Роль аминокислот в регуляции активности и множественных форм дегидрогеназ тутового шелкопряда

Гаверова, Юлия Геннадьевна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Роль аминокислот в регуляции активности и множественных форм дегидрогеназ тутового шелкопряда
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Роль аминокислот в регуляции активности и множественных форм дегидрогеназ тутового шелкопряда"

На правах рукописи

РГБ ОД

I 5 „

ГАВЕРОВА Юлия Геннадьевна

РОЛЬ АМИНОКИСЛОТ В РЕГУЛЯЦИИ АКТИВНОСТИ И МНОЖЕСТВЕННЫХ ФОРМ ДЕГИДРОГЕНАЗ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА

Специальность 03.00.04 - биологическая химия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в Московском педагогическом государственном университете на кафедре органической и биологической химии

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор КОНИЧЕВ А.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук ЕРЕМИНА OJO.

кандидат биологических наук ШАМШИНА Т.Н.

Ведущая организация: Институт биохимии РАН имени АН. Баха

Защита состоится ............2ООО г. в .^Н. часов

на заседании Диссертационного Совета К 053.01.01 в Московском педагогическом государственном университете по адресу: 129278, Москва, ул. Кибальчича, д. 6, корп. 5, ауд. 506.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского педагогического государственного университета по адресу: 119435, Москва, ул. Малая Пироговская, д. 1.

Автореферат разослан «..О?..».......f^^^fd!......2000 года

Ученый секретарь

Диссертационного Совета

ХОЛМОГОРОВА Н.В.

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Анализ содержащихся в современной литературе сведений о регуляции метаболических процессов у различных организмов показал, что в настоящее время уделяется значительное внимание воздействию на ферменты таких природных биологически активных веществ, как аминокислоты. Аминокислоты способны проникать практически во все структуры живых клеток и осуществлять регуляцию активности ферментов на уровне транскрипции, трансляции, посттрансляционной модификации и метаболизма (Eisenstein, 1995; Tipper, Kaufman, 1992; Rishikof et al., 1998; Xu et al., 1998; Kuwahata et al., 1998; Deboer et al., 1998). Аминокислоты могут модулировать действие и стимулировать секрецию гомонов (Macdonald et al., 1991; Dongryul et al., 1997; Ushida et al., 1998). Большинство работ по влиянию аминокислот на ферменты выполнено в системе in vitro и посвящено, в основном, аллостерической регуляции их активности. Наиболее изучены в этом плане ферменты аминокислотного и белкового обмена, причем преимущественно у растений (Тюльпанова, Еременко, 1976; Евстигнеева и др., 1985; Расулов, 1990; Lee et al., 1998). Проводятся работы по исследованию воздействия аминокислот in vivo на разнообразные обменные процессы у животных и человека (Кричевская и др., 1983; Massiilon et al., 1996; Bergamini et al., 1995). Имеются данные, хотя и весьма немногочисленные, о воздействии аминокислот на активность дегидрогеназ у разных объектов (Rosen-brough, 1996; Malik, Ahluwalia, 1994). С помощью аминокислот пытаются лечить некоторые нарушения обмена веществ у человека и животных (Dekoning et al., 1998; Lemosquet et а!., 1997).

Исследования по влиянию аминокислот на ферменты насекомых крайне немногочисленны. Изучению подвергались в основном ферменты аминокислотного и белкового обмена, и соответствующие исследования проводились преимущественно in vitro (Горленко, Грошева, 1984; Агад-жанян, Арутюнян, 1974). В то же время известно, что концентрация свободных аминокислот в организме насекомых достигает значительно более высоких значений, чем у других животных (Филиппович и др., 1992), поэтому пул свободных аминокислот, несомненно, играет важную роль в адаптационных процессах у насекомых (Band, Band, 1987). Вполне естественным выглядит предположение о дифференцированном влиянии аминокислот на активность отдельных форм ферментов насекомых, однако работ, посвященных регуляции множественных форм ферментов при участии аминокислот, очень мало (Пиункова и др., 1999).

Исходя из выше изложенного, исследование воздействия аминокислот на активность и множественные формы дегидрогеназ, непосредственно не связанных с аминокислотным обменом, представляется весьма интересным с точки зрения расшифровки значения аминокислот в регуляции разнообразных метаболических процессов у хозяйственно ценных видов насекомых и насекомых-вредителей. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы является изучение роли протеиногенных аминокислот в регуляции активности а-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и ма-латдегидрогеназы и их множественных форм в тканях и органах тутового шелкопряда и у гусениц большой вощинной моли, а также расшифровка возможных механизмов этой регуляции.

Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

1. Исследовать влияние аминокислот на активность и множественные формы а-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатде-гидрогеназы и малатдегидрогеназы в тканях и органах тутового шелкопряда in vivo и in vitro.

2. Сопоставить влияние аминокислот на активность и множественные формы дегидрогеназ у тутового шелкопряда и одного из видов насекомых-вредителей - большой вощинной моли.

3. Изучить возможность воздействия аминокислот на транскрипцию и трансляцию отдельных форм дегидрогеназ тутового шелкопряда с использованием соответствующих ингибиторов указанных процессов.

4. Выделить в индивидуальном состоянии и сопоставить физико-химические свойства присутствующей в норме (контрольной) формы одной из дегидрогеназ со свойствами форм, появляющихся в ответ на введение аминокислот, и проанализировать возможные механизмы их возникновения.

5. Исходя и'з сопоставления полученных данных, обсудить возможность регуляции метаболизма у насекомых аминокислотами. Научная новизна. Впервые исследовано влияние протеиногенных аминокислот на активность и множественные формы дегидрогеназ гусениц тутового шелкопряда и большой вощинной моли в опытах in vivo и in vitro. Показано, что воздействие аминокислот на эти ферменты видо- и тканеспецифично и зависит от времени экспозиции.

Установлена возможность воздействия отдельных аминокислот на процессы транскрипции и трансляции малатдегидрогеназы жирового тела тутового шелкопряда.

Разработана принципиально новая схема выделения и очистки НАД+-зависимой малатдегидрогеназы из жирового тела тутового шелкопряда, позволяющая достаточно быстро получить отдельные формы фермента в практически гомогенном состоянии.

Впервые охарактеризована одна из форм малатдегидрогеназы, появляющаяся в жировом теле тутового шелкопряда после инъекции аминокислот, выявлены различия в ее физико-химических параметрах по сравнению с формой, присутствующей в этой ткани в норме. Предложен возможный механизм образования высокоподвижной формы малатдегидрогеназы в результате ограниченного протеолиза исходной формы. Практическое значение работы. Полученные результаты расширяют представления о механизмах регуляции ферментов липидного и углеводного обменов у насекомых. Анализ полученных данных показывает, что аминокислоты играют важную роль в регуляции окислительно-восстановительных процессов в различных тканях и органах насекомых, и экстремально высокий уровень их концентрации имеет большое адаптационное значение для представителей этого класса животных.

Установлено, что аминокислоты способны существенно влиять на процессы транскрипции и трансляции, уменьшать действие антибиотиков и оказывать антистрессовое воздействие на организм насекомых. Показана способность аминокислот осуществлять контроль экспрессии отдельных форм малатдегидрогеназы в жировом теле тутового шелкопряда.

Полученные данные о влиянии аминокислот на метаболизм насекомых позволяют рассматривать их в качестве возможных регуляторов жизнедеятельности хозяйственно ценного вида насекомых - тутового шелкопряда, а также насекомых-вредителей.

Апробация работы. Результаты работы докладывались на 2-ом съезде биохимического общества РАН (Москва, май 1997 г.), IX съезде Русского энтомологического общества РАН «Проблемы энтомологии в России» (С.-Петербург, 1998), на конференции по итогам научно-исследовательской работы МПГУ (1997 г).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 6 статей и тезисов научных сообщений.

Структура и объем работы. Работа состоит из введения, обзора литературы, отражающего современные представления о роли аминокислот в регуляции активности ферментов, описания материалов и методов исследования, результатов эксперимента и их обсуждения, заключения и выводов. Диссертационная работа изложена на 154 страницах машинописного текста, содержит 42 таблицы, 32 рисунка. Список цитируемой литературы включает 225 названий.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Материалом для исследования служили гусеницы тутового шелкопряда Bombyx mori L. 5-го личиночного возраста пород Враца 4, Кавказ 2 и гибрида Кавказ 2 х Кавказ 1. Исследованию подвергали гемолимфу, жировое тело и стенку кишечника. В опытах использовали также гусениц большой вощинной моли Galleria mellonella L.

Для изучения влияния аминокислот на активность и множественные формы ферментов 10 мМ водные растворы 9 аминокислот: L-аргинина (арг), L-аспарагиновой кислоты (асл), L-шстидина (зис), глицина (гли), L-лейцина (лей), L-серина (сер), L-фенилаланина (фен) и L-цистеина (цис) вводили гусеницам путем подкожной инъекции в третий грудной сегмент. Через 2 и 24 часа после инъекции насекомых препарировали, препараты тканей гусениц тутового шелкопряда и личинок вощинной моли использовали для приготовления экстрактов растворимых белков. Экстракцию проводили 0,15 M раствором NaCI. Концентрацию белка в образцах определяли по методу Лоури (Lowry et al., 1951).

Активность дегидрогеназ определяли спектрофотометрически по изменению поглощения при 340 нм при образовании НАД(Ф)Н (Кочетов, 1980). За единицу активности фермента принимали такое его количество, которое катализирует образование 1 мкмоль НАД(Ф)Н в 1 мин. Удельную активность рассчитывали в единицах активности на 1 мг белка. Множественные формы дегидрогеназ выявляли методом энзимэлек-трофореза на колонках 5,5%-ного полиакриламидного геля (ПААГ). Для проявления зон их активности использовали тетразолиевый метод (Кочетов, 1980). Активность множественных форм дегидрогеназ оценивали по площадям пиков на денситограммах, полученных в результате сканирования гелевых колонок.

Для исследования влияния аминокислот in vitro на общую активность дегидрогеназ в реакционную смесь для спектрофотометрического определения их активности вместо 0,1 мл используемого буфера вносили 0,1 мл 10 мМ растворов аминокислот. Для изучения влияния аминокислот in vitro на множественные формы дегидрогеназ ферментный пре-

парат смешивали с растворами аминокислот в объемном соотношении 1 : 1 и проводили инкубацию в течение 15 мин.

Для исследования механизмов влияния аминокислот на активность и множественные формы малатдегидрогеназы за 1 час до инъекции аминокислот насекомым вводили по 2 мкл водных растворов ингибиторов транскрипции (актиномицина D, 20 мкг/особь) и трансляции (пуро-мицина, 5 мкг/особь).

Для выделения и очистки форм малатдегидрогеназы использовали методы осаждения сульфатом аммония, гельфильтрации через Ultro-gelAcA-44, препаративного электрофореза с последующей электроэлю-цией. Молекулярную массу форм определяли методом гельфильтрации через Sephadex G-100 с использованием в качестве белков-маркеров цитохрома с, ингибитора трипсина, овальбумина и бычьего сывороточного альбумина (Кочетов, 1980). Изоэлектрические точки определяли методом аналитического изоэлектрофокусирования в 5,5%-ном ПААГ.

Протеолитическую активность определяли по методу Ансона (Anson, 1939). Для изучения действия протеаз на малатдегидрогеназу в гомогенных образцах формы малатдегидрогеназы с Rf=0,42 растворяли навески пепсина, трипсина и папаина, доводя концентрацию фермента в каждом варианте до 2 мг/мл. Затем образцы инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Образование высокоподвижной формы малатдегидрогеназы в результате действия протеаз контролировали методом электрофореза.

ВЛИЯНИЕ АМИНОКИСЛОТ НА АКТИВНОСТЬ И МНОЖЕСТВЕННЫЕ ФОРМЫ ГЛЮКОЗО-6-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ, а-ГЛИЦЕРО-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ И МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ.

На первом этапе работы нами было исследовано влияние трех аминокислот: гли, гис и цис на активность и множественные формы малатдегидрогеназы (МДО, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г-6-ФДГ) и а-глицерофосфатдегидрогеназы (а-ГФДГ) гусениц большой вощинной моли in vivo. Результаты исследования позволили прийти к заключению, что определенные аминокислоты могут существенно усиливать или угнетать удельную активность а-ГФДГ, Г-6-ФДГ и МДГ и таким образом влиять на интенсивность разнообразных процессов углеводного и ли-пидного обмена у насекомых. Зти воздействия непосредственно связаны с изменениями в спектрах множественных форм изученных ферментов.

Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа тутового шелкопряда оказалась весьма отзывчива к воздействию аминокислот. На их инъекцию фермент отвечал многократным увеличением или уменьшением активности во всех исследованных тканях (табл. 1). Пей вызывает через 2 ч появление двух новых, более подвижных форм Г-6-ФДГ гемолимфы. Через 24 ч после инъекции гис возникала малоподвижная форма с Rf=0,09. Анализ активности множественных форм Г-6-ФДГ показал, что действие аминокислот сказывалось преимущественно на стабильно проявляющейся контрольной форме (Rf=0,28).

В жировом теле введение экзогенных аминокислот увеличивает активность фермента, сниженную под влиянием стресса от укола. Возможно, это связано с тем, что экзогенные аминокислоты корректировали соотношение концентраций эндогенных аминокислот, нарушенное стрессом, что отмечено также в различных тканях крыс (Dadmarz et al.,

Таблица 1.

Влияние аминокислот на общую активность дегидрогеназ в тканях и органах тутового шелкопряда in vivo.

Вариант опыта Активность

«-Глииегзо£ЬоссЬ атдегилоогеназа Глюкозо-б-сЬоссЬатдегидоогеназы Малатдегидвогеназа

2 ч после инъекции 24 ч после инъекиии 2 ч после инъекции 24 ч после инъекции 2 ч после инъекции 24 ч после инъекции

А х 10 % Ах 10г % Ах 101 % Ах 10' % Ах 10' % Ах 101 %

О 5 i- 8 8 о. к 0.80 + 0.02 0.80 + 0.02 0.59 ±0.13 0.59 ±0.13 0.66 + 0.12 0.68 + 0.12

к* 2.17 ±0.72 100 0 80 + 0.16 100 0.31 ± 0.06 100 0.04 ±0.01 100 5.83 + 0.04 100 7.75 + 0.02 100

АРГ 4.66 ± 1.94 21S 1.66 ±0,23. . 208 3.10 ± 0.80 1016 0.32 + 0.05 804 5.92 + 0.02 102 9,38+0.00 120

АСП .1.18*0.32 54 3.38 ±0.48 61 0.68 + 0.12 221 0.08 + 0,03 200 5.92 + 0 04 102 3.18 ±Q.00 40

ГИС 0.75 ± 0.23 35 0.9.1 ± 0,05 113 0,79 ±0.04 258 0.08 ±0.01 200 6.84+0.00 118 13.22 ±0.14 171

ГЛИ 0.53 ± 0.05 25 2.73 + 0.70 342 0.19 + 0.04 63 0.10 + 0.00 240 8.51 ±0.02 147 7 93+0 00 103

ЛЕИ 1.54 .+ 0.29 71 1.181Q.05 148 1.42 + 0.08 463 0.39 ±0.05 977,5 6.42 + 0.04 110 10.00 + 0.06 130

СЕР 0.63 ±0.09 29 0,7.4 ± 0,12 93 0.50 + 0.06 164 _ 5.47 + 0.05 94 8.85 ± 0.02 114

ФЕН 2.65 ±..0,24... 122 10,86 + 073 1357 0.77 ±0.13 253 0.43 + 0,01 1065 1.71 ±о.оа 28 9 ЙЗ + 0.03 123

ЦИС 2.39 ±0.11 110 2,09 + 0.13 261 0.2В + 0.07 84 0.15 + 0 00 362.5 6.84 + 0.05 118 ■8.14 + 0.00 105

< ё X 3" S * 3 г S g ш L- К 0.28 + 0.20 0.28 ± 0.02 0,32 ± 0,03 0.32 + 0 03 0.15 + 0.04 0.15 + 0 04

Кв 0.41+Ш)3.. 100 0.15 ±0.01 100 0.70 + 0.00 100 0.20 ±0,04 100J 0.90 + 0.04 100 О 75 + 0.07 100

АРГ 0.19 ± 0.01 46 0.16 + 0:004 _106, 0.20 + 0.001 29 0.12 + 0.001 60 0 90 + 0.04 100 1,14 + 0,04 157

АСП 0.1В+ 0.01 44 0.11+0.004 73 0.20 ± 0.001 23 0 72 + 0 001 110 1.02 + 0.04 111 0.62 + 0 04 86

ГИС 0.20 ± 0.01 49 0.14 ±0.01 93 0.16 ±0.00 23 0.18 + 0.01 90 1.02 + 0.04 111 102 + 0.09 143

ГЛИ 0.14 ±0.00 34 0.1Q + 0.01 67 о.2о±о:оо 29 0.17 + 0.01; 87 0.90 + 0 00 100 1:50 +О р4 200

ЛЕЙ 0.13 + 0.01 32 0.13 ±0.004 87 0.40 ± 0.001 57 .01+0.001 7Ь 1.14 + 0.04 122 0 90+ 0.07 129

СЕР 0.18 + 0.01 44 0.22 ± 0.01 147 . . 0.82 + 0.12 89 0 53 + 0.09 71

ФЕН 0.17 + 0.01 41 0.10 ±0.04 67 0.03 + 0.00 4 0.48 ±0.001 240 0.82 ±0.06 89 1 02 + 0 04 143

ЦИС К 56 67 29 125 144 +o'i 7 78 ^ 144 + 0.17 114

кя 3.75 + 0-53 100 1.61+0.00 100 4.51 ±0.32 100 21.70 + 1.11 100 0.54 + 0.05 100 4.88 ± 1.31 100

АРГ 4.2910.53 114 2.41 ± 0.48 150 0.58 + 0.14 12 0.84 + 0.07 4 0.80 + 0.16 150 4.42 + 0.79 91

АСП 3.22 ± 0.93 86 1.61 ±0 00 100 2.25 ±.0.16 . 50 1,93 ±0.83 9 0.32 + 0.09 60 2.73 + 0.58 56

ГИС 2.42 + 0 81 64 3.22 + 0.00 200 9.81 ±0.58 218 2.05 + 0 36 9 4.66+ 1.01 870 1.37 ±0.46 28

ГЛИ 4.50 + 1.70 120 , 3.22 ±0,93 200 1.72 + 0.41 38 3.86 ± 0.83 18 1.54 + 0.34 288 0,14 + 0.04 3

ЛЕЙ 4.00+ 0.80 107 1.15 ± 0.22 71 34.08 + 1.70 756 11.58 + 2.91 53 1.93 + 0.49 360 2.36 ± 0.69 48

ФБН 3,64 + 0,60 97 4.82 ±0,00 299 6.11+1.05 135,5 4.34 + 0.55 20 6.27 + 0.90 1170 1.13 ±0.32 23

ЦИС 3.75 + 0.53 100 . 2.S9.Í 0.56 180 4.02 ±1,25 89 ...4,34 ±0,55 20 3.12 + 0.75 582 . 1.38 ±0.25 28

Примечание: К - интактные насекомые; Ка - контрольные гусеницы (после инъекции 2 мкл воды); А - активность, мкмоль НАД(0)Н/мин на 1 особь; % - активность в

% к Кв

1998). В экспериментах in vitro нами установлено, что арг, фен, асп и цис существенно активировали фермент. Спектр множественных форм Г-6-ФДГ жирового тела оказался достаточно сильно подверженным влиянию аминокислот (рис. 1). Снижение или полное ингибирование активности одних форм Г-6-ФДГ компенсировалось повышением активности других, что во многих случаях приводило к увеличению общей активности и говорит о высокой степени приспособляемости этого важнейшего фермента пентозофосфатного пути обмена углеводов. Не менее важно то, что Г-6-ФДГ - липогенный фермент, поэтому важна его стабильность и тонкая регуляция в жировом теле - ткани, где преимущественно происходит синтез липидов у тутового шелкопряда (Филиппович, 1992). Сопоставление опытов in vivo и in vitro в целом указывает на опосредованное (не прямое) воздействие аминокислот на активность Г-6-ФДГ, осуществляемое вероятно на уровне транскрипции или трансляции соответствующих мРНК, хотя для отдельных аминокислот (арг) нельзя исключить и прямое воздействие аминокислот на молекулы фермента.

о п

0,2

0,4

0,6 -0,8 -

1,0

К КН2о арг асп гас гаи лей фен цис

Рисунок 1. Схема энзимограмм глкжозо-6-фосфатдегидрогеназы жирового тела тутового шелкопряда через 24 ч после инъекции аминокислот (К-интактные насекомые, Кн2о - после инъекции дистиллированной воды).

Выявленные нами изменения в наборе форм Г-6-ФДГ стенки кишечника, вызванные лей, скорее всего, связаны с его способностью воздействовать на процессы транскрипции и трансляции, продемонстрированной рядом исследователей на других объектах (Ки\л/а1та1а е1 а1., 1998; ОеЬоег е1 а1., 1998; Бодуата е! а!., 1998). Возможно также, что появление менее подвижных (более высокомолекулярных) форм Г-6-ФДГ связано с олигомеризацией, характерной для этого фермента (Борзаковская и др., 1991).

На а-ГФДГ гемолимфы аминокислоты оказывали незначительное влияние. В жировом теле через 2 ч инъекция асп, гис, гли, лей и сер приводила к снижению общей активности а-ГФДГ, а арг и фен - к ее увеличению. Через 24 ч после инъекции асп общая активность а-ГФДГ жирового тела уменьшалась почти на 40%, тогда как после введения остальных аминокислот, за исключением сер, она возрастала. Так как известно, что у насекомых есть глутаматные рецепторы, достаточно актив-

ные в отношении аспартата, а также рецепторы глицина (Лопатина и др., 1997; Лапшина, 1998), можно предположить, что действие аминокислот может быть опосредовано рецепторами нервной системы насекомого.

Инъекция аминокислот приводила через 2 ч к появлению в жировом теле новых форм а-ГФДГ с Rf=0,52; 0,40 и 0,27. В то же время, после инъекции ряда аминокислот а-ГФДГ с Rf=0,63 была частично или полностью ингибирована. Возможно, появление менее подвижных форм фермента в жировом теле гусениц тутового шелкопряда связано с усилением под действием аминокислот биосинтеза липидов, которые синтезируются у этого насекомого именно в жировом теле (Филиппович и др., 1992; Gakhar, Vandana, 1993).

Через 2 ч все исследованные аминокислоты вызывали значительное снижение активности а-ГФДГ стенки кишечника (табл. 1), которое сохранялось в течение суток почти во всех вариантах опыта. Через 2 ч после введения аминокислот наблюдалась тенденция к появлению менее подвижных форм а-ГФДГ в стенке кишечника, которая наблюдалась и в жировом теле насекомых. Наблюдаемые изменения в энзимограммах а-ГФДГ могут быть результатом альтернативного сплайсинга соответствующих мРНК, что отмечено для некоторых видов Drosophila в отношении этого фермента (Wilanowski et al, 1998; Wilanowski, Gibson, 1998).

Исследование влияния аминокислот in vivo на активность МДГ в гемолимфе, жировом теле и стенке кишечника показало, что их воздействие на фермент наиболее ярко выражено в гемолимфе (табл. 1), что вполне объяснимо, т.к. их гомеостаз очень важен для насекомых, и даже ничтожное изменение баланса аминокислот приводит к существенным метаболическим сдвигам. В гемолимфе все исследованные аминокислоты, за исключением асп, увеличивали активность фермента через 2 ч после инъекции, тогда как через 24 ч активность МДГ значительно снижалась по сравнению с контролем. В целом введение аминокислот вызывает заметные циклические изменения в активности изученных ферментов, что, вероятно, отражает характерные этапы адаптационных изменений в организме животных под действием самых разных биологически активных веществ (Цветков, 1999). В гемолимфе аминокислоты могут вызывать ингибирование активности ряда форм МДГ и одновременно индуцировать появление новых форм фермента. Ингибирование аминокислотами наиболее подвижных форм фермента было компенсировано высокой активностью менее подвижных.

В жировом теле следует отметить увеличение общей активности МДГ под действием гли (на 47%) через 2 ч после инъекции и гис (на 71%) через 24 ч, а также снижение ее через 2 ч после введения фен (на 72%) и через 24 ч после введения асп (на 60%) (табл. 1). В опытах in vitro обращает на себя внимание сильный ингибирующий эффект асп, что можно объяснить структурным подобием ее с субстратом МДГ. Однако и in vivo асп существенно снижала активность МГД, что дает возможность предположить вмешательство экзогенной асп в функционирование ма-лат-аспартатного цикла, ярко выраженного у тутового шелкопряда (Yagi-numa, Yamashita 1986). В жировом теле под влиянием всех исследованных аминокислот, за исключением гли и фен, исчезала высокоподвижная форма МДГ, появляющаяся через 2 ч после инъекции воды, что свидетельствует о способности аминокислот воздействовать на процессы в

организме насекомого, вызванные стрессом. Возможно, такое действие аминокислот связано с их влиянием на белоксинтезирующий аппарат клеток жирового тела, что коррелирует с литературными данными (В1оттааг1 е1 а1., 1995). Следует отметить появление высокоподвижных форм МДГ через 24 ч после введения ряда аминокислот (рис. 2). Так, лей стимулировал появление зоны с Яг=0,52, гис, гли и сер - с [^=0,60, гли и сер - с 1^=0,78. Можно предположить, что высокоподвижные формы МДГ являются результатом активируемого аминокислотами ограниченного протеолиза. %

О 0,2

0,4

0,6

0,8

1.0

К Кн.о аРг асП тие гли лей сер фен цис

Рисунок 2. Схема энзимограмм множественных форм малатдегидрогена-зы жирового тела тутового шелкопряда через 24 ч после инъекции аминокислот (условные обозначения см. рис. 1).

Для МДГ стенки кишечника нами установлено довольно существенное активирующее влияние всех аминокислот, за исключением асп и сер через 2 и 24 ч после инъекции (табл. 1). Аминокислоты оказывали значительное влияние на наборы множественных форм МДГ через 2 ч после введения. Так, появлялись малоподвижные формы под действием асп, гис, гли, лей и фен и новая форма с более высокой подвижностью под действием арг. Возможно, появление такого количества новых форм связано с тем, что аминокислоты вмешивались в процесс транскрипции, нарушая считывание гена МДГ РНК-полимеразой (Gesteland, Atkins, 1996). Через 24 ч влияние аминокислот на спектр множественных форм МДГ было менее заметным и выражалось в основном в исчезновении на энзимограммах некоторых зон активности фермента.

Различное влияние аминокислот на активность определенных форм фермента и индукция новых форм МДГ, отсутствующих в контроле, могут расцениваться как косвенное свидетельство воздействия аминокислот на процессы транскрипции и трансляции генетически детерминированных форм МДГ. Генетический контроль изоферментов МДГ у разных организмов, таких как мясные мухи, паутинный клещик, комар, известен из литературных данных (Tewari, Thakur, 1994; Goka, Takafuji, 1995; Dinardomiranda, Contel, 1996).

ИЗУЧЕНИЕ МЕХАНИЗМОВ ВОЗДЕЙСТВИЯ АМИНОКИСЛОТ НА МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗУ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИНГИБИТОРОВ ТРАНСКРИПЦИИ И ТРАНСЛЯЦИИ

Нами исследовано влияние ингибиторов транскрипции (актиноми-цина Э) и трансляции (пуромицина) на изменения в активности множественных форм МДГ жирового тепа личинок тутового шелкопряда породы Кавказ 2, вызываемых инъекцией пяти аминокислот (гли, гис, сер, фен и цис).

Через 2 ч после инъекции практически все аминокислоты в той или иной степени снимали ингибирующее воздействие актиномицина Э и пуромицина на общую активность МДГ. Через 24 ч после введения актиномицина О все исследованные аминокислоты увеличивали активность МДГ, что свидетельствует о значительной продолжительности биогенного эффекта аминокислот. Через сутки пуромицин подавлял активацию МДГ гис. Это может служить свидетельством того, что активирующее действие гис направлено на белоксинтезирующий аппарат клеток жирового тела.

Вместе с тем, в опытах с ингибиторами наблюдаются значительные и неоднозначные изменения в наборе множественных форм МДГ. Через 2 ч после инъекции актиномицина 6 по сравнению с контрольными насекомыми наблюдается исчезновение малоподвижной при электрофорезе (высокомолекулярной) формы МДГ ^=0,10), что, скорее всего, связано с репрессией транскрипции мРНК этой формы. Вместе с тем, у насекомых через 2 ч после введения антибиотика также проявляется отсутствовавшая в контроле, но появлявшаяся после введения аминокислот форма МДГ с Р^=0,52. Скорее всего, она является продуктом неспецифической реакции организма насекомого на введение чужеродных веществ. Через 2 ч после инъекции пуромицина появляется высокоподвижная (очевидно низкомолекулярная) форма фермента с- Р(=0,60. Эти данные в полной мере соответствуют представлениям о том, что пуромицин вызывает синтез укороченных полипептидов. В целом выявляется сильное антистрессовое и противоантибиотическое (биогенное) воздействие гли на уровне форм МДГ жирового тела тутового шелкопряда.

Через 24 ч у гусениц, которым вводили сер, наблюдается существенное изменение спектра форм МДГ: типичные для интактных насекомых формы исчезают, а взамен им возникают мощные высокомолекулярная форма с Р^=0,06, а так же низкомолекулярная форма с И^О.бО. Возможно, что сер каким-то образом задерживает трансляцию форм МДГ, так как аналогичные формы возникают при воздействии пуромицина. Через 24 ч актиномицин й продолжает блокировать синтез высокомолекулярных форм фермента (рис. 4.5). Биогенное воздействие гли, сер, фен и цис оказывается непродолжительным. Актиномицин О блокирует последствия введения аминокислот, что свидетельствует о том, что, изменения в наборах форм МДГ под действием аминокислот связаны с влиянием последних на транскрипционные процессы. Возможно, что появление под влиянием аминокислот форм с К; 0,42 и 0,52 связано со снижением специфичности аминоацил-тРНК-синтетаз и синтезом белков, обладающих малатдегидрогеназной активностью, но с измененной первичной структурой. Пуромицин, ингибируя трансляцию и, соответственно, включение аминокислот в белки, препятствует образованию ука-

занных форм МДГ. Ранее была показана возможность снижения специфичности аминоацил-тРНК-синтетаз мышц кролика при введении в рацион избытка какой-либо аминокислоты, результатом чего являлся синтез белков с измененной первичной структурой (Гулый и др., 1987).

ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА ФОРМ МАЛАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ, ВЫЯВЛЕННЫХ В ЖИРОВОМ ТЕЛЕ ТУТОВОГО ШЕЛКОПРЯДА ПОСЛЕ ИНЪЕКЦИИ АМИНОКИСЛОТ.

Полученные нами данные позволили установить, что через 24 ч после инъекции гли и сер в жировом теле появляется новая форма МДГ, обладающая высокой подвижностью в ПААГ, не выявляемая в жировом теле контрольных насекомых. Исследования с использованием ингибиторов транскрипции и трансляции, показали, что данная форма не является результатом специфической индукции биосинтеза МДГ под действием аминокислот. В целях изучения механизма образования этой формы мы сочли целесообразным выделить высокоподвижную форму фермента и сравнить ее с одной из форм, присутствующих в жировом теле у контрольных насекомых. В связи с этим нами была разработана оригинальная схема очистки интересующих нас форм МДГ, позволившая достаточно быстро получить их в индивидуальном состоянии.

Материалом для выделения двух форм МДГ (формы с 0,42 и 0,78) служило жировое тело насекомых, инъецированных гли, собранное через 24 ч после инъекции. Белки экстрагировали 0,15 М раствором N30, полученный экстракт служил в качестве исходного образца для выделения фермента. Выделение исследуемых форм МДГ включало следующие стадии: осаждение фермента из исходного экстракта сульфатом аммония (до 0,9 насыщения), гельфильтрация через Шгоде! АсА-44, концентрирование полученного с колонки образца методом диализа против раствора полиэтиленгликоля и препаративный электрофорез в пластинах ПААГ с последующей элюцией. Результаты выделения и очистки высокоподвижной формы МДГ представлены в таблице 2. Последний этап выделения позволил получить исследуемые формы МДГ в гомогенном состоянии (рис. 3). Удельная активность контрольной формы составила 2,61 ед./мг белка, формы, появлявшейся после введения гли и сер - 2,23 ед./мг белка. Таким образом, исследуемые формы были очищены в 30 и 26 раз соответственно (табл. 2), и, что особенно важно, получены практически гомогенные препараты, пригодные для дальнейшего изучения их физико-химических свойств.

Обнаруженные нами и выделенные из жирового тела молекулярные формы МДГ значительно различаются по электрофоретической подвижности, что позволяет предполагать существенные различия в значениях их изоэлектрических точек и молекулярных масс. Ранее было установлено, что МДГ, обнаруженная у различных организмов представляет собой димер с молекулярной массой 40-80 кДа, как правило состоящий из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой порядка 25-38 кДа (Кадеуата е\ а!., 1972; 1995; МиэгаК й а!., 1998; Сог-ЬоЬареЬгедоэа е1 а1„ 1998). Мы определили молекулярную массу исследуемых форм МДГ методом гельфильтрации через ЗерЬас1ех й-100 и установили, что для формы НАД+-МДГ с Р^=0,42 молекулярная масса равна 63 «Да, а для высокоподвижной формы с Я(=0,78 - 30 кДа.

Таблица 5.1.

Выделение и очистка двух форм малатдегидрогеназы из жирового тела

Стадия очистки Объем, мл Общая активность, единиц Содержание белка, мг Удельная активность, ед./мг белка Степень очистки Выход по активности, % Выход по белку, %

1. Исходный препарат 7 3,5 40,6 0,086 1 100 100

2. Осаждение (Ж4)2504 до 0,9 насыщения 5,2 3,81 20,5 0,186 2,2 109 50

3. Гельфильтра-ция через Шго-де! АсА44 5,5 0,67 2,67 0,251 2,9 19 6,5

4. Концентрирование против раствора ПЭГ (М=35000) 1,8 0,608 1,50 0,406 4,7 17 3,7

5.1. Препаративный электрофорез и электроэлюция из 5,5% ПААГ формы с (^=0,42 4 0,240 0,092 2,609 30,3 6,9 0,23

5.2. Препаративный электрофорез и электроэлюция из 5,5% ПААГ формы с 1^=0,78 4 0,168 0,075 2,225 25,9 4,8 0,19

R-f

0,2 0,4 0,6 0,8

101- 1— 1—1 1—1 1_1 + •'1.23 4 Рисунок 3. Схемы энзимограмм форм малатдегидрогеназы жирового тела тутового шелкопряда (24 ч после инъекции зли): 1-исходный препарат жирового тела; 2-очищенный препарат формы МДГ с Яг=0,42; 3-очищенный препарат формы МДГ с РИ0,78; 4 - после инкубации препарата формы с 1^=0,42 с пепсином.

Сравнивая полученные нами данные с литературными, можно заметить, что контрольная форма МДГ жирового тела по молекулярной массе сходна с димерными ферментами из других объектов, тогда как форма, выявленная после инъекции аминокислот, имеет молекулярную массу, близкую к массам субъединиц МДГ, выделенных из различных организмов. Это позволяет высказать предположение, что исследуемая высокоподвижная форма может оказаться каталитически активной субъединицей МДГ, в результате ограниченного протеолиза утратившей способность образовывать димерную молекулу. Ранее было показано, что НАДФ+-МДГ(КФ 1.1.1.82) из листьев гороха подвергалась ограниченному протеолизу с N-конца, что выражалось в образовании каталитически активных мономеров по 34,7 кДа (Kampfenkel, 1992).

Косвенным свидетельством справедливости нашего предположения могут служить различия изоэлектр^еских точек высокоподвижной и контрольной форм. Для формы НАД+-МДГ с Rf=0,42 изоэлектрическая точка равна 5,8, а для высокоподвижной формы с Rf=0,78 - 5,2. Эти данные вполне согласуются с литературными, хотя и имеют некоторые отличия (Jaussi, 1995). Кислые значения pi исследованных нами форм МДГ жирового тела позволяют предполагать, что они, скорее всего, локализованы в цитозоле. Существенные различия в значениях их молекулярных масс, а также тот факт, что форма, появляющаяся после инъекции аминокислот, обладает более низким значени<зм изоэлектрической точки, дают основание считать, что появление высокоподвижной формы МДГ обусловлено индукцией аминокислотами протеолитических ферментов цитозоля, которые отщепляют от контрольной формы фрагменты, в состав которых входят положительно заряженные аминокислоты.

Для проверки высказанного выше предположения о возможности индукции аминокислотами протеолиза в жировом теле нами были проведены соответствующие эксперименты по влиянию гли и сер на проте-олитическую активность в жировом теле in vivo. Была исследована активность протеаз жирового тела с оптимумом рН 3,4 и 6,2 через 24 ч после инъекции аминокислот и установлено, что гли увеличивал активность как кислой, так и нейтральной протеазы ~ в 1,8 раза. Возможно, инъекция гли индуцировала образование этих ферментов de novo.

Выявленное нами повышение активности протеаз гли позволило предположить, что протеазы жирового тела принимают участие в возникновении высокоподвижной формы МДГ в этой ткани. Это дало основание сделать попытку получить интересующую нас форму, воздействуя на препарат контрольной формы (с Rf=0,42) различными протеазами: пепсином, трипсином и папаином. После инкубации препарата МДГ (Rf=Q,42) с пепсином электрофоретически было выявлено присутствие обеих форм фермента: контрольной с Rf=0,42 и высокоподвижной с Rf=0,78 (рис. 3), что свидетельствует о том, что новая низкомолекулярная форма МДГ появляется в результате ограниченного протеолиза формы МДГ, присутствующей в жировом теле гусениц в норме.

ВЫВОДЫ.

mellonella. Введение насекомым растворов аминокислот приводит к весьма существенным изменениям в активности и спектрах множественных форм этих ферментов, напрямую не связанных с обменом аминокислот. Воздействие аминокислот на изучаемые ферменты видо- и тка-неспецифично и развивается во времени.

2. Различные аминокислоты могут существенно усиливать или угнетать активность а-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы гусениц большой вощинной моли и таким образом влиять на интенсивность процессов углеводного и липидного обменов у этого вида насекомых-вредителей. Воздействие аминокислот непосредственно связано с изменениями в спектрах множественных форм изученных ферментов. Наиболее отзывчив к инъекции аминокислот спектр форм НАД+-зависимой малатдегидрогеназы, в котором аминокислоты вызывают как появление новых форм, так и избирательное подавление активности других форм фермента.

3. Реакции а-глицерофосфатдегидрогеназы на инъекцию аминокислот у гусениц тутового шелкопряда существенно отличаются в разных тканях. Большинство аминокислот угнетают активность фермента в жировом теле и кишечнике через 2 часа после инъекции, однако, в то время как в стенке кишечника активность через сутки после инъекции остается сниженной, в жировом теле под действием большинства аминокислот она возрастает. Влияние аминокислот на а-глицерофосфат-дегидрогеназу гемолимфы незначительно. Выявлена тенденция к появлению малоподвижных форм а-глицерофосфатдегидрогеназы в стенке кишечника и жировом теле через 2 часа после введения аминокислот.

4. Глюкозо-б-фосфатдегидрогеназа тутового шелкопряда весьма отзывчива к воздействию аминокислот. На их инъекцию фермент отвечает многократным увеличением или уменьшением активности и изменением в наборах множественных форм. Снижение активности или полное ингибирование активности одних форм фермента компенсируется повышением активности других форм, что говорит о высоко развитой системе контроля активности ключевого фермента пентозофосфатного пути обмена углеводов у насекомых.

5. Воздействие аминокислот на НАД+-зависимую малатдегидроге-назу тутового шелкопряда наиболее ярко выражено в гемолимфе, причем, как показывает сопоставление результатов опытов in vivo и in vitro, изменения в активности не связаны с непосредственным влиянием аминокислот на молекулы фермента. Выявлена тенденция к ингибированию аминокислотами наиболее электрофоретически подвижных (анодных) форм фермента в этой ткани, которая компенсируется высокой активностью менее подвижных форм. L-Аспарагиновая кислота значительно снижает активность малатдегидрогеназы в жировом теле как в опытах in vivo, так и in vitro, что можно объяснить структурным подобием этой аминокислоты субстрату фермента, а также вмешательством ее в функционирование малат-аспартатного цикла. Во всех исследованных тканях гусениц тутового шелкопряда инъекция аминокислот оказывает существенное влияние на множественные формы малатдегидрогеназы, выражающееся как в ингибировании отдельных форм, так и в появлении новых, не присутствующих у насекомых в норме.

6. В опытах с актиномицином D и пуромицином установлено, что аминокислоты способны активно вмешиваться в процессы экспрессии генетического материала в жировом теле тутового шелкопряда. Они оказывают выраженное антистрессовое и противоантибиотическое действие, проявляющееся в отношении концентрации растворимых белков, общей активности и множественных форм малатдегидрогеназы. Наиболее мощным эффектом такого рода обладает глицин.

7. После инъекции глицина в жировом теле гусениц тутового шелкопряда возникают высокоподвижные формы малатдегидрогеназы, одна из которых (с Rf=0,78) с использованием методов гёльфильтрации и препаративного электрофореза выделена в гомогенном состоянии. Сопоставлены свойства данной формы со свойствами формы фермента (с Rf=0,42), функционирующей у контрольных (интактных) насекомых. Молекулярная масса возникающей в результате инъекции глицина формы составляет 30 кДа, что в 2 раза меньше молекулярной массы контрольной формы, а ее изоэлектрическая точка (pl=5,2) ниже, чем у исходной формы (pl=5,8), что дало основание предполагать, что высокоподвижная форма малатдегидрогеназы, появляющаяся после инъекции зли, является каталитически активным мономером.

8. В модельных опытах с использованием протеолитических ферментов (пепсина, трипсина и папаина) установлено, что появление после инъекции глицина высокоподвижной формы малатдегидрогеназы является результатом ограниченного протеолиза предсуществующей в жировом теле формы фермента и, вероятно, является каталитически активным мономером, возникшим в результате активации протеолитических ферментов, активность которых, как установлено, возрастает в тканях тутового шелкопряда после инъекции аминокислот.

9. Полученные данные открывают перспективу целенаправленной регуляции обменных процессов у насекомых' посредством протеиноген-ных аминокислот.

Список печатных работ, опубликованных по теме диссертации.

1. Гаверова Ю.Г., Коничев А.С., Филиппович Ю.Б., Пиункова С.А. Влияние аминокислот на аю-ивность и спектры множественных форм глю-козо-6-фосфатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы тутового шелкопряда.// Научные труды МПГУ им. В.И.Ленина, серия "Естественные науки". М„ "Прометей". 1996. С.266-270.

2. Гаверова Ю.Г., Морозова М.А., Пиункова С.А. Исследование влияния амиокислот на активность малатдегидрогеназы жирового тела тутового шелкопряда ¡n vivo и in vitro.// Научные труды МПГУ им. В.И.Ленина, серия "Естественные науки". М., "Прометей". 1997. С.77-78.

3. Ю.Г. Гаверова, А С. Коничев. Исследование влияния аминокислот на глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу и малатдегидрогеназу тутового шелкопряда.// Тезисы стендовых сообщений 2 съезда биохимического общества Российской академии наук (Москва, 19-23 мая 1997г.). Пущино. 1997.4.1. С.180.

4. Гаверова Ю.Г, Груздева Н.М., Коничев А.С., Коничева А.П., Морозова M А, Пиункова С.А., Филиппович Ю.Б. Влияние аминокислот на активность глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, малатдегидрогеназы и фос-фатазного комплекса ферментов в тканях и органах тутового шелкопряда Bombyx mori L. (Lepidoptera, Bombycidae).// Сборник научных

трудов IX съезда Русского энтомологического общества РАН "Проблемы энтомологии в России". С.-Пб. 1998. T.I. С.81.

5. Гаверова Ю.Г., Коничев А.С., Филиппович Ю.Б. Изучение влияния аминокислот на активность и множественные формы малатдегидроге-назы стенки кишечника гусениц тутового шелкопряда.// Научные труды МПГУ, серия "Естественные науки". М., "Прометей". 1998. С.234-236.

6. Gaverova J.G., Konichev A.S., Philippovich Yu.B. The Effects of Amino Acids on the Activities and Multiple Forms of Glucose-6-phosphate Dehydrogenase of Silkworm Bombyx mori L. Vl-th European Congress of Entomology. Czech Republic. Ceskc Budejovice, August 23-29, 1998. Abstract

(27).

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Гаверова, Юлия Геннадьевна

ВВЕДЕНИЕ.

Влияние аминокислот на активность ферментов обзор литературы).

Влияние аминокислот на ферменты микроорганизмов.

Влияние аминокислот на ферменты растений.

Влияние аминокислот на ферменты животных.

Материалы и методы.

Материал.

Введение аминокислот.

Приготовление экстрактов растворимых белков.

Определение активности а-глицерофосфатдегид-рогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и мал атдегидрогеназы.

Выявление множественных форм дегидрогеназ.

Определение активности множественных форм дегидрогеназ.

Исследование воздействия аминокислот на дегидрогеназы in vitro.

Исследование влияния аминокислот на уровне транскрипции и трансляции.

Методы выделения и очистки отдельных форм

НАД*-зависимой малатдегидрогеназы.

Осаждение растворимых белков сульфатом аммония.

Гельфильтрация.

Концентрирование образцов.

Препаративный электрофорез.

Определение молекулярных масс форм малатдегидрогеназы жирового тела методом гельфильтра

Определение изоэлектрических точек форм малатдегидрогеназы жирового тела методом изоэпектрофокусирования.

Определение протеолитической активности.

Исследование влияния протеолитических ферментов на образование высокоподвижной формы малатдегидрогеназы

Статистическая обработка результатов эксперимента.

Влияние аминокислот на активность и множественные формы малатдегидрогеназы, а-глицерофосфатдегидрогеназы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы тутового шелкопряда и вощинной моли.

Влияние аминокислот на активности и множественные формы малатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и а-глицерофосфатдегидрогеназы гусениц вощинной моли.

Влияние аминокислот на активность и множественные формы а-глицерофосфатдегидрогеназы в тканях и органах тутового шелкопряда.

Влияние аминокислот на активность и множественные формы глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в тканях и органах тутового шелкопряда in vivo и in vitro. Влияние аминокислот на активность и множественные формы малатдегидрогеназы в тканях и органах тутового шелкопряда.

Изучение механизмов воздействия аминокислот на малатдегидрогеназу тутового шелкопряда с использованием ингибиторов транскрипции и трансляции.

Выделение и свойства форм малатдегидрогеназы, выявленных в жировом теле тутового шелкопряда после инъекции аминокислот.

Выделение форм малатдегидрогеназы, выявленных в жировом теле тутового шелкопряда после инъекции глицина и серина.

Определение молекулярных масс исследуемых форм малатдегидрогеназы.

Определение изоэлектрических точек исследуемых форм малатдегидрогеназы.

Влияние аминокислот на протеолитическую активность в жировом теле и воздействие протеаз на контрольную форму малатдегидрогеназы.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Роль аминокислот в регуляции активности и множественных форм дегидрогеназ тутового шелкопряда"

АКТУАЛЬНОСТЬ ТЕМЫ.

Анализ содержащихся в современной литературе сведений о регуляции метаболических процессов у различных организмов показал, что в настоящее время уделяется значительное внимание воздействию на ферменты таких природных биологически активных веществ, как аминокислоты. Аминокислоты способны проникать практически во все структуры живых клеток и осуществлять регуляцию активности ферментов на уровне транскрипции, трансляции, посттрансляционной модификации и метаболизма (Eisenstein, 1995; Tipper, Kaufman, 1992; Rishikof et а!., 1998; Xu et al., 1998; Kuwahata et al., 1998; Deboer et al., 1998). Они также могут модулировать действие и стимулировать секрецию гомонов (Macdonald et al., 1991; Dongryul et al., 1997; Ushida et al., 1998). Большинство работ по влиянию аминокислот на ферменты выполнено в системе in vitro и посвящено, в основном, аллостерической регуляции их активности. Наиболее изучены в этом плане ферменты аминокислотного и белкового обмена, причем преимущественно у растений (Тюльпанова, Еременко, 1976; Евстигнеева и др., 1985; Расулов, 1990; Lee et al., 1998). Проводятся работы по исследованию воздействия аминокислот in vivo на разнообразные обменные процессы у животных и человека (Кричевская и др., 1983; Massillon et al., 1996; Bergamini et al., 1995). Имеются данные, хотя и весьма немногочисленные, о воздействии аминокислот на активность дегидрогеназ у разных объектов (Rosenbrough, 1996; Malik, Ahluwalia, 1994). С помощью аминокислот пытаются лечить некоторые нарушения обмена веществ у человека и животных (Dekoning et al., 1998; Lemosquet et al., 1997).

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Целью настоящей работы является изучение роли протеиноген-ных аминокислот в регуляции активности а-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и ма-латдегидрогеназы и их множественных форм в тканях и органах тутового шелкопряда, а также расшифровка возможных механизмов этой регуляции.

Для достижения этой цели были сформулированы следующие задачи:

5. Исходя из сопоставления полученных данных, обсудить возможность регуляции метаболизма у насекомых аминокислотами.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА.

Впервые исследовано влияние протеиногенных аминокислот на активность и множественные формы дегидрогеназ гусениц тутового шелкопряда и большой вощинной моли в опытах in vivo и in vitro. Показано, что воздействие аминокислот на эти ферменты видо- и тканеспеци-фично и зависит от времени экспозиции.

Установлена возможность воздействия отдельных аминокислот на процессы транскрипции и трансляции на примере малатдегидрогеназы жирового тела тутового шелкопряда. Установлено, что процессы транскрипции и трансляции в этой ткани достаточно чувствительны к концентрации некоторых аминокислот.

ПРАКТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ.

Полученные результаты расширяют представления о механизмах регуляции ферментов липидного и углеводного обменов у насекомых. Анализ полученных данных показывает, что аминокислоты играют важную роль в регуляции окислительно-восстановительных процессов в различных тканях и органах насекомых, и экстремально высокий уровень их концентрации имеет большое адаптационное значение для представителей этого класса животных.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Гаверова, Юлия Геннадьевна

выводы.

1. Впервые исследовано влияние протеиногенных аминокислот на активность и множественные формы а-глицерофосфатдегидрогеназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и малатдегидрогеназы гусениц тутового шелкопряда Bombyx mori и большой вощинной моли Galleria mellonella. Введение насекомым растворов аминокислот приводит к весьма существенным изменениям в активности и спектрах множественных форм этих ферментов, напрямую не связанных с обменом аминокислот. Воздействие аминокислот на изучаемые ферменты видо- и тка-неспецифично и развивается во времени.

3. Реакции а-глицерофосфатдегидрогеназы на инъекцию аминокислот у гусениц тутового шелкопряда существенно отличаются в разных тканях. Большинство аминокислот угнетают активность фермента в жировом теле и кишечнике через 2 часа после инъекции, однако, в то время как в стенке кишечника активность через сутки после инъекции остается сниженной, в жировом теле под действием большинства аминокислот она возрастает. Влияние аминокислот на а-глицерофосфатдегидрогеназу гемолимфы незначительно. Выявлена тенденция к появлению малоподвижных форм а-глицерофосфатдегидрогеназы в стенке кишечника и жировом теле через 2 часа после введения аминокислот.

4. Глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа тутового шелкопряда весьма отзывчива к воздействию аминокислот. На их инъекцию фермент отвечает многократным увеличением или уменьшением активности и изменением в наборах множественных форм. Снижение активности или полное ингибирование активности одних форм фермента компенсируется повышением активности других форм, что говорит о высоко развитой системе контроля активности ключевого фермента пентозофосфатного пути обмена углеводов у насекомых.

1^=0,42), функционирующей у контрольных (интактных) насекомых. Молекулярная масса возникающей в результате инъекции глицина формы составляет 30 кДа, что в 2 раза меньше молекулярной массы контрольной формы, а ее изоэлектрическая точка (р1=5,2) ниже, чем у исходной формы (р1=5,8), что дало основание предполагать, что высокоподвижная форма малатдегидрогеназы, появляющаяся после инъекции гли, является каталитически активным мономером.

8. В модельных опытах с использованием протеолитических ферментов (пепсина, трипсина и папаина) установлено, что появление после инъекции глицина высокоподвижной формы малатдегидрогеназы является результатом ограниченного протеолиза предсуществующей в жировом теле формы фермента и, вероятно, она является каталитически активным мономером, возникшим в результате активации протеолитических ферментов, активность которых, как установлено, возрастает в тканях тутового шелкопряда после инъекции аминокислот.

9. Полученные данные открывают перспективу целенаправленной регуляции обменных процессов у насекомых посредством протеиноген-ных аминокислот.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Проведенные нами исследования показали, что аминокислоты обладают выраженным регуляторным эффектом в отношении разнообразных метаболических процессов, протекающих в организме насекомых. Полученные данные красноречиво свидетельствуют о важной роли, которую играют аминокислоты на всех уровнях регуляции обмена веществ в тканях и органах гусениц тутового шелкопряда. Отдельные аминокислоты способны напрямую воздействовать на молекулы ферментов, заметно изменяя их активность. Так, асп ингибирует МДГ, связываясь, по-видимому, с активным центром определенных форм этого фермента, фен повышает активность Г-6-ФДГ, что, возможно, связано с конформа-ционными изменениями молекул энзима. Однако, непосредственное воздействие аминокислот на исследованные нами дегидрогеназы скорее исключение, чем правило. Мишенью для вводимых нами аминокислот являлись другие процессы, такие как транскрипция, биосинтез белка, протеолиз, транспорт веществ через мембраны, и наблюдаемые нами изменения в активности и наборах множественных форм а-ГФДГ, Г-6-ФДГ и МДГ являются лишь звеньями в достаточно длинной цепи событий, происходящих в организме тутового шелкопряда после инъекции аминокислот. Конечным итогом в данном случае являлись изменения в жизнедеятельности целого организма насекомого. Наиболее ярко эти изменения проявлялись в двух вариантах опыта. Через сутки после инъекции гли у гусениц тутового шелкопряда породы Враца 4 наблюдалось значительное повышение двигательной активности, а после инъекции сер, напротив, гусеницы выглядели вялыми и двигались мало. И в обоих случаях завивка кокона началась позже, чем у других насекомых.

Не вызывает сомнения факт, что аминокислоты способны влиять на экспрессию различных генов у тутового шелкопряда. Механизм этого влияния еще не ясен и требует дальнейшего исследования. Вполне возможно, что аминокислоты связываются с какими-либо белками-регуляторами, приводя к репрессии или, наоборот, дерепрессии транскрипции соответствующих генов. Не стоит исключать и возможность связывания аминокислот непосредственно с нуклеиновыми кислотами. Например, нами установлено, что влияние сер и цис на одну из форм МДГ жирового тела совпадает с таковым ингибитора транскрипции актиноми-цина О, что дает возможность предположить сходный механизм связывания этих аминокислот с ДНК. Возможно также, что связывание аминокислот с отдельными нукпеотидными последовательностями изменяет считывание информации РНК-полимеразой.

Аминокислоты способны стимулировать и ингибировать биосинтез белка. Появление новых форм МДГ на уровне трансляции едва ли можно объяснить целенаправленным действием аминокислот на биосинтез именно этих форм. Вероятно, влиянию аминокислот подвергался бело-ксинтезирующий аппарат в целом, независимо от того, какая мРНК транслируется. Возможно, происходит взаимодействие с рибосомными белками или факторами трансляции, хотя не стоит исключать воздействие таких аминокислот, как гли на конформацию различных РНК.

Столь широкий спектр эффектов аминокислот позволяет им осуществлять контроль практически над всеми процессами в организме насекомых. Они способны изменять направление метаболических процессов, осуществлять «переключение» путей обмена различных веществ. Несомненно регуляция метаболизма насекомых при участии аминокислот сложилась на достаточно ранних этапах эволюции, и высокие концентрации аминокислот в гемолимфе и других тканях имеют большое адаптационное значение.

Обращает на себя внимание выраженный антистрессовый эффект некоторых аминокислот. Их способность уменьшать действие стресса может реализоваться через самые разнообразные механизмы, в том числе через изменения в процессах транскрипции и трансляции, через нервную и эндокринную системы. Механизм антистрессового действия аминокислот, также как и механизм действия самого стресса на ферменты биологического окисления насекомых представляет большой теоретический и практический интерес и требует дальнейшего исследования.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Гаверова, Юлия Геннадьевна, Москва

1. Агаджанян А.Х., Арутюнян Л.М., Гукасян Дж.Г. Взаимосвязь аргиназы и ферментов биосинтеза пролина у жуков фасолевой зерновки // Биол. ж. Арм.1980. Т.ЗЗ, № 6. С.638-643.

2. Акимова Н.И., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Регуляция метаболизма глутамина у Chlorella pyrenovidosa. Регуляция активности глутаминсинтетазы аминокислотами//Биохимия. 1976. Т.41, вып. 8. С.1471-1478.

3. Амбарцумян A.A., Безирджян Х.О. Валин.пируват-аминотрансфераза Brevibacterium flavum: каталитические свойства//Биохимия. 1994. Т.59, в.9. С.1385-1392.

4. Борзаковская Е.В. Сравнительная характеристика глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы тутового и дубового шелкопряда / Автореф. дисс. канд. биол. наук. 1987. Москва. 16 с.

5. Борзаковская Е.В., Коничев A.C., Филиппович Ю.Б. Выделение и физико-химические свойства глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы куколок тутового шелкопряда // Биохимия. 1991. Т.56, в.10. С. 12401246.

6. Быкова Е.В., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Очистка, свойства и регуляция активности глутаминсинтетазы из корней пшеницы//Прикладная биохимия и микробиология. 1988. Т.24,№1. С.14-19.

7. B.Л. Очистка, четвертичная структура и некоторые свойства глутаминсинтетазы из корней тыквы // Биохимия. 1984. Т.49, вып.4.1. C.599-606.

8. Горленко В.А., Трошева М.П. Влияние аминокислот и некоторых пептидных акцепторов на активность у-глутамилтрансферазы в тканях тутового шелкопряда / Биохимия насекомых. М., МГПИ. 1984. С. 92-102.

9. Евстигнеева З.Г., Пушкин A.B., Голова Т.П., Кретович В.Л. Возможный механизм и физиологическое значение ингибирования активности глутаминсинтетазы корней тыквы аминокислотами //Биохимия. 1985. Т.59, в.1. С.91-96.

10. Кара-Мурза С.Н., Ивановская Л.В., Жданова Н.М. Влияние аминокислот на активность ß-аспартокиназы Corynebacterium glutamicum штамма дикого типа и его мутанта // Прикладная биохимия и микробиология. 1978. т. 41, №3, T.XIV. С.345-354.

11. Кпунова С.М., Тарасенко Н.В., Киреева З.В. Изучение протеолитического комплекса ферментов в гемолимфе и шелкоотделительной железе тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития // Биохимия насекомых. М„ МГПИ. 1987. С.112-120.

12. Коен Ф. Регуляция ферментативной активности. М., Мир. 1986. 735 с.

13. Кометиани И.Б. Исследование дегидрогеназного комплекса ферментов некоторых насекомых в норме и под влиянием регуляторов роста /Дисс. канд. биол. наук. 1995. Москва. 146 с.

14. Коничев A.C. Физико-химическая и функциональная характеристика множественных форм ферментов насекомых/Автореф. дисс. док. биол. наук. 1991. Москва. 48 с.

15. Коничев A.C. Метаболическая роль множественных форм глюкозо-1-фосфатазы, NAD+- и 1МАОР+-зависимых сорбитолдегидрогеназ, кислой фосфатазы и глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы в тканях и органах тутового шелкопряда // Биохимия. 1997, т.62, в.5. С.635-643.

16. Коничева А.П., Орловская В., Цветаева И.А. Применение ферментативных тестов при улучшении питательных сред для насекомых путем внедрения отдельных аминокислот / Биохимия насекомых. Москва. 1984. С.125-138.

17. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М., Высшая школа. 1971. С.15-18.

18. Кочетов Г.А. Практическое руководство по энзимологии. М., Высшая школа. 1980. 272 с.

19. Кретович В.Л., Серебренников В.М., Ауэрман Т.А. Регуляция активности глутаминсинтетазы кормовых дрожжей Candida tropicalis конечными продуктами обмена глутамина // Биохимия. 1976. Т.41, в.1. С. 167-174.

20. Кричевская A.A., Шугалей B.C., Цветненко Е.З., Ананян A.A. Защитное действие аргинина при гипероксии. Активность глутаминазы и глутаматдекарбоксилазы мозга //Вопр. мед. химии. 1978. Т.24, №1. С.42-46.

21. Кричевская A.A., Шугалей B.C., Ананян A.A., Степнина Е.Г. О механизмах влияния адаптации к холоду на устойчивость организма к гипероксии //Физиол. журнал. 1982. Т.68, №10. С.1427-1430.

22. Кричевская A.A., Лукаш А.И., Шугалей B.C., Бондаренко Г.И. Аминокислоты, их производные и регуляция метаболизма. Изд-во Ростовского университета. 1983. 216с.

23. Лапшина И.Б, Роль аспартатных рецепторов в нервно-мышечной передаче у саранчи Locusta migratoria//Журнал эволюционной биохимии и физиологии. 1998. Т.34, №1. С.19-27.

24. Леушин С.Г., Яковлев B.C., Сечин В.А., Сечина М.А. Влияние препаратов аминокислот на использование питательных веществ рационов. Оренбург. 1990. С.14 -18.

25. Манковская И.Н., Носарь В.И., Назаренко А.И., Говоруха Т.Н., Братус Л.В. Некоторые механизмы антигипоксического действия таурина //Физиологический журнал. 1992. Т.38, №5. С.81-88.

26. Пиункова С.А., Коничев A.C., Филиппович Ю.Б. Влияние аминокислот на активность фосфатазного комплекса капустной белянки (Pieris brassicae L.)//Прикладная биохимия и микробиология. 1999. Т.35, №6. С.657-661.

27. Пушкин A.B. Свойства и регуляция глутаминсинтетазы гороха / Автореф. дисс. канд. биол. наук. 1973. Москва. 16 с.

28. Пушкин A.B., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Влияние аминокислот на активность глутаминсинтетазы гороха//Физиология растений. 1974. Т.21, №3. С.512-517.

29. Расулов A.C., Шакиров З.С., Евстигнеева З.Г., Цупрун В.Л., Кретович

30. B.Л. Четвертичная структура глутаминсинтетазы A. braunii // Биохимия. 1986. Т. 51. в.З. С.413-419.

31. Расулов A.C. Глутаминсинтетаза одноклеточных зеленых водорослей и её регуляция / Автореф. дисс. док. биол. наук. 1990. Москва. 49 с.

32. Расулов A.C. Шакиров З.С., Евстигнеева З.Г., Кретович В.Л. Регуляция активности молекулярных форм глутаминсинтетазы Ankistrodesmus braunii аминокислотами// Биохимия. 1990. Т.55, в.2.1. C.256-261.

33. Русских Г.С. Молекулярные механизмы регуляции множественных форм глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и гексокиназы при стрессе. / Дисс. канд. биол. наук. 1992. Новосибирск. 153 с.

34. Тарасенко Н.В. Исследование комплекса белковых ингибиторов протеолитических ферментов тканей и органов тутового шелкопряда на заключительном этапе его личиночного развития. /Дисс. канд. биол. наук. 1999. Москва. 141 с.

35. Тюльпанова Э.С., Еременко В.В. Регуляция аминокислотами образования L-аспарагиновой кислоты у Bacillus mesentericus // Микробиология. 1976. т.45, вып. 2. С.259-265.

36. Филиппович Ю.Б., Щеголева Л.И. Исследование растворимых белков тканей тутового шелкопряда методом электрофореза в полиакриламидном геле //Доклады АН СССР. 1967. Т. 174, №1. С.240-242.

37. Филлипович Ю.Б., Коничев A.C. Множественные формы ферментов насекомых и проблемы сельскохозяйственной энтомологии. М. Наука, 1987 168 с.

38. Филлипович Ю.Б., Лаптева Т.И., Никитина И.А. Основы биохимии тутового шелкопряда. М. Прометей. 1992. 304 с.

39. Цветков В.Л. Кислая фосфатаза гидробионтов как маркерный фермент токсического воздействия на организм / Автореф. дисс. канд.биол. наук. 1998. Москва. 15 с.

40. Чарыков А.К. Математическая обработка результатов химического анализа. Л., Химия. 1984. С.22-26.

41. Ahmed A., Maxwell D.L., Taylor P.M., Rennie M.J. Glutamine transport In human skeletal muscle//Amer. J. Physiol. 1993. V.264, №6. P. E993-E1000

42. Akamatsu Y., Shimada M. Suppressive Effect of L-phenylalanine on lignin peroxidase in the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium // FEMS Microbiol. Lett. 1995. V.131, №2. P. 185-188.

43. Akamatsu Y., Shimada M. Suppressive effect of L-phenylalanine on manganese peroxidase in the white rot fungus Phanerochaete chrysosporium // FEMS Microbiol. Lett. 1996. V.145, №1. P. 83-86.

44. Anson M.L. The estimation of pepsin, trypsin, papain and cathepsin with hemoglobin //J. Gen. Physiol. 1939. V.22, №1. P.79-82.

45. Aoyama Y., Takagi M., Yoshida A. Excess dietry histidine accumulates lipids in rat liver//Сотр. Biochem. Physiol. A. 1995. V.112, №3-4. P. 503509.

46. Ariasmontano J.A., Martinezfong D., Aceves J. Glutamate stimulation of tyrosine hydroxylase is mediated by NMDA receptors in the rat striatum // Brain Research. 1992. V.569, №2. P. 317-322.

47. Balsam L., Nikbakht N. L-Arginine inhibits vasopressin-stimulated mesangial cell Ca2+//Amer. J. Physiol. Cell Physiology. 1998. V.44, №2. P. C352-C357.

48. Band H.T., Band R.N. Amino acid and allozyme frequency changes in overwintering Chymomyza amoena (Diptera, Drosophilidae) larvae // Experientia. 1987. V.43, №9.

49. Baran H., Okuno E., Kido R., Schwarcz R Purification and characterization of kynurenine aminotransferase I from human brain//Neurochem. 1994. V.62, №2. P.730-738.

50. Berg E.A., Wu J.Y., Campbell L., Kagey M., Stapleton S.R. Insulin-like effects of vanadate and selenate on the expression of glucose-6-phosphate dehydrogenase and fatty acid synthase in diabetic rats // Biochimie. 1995. V.77, №12. P. 919-924.

51. Bergamini E., Bombara M., Delroso A., Gori Z., Masiello P., Masini M., Pollera M., Vittorini S. The regulation of liver protein degradation by amino acids in vivo effects of glutamine and leucine //Arch. Physiol. Biochem. 1995. V.103, №4. P. 512-515.

52. Bergh K.T., Brakhage A.A. Regulation of the Aspergillus nidulans penicillin biosynthesis gene Acva (Pcbab) by amino acids implication for involvement of transcription factor Pacc//Appl. Envir. Microbiol. 1998. V.64, №3. P. 843-849.

53. Berkemeyer M., Scheibe R., Ocheretina O. A novel, non-redox-regulated NAD-dependent malate dehydrogenase from chloroplasts of Arabidopsis thaliana L. //J. Biol. Chem. 1998. V.273, №43. P. 27927-27933.

54. Blommaart E.F.C., Luiken Y.J. F.P., Blommaart P.J.E., Woerkom G.M., Meijer A.Y. Phosphorylation of ribosomal protein S6 is inhibitory for autophagy in isolated rat hepatocytes//J. Biol. Chem. 1995. V.270, №5. P.2320-2326.

55. Bodnaryk R.P., Bronskill J.F., Fetterly J.R. Membrane-bound y-glutamyl transpeptidase and its role in phenylalanine absorbtion-reabsorbtion in thelarva of Musca domestica // J. Ins. Physiol. 1974. V.20, №1. P.167-174.

56. Borsa P., Gingerich D.P. Allozyme variation and an estimate of the inbreeding coefficient in the coffee berry borer, Hypothenemus hampei (Coleoptera, Scolytidae) II Bull. Entomol. Research. 1995. V.85, №1. P. 2128.

57. Bourtzis K., Marmaras V.J. Integumental phosphatase isoenzymes from white puparia of Ceratitis capitata isolation and characterization//Biochemistry and Cell Biology. 1991. V.69, №10-1. P. 731-735.

58. Breiter D.R., Resnik E., Banaszak L.J. Engineering the quaternary structure of an enzyme construction and analysis of a monomeric form of malate dehydrogenase from Escherichia coli//Protein Science. 1994. V.3, №11. P. 2023-2032.

59. Brodey M.M., Bishop S.H. Malate dehydrogenase isoforms from ribbed mussel (Modiolus demissus) gill tissue II Comp. Biochem. Physiol. B. Comparative Biochemistry. 1991. V.100, №4. P. 775-782.

60. Chimpendale G.M. Metamorphic changes in the fat body proteins of the southweatern corn borner, Diatraea grandiosella//J. Insect Physiol. 1970. V.16, №6. P. 1057-1068.

61. Chimpendale G.M., Kilby B.A. Relatioship between the proteins of the hemolymph and fat body during development of Pieris brassicae // J. Insect Physiol. 1969. V.15, №5. P. 905-926.

62. Cohen G.H. The aspartokinases and homoserine dehydrogenases of E. coli//Current Topics of Cellular regulation. 1969. V.1. P. 184-231.

63. Coles G.C. Haemolymph and moulting in Phodnius prolixus Stal //J. Insect Physiol. 1965. V.11, №10. P. 1317-1323.

64. Collet V., Carrez D., Croisy A., Dimicoli J.L. Effect of methionine on glycolysis in tumor cells in vivo and in vitro NMR-studies // NMR in Biomedicine. 1996. V.9, №2. P. 47-52.

65. Conovas F., Valpuesta V., Nunez D.C. Characterization of tomato leaf glutamine synthetase // Plant. Sci. Lett. 1984. V.37, №1-2. P. 79-85.

66. Contel E., Mestringer M., Martins E. Genetic control and developmental expression of malate dehidrogenase in Apis mellifera // Biochem. Genet. 1977. V.15. P.859-876.

67. Cordobapedregosa M.C., Gonzalezreyes J.A., Serrano A., Villalba J.M., Navas P., Cordoba F. Plasmalemma-associated malate dehydrogenase activity in onion root cells // Protoplasma. 1998. V.205, №1-4. P. 29-36.

68. Cunningham M.A., Ho L.L., Nguyen D.T., Gillilan R.E., Bash P.A. Simulation of the enzyme reaction mechanism of malate dehydrogenase // Biochemistry. 1997. V.36, №16. P. 4800-4816.

69. Dadmarz M., Vanderburg C., Milakofsky L., Hofford J.M., Vogel W.H.

70. Effects of stress on amino acids and related compounds in various tissues of fasted rats // Life Sciences. 1998. V.63, №16. P. 1485-1491.

71. Davis J.R. Disc electrophoresis. Method and application to human serum proteins //Ann. N-Y. Acad. Sei. 1964. V.121, №2. P. 404-427.

72. Deboer M., Bebelman J.P., Goncalves P.M., Maat J., Vanheerikhuizen H., Planta R.J. Regulation of expression of the amino acid transporter gene Bap3 in Saccharomyces cerevisiae//Molecular Microbiology. 1998. V.30, №3. P. 603-613.

73. Dehpande B.S., Ambedkar S.S., Shewale J.G. Effect of amino acids on the production and activities of cephalosporin C acylase and penicillin V acylase from Aeromonas species Acy-95//J. Basic Microbiology. 1997. V.37, №6. P. 403-405.

74. Denbutter G., Lindeil S.L., Sumimoto R., Schilling M.K., Southard J.H., Beizer F.O. Effect of glycine in dog and rat liver transplantation //Transplantation. 1993. V.56, №4. P. 817-822.

75. Deuel T.S., Lowie F., Lerner A. Glutamine synthetase from rat liver. Purification, properties and preparation of specific antisera // J. Biol. Chem. 1978. V.253, №17. P. 6111-6118.

76. Dinardomiranda L.L., Contel E.P.B. Enzymatic variability in natural populations of Aedes aegypti (Diptera, Culicidae) from Brazil//J. Med. Entomol. 1996. V.33, №5. P. 726-733.

77. Dongryul L., Kondo H., Furukawa S., Nakano K. Stimulation of NGF production by tryptophan and its metabolites in cultured mouse astroglial cells // Brain Research. 1997. V.777, №1-2. P. 228-230.

78. Dungan S.M., Datta P. Confected feetback inhibition. Purification and some properties of aspartokinase from Pseudomonas fluorescens//J. Biol. Chem. 1973. V.248, №24. P.8534-8540.

79. Eceleston M., Kelly D.P. Competition among amino acids for incorporation into Methycoccus capsulatus //J. Gen. Microbiol. 1972. V.73, №2. P. 303314.

80. Eceleston M., Kelly D.P. Assimilation and toxicity of some exogenous compounds, alcohol, sugars and acetate in the methane-oxidizing bacterium Metylococcus capsulatus//J. Gen. Microbiol. 1973. V.75, №1. P.211-221.

81. Eisenstein E. Allosteric regulation of biosynthetic threonine deaminase from Escherichia coli effects of isoleucine and valine on active site ligand binding and catalysis//Arch. Biochem. Biophys. 1995. V.316, №1. P. SUSIS.

82. Eklove H., Webb R.A. The Effect of L-glutamate and related agents on adenylate cyclase in the cestode Hymenolepis diminuta // Can. J. Physiol. Pharmacol. 1991. V.69, №1. P. 28-36.

83. Enzyme Handbook I Eds. D.Schoburg, M.Salzmann. Springer-Verlag. Berlin; N.Y.; London; Paris; Tokyo; Hong-Kong; Barselona. 1991-1996. V.1-12.

84. Farkas R., Knopp J. Ecdysone-modulated response of Drosophila cytosolic malate dehydrogenase to juvenile hormone//Arch. Insect Bioch. Physiol.1997. V.35, №1-2. P. 71-83.

85. Farkas R., Knopp J. Genetic and hormonal control of cytosolic malate dehydrogenase activity in Drosophila melanogaster // Gen. Physiol. Biophys. 1998. V.17, №1. P. 37-50.

86. Fears R., Murrell A. Tryptophan and the control of triglycerides and carbohydrate metabolism in the rat // Bri. J. Nutr. 1980. V.43, № 2. P. 349356.

87. Ferguson A.R., Sims A.P. The regulation of glutamine metabolism in Candida utilis: the role of glutamine in control of glutamine synthetase // J. Gen. Mocrobiol. 1974. V.80, №1. P. 159-171.

88. Flores M., Aristoy M.C., Toldra F. Feedback inhibition of porcine muscle alanyl and arginyl aminopeptidases in cured meat-products // J. Agricultural and Food Chemistry. 1998. V.46, №12. P. 4982-4986.

89. Fox H.L., Pham P.T., Kimball S.R., Jefferson L.S., Lynch C.J. Amino acid effects on translational repressor 4E-BP1 are mediated primarily by L-leucine in isolated adipocytes//Amer. J. Physiol. Cell Physiology. 1998. V.44, №5. P. C1232-C1238.

90. Friguet B., Szweda L.I., Stadtman E.R. Susceptibility of glucose-6-phosphate dehydrogenase modified by 4-hydroxy-2-nonenal and metal-catalyzed oxidation to proteolysis by the multicatalytic protease//Arch. Biochem. Biophys. 1994. V.311, №1. P. 168-173.

91. Fuentes J.M., Campo M.L., Soler G. Kinetics and inhibition by some amino acids of lactating rat mammary gland arginase//Arch. Int. Physiol. Biochim. Biophys. 1994. V.102, №5. P. 255-258.

92. Gakhar S.K., Vandana J. Expression of a-glycerophosphate dehydrogenase during the development and aging of malaria vector Anopheles stephensi (Diptera, Culicidae) // Mechanisms of Ageing and Development. 1993. V.71, №1-2. P. 13-21.

93. Garciafernandez J.M., Lopezruiz A., Alhama J., Roldan J.M., Dapena J.D. Effect of glutamine on glutamine synthetase regulation in the green alga Monoraphidium braunii // Planta. 1995. V.195, №3. P. 434-439.

94. Giroux I., Kurowska E.M., Carroll K.K. Role of dietary lysine, methionine, and arginine in the regulation of hypercholesterolemia in rabbits//J. Nutr. Biochem. 1999. V.10, №3. P. 166-171.

95. Glatz E., Persson M., Rutberg B. Antiterminator protein Glpp of Bacillus subtilis binds to Glpd leader messenger-RNA // Microbiology-UK. 1998. V. 144, №2. P. 449-456.

96. Gleason W.B., Fu Z.J., Birktoft J., Banaszak L. Refined crystal structure of mitochondrial malate dehydrogenase from porcine heart and the consensus structure for dicarboxylic acid oxidoreductases // Biochemistry. 1994. V.33, №8. P. 2078-2088.

97. Goka K., Takafuji A. Genetic basis of esterase, malate dehydrogenase and phosphoglucoisomerase allozymes in the 2-spotted spider mite, Tetranychus urticae Koch//Appl. Entomology and Zoology. 1995. V.30, №4. P. 529-535.

98. Gonzalezmateos F., Gomez M.E., Garciasalguero L., Sanchez V., Aragon

99. J.J. Inhibition of glycolysis by amino acids in ascites tumor cells -specificity and mechanism//J. Biol. Chem. 1993. V.268, №11. P. 78097817.

100. Gotterbarm G.G., Roth F.X., Kirchgessner M. Influence of the ratio of indispensable dispensable amino acids on whole body protein turnover in growing pigs//J. Animal Physiol, and Animal Nutr. 1998. V.79, №3-4. P. 174-183.

101. Grisoni M.L., Uzu G., Larbier M., Geraert P.A. Effect of dietary lysine level on lipogenesis in broilers//Reproduction Nutrition Development. 1991. V.31, №6. P. 683-690.

102. Haystead A. Glutamine synthetase in chloroplasts of Vicia faba // Planta. 1973. V.111, №3. P. 1195-1200.

103. Herranz R., Garcialopez M.T., Perez C. Synergistic inhibition of aminopeptidase B by penicillamine or cysteine and metallic salts//Arch. Pharm. 1991. V.324, №4. P. 239-241.

104. Jahreis G., Aurich H. Eine membrangebundene Alanylaminopeptidase aus Acinetobacter calcoaceticus. 3. Hembarkeit des Enzyms // Biomed. Biochim. Acta. 1990. V.49, №5. P.339-345.

105. Janiczek O., Kovar J., Glatz Z. Purification and properties of malate dehydrogenase from Paracoccus denitrificans // Preparative Biochemistry. 1993. V.23, №3. P. 285-301.

106. Jaussi R. Homologous nuclear-encoded mitochondrial and cytosolic isoproteins. A review of structure, biosynthesis and genes // Eur. J. Bioch. 1995. V.228, №3. P. 551-561.

107. Kageyama T., Takahashi S.Y., Ohnishi E. Malate dehydrogenase in the eggs of the silkworm Bombyx mori: purification and properties // Insect biochem. 1972. V.2. P. 186-196.

108. Kajinami S., Wendler S.H., Smith E.C. Glutamine synthetase from tobacco tissue grown in suspension culture // Tobacco Science. 1971. V.15. P. 135140.

109. Kausen G.A., Strecker N.J. Purification and properties of arginase of rat kidney// Biochem. J. 1973. V.133. P.779-788.

110. Kim J.H., Mullin C.A. Structure-phagostimulatory relationships for amino acids in adult western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera//J. Chemical Ecology. 1998. V.24. №9. P. 1499-1511.

111. Kurowska E.M., Carroll K.K. Studies on the mechanism of induction ofhypercholesterolemia in rabbits by high dietary levels of amino acids // J. Nutr. Biochem. 1991. V.2, №12. P. 656-662.

112. Kurowska E.M., Carroll K.K. LDL versus apolipoprotein B responses to variable proportions of selected amino acids in semipurified diets fed to rabbits and in the media of HepG2 cells // J. Nutr. Biochem. 1996. V.7, №8. P. 418-424.

113. Malik P., Mckenna M.C., Tildon J.T. Regulation of malate dehydrogenases from neonatal, adolescent, and mature rat brain // Neurochemical Research. 1993. V.18, №3. P. 247-257.

114. Malik V.B.T., Ahluwalia P. Studies on effect of monosodium glutamate (MSG) on various fractions of lipids and certain carbohydrate metabolic enzymes in liver and blood of adult male mice //Toxicology Letters. 1994. V. 74, №1. P. 69-77

115. Mathur M., Saluja D., Sachar R.C. Posttranscriptional regulation of s-adenosylmethionine synthetase from its stored messenger-RNA in germinated wheat embryos // Biochim. Biophys. Acta. 1991. V.1078, №2. P. 161-170.

116. Matsumoto H., Hirasawa K., Kawano S., Tarahashi E. Some regulative properties of glutamine synthetase in cucumber leaves // Soil. Sci. Plant Nutr. 1975. V.21, №4. P. 379-389.

117. Matthews D.R., Boland O. The stimulation of insulin secretion in non-insulin-dependent diabetic patients by amino acids and gliclazide in the basal and hyperglycemic state // Metabolism. Clinical and Experimental.1997. V.46, №12. P. 5-9.

118. Mazurek S., Hugo F., Failing K., Eigenbrodt E. Studies on associations of glycolytic and glutaminolytic enzymes in MCF-7 cells. Role of P36 // J. Cell. Physiol. 1996. V.167, №2. P. 238-250.

119. Minard K.I., Mcalisterhenn L. Glucose-induced phosphorylation of the

120. Nagano M., Hachiya A., Ashihara H. Phosphate starvation and a glycolytic bypass catabolyzed by phosphoenolpyruvate carboxylase in suspension-cultured Catharanthus roseus cells //J. Biosciences. 1994. V.49, №11-12. P.742-750.

121. Patel A.B., Srivastava S., Phadke R.S., Govil G. Arginine activates glycolysis of goat epididymal spermatozoa an NMR-study//Biophys. J. 1998. V.75, №3. P. 1522-1528.

122. Patterson R.A., Leake D.S. Human serum, cysteine and histidine inhibit the oxidation of low density lipoprotein less at acidic pH // FEBS letters. 1998. V.434, №3. P. 317-321.

123. Patti M.E., Brambilla E., Luzi L., Landaker E.J., Kahn C.R. Bidirectional modulation of insulin action by amino acids // J. Clinical Investigation. 1998. V. 101, №7. P. 1519-1529.

124. Reynolds C., Wills E.D. Role of proteolytic enzymes in the activation oflysosomal acid phosphatase // Cytobios. 1974. V.11, №41. P. 17-20.

125. Rishikof D.C., Kuang P.P., Poliks C., Goldstein R.H. Regulation of type Icollagen messenger-RNA in lung fibroblasts by cystineavailability// Biochem. J. 1998. V.331, №4. P. 417-422.

126. Robert Ch., Richard-Forget F., Rauch C., Pabion M., Cadet F. A kineticstudy of the inhibition of palmito polyphenol oxidase by L-cystein // Int. J.

127. Biochem. and Cell Biol. 1996. V.28, №4. P.457-463.

128. Robertson D.L., Alberte R.S. Isolation and characterization of glutaminesynthetase from marine diatom Skeletonema costatum // Plant Physiology.1996. V.111, №4. P.1169-1175.

129. Rosenbrough R.W. Crude protein and supplemental dietary tryptophan effects on growth and tissue neurotransmitter levels in the broiler chicken // Brit. J. Nutr. 1996. V.76, №1. P. 87-96.

130. Rowland P., Basak A.K., Gover S., Levy H.R., Adams M.J. The 3-dimensional structure of glucose-6-phosphate dehydrogenase from Leuconostoc mesenteroides refined at 2.0-angstrom resolution // Structure. 1994. V.2, №11. P. 1073-1087.

131. Sano K., Shiio I. Microbiol. Production of L-lisine. 3. Production by mutants resistant to S-(2-aminoethyl)-L-cysteine//J. Appl. Microbiol. 1970. V.16. P.373-391.

132. Saravanan N., Senthil D., Varalakshmi P. Effect of L-cysteine on lipid peroxidation in experimental urolithiatic rats//Pharmacol. Research. 1995. V.32, №3. P. 165-169.

133. Schwab K.B., Gaff D.F. Influence of compatible solutes on soluble enzymes from desiccation-tolerant Sporobolus stapfianus and desiccation-sensitive Sporobolus pyramidalis//J. Plant Physiol. 1990. V.137, №2. P. 208-215.

134. Sidransky H., Verney E. Amino acid imbalances negate tryptophan-induced stimulation of hepatic protein synthesis // FASEB Journal. 1997. V.11, №3. p. 365.

135. Smith K., Reynolds N., Downie S., Patel A., Rennie M.J. Effects of flooding amino acids on incorporation of labeled amino acids into human muscle protein//Amer. J. Physiol. Endocrinology and Metabolism. 1998. V.38, №1. P. E73-E78.

136. Song M.C., Shimokata K., Kitada S., Ogishima T., Ito A. Role of basic amino acids in the cleavage of synthetic peptide substrates by mitochondrial processing peptidase//J. Biochem. 1996. V.120, №6. P. 1163-1166.

137. Soni T., Wolfram C., Guerroui S., Raynaud N„ Poggi J., Moatti N„ Gautier M. Respective effects of glucose and glutamine on the glutamine synthetase activity of human skin fibroblasts//Molecular and Cellular Biochemistry. 1991. V. 102, № 2. P. 149-154.

138. Sonoli S.B., Hooli M.A. Histological and histochemical studies of the apical cells of the cotton bollworm, Heliothis armigera (Huebner) (Lepidoptera, Noctuidae)//Int. J. of Insect Morphology & Embryology. 1992. V.21, №3. P. 263-270.

139. Spolarics Z. A Carbohydrate rich diet stimulates glucose-6-phosphate dehydrogenase expression in rat hepatic sinusoidal endothelial cells // J. Nutr. 1999. V.129, №1. P. 105-108.

140. Storey K.B., Keefe D., Kourtz L., Storey J.M. Glucose-6-phosphate dehydrogenase in cold hardy insects kinetic properties, freezing stabilization, and control of hexose monophosphate shunt activity// Insect Biochemistry. 1991. V.21, №2. P. 157-164.

141. Surve S.S., Mahoney R.R. Thermal stabilization of 4 microbial p-galactosidases by histidine, casein amino acids and casein//J. Food Biochemistry. 1991. V.15, №3. P. 201-207.

142. Swallow C.J., Gristein S., Sudsbury R.A., Rotstein O.D. nitric oxide derived from l-arginine impairs cytoplasmic pH regulation by vacuolar-type H+-ATPases in peritoneal macrofages//J. Experimental Medicine. 1991. V.173, №5. P.1009-1021.

143. Tan A.K., Eaton D.L. Activation of plasma procarboxypeptidase В // J. Cell Biochem. 1994. Suppl. 18d. P.162.

144. Tipper J., Kaufman S. Phenylalanine induced phosphorylation and activation of rat hepatic phenylalanine hydroxylase in vivo //J. Biol. Chem. 1992. V.267, №2. P. 889-896.

145. Uttaro A.D., Opperdoes F.R. Characterization of the 2 malate dehydrogenases from Phytomonas sp. purification of the glycosomal isoenzyme // Molecular and Biochemical Parasitology. 1997. V.89, №1. P. 51-59.

146. Weller J.L., Jaffe H„ Roseboom P.H., Zylka M.J., Klein D.C. 2D-Page analysis adrenergically regulated pineal protein AIP 37/6 is a phosphorylated isoform of cytosolic malate dehydrogenase // Brain Research. 1996. V.713, №1-2. P. 8-16.

147. Wilanowski T.M., Gibson J.B. sn-Glyceroi-3-phosphate dehydrogenase inthe honeybee Apis mellifera. An unusual phenotype associated with theloss of introns // Gene. 1998. V.209, №1-2. P. 71-76.

148. Wilanowski T.M., Yoong S.H.S., Bartoszewski S., Gibson J.B. Expressionof the Gpdh-4 isozyme of sn-glycerol-3- phosphate dehydrogenase in 3

149. Drosophila species // Heredity. 1998. V.81, №10. P. 390-395.

150. Wise D.J., Anderson C.D., Anderson B.M. Purification and kineticcharacterization of Haemophilus parasuis malate dehydrogenase//Arch.

151. Biochem. Biophys. 1997. V.344, №1. P. 176-183.

152. Zdanski C.J., Carrasco V., Johnson K., Prazma J., Pillsbury H.C. Inhibition of nitric oxide synthase causes elevation of hearing thresholds// Otolaryngology. Head and Neck Surgery. 1998. V.119, №3. P. 159-163.

153. Zimmer H.G. Regulation of and intervention into the oxidative pentose phosphate pathway and adenine nucleotide metabolism in the heart//Molecular and Cellular Biochemistry. 1996. V.161, №7. P. 101-109.

Информация о работе

Гаверова, Юлия Геннадьевна
кандидата биологических наук
Москва, 2000
ВАК 03.00.04

Диссертация

Роль аминокислот в регуляции активности и множественных форм дегидрогеназ тутового шелкопряда - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы