Сравнительный анализ экспрессии гена белка Fas в клетках человека при различных альтерирующих воздействиях на организм

Уткин, Олег Владимирович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Сравнительный анализ экспрессии гена белка Fas в клетках человека при различных альтерирующих воздействиях на организм
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительный анализ экспрессии гена белка Fas в клетках человека при различных альтерирующих воздействиях на организм"

На правах рукописи

УТКИН ОЛЕГ ВЛАДИМИРОВИЧ

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ЭКСПРЕССИИ ГЕНА БЕЛКА FAS В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА ПРИ РАЗЛИЧНЫХ АЛЬТЕРИРУЮЩИХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ НА ОРГАНИЗМ

03.00.04 - биохимия 03.00.13 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 3 AB Г 2007

Нижний Новгород 2007

003064563

Работа выполнена в Нижегородском государственном университете им. Н.И. Лобачевского и Нижегородском НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной.

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор В.В. Новиков доктор медицинских наук A.B. Алясова

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор К.Н. Конторщикова доктор биологических наук, профессор А.Е. Хомутов

Ведущая организация:

Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. H.H. Блохина РАМН

Защита состоится «27 » СС^сТЗ+Ухъ 2007 года в «» часов на заседании диссертационного совета Д 212.166.15 при Нижегородском госуниверситете им. Н.И. Лобачевского по адресу: 603950, Нижний Новгород, пр. Гагарина 23.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ННГУ

Автореферат разослан « 6

2007 года

Ученый секретарь

диссертационного совета, доцент, к.б.н.

A.C. Корягин

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Программируемая гибель клеток (апоптоз) необходима для нормального развития и существования многоклеточных организмов (Abastado, 1996). Путем апоптоза происходит удаление клеток, выживание которых нежелательно для организма, например, злокачественно трансформированных клеток или клеток, зараженных вирусом.

Одним из рецепторов, инициирующих программируемую клеточную гибель, является Fas (CD95) протеин. Молекула CD95 экспрессируется на мембране клеток различных типов и участвует в передаче апоптотического сигнала. Помимо мембранной формы (mFas/mCD95) описаны растворимые формы Fas белка (sFas/sCD95), образующиеся в результате альтернативного сплайсинга мРНК. Среди них выделяют доминирующий вариант молекулы, образующийся в результате делении 6 экзона, кодирующего трансмембранный домен (FasExoóDel/FasTMDel). Остальные (минорные) формы образуются в результате единичных или комбинированных делеций разных экзонов (Papoff et al., 1996). Растворимые продукты трансляции альтернативных форм мРНК Fas белка модулируют апоптотический сигнал в зависимости от степени олигомеризации. Мономерные растворимые формы CD95 протеина ингибируют апоптоз, тогда как олигомерная форма проявляет цитотоксические свойства (Proussakova et al., 2003). Кроме того, существование большого количества альтернативных форм растворимого Fas белка позволяет предположить наличие регуляции начальных стадий апоптоза за счет повышения или снижения их экспрессии. Однако характер экспрессии минорных растворимых форм в разных типах клеток и механизмы их возможного участия в регуляции апоптоза не выяснены и требуют детального изучения.

Цель исследоппния

Исследовать особенности спектра альтернативных форм мРНК CD95 протеина в сопоставлении с сывороточным уровнем растворимого Fas белка при различных альтерирующих воздействиях на организм.

Задачи

1. Изучить особенности изменения спектра альтернативных форм мРНК Fas белка в мононуклеарных клетках периферической крови и гепатоцитах при хронических вирусных гепатитах В и С, в мононуклеарных клетках крови и клетках опухолевого очага при раке молочной железы и в мононуклеарных клетках при ожоговой травме.

2. Оценить уровень экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм CD95 протеина в мононуклеарных клетках крови и клетках печени при вирусных гепатитах В и С и в мононуклеарных клетках крови при ожоговой травме.

3. Осуществить сравнительный анализ взаимоотношений между спектром и количественным содержанием альтернативных форм мРНК CD95 протеина в клетках и содержанием суммарной и олигомерной фракций растворимого Fas белка в сыворотке крови при вирусных гепатитах, раке молочной железы и ожогах.

4. Провести сравнительный анализ взаимоотношений между изменениями в спектре альтернативных форм мРНК Fas белка в мононуклеарных клетках и содержанием СБ95-положительных клеток периферической крови при вирусных гепатитах В и С, раке молочной железы и ожоговой травме.

Научная нопизна

Впервые при вирусных гепатитах В и С, раке молочной железы и ожоговой травме в мононуклеарных клетках крови выявлено уменьшение числа мРНК минорных альтернативных форм CD95 протеина, что сопровождается изменением сывороточной концентрации мономерной и олигомерной форм растворимого Fas белка.

Впервые установлено, что мононуклеарные клетки крови лиц с неблагоприятным исходом ожоговой болезни (погибшие), характеризовались достоверным снижением соотношения уровней экспрессии мРНК FasTMDel к мРНК mFas как по сравнению с группой лиц, имеющих благоприятный исход ожоговой болезни (выжившие), так и по сравнению с донорами.

Впервые показано, что на третьей и четвертой стадиях рака молочной железы наличие мРНК FasExo4,6Del и мРНК FasExo4Del в мононуклеарных клетках крови сопровождалось достоверным снижением сывороточного содержания олигомерного растворимого Fas белка. Впервые выявлено, что при вирусных гепатитах В и С отсутствие мРНК минорной FasExo3,4Del формы в мононуклеарных клетках периферической крови сопровождается достоверно повышенным сывороточным уровнем суммарного растворимого CD95 протеина.

Впервые обнаружено, что повышение сывороточного содержания суммарного sCD95 протеина при хроническом гепатите С ассоциировано с сохранением только одной минорной формы мРНК Fas белка (FasExo4Del) на фоне статистически достоверного повышения в гепатоцитах уровня экспрессии мРНК FasTMDel формы.

Практическая значимость работы

Разработанный нами методический подход для раздельной детекции уровня экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas белка с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени может быть использован для мониторинга течения ожоговой болезни и в качестве возможного прогностического критерия исхода заболевания. Используемые в работе подходы для дифференциальной детекции спектра альтернативных форм мРНК Fas белка могут применяться для оценки функционального состояния клеточного звена иммунитета при нарушениях гомеостаза организма. Полученные данные могут быть использованы в преподавании курсов по биохимии и иммунологии для студентов вузов биологического и медицинского профиля.

Положения, выносимые на защиту

1. При ожоговой травме изменение соотношения в уровнях экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas белка наблюдается в мононуклеарных клетках лиц с неблагоприятным исходом ожоговой болезни.

2. При хроническом гепатите С повышение сывороточного содержания суммарного sCD95 происходит на фоне изменения числа минорных форм мРНК в мононуклеарных клетках крови, уровня экспрессии мРНК FasTMDel и соотношения мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas белка в клетках печени.

3. Достоверное снижение сывороточного уровня олигомерного sCD95 при раке молочной железы осуществляется на фоне изменения экспрессии мРНК альтернативных форм Fas белка, как в клетках периферической крови, так и в клетках опухолевого очага.

Апробация работы

Результаты работы представлены на Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией» (С.-Петербург, 2004), Международном конгрессе молодых ученых «Науки о человеке» (Томск, 2005), Третьем международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005), XI Нижегородской сессии молодых ученых (Естественнонаучные дисциплины) (Нижний Новгород, 2006), 9-й Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2005), I съезде комбустиологов России (Москва, 2005), научной конференции «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной (Нижний Новгород, 2006), X Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2006).

микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной и Нижегородского отделения Российского научного общества биохимиков и иммунологов 24 апреля 2007 года.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа в объеме листов состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация иллюстрирована2£рисунками »/'¿Тгаблицами. Библиографический указатель вклгочает/ЗУисточника литературы ^отечественных I¡/¿иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использовали образцы сыворотки и мононуклеарных клеток периферической крови 74 здоровых доноров. Средний возраст доноров составил 36 лет. Исследовано 20 образцов биопсии печени, 35 образцов сыворотки крови и 15 образцов мононуклеарных клеток крови, полученных от лиц, поступивших на лечение в Городскую инфекционную больницу № 2 г. Нижнего Новгорода. Материал был любезно предоставлен к.м.н. Отмаховой И.А. В работе также использовали 86 образцов сыворотки крови, 86 образцов мононуклеарных клеток периферической крови и 22 образца клеток опухолевого очага женщин в возрасте от 31 до 82 лет с гистологически подтвержденным диагнозом рака молочной железы, находящихся на лечении в Нижегородском областном онкологическом диспансере. Кроме того, в работе были использованы 156 образцов сыворотки крови и 156 образцов мононуклеарных клеток периферической крови лиц, проходивших лечение в отделении термической травмы взрослых Российского ожогового центра на базе Нижегородского НИИ травматологии и ортопедии. Их средний возраст составил 42 года. Общая площадь ожогового поражения составляла от 30 до 90 % поверхности тела. Исследования проводили в динамике от момента поступления пострадавших в стационар на первые, третьи и пятые сутки. В 19 случаях ожоговая болезнь привела к гибели пострадавших. Все диагнозы были

поставлены и верифицированы врачебными коллективами соответствующих учреждений.

Оценку спектра и уровня экспрессии альтернативных форм мРНК Fas белка проводили с помощью полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР), и ОТ-ПЦР в реальном времени. При одновременном исследовании в одном образце уровня экспрессии мРНК mFas и FasTMDel из номера порогового цикла sFas вычитали номер порогового цикла mFas, получали разницу значимых циклов амплификации (РЗЦА). Относительные цифровые значения позволяли избежать ошибок, связанных с неизбежным различным количеством мРНК Fas белка в исследуемых образцах.

Сывороточное содержание суммарного растворимого CD95 протеина определяли с применением меченых пероксидазой хрена моноклональных антител (МКА) ИКО-160 и поликлонапьных антител против мембранных белков мононуклеарных клеток периферической крови человека, используемых в качестве «первых» антител и сорбируемых в лунки планшетов для иммуноферментного анализа. Для исследования уровня олигомерной фракции растворимого Fas белка в качестве первых антител использовали очищенные МКА ИКО-160, в качестве вторых антител применяли МКА ИКО-160, меченые пероксидазой хрена. Относительное содержание CD95 (Раз)-положительных мононуклеарных клеток оценивали в реакции непрямой иммунофлуоресценции с использованием МКА ИКО-160 и ФИТЦ-меченых поликлональных антител против мышиных иммуноглобулинов. Использовали МКА, полученные в Российском онкологическом научном центре им. H.H. Блохина РАМН.

Маркеры вирусных гепатитов определяли с помощью иммуноферментных тест-систем фирмы «Диагностические системы» (г. Нижний Новгород).

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью пакета программ BIOSTAT и Statistica v. 6.0. Нормальность распределения данных проверяли с использованием критерия Шапиро-Уилка. Дальнейший анализ проводили с использованием критериев Манна-Уитни, Стьюдента с поправкой Бонферрони и критерия ранговой корреляции Спирмена.

Результаты » обсуждение

В настоящей работе определен спектр альтернативных форм мРНК Fus белка, уровень экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм в сравнении с содержанием Fas белка в сыворотке крови, относительным содержанием Fas-положительных м он о ну к л парных клеток периферической крови при различных альтерирующих воздействиях на организм, характеризующихся разной степенью выраженности япоптотических реакций. Литературные данные свидетельствуют о том, что ожоговая травма характеризуется высокой степенью выраженности япоптотических реакций, рак молочной железы — угнетением процессов реализации программируемой клеточной смерти (Lehedev et al1999, Peler et a!., 2005). В отношении напряженности апоптотических процессов при вирусных гепатитах В и С данные литературы весьма противоречивы (Ferenbach et al., 1997, Marusawa et al., 1999).

Как видно из рис. 1, в мононуклеарны.х клетках периферической крови здоровых доноров присутствует мРНК, кодирующая мембранную, доминирующую растворимую и 4 минорных растворимых формы Fas белка.

Донор M

Рис- 1. Спектр форм мРНК Fas белка в мононуклеарны.х клетках крови здоровых доноров, i - mFas; 2 — FasTMDcl; 3 - FasExo4Del; 4 - FasExo3,4Del; 5 - FasExo4,óDel; 6 - Fa>Exo3,4,óDel; M - маркер молекулярных масс (ДНК фага ipX 174 Нае Ш)

При хронических гепатитах В и С (ХГВ и ХГС) клетки печени содержали

одну минорную форму мРНК (РазЕхоЮеО, а также мРНК мембранной и

доминирующей растворимой форм Рцк белка (рис. 2).

ХГВ ХГС

Рис. 2. Электрофореграмма альтернативных форм мРНК Fas белка гепатоцитов при вирусных гепатитах В и С. 1 — niFas; 2 — FasTMDel; 3 - FasExo4Del

В моноиуклеарных клетках периферической крови лиц при хроническом гепатите В и С детектировались три минорные формы мРНК (FasExo4Del, FasExo4,6Dfel и F;tsExo3,4T6Del) наряду с мРНК mFas и FasTMDel (рис. 3).

М Донор ХГС ХГВ

Рис. 3. Альтернативные формы мРНК Fas белка в мопонуклеарных клетках периферической крови при вирусных гепатитах В и С, 1 - mFas; 2 - FasTMDel; 3 - FasExo4Del; 4 - Fas6xo3,4Del; 5 - FasExo4,6Del; 6 - FasExo3,4,óDcl; M -маркер молекулярных масс (ДНК фага рХ 174 Нле Ш)

При раке молочной железы в моноиуклеарных клетках крови на первой стадия развития неопластическога процесса н 64% случаев обнаруживались две минорные формы мРНК Fas белка (FnsExo4,6Dcl и FasExo4Del), а в 36% случаев одна минорная форма мРНК (FasExo4,6Bel) (рис. 4).

L 2 3 4 5 6

Рис. 4. Спектр форм мРНК Fas белка в моноиуклеарных клетках крови при раке молочной железы

1,2 - первая стадия, 2 — вторая стадия, 3,4 - третья стадия, 5,6 - четвертая стадия

На второй, третьей и четвертой стадиях рака молочной железы во всех исследованных образцах моноиуклеарных клеток кроаи были обнаружены две минорные формы м РНК (FasExo4,6Del и FasExo4Del). При этом па всех стадиях онкологического процесса детектировалась мРНК niFas и FasTMDel. В отличие от момонуклеарных клеток кро-ви в опухолевых клетках мРНК mFas и FasTMDel обнаруживалась только па четвертой стадии неопластического процесса. Спектр мРНК, кодирующих минорные формы растворимого Fas белка, широко варьировал на разных стадиях рака молочной железы (табл. I ).

Таким образом, клетки опухолевого очага характеризуются более вариабельной картиной экспрессии мРНК минорных форм Fas белка по сравнению с клетками периферической крови. В клетках опухоли на каждой стадии неоп ласти чес ко го процесса наблюдается изменение числа и состава мРНК минорных форм CD95 протеина, в клегках периферической крови такие изменения происходят только при переходе с первой на вторую стадию онкологического процесса.

Таблица 1

Встречаемость альтернативных форм мРНК Fas белка в клетках опухолевого очага на разных стадиях рака молочной железы

Формы мРНК CD95 протеина Стадии рака молочной железы

I II Ш IV

mFas — — — +

FasTMDel — — — +

FasExo3,4Del + + + +

FasExo4Del — + — +

FasExo3,4,6Del — — + —

FasExo4,6Del + + — +

В мононуклеарных клетках периферической крови лиц, получивших ожоговую травму, обнаруживался иной набор мРНК, кодирующий разные формы Fas белка (рис. 5).

В 44% исследованных образцов мононуклеарных клеток периферической крови, вне зависимости от срока с момента получения ожога, детектировались мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм, а также единственная минорная форма мРНК, образующаяся в результате делеции 3,4,6 экзонов. Во всех остальных случаях наряду с экспрессией мРНК mFas и FasTMDel были обнаружены три минорные формы мРНК с делениями 4; 4,6 и 3,4,6 экзонов. Заметим, что три указанные минорные формы мРНК Fas белка наблюдались в клетках периферической крови 16 из 19 пострадавших с неблагоприятным исходом ожоговой болезни.

1 сутки 3 сутки

5 сутки

1 сутки 3 сутки 5 сутки

Рис. 5. ЭлекТрофорСграмма альтернативных форм мРНК Fas белка мононуклеарны* к легок периферической криви при ожогах. 1 - mFas; 2 -FasTMDel: 3 - FasExo4Del; 4 - FasE.xo4.6Del; 5 - FasExo3,4,6Del. A - пять альтернативных форм мРНК Fas белка; В - три альтернативные формы мРНК Fus белка

Выявленный спектр альтернативных вариантов мРНК Fas белка в клетках периферической крови, печени и опухолевого очага, с одной стороны, отражает особенности тран скриптом а разных типов клеток, с другой стороны, может оказывать влияние на процессы, связанные с инициацией ал о птоза во время развития патологического процесса. По сравнению со здоровыми лицами снижение числа альтернативных форм мРНК CD95 протеина может быть

результатом ингибирования транскрипции гена или усиления деградации мРНК. Не исключено, что оба механизма вовлечены в этот процесс.

Таблица 2

Значения порогового цикла амплификации мРНК mFas и FasTMDel

мононуклеарных клеток крови при вирусных гепатитах

Группы Значения порогового цикла амплификации

mFas FasTMDel

Доноры 21,09+0,03 22,07±0,17

ХГС 20,11±0,05* 20,32+0,17*,**

ХГВ 21,07±0,04 21,67±0,18**

* - статистически достоверные различия по сравнению с донорами (р<0,05) ** - статистически достоверные различия между ХГС и ХГВ (р<0,05)

При хроническом гепатите С в клетках крови наблюдалось статистически достоверное снижение соотношения уровня экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм (РЗЦА) по сравнению с донорами. При хроническом гепатите В такая закономерность выявлена не была. Проведенный анализ не выявил статистически достоверных различий в РЗЦА мРНК доминирующей растворимой и мембранной форм С095 протеина как в клетках печени, так и в мононуклеарных клетках крови при вирусных гепатитах В и С в сравнении друг с другом (табл. 3).

Разница значимых циклов амплификации мРНК РавТМОе! и шРав мононуклеарных клеток крови при вирусных гепатитах В и С

Группы Материал исследования

гепатоциты кровь

Доноры — 0,98±0,14

ХГС 0,15±0,09 0,21±0,12*

ХГВ 0,41±0,12 0,62±0,14

* - статистически достоверные различия по сравнению с донорами (р<0,05)

Согласно данным литературы источником растворимой формы CD95 протеина при вирусных гепатитах могут быть два основных вида клеток: активированные Т-лимфоциты и гепатоциты (Krams et al., 1998). Ранее Птицыной с соавт., (2000) было показано, что при вирусных гепатитах В и С происходит повышение сывороточной концентрации суммарного растворимого CD95 протеина. В отличие от уровня суммарного sCD95 сывороточное содержание олигомерного sCD95 при вирусных гепатитах В и С не претерпевало достоверных изменений. То есть, повышение суммарной фракции Fas белка происходит за счет мономерной формы, ингибирующей апоптоз, в том числе и программу клеточной гибели инфицированных гепатоцитов.

Дополнительно, в мононуклеарных клетках крови при хроническом гепатите С наблюдается повышение уровня экспрессии мРНК FasTMDel. Мы полагаем, что инфицирование вирусом гепатита С приводило к повышению синтеза мРНК растворимой формы CD95 протеина, ростом его концентрации в крови и блокадой апоптотических процессов. Отсутствие достоверных различий от нормы в уровне олигомерного растворимого Fas белка при вирусных гепатитах указывает на независимость экспрессии мРНК FasTMDel и содержания олигомерного sCD95 в сыворотке крови.

При тяжелой ожоговой травме статистически достоверных различий между РЗЦА в группе доноров и группе пострадавших выявить не удалось. При этом у лиц с неблагоприятным исходом ожоговой болезни, наблюдалось изменение соотношения уровней экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas белка. Это выражалось в снижении средних значений РЗЦА (табл. 4).

Таблица 4

Различия в уровнях экспрессии мРНК FasTMDel и mFas в мононуклеарных клетках периферической крови при ожоговой травме

Прогноз ожоговой болезни Сроки после травмы (сутки) Здоровые доноры

1 3 5

благоприятный 1,04±0,12 1,11±0,16 0,83±0,28 0,98+0,14

неблагоприятный 0,36±0,21*,** 0,18±0,28*,** 1,12+0,15

* - статистически достоверные различия по сравнению с донорами (р<0,05)

** - статистически достоверные различия между группами лиц с благоприятным и неблагоприятным исходами ожоговой болезни (р<0,05)

При раке молочной железы мононуклеарные клетки крови экспреесировали одну или две минорные формы мРНК CD95 протеина наряду с экспрессией мРНК mFas и FasTMDel. В обоих случаях относительное и абсолютное содержание Fas-положительных клеток находилось в пределах нормы (табл. 5). При этом экспрессия мРНК минорной FasExo4,6Del формы наряду с экспрессией мРНК mFas и FasTMDel форм, сопровождалась тенденцией к повышению сывороточного уровня олигомерной формы растворимого CD95 протеина от первой до четвертой стадии неопластического процесса. Экспрессия двух минорных форм мРНК (FasExo4Del и FasExo4,6Del), наряду с экспрессией мРНК mFas и FasTMDel форм, происходила на фоне статистически достоверного понижения сывороточного уровня олигомерного растворимого CD95 протеина на третьей и четвертой стадии рака молочной железы. Снижение сывороточного содержания олигомерного sFas сопровождалось увеличением числа минорных форм мРНК CD95 протеина в клетках опухолевого очага на первой и второй стадии неопластического процесса, появлением мРНК FasExo3,4,6Del формы на третьей стадии и максимальным количеством альтернативных форм мРНК исследуемой молекулы на четвертой стадии рака молочной железы. Следует отметить, что изменение спектра мРНК минорных форм CD95 протеина в мононуклеарных клетках крови и клетках опухолевого очага не сопровождалось изменением сывороточного уровня sCD95 на разных стадиях заболевания. Подобный факт указывает на независимость данных событий.

Можно предположить, что при раке молочной железы продукты трансляции минорных альтернативных форм мРНК Fas белка участвуют в реализации молекулярных механизмов, блокирующих процесс олигомеризации доминирующей растворимой формы исследуемой молекулы. В пользу подобного предположения свидетельствуют полученные нами результаты об увеличении сывороточного содержания суммарной и снижении олигомерной фракций растворимого CD95 протеина.

Сывороточный уровень растворимого Fas белка и относительное содержание С095-положительных клеток при разных спектрах минорных форм мРНК Fas в клетках крови лиц с диагнозом рак молочной железы

Показатель Здоровые доноры Минорные формы мРНК CD95 Стадии неопластического процесса

I II III IV

Относительное число CD95+ клеток, % 14,2±1,6 FasExo4,6Del 9,8±2,7 10,2±2,9 9,4±1,8 11,6+1,7

FasExo4,6Del + FasExo4Del 15,7±2,4 16,3±2,7 I4,9±3,8 15,4+4,1

Абсолютное число CD95+ клеток х 109/л 0,53±0,01 FasExo4,6Del 0,46±0,03 0,52±0,07 0,57+0,05 0,48±0,04

FasExo4,6Del + FasExo4Del 0,49+0,05 0,54±0,06 0,52±0,03 0,55±0,06

Суммарный sCD95, U/ml 401,3±38,6 FasExo4,6Del 1121,7±40,3* 1155,4±40,6* 1257,4±50,7* 1213,5+44,1*

FasExo4,6Del + FasExo4Del 1103,3±50,1* 1208,1±48,7* 1252,45±46,5* 1182,7+48,4*

Олигомерный sCD95, U/ml 250,4±5,7 FasExo4,6Del 261,0±5,9 267,4±6,2 277,3±7,4 282,2+9,3

FasExo4,6Del + FasExo4Del 248,2±7,6 244,3±7,1 132,2±8,4*,** 121,3±9,7*,**

* - статистически достоверные различия по сравнению с донорами (р<0,05)

** - статистически достоверные различия между группами (р<0,05)

Тяжелая ожоговая травма пациентов, в мононуклеарных клетках крови которых обнаруживалась мРНК FasExo3,4,6Del, мРНК mFas и FasTMDel, приводила к достоверному снижению относительного числа CD95-положительных клеток по сравнению с донорами (табл. 6). Наличие трех минорных форм (FasExo4Del; FasExo4,6Del и FasExo3,4,6Del) наряду с экспрессией мРНК mFas и FasTMDel форм сопровождалось тенденцией к уменьшению относительного содержания С095-положительных клеток. Абсолютное содержание CD95-положительных клеток достоверно не различалось у больных, мононуклеарные клетки крови которых экспрессировапи одну или три минорные формы мРНК Fas белка, но было статистически достоверно ниже нормы. У пострадавших, мононуклеарные клетки которых экспрессировапи одну минорную форму мРНК (FasExo3,4,6Del), мРНК mFas и FasTMDel, сывороточный уровень олигомерной фракции растворимого Fas белка был статистически достоверно снижен в 1,7 раза по сравнению с донорами уже в первые сутки с момента получения травмы и оставался пониженным на третьи и пятые сутки. Наличие трех минорных форм мРНК растворимого Fas белка (FasExo4Del; FasExo4,6Del и FasExo3,4,6Del) и мРНК mFas и FasTMDel не приводило к изменению сывороточного содержания олигомерной фракции исследуемой молекулы. Сохранение уровня олигомерного sFas белка в пределах нормы может рассматриваться как свидетельство отсутствия патофизиологических изменений на стадии инициации апоптоза и, как следствие, неучастия этого протеина в реализации программированной гибели клеток.

У пострадавших от ожоговой травмы, мононуклеарные клетки крови которых экспрессировапи мРНК либо одной, либо трех минорных форм наряду с экспрессией мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм, не наблюдалось достоверных различий в сывороточном содержании суммарной фракции растворимого CD95 протеина как по сравнению с донорами, так и в сравнении друг с другом.

Сывороточный уровень растворимого Fas белка и относительное содержание СБ95-положительных клеток при разных спектрах минорных форм мРНК Fas в клетках крови пострадавших от ожоговой травмы

Показатель Здоровые доноры Минорные формы мРНК CD95 Сроки после травмы (сутки)

первые третьи пятые

Относительное число CD95+ клеток, % 14,2±1,6 FasExo3,4,6Del 4,8±1,7* 5,0+1,8* 5,6+1,7*

FasExo4Del+ FasExo4,6Del+ FasExo3,4,6Del 7,2±2,4 9,2+2,7 10,4±1,9

Абсолютное число CD95+ клеток х 109/л 0,53+0,01 FasExo3,4,6Del 0,04+0,02* 0,12±0,05* 0,15±0,04*

FasExo4Del+ FasExo4,6Del+ FasExo3,4,6Del 0,05±0,02* 0,15±0,03* 0,18±0,06*

Суммарный sCD95, U/ml. 401,3±38,6 FasExo3,4,6Del 378,7±12,3 371,4+18,7 383,5±20,1

FasExo4Del+ FasExo4,6Del+ FasExo3,4,6Del 398,3±10,1 400,5±17,3 351,3+20,4

Олигомерный sCD95, U/ml 250,4±5,7 FasExo3,4,6Del 136,0+6,8*** 143,3±7,4*,** 154,2+12,1* **

FasExo4Del+ FasExo4,6Del+ FasExo3,4,6Del 224,4±7,6 258,7±8,1 273,2±9,7

* - статистически достоверные различия по сравнению с донорами (р<0,05) ** - статистически достоверные различия между группами (р<0,05)

Можно предположить, что при тяжелой ожоговой травме повышение чувствительности мононуклеарных клеток к апоптозу наблюдается уже на уровне экспрессии соответствующих мРНК. Это выражается в уменьшении в сравнении с нормой количества минорных альтернативных форм мРНК Fas белка, изменении соотношения уровня экспрессии мРНК mFas и FasTMDel, понижении сывороточного уровня суммарного sCD95, а также в достоверном снижении относительного числа СБ95-положительных клеток крови.

Таким образом, для вирусных гепатитов В и С, рака молочной железы и ожоговой травмы общей чертой регуляции Fas-зависимого апоптоза является уменьшение числа минорных альтернативных форм мРНК Fas белка в мононуклеарных клетках крови при наличии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм.

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что в мононуклеарных клетках периферической крови у лиц, инфицированных вирусами гепатитов В и С, у больных раком молочной железы и при ожогах наблюдается уменьшение числа мРНК минорных альтернативных форм CD95 протеина по сравнению со здоровыми донорами. Данный факт сопровождается изменением динамического равновесия в содержании мономерной и олигомерной форм растворимого Fas белка.

2. Выявлено достоверное повышение уровня экспрессии мРНК mFas и FasTMDel, достоверное снижение соотношения уровня экспрессии мРНК доминирующей растворимой формы к уровню экспрессии мРНК мембранной формы в клетках крови лиц с хроническим гепатитом С по сравнению с донорами.

3. Установлено, что при тяжелой ожоговой травме достоверное снижение соотношения уровня экспрессии мРНК FasTMDel к уровню экспрессии мРНК mFas в мононуклеарных клетках крови наблюдалось у лиц с неблагоприятным исходом ожоговой болезни.

4. Показано, что в мононуклеарных клетках крови экспрессия мРНК FasExo3,4,6Del формы при ожоговой травме, а также экспрессия мРНК FasExo4,6Del и FasExo4Del форм при неопластическом процессе сопровождалась достоверным снижением сывороточного уровня олигомерного SCD95 по сравнению с нормой.

5. Обнаружено, что при хроническом гепатите С отсутствие в клетках крови мРНК FasExo3,4Del формы наряду с детекцией в клетках печени мРНК FasExo4Del формы и повышением уровня экспрессии мРНК FasTMDel сопровождалось увеличением сывороточного содержания суммарного sCD95 по сравнению с донорами.

7. Установлено, что при ожогах у лиц, в клетках крови которых присутствует мРНК FasExo3,4,6Del формы, наблюдалось достоверное по сравнению с донорами снижение относительного числа CD95-положительных клеток на первые, третьи и пятые сутки с момента получения травмы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

I. Работы, опубликованные в ведущих рецензируемых научных

журналах и изданиях, определенных ВАК:

1. Евсегнеева И.В. Содержание суммарной и олигомерной фракций CD95 антигена в сыворотке крови больных вирусными гепатитами В и С / Евсегнеева И.В., Птицына Ю.С., Новиков Д.В., Отмахова И.А., Уткин О.В., Кравченко Г.А., Барышников А.Ю., Новиков В.В. // Физиология и патология иммунной системы. - 2005. — Т. 9, № 3. - С. 12-15.

2. Новиков В.В. Растворимые антигены CD38 и CD95 при раке молочной железы / Новиков В.В., Алясова A.B., Уткин О.В., Лютина Е.В., Новиков

Д.В., Варшавская Л.В. // Российский биотерапевтический журнал. - 2005. -№3. - С. 46-51.

3. Кравченко Г.А. Изучение сывороточного уровня Fas протеина при вирусном гепатите В у наркоманов. / Кравченко Г.А., Уткин О.В., Новиков В.В., Птицына Ю.С. II Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, серия Инновация в образовании. - 2005. - Выпуск 1(9).-С. 257-261.

4. Уткин О.В. Содержание суммарной и олигомерной фракций растворимого CD95 в сыворотке крови ожоговых больных / Уткин О.В., Новиков В.В., Лебедев М.Ю. // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, серия Биология. - 2006. - Выпуск 1(11). - С. 146149.

II. Статьи, доклады, тезисы докладов региональных и

всероссийских конференций:

1. Novikov D.V. Real time PCR for comparative analysis of the mRNA expression of membrane and dominant soluble forms Fas-antigen / Novikov D.V., Lebedev MJu., Utkin O.V., Zimin Ju.V., Lutina E.V., Sergeeva T.F., Novikov V.V. // Third Moscow international congress: Biotechnology, Moscow, March, 14-18, 2005.-P. 195-195.

2. Уткин O.B. Изучение Fas-зависимого апоптоза мононуклеарных клеток периферической крови на модели ожоговой травмы / Уткин О.В., Лебедев М.Ю., Новиков Д.В. // Российская научно-практическая конференция: Узловые вопросы борьбы с инфекцией, Санкт-Петербург, 1-2 декабря 2004 года. - С. 249-250.

3. Лебедев М.Ю. Изучение экспрессии мРНК Fas-антигена при различных патологиях / Лебедев М.Ю., Уткин О.В., Новиков В.В, Новиков Д.В., Зимин Ю.В. // Паллиативная медицина и реабилитация. - 2005. - № 1. -С. 74-74.

4. Уткни О.В. Сравнительный анализ экспрессии мРНК мембранной и доминирующей форм Fas-антигена, с использованием ПЦР в реальном времени / Уткин О.В., Новиков Д.В., Лебедев М.Ю., Новиков В.В. //

Международная Пущинская школа-конференция молодых ученых, Пущино. - 2005. - С. 212-212.

5. Ряекова Е.А. Экспрессия матричных РНК различных форм Fas-антигена в лимфоцитах периферической крови тяжелообожженных / Ряекова Е.А., Уткин О.В., Сергеева Т.Ф., Лебедев М.Ю. // Сборник научных трудов I съезда комбустиологов России, Москва. - 2005. - С. 85-86.

6. Уткин О.В. Изучение экспрессии альтернативных форм мРНК Fas-антигена при вирусных гепатитах и ожоговой травме / Уткин О.В., Лебедев М.Ю., Новиков Д.В., Новиков В.В. // Материалы научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения ак. РАМН И.Н. Блохиной, Н. Новгород. - 2006. - С. 202-206.

7. Уткин О.В. Изучение экспрессии альтернативных форм мРНК Fas-антигена при различных патологиях / Уткин О.В., Новиков Д.В. // XI Нижегородская сессия молодых ученых естественнонаучные дисциплины. - 2006. - С. 205-206.

8. Уткин О.В. Экспрессия матричной РНК Fas-антигена при раке молочной железы и раке легкого / Уткин О.В., Новиков Д.В., Степанова Л.С., Иванчикова K.M., Новиков В.В. // X Росс, онкол. конгресс. - М. - 2006. -С. 240-240.

Формат 60x84 'Лб. Бумага офсетная. Печать офсетная. Гарнитура «Тайме». Усл. п. л. 1. Заказ 833. Тираж 100 экз.

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии Нижегородского госуниверситета им. Н.И. Лобачевского. Лиц. ПД № 18-0099 от 4.05.01. 603000, г. Н. Новгород, ул. Б. Покровская, 37.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Уткин, Олег Владимирович

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Общие представления об апоптозе.

1.2. Структура CD95 (Fas) протеина.

1.3. Строение CD95 лиганда (FasL).

1.4. Регуляция альтернативного сплайсинга Fas белка во время апоптоза.

1.5. Механизмы реализации Fas-зависимого апоптоза.

1.5.1. Каспазы и механизм их действия.

1.5.2. Ингибиторы каспаз.

1.5.3. Липидные рафты и Fas-опосредованный апоптоз.

1.6. Общие представления о растворимых формах мембранных белков.

1.7. Многообразие форм CD95 (Fas) протеина.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материалы исследования.

2.2. Реакция непрямой иммунофлуоресценции.

2.3. Получение козьих поликлональных антител, специфичных к поверхностным белкам мононуклеарных клеток крови человека.

2.4. Перйодатный метод синтеза конъюгата.

2.5. Получение образцов сыворотки крови.

2.6. Иммуноферментные методы определения растворимых форм мембранных белков клеток иммунной системы.

2.7. Выделение РНК из клеток.

2.8. Постановка реакции обратной транскрипции.

2.9. Постановка полимеразной цепной реакции.

2.10. Электрофорез нуклеиновых кислот в агарозном геле.

2.11. Постановка обратной транскрипции-полимеразной цепной реакции в реальном времени.

2.12. Методы статистического анализа.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

3.1. Изучение экспрессии гена белка Fas при вирусных гепатитах В и С.

3.2. Исследование экспрессии гена белка Fas при раке молочной железы.

3.3. Влияние ожоговой травмы на экспрессию гена CD95 протеина.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Сравнительный анализ экспрессии гена белка Fas в клетках человека при различных альтерирующих воздействиях на организм"

Актуальность проблемы

Одним из рецепторов, инициирующих программируемую клеточную гибель, является Fas (CD95) протеин. Молекула CD95 экспрессируется на мембране клеток различных типов и участвует в передаче апоптотического сигнала. Помимо мембранной формы (mFas/mCD95) описаны растворимые формы Fas белка (sFas/sCD95), образующиеся в результате альтернативного сплайсинга мРНК. Среди них выделяют доминирующий вариант молекулы, образующийся в результате делеции 6 экзона, кодирующего трансмембранный домен (FasExo6Del/FasTMDel). Остальные (минорные) формы образуются в результате единичных или комбинированных делеций разных экзонов (Papoff et al., 1996). Растворимые продукты трансляции альтернативных форм мРНК Fas белка модулируют апоптотический сигнал в зависимости от степени олигомеризации. Мономерные растворимые формы CD95 протеина ингибируют апоптоз, тогда как олигомерная форма проявляет цитотоксические свойства (Proussakova et al., 2003). Кроме того, существование большого количества альтернативных форм растворимого Fas белка позволяет предположить наличие регуляции начальных стадий апоптоза за счет повышения или снижения их экспрессии. Однако характер экспрессии минорных растворимых форм в разных типах клеток и механизмы их возможного участия в регуляции апоптоза не выяснены и требуют детального изучения.

Цель исследования

Задачи

1. Изучить особенности измеиения спектра альтернативных форм мРНК Fas белка в мононуклеарных клетках периферической крови и гепатоцитах при хронических вирусных гепатитах В и С, в мононуклеарных клетках крови и клетках опухолевого очага при раке молочной железы и в мононуклеарных клетках при ожоговой травме.

4. Провести сравнительный анализ взаимоотношений между изменениями в спектре альтернативных форм мРНК Fas белка в мононуклеарных клетках и содержанием С095-положительных клеток периферической крови при вирусных гепатитах В и С, раке молочной железы и ожоговой травме.

Положения, выносимые на защиту 1. При ожоговой травме изменение соотношения в уровнях экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas белка наблюдается в мононуклеарных клетках лиц с неблагоприятным исходом ожоговой болезни.

Научная новизна

Впервые установлено, что мононуклеарные клетки лиц с неблагоприятным исходом ожоговой болезни (погибшие), характеризовались достоверным снижением соотношения уровней экспрессии мРНК FasTMDel к мРНК mFas как по сравнению с группой лиц, имеющих благоприятный исход ожоговой болезни (выжившие), так и по сравнению с донорами.

Практическая значимость работы

Разработанный нами методический подход для раздельной детекции уровня экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas белка с помощью полимеразной цепной реакции в реальном времени может быть использован для мониторинга течения ожоговой болезни и в качестве возможного прогностического критерия исхода заболевания. Используемые в работе подходы для дифференциальной детекции спектра альтернативных форм мРНК Fas белка могут применяться для оценки функционального состояния kj,сточного звена иммунитета при нарушениях гомеостаза организма. Полученные данные могут быть использованы в преподавании курсов по биохимии и иммунологии для студентов вузов биологического и медицинского профиля.

Апробация работы

Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний», посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной (Нижний Новгород, 2006), X Российском онкологическом конгрессе (Москва, 2006).

По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании кафедры молекулярной биологии и иммунологии ННГУ им. Н.И. Лобачевского, межлабораторного семинара Нижегородского НИИ эпидемиологии и микробиологии им. акад. И.Н. Блохиной и Нижегородского отделения Российского научного общества биохимиков и иммунологов 24 апреля 2007 года.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа в объеме 124 листов состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследований, собственных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы. Диссертация иллюстрирована 22 рисунками и 10 таблицами. Библиографический указатель включает 159 источников литературы (26 отечественных и 133 иностранных).

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Уткин, Олег Владимирович

ВЫВОДЫ

1. Обнаружено, что в мононуклеарных клетках периферической крови лиц, инфицированных вирусами гепатитов В и С, у больных раком молочной железы и при ожогах наблюдается уменьшение числа мРНК минорных альтернативных форм CD95 протеина по сравнению со здоровыми донорами. Данный факт сопровождается изменением динамического равновесия в содержании мономерной и олигомерной форм растворимого Fas белка.

6. Выявлено, что при хроническом гепатите С и раке молочной железы изменения в спектре и количественном содержании мРНК Fas белка в мононуклеарных клетках периферической крови не сопровождались изменениями относительного числа С095-положительных клеток. 7. Установлено, что при ожогах у лиц, в клетках крови которых присутствует мРНК FasExo3,4,6Del формы, наблюдалось достоверное по сравнению с донорами снижение относительного числа CD95-положительных клеток на первые, третьи и пятые сутки с момента получения травмы.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Альтернативный сплайсинг пре-мРНК является универсальным механизмом регуляции экспрессии генов и функционального разнообразия белковых продуктов. В настоящее время установлено, что гены человека, участвующие в реализации программы гибели клеток (апоптоза), подвергаются альтернативному сплайсингу. Изменения в регуляции альтернативного сплайсинга апоптоз-специфических генов часто приводят к нарушению передачи апоптотического сигнала, что сопровождается альтерациями гомеостаза организма. Так ослабление апоптотического каскада сигналов, определяет повышенную склонность к формированию неопластических и аутоиммунных процессов. Повышенная готовность к апоптозу часто обусловливает заболевания, связанные с развитием атрофических процессов в нервной, мышечной, эндокринной тканях (Никонова и др., 1997).

Одним из рецепторов, инициирующих программируемую клеточную гибель, является CD95 (Fas), участвующий в передаче сигналов клеточной смерти после взаимодействия с лигандом. Описаны растворимые формы CD95, образующиеся в результате альтернативного сплайсинга первичного транскрипта (пре-мРНК) (Cascino et al., 1995; Cascino et al., 1996). Продукты трансляции, синтезируемые в растворимой форме, проявляют разные функциональные особенности в зависимости от степени олигомеризации белковых молекул. Мономерные формы растворимого Fas белка блокируют центры связывания на Fas лиганде, предотвращая его взаимодействие с мембранным аналогом. В то же время олигомеризация растворимого CD95 протеина индуцирует его цитотоксичность (Proussakova et al., 2003). В свою очередь, изменение равновесного содержания мономерной и олигомерной форм растворимого Fas белка приводит к модуляции апоптотических реакций.

В настоящей работе определен спектр альтернативных форм мРНК Fas белка, уровень экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм в сравнении с содержанием Fas белка в сыворотке крови, относительным и абсолютным содержанием Fas-положительных мононуклеарных клеток периферической крови в норме и состояниях, характеризующихся разной степенью выраженности апоптотических реакций.

Литературные данные свидетельствуют о том, что ожоговая травма характеризуется высокой степенью выраженности апоптотических реакций, рак молочной железы - угнетением процессов реализации программируемой клеточной смерти (Lebedev et al., 1999; Peter et al., 2005). В отношении напряженности апоптотических процессов при вирусных гепатитах В и С данные литературы весьма противоречивы (Ferenbach et al., 1997; Marusawa etal., 1999).

Регуляция экспрессии гена Fas белка с помощью альтернативного сплайсинга является важным событием реализации апоптотической программы, приводящая к образованию белковых изоформ, выполняющих разные функции в клетке. Интенсивность сигналов смерти/выживания напрямую зависит от спектра белковых молекул CD95, участвующих в инициации или блокаде апоптотического процесса.

С помощью метода полимеразной цепной реакции, сопряженной с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) и ОТ-ПЦР в реальном времени обнаружено уменьшение числа мРНК минорных альтернативных форм CD95 протеина в мононуклеарных клетках периферической крови при вирусных гепатитах В и С, раке молочной железы и ожоговой травме по сравнению с нормой.

В мононуклеарных клетках периферической крови здоровых доноров присутствует мРНК, кодирующая мембранную, доминирующую растворимую и 4 минорных растворимых формы Fas белка (FasExo4Del, FasExo3,4Del, FasExo4,6Del и FasExo3,4,6Del).

При хронических гепатитах В и С (ХГВ и ХГС) клетки печени содержали одну минорную форму мРНК (FasExo4Del), а также мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas белка, В мононуклеарных клетках периферической крови лиц при хроническом гепатите В и С детектировались три минорные формы мРНК (FasExo4Del, FasExo4,6Del и FasExo3,4,6Del) наряду с мРНК mFas и FasTMDel.

При раке молочной железы в мононуклеарных клетках крови на первой стадии развития неопластического процесса в 64% случаев обнаруживались две минорные формы мРНК Fas белка (FasExo4,6Del и FasExo4Del), а в 36% случаев одна минорная форма мРНК (FasExo4,6Del). На второй, третьей и четвертой стадиях рака молочной железы во всех исследованных образцах мононуклеарных клеток крови были обнаружены две минорные формы мРНК (FasExo4,6Del и FasExo4Del). При этом на всех стадиях онкологического процесса детектировалась мРНК mFas и FasTMDel. В отличие от мононуклеарных клеток крови в опухолевых клетках мРНК mFas и FasTMDel обнаруживалась только на четвертой стадии неопластического процесса. Спектр мРНК, кодирующих минорные формы растворимого Fas белка, широко варьировал на разных стадиях рака молочной железы. Таким образом, клетки опухолевого очага характеризуются более вариабельной картиной экспрессии мРНК минорных форм Fas белка по сравнению с клетками периферической крови. В клетках опухоли на каждой стадии неопластического процесса наблюдается изменение числа и состава мРНК минорных форм CD95 протеина, в клетках периферической крови такие изменения происходят только при переходе с первой на вторую стадию онкологического процесса.

В мононуклеарных клетках периферической крови пострадавших от ожоговой травмы обнаруживался иной набор мРНК, кодирующий разные формы Fas белка. В 44% исследованных образцов мононуклеарных клеток периферической крови, вне зависимости от срока с момента получения ожога, детектировались мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм, а также единственная минорная форма мРНК, образующаяся в результате делеции 3,4,6 экзонов. Во всех остальных случаях наряду с экспрессией мРНК mFas и FasTMDel были обнаружены три минорные формы мРНК с делециями 4; 4,6 и 3,4,6 экзонов. Заметим, что три указанные минорные формы мРНК Fas белка наблюдались в клетках периферической крови 16 из 19 пострадавших с неблагоприятным исходом ожоговой болезни.

Выявленный спектр альтернативных вариантов мРНК Fas белка в клетках периферической крови, печени и опухолевого очага, с одной стороны, отражает особенности транскриптома разных типов клеток, с другой стороны, может оказывать влияние на процессы, связанные с инициацией апоптоза во время развития патологического процесса. По сравнению со здоровыми лицами снижение числа альтернативных форм мРНК CD95 протеина может быть результатом ингибирования транскрипции гена или усиления деградации мРНК. Не исключено, что оба механизма вовлечены в этот процесс.

Возможной причиной уменьшения числа минорных форм мРНК CD95 протеина является активация мононуклеарных клеток периферической крови в ответ на альтерирующие воздействия на организм, что рассматривается в качестве одного из факторов, участвующих в регуляции Fas-зависимого апоптоза (Liu et al., 1995).

Кроме того, образующиеся минорные формы мРНК кодируют усеченные белковые продукты, функция которых в настоящее время не известна. Мы полагаем, что они могут играть роль в регуляции экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм, действуя как простой включатель/выключатель транскрипции гена. В пользу данной гипотезы свидетельствуют полученные нами результаты об изменении экспрессии мРНК mFas и FasTMDel в мононуклеарных клетках крови при вирусных гепатитах В и С, ожоговой травме, а также клетках опухолевого очага при раке молочной железы.

К особенностям структурной организации минорных альтернативных форм CD95 протеина можно отнести наличие внеклеточного участка молекулы, необходимого для взаимодействия с лигандом, а также отсутствие домена смерти, выполняющего функцию передачи сигнала смерти внутрь клетки. Мы полагаем, что минорные формы Fas белка могут участвовать в формировании функционально не активных Fas тримеров на поверхности клетки, могут связывать лиганд, но не способны к трансдукции апоптотического сигнала.

Определение уровня экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas белка показало, что при хроническом гепатите С в клетках крови уровень экспрессии мРНК mFas и FasTMDel был достоверно выше, чем у здоровых лиц. При хроническом гепатите В таких различий выявлено не было. При хроническом гепатите С в клетках крови наблюдалось статистически достоверное снижение соотношения уровня экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм (РЗЦА) по сравнению с донорами. При хроническом гепатите В такая закономерность выявлена не была. Проведенный анализ не выявил статистически достоверных различий в РЗЦА мРНК доминирующей растворимой и мембранной форм CD95 протеина как в клетках печени, так и в мононуклеарных клетках крови при вирусных гепатитах В и С в сравнении друг с другом.

Проведенный анализ спектра форм мРНК Fas белка и уровня экспрессии мРНК FasTMDel в сравнении с его содержанием в сыворотке крови позволяет предположить, что повышение сывороточного содержания суммарного растворимого Fas белка при хронических гепатитах В и С может быть связано с исчезновением в мононуклеарных клетках крови мРНК FasExo3,4Del формы и наличием только одной минорной формы мРНК (FasExo4Del) в клетках печени. Дополнительно, в мононуклеарных клетках крови при хроническом гепатите С наблюдается повышение уровня экспрессии мРНК FasTMDel. Мы полагаем, что инфицирование вирусом гепатита С приводило к повышению синтеза мРНК растворимой формы CD95 протеина, ростом его концентрации в крови и блокадой апоптотических процессов. Отсутствие достоверных различий от нормы в уровне олигомерного растворимого Fas белка при вирусных гепатитах указывает на независимость экспрессии мРНК FasTMDel и содержания олигомерного sCD95 в сыворотке крови.

При тяжелой ожоговой травме статистически достоверных различий между РЗЦА в группе доноров и группе пострадавших выявить не удалось. При этом у лиц с неблагоприятным исходом ожоговой болезни, наблюдалось изменение соотношений уровней экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas белка. Это выражалось в снижении средних значений РЗЦА.

Тяжелая ожоговая травма лиц, в мононуклеарных клетках крови которых обнаруживалась мРНК FasExo3,4,6Del, мРНК mFas и FasTMDel, приводила к достоверному снижению относительного числа CD95-положительных клеток по сравнению с донорами. Наличие трех минорных форм (FasExo4Del; FasExo4,6Del и FasExo3,4,6Del) наряду с экспрессией мРНК mFas и FasTMDel форм сопровождалось тенденцией к уменьшению относительного содержания С095-положительных клеток. Абсолютное содержание С095-положительных клеток достоверно не различалось у лиц, мононуклеарные клетки крови которых экспрессировали одну или три минорные формы мРНК Fas белка, но было статистически достоверно ниже нормы. У пострадавших, мононуклеарные клетки которых экспрессировали одну минорную форму мРНК (FasExo3,4,6Del), мРНК mFas и FasTMDel, сывороточный уровень олигомерной фракции растворимого Fas белка был статистически достоверно снижен в 1,7 раза по сравнению с донорами уже в первые сутки с момента получения травмы и оставался пониженным на третьи и пятые сутки. Наличие трех минорных форм мРНК растворимого Fas белка (FasExo4Del; FasExo4,6Del и FasExo3,4,6Del) и мРНК mFas и FasTMDel не приводило к изменению сывороточного содержания олигомерной фракции исследуемой молекулы. Сохранение уровня олигомерного sFas белка в пределах нормы может рассматриваться как свидетельство отсутствия патофизиологических изменений на стадии инициации апоптоза и, как следствие, неучастия этого протеина в реализации программированной гибели клеток.

У пострадавших от ожоговой травмы, мононуклеарные клетки крови которых экспрессировали мРНК либо одной, либо трех минорных форм наряду с экспрессией мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм, не наблюдалось достоверных различий в сывороточном содержании суммарной фракции растворимого CD95 протеина как по сравнению с донорами, так и в сравнении друг с другом.

Можно предположить, что при тяжелой ожоговой травме повышение чувствительности мононуклеарных клеток к апоптозу, наблюдается уже на уровне экспрессии соответствующих мРНК. Это выражается в уменьшении количества минорных альтернативных форм мРНК Fas белка, изменении соотношения уровня экспрессии мРНК mFas и FasTMDel, понижении сывороточного уровня суммарного sCD95, а также достоверного снижения относительного числа С095-положительных клеток у пострадавших от ожоговой травмы по сравнению с донорами. С другой стороны, изменением уровня транскрипции генов различных форм Fas молекул можно лишь частично объяснить уменьшение способности иммунокомпетентных клеток продуцировать белковый продукт. В первую очередь это относится к пациентам, которые имели благоприятный исход ожоговой болезни.

При раке молочной железы мононуклеарные клетки крови экспрессировали одну или две минорные формы мРНК CD95 протеина наряду с экспрессией мРНК mFas и FasTMDel. В обоих случаях относительное и абсолютное содержание Fas-положительных клеток находилось в пределах нормы. При этом экспрессия мРНК минорной FasExo4,6Del формы наряду с экспрессией мРНК mFas и FasTMDel форм, сопровождалась тенденцией к повышению сывороточного уровня олигомерной формы растворимого CD95 протеина от первой до четвертой стадии неопластического процесса. Экспрессия двух минорных форм мРНК (FasExo4DeI и FasExo4,6DeI), наряду с экспрессией мРНК mFas и FasTMDel форм, происходила на фоне статистически достоверного понижения сывороточного уровня олигомерного растворимого CD95 протеина на третьей и четвертой стадии рака молочной железы. Снижение сывороточного содержания олигомерного sFas сопровождалось увеличением числа минорных форм мРНК CD95 протеина в клетках опухолевого очага на первой и второй стадии неопластического процесса, появлением мРНК FasExo3,4,6DeI формы на третьей стадии и максимальным количеством альтернативных форм мРНК исследуемой молекулы на четвертой стадии рака молочной железы. Следует отметить, что изменение спектра мРНК минорных форм CD95 протеина в мононуклеарных клетках крови и клетках опухолевого очага не сопровождалось изменением сывороточного уровня sCD95 на разных стадиях заболевания. Подобный факт указывает на независимость данных событий.

107

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Уткин, Олег Владимирович, Нижний Новгород

1. Алясова А.В., Тагиров О.Т., Варшавская Л.В. К вопросу об иммунологическом мониторинге рака молочной железы // Росс, биотерап. журн. - 2003. - № 1. - С. 4-4.

2. Блохин Д.Ю. Причины ограниченной эффективности противоопухолевой терапии с позиций клеточной биологии // Росс, биотерап. журн. 2005. - Т. 4, № 3. - С. 18-23.

3. Воскресенская Н.А. Проблемы апоптоза // Лаборатор. мед. 2001. - № 4.-С. 34-43.

4. Глухова Е.И., Лукашина М.И., Богатырев В.Н. и др. Экспрессия белков, контролирующих апоптоз, и индекс ДНК опухолевых клеток рака молочной железы // Росс, биотерап. журн. 2003. - № 3. - С. 15-21.

5. Дейвис К. Анализ генома. М., 1990. - 289 с.

6. Долгушин И.И., Эберт Л.Я., Лифшиц Р.И. Иммунология травмы. -Свердловск, 1989.- 187 с.

7. Евсегнеева И.В., Птицына Ю.С., Новиков Д.В. и др. Содержание суммарной и олигомерной фракций sCD95 антигена в сыворотке крови больных вирусными гепатитами В и С // Физиол. и патол. иммунн. сист. 2005. - Т. 9, № 3. - С. 12-15.

8. Егоров A.M., Осипов А.П., Дзантиев Б.Б. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. М., 1991. - 288 с.

9. Кравченко Г.А., Тагиров О.Т., Новиков В.В. Растворимый Fas (CD95) белок, ингибирующий апоптоз как прогностический биомаркер течения РМЖ//Вест. ННГУ, сер. Биол. -2001. -№ З.-С. 18-25.

10. Лебедев М.Ю., Птицына Ю.С., Новиков В.В. Содержание растворимой формы Fas-антигена в крови пациентов с термической травмой // International. J. Imunorehab. 2000. - Vol. 2, № 2. - P. 84-84.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Методы генетической инженерии. -М., 1984.-304 с.

12. Никонова М.Ф., Чегаева Е.В., Литвина М.М. и др. Апоптоз активированных лимфоцитов и подавление их пролиферативного ответа на митоген при контакте с эпителиальными клетками, происходящими из тимуса человека // Иммунол. 1997. - № 3. - С. 912.

13. Новиков В.В. Растворимые формы дифференцировочных антигенов гемопоэтических клеток // Гематол. и трансфузиол. 1996. - № 6. - С. 40-43.

14. Новиков В.В. Растворимые дифференцировочные антигены // Матер. Европ. школы онкологов. М., 1999. -С. 10-14.

15. Новиков Д.В., Уткин О.В., Лебедев М.Ю. и др. Метод сравнительной оценки экспрессии мРНК мембранной и доминирующей растворимой форм Fas-антигена с использованием ПЦР в реальном времени // Матер. III Моск. междун. конгр. 2004. - С. 52-54.

16. Парамонов Б.А., Порембский Я.О., Яблонский В.Г. Ожоги: Руководство для врачей. СПб, 2000. - С. 351-378.

17. Птицына Ю.С., Борнякова И.А., Мартынова Т.Г. и др. Содержание растворимой формы CD95 антигена в сыворотке крови больных гепатитами В и С // Росс. журн. гастроэнтерол., гепатол., колопроктол. 1999.-Т. 9,№ 1.-С. 75-76.

18. Птицына Ю.С., Борнякова И.А., Шломина И.А. и др. Растворимый и мембранный Fas/Apo-1 (CD95) антиген в крови больных гепатитами В и С // Клинич. лаборатор. диагн. 2000. - № 10. - С. 10-11.

19. Птицына Ю. С., Кравченко Г. А., Новиков В. В. и др. Уровень сывороточного CD95 олигомера у наркоманов, больных хроническимвирусным гепатитом С // Вестн. ННГУ, сер. Биол. 2004. - Вып. 3. - С. 211-213.

20. Ройт А., Бростофф Дж., Мейл Д. Иммунология. М., 2000. - 592 с.

21. Рыжов С.В., Новиков В.В. Молекулярные механизмы апоптотических процессов // Росс, биотерап. журн. 2002. - Т. 1, № 3. - С. 5-11.

22. Соринсон С.Н. Вирусные гепатиты. СПб, 1998. - 325 с.

23. Тагиров О.Т., Козлов А.Ю., Новиков В.В. и др. Растворимый Fas (CD95) антиген, ингибирующий апоптоз, как прогностический биомаркер течения рака молочной железы // Вест. ННГУ, сер. Биол. -2001.-Вып. 1 (3).-С.21-25.

24. Ушакова Т.А., Глоба А.Г., Карелин А.А. Механизм и роль апоптоза при патологии: актуальность исследования в комбустиологии // Комбустиол. -2004. -№ 19. -С.30-40.

25. Фримель Г. Иммунологические методы. М., 1987. - 472 с.

26. Abastado J.-P. Apoptosis: function and regulation of the cell death // Res. Immunol. 1996. - Vol. 147. - P. 443-456.

27. Alderson M.R., Tough T.W., Braddy S. et al. Regulation of apoptosis and T cell activation by Fas-specific mAb // Int. Immunol. 1994. - Vol. 6. - P. 1799-1806.

28. Alnemry E.S., Fernandes T.F., Haldar S. et al. Involvement of Bcl-2 in glucocorticoid induced apoptosis in human pre-B-leukemias // Cancer Res. -1992.-Vol. 52,- P. 491-495.

29. Ayroldi E., D'Adamio F., Zollo O. et al. Cloning and expression of a short Fas ligand: a new alternatively spliced product of the mouse Fas ligand gene // Blood. 1999. - Vol. 94. - P. 3456-3467.

30. Behrmann I., Walczak H., Krammer P.H. Structure of the human APO-1 gene // Europ. J. Immunol. 1994. - Vol. 24 (12). - P. 3057-3062.

31. Bernardi P., Brockemeier K.M., Pfeiffer D.R. Recent progress on regulation of the mitochondrial permeability transition pore: a cyclosporin-sensitive pore in the inner mitochondrial membrane // J. Bioenerg. Biomembr. 1994. -Vol. 26.-P. 509-517.

32. Black P.H. Shedding from normal and cancer cell surface antigens // New England J. Med.- 1980.-Vol. 303.-P. 1415-1416.

33. Budd R.C. Death receptors couple to both cell proliferation and apoptosis // J. Clin. Invest. -2002. Vol. 109, № 4. - P. 437^42.

34. Caldas H., Jiang Y., Holloway M. P. et al. Survivin splice variants regulate the balance between the proliferation and cell death // Oncogene. 2005. -Vol. 24.-P. 1994-2007.

35. Cascino I., Fiucci C., Papoff C. And Ruberti C. Three functional soluble forms of the human apoptosis-inducing Fas molecule are produced by alternative splicing//J. Immunol.- 1995.-Vol.154.-P. 2706-2713.

36. Cascino I., Papoff G., De Maria R. et al. Fas/Apo-1 (CD95) receptor lacking the intracytoplasmic signaling domain protects tumor cells from Fas-mediated apoptosis//J. Immunol.-1996.-Vol. 156.-P. 13-17.

37. Chang H.Y., Yang X. Proteases for cell suicide: functions and regulation of caspases // Microbiol, and Mol. Biol. Rev. 2000. - Vol. 64, №4. - P. 821846.

38. Cheng J., Zhou I., Liu C. et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by soluble form of the Fas molecule // Science 1994. - Vol. 263. - P. 17591762.

39. Chomszynskii P., Sacchi N. Single step method of RNA isolation by acid guanidinium thiocyonate - phenol - chloroform extraction // Analyt. Biochem.- 1987.-Vol. 162.-P. 156-159.

40. Cremesti A., Paris F., Grassme H. et al. Ceramide Enables Fas to Cap and Kill // J. Biol.Chem. 2001. - Vol. 276, № 26. - P. 23954-23961.

41. Crespo J., Rivero M., Mayorga M. et al. Involvement of the fas system in hepatitis С virus recurrence after liver transplantation // Liver Transpl. -2000. Vol. 6, № 5. - P. 562-569.

42. Debatin K.M., Krammer P.H. Resistance to APO-1 (CD95) induced apoptosis in T-ALL is determined by a BCL-2 independent anti-apoptotic program // Leukemia. 1995. - Vol. 9. - P. 815-820.

43. De Maria R., Lenti L., Malisan F. et al. Requrement for GD3 ganglioside in CD95- and ceramide-induced apoptosis // Science. 1997. - Vol. 277. - P. 1652-1655.

44. Deveraux Q.L., Reed J.C. IAP family proteins-suppressors of apoptosis // Genes and Development. 1999. - Vol. 13. - P. 239-252.

45. Dhein J., Daniel P.T., Trauth B.C. Induction of apoptosis by monoclonal antibody anti-APO-1 class switch variants is dependet on cross-lincing of APO-1 cell surface antigens // J. Immunol. 1992. - Vol. 149. - P. 31663173.

46. Dhein J, Walczak H, Baumler C. et al. Autocrine T-cell suicide mediated by APO-1 /(Fas/CD95) // Nature. 1995. - Vol. 373. - P. 438-441.

47. Ekert P.G., Vaux D.L. Apoptosis and the immune system // Brit. Med. Bull. -1997.-Vol. 53.-P. 591-603.

48. Faubion W.A., Gores G.J. Death receptor in liver biology and pathobiology //Hepatol.- 1999.-Vol. 29.-P. 1-4.

49. Ferenbach D.A., Haydon G.H., Rae F. et al. Alteration in mRNA levels of Fas splice variants in hepatitis C-infected liver // J. Pathol. 1997. - Vol. 183, №3.-P. 299-304.

50. Forch P., Puig O., Kedersha N. et al. The apoptosis-promoting factor TIA-1 is a regulator of alternative pre-mRNA splicing // Mol. Cell. 2000. - Vol. 6.-P. 1089-1098.

51. Fu J., Jin Y., Arend L.J. Smac3, a novel Smac/DIABLO splicing variant, attenuates the stability and apoptosis-inhibiting activity of X-linked inhibitor of apoptosis protein // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278. - P. 52660-52672.

52. Furuya Y., Fuse H., Masai M. Serum soluble Fas level for detection and staging of prostate cancer // Anticancer Res. 2001. - Vol. 21, № 5. - P. 3595-3598.

53. Ghobrial I.M., Witzig Т.Е., Adjei A.A. Targeting apoptosis pathways in cancer therapy // CA Cancer J. Clin. 2005. - Vol. 55. - P. 178-194.

54. Giacomelli R., Passacantando A., Parzanese I. et al. Serum levels of soluble CD30 are increased in ulcerative colitis (UC) but not in Cronhus disease (CD)//Clin. Exp. Immunol.-1998.-Vol. Ill (3).-P. 532-535.

55. Golks A., Brenner D., Fritsch C. et al. c-FLIPr, a new regulator of death receptor-induced apoptosis // J. Biol. Chem. 2005. - Vol. 280, № 15. - P. 14507-14513.

56. Gulbins E., Grassme H. Ceramide and cell death receptor clustering // J. Biochim. et Biophys. -2002. Vol. 1585.-P. 139-145.

57. Hannun Y.A., Luberto C. Ceramide in the eucaryotic stress response // Trends Cell Biol. 2000. - Vol. 10. - P. 73-80.

58. Hayashi N., Mita E. Fas system and apoptosis in viral hepatitis // J. Gastroenterol. Hepatol. 1997. - Vol. 12. - P. 223-226.

59. Ho P., Hawkins J. Mammalian initiator apoptotic caspases // FEBS J. -2005. Vol. 272. - P. 5436-5453.

60. Hoffmann Т.К., Dworacki G., Tsukihiro T. et al. Spontaneous apoptosis of circulating T lymphocytes in patients with head and neck cancer and its clinical importance // Clin. Cancer Res. 2002. - Vol. 8. - P. 2553-2562.

61. Horgan A.F., Mendez M.V., O'Riordain D.S. et al. Altered gene transcription after burn injury results in depressed T-lymphocyte activation // Ann. Surgery. 1994. - Vol. 220. - P.342-351.

62. Huang В., Eberstadt M., Olejniczak E.T. et al. NMR structure and mutagenesis of the Fas (APO-1/CD95) death domain // Nature 1996. -Vol. 384.-P. 638-641.

63. Hu Y., Benedict M.A., Ding L. et al. Role of cytochrome С and dATP/ATP hydrolysis in Apaf-1-mediated caspase-9 activation and apoptosis // EMBO. 1999. - Vol. 18. - P. 3585-3595.

64. Itoh N., Nagata S.A. Novel protein domain required for apoptosis. Mutational analysis of human Fas antigen // Biol. Chem. 1993. - Vol. 268 (15).-P. 10932-10937.

65. Iwai K., Miyawaki Т., Takizawa T. et al. Differential expression of bcl-2 and susceptibility to anti-Fas-mediated cell death in peripheral blood lymphocytes, monocytes, and neutrophils // Blood. 1994. - Vol. 84. - P. 1201-1208.

66. Jacobson M.D., Burne J.E., Raff M.C. Programmed cell death and Bcl-2 protection in the absence of a nucleus // EMBO J. 1994. - Vol. 13. - P. 1899-1910.

67. Jenkins M., Keir M., McCune J.M. A membrane-bound Fas decoy receptor expressed by human thymocytes // J. Biol. Chem. 2000. - Vol. 275, №11. -P. 7988-7993.

68. Joashi U., Tibby S.M., Turner C. et al. Soluble Fas may be a proinflammatory marker after cardiopulmonary bypass in children // J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2002. - Vol. 123. - P. 137-144.

69. Jodo S., Kobayashi S., Nakajima Y. et al. Elevated serum levels of soluble Fas/APO-1 (CD95) in patients with hepatocellular carcinoma // Clin. Exp. Immunol. 1998.-Vol. 112, №2.-P. 166-171.

70. Kamitani Т., Nguyen H.P., Yeh Т.Н. ^ctivation-induced Aggregation and Processing of the Human Fas Antigen // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272 -P. 22307-22314.

71. Kayagaki N., Kawasaki A., Ebata T. et al. Metalloproteinase-mediated release of human Fas ligand // J. Exp. Med. 1995. - Vol. 182. - P. 17771783.

72. Kerr J.F., Wyllie A.H., Currie A.R. Apoptosis: a basic biological phenomenon with wide-ranging implications in tissue kinetics // Brit. J. Cancer. 1972. - Vol. 26 (4). - P. 239-257.

73. Kischkel F.C., Hellbardt S., Behrmann I. et al. Cytotoxicity-dependet APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor // EMBO. 1995. - Vol. 14. - P. 5579-5588.

74. Kiyokawa E., Baba Т., Otsuka N. et al. Spatial and Functional Heterogeneity of Sphingolipid-rich Membrane Domains // J. Biol. Chem. -2006. Vol. 280, № 25. - P. 24072-24084.

75. Klas C., Debatin K.M., Jonker R.R. et al. Activation interferes with the APO-1 pathway in mature human T cells // Int. Immunol. 1993. - Vol. 5. -P. 625-630.

76. Krammer P.H., Behrmann I., Daniel P. et al Regulation of apoptosis in the immune system // Curr. Opin. Immunol. 1994. - Vol. 6 (2). - P. 279-289.

77. Krammer P.H. CD95 (APO-1/Fas)-mediated apoptosis: live and let die // Adv. Immunol. 1999. - Vol. 71. - P. 163-210.

78. Krams S.M., Fox S.K., Beatty P.R. et. al. Human hepatocytes produce an isoform of FAS that inhibits apoptosis // Transplant. 1998. - Vol. 65. - P. 713-721.

79. Kroemer G., Petit P., Zamzami N. et al. The biochemistry of programmed cell death // FASEB J. 1995. - Vol. 9 (13). - P. 1277-1287.

80. Lebedev M.Ju., Novikova N.A., Novikov V.V. Apoptosis of peripheral blood mononuclear cells in patient after a thermal trauma // International. J. Immunorehab. 1999.- № 14.- P. 105-105.

81. Lebedev M.Ju., Ptitsina J.S., Vilkov S.A. et al. Membrane and soluble forms of Fas (CD95) in peripheral blood lymphocytes and in serum from burns patients // Burns 2001. - Vol. 27, № 7. - P. 669-673.

82. Lebedev M.Ju., Sholkina M.N., Utkina T.M. et al. Immunophenotype of peripheral blood lymphocytes in burn patients // Rus. J. Immunol. 2001. -V. 6.-P. 47-54.

83. Lechner H., Amort M., Steger M.M. et al. Regulation of CD95 (APO-1) expression and the induction of apoptosis in human T cells: changes in old age. // Int. Arch. Allergy. 1996. - Vol. 110. - P. 238-243.

84. Lee S.H., Shin M.S., Park W.S. et al. Alteration of Fas (Apo-l/CD95) gene in transitional cell carcinomas of urinary bladder // Cancer Res. 1999. -Vol. 59.-P. 3068-3072.

85. Lei H., Vorechovsky I. Identification of splicing silencers and enhancers in sense Alus: a role for pseudoacceptors in splice site repression // Mol. Cell Biol. 2005. - Vol. 25, № 16. - P. 6912-6920.

86. Levacher M., Hulstaer F., Tallet S. et al. The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrom: staining and prognostic value // Clin. Exp. Immunol. 1992. - № 90. - P. 376.

87. Levade Т., Jaffrezou J. P. Signaling sphingomyelinases: which, where, how and why? // Biochim. Biophys. Acta. 1999. - Vol. 1438. - P. 1-17.

88. Liu С., Cheng J., Mountz J. D. Differential expression of human Fas mRNA species upon peripheral blood mononuclear cell activation // J. Biochem. -1995.-Vol. 310.-P. 957-963.

89. Liu J.H., Wei S., Lamy T. et al. Blockade of Fas-dependent apoptosis by soluble Fas in LGL leukemia // Hematol. 2002. - Vol. 100. - P. 14491453.

90. Liu H., Zhang M., Krainer A.R. Identification of functional exonic splicing enhancer motifs recognized by individual SR proteins // Genes and Dev. -1998.-Vol. 12.-P. 1998-2012.

91. Marusawa H., Hijikata M., Chiba T. et al. Hepatitis С virus core protein inhibits Fas- and tumor necrosis factor alpha-mediated apoptosis via NF-kB activation // J. Virol. 1999. - Vol. 73, № 6. - P. 4713-4720.

92. Medema J.P., Scaffidi C., Kischkel F.C. et al. FLICE is activated by association with the CD95 death-inducing signaling complex (DISC) // EMBO J. 1997. - Vol. 16. - P. 2794-2804.

93. Medema J.P., Toes R.E., Scaffidi C. et al. Cleavage of FLICE (caspase-8) by granzyme В during cytotoxic T-lymphocyte-induced apoptosis // Eur. J. Immunol. 1997. - Vol. 27. - P. 3492-3498.

94. Miyawaki Т., Uehara Т., Nibu R. et al. Differential expression of apoptosis-related Fas antigen on lymphocyte subpopulations in human peripheral blood//J. Immunol.- 1992.-Vol. 149.-P. 3753-3758.

95. Mizutani Y., Yoshida O., Bonavida B. Prognostic significance of soluble Fas in the serum of patients with bladder cancer // J. Urol. 1998. -Vol. 160, №2.-P. 571-576.

96. Murphy Т.J., Paterson H.M., Mannick J.A. et al. Injury, sepsis, and the regulation of Toll-like receptor responses // J. Leuk. Biol. 2004. - № 75.-P. 400-407.

97. Muschen M., Warskulat U., Beckmann M.W. Defining CD95 as a tumor suppressor gene // J. Mol. Med. 2000. - Vol. 78. - P. 312-325.

98. Nagata S. Apoptotic DNA fragmentation // Exp. Cell Res. 2000. -Vol. 256.-P. 12-18.

99. Organ B.C., Antonacci A.C., Chiao J at al. Changes in lymphocyte number and phenotype in seven lymphoid compartments after thermal injury // Ann. Surg. 1989 . - Vol. 210 . - P. 78-89.

100. Owen-Schaub L.B., Yonehara S„ Crump W.L. et al. DNA fragmentation and cell death is selectively triggered in activated human lymphocytes by Fas antigen engagement // Cell Immunol. 1992. - Vol. 140.-P. 197-205.

101. Owen-Schaub L. Soluble Fas and cancer // Clin. Cancer. 2001. -Vol. 7.-P. 1108-1109.

102. Papoff G., Cascino I., Eramo A. et al. An N-terminal domain shared by Fas/Apo-1 (CD95) soluble variants prevents cell death in vitro // J. Immunol. 1996. - Vol. 156. - P. 4622-4630.

103. Papoff G., Hausler P., Eramo A. et al. Identification and characterization of a ligand-independent oligomerization domain in the extracellular region of the CD95 death receptor // J. Biol. Chem. 1999. -Vol. 274, № 53. - P. 38241-38250.

104. Peter M.E., Legembre P., Barnhart B.C. Does CD95 have tumor promoting activities // Biochim et Biophys. Acta. 2005. - Vol. 1755. - P. 25-36.

105. Pinkoski M.J., Brunner Т., Green D.R. et al. Fas and Fas ligand in gut and liver // Am. J. Physiol. Gastrointest. 2000. - Vol. 278. - P. 354-366.

106. Proussakova O.V., Rabaya N.A., Moshnikova A.B. et al. Oligomerization of Soluble Fas Antigen Induces Its Cytotoxicity // J. Biol. Chem. 2003. - Vol. 278, № 38. - P. 36236-36241.

107. Puiu L., Petrakou E., Apostolidou A. et al. Lack of Fas (Apo-l/CD95) gene structural alterations or transcript variant ratio changes in breast cancer // Cancer Letters. 2003. - Vol. 194. - P. 91-97.

108. Rathmell J.C., Thompson C.B. The central effectors of cell death in the immune system // Annu. Rev. Immunol. 1999. - Vol. 17. - P. 781828.

109. Reed J.C., Doctor K.S., Goldzik A. The domain of apoptosis: a genomic perspective // Sci. STKE. 2004. - Vol. 239. - P. 1-29.

110. Rokita E., Menzel EJ. Characteristics of CD 14 shedding from human monocytes. Evidence for the competition of soluble CD 14 (sCD14) with CD14 receptors for lipopolysaccharide (LPS) binding // APMIS. 1997. -Vol. 105 (7).-P. 510-518.

111. Rosse Т., Olivier R., Monney L. et al. Bcl-2 prolongs cell survival after Bax-induced release of cytochrome С // Nature. 1998. - Vol. 391. -P. 496-499.

112. Rudert F., Moloney S., Lindridge E. et al. Transcription factors regulating CD95/fas gene expression // Cancer Detect, and Prevent. 2000. -Vol. 24.-P. 3373-3474.

113. Ryo K., Kamogawa Y., Ikeda I. et al. Significance of Fas antigen-mediated apoptosis in human fulminant hepatic failure // Am. J. Gastroenterol. 2000. - Vol. 95, № 8. - P. 2047-2055.

114. Sacco R., Leuci D., Tortorella C. et al. Transforming growth factor betal and soluble Fas serum levels in hepatocellular carcinoma // Cytokine -2000. Vol. 12, № 6. - P. 811-814.

115. Sarraf C.E., Bowen I.D. Kinetic studies on a murine sarcoma and an analysis of apoptosis // Brit. J. Cancer. 1986. - Vol. 54 (6). - P. 989-998.

116. Sato Т., Irie S., Kitada S. et al. FAP-1: a protein tyrosine phosphatase that associate with Fas // Science. 1995. - Vol. 268. - P. 411-415.

117. Sato M., Konuma Т., Yanagisawa N. et al. Fas-Fas ligand system in the peripheral blood of patients with renal diseases // Nephron. 2000. -Vol. 85,№2.-P. 107-113.

118. Schedlowski M. Stress, Stress Hormones and the Immune System // Immunol. Today. 1998. - № 19. - 535 p.

119. Schleter В., Konig W., Koller M. et al. Studies on B-lymphocyte dysfunctions in severely burned patients // J. Trauma. 1990. - Vol. 30, № 11.-P. 1380-1389.

120. Schleter В., Konig W, Koller M. at al. Differential regulation of T-and B-lymphocyte activation in severely burned patients // J. Trauma. -1991.- Vol. 31, №2.-P. 239-246.

121. Schneider P., Bodmer J.L., Holler N. et al. Characterization of Fas (Apo-1, CD95)-Fas ligand interaction // J. Biol. Chem. 1997. - Vol. 272, №30.-P. 18827-18833.

122. Schwerk C., Schulze-Osthoff K. Regulation of apoptosis by alternative pre-mRNA splicing // Mol. Cell. 2005. - Vol. 19. - P. 1-13.

123. Sheen-Chen S.M., Chen H.S., Eng H.L. et al. Circulating soluble Fas in patients with breast cancer // World J. Surg. 2003. - Vol. 27. - P. 10-13.

124. Shimaoka Y., Hidaka Y., Okumura M. et al. Serum concentration of soluble Fas in patients with autoimmune thyroid diseases // Thyroid. 1998. -Vol. 8, № 1. - P. 43-47.

125. Shimizu S., Eguchi Y., Kamiike W. et al. Bcl-2 prevents apoptosis mitochondrial dysfunction by regulating proton flux // Proc. Natl. Acad. Sci USA.-1998.-Vol. 95.-P. 1455-1459.

126. Silvestris F., Cafforio P., Frassanito M.A. et al. Overexpression of Fas antigen on T cells in advanced HIV-1 infection: differential ligation constantly induces apoptosis//AIDS.-1996.-Vol. 10.-P. 131-141.

127. Simons K., Ehehalt R. Cholesterol, lipid rafts, and disease // J. Clin.Invest. 2002. - Vol. 110. - P. 597-603.

128. Sparkes B.G. Immunolological responses to thermal injury // Burns. -1997.- Vol.23,№2.-P. 106-113.

129. Stamm S., Ben-Ari S., Rafalska I. et al. Function of alternative splicing // Gene. 2005. - Vol. 344. - P. 1-20.

130. Suda Т., Takahashi Т., Tanaka M. et al. Molecular cloning and expression of the Fas ligand, a novel member of the tumor necrosis factor family // Cell. 1993. - Vol. 75. - P. 1169-1178.

131. Stennicke H.R., Salvesen G.S. Caspases controlling intracellular signals by protease zymogen activation // Biochim. Biophys. Acta. - 2000. -Vol. 1477.-P. 299-306.

132. Suda Т., Hashimoto H., Tanaka M. et al. Membrane Fas ligand kills human peripheral blood T-lymphocytes, and soluble Fas ligand blocks the killing // Exp. Med. 1997. - Vol. 186. - P. 2045-2050.

133. Takashima H., Nakajima Т., Moriguchi M. et al. In vivo expression patterns of survivin and its splicing variants in chronic liver disease and hepatocellular carcinoma // Liver Intern. 2005. - Vol. 25. - P. 77-84.

134. Tanaka M., Suda Т., Takahashi T. et al. Expression of the functional soluble form of the human Fas ligand in activated lymphocytes // EMBO. -1995.-Vol. 14.-P. 1129-1135.

135. Teodorczyk-Injeyan J.A., Sparkes B.G., Mills G.B. et al. Impaired expression of interleukin-2 receptor (IL2R) in the immunosuppressed burned patient: reversal by exogenous IL2 // J. Trauma. 1987. - Vol. 27, № 2. - P. 180-187.

136. Taupin J., Tian Q., Kedersha N. et al. The RNA-binding protein TIAR is translocated from the nucleus to the cytoplasm during Fas-mediated apoptotic cell death//Cell Biol. 1995.-Vol. 92.-P. 1629-1633.

137. Teodorczyk-Injeyan J.A., Cembrzynska-Nowak M., Lalani S. et al. Immune deficiency following thermal trauma is associated with apoptotic cell death // J. Clin. Immunol. 1995. - Vol. 15, № 6. - P. 318-328.

138. Thonel A., Eriksson J.E. Regulation of death receptors relevance in cancer therapies // Toxicol, and Applied Pharmacol. - 2005. - Vol. 207. - P. 123-132.

139. Thornberry N.A., Lazebnik Y. Caspases: enemies within // Science.1998.-Vol. 281.-P. 1312-1316.

140. Tortorella C., Sacco R., Orlando P. et al. sICAM-1, sCD95 and sCD95L levels in chronic liver diseases of different etiology // Immunopharmacol. Immunotoxicol. 2000. - Vol. 22, № 1. - P. 19-33.

141. Toyoda M., Kakizaki S., Horiguchi N. et al. Role of serum soluble Fas/soluble Fas ligand and TNF-alpha on response to interferon-alpha therapy in chronic hepatitis С // Liver. 2000. - Vol. 20, № 4. - P. 305-311.

142. Trauth B.C, Klas C, Peters A.M. et al. Monoclonal antibody-mediated tumor regression by induction of apoptosis // Science. 1989. - Vol. 245 (4915).-P. 301-305.

143. Walczak H., Krammer P.H. The CD95 (APO-l/Fas) and the TRAIL (APO-2L) apoptosis systems // Exp. Cell Res. 2000. - Vol. 256 (1). - P. 58-66.

144. Wesche D.E., Lomas-Neira J.L., Perl M. et al. Leukocyte apoptosis and its significance in sepsis and shock // J. Leukoc. Biol. 2005. - Vol. 78, №2.-P. 325-337.

145. Wood C.M., Goodman P.A., Vassilev A.O. et al. CD95 (Apo-l/Fas) deficiency in infant acute lymphoblastic leukemia: detection of novel soluble Fas splice variants // Eur. J. Haematol. 2003. - Vol. 70. - P. 156171.

146. Yamada Y., Shigeatsu E., Hajime N. et al. Examination of soluble Fas ligand (sFasL) in patients with burns // Burns. 2003. - Vol. 29. - P. 799802.

147. Yonehara S., Ishii A., Yonehara M. A cell-killing monoclonal antibody (anti-Fas) to a cell surface antigen codownregulated with the receptor of tumor necrosis factor // Exp. Med. 1989. - Vol. 169. - P. 17471756.

148. Yoshino Т., Kondo E., Cao L. et al. Inverse expression of bcl-2 protein and Fas antigen in lymphoblasts in peripheral lymph nodes and activated peripheral blood T and В lymphocytes // Blood. 1994. - Vol. 83. -P. 1856-1861.

149. Zamzani N., Marchetti P., Castedo M. et al. Sequencial reduction of mitochondrial transmembrane potential and generation of reactive oxigen species early programmed cell death // Exp. Med. 1995. - Vol. 182. - P. 367-377.

150. Zipp F., Otzelberger K., Dichgans J. et al. Serum CD95 of relapsing remitting multiple sclerosis patients protects from CD95-mediated apoptosis //J. Neuroimmunol. 1998. - Vol. 86, № 2. - P. 151-154.

Информация о работе

Уткин, Олег Владимирович
кандидата биологических наук
Нижний Новгород, 2007
ВАК 03.00.04

Диссертация

Сравнительный анализ экспрессии гена белка Fas в клетках человека при различных альтерирующих воздействиях на организм - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы