Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Селекция ЛАК клетками белка Tag7 человека, клонирование и изучение соответствующего гена

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Миркина, Ирина Ильинична, Москва



/

/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ ГЕНА

На правах рукописи УДК 577.1+599.323.4

МИРКИНА ИРИНА ИЛЬИНИЧНА

СЕКРЕЦИЯ ЛАК КЛЕТКАМИ БЕЛКА TAG7 ЧЕЛОВЕКА, КЛОНИРОВАНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ СООТВЕТСТВУЮЩЕГО ГЕНА

специальность 03.00.03- молекулярная биология

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научные руководители:

член-корреспондент РАН, доктор биологических наук Н. В. Гнучев

кандидат биологических наук С. Л. Киселев

МОСКВА

1999

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ-.................-...............................-7

ВВЕДЕНИЕ-..................................................................9

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Основной принцип врожденного и приобретенного иммунного ответа-------------------------------------------------......—-----------10

2 Рецепторы, вовлеченные в неклональный иммунный ответ

2.1 Общая характеристика------------------------------------------------11

2.2 Семейство Toll/IL-IR..................................................13

3 Белковые факторы, продуцируемые в процессе иммунного ответа: сигналы опасности

3.1 Прямое цитолитическое действие на чужеродный антиген-----------18

3.2 Хемоаттракция (хемотаксис)—........-------------------------------22

3.3 Стимуляция клепальных Т- и В- лимфоцитов и

клеток врожденного иммунитета------------------------------------22

4 Роль сигналов опасности в противоопухолевом иммунитете:

4.1 ЛАК клетки как in vitro модель для изучения противоопухолевого иммунитета............................................................24

4.2 Причины иммунологической толерантности организма в отношении опухолей----------------------------------—-----------------------------25

4.3 Механизм повышения иммуногенности с помощью сигналов

опасности---------------------------------------------------------------28

5 Индукция программированной гибели клеток-мишеней,

пораженных чужеродным антигеном: 5. 1 Классификация механизмов клеточной гибели:

некроз и апоптоз------------------......................................31

5.2 Основные признаки апоптоза--------------------------------------------33

5.3 Основные механизмы трансдукции апоптотического сигнала:

5.3.1 Роль адапторных молекул в апоптозе---------------------------------34

5.3.2 Эффекторные молекулы: идентификация, пути активации и осуществления эффекторных функций в процессе апоптоза-----------38

5.4 Регуляция "апоптотической программы": ингибиторы и активаторы апоптоза и их значение для организма—---------------------------------43

ЗАКЛЮЧЕНИЕ-.................-...........................................52

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ:

-Ферменты и реактивы------------------------------г----------------------55

-Агарозный гель-электофорез ДНК------------------------------—..........55

-Реакция обратной транскрипции и амплификация фрагментов кДНК

tag 7-........................................................................55

-Плазмидные и фаговые векторы-----------------------------------......—56

-Штаммы бактерий---------------------------------------------------------57

-Трансформация клеток Е. coli плазмидной ДНК----------------------------57

-Выделение плазмидной ДНК-------------------------------------------------59

-Определение первичной последовательности ДНК---------------------------60

-Выделение тотальной РНК..........-...............................-.....61

-Выделение хромосомной ДНК и приготовление образцов

хромосомной ДНК для Саузерн-блот-гибридизационного анализа-----------61

-Выделение фаговой ДНК-.............................................-.....62

-Нозерн- и Саузерн- блот гибридизационный анализ.........-.........-.....64

-Конструирование геномной человеческой библиотеки-----------------------67

-Приготовление бактериальных штаммов, определение

титра и амплификация библиотеки----------------------------------------68

-Скрининг библиотеки.....-..........................-......----------------70

-Клонирование, экспрессия и выделение рекомбинантного

интерлейкина 2--------------------------------------------------------------72

-Получение поликлональной антисыворотки к белку Tag7--------------------74

-Очистка политональных Tag7-специфических антител-...................75

-Выделение и культивирование лейкоцитов периферической

крови и ЛАК клеток человека------------------------------------------------76

-Культивирование трансформированных клеточных линий------------------77

-Определение цитолитической активности----------------------------------78

-Изучение фрагментации ДНК клеток-мишеней-----------------------------78

-Иммуногистохимический анализ--------------------------------------------79

-Иммунофлуоресцентный анализ---------------------------------------------80

Иммунопреципитация Tag 7-подобного иммунореактивного белка из клеточных лизатов и кондиционной среды-------------------------80

-Электрофорез белков в полиакриламидном геле и Вестерн-блот анализ----81

-Иммуноаффинная хроматография Tagl-иммунореактивного белка--------84

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ:

- Мышиный ген tag 7 имеет своего человеческого гомолога-------------------86

- Идентификация и клонирование фрагмента

кодирующей ДНК гена tag 7 человека---------------------------------------87

- Клонирование полноразмерной к ДНК человеческого tag 7--------------------90

- Идентификация геномной копии tag7 человека-----------------------------93

- Изучение геномной организации tag7 человека. Сравнительный анализ геномных копий человеческог и мышиного tag 7-----------------------------94

-Иммуногистохимический и иммунофлуоресцентный анализ экспрессии

Tag 7 в тканях и органах человека-----------------------------------------98

-Изучение экспрессии мРНК tag 7 в лейкоцитах периферической крови и

лимфокин- активированных киллерах человека-----------------------------106

-Анализ белков супернатанта ЛАК клеток с помощью Вестерн-блот

анализа с антителами к Tag7---------------------------------------------109

-Ингибирование цитолитической активности супернатанта

ЛАК клеток антителами к Tag7----------------------------------------—115

-Нуклеосомальная фрагментация ДНК клеток-мишеней, индуцированная супернатантом ЛАК клеток и ее ингибирование

антителами к Tag7-.......................................................117

-Хроматографическое выделение Tag7- иммунореактивного

белка на иммуно аффинном сорбенте------------------------........-.....-119

ВЫВОДЫ-..................................................................124

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ-..................................................126

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ:

АПК- антиген-презентирующие клетки

ЕК- естественные киллеры

ЦТЛ- цитотоксические Т-лимфоциты

МНС класса I и II- major histocompatibility complex -главный комплекс гистосовместимости класса I и II Т|,- Т- хелперы

ЛАК - лимфокин-активированные киллеры LPS- липополисахариды

ПАМП -патоген-ассоциированный молекулярный паттерн.

ПРР- паттерн-распознающие клеточные рецепторы

IFNy- интерферон у

IL-1 - интерлейкин 1

IL-1R- рецептор интерлейкина 1

IL-2- интерлейкин2

DD- death domain- домен смерти

DED- death effector domain- эффекторный домен смерти

FASL- FAS лиганд

TNF- фактор некроза опухолей

TCR- Т-клеточный рецептор

sFASL- секретируемая форма FAS лиганда

FADD- FAS-associated death domain, FAS- ассоциированный домен смерти TRADD- TNF receptor-associated death domain- домен смерти, ассоциированный с рецептором TNF.

ICE -interleukin-ip converting enzyme- интерлейкин-lp-конвертирующий фермент

FLICE/ MORT1 - FADD-Iike IL-lp- converting enzyme- FADD- родственный

IL-1 p- конвертирующий фермент, каспаза-8

CAD -каспаз-активированная дезоксирибонуклеаза

FLIPs- FLICE-inhibitory proteins- FLICE- ингибирующие белки

EST- expression sequence tag

TAE- Tris-acetate-EDTA buffer

TBE- Tris- borate-EDTA- buffer

ПААГ- полиакриламидный гель

SDS- sodium dodecylsulfate, додецилсульфат натрия

ВВЕДЕНИЕ

Одной из наиболее актуальных проблем современности является рост заболеваний, связанных с дисфункционированием иммунной системы организма. В связи с этим приоритетной задачей молекулярной биологии и медицины является изучение молекулярных механизмов иммунитета.

Известны два вида иммунитета, сформировавшиеся в процессе эволюционного развития: врожденный и приобретенный. Врожденный иммунитет в той или иной форме присутствует во всех многоклеточных организмах и является филогенетически более древней системой, тогда как приобретенный иммунитет, сложившийся значительно позднее, характерен преимущественно для млекопитающих.

Приоритет в иерархии иммунных функций традиционно отдавался приобретенному иммунитету. Однако в настоящее время установлено, что врожденный иммунитет не менее важен для осуществления иммунного ответа. Более того, только координированная работа обеих форм иммунитета обеспечивает надежную защиту организма от бактериальной, грибковой, вирусной инфекций и злокачественных новообразований.

Изучение и клонирование генов, вовлеченных в работу врожденного и приобретенного иммунитета позволяет глубже понять механизм работы иммунитета в норме и причины сбоев в этом механизме, характерные для различных патологий.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1 Основной принцип врожденного и приобретенного иммунного ответа.

Защита организма от вредоносного воздействия патогенных бактерий, вирусов и злокачественных образований осуществляется клетками иммунной системы.

Приобретенный иммунный ответ опосредован Т- и В-лимфоцитами, имеющими клонально-распределенные антигенные рецепторы, что позволило обозначить данный вид иммунитета как специфический (1-4). В результате соматической реорганизации генов иммуноглобулинов на поверхности Т- и В- лимфоцитов образуется около 10п клонов, экспрессирующих различные антигенные рецепторы. Они распознают антиген, представленный на поверхности антиген-презентирующих клеток ( АПК) в комлексе с МНС типа I и II. В результате клоны лимфоцитов, имеющие рецептор соответствующей афинности пролиферируют и развиваются в эффекторные клетки: Т-хелперы, Т-киллеры, плазматические В-клетки (4). Такой механизм распознавания антигена, известный как клональная селекция, коренным образом отличает приобретенный иммунитет от врожденного (неклонального, неспецифического) иммунитета.

Врожденный иммунитет реализуется с помощью широкого спектра клеток иммунной системы: макрофаги, нейтрофилы, дендритные клетки, отдельные субпопуляции Т-лимфоцитов (уб Т-лимфоциты), естественные

киллеры (1-5). Все они характеризуются отсутствием клонально-распределенных рецепторов и распознают характерные структуры патогена, в частности, липополисахариды, тейхоевые кислоты, пептидогликаны, двухспиральную РНК, объединенные общим термином ПАМП (патоген-ассоциированный молекулярный паттерн).

Роль таких клеток состоит в индукции первичного иммунного ответа (или воспаления). Этот ответ индуцируется при взаимодействии ПАМП с паттерн-распознающими клеточными рецепторами (ПРР) (1, 2, 3). 2 Рецепторы , вовлеченные в неклональный иммунный ответ. 2.1 Общая характеристика

В отличие от клональных рецепторов, кодируемых исключительно иммуноглобулинами, ПРР принадлежат к различным семействам белков, причем не для всех известных в настоящий момент рецепторов установлены функции и соответствующие лиганды. Среди них можно выделить несколько групп, в том числе ( 3):

1 С-лектины, включая коллектины и рецепторы экспрессируемые ЕК (Ly49A-G, NKR-P1), макрофагами и дендритными клетками (макрофагальный С-лектин, макрофагальный маннозный рецептор DEC 205) . Рецепторы данной группы связывают широкий спектр бактериальных и вирусных полисахаридов и опосредуют фагоцитоз, опсонизпацию, активацию комплемента (лектиновый путь), цитолитические функции, в том числе противоопухолевую активность макрофагов, а также секрецию

IFN-y. Маннозный рецептор макрофагов и дендритных клеток ответственен за интернализацию бактериальных антигенов, их транслокацию к МНС П-содержащим мультивезикулярным эндосомальным компартментам для последующей презентации Т-хелперам. Субпопуляции ЕК, несущие лектин-подобный рецептор вовлечены в распознавание и цитолиз клеток-мишеней. Кроме того, рецепторы ЕК Ly49A и Ly49C опосредуют негативную регуляцию цитолитической активности ЕК, взаимодействуя с МНС класса I.

2 Пентраксины. Являясь компонентами острой фазы иммунного ответа, они продуцируются в печени и высвобождаются в плазму крови в ответ на патогены. Лигандами пентраксинов являются фосфатидилхолин и компоненты бактериальной клеточной стенки, взаимодействие которых с рецептором индуцирует опсонизацию и активацию комплемента.

3 Интегрины. Эти рецепторы экспрессируются макрофагами, дендритными клетками, ЕК и Т клетками, их лигандом является LPS. Показано участие интегринов в фагоцитозе и межклеточных взаимодействиях, в частности адгезии.

4 Липидные трансферазы. Как и пентраксины, они синтезируются в печени, попадая в плазму крови во время острой фазы иммунного ответа. Взаимодействуя с LPS, они опосредуют антибактериальный ответ

5 Лейцин-богатые белки (Leucine-rich-regions, LRR ). К этой группе относятся множество ПРР, среди которых можно выделить семейство рецепторов Toll/IL-1. 2.2 Семейство Toll/IL- IR

Интенсивное изучение механизмов природного иммунитета первоначально было связано с использованием в качестве удобной для анализа модели организмов, характеризующихся отсутствием приобретенного иммунитета. Такой моделью стали насекомые, в частности, дрозофила. Было установлено, что индукция иммунного ответа против инфекций у дрозофилы осуществляется с помощью белка Spazle при его взаимодействии с идентифицированным трансмембранным рецепторным белком, обозначенным как Toll (dToll). Взаимодействие Toll с лигандом Spazle активирует два внутриклеточных белка-ТиЬе и Pelle (2, 6). Точная функция Tube не установлена, однако он рассматривается как адаптор, опосредующий активацию серин-треониновой киназы Pelle посредством транслокации Pelle к внутренней поверхности мембраны. С помощью промежуточной киназы активный Pelle индуцирует фосфорилирование гомолога IkB - Cactus, являющегося ингибитором цитоплазматического комплекса Cactus-Dorsal. Индуцированная фосфорилированием деградация Cactus вызывает высвобождение Dorsal и его транслокацию в ядро, где он активирует транскрипцию генов противомикробных пептидов (2, 6).

Сравнительный анализ путей транедукции сигналов, инициируемых патогенами у дрозофилы, млекопитающих и растений показал, что Toll-опосредуемый сигнал обладает эволюционной консервативностью. В частности, была установлена аналогия Toll/ Dorsal- сигнала транедукции с сигналом, опосредуемым IL-1R в клетках млекопитающих (7).

IL-1 является цитокином, продуцируемым различными типами клеток при повреждении тканей и инфекции и опосредующим воспалительный процесс. Три лиганда- IL-la, IL-1(3 и антагонист рецептора IL-1 (IL-1га) - связываются с тремя формами рецептора IL-1: IL-1R типа I (IL-1RI, 80 кДа), IL-1R типа II (IL-1RII, 68 кДа) и секретируемой формой IL-1R типа II (sIL-lRII). Цитоплазматическая область IL-1RI состоит из 213 аминокислот и именно она ответственна за проведение сигнала, в то время как цитоплазматическая область IL-1RII содержит лишь 29 аминокислот и не способна транедуцировать сигнал. Было обнаружено, что цитоплазматическая область IL-1RI человека и аналогичная область рецептора Toll дрозофилы обладают значительной степенью гомологии (6). Сайт-направленный мутагенез и делеционный анализ позволили обозначить внутри цитоплазматической области район, опосредующий передачу сигнала и являющийся общим для Toll и IL-1R. В действительности, было установлено, что стимуляция клеток, экспрессирующих IL-1R интерлейкином а или р индуцирует активацию Pelle- подобной киназы

IRAK с последующей деградацией комплекса NFkB- IkB, гомологичного Dorsal- Cactus и активацией NFkB (8).

В то же время необходимо отметить, что в отличие от лейцин-богатой (LRR) внешней, N- концевой, последовательности Toll рецептора внешняя область IL-1R представляет собой три иммуноглобулиновых домена (7, 8).

Было идентифицировано несколько генов дрозофилы, имеющих гомологию с цитоплазматической областью Toll и IL-1R: 18- wheeler, tir (Toll-like receptor) и MstProx (6-10). Помимо известной роли wheeler и tir в эмбриогенезе предполагают, что эти гены вовлечены в межклеточные взаимодействия, в частности, они могут быть молекулами адгезии . Однако эти функции находятся в стадии изучения.

Основываясь на важной роли, отводимой dToll в процессах развития и иммунной регуляции был проведен поиск по компьютерным базам данных EST с целью идентификации последовательностей человеческих генов, проявляющих гомологию с Toll/ IL-IR. В результате был идентифицирован и охарактеризован человеческий гомолог dToll (10). Подобно dToll человеческий Toll (hToll) является трансмембранным белком типа I с лейцин-богатой (LRR) N-концевой областью, гомологичной dToll и цитоплазматической областью, гомологичной Toll/ IL-IR.

Анализ профиля эспрессии hToll в различных органах и тканях установил преимущественную эспрессию мРНК hToll в лейкоцитах периферической крови- моноцитах, макрофагах, дендритных клетках, Т-

клетках и клетках селезенки. Детектируемая незначительная экпрессия в других тканях как предполагается, связана с присутствием в них макрофагов и дендритных клеток (10).

С помощью химерной конструкции, постоянно экспрессирующей активный hToll была показана индукция NFkB и экспрессия генов иммунного ответа, находящихся под контролем NFkB.

За последнее время путем компьютерного поиска был найден ряд генов млекопитающих, гомологичных Toll и IL-1R и составляющих растущее семейство Toll/ IR-1R-подобных генов: человеческие TIL, TLR (Toll-like receptor)l-5, человеческий и мышиный MyD88, мышиный T1/ST2 (11-16).

TIL и TLR характеризуются дифференциальной экспрессией. Транскрипт TLR1 был найден в яичниках и селезенке, а также в лимфоме Буркитта. мРНК TLR2 и TLR3 была детектирована в легких, сердце, мозге и мышцах, TLR3 также присутствует в плаценте и поджелудочной железе. Транскрипты TLR4 и TLR5 исключительно тканеспецифичны: TLR4 обнаруживается только в плаценте, а слабый сигнал TLR5