сравнению с пациентами со стабильной стенокардией и донорами. У пациентов со стабильной стенокардией отмечено увеличение содержания активатора плазминогена урокиназного типа в крови и на мембране циркулирующих моноцитов.

3. У пациентов с ИБС, стабильной стенокардией, обнаружена отрицательная корреляционная связь между содержанием регуляторных Т-лимфоцитов в крови и количеством пораженных атеросклерозом коронарных артерий. Связи между уровнем циркулирующих регуляторных Т-лимфоцитов в крови и известными факторами риска ИБС не обнаружено.

4. Адгезия и миграция моноцитов in vitro зависят от состояния внеклеточного матрикса и определяются типом вовлеченных молекул адгезии. В спонтанной адгезии клеток на фибриногене участвуют преимущественно интегрины CD1 lb/CD 18, в МСР-1-стимулированной адгезии и миграции — интегрины CDllc/CD18. Протеолитическая деградация фибриногенового матрикса приводит к усилению миграционного ответа клеток in vitro.

5. МСР-1 вызывает активацию ряда сигнальных молекул в моноцитарных и эндотелиальных клетках. Впервые установлено, что наибольший вклад в МСР-1-опосредованную миграцию моноцитов вносят киназы семейства src и р38 МАР-киназа, а в подвижность эндотелиальных клеток - PI-3-киназа и ERK1/2 (р42/44) МАР-киназы.

6. Обнаружено, что ингибитор протеинкиназы mTOR рапамицин (сиролимус) подавляет in vitro хемотаксис лимфобластных клеток и лимфоцитов, находящихся в стадии бласпрансформации.

7. По действию на миграцию моноцитарных клеток in vitro протестированы и выбраны для испытаний in vivo пептидные фрагменты хемокина МСР-1: пептид X (65-76), ингибирующий МСР-1-зависимую миграцию клеток, и пептид IX (29-40), стимулирующий подвижность моноцитов.

8. Установлено, что пептид X ингибирует миграцию лейкоцитов, стимулированную МСР-1 и ЛПС, у мышей, подавляет подкожное ЛПС-индуцированное воспаление у крыс и приматов и замедляет рост неоинтимы после баллонного повреждения сонных артерий крыс. Противовоспалительные свойства пептида X опосредованы конкуренцией с МСР-1 за связывание с гликозаминогликанами (ГАГ).

9. У пациентов с ИБС, которым проводилось дополнительное к стандартной терапии введение пептида X (Инграмона) до и после стентирования коронарных артерий, концентрация в крови СРБ, фибриногена и МСР-1 после вмешательства ниже, чем у пациентов на фоне стандартной терапии.

10. Пептид IX при локальном введении экспериментальным животным вызывает привлечение моноцитов, стимулирует образование грануляционной ткани и ангиогенез и увеличивает скорость ранозаживления. Показано кардиопротективное действие пептида IX в модели экспериментального инфаркта миокарда у крыс.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Оценка количества регуляторных Т-клеток в крови при ИБС может способствовать выявлению пациентов с высоким риском прогрессирования коронарного атеросклероза. Определение содержания в крови МСР-1 может быть дополнительным диагностическим критерем нестабильной стенокардии. Пептидный препарат Инграмон, обладающий противовоспалительным действием, может найти применение при лечении ИБС, в частности, у пациентов с повышенным уровнем маркеров воспаления в крови и имеющих высокий риск развития острого коронарного синдрома и рестеноза после эндоваскулярных вмешательств. Введение препарата на основе пептида IX, стимулирующего миграцию моноцитов, в зону некроза может снизить степень отрицательного ремоделирования миокарда в отдаленные сроки после инфаркта.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Глазкова Н.Б., Арефьева Т.И., Антонова О.А., Красникова ТЛ. Действие ингибиторов митоген-активируемых киназ на хемотаксис клеток, стимулированный моноцитарным хемотаксическим белком-1. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 2003,89(1):43-52.

2. Красникова Т.Л., Арефьева Т.И., Кухтина Н.Б. Хемокины, рецепторы хемокинов и атерогенез. Успехи современной биологии. 2003, 123 (5):506-514.

3. Кухтина Н.Б., Арефьева Т.И., Арефьева A.M., Красникова Т.П. Зависимость хемотаксического ответа моноцитарных клеток, стимулированных МСР-1, от состава подложки. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 2003, 89 (12): 43-51.

4. Арефьева Т.И., Проваторов С.И., Самко А.Н., Кухтина Н.Б., Антропова Ю.Г., Ильинская О.П., Тарарак Э.М., Красникова T.JI. Цитофлюориметрический анализ лейкоцитов из нестабильных атеросклеротических бляшек коронарных артерий человека. Приложение к журналу "Кардиоваскулярная терапия и профилактика" 2003, Т.2, №3, С. 19.

5- Сидорова М.В., Молокоедов А.С., Арефьева Т.И., Кухтина Н.Б., Красникова Т.Л, Беспалова Ж.Д, Бушуев В.Н. Твердофазный синтез пептидных фрагментов хемокина МСР-1 человека и изучение их биологической активности. Тезисы Российского симпозиума по химии и биологии пептидов, Москва 17-19 ноября 2003,1-38, С.42.

6. Сидорова М.В., Молокоедов А.С., Арефьева Т.И., Кухтина Н.Б., Красникова Т.Л., Беспалова Ж.Д, Бушуев В.Н. Пептидные фрагменты хемокина МСР-1, их структурных аналогов и их влияние на MCP-1-опосредованную миграцию моноцитарных клеток. Биоорганическая химия. 2004, 30(6): 582-593.

7. Arefieva Т.; Provatorov S.; Samko A.; Kukhtina N.; Antropova U.; Ilyinskaya O.; Tararak E.; Krasnikova Т.. Flow cytometry analysis of leukocytes from coronary atherosclerotic plaques. Journal of Hypertension. 2004. 22(2), pp. 185-186.

8. Krasnikova Т.; Sidorova M.; Arefieva Т.; Kukhtina N.; Molokoedov A.; Bushuev V. Synthetic peptides corresponding to MCP-1 N- and C-terminal sequences inhibit monocyte migration. Journal of Hypertension. 2004. 22(2). p. 66.

9. Krasnikova Т.; Sidorova M.; Arefieva Т.; Kukhtina N.; Molokoedov A.; Bushuev V.; Bespalova J. The effects of synthetic peptides corresponding to MCP-1 sequences on monocytic cell migration. European Heart Journal. 2004. 25. p. 143.

10. Н.Б. Кухтина, Т.И. Арефьева, Т.Л. Красникова. Внутриклеточный сигнальный каскад в миграции CD4+ Т-лимфоцитов при действии индуцируемого интерфероном-гамма белка-10. Биохимия, 2005, 70: 790-795.

11. T.I.Arefieva, N.B.Kukhtina, О.А. Antonova, T.L.Krasnikova. МСР-1-stimulated chemotaxis of monocytic and endothelial cells is dependent on activation of different signaling cascades. Cytokine. 2005, 31(6): 439-446.

12. Т.Л. Красникова; Т.И. Арефьева; М.Г. Мелехов; Н.Б. Кухтина; М.В. Сидорова; А.С. Молокоедов; В.Н.Бушуев; Ж.Д. Беспалова; Е.И.Чазов. Пептид последовательности 66-77 моноцитарного хемотаксического белка (МСР-1) -ингибитор воспаления у экспериментальных животных. Доклады академии наук. 2005. 404 (4): 1-4.

13. N. Kukhtina, Т. Arefieva, A. Basinkevich, S. Provatorov, R. Shakhnovich, T. Krasnikova. The number of circulating plasmacytoid dendritic cells is decreased in acute coronary event. Journal of Hypertension. 2005. 23 (suppl 2): S366.

14. Красникова Т.Л.; Сидорова M.B.; Молокоедов Ф.С.; Арефьева Т.И.; Кухтина Н.Б. Мелехов М.Г.; Беспалова Ж.Д. Новый додекапептид из С-концевого домена моноцитарного хемотаксического белка (МСР-1) - ингибитор воспаления. II Российский симпозиум по химии и биологии пептидов Санкт-Петербург, 25-27 мая 2005г. Тезисы докладов и стендовых сообщений. 2005. С. 75.

15. М.В. Сидорова; А.С. Молокоедов; Ф.Ф. Азьмуко; Т.Н. Арефьева; М.Г. Мелехов; Н.Б. Кухтина; Т.Л. Красникова; Ж.Д. Беспалова; В.Н. Бущуев. Пептидный фрагмент (66-77) моноцитарного хемотаксического белка 1 и его ретро-энантио-аналог ингибируют миграцию клеток in vivo и in vitro. Биоорганическая химия. 2006. 32: 161-168.

16. Е.И. Чазов; Т.Л. Красникова; Ж.Д. Беспалова; Н.Б. Кухтина; М.Г. Мелехов; Т.И. Арефьева; М.В. Сидорова; А.С. Молокоедов; Т.Е. Гвоздик; Б.М. Мартьянов; В.В. Поздеев; В.Б. Сергиенко; Т.Л. Бушуева. Ингибирование миграции моноцитов и гранулоцитов in vivo пептидом последовательности 65-76 моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1). Доклады академии наук. 2006. 411: 1-3.

17. С.И. Проваторов, Т.И. Арефьева, Н.Б. Кухтина, Т.К. Лкжова, A.M. Арефьева, Т.Л. Красникова. Маркеры воспаления - моноцитарный хемотаксический белок-1 (МСР-1) и С-реактивный белок - в крови пациентов с нестабильной стенокардией и стабильной стенокардией напряжения. Терапевтический архив. 2006, 6: 66-69.

18. Krasnikova Т., Kukhtina N., Arefieva Т., Martianov В., Sidorova М., Molokoedov А., Bespalova Z. МСР-1 C-terminus (66-77) peptide is an inhibitor of inflammation. Bioscience 2006 Scientific Programm and Abstracts, 23-27 July, SECC, Glasgow, UK 2006. p. 144.

19. N.B. Kukhtina, R.S. Akchurin, T.I. Arefieva, T.L. Krasnikova Different cytokine expression profiles in atherosclerotic plaques and aorta from patients with CAD. Journal of Hypertension. 2006. s377.

20. T.I. Arefieva, S.I. Provatorov, N.B. Kukhtina, Т.К. Liukova, A.M. Arefieva, T.L. Krasnikova. Plasma levels of CRP and MCP-1 in patients with stable and unstable angina. Journal of Hypertension. 2006. 24. S380.

21. Chazov EI, Bespalova JD, Arefieva TI, Kukhtina NB, Sidorova MV, Provatorov SI, Krasnikova TL. The peptide analogue of MCP-1 65-76 sequence is an inhibitor of inflammation. Can J Physiol Pharmacol. 2007; 85(3-4): 332-40.

22. Красникова Т.Л., Н.Б. Кухтина, Т.И. Арефьева, М.В. Сидорова, А.А.Азьмуко,

A.С.Молокоедов, Е.В.Арзамасиев, К.И. Малиновская, Ж.Д. Беспалова. Инграмон — С-терминальный фрагмент (65-76) моноцитарного хемотаксического белка -1 (МСР-) - новый потенциальный противовоспалительный препарат, Доклад на III Российском симпозиуме "Белки и пептиды", Пущино, 2007.

23. Кухтина Н.Б., Баигтрыков П.П., Арефьева Т.И., Соколов В.О., Красникова Т.Л. Синтетический фрагмент 65-76 моноцитарного хемотаксического белка -1 (инграмон) ингибирует формирование неоинтимы у крыс. Доклад на III Российском симпозиуме "Белки и пептиды", Пущино, 2007.

24. Н. Б. Кухтина, П. П. Баштрыков, Беспалова Ж.Д., Сидорова М.В., Т. И. Арефьева,

B.О.Соколов, Т. Л. Красникова. Влияние синтетического фрагмента 65-76 МСР-1

на формирование неоинтимы после баллонного повреждения у крыс. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 2008,94(1): 27-36.

25. Н.Б. Кухтина, Т.И. Арефьева, A.M. Арефьева, Р.С. Акчурин, T.JI. Красникова. Экспрессия хемокинов и цитокинов в атеросклеротических бляшках и интиме артерий у больных ИБС. Терапевтический архив. 2008, 4:63-69.

26. Красникова T.JI., Н.Б. Кухтина, Т.И. Арефьева, М.В. Сидорова, А.А.Азьмуко, А.С.Молокоедов, Е.В.Арзамасцев, К.И. Малиновская, Ж.Д. Беспалова. Разработка противовоспалительных пептидных препаратов- антагонистов хемокинов. Доклад на симпозиуме "Результаты фундаментальных и прикладных исследований для создания новых лекарственных средств", Москва, 2008.

27. Kukhtina NB, Bashtrykov РР, Bespalova ZhD, Sidorova MV, Aref eva TI, Sokolov VO, Krasnikova TL. Effects of synthetic monocyte chemotactic protein - 1 fragment 65-76 on neointima formation after carotid arteiy balloon injuiy in rats. Neurosci Behav Physiol. 2009, 39:153-159.

28. Красникова Т.Л., Сидорова M.B., Арефьева Т.И., Кухтина Н.Б., Азьмуко А.А., Беспалова Ж.Д. Разработка нового пептидного противовоспалительного пептидного препарата — ингибитора моноцитарного хемотаксического белка -1 (МСР-1). Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 2009, 95(5): 494-506.

29. Арефьева Т.И, Проваторов С.И., Потехина А.В., В.О.Соколов, Кухтина Н.Б., Самко А.Н., Красникова. Влияние имплантации содержащих рапамицин стентов в коронарные артерии на количество циркулирующих CD4+CD25 high + -регуляторных Т- клеток. Терапевтический архив. 2009, 9:33-37.

30. Соколов В.О., Красникова TJL, Прокофьева JI.B., Кухтина Н.Б., Арефьева Т.И. Экспрессия маркеров регуляторных CD + CD25+foxp3+ клеток в атеросклеротических бляшках коронарных артерий человека. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009, 147(8): 667-670.

31. Т Potekhina A., V.Sokolov, E.Pylaeva, S.Provatorov, N.Kukhtina, T.Krasnikova, T.Arefieva. Circulating CD4+CD25 high + CD127 low regulatory T-cells after coronaiy stenting with rapamycin-eluting stents. 8th International congress on coronaiy arteiy disease from prevention to infection. October 11-14 , 2009, Prague, Czech Republic.

32. Красникова Т.Л., Никитин П.И., Ксеневич Т.И., Горшков Б.Г., Сидорова М.В., Азьмуко.А.А., Арефьева Т.И., Кухтина Н.Б., Беспалова Ж.Д. Анализ влияния фрагмента (65-76) С-кокцевого домена моноцитарного хемотаксического белка -1 (МСР-1) Инграмона на взаимодействие МСР-1 с гепарином. Тезисы IV Российского симпозиума "Белки и пептиды', Казань, 23-27 июня, стр.78, 2009.

33. V.Sokolov. T.Krasnikova, L. Prokofieva, T.Arefieva. Regulatory (foxp3+) T-cells in human coronary atherosclerotic lesions. Abstracts of 19th European Meeting on Hypertension, Milan, June 12-16, p. S93. 2009.

34. Т.Л. Красникова, П.И. Никитин, Т.И. Ксеневич, Б. Г. Горшков, М.В. Сидорова, А.А. Азьмуко, Т.И. Арефьева, Е.Н. Мамочкина, Е.Е. Ефремов, Ж.Д. Беспалова. Влияние пептидного фрагмента (65-76) С-концевого домена моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) на взаимодействие МСР-1 с гепарином. Доклады академии наук. 2010, 433 (4): 559-562.

35. А.В. Потехина, С.И. Проваторов, Т.И. Арефьева, Н.Б. Кухтина, В.П. Масенко, Е.И. Казначеева, Н.Ю. Рулева, Е.А. Ноева, М.К. Осяева, М.В.Сидорова, Ж.Д. Беспалова, Т.Л.Красникова. Влияние противовоспалительного пептидного препарата Инграмон на содержание белков острой фазы воспаления и хемокинов

в крови больных после коронарного стентирования. Терапевтический архив. 2010, 11:58-62.

36. V.Sokolov, A. Potekhina, E.Pylaeva, S.Provatorov, N.Kukhtina, T.L. Krasnikova, T. Arefieva. Circulating CD4CD25highCD1271ow regulatory T-cells after intracoronaiy implantation of rapamycin-eluting stents. 20thEuropean Meeting on Hypertention and Cardiovascular prevention, 18-21 June 2010, Oslo, Norway

37. E.Pylaeva, A. Potekhina, V.Sokolov, S.Provotorov, V.P.Masenko, N.Kukhtina, T.L. Krasnikova, E. Noeva, T. Arefieva. The dynamics of blood lymphocyte subpopulations after coronary stenting with rapamycin eluting stents. ESC Congress 2010, 28 August -1 September, Stockholm, Sweden

38. Красникова TJL, Кухтина Н.Б., Арефьева Т.И., Соколов B.O., Рулева Н.Ю., Пылаева Е.А., Азьмуко А.А., Сидорова М.В., Беспалова Ж.Д. Пептидный фрагмент 29-40 аминокислотной последовательности моноцитарного хемотаксического белка -1 (МСР-1) стимулирует миграцию моноцитов Тезисы V Всероссийского симпозиума «Белки и пептиды», Петрозаводск 2011.

39. Кухтина Н.Б., Арефьева Т.И., Рулева Н.Ю., Беспалова Ж.Д., Сидорова М.В., Красникова Т.Л. Пептидные фрагменты фракталкина (CX3CL1) как перспективные лекарственные препараты Тезисы V Всероссийского симпозиума «Белки и пептиды», Петрозаводск 2011.

40. Т.Л. Красникова, П.И. Никитин, Т.И. Ксеневич, Б.Г. Горшков, Т.Л. Бушуева, Т.И. Арефьева, Н.Ю. Рулева, М.В. Сидорова, А.А. Азьмуко, Ж.Д. Беспалова. Ингибитор воспаления, пептидный фрагмент (65-76) моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) препятствует связыванию МСР-1 с гепарином. Биологические мембраны, 2011,28(1): 68-76.

41. А.В. Потехина, В.О. Соколов, Е.А. Пылаева, С.И. Проваторов, В.П. Масенко, Е.Г. Босых, Е.А. Ноева, Т.Л. Красникова, Т.И. Арефьева. Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов в крови больных после ангиопластики коронарных артерий с имплантацией стентов с рапамициновым покрытием. Кардиология. 2011, 51(3):47-53.

42. Arefieva TI, Krasnikova TL, Potekhina AV, Ruleva NU, Nikitin PI, Ksenevich TI, Gorshkov BG, Sidorova MV, Bespalova ZD, Kukhtina NB, Provatorov SI, Noeva EA, Chazov EI. Synthetic peptide fragment (65-76) of monocyte chemotactic protein-1 (MCP-1) inhibits MCP-1 binding to heparin and possesses anti-inflammatory activity in stable angina patients after coronary stenting. Inflamm Res. 2011, 60(10):955-964.

43. Potekhina AV, Provatorov SI, Sokolov VO, Pylaeva EA, Masenko VP, Noeva EA Kukhtina NB, Krasnikova TL, Arefieva TI. CD4(+)CD25(high)CD127(low) regulatory T cells in patients with stable angina and their dynamics after intracoronary sirolimus-eluting stent implantation. Hum Immunol. 2011;72(7):553-557.

44. Кухтина Н.Б., Руткевич П.Н., Шевелев АЛ., Власик Т.Н., Арефьева Т.И. Участие бета-2-интегринов CD1 lb/CD 18 и CDllc/CD18 в адгезии и миграции клеток на фибриногене. Российский физиологический журнал им. И.М.Сеченова. 2011, Т.97, №6, С.601-608.

45. Красникова Т.Л., Кухтина Н.Б., Арефьева Т.И., Соколов В.О., Рулева Н.Ю., Пылаева Е.А., Азьмуко А.А., Сидорова М.В., Беспалова Ж.Д. Пептидный фрагмент 29-40 аминокислотной последовательности моноцитарного хемотаксического белка -1 (МСР-1) стимулирует миграцию моноцитов. Тезисы V Всероссийского симпозиума «Белки и пептиды», Петрозаводск 2011.

46. Кухтина Н.Б., Арефьева Т.И., Рулева Н.Ю., Беспалова Ж.Д., Сидорова М.В., Красникова T.JI. Пептидные фрагменты фракталкина (CX3CL1) как перспективные лекарственные препараты. Тезисы V Всероссийского симпозиума «Белки и пептиды», Петрозаводск 2011.

47. Кухтина Н.Б., Арефьева Т.Н., Рулева Н.Ю., Сидорова М.В., Азьмуко А.А, Беспалова Ж.Д., Красникова Т.Л. Пептидные фрагменты хемокинового домена фракталкина: влияние на миграцию моноцитов человека. Биоорганическия химия. 20]2, 38(6):660-666.

48. Т. И. Арефьева, В. О. Соколов, Е. А. Пылаева, Н. Б. Кухтина, А. В. Потехина, Н. Ю. Рулева, М. В. Сидорова, Ж. Д. Беспалова, А. А. Азьмуко, Т. Л. Красникова. Пептидный фрагмент 29-40 аминокислотной последовательности моноцитарного хемотаксического белка-1 (МСР-1) стимулирует миграцию моноцитов in vivo и способствует ранозаживлению. Доклады академии наук. 2012, 446(1):106-109.

49. Красникова Т.Л., Беспалова Ж.Д., Сидорова М.В., Азьмуко A.A., Арефьева Т.И., Рулева Н.Ю., Гаврилова С.А., Ахметшина М.Р., Бердалин А.Б., Буравков C.B. Пептидный фрагмент (29-40) хемокина МСР-1 ускоряет ранозаживление. Тезисы VI Всероссийского симпозиума «Белки и пептиды», Уфа 2013.

50. A. Potekhina, Е. Pylaeva, К. Raskina, A. Kuranova, S. Provatorov, Е. Noeva, T. Arefieva The balance of T-regulatory and T-helper 1 and 17 lymphocyte subsets in blood of patients with coronary atherosclerosis. 81 EAS Congress, 2013, Lyon, France.

Патенты:

51.Чазов Е.И., Беспалова Ж.Д., Азьмуко A.A., Сидорова М.В., Молокоедов A.C., Красникова Т.Л., Арефьева Т.И., Кухтина Н.Б.. Способ получения додекапептида и трипептид лдля его осуществления. Патент 2340626.

52.Азьмуко A.A., Арефьева Т.И., Беспалова Ж.Д., Красникова Т.Л., Кухтина Н.Б., Молокоедов A.C., Палькеева М.Е., Рулева Н.Ю., Сидорова М.В., Соколов В.О.. Пептид для ингибирования фракталкин-стимулированной миграции моноцитарных клеток. Патент 2461565.

СПИСОК ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ

БСА - бычий сывороточный альбумин

ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография

ГАГ - гликозаминогликаны

ДСН- додецилсульфат натрия

ДСС - дисукцинимидный эфир субериновой кислоты

ИБС - ишемическая болезнь сердца

ИЛ — интерлейкин

ИФА — иммуноферментный анализ

КС -коронарное стенгирование

ЛПС - липополисахарид

мРНК — матричная РНК

миРНК- малые интерферирующие РНК

мкАТ - моноклональные антитела

ПААГ - полиакриламидный гель

ПВЧ - псевдовирусные частицы

ПЦР — полимеразная цепная реакция

СРБ — С-реактивный белок

СЧ - сыворотка крови человека

ТФР - трансформирующий фактор роста

ФНО - фактор некроза опухоли

ЭК - эндотелиальные клетки

ЭТС - эмбриональная телячья сыворотка

АТСС - Американская коллекция клеточных культур

Foxp3- фактор транскрипции, экпрессируется в регуляторных Т-клетках

G-белок - гуанозинтрифосфат (ГТФ)-связывающий белок

IP-10 — индуцируемый интерфероном-у белок-10

МАР-киназы - митоген-активируемые протеинкиназы

MDC — хемокин, синтезируемый макрофагами

МСР-1 -моноцитарный хемотаксический белок-1

MIG - индуцированный интерфероном-у монокин

MIP - макрофагальный воспалительный белок

mTOR - протеинкиназа, мишень рапамицина у млекопитающих

PI-3-киназа - фосфатидилинозитол -3-киназа

RANTES - хемокин, экспрессируемый и секретируемый Т-лимфоцитами при активации

SDF — хемокин, продуцируемый стромальными клетками TARC — хемокин тимуса, экспрессируемый при активации клеток vWF - фактор фон-Виллебранда

Заказ № 1395/13 . Формат 60x90/16. Усл. печ. 3,13 л. Бумага офсетная. Тираж 110 шт. Отпечатано в типографии ООО «Аналитик» г. Москва, Ленинградское шоссе, д. 18. Тел. 617-09-24

Текст научной работыДиссертация по биологии, доктора биологических наук, Арефьева, Татьяна Игоревна, Москва

ФГБУ «Российский кардиологический научно-производственный

комплекс» МЗ РФ

На правах рукописи

05201450298

Арефьева Татьяна Игоревна

Миграция лейкоцитов и способы ее регуляции при

атеросклерозе

?

Клеточная биология, Цитология, Гистология - 03.03.04

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук

Научные консультанты: д.б.н. Красникова Т.Л. академик РАН, РАМН Чазов Е.И.

Москва 2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

Введение 6

Список сокращений 12

Обзор литературы 16

1. Атеросклероз - хроническое воспалительное заболевание артериальной 16 стенки с воспалительной и аутоиммунной составляющими .

1.1. Краткая история развития представлений о патогенезе 16 атеросклероза.

1.2. Характеристика воспалительного процесса в стенке артерии при 18 атеросклерозе.

1.3. Обострение воспаления как причина «дестабилизации» 22 атеросклеротической бляшки.

1.4. Системные проявления воспалительной реакции в сосудистой 24 стенке: повышение количества активированных лейкоцитов, увеличение концентрации «растворимых» маркеров воспаления.

1.5. Атеросклероз и системные воспалительные заболевания. 26

1.6. Опыт применения нестероидных противовоспалительных 27 препаратов при ИБС.

1.7. Регуляторные Т-лимфоциты при ИБС. 29

1.8. Рапамицин в кардиологии. Иммуномодулиругощие свойства 31 рапамицина.

2. Воспаление как стадия ранозаживления. 34 2.1. Особенности воспалительной реакции при инфаркте миокарда. 37

3. Миграция лейкоцитов в очаг воспаления. 39

3.1. Этапы миграции лейкоцитов в сосудистую стенку. Молекулы 39 адгезии лейкоцитов. Интегрины как мишень для воздействий при ИБС.

3.2. Система активации плазминогена в адгезии и миграции 44 моноцитов.

3.3. Хемотаксические цитокины (хемокины)- стимуляторы миграции 48 лейкоцитов. Хемокины и атерогенез.

3.4. Рецепторы хемокинов, пути передачи внутриклеточных сигналов. 62 Рецептор МСР-1.

3.5. Рапамицин-чувствительный сигнальный каскад в миграции клеток. 70

4. Препараты, действующие на хемокины и рецепторы хемокинов, 72 противовоспалительный и антиатерогенный эффект.

4.1. MCP-1/CCL2 как основная мишень для разработки активаторов 76 и ингибиторов миграции моноцитов.

5. Заключение по обзору литературы. 83 Цель и задачи исследования 84 План исследования 85

2

Материалы и методы 87

Характеристика пациентов ИБС и доноров, включенных в анализ 87 экспозиции молекул адгезии и рецепторов урокиназы моноцитами, содержания урокиназы в периферической крови.

Характеристика пациентов ИБС, стабильной и нестабильной 88 стенокардией, включенных в анализ содержания МСР-1 и СРБ в плазме крови.

Характеристика пациентов со стабильной и нестабильной стенокардией и 89 доноров, включенных в исследование количества циркулирующих СБ4+ активированных хелперных и регуляторных Т-лимфоцитов. Характеристика пациентов, включенных в исследование зависимости 90 количества циркулирующих регуляторных Т-лимфоцитов от степени поражения коронарных артерий и в клинические испытания пептидного препарата Инграмон.

Получение образцов крови. 91

Получение и хранение образцов интимы коронарных сосудов. 94

Выделение клеток из образцов интимы артерий. 94

Выделение мононуклеарных лейкоцитов из периферической крови. 95

Выделение нейтрофильных гранулоцитов из периферической крови. 95

Получение обогащенной моноцитами суспензии клеток методом 96 центрифугирования в ступенчатом градиенте плотности.

Выделение моноцитов с помощью иммуномагнитных бус. 96

Выделение и культивирование СБ4+ лимфоцитов. 97

Культивирование линейных клеток ТНР-1 и 1игка1:. 98

Получение клонов клеток ТНР-1 со сниженным уровнем экспрессии 99 молекул СБПЬ и СО 18.

Выделение и культивирование эндотелиальных клеток из пупочной вены 99 человека.

Оценка адгезии клеток. 100

Изучение миграции клеток в модифицированной камере Бойдена и в системе 101 ТгапБлуеП.

Определение уровня фосфорилирования киназ в клетках с помощью ЮЗ Вестерн-блоттинга.

Активация лейкоцитов в «цельной» крови. 104

Иммунофенотипирование клеток (выявление поверхностных и 104 внутриклеточных антигенов) методом цитофлуориметрии в потоке. Оценка параметров связывания урокиназы с моноцитами. 107

Определение концентрации урокиназы, МСР-1 и белков острой фазы 107 воспаления (СРБ, фибриногена) в крови.

Морфологический и иммуногистохимический анализ образцов интимы 108 коронарных артерий и аорт человека.

Выделение мРНК из образцов интимы коронарных артерий человека. 109

3

Реакция обратной транскрипции и полимеразно-цепная реакция (ПЦР). ПО

Расчет и синтез пептидных фрагментов хемокина МСР-1. 111

Оценка способность пептидов к образованию димеров. 113

Оценка проникновения пептида X в очаг воспаления. 114

Оценка устойчивости пептидов в плазме крови ex vivo. 114

Тестирование пептидов по их действию на миграцию клеток in vitro, 114 экспозицию моноцитами молекул адгезии и содержание внутриклеточного Са++.

Изучение хемотаксиса клеток in vivo в модели «air pouch» («воздушный 116 мешок») у мышей.

Модель подкожного воспаления у крыс и приматов. 117

Баллонная ангиопластика левой общей сонной артерии крыс. 118

Оценка воспалительной реакции при подкожной имплантации агарозного 119 геля.

Модель ранозаживления у мышей. 119

Модель ишемии нижней конечности у крыс. 120

Модель инфаркта миокарда у крыс. 121

Анализ влияния пептида X на димеризацию МСР-1 в растворе с помощью 124 гель-электрофореза и Вестерн-блоттинга.

Анализ взаимодействия МСР-1 с гепарином с помощью безмаркерного 125 биосенсорного прибора «Пикоскоп®» и ИФА.

Статистический анализ. 127

Результаты 129

1. Воспаление в патогенезе атеросклероза. 129

1.1. Анализ клеточного состава и экспрессии цитокинов в образцах 129 атеросклеротических бляшек коронарных артерий человека.

1.2. Концентрация МСР-1 и СРБ в плазме крови пациентов с ИБС 132 при нестабильной стенокардии и стабильной стенокардии напряжения.

1.3. Экспрессия молекул адгезии и рецепторов урокиназы 133 моноцитами крови при ИБС. Содержание урокиназы на моноцитах и

в крови пациентов.

1.4. Содержание активированных хелперных и регуляторных Т- 134 клеток в крови пациентов с ИБС, стабильной и нестабильной стенокардией.

1.5. Содержание регуляторных Т-клеток у пациентов с ИБС, 135 стабильной стенокардией, с различной выраженностью атеросклеротического поражения коронарных артерий.

2. Особенности адгезии и миграции моноцитов. 138

2.1. Адгезия и миграция моноцитарных клеток на фибриногене и 138 продуктах его деградации.

2.2. Участие (32-интегринов CDllb/CD18 и CDllc/CD18 в адгезии и 138

4

миграции клеток.

2.3. Внутриклеточные сигнальные каскады, участвующие в хемокин- 145 зависимой миграции клеток.

2.4. Действие рапамицина на миграцию лейкоцитов. 151 3. Пептидные фрагменты хемокинов как регуляторы миграции клеток. 154

3.1. Тестирование пептидных фрагментов in vitro. 154

3.2. Пептид X - ингибитор хемотаксиса лейкоцитов. 156

3.2.1.Устойчивость пептида X к деградации в плазме крови. 156 Накопление пептида X в очаге воспаления.

3.2.2. Изучение действия пептида X на миграцию клеток in vivo. 157

3.2.3. Действие пептида X на рост неоинтимы при баллонном 163 повреждении сонной артерии крысы.

3.2.4. Влияние пептида X на содержание маркеров воспаления в 167 крови пациентов после стентирования коронарных артерий.

3.2.5. Изучение механизмов противовоспалительного действия 170

пептида X: влияния на взаимодействие МСР-1 с клеточными

рецепторами, димеризацию МСР-1 и связывание с гепарином.

3.3. Пептид IX стимулирует миграцию моноцитов. 177

3.3.1. Действие пептида IX на подвижность клеток человека in vitro 177 и in vivo у экспериментальных животных.

3.3.2. Анализ влияния пептида IX на формирование грануляционной 181 ткани при имплантации в составе агарозного геля. Действие пептида IX на ангиогенез и ранозаживление.

3.3.3.Действие пептида IX на восстановление миокарда после 184 экспериментальной ишемии-реперфузии у крыс.

3.3.4.В стимулирующий миграцию клеток эффект пептида IX не 188 вовлечены рецептор МСР-1 CCR2 и другие Gi-белок-сопряженные рецепторы.

3.3.5. Активность пептида IX зависит от наличия в его составе 188

остатка цистеина.

Обсуждение результатов 191

Заключение 228

Практические рекомендации 229

Выводы 229

Благодарности 231

Список цитированной литературы 232

ВВЕДЕНИЕ

Сердечно-сосудистые заболевания, несмотря на многочисленные достижения в изучении их патогенеза, продолжают лидировать в списке заболеваний, приводящих к преждевременной смертности и инвалидизации населения развитых стран. Атеросклеротическое поражение артерий является наиболее частой причиной развития сердечно-сосудистой патологии. Трудности в исследовании атерогенеза связаны с тем, что в его основе лежат воспалительные и аутоиммунные механизмы, зависящие от ряда внешних и внутренних факторов. Воспаление сопровождается накоплением лейкоцитов в интиме артерии и продукцией широкого спектра цитокинов и других биологически активных веществ, оказывающих митогенное, протромбогенное и повреждающее действие на компоненты сосудистой стенки и приводящих к ее «ремоделированию» - формированию атеросклеротического поражения. Обострение воспалительного процесса в атеросклеротической бляшке может вызвать ее повреждение и последующий тромбоз, что проявляется клинически развитием острого коронарного синдрома - приступа нестабильной стенокардии и инфаркта миокарда. Воспалительная «природа» атерогенеза подтверждается тем, что атеросклероз зачастую ассоциирован с системными воспалительными и аутоиммунными заболеваниями. При атеросклерозе, как и при других системных заболеваниях, отмечается активация лейкоцитов, эндотелиальных клеток, увеличенная секреция клетками «провоспалительных» цитокинов. Как следствие в кровотоке увеличивается содержание маркеров воспаления — белков острой фазы и цитокинов, появляются активированные лейкоциты и тромбоциты. В ряде клинических исследований у пациентов с ишемической болезнью сердца (ИБС) выявлена связь между высокой концентрацией маркеров воспаления в крови и негативным прогнозом заболевания.

Мононуклеарные клетки являются преобладающей по численности популяцией лейкоцитов в атеросклеротической бляшке. Ключевую роль в

инициировании и поддержании воспалительного процесса играют моноциты. В атероме моноциты дифференцируются либо в пенистые клетки, нагруженные липидами, либо в макрофаги, продуцирующие воспалительные цитокины, факторы роста, протеолитические ферменты, обладающий тромбогенной активностью тканевой фактор. Многие из этих молекул оказывают повреждающее действие на эндотелиальные клетки, способствуя локальной вазоконстрикции и пристеночному тромбообразованию. Макрофагальные цитокины и факторы роста могут оказывать прямое хемотаксическое и митогенное действие на гладкомышечные клетки стенки сосуда. Помимо моноцитов в зрелых атеросклеротических бляшках обнаружены клетки адаптивного иммунитета, среди которых преобладают Т-хелперы 1 типа. Эффекторные лимфоциты «узнают» аутоантигены (окисленные липопротеиды низкой плотности, белки теплового шока и др.), представленные антигенпрезентирующими клетками - макрофагами и дендритными клетками, -и продуцируют цитокины. Продуцируемые Т-хелперами 1 типа цитокины вызывают активацию моноцитов, лимфоцитов и гладкомышечных клеток, т.о. поддерживая воспалительную реакцию в сосудистой стенке. Регуляторные Т-клетки являются основной субпопуляцией лимфоцитов, угнетающих реактивность клеток иммунной системы, в том числе Т-хелперов 1 типа, в отношении собственных и чужеродных антигенов. Дефицит регуляторных Т-клеток может привести к персистирующему воспалению независимо от причин, его вызвавших. В ряде исследований, выполненных на животных, доказана «антиатерогенная» роль регуляторных Т-клеток. Оценка состояния данного звена клеточного иммунитета при атеросклерозе у человека и анализ терапевтического потенциала иммуномодуляторных воздействий при ИБС являются на сегодняшний день задачами исследований ведущих мировых лабораторий.

Воспаление является неотъемлемым звеном восстановления целостности ткани при ее повреждении, в том числе при ишемическом поражении миокарда.

Современные достижения в лечении больных с инфарктом миокарда связаны с разработкой способов быстрого восстановления кровотока в коронарной артерии. Однако эффективных подходов, действующих на процесс заживления миокарда, на сегодняшний день нет. Моноциты/макрофаги необходимы для эффективного ранозаживления. Благодаря способности к фагоцитозу, эти клетки принимают участие в очищении раны от продуктов распада ткани. Основной вклад моноцитов/макрофагов в восстановление тканей заключается в продукции широкого спектра цитокинов и факторов роста. Данные медиаторы паракринно влияют на другие клетки, вызывая хемотаксис и пролиферацию фибробластов, эндотелиальных клеток, синтез белков внеклеточного матрикса. Подавление воспалительной реакции в поврежденном миокарде может иметь отрицательные последствия - приводить к «несостоятельности» рубца и образованию аневризм. С другой стороны, чрезмерное воспаление может оказать дополнительное повреждающее действие на миокард. Таким образом, воздействие на воспалительный каскад «во времени и пространстве» дает уникальную возможность для оптимизации процесса заживления и предупреждения отрицательного ремоделирования желудочка в отдаленные сроки.

Выход лейкоцитов из кровотока и их миграция в тканях многоступенчатый процесс, зависящий от уровня активации клеток цитокинами и особенностей их взаимодействия с другими клетками и белками межклеточного матрикса. Молекулы адгезии лейкоцитов способны связываться с лигандами эндотелиальных и мышечных клеток, фибробластов, тромбоцитов, с сывороточными белками и белками внеклеточного матрикса. Наиболее значимую роль в миграции лейкоцитов в очаг воспаления/повреждения тканей играют специфические для лейкоцитов р2-интегрины, т.к. они взаимодействуют с поверхностными молекулами эндотелия и тромбоцитов, а также с фибрин(оген)ом. Способность мигрирующих клеток преодолевать барьеры из белков внеклеточного матрикса зависит от активности

протеолитических ферментов на поверхности клеток. Система активации плазминогена, которая включает плазминоген, активаторы и ингибиторы плазминогена, а также связывающие их поверхностные белки и рецепторы, играет центральную роль в клеточной инвазии. Направление движения лейкоцитов в тканях зависит от градиента концентрации хемотаксических цитокинов - хемокинов.

Семейство хемокинов открыто относительно недавно, и на сегодняшний день оно объединяет около 50 небольших по молекулярной массе (8-10 кДа) основных белков. Хемокины вырабатываются практически всеми типами клеток, они контролируют миграцию лейкоцитов в условиях гомеостаза, в частности, распределение клеток в лимфоидных органах, и при воспалении. Рецепторы хемокинов сопряжены с гуанозинтрифосфат-связывающими белками (О-белками) и представляют собой классический тип рецепторов с семью трансмембранными доменами. Для осуществления хемотаксической активности в условиях крово - и лимфотока необходимо создание концентрационного градиента хемокинов за счет их связывания с гликозаминогликанами (ГАГ), гепарином/гепарансульфатом, на поверхности клеток и в составе внеклеточного матрикса. Помимо хемоаттрактантных свойств хемокины участвуют в активации клеток, сопровождающейся продукцией активных форм кислорода, цитокинов и протеолитических ферментов, влияют на апоптоз и другие клеточные процессы. Система хемокины/рецепторы хемокинов характеризуется «вырожденностью» и «избыточностью»: большинство рецепторов «узнают» несколько хемокинов, и один и тот же хемокин может связываться с несколькими типами рецепторов. Кроме того, при одновременной активации нескольких рецепторов соответствующими лигандами может наблюдаться как усиление, так и ослабление (гетерологическая десенситизация) итогового сигнала. Этими свойствами системы хемокинов можно объяснить трудности в изучении функционирования индивидуальных рецепторов, в определении роли

хемокинов и их рецепторов в развитии патологических состояний и в поиске мишеней для терапевтических воздействий.

Моноцитарный хемотаксический белок - 1 (МСР-1, CCL2) является наиболее изученным хемокином в приложении к хроническому воспалительному процессу, в частности, атерогенезу. МСР-1 продуцируется в очаге воспаления различными типами клеток. Основной мишенью МСР-1 являются моноциты, МСР-1 также способен стимулировать миграцию активированных лимфоцитов и эндотелиальных клеток. Ведущая роль МСР-1 в формировании атеросклеротических поражений продемонстрирована в модельных экспериментах с использованием мышей, «нокаутированных» по генам МСР-1 или его рецептора CCR2. Аналогичный феномен наблюдался при испол