Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ГРИБОВ СЕМЕЙСТВА СНОАНМНОНАСК В ПРОЦЕССЕ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ И КОМПОНЕНТОВ КЛЕТОЧНОЙ СТЕНКИ ГРИБОВ СЕМЕЙСТВА СНОАНМНОНАСК В ПРОЦЕССЕ ДИФФЕРЕНЦИАЦИИ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

йектитут июкеиодоти

На правах рукописи

ТБРЕОИНАВврааихаАловжа

УДК 582.281.213:579.22/234

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СТРУКТУРЫ ИКСЫПОНВНТОВ КЯЕТСЯШЙ CÜEHKH ГРИБОВ СШЁЙСТВА ШОАКЕШОШвШ , В ПРОЦЕССЕ да»ЕРЕНШАЦИИ

( 03.00.(77 - минро0иолояя )

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой с тетях кандидата 0я<хяопгаесн*х вдук

Москва - ISB3 г. '

Работе выполнена в Институте микробиология АН СССР -

: Научный руководитель: доктор;биологических наук Е.П.Феофиова

Официальные оппонента: - доктор биологических жаукИ.Б.Наумова-

доктор бнологвчвсвах наук В.И.Дуда

Ведущее учреждение - Институт биохимии я ^взиодогии микроорганизмов АН СССР

Занята состоится "/о" 1983 г. в ¿Г часов

на заседания Сжциализированного совета Д.008.64.01 в институте микробиология АН СССР. Адрес: 1X7312, г. Москва, щюсдакт 60-летия Октября, д. 7, корп. 2. Ученый совет ИШИ АН СССР.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Институте микробиологии АН СССР.

Автореферат разослан " У " г. ; . .

Ученый секретарь - . _ '■-'.''

стщалнзкрованното совета ; к.б.н. Л.Н.Москаленко

Актуальность проблемы. Интенсивное изучение клеточных стенок грибов началось относительно недавно - в шестидесятых годах, после того, как были разработаны надежные методы выделения клеточных стенок и способы оценки их чистого. Длительное время клеточную стенку 1рибов рассматривали как инертную структуру, выполняицух только опорную функцию. Однако исследования последних лет позволили установить ряд новых функций клеточных стенок грибов. Показано, например, что клеточная стенка может служить в условиях голодания источником запасных веществ ( Wessela, Sietsna , 1979). 06-наруженн гядролазн, иммобилизованные в клеточной стенке (ноtariо et.ai. , 1979). Появились сведения о<3 участии клеточной стенки в транспорте веществ ( Ooo&ar . 1978). Таким образом, по современным гдредставлениям клеточная стенка грибов является структурой, активно участвующей в жизни клетки.

Однако лишь единичные исследования посвящены изучению роли клеточной стенки в морфогенезе грабов. Морфогенез мицелиальных грибов имеет уникальную особенность, обусловленную верхушечным (апикальным) способом роста. Особый интерес представляют мукоровне грибы, у которых в процессе онтогенеза клеточная стенка дважды образуется de novo ( Crov» , 1976). В связи с этим исследование клеточной стенки в процессе дифференциации мукоровых грибов представляет особый интерес для изучения взаимосвязи морфогенеза с составом и структурой клеточных стенок.

Исследование клеточных стенок грибов представляет интерес и для современной хемоси с теыати кн, так как состав основных полисахаридов является важным таксономическим кри терием ( б artni old-Carola, 1970). Поэтому в настоящей работе бшга поставлена также задача рассмотреть спорный вопрос о систематическом положении грибов рода Cimninghamella , используя данные сравнительного иссле-

дования состава клеточных стенок грибов семейства сьоааерьога-ое&е . В состав этого семейства входят три рода - Choanephora, Elate ale а и ftumi ugh ante IIa ( Fitspatrick! 1930; Кирсанов с соавтор., 1954; ггвьа et. ai, , 1969). Так как состав меточных стенок некоторых представителей родов choaaephora И Blakeslea частично изучен, то основным объектом для исследования клеточных стенок в процессе дифференциации был выдран один из представителей рода Cunningham« 11* - с. J арoniea,Состав клеточных стенок грибов этого рода к началу настоящего исследования не был изучен. В качестве od-ьекта для сравнения использован гриб в. tri яро га , клеточные стенка которого изучали только на тех стадиях онтогенеза, которые предвтавляяи интерес для сравнения.

Исследование состава клеточных стенок имеет'важное значение не только для изучения морфогенеза, систематика и филогении грибов. Клеточная отенка грибов представляет интерес для фактики как источник природных полисахаридов. Одним из таких природных полисахаридов является хитин - основной компонент клеточных стенок мукоровых хрибов. Этот полисахарид и его производные находят в настоящее время применение как антикоагулянты крови, адсорбенты в афинной и ионообменной хроматографии, заменителя целдхло-за в бумажной л текстильной промышленности, полимерные красители. Поэтому изучение состава клеточных стенок хрибов и свойств их основных полисахаридов будет способствовать более широкому использованию природных биополимеров в народном хозяйстве.

Цель и задачи исследования. Цель» настоящей работы являлось сравнительное изучение состава н структуры клеточных стенок грибов семейства Ciioanephoraoeae в процессе дифференциация.

В задачи исследования входило:

I. Определить состав клеточных стенок гиф c.japonioa и

Б.trispoга . Выяснить, какие изменения наблюдаются в клеточных стенках в процессе роста грибов.

2. Провести изучение клеточных стенок спороносцев и спор.

3. Сравнить действие полового гормона - триспоровых кислот на морфолога» мицелия и состав клеточных стенок тиф с.japónica и B.trlepore.

4. Выяснить, как согласуются полученные результаты сравнительного изучения состава клеточных стенок грибов семейства толпе рЬо rao еав с систематическим положением грибов рода Cannln-ghamella.

5. Провести сравнительное изучение основного компонента клеточных стенок - хитина - у C.Japonioft , B.tri8pora , других микроскопических грибов о хитином краба Cáncer maglster .

Натчная новизна работа. Впервые показано, что на всех изученных этапах дифференциации С.Japónica и В. trl вро га клеточная стенка является динамической по составу структурой. Количественные или качественные изменения в составе клеточной стенки обусловлены особенностями генезиса этой структуры в процессе онтогенеза.

Впервые для мицелиалышх грибов показано; что в процессе роста наблюдается изменение морфологии клеточной стенки, связанное с изменением в ее составе содержания хитина и белка. Обнаружены различия в качественном составе стенок спор и гиф. Получены новые данные о различиях в соотношении компонентов клеточных стенок гиф и спороносцев. Впервые установлено, что морфогенетическое действие триспоровых кислот связано с определенными изменениями в составе клеточных стенок гиф С.Japónica и B.trlspora .

В настоящей работе впарвые для рассмотрения спорного воцроса о систематическом положении грибов рода CmmingbameHa использо-

ваш в качестве дополнительного критерия данные о составе клеточных стенок. Сравнительное изучение состава клеточных стенок гиф, спороносцев и спор С, ¿ароп1са позволяет заключить, что этот микроскопический гриб не отличается по составу основных полисахаридов, а также по тицу бесполого размножения от других грибов семейства СЬоапврЬогю«».« . полученные результаты ставят под сомнение необходимость выделения грибов рода сшш1пвЬвте11а из семейства СЬоаперЬогвевм в отдельное семейство СшщтгЬаавИасеав.

Впервые проведено сравнительное изучение образцов хитина некоторых микроскопических грибов с хитином краба. В результате исследования сделан вывод о том, что микроскопические грибы могут быть использованы в качестве природного источника для получения хитина. Разработан метод выделения хитина из биомассы микроскопических грибов.

Практическая данность исследования. Сравнительное изучение состава клеточных стенок грибов семейства сьеаперЬогаоеае в процессе онтогенеза позволило получить новые данные, которые могут быть использованы для уточнения систематического положения грабов рода Сплп1п££1ьпе11*,

Разработаны метода выделения чистых фракций клеточных стенок гиф, спороносцев и спор, которые могут найти применение в биохимии и микробиологии.

Проведено сравнительное изучение образцов хитина микроскопических, грибов о хитином краба. Результаты показывают, что микроскопические 1рибы могут быть использованы в качестве источника для получения хитина. Полученные данные использованы при разработке метода выделения хитина из биомассы грибов, на который получено авторское свидетельство. Метод прошел 'апробацию на Московском химическом заводе им. П.Л.Войкова. Подученный продукт - хи-

тик микроскопических грибов - имеет ТУ - 6-09 05-898-78.

Апробапия работы. Основные положения диссертации докладывались на конференции молодых спеииалисгов ШШ АН СССР, посвященной 60-летию Советской власти (1977); на все союзной конференции по онтогенезу микроорганизмов {Лувдяо-на-Оке, 1978); на заседании кафедры низших растений МГУ им. Ы .В .Ломоносова (1980); на заседании секции "Биологачесхи активные соединения" Московского отделения ВЫО (1982).

г^бликят^тд. По теме диссертации опубликована пять работ и получено одно авторское свидетельство.

Структура и объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, экспэриментальной части с обсуждением результатов в каждой главе, заключения, выводов а списка литературы. Работа изложена на 123 страницах, иллюстрирована 8 таблицами и 42 рисунками. Список цитируемой литературы вшчает 180 работ - 27 на русском и 153 на иностранных языках.

Экспериментальная часть А. Материалы а методы исследования Основными объектами исследования служили ге тероталличные му-коровые Грибы Cunninghamslla Japoniea BKMF I204C-), I205C+) и Blakeslea -triepora BKUF 987(-), 70I(+).

Микроскопические грибы культивировали на среде Гудцэина ( carton at, , 1951) и № 12 (Бехтерева, Дедшхина, 1967). Споронос-цы и споры выращивали на поверхности суслового агара в специальных лотках.

Выделение фракций клеточных стенок шф, спор а спороносцев проводили методом дифференциального центрифугирования. Материал разрушали методом твердого давления на прессе Хыэза. Неразрушен-

ные сюры отделяли путем центрифугирования в 3,65 М сахарозе в течение 40 минут при 12.000 g и 4°С. Разрушенные споры подвергали воздействию ультразвука (21 кгц, 15 мин,) в ледяной бане. Удаление цитоплазматического содержимого проводили цутем многократного центрифугирования разрушенного материала в дистиллированной воде в течение 10 минут при 8.000g и 4°С. Параллельно отбирали часть промывных вод и исследовали интенсивность их поглощения при •Л = 260 и 280 ны. Образцы клеточных стенок просматривала в электронный микроскоп. Полученный материал лиофшшзировали. Критерием чистоты фракций клеточных стенок служило:

I. Отсутствие цитоплаэматического содержимого на срезах клеточных стенок при наблюдении в электронны! микроскоп.

'2. Незначительное поглощение цромнвных вод щщ Л- 260 и 280 нм (менее 0,050).

3. Отсутствие пиков рибозы и дезоксирибозы при анализе состава нейтральных Сахаров методом гаэожидкостной хроматографии.

Подготовку материала для электронной микроскопии проводили по методике,Бирюзовой (1963). Контрастирование срезов осуществил-. ли 3Í раствором уравдлацетата и по методу Рейнояьдса ( Reynolds, 1963).

Выделение фракции легкоэкстретируемых липидов проводили методом Фольча ( Foloh et. al. , 1937).

Обезжиренные клеточные стенщ гидролизавали Зн HCl в течение 3 часов при 100°С. В подученном гидролазате определяли общее содержание нейтральных Сахаров (а) с фенол-серным { Dubois et.ai, 1956) и антроновым реактивами (Зайцева, Афанасьева, 19ЭТУ. Ленто-зц определяли с оршновым реактивом (Зайцева, Афанасьева, I95V). Для определения содержания уроновых"кислот использовали модифицированный карбазояьный метод ( Bitter, Muir . 1962). 6

Качественный состав нейтральных Сахаров определяли методом газожидкостной хроматографии ÍISX). Гвдролизат клеточных стенок выпаривали на роторной испарителе и сушили далее на масляном вакуумном насосе. Сухой остаток использовали для получения летучих производных Сахаров - ацетатов альднтов (вartni<Л1-g ar ci а, Ilmberg , 1972), ацетатов альдононитрвлов ( ТГагта et, al. , 1973) и триметилсилильных производных СБробст, 1973). Разделение триме-тилсилилышх производных Сахаров проводили на sE-ЗО. ацетатов альдитов л ацетатов альдононитрвлов Сахаров - параллельно на ХЕ-60 и 4-бутандиолсукцинате (БДС). Хромато гравирование проводили на приборе Хром-4, ЧССР.

Содержание аминосахаров определяли методом Боаса (Boas , 1953Г. ГЖцролаз клеточных стенок проводили 6 н HCl в течение 6 часов щи Ю0°С.

Количество белка в клеточных стенках определяли методом Лоу-ри С Lo ягу et. al. , 1951) в щелочном гидролизате после 3-кратной обработки обезжиренных стенок 0,3 я 1ШЩ в течение I часа цри 2f?°C.

Для определения содержания в-каротина использовали методику, описанную Вакуловой с соавторами (1964).

Триспоровые кислоты выделяли из культуральноВ жидкости совместно растущих (+) и (-) шта«шов s.trispor* ( Феофвлова, 1977).

Выделение хитина из биомассы миЕфоскошческих грибов н панцирей крабов проводили модифицированным методом Шмидта (Фео$влова, 1977).

Количество общих ацетильных групп в клеточных стенках и образцах хитина определяли методом ГЮС после хидролиэа их 6 н HCl в течение 12 часов цри 100°С. Для разделеная летучих кислот использовали колонку о пористым полимером Por*pao q . Хромато1р£-

7

Жирование проводили на приборе Packari . модель 7500. Содержание ацетата определяли методом внутреннего стандарта (Мак-Нейр, Бо-нелли, 1970).

Инфракрасные спектры получали на приборе цв-20. Для изготовления таблеток использовали смесь из 2 иг хитина я 200 мг квг.

Ренттеногра$ичес кие исследования проводили на дифрактометре ДРОН-1 на СиК* излучении.

Элементный анализ образцов гитана цроводили стандартным методом.

Для математической обработки результатов исследования использовали следужщие методы:

1. Расчет количества общих ацетильных групп цроводили с использованием медианы (Ашмарин, Воробьев, 1962). Границы доверительного интервала определяли по таблицам Ван дер Вардена (Ван дер Варден, i960).

2. В остальных'опытах для оценки существенности различай использовали порядковый критерий.

Б. Результаты исследования и юс обсуждение -

I. Изучение состава клеточных стенок тдФ г .laponioa н в. tri ере га.

Об изменениях в клеточных стенках грибов в цроцессе роста имеется единичные данные. Показано, например, что в клеточных стеяках ЗмэоЬагойуоев свг«т1в!ав в прошссе экспоненциального роста изменяется содержание основных полисахаридов - маннана и глисана ( НауавМЪв et.al. , 1977). Для миделиальных грибов этот вопрос имеет особое значение, так как им свойствен апикальный рост, цри которсм синтез клеточной стенки происходит только в точках роста (апексе и местах ветвления). Имеются данные о том, что в цроцессе роста Cunoiaghanella вlegans активность хдтин-8

синтазы претерпевает резкие изменения ( Мооге, РвЪег4у , 1Э75). Эти данные позволили предположить, что состав клеточных стенок гиф мицелиальнюс грибов тоже должен изменяться в цроцессе роста.

Для изучения состава клеточных стенок гиф использовал» культуру, находящегося в стадии трофофазы и идиофазы. Пробы отбирали через 24,48,72,96 часов от начала роста гриба.

В хидков среде ГУдвина с.1ароп1о» растет в виде небольших шаровидных колоний. Мжрзлий 1риба представлен однородными слабо-ветвящимися гифами. С переходом в стадию идиофазн заметно увеличивается диаметр гаф, появляется множество расширений, начинается интенсивное дихотомическое ветвление, характерной для мутсоровых грибов.

При росте в погруженных условиях с.зарои1еа накапливает максимальную биомассу к 72 часам (в среднем 12,0-12,5 г/л среды). Кривая прироста биомассы показывает, что переход культуры из стадии трофофазн в стадию идиофазы, происходит между 48 и 72 часами. Процесс автолиза начинается после 90 часов культивирования и к 96 часам наблвдается небольшое падение уровня биомассы (до 11,6-11,9 г/л среды).

КЛеточнал стенка гиф с.ЗароШоа как в стадии трофофазы, так и в стадии идиофазы имеет волокнистое строение. В стадии идиофазн иногда наблюдается неравномерное утолщгние клеточной стенки в 2-3 раза.

Содержание отдельных компонентов клеточных стенок гиф (-) штамма С.3ароп1оа в процессе роста изменяется неодинаково (табл. I). Приведенные данные показывают, что содержание уроновых кислот, нейтральных Сахаров и лидадов в клеточных стенках таф остается практически неизменным. Методом ШХ показано, что качественный состав нейтральных Сахаров с возрастом культуры существенных из-

Таблица I.

Изменения в содержании отдельных компонентов клеточных стенок ГИф (-) штамма С.Лароп1ва , %.

определяемые вещзства возраст культуры, час

24 48 72 96

сухая биомасса, г/л 4,55 9,75 12,2 11,6

яеитозы 2,0 2,65 2.65 3,0

нейтральные сахара (а) 5.4 5,7 5,65 5,8

нейтральные сахара (б) 7,0 7,0 8,0 8,0

уроновне кислоты 5,4 6,1 6,6 * 7,0

аминосакара 18,7 18,9 29,6 23,7

белок 9,75 6,85 5,3 5,25

ляпиды 10,0 11,0 11,0 10,2

мененнй не претерпевает. Основными моносахаридами являются фуко-за, галактоза, манноза. Ксилоза, арабиноза и глюкоза присутствуют в небольшом количестве. Обнаружены также следы рибозы и дезоксл-рибозы.

В ранней трофофазе количество белка в клеточных стенках составляет 8-10%, в поздней идиофазе - снижается до 4-5?. В трофофазе происходит активный рост с. ¿ароп!са , сопровождаемый интен- ' сивным синтезом клеточных стенок, что связано, видимо, с высоким содержанием ферментных белков в области клеточной стенки.

В процессе роста с, ¿ароп1оа в клеточных стенках гиф наблюдается также резкое изменение в содержании аминосахаров. Макси- , мальное количество их обнаружено в составе клеточных стенок гаф в возрасте 72 часов, что на 70-75$ превышает содержание аминосаха-ров в расшей трофофазе.

Таким образом, нами впервые показано, что в клеточных стенках гаф в процессе роста с.¿ароШса изменяется количество хитина н белка, тогда как содержание нейтральных Сахаров; уроновых кис-10

лот и лишдов остается неизменным.

Эта данные интересно рассмотреть в связи со строением клеточных стенок мукоровых грибов. Хитин образует в стенке фибриллярный ригидный остов ( Веа^п1е*1-Саге1а , 1968). Гзтерополисахарид, состоящий из нейтральных Сахаров и уроновнх кислот, составляет основу матрикса. Обнаруженное нами постоянство состава компонентов матрикса и изменчивость микрофябриллярной части клеточной стенки позволяют сделать предполояэние о второстепенной роли матрикса л главенствующей рели микрофибраллярной части в морфогенезе .грибов на стадии вегетативного роста.

Известно, что в составе клеточных стенок бактерий, водорослей, дрожжей в процессе роста происходят определенные изменения. Шщелиальные грибы отличаются от этих микроорганизмов апикальным способом роста. Согласно современным представлениям, синтез клеточных стенок мицелиальних грибов происходят в апикальной и ближней субапикапьной области ( Соо1'ау, Тг1пе1, 1580). Нами показано что увеличение доли хитина в составе клеточной стенки С.3аро»1оа. происходит в идиофазе, когда в мицелии замедляются ростовые процессы и накапливается большое количество лишдов. При этом увеличивается диаметр гиф и толщина клеточной стенки, появляется многочисленные расширения. Эти данные позволяют предположить, что синтёз клеточной стенки в щщофазе осуществляется не только в точках роста, но и по всей длине гифы. Увеличение содержания хитина, видимо, -связано с возрастанием опорной функции клеточной стенки в стадии идаофаэы.

Таким образом, в настоящем исследовании впервые показано, что состав а морфодотая клеточной стенки гиф изменяется в процессе роста, _ причем наибольшему изменению шизергаэтея -ТиЗркляяр^ая честь стенка.

Согласно принятой xeuo таксономии для мукоровых грибов-характерно наличие в клеточных стенках гаф двух азотсодержащих полисахаридов - хитина {поли-н-ацетил-с-глгкозамияа) и хитозана (полн-D -глшозамина). Однако цри исследовании состава клеточных стенок новым методом деэаминирующей деполимеризации показано, что в стенках гиф типичного представителя мукоровых грибов imeor ouoe-40 хитозан отсутствует ( U ate ma et. Bl. , 1977). В связи с ЭТИМ нами проведено сдациальноЗ исследование азотсодержащих полисахаридов в клеточной стенке c.japoaioa .

Ранее для выделения хитозана клеточные стенки обрабатывали последовательно горячей щелочь» и кислотой, что, по нашему мнению, не исключает попутного деацетюлирования хинина. Поэтому в настоящем исследовании был использован метод, который позволяет определить соотношение ацетата и глшозамина непосредственно в клеточных стенках. Оказалось, что в клеточных стенках гиф с.japonic* в возрасте 24 часов соотношение моль ацетата/моль глюкоэ-амина составляет 0,9-0,95, а в возрасте 72 часов -.1,0. Эти данные свидетельствуют о том, что в клеточных стенках практически весь глюкозамин аце тилирован.

Таким образом, методом, исключающим возможность деаце титрования хитина в цроцессе выделения хитозана, показано, что в клеточных стенках гиф с,Japonic»», хитозан отсутствует.

Параллельно этому исследованию методом ИК-спектршетрии, рентгеноструктурного, элементного и биохимического анализов в клеточных стенках гиф с. japonic а был идентифицирован-хитин, по свойствам обносящийся к «с -хитину.

Исходя из полученных нами и литературных данных,можно предположить, что в клеточных стенках мукоровых грибов присутствуют не хитин и хитозан, а хитин и,возможно, его частично деацетили-г 12

рованные формы.

Таким образом, в настоящее время для двух мукоровых грибов двумя разними методами установлено отсутствие хитозана в клеточных стенках гиф. Эти данные вносят уточнение в хемосистематику грибов, так как ранее именно хитозан считался характерным компонентом клеточных стенок мукоровых грибов.

Важным критерием в современной хемосистематике грибов является состав основных'полисахаридов клеточных стенок гиф. Поэтому в связи со спорным систематическим положением грибов рода ^щ^д. ghameiia мы провели для сравнения изучение состава стенок 1Вф другого представителя семейства Cho адврЬ о rao е ае "* В. trlspora.

Клеточная стенка шф B.triepora имеет волокнистое строение, в стадии щщофаэы увеличивается толодна клеточной стенки (в 2-0 раза), иногда наблвдается неравномерное утолщение стенки. Установлено, что в состав клеточной стенки гиф B.trispora (72 часа) ' входят: аминосахара - 20-26$; нейтральные сахара (б) - 25-27$; уроновне кислоты - 14,1$; белок - 3-5$; липиды - 12-13$. Методом ПИ показано, что нейтральные сахара представлены, в основном, фукозой, галактозой,маннозой, ксилозой и глюкозой.

Сравнение шлученных нами данных о составе клеточных стенок С.japónica и в.-tri эр о га с составом стенок гиф еще одного представителя семейства Choanopiionioeae - СЬоаперЬог» euearMtaraa ( Latoumeatt et.al, , 1974) показало, что основными полисахаридами клеточных стенок всех этих грибов являются азотсодержащие полисахариды. Согласно принятой хемотаксономии для мукоровых грибов характерно щшсутствие в стенках гиф хитина и хитозана (ваг-tnioki-Garoia , 1970). Результата нашего исследования клеточных стенок с.japónica и подученные ранее данные для it.nuoedo ( »а-tema et.al. , 1977,6) опровергают присутствие хитозана как истин-

13

ного компонента стенки гиф. Однако в гидролизатах клеточных отенок исследованных грибов семейства сьоадврьогаоеавсодержатся нейтральные сахара и уроновые кислоты, причем этих компонентов значительно больше у В.'Ьг^эрога , чем у С. ¿ароШоа и С, си сиг-мгатт . Известно, что нейтральные сахара и уроновые кислоты в клеточных стенках мукоровых грибов входят в состав гетерополи-сахарида мукорана (гликурана) (Ва1Ча1вЫ-&агс1а , 1968;1)агета

, 197?,а), содержание которого в стенке составляет от 10 до 3(12. Нукоран не встречается у грибов других таксонов и считается характерным компонентом стенок гиф мукоровых грибов. Поэтому на основании полученных нами и литературных данных, вероятно, правильнее полагать, что характерными компонентами клеточных стенок гиф мукоровых грибов являются не хитин а хитозан, а хитан и мукоран.

Среди мукоровых грибов различают гомо- и гетероталличные виды, с,¿аропХва относится к ге те роталличным грибам. Известно, что (+) и {-) штаммы таких грибов различаются по многим физиологическим признакам: содержанию каротиноидов, скорости роста, интенсивности дыхания (Феофнлова, 1977). Однако наиболее существенные отличия обнаружены в системе гормональной регуляции: калщый штамм синтезирует триспоровые кислоты из предшественника, образованного половым партнером С ВчЧлек ес.&д.. , 1976). В связи с этим определенный иитерес представляет изучение состава клеточных стенок гиф (+) и (-) штаммов. Полученные в атом направлении данные будут способствовать углублению представлений о таком важном биологическом явлении как гетероталлизм.

Приведенные в таблице 2 данные показывают, что качественный состав клеточной стенки гиф и содержание в ней отдельных компонентов у (.+! и (—) штаммов практически не различается. 14

Таблица 2

Состав клеточных стенок гиф (+) в (-) штаммов c.japonioa.

определяемые вещества штамм

__(+) "То

нейтральные сахара (а) 6,1 6,8

нейтральные сахара (б) 8,4 7,8

шнтозы 2,4 2,6

уроновые кислоты 3,2 3,6

аминосахара 25,8 28,9

белок 4,9 4,6

лншды 10,2 11,4

Примечание: возраст культуры С+) и (-) штеммов гриба - 72 часа.

Отсутствие отличий в составе клеточных стенок различных в половом отношении штаммов гриба подтверждает, таким образом, предположение о тем, что явление гетероталлизма в большей степени связано с отличиями в системе гормональной регуляции, чем в составе меток (ви'Ьоак et.ai. , 1976; Феофилова, 1977), Полученные нами результаты согласуются такие с даншми о том, что морфолога чески (+) и (-) шташи мукоровнх грибов не различаются (Миль-ко, 1974).

Таким образом, в данной главе показано, что качественный состав клеточных стенок гиф C.japoaiea и в.trlspora одинаков, различие обнаружено только в содержании нейтральных Сахаров и уро-ноаыХ кислот, которых значительно.больше у B.triepor» . В клеточной стенке гиф C.japonioa идентифицирован хитин и доказано отсутствие хитозана. Установлено, что в процессе роста изменяется морфология клеточной стенки и содержание в ней хитина и белка. Показано, что явление гетероталлизма у с.japónica не связано с различи ямЬ в составе клеточных стенок гиф у (+) и (-) штаммов.

2. Изучение состава и структуры клеточных ставок спор к спороносцев с.лауоШеа и стенок спор В. t rispo га .

В генезисе клеточной стенки в цроцессе онтогенеза Zygomycetes имеется уникальная особенность: клеточная стенка споры и гифы образуется &в novo ( сготв , 1976). Поэтому исследование клеточных стенок спороносцев, спор и гиф представляет интерес для изучения взаимосвязи состава и структуры клеточной стенки с цн-тодиффгре нцировкой.

Для грибов рода Cunninghams На вопрос о типе бесполого размножения является спорным: некоторые исследователи относят его к конидаальному, другае считают с порангиальным. В связи с этим и систематическое положение грибов этого рода не установлено окончательно. Известно, что состав клеточных стенок сдар и конидий по-разному отличается от состава клегочных стенок гиф С Bartnieici-

Gíu-Cia , 1968; таи Laer» et.al. , Iii?? ; Marti» et,al. , 1973; Schalt et.al. , 1975). Поэтому исследование состава клеточных стенок raí и спор с,japónica может помочь с биохимических позиций подойти к решению вопроса о типе бесполого размножения грибов рода Cunninghams 11а , что важно для установления их систематического положения.

С.japónica образует на сусловом агаре быстро растущие интенсивно соорулирукидае пушистые колонии. Спороносцы ответвляются от гиф субстратного мицелия и представляют собой прямые неокрашенные гифы . Споры шаровидные, теми о о краденные, неподвижные, фи наблюдении их в сканирующий микроскоп видно, что поверхность споры покрыта многочисленными тупоконечными шипами. Исследование тонких срезов клеточных стенок спор в электронном микроскопе показало, что стенка споры состоит из двух четко выраженных слоев. Внутренний слой, проницаемый для электронов, несколько.толще внеш-16

него и имеет мелкозернистую структуру. Внешний слой, для электронов непроницаемый, имеет, видимо, аморфную структуру.

Споры В.берега эллиптические, продольной счерченные с кучном лентовидных выростов на противоположных концах, рисунок поверхности напоминает кукурузный початок. Клеточная стенка споры двуслойная, волнистая, имеет мелкозернистую структуру. Установлено, что в состав клеточной стенки споры в.Ъг1в?ог% входят аминосахара - 7,2%; нейтральные сахара (0) - 14,5?; урановые кислом - 4,0?; липиды - 15,6?. Нейтральные сахара представлены преимущественно глюкозой. Кроме того, в стенках спор обнаружен темный пигмент, цредположительно относящийся к меланинам, и фиолетовый пигмент, извлекающийся подкисленная бутанолом.

В составе клеточных стенок спороносцев и спор со*р<ш1еа имеются существенные отличия (табл. 3).

Таблица 3

Состав клеточных стенок спор и спороносцев <+) и С-) штаммов С,]ароо1ва , %,

определяемые клеточные стенки стенки спороносцев

вещества (+) спор (+) (->

нейтральные сахара (а) 9,4 13,3 1,4 1,7

нейтральные сахара (б) 9,1 15,6 2,4 3,0

пентозы 1.3 1,8 1.0 1.0

уроновые кислоты 2,9 4,0 1.7 1,8

амнносахара 6,3 8,2 II,3 8,2

белок 10,0 9,0 5,5 7,5

липиды' 12,7 II,5 28,3 27,2

В клеточных стенках спор значительно больше нейтральных Сахаров, уроновых кислот и белка. Клеточные стенки спороносцев отличаются высоким содержанием липидов. Методом ПОС установлено, что нейтральные сахара стенок спор представлены преимупествекно

17

глюкозой, обнаружены также следы маннозы, галактозы, фукозы, ара-бинозы и ксилозы. Состав нейтральных Сахаров клеточных стенок спороносцев близок таковому в стенках гаф с.japonioa . Основными сахарами являются фухоза, галактоза, .манноза, в меньшем количестве присутствуют ксилоза , глюкоза и арабиноза, в виде следов - рибоэа и жезоксирибоэа.

Общее содержание нейтральных Сахаров в клеточных стенках спороносцев составляет не более 2-3? и представлены они, в основном, фукоэой, галактозой и маннозой. Количество нейтральных Сахаров в стенках спор достигает 14-15$, в состав их входит, преимущественно, глюкоза, остальные сахара обнаружены в следовых количествах. Эти данные позволяют заключить, что в клеточных стенках спор с. j ароШо елри су тс тву е т качественно новый полимер глнжозной природы, несвойственный стенке спороносцев и гиф.

В стенке спор С.japónica присутствует пигмент, который по качественный реакциям, растворимости в различных растворителях, ИК-спектру отнесен к меланинам.

Таким образом, из результатов проведенного нами исследования клеточных стенок спор и спороносцев c.Japonio* можно сделать вывод, что эти структуры различаются не только цо количеству отдельных компонентов, но и качественно: в стенках спор появляется полимер глшозвой црироды и меланин.

Как известно, клеточная стенка спороносца является продолжением стенка гифы. В настоящем исследовании показано, что состав стенок спороносцев и гиф различается лишь по количеству отдельных компонентов. Ранее было показано, что стенка споры cunnisgba-eella »obiouiata образуется независимо от стенки спороносца (Khan ,1975). Нами установлено, что такая структурная црерывио-тость в образования клеточной стенки сопровождается изменением 18

качественного состава стенки. Таким образом, можно заключить, что качественные или количественные изменения в составе клеточных стенок зависят от особенностей генезиса стенки в процессе дифференциации.

Полученные нами данные представляют интерес для систематики грибов рода Cunaínehaiaeiia . Некоторые исследователи относят этот род К семейству Choanepboraeeae ( Fltzpatriek , 19Э0; Курсанов с соавтор., 1954; Zy°ha et.al. , 1969), другие выделяют его в отдельное семейство СиплшгЪатеНаоеае (Наумов, 1935; Милько, 1974). Это грибы выделяют в отдельное семейство на основании того, что у них при бесполом размножении образуются только конидщи. Этот признак отличает их от других родов семейотва сьоа-aephor&ceae , которым более свойственно спорообразование.

Однако на основании электронвомикросколическнх исследований Процесса бесполого размножения у c.eehinai*ta было сделано предположение о том, что у этого гриба образуются не конидии, а споры в моноспоровых спорангиолях ( Khan , 1975). Ранее было показано, что клеточные стенки спор других мукоровых грибов отличаются от стенок гиф тем, что в них появляется глюкан ( Bartaioti-Garela t I9&8; van laere et.al. 1 1977). Состав же клеточных стенок конидий и конидиеносцев отличается только по количеству отдельных компонентов, так как стенка конидии является продолжением стенки конидиеносца ( Martin a-t.ai, , 1973; Sobmit «t.al., 1975).

Полученные нами результаты показывают, что стенка споры с.Japonicen в.triaporaотличается от клеточной стенки гифы не только количественно, но и качественно: в ней появляется полимер глвкозной природы и меланин. Эти данные свидетельствуют о том, что в процессе бесполого размножения С.japonioa образуются, ви-

19

димо, споры, но не конидии. Напомним, что грибы рода ситИп^иа-швиа выделяют в отдельное семейство на основания строго кони-диального спороношения. Таким образом, результаты цроведенного исследования свидетельству»! о необходимости более глубокого изучения грибов этого рода и получения новых данных для выделения юс в отдельное семейство.

3. Влияние тоиспоиовнх кислот на морфологию мицелия и состав клеточных стенок гиФ р. .1 ароп! с а и в.гг1зрога .

Половая дифференциация у мукоровых грибов контролируется с помощью особого полового гормона - зрвспоровых кислот. Три споровые кислоты выделены и изучены только у нескольких мукоровых грибов, однако высказано предположение, что эти соединения являются половыми гормонами для всех грибов порядка шоога1в8 . До настоящего времени из культуры совместно растущих (+) и штаммов с.лароп1еа не удалось выделить триспоровые кислоты, а . в.гг1 ярого образует их в больше»! количестве. В результате действия трисдаровых кислот на концах вегетативных гиф образуются половне выросты - зигофоры. Показано, что поверхность зигофор намного сильнее связывает лектины, чем поверхность гиф С/оавв> йооАау г 1977). Эти данные позволяют предположить, что морфоге-нетическай эффект три споровых: га слот сопровождается изменением состава клеточной стенки.

Цри росте в погруженных условиях в присутствии экзогенных триспоровых КИСЛОТ В мицелии как С.ЗароШоа . так И В.1г1эро-га наблюдается: появление амцулообразных и сферических расширений. Из приведенных в таблице 4 данных следует, что в составе клеточных стенок гиф с,^арол1оа и наблюдаются прак-

тически одинаковые изменения: в полтора раза увеличивается содержание белка и на 15-20$ снижается уровень аминосахаров. 20

Таблица 4

Влияние триспоровых кислот на состав клеточных стенок тиф с.}&роо1оа и в.1г1арог® (% от веса обезжиренных стенок)*

определяемые с. 1»ров1оа в,*г1ерог»

вещества контроль контроль контроль контроль

+ тек + тек '

сухая биомасса г/л 10,4 9,8 9,9 8,0

амикосахара 20,0 16,3 22,3 19,3

нейтральные сахара (а) 4,1 4,2 —

нейтральные сахара (б) . 6,0' 5,9 28,1 27,0

пентозн 1.9 1,7; 5,2 5,9

уроновые кислоты 4,9 4,5 — —

белок 3,3 5,1 3.8 ' 5,8

Примечание: - триспоровые кислоты (£^^>320,0) в количестве 500 мкг/мл вносили в растущую 26-часовух культуру триба и культивирование драдояжали еще 48 часов.--не определяли.

Содержание нейтральных Сахаров и уроновых кислот существенно не изменяется. Качественный состав нейтральных Сахаров остается неизменным.

Таким образом, в настоящей работе впервые на примере двух мукоровых грибов показано, что морфогенетическое действие полового гормона сопровождается определенными изменениями в составе клеточных стенок. Полученные данные расширяют сучествуювде представления о функциях триспоровых кислот и половом морфогенезе. Результаты исследования показывают, что действие гормона распространяется не только на процессы метаболизма, во и на синтез клеточной стенки, что связано с изменением ее морфологии.

Сравнительное изучение влияния триспоровых кислот на состав стенок гиф с. ¿ароЩоа и в. *г1врог* позволило выявить обще закономерности в действии полового гормона. Эти данные позволяю предположить, что у этих грибов имеются близкие системы гормонального контроля. „

4. Сравнительное изучение хитина некоторых микроскопических грибов и'хитина краба.

К началу настоящего исследования были изучены некоторые свойства хитина ряда микроскопических грибов (irahadevan, latum, 1965; cbaeket, Chen, 1978). Однако сравнение этих данных не представлялось возможным, тан как выделение и очистка хитина проводилась различными методами. Вопроб об отличиях в свойствах хитина, подученного из различных природных источников, интересен не только в теоретический, но и в практическом аспекте, так как в задачу исследования входила разработка метода выделения хитина из микроскопических грибов.

В качестве природных источников для получения хитина мы использовали микроскопические грабы, принадлежащие семейству съо-

anaphoraeeaeC С. i aponioa И В. triapora ) и Aapergillace&e (A.nl-geii .

Хитин краба представляет собой неправильной формы плотные мелкие пластинки. Хитин грибов имеет волокнистое строение и, в отличие от хитина краба, легко подвергается разрушению .

Из анализа дифрактограмл следует, что хитин исследованных микроскопических грибов и крабов имеет идентичную кристаллическую структуру, однако хитину краба свойственна более высокая степень упорядоченности. ИК-спектры всех образцов хитина обнаруживают характерные для хитина (ctaoket, Chen , 1978) полосы поглощэ-

_т

ния в областях 3263, 1655, 1550 см 3 хитину краба свойственно более сильное поглощение в области'1680-900 см"1.

Данные элементного анализа показывают, что хитин грибов менее богат азотом, причем самое низкое содержание отмечается душ хитина из a.nigs г . Кроме того, в этом образце обнаружено 4-5% глюкозы, что коррелирует с пониженным содержанием глюкозакина и ацетата. 22

Хитин грибов С. japonlea и В,tri грога , принадлежащих к одному семейству, незначительно отличается по данным элементного анализа.

Таким образом, в настоящей работе доказано, что хитин микроскопических грибов по вашейшим физико-химическим свойствам соответствует хитину крабов. Полученные данные свидетельствуют о том, что микроскопические грибы могут служить источником для получения хитина. На основе этого исследования наш разработан метод получения хитина из биомассы микроскопических 1рибов.

ВЫВОДЫ

I. Выявлены особенности состава клеточных стенок грибов семейства сьоаперьогеоеве . Клеточная стенка гиф этих грибов однослойна и имеет волокнистую структуру. В состав стенки гифс.ллро-nice входят (?): аминосахара - 20-30, нейтральные сахара - 8-10 (из них пентозы - 2-3), урановые кислоты - 5-7, белок - 5-10, ли-пиды - 10-12. В клеточных стенках гиф этого гриба идентифицирован хитин х показано отсутствие хитозана. Клеточная стенка гиф B.tri-эрога представлена следующими компонентами (?): аминосахара - 2026, нейтральные сахара - 25-27, уроновые кислоты - 14-15, белок -3-5, липиды - 10-12.' В гидролиэатах клеточных стенок гиф этих грибов нейтральные сахара представлены в основном галактозой, фуко-зой, маннозой, а также небольшим количеством ксилозы, глюко§ы и арабинозы,

2. Клеточная стенка с.japonie® и в.trispora в процессе дифференциации является динамической по составу структурой. Процесс морфогенеза у этих грибов сопровождается не только количественными, но и качественными изменениями в составе клеточной стенки, что обусловлено особенностями генезиса этой структуры в процессе дифференциации.

Впервые для мицелиальннх грибов показано, что наблюдаемые в процессе роста изменения формы гиф, увеличение их диаметра и толщины клеточной стенки сопровождаются изменением содержания хитина в белка в составе клеточной стенки.

Клеточная стенка спороносцев c.japoniea по качественному составу не отличается от стенки гиф, но содержит значительно больше липидов и меньше полисахаридов.

Клеточная стенка спор C.japoniea иB.triapora существенно от-

личается от стешет гиф по структуре и составу. Стенка спор этих грибов двуслойна и имеет мелкозернистую структуру.. В клеточных стенках спор присутствуют два, несвойственных стенкам гиф,компонента: глюкан и меланин.

3. Впервые показано, что морфогенетачесное действие полового гормона - три споровых кислот - сопровождается изменением содержания белка и хитина в составе клеточных стенок гифС.japónica и B.tríspora . Установлено, что явление гетероталлизма у С.japónica не связано с различиями в составе стенок гиф (+) и (-) штаммов.

4. Сравнение данных о составе клеточных стенок грибов семейства Cboanephoraceae показало, что по основному критерию современной хемосистематики - составу полисахаридов клеточной стенки гиф -эти грибы не отличаются друг от друга. Обнаруженные изменения в составе клеточной стенки с. Japónica в процессе онтогенеза позволяют также считать, что продукты бесполого размножения этого гриба являются спорами, а не конидиями. Последний вывод противоречит основному критерию, на основании которого грибы рода Conninghamella выделены рядом авторов в отдельное семейство,

5. Хитин изученных микроскопических грибов по важнейшим фиэи-ко-химическим свойствам соответствует хитину крабов. Таким образом, микроскопические грибы могут быть использованы в качестве источника для получения хитина. Разработан метод получения хитина

из биомассы микроскопических грибов.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации:

1. Феофалова З.П., Терешина В.М., Локшин Б.В., Орешкин A.B., Иванова Н.И. Влияние триспоровых кислот на'состав компонентов клеточной стенки В1a^eelea trispoга taxier - - Микробиология, 1977, т. 46, в. 5, с. 938-943. ■

2. Терешина В.М., Фесйилова Е.П., Бехтерева М.Н. Состав клеточных стенок спороносцев я спор Cuminghamella japónica • - Микробиология, 1979, т. 48, в. 4, с. 617-618.

3. Терешина Феофалова В.П. Влияние триспоровых кислот на состав клеточных стенок Cuaninebaaeila japónica . - Микробиология, 1980, т. 49, в..1, с. 172-174.

4. Феофилова S.U., Терешина В.М., Иванова H.H., Генин Я.З., Гопенгауз ФЛ. физико-химические свойства хитина крабов и некоторых микроскопических грибов. - прикладная баохшжя и микробиология, i960, т. 16, в. 3, С. 377-382.

5. ФеойЕилова Е.П., Терешина В.И. Возрастные-изменения в составе клеточной стенки у сиппт^ашвЦа japonice— Макройаологая, 1980, т. 49, в. 5, с. 756-760.

24

Подписано к печати 25,02.83. Т-02500, Объем 1,5 п. ЛлТираж 150 акэ. Зак. 172,

Сфсетяое ирввввоасгво типограф™ í*3

издательства 'Ноу«' ■ Мосхм К-45, уп.Ждавоеа, Д2/1.