Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Сравнительная характеристика глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы тутового и дубового шелкопряда

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Сравнительная характеристика глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы тутового и дубового шелкопряда"

МОСКОВСКИЙ ОРДЕНА ЛЕНИНА II ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ПЕДАГОГИЧЕСКИЙ ИНСТИТУТ имени В. И. ЛЕНИНА

Специализированный совет К 113.08.06

На правах рукописи

БОРЗАКОВСКАЯ Елена Витальевна

УДК 595.7:577.152.1

СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ТУТОВОГО И ДУБОВОГО ШЕЛКОПРЯДА

03.00.04 — биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 1987

Работа выполнена в Московском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственном педагогическом институте имени В. И. Ленина.

Hay ч ii ы и руководитель: доктор биологических наук, профессор ФИЛИППОВИЧ Ю. Б.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук ЩЕРБУХИН В. Д. кандидат биологических наук ТИМОФЕЕВ А. В.

Ведущее научно-исследовательское учреждение: институт биологии развития им. Н. К. Кольцова АН СССР.

Защита состоится 1988 г. в ч'^.^л ча-

сов на заседании специализированного совета К 113.08.06 по присуждению ученой степени кандидата наук в Московском ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственном педагогическом институте имени В. И. Ленина по адресу: Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корп. 5, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке МГПИ им. В. И. Ленина, 119435, Москва, Малая Пироговская, д. 1.

Автореферат разослан «.

Ученый секретарь специализированного совета f¡Mc¿cf ОЖИГОВА А. И.

ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ ' Актуальность теш. Центр?чьное положение глкжозо-6-фосфат-дегидрогеназы в обмене вещестЕ предопределяет устойчивый и глубокий интерес исследователей к этому ферменту на протяжении почти шести десятилетий, прошедших с момента его*открытия (Warturg, Christian, 1931 ). Так гак глшозо-С-фхэсфатдеглдрогв-наза является ключевым формантом пентозофосфатного пути распада углеводов,то по уровню её активности можно судить об интенсивности данного пути обмена углеводов в том или ином биологическом объекте4

Для всестороннего изучения лях5ого фермента, для понимания его функциональных особенностей необходимо углубленное исследование его физико-химических свойств. Свойства и строение глюко-зо-6-фэсфатдегидрогеназы достаточно подробно изучены у многих представителей животных и микроорганизмов. У ряда видов выяснена четвертичная структура фермента (ohnishi, Hori, 1977 i Тимофеев, I982,nammond, 1935 ) и определен его аминокислотный состав (De Plora et al., 1977}Donohtie et al, 1981). В последнее время В литературе появились данныо об исследовании механизмов регуляции ферментативной реакции, катализируемой глккозо-6-фосфатде-гидрогеназой (Haghighi, Levy, 1982} Viola, 1984 ). Наибольшее число работ посвящено изучению глккозо-6-фосфатдегидрогеназы человека, так как установлено, что уровень активности фермента¡ а также поведение форм фермента при электрофорезе и изоэлектрофо- . кодировании является надежным тестом при диагностика ряда заболеваний человека (Beutler, 1980; Морозова, Плотникова, I982Í Diamant et al.-, 1984).'

Глюкозо-6-фосфатдегидрогейаза насекомых, самого многочйс-ленного на Земле класса животных, изучена значительно слабое. Единственным исключением является фермент из Droaophila aela-nogaater , поскольку полиморфная глшозо-6-фосфатдегидрогеназа дрозофилы оказалась удобным модельным объектом при исследованиях в области биохимической генетики (Fádda et al., 1979i Bijaría, Delden, 1977 ). К настоящему времени определены основные физико-химические свойства этого фермента, включая молекулярную Массу й субъединичный состав (Розовскийt I§8Í.j Léè et al.j i^fsj Williámáon, Bentley, 1983 ). ¡V

Сведения, имеющиеся в литературе о структуре и свойотзах глюкозо-б-фосфатдегидрогинаэ других представителей этого интереснейшего класса животных, носят достаточно фрагментарный характер. Активность фермента изучали лишь н? отделышх Лазах развития насекомых, что но дает возможность сопоставить динамику активности с ходом морфогенетйчэских перестроек в течении всего жизненного цикла (Eguchi, 1968 ). Фермент, выделенный из комнатной мухи и жирового тела гусениц тутового шелкопряда (Hörle, 1967} Ohefurká, 1957 ), Частично очищен и охарактеризован по некоторым физико-химическим свойствам. Несколько подробнее исследована глгакозо-6-фосфатдегидрогеназа из греш тутового шелкопряда, хотя она fice же не била получена, в гомогенном состоянии (rakahaalii et al., 1974 ). В литературо Нет данных и по изучению субклеточной локализации глшоэо-б-фосфагдвгйдроге-назы uacQKOMtiX и её субстратной специфичности, отсутствуют данные по аминокислотному составу; молекулярная масса и субъеди-кичный состав определены лишь для фермента, выделенного из дро-. вофилы.

Крайне ограничеш сведения о глшозо-6-фосфатдегидрогеназе полозах насекошх. Хотя показана отчетливая взаимосвязь между уровнем активности глжозо-Ч>-$осфатдегидрогеназн в Грене тутового шелкопряда и продуктивно, стыэ его гибридов (Егорова, Сашси-на, 197Э; Налётова, Егорова, i960), охарактеризована она i: настоящему времени далеко не уолно. Совершенно нет дашшх о Глюко-80-6-фосфатдагицрогвназе другого хозяйственно-полезного вида насекомых - китайского дубового шелкопряда. В связи с этим следует отметить, что в нашей стране ужа на протяжении многих лет ведутся работы по селекции и акклиматизации этого ценнейшего шелкойоса'(Сшшцкий и др. , 1978; Радкбзич и др., 1979). : . , : В свете вышеизложенного представляется несомненно интерес-¡иым.й важным как в теоретическом, так и практическом аспектах . более углубленное изучение гликозо-6-фзсфатдегидрогенаэ таких .хозяйственно-ценных видов насекомых, как .тутовый иолкопрлд и китайский дубовый шелкопряд.

ЦЕЛЬ И ЗД1ДЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ. Целью данного исследования -квляется изучение глотозо-6-фосфатде1идрогенази тутового и ду-: рового шелкопрядов в сравнительно биохимическом аспекте. Исходя из 8T0fcó,B работе поставлены следующие конкретные задачи: ; - оопоотавить уровни активности глисозо-6-фосфатдегидроге-

назы в онтогенеза двух видов насекомых - тутового и дубового шелкопряда;

- выявить субклеточную локализацию фермента у данных видов;

- разработать процедуру очистки с целью по-%чепия гомогенных препаратов щтсозо-6-фэсфатдетдрогенази из обоих видов насекомых;

- сопоставить физико-химические свойства глюкозо-6-фосфат-дегидрогеназы, выделенной из тутового и дубового шелкопряда;

- выявить возможность использования данных об активности глюкозо-6-фосфатдегидрогенаэы в гране пород и гибридов тутового шелкопряда для массового прогнозирования гетерозиса у гиб- . ридов этого вида.

Научная нозизна работы. Впервые осуществлено выделение глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФД) из организма дубового шелкопряда и из куколок тутового шелкопряда; оба фермента охарактеризованы по основным физико-химическим свойствам. Изучено -изменение удельной активности Г6ФД в онтогенезе того и другого , вида на с в ког.ях, сопоставлен уровень удельной активности фермента в различных тканях тутового и дубового шелкопрядов, исследована динамшса активности фермента в тканях гусениц тутового шелкопряда.

Осуществлен анализ удельной активности Г6ФД в грене большого числа исходных пород и полученнчх от их скрещивания гибридов тутового шелкопряда, на оснований чего показана целесообразность использования данных по уровню удельной активности фермента в яйцах насекомкх в качестве биохимического теста для раннего прогнозирования явлений гетерозиса у тутового шелкопряда. ■ •

Установлено, что в грене как тутового, так и дубового шелкопряда суммарная т\лн&озо-6-фоефятдегидрогвНа.зная активность наблюдается преимущественно в цитозоле, но наивысшая удельная активность зафиксирована й мшфосомаяьной фракций. Фермент проявляет активность лийь в присутствии глюйозо-6-фосфата и НАДФ+, Показано, что, хотя основные физйко-химйчвские и кинетические > параметры Т6ФД туговбго и Дубового шолкопряда близки, Четверо " тичнёя структура молекул этих ферментов сильно отличается^ Г6ФД тутового Шелкопряда является тотрамером, в то Время как фермер Дубового шелкопряда совершенно уникален по своему стрэвгапо,,''' представляя собой мультимер, состоящий ив 24 субъединщ.1 ;*

Изучение аминокислотного состава ползало, что, в целом, Г6ФД тутового и дубового шелкопрядов по этому показателю похожа на одноименный. формант представителей других классов животных.

Практической значение работы. Разработана универсальная схема выделения Г6ФД из организма насекомых, включающая фракционирование белков гомогената методом впсаяивания, гельфильтрацию через еефадекс о -100, аффинную хроматографию на цибакрон-оефа-розе 4В и аффинную хроматографию на 2',5-АД£-сефарозе 4В.

Анализ уровня удельной активности Г6ФД-в грене пород и полненных от их скрещивания гибридов может быть использован в качестве надежного и эффективного метода для раннего прогнози-розания гетерозиспых явлений у этого ценного в хозяйственном отношении животного.

Апробация работы. Результаты исследований докладывались на 1У Всесоюзном симпозиуме "Пентозофосфатный путь превращения углеводов, его механизм и регуляция" (Калинин, февраль 1984), . на IX съезде Всесоюзного энтомологического общества (Киев, ок-. тябрь 1984), на У Всесоюзном биохимическом съезде (Киев, 1986), на Ленинских чтениях МГПИ им. В.И.Ленина (апрель 1985), на юбилейной научно-методической конференции, посвященной 60-летию образования кафедры органической и биологической химии (февраль 1983). "

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения; обзора литературы, освевдудего степень изученности Г6ФД различных видов животных и микроорганизмов; описания объектов и методов исследования; 4-х глав, содержащих результаты эксперимента и их обсуждение; заключения, выводов и списка использованной литературы, включающего 155 ссылок. Работа изложена на 142 страницах машинописного текста, содержит 23 рисунка и 12 таблиц,. : ■

ЭКСПЕРШЛИГГАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

• ' " • Материал и методы исследования

В качестве материала для исследования Г6ФД тутового шелкопряда использовали насекомых породы Скороспелая-2, получаемых с Росшелкстанции (п.-Иноземцево; Ставропольского 1фая), а для изучения Г6ФД китайского дубового шелкопряда - насекомых порода Полесский тассар, получаемых из Проблемной лаборатории

освоения, охраны и реконструкции животного мира белорусского поозерья при кафедре зоологии Витебского государственного педагогического института им. С.М.Клрова и Украинской сельско-хозяй-ственной академии (пос. Теремки, Киевской обл.)>Грену исходных пород и полученных от их скрещива1шя гибридов получали с Рос-шелкстанции.

При исследовании влияния гормонов на активность Г6ФД жирового тела гусениц тутового шелкопряда обработку биологического материала .e-экдизоном проводили путем микроинъекций раствора гормона каждой гусенице (5 мкл 0,0001%-ного раствора гормона в 7^-ном этаноле); обработку гусениц раствором аналога газенильно-го гормона zr -515 вели топчкально по I мкл 0,15?-ного раствора препарата в ацетоне на каждую гусеницу.

Материал для Выделения Г6ФД заготавливали в виде сульфатно-аммонийных осадков белков грубых экстрактов куколок и хранили их при температуре +4°С.

Активность Г6ФД определяли спактрофотометрическим методом по приросту уровня НАДФН (Кочетов, 1980).

Фракционирование растворимых белков тканей насекомых осуществляли методом электрофореза в полиакриламидном геле в модификации для тканей насекомых (Филиппович, Щёголева, 1967). Активность Г6ФД в полиакриламидном геле выявляли тетразолиавым методом (Кочетов, 1980).

Содержание белка в пробах определяли по метод}- Лоури (Lowry et al., 1951 ). На гелевых колонках белковые зоны выявляли с помощью окрашивания 0,2^-ным раствором кушсси голубого, а такая применяли высокочувствительный метод серебрения белковых зон (Nelaon, Brown, 1984 ). -

Мэлекулярнута массу Г6ФД определяли методом электрофореза в градиенте Концентраций акриламида 3,5 - 20$.

Электрофорез в геле с ДДС-На проводили по методу Лаеммля

( Laommli, 1970 ).

Аминокислотный состав определяли на аминокислотном анализаторе "Alpha " (ькв , Швеция) после гидролиза образцов 20%-ой. HCI при 105°С в течении 24 часов.

Субклеточную локализацию Г6ФД грены тутового и дубового шелкопряда определяли после выделения субклеточных фракций методом дифференциального центрифугирования (Водолеев, 1977)i

• Результаты и их обсуждение

Активность глкжозо-6-(Гх)с(Татдегшгоогенаэн в онтогенезе тутового и дубового шелкопрядов. Результаты определения удельной активности Г6ФД на.различных этапах онтогенеза тутового и дубового шелкопрядов представлены но рисунке I. Изменения активности Г6ФД в период весенней инкубации грены синхронны у обоих видов. В начале и середине эмбриогенеза отмечено Повышение активности фермента по сравнению с уровнем его. активности в не-оплодотворенной грене. В Конце эмбрионального развития наблюдается резкий спад активности Г6ФД у обоих видов. Сходство в динамике активности Г6ФД тутового и дубового шелкопрядов сохраняется до начала III личиночного возраста. Затем в период интенсивного питания возникают значительные расхождения в динами. ке активности фермента у двух видов, которые к началу куколочкой фазы развития преобретают контрастный характер. Причины контрастности в изменении активности Г6ФД на куколочной фазе развития, по-видимому, следует искать в различиях в биологии этих двух видов насекомых. Наивысшая активность Г6ФД у тутового шелкопряда совпадает с началом процессов метаморфоза, приводящих через две недели к образованию взрослого насекомого. У дубового шелкопряда после образования куколки наступает многомесячная куколочная диапауза, во время которой происходит торможение всех биологических процессов. К середине куколочной фазы развития у тутового шелкопряда наблюдается спад активности фермента» а у дубового шелкопряда по мере приближения к весеннему выходу . имаго активность Г6ФД повышается. ,, , При сопоставлении удельной активности Г6ФД в кирсвом теле, 1шшечник8 и туике тутового и дубового шзлкоцрядов в нача- , ле У личиночного возраста (табл. I) выявлены существенные различия: если у тутового шелкопряда наблюдается высокая активность' фермента в жировом теле , то в этой же ткани дубового шелкопряда она низка» Вместо о теп сравштельно низкой актив-S ности Г6ФД в станке кишечника тутового шелкопряда противосто-* ; ит высокая активность фермента в стенке кишечника дубового

Еелкопряда, превышающая таковую у тутового шелкопряда почуй 4 раза. Выявленные изменения-в удельной активности Г6ФД в различных тканях тутового шэлкопряда с начале. У личиночного возраста и вплоть до середины куколочной фазы развития отра- . ;ганы на рксучко 2. Наряду почти,с полным отсутствием актив- ;

' "" Удельная активность (ныоль надан/мин на мг балка)

1 - тутовый шелкопряд; II - дубовый шелкопряд. Эмбриогенез: I - неоплодотворешшя грена;

2 - начало; 3 - середина; 4 - конец инкубации грены; личинка: 5 - 1-й день I возраста; 6.—линька на II личиночный возраст; 7 - 1-й день II возраст ; 8 - лгаъка нг На возраст; 9.- 1-й день III возраста; 10 - линька на 1У возраст; II - 1-й день 1У возраста; 12- линька.на У возраст; 13 - 1-й день У возраста (личинка); 14 - личинка У возраста

' перед завивкой кокона; куколка: 15 - предауколкэ; 16 - белая куколка; I? - середина кухолочной фазы развитая.

Таблица I

Активность Г6ФД в некоторых тканях тутового и дубового шелкопряда в начале У личиночного возраста (нмоль НЛДЗН/мин на мг белке)

Жировое Стенка

. насекомого\_ тело (М+М) кишечника (f.I+м)

Тутовый шзлкоцряд 48,6 + 4;27 11,95 + I-.22 14,08 + 2,07

Дубови'1 шелкопряд 11,6 45*25 + 0,35 • 8,0 + 0,20

Удельная активность (ныоль НАДФН/шн на мг белка;

Фазы и стадпд — развития .

■ I 3 4 о

,;Гис,2. Динамтва активности Г6ФД в тканях тутового шелкопряда.; I, -гемолимфа., II - стош{а кдтчнкка, III - фиб-роиновый .(а) и сорициновий (б^отдол иелкоотделительной жплозы1У'- игровое того, У -тушка. £азы п стадии развития: I - личинка 1-го дня У .возраста , 2 - личинка со-редины У возраста, 3 - знгшпса У возраста тред завивкой кокона, 4 - белая;куколка,:5 -серодайа куколочноЗ фазы развития.: . л. '

поста фермента в гемолимфе, у личинок У возраста, обнаружена очень вне окая активность фермента в .гл ¡ревом теле, резко снижающаяся к началу куколочной (Тазы развития. Активность Г6ФД в тушке личинок относительно невысока и увеличивается к началу куколочного развития. В обоих отделах шелкоотделптельной железы, напротив, выявлено падение активности Г6ФД к началу фазы куколки, что, по-видалому, связано с инволюцией этого органа после завивки кокона. Активность фермента в стенке кишечника сохраняется на одном и том же сравнительно невысоком уровне в течении всего У возраста.

Неравномерность распределения активности Г6ФД в тканях и органах тутового п дубового шелкопряда, а. также своеобразие изменения активности фермента в тканях предопределяет, й' свою '■ очередь, динамику активности этого фермента в целых гомогена-тах личинок У возраста л куколок, Из полученных данных также следует, что основным местом локализации глшозо-6-фосфзтдегид- • рогеназной реакции у тутового шашэпряда на личиночной фаза развития является жщювое тело, а у дубового шелкопряда - стенка кишечника, что, по-видимому, связано о различным содержанием углеводов в потребляемом гусентгамй корме (Смотан, 1953Показательно , что в эмбриогенезе, когда еще подлостью не сформя- . роваяы и не функционируют основные органы насекомого, Дшгашка активности ферментов у обоих видов имеет сходный характер. •

При изучении субклеточной локализации Г6ФД в хрене туго- • вого и дубового шелкопряда отмечены черт сходства. Более 90$ : общей активности ШЩ в яйцах обоих видов сосредоточено а цй- . тозольной фракции; в остальных исследова&х субклеточных фракциях содержание фермента, невелико. Б.греке обоих видов насекомых наивысшая удельная актлвность зафиксирована во фракциях ■ • микросом при низком содержании общей активности (не более 2$)..

• -. Таким образом,.с одной стороны, пайщзаится определенные '■ : черты сходства в представительстве глЕКозо-в-фосфатдегидрог?на-зы на различных фазах ргзвития тутового и Дубового шелвопрй-да", а с другой;стороны, замети значительные и закономерные • различия и датамшга активности 'фермента узтяхдаух видов.' Последние-, видимо, отражают сущаствопша различия: в интонсив^ нооти распада углеводов гго пептоэофо'с.фатно«у путяг на разшех >-,■ этапах развития насекомых. Из этого следует, что дальяеПшод . , Изуч0га1е:фкзлк0-хи2.01чес1глх свойств ГбЗЩ двух вздов насекомых.; - представляет нзеошшшый интерос дал. позлигои особеикзстой '

строения и функционирования ключевого фермента апотоулческоГр. пути распада углеводов у насэкошх.

Выделение Г6ФД из куколок тутового и дубового шелкопряда. Для выделения ГСФД из куколок тутового в дубового шелкопряда разработана универсальная процедура очистки, включающая гель-филътрацию сульфатно-аммошйкых осадков через софадекс а-100, аффинную хроматографию на цкбакрон-сефзрозэ 4В и аффинную хроматографию на 2',5-АДФ-свфЬрозе 4В, Хроштографическое поведение Г65Д при перечисленных процедурах сходно у куколок обоих видов (рис. 3-5). Используя предложенную схему очистки,оба фермента были выделены в гомогошюм состоянии с 1000-кратной степенью очистки и с высоким выходом по общей активности (табл, 2).

Полученные препараты ферментов использовали для определения физико-химических и кинетических свойств Г6ФД куколок тутового и дубового шелкопряда (табл. 3). Ферменты обоих видов сохраняют высокую каталитическую активность в достаточно"широком диапазоне рН, что свойственно и Т6ФД других видов животных ( СйиивМ., Ног!, 1977) Маниока, Ног1, 1980), Фермент тутового шелкопряда, теряющий активность после 10-минутной инкубации при 50°0, более термолабилен, чем фермент дубового шелкопряда, полная инактивация которого наступает при 60°С. Фермент иа обоих видов имеет достаточно низкие значения Км как по субстрату, так и по кофактору, причем для той и другой Г6ФД отмечено более высокое сродство к НАДф+, чем к глюкозо-6-фосфату.

' А280 лА340 , 2

I

. V - • . то 140 210 ' V (ни)

' Рис. 3. Гель-фильтрацяя Г6ФД'куколок тутового шелкопряда че-pes с&рдвкс G-IOO. I - слада белков (A^q) ; 2 - элюция Г6ФД (лЛз^0). '/,

-оде

-0,05-

к

N

I_

KCl (M)

0,8 0,6 0,4

- 0,2

номера фракций

10 20 30 60 70 80 90 100 Рис. 4. Аффинная хроматография Г6ФД куколок тутового шелкопряда на цибакрон-сефарозе 4В. I - элщия белков (Ajjqo^ ® ~ эла~ ция Г6ФД (aA^q) ¡ 3 - градиент концентрации KCl.

0,2

од

"280 . 0,04 340 л . 1

0,03 1 1 1 V ! \ 3 _____

0,02 ■JVz^ — ' / 1Р

У / ^хр.от. —i \ ■ / \ ./ Ч / \

У / 1 . Х- 1 1 - - т — Ух - - А-

KCl (М)

1,5 .

1,0 ■ ; 0,5

помора фракций

10 20 50 60 70 80

Рис. 5, Аффишая хроматография Г6ФД куколок тутового шелкопряда на 2'5-АДФ-СЕФАРОЗЕ 4В. I - элтапя белков (Aggo^J 2 - эл®-цхя Г6ФД' (äA^q) ; .3 - градиент концентрации KCl.

• -.Молекулярная масса Г6ФД тутового шелкопряда, определенная/ методом электрофореза в ПААГ, оказалась равной 232 ООО, а Г6ЗД .дубового шелкопряда - 605 ООО.Субъединнчнкй состав белковых молекул определяли методом электрофореза в полиакртаамидком ' геле в присутствии ДЦС- Тй; в качестве примера на рис. С при- . ведеш. соответствуйте данные по Г6ФД тутового шелкопряда;;> • * Полученные-дашше свидетельствуют о том," что Г6ФД тутового шелкопряда состоит, из '2-х типов оубъедшшц о Мг 51 ООО и 54 ООО, Г6ФД дубового шелкопряда такле состоит из двух тшюв ,

Таблица 2 . Очистка Г6ФД куколок тутового шелкопряда

Стадам очистки

Удельная активность, шлоль 1КДФН в и® на мг белка

Степень очистки

цато.м аммония (30-50$ насшце-

Осавденпе суль-гом Э-оС ния)

Гельфлльтрация через сеЗадекс а-ЮО

Хроматография на цлбакрон-сефарозе- 4В •

Хроматография на 2,5ЦАЖ'-се-фарозе 4В •

592 3408(100$) 5,76

39G 3216(96,7$) 8,12

11,55 1687(49,5$) '146,1

0,14 915(27$) 6625

I

1.5 25,4 1150

субъединиц, но их молекулярная масса намного ниже и составляет 25 ООО и 28 ООО; Эти данные свидетельствуют о том, что Г6ФД тухлого шелкопряда имеет тетрамерпуга структуру, что достаточно характерно для животных (Алексеев, 1980; Lee et al., 1978 ). Для Г6ФД дубового шелкопряда свойственна совершешю уникальная четвертичная структура, представленная, по-видимому, мультиме-рсм, состоящим из 24 субъединиц.

v Таблица 3

Свойства Г6ФД куколок тутового и дубового шелкопрядов

Источник фермента Оптимум ■ рИ Температура инактивации Субстратная специфичность Км (М)

по субстрату но. ндда+

Тутовый 7 Б_9 2 шелкопряд

Дубовый 7' 5_д п пелкопрзд J,u

50 ■60

™131Ада^С" 1.25x1o-5

й°НАда^С" 5•1x10-5 4,ЗхЮ-6

Результаты.изучения амипоккслотного.состава Г6ФД тутового '3 дубового шелкопряда представлены в таблице 4. В целок, ами-; нокязлотшй состав фермента напоминает таковой ГСФД представителей друщх таксономических групп. В частности характерна

lg Mr

A Б

I - Г6ФД .. I л II - субъедгошцы Г6ФД

Ферртшш (440 ООО)

Каталаза (232 ООО)

Лактатдеищроге- с п наза (140 ООО) 0,и

4,8

Бкчий сыворо-. точный альбтг-\мин (67 ООО) 4,С

4,4 -

Овальбужш (43 ООО)

Бычий сывороточный альбут.пш (67 ООО)

1ТТ .Каталаза 11 (60 ООО)

Лактотдегядрогз-* наза (36 ООО)

'^Ферритшг . ■ ■ (13 500)

0,1 0,5 0,9 1 0,1 0,5 0,9 1

Рпс. 6, Определение молекулярной массы Г6ФД тутового''шелкопряда (Л) и субъединиц, входящих в её состав (Б).

близость соотношения (Азх + Glx ) > ( Lya + Hie + Arg ), a также относительно высокое содеряание глицина, отмеченное ранее для Г6ФД, выделенных из других видов ( Matsuokn et al., 1983s Donohue et al., 1981 ), в то яо время у изученных нага ГйФД насекошх невысок уровень ароматических аминокислот и, напротив, значительно содерлание серила.

Таблица 4 ■ Аминокислотный состав Г6ФД куколок тутового и дубового шелкопряда (в моль %).

Амгего-кислоты ■Тутовый шелкопряд Дубовый' шелкопряд Аминокислоты Тутовый шелкопряд Дубовый шолкопряд

Азх 11,83 9,60 lie 7,08 3,75

Thr 8,49 . 5,04 Lou 9,45 6,00

Зег 14,74 12,18 Phe- . 3,60 следы

Glx 2,77- 10,38 . . His 1,91 1,47

0,83 ; ' 6,93 bys 0,50 2,42

Gly .•21,56 24,80 . Arg 1,55 -

Ala 8,32 . II,41 Tyr , следы.. • следы

Val 7,37 : 5,97-'

Сопоставление свойств Г6ФД двух рпдов насекомых, относятся к отряду Lepiioptera , указывает на их большое сходство

по основным физико-химическим и кинетическим параметрам, равно как и близость по этим показателя;/ к Г6ФД представителей других групп животных и микроорганизмов. В целом, единообразие физико-химических и кинетических свойств Г6ФД, выделенных из самых различных источников, свидетельствует о высоком эволюционном консерватизме строения и функций этого ключевого фермента одного из альтернативных путей обмена углеводов;

В дополнение к сравнительной характеристике Г6ФД двух видов насекомых в рожах диссертационной работы был выполнен эксперимент по массовому анализу удельной активности Г6ФД в грепе 14-и исходных пород и 20-и полученных от их скрещивания гибридов тутового шелкопряда. Исходя из полученных данных, сделан вывод о сопряженности уровня активности Г6ФД с проявлением гетерозиеных свойств у гибридов тутового шелкопряда. Результаты контрольной выкормки, проведенной на Ростелнстанция на основании составленного прогноза, подтвердили перспективность применения данного ферментативного теста для прогнозирования гетерозиса у гибридов тутового шелкопряда. Надежность и эффективность прогноза по Г6ФД возрастает при комплексном тестировании образцов грены на гетерозис, включая анализ активности таких ферментов, как кислая ДНКаза (Бочкова, 1982) и 'сорбитол-дегидрогеназа (Рог, 1986),

Выводы '

1. Динамика активности Г6ФД в онтогенезе тутового и дубового" шелкопряда существенно отличается в конце личиночного л начале куколочного развития, что свидетельствует о различной . ^интенсивности пептозофюсфатного пути обмена углеводов у двух изучаемых видов насекомых в этот период их развития. Активность Г&5Д наиболее шейка в жировом теле у тутового шелкопряда и в . стенке кишечника - у дубового. Й гемолимфе обоях видов активность Г6ФД практически отсутствует; *■'..'.'.'•'. ;■

2. Глюкозо-6-фос$атдэгадрогоназа в греий обоих.видов шелкопряда преимущественно локализована в цитозольной фракции, где сосредоточено более 9С$ общей активности фермента. Максимальная удельная активность Г6ФД зафиксирована в мшфосоМайьнбй фракции грены.' . ■ (, . ■...,.' ^

3. Г6ФД тутового и дубового шелкопряда характеризуется бжхгхшк вначейнями оптямума рИ, температуры инактивации, Ки-

'.кртячоокйх констант, одинаковой п абсолютной специфичностью ;

к глюко зо -G-фосфату и НАДФ+ в качестве кофермента, но резко различаются по значению молекулярной массы мультимеров, составляющих их субъединиц и умеренно - по содержанию аминокислот, В целом это свидетельствует в пользу представления об использо- ■ вании блочного принципа изменения структура мультимерных форм '' ■ Г6ФД в процессе эволюции коконопрядущих насекомых.

4. Разработана универсальная процедура выделения гомогенных препаратов Г6ФД из куколок тутового и дубового шелкопряда, позволяющая достичь 1000-кратной степени очистки фермента с ЗС$-ным ваходом по общей активности.

5. Биосинтез Г6ФД у тутового шелкопряда регулируется гормонально ( причем действие экдизона и аналогов ювенильного гормона разнонайравлено а парйые сутки посла обработки ими личинок У возраста.

6» Определение уровня удельной активности Г6ФД в грене исходных пород и полученных от их скрещивштя гибридов рекомендовано в качестве теста для раннего прогнозирования гетерозиса у гибридов тутового шелкопряда.

Список опубликованных работ по материалам диссертации

.I. Кутузова Н.М», Шамшина Т.Н., Борзаковская 33»B. Актив- . ность глккозо-6-фосфатдогидрогеназы в грене пород и гибридов тутового шелкопряда //Биохимия насекомых. М,: МГШ им. В,Й.Ленина. J98I. Вып. 23. С. 51-53« -■..','

Борзаковская Е.В., Филиппович Ю,Б., Конлчов A.C.', Шедько Э.П.- Изменение активности глисозо-б-фосх^тдегидрогеназы 1 в онтогенезе тутового и дубового шелкопрядов // Онтогенез, 1982. Т. 13. » 6. С. 660-564. . : '

3. Борзаковская Е.В,, Коничев A.C., Филиппович Ю.Б. .. . Выделение, очистка и свойства глхкозо-6ч*юсфатдогидрогеназы, ' дубового шелкопряда- // Тезисы докладов 17 Всесоюзного сишга- f . зиума "ПентозофосфатныЛ путь превращения углеводов» ого ме-' ханизм и регуляция", Калинин: 1984. С< 2t-22.

. 4* Коттчев A,C«, Зчкалов А.П4, Проскурина Борза-;;'

ковская Е.В. Выделение й характеристика ферментов» маркирующих явление гетерозиса у полезных видов // Труда IX съезда. ; Всесоюзного энтомологического общества., Киев: 1984. Часть I«, С.. 237-238. " ' ' ' ' ' ' ; '

' К. ' ■ ' ■ , ' ; ; .

5. Борзаковская E.B., Конячев A.C., Филиппович 10.Б., Иванов В.Г., Ханина В.А. Некоторые свойства высокоочищенной глюкозо-б-фосфатдегидрогеназы из куколок дуоового шелкопряда // Межвузовский сборник научных трудов: Биохимия насекомых, М.: МПЕ1 ш. В.И.Ленина. 1985. С. 12-18.

- 6. Грошева М.П., Борзаковская Е.В. Очистка глюкозо-6-фэефатдепшхэгсназы из куколок тутового шелкопряда на цибакрон-РЗ о А -с ефаро з // Межвузовский сборник научных трудов: Биохимия насекомых. М,: f.HTM им. В.И.Ленина. 1985. С. 37-40,

7. Борзаковская Е.В., Рог Л.Е., Коничев A.C. Выделение, очистка и свойства глшозо-6-фосфатдегидрогеназы и сорбитол-дегядрогеназы тутового шелкопряда // Тезисы стендовых сообщений У Всесоюзного биохимического съезда. М.: Наука. 1986. Т. 2. С. 30-31. -