Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание вектора на основе ДНК вируса SV40 с синтетическим геном, кодирующим биологически активный низкомолекулярный пептид брадикинин и изучение экспрессии этого "гена"

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Создание вектора на основе ДНК вируса SV40 с синтетическим геном, кодирующим биологически активный низкомолекулярный пептид брадикинин и изучение экспрессии этого "гена""

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК МЕЛИКО-ГЕКЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР.

РГБ ОД

.1 1 . ...........,■•,.. На ^нравах рукопи«:

' УДК 575:577.?.

ПЕТРОВА ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА.

СОЗДАНИЕ ВЕКТОРА НА ОСНОВЕ ДНК ВИРУСА БУ40 С СИНТЕТИЧЕСКИМ ГЕНОМ, КОДИРУЮ» БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫЙ НИЗК0М0ЛЕКУЛЯРНЫЯ ПЕПТИД БРАДИККНИН И ИЗУЧЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ЭТОГО "ГЕНА".

Специальность 03. 00. 15 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1994

Работа выполнена в Медико - генетическом Научном Центре РАМН

Научны!": руководитель:

доктор реологических наук. В.Н.КАЛИНИН' '•'

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Д.М.СПИТКОБСКИЙ

доктор, биологических наук, профессор 0.А.ГОМАЗКОВ

Ведущее учреждение

МГУ им. М.В.Ломоносова"

Защита диссертаци состоится_ "21." НО-^Я 1994 Г. в У/. 00 часов на заседании Специализированного Совета Д 001. 1'6. 01-при Медико - генетическом Научном Центре РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д. 1 •

Автореферат разослан

г г

1994 Г.

Ученый секретарь-.Специализированного. Совета . доктор биологических наук,

профессор Л.Ф.КУРИЛО

Актуальность теш. Перенос и экспрессия генов г клетках млекопк-ших, в том числе и человека, представляет значительный интерес как фундаментальной молекулярной биологии, та: и для ее прикладных обтек. Современный -уровень развития технологии- рекокбинантных ДНК воляет создавать практически любые сочетания генетического материа-Однако; репликация и экспрессия рекомбинантов могут оказаться не-местимыми с процессами жизнедеятельности реципиентных клеток. Соз-ие вектора на основе ДНК вируса oY40 с синтетическим геном, кодиру-м биологически активный низкомолекулярный пептид брадикинин и ана-зкспрёссии этого "гена" представляется весьма актуальной задачей, чение которой, возможно, поможет преодолевать некоторые трудности, занные с клонированием тибридных молекул ДНК. Избрав в качестве мои для наших исследований систему, содержащую ключевой компонент ликреинкининовой системы - пептид брадикинин, мы руководствовались бражениями связанными с возможной перспективой ее использования отералии. Известно, что генетические дефекты, вызывающе, утрату собности синтезировать брадикинин. приводят к наследственно-обус-ленным заболеваниям - некоторым формам гипертенгии и бронхиаль-астме" ( Wuepper K.D., .1972; ' Donaldson.V.H., е.а., 1976 ). С по-ью же предложенной нами конструкции SV40(brd) можно попытаться кор-тировать патологические дефекты сначала на уровне клеточных культур, атем на уровне организма, что в настоящее время также является ак-льной задачей.- •■ .....Ч

Дель данной работы заключается в исследовании экспрессии неприрод-синтетическсй короткой нуклеотидной последовательности, кодирующей иологически активный пептид брадикинин в эукариотических клетках. Для достижения этой цели необходимо было решить следующие эксперит-тальные задачи: " . -

1) Создать вектор на основе ДНК вируса SV40 с синтетическим г.еном, ирующим биологически активный низкомолекулярный пептид брадикинин.

2) Провести молекулярно-генетический анализ ДНК и РНК, выделенных трансфицированных плазмидой SY40(brd) клеток культуры CV-1 почки

еной африканской мартьшки и культуры клеток почки эмбриона человека ачм 293) с целью проверки стабильности структуры SV40(brd) • после сирования вируса. • а также для выявления' к- исследования- экспрессии дикинина в культивируемых клетках CV-1 и 293 стал«?..

ч

ч

3) Изучить . биологическую активность нарабатываемого продукта культуре караиомиоцитов, его влияние на сократительную активность к ток.

Задача настоящего исследования заключается е конструировании основе ДНК варуса SV40 рекомбинанта SV40(brdX-, в котором в 3'-конце часть ге.на VP1, кодирующего основной структурный^белок оболочки вир встроена синтетическая последовательность "гена" брадикинина, в изу нии экспрессвя введенного в составе - рекомбинанта "гена" брадикинина пермиссивных для вируса SV40 клетках культуры CV-1 почки африканс зеленой мартдаш и в непермиссивной для вируса SV40 культуре гле почки эмбриона человека ( штамм 293 ), а также в исследовании физио гической активности синтезируемого брадикинина- Эти исследова представляются первым и необходимым этапом изучения возможности э прессии искусственно введенных в клетки млекопитающих генов биологи ки активных пептидов.

Научная новизна работы заключается в том, что впервые получен комбинантный геном SV40(brd), обеспечивающий без участия вируса -мойщика высокий уровень'экспрессии "гена" брадикинина в заражен клетках млекопитающих и служащий основой формирования биологически тивных вирусных частиц. ■ •■ - - ■

Разработка система тестирования брадикинина на культуре кардис оцитов новорсэденных- крысят. Чувствительность метода на 5-6 поряд выше традиционно используемых методов тестирования этого нейропепт на гладкомышечных препаратах некоторых органов и тканей отдельных дов животных, что позволяет анализировать концентрации "рекомбинант го" брадикинина в диапазоне от 10_17м до 10"8М.

Практическая ценность работы. заключается в том, что получение настоящей работе генно-инженерная конструкция, сохраняющая ', в се составе целый геном вируса SV40 и не требующая для репликации ви са-помощника," (1) может служить моделью для изучени экспрессии кое ких нуклеотидаых последовательностей in vitro; (2) использоватьс качестве вектора для переноса чужеродных генов в клетки млеколитак с целью получения образования биологически активных низкомолекуляс пептидов в системе'in vitro; (3) для получения' трансгенных жиео! гипертензиЕней линии с синтетическим "геном" брадикинина с целью v

i действия брадикинина в системе in vivo.

Экспериментальные данные по тестированию биологической активности гзированного "рекомбинантного" брадикинина с помошью культуры кар-юиитов могут представлять практический и теоретический интерес в ;тве обоснований для разработки гённЬтёрапевтических подходов в гаи вопросов, связанных, с коррекцией гипертензивных состояний, яв-;я ценными в методическом аспекте.

Основные положения, выдвигаемые на защту:

1) Сконструированный рекомбинантный геном SV40(brd), созданный на зе ДНК вируса SV40 путем введения в 3'-концевую часа гена VP1 гтической последовательности гена брадикинина, представляет собой ильную систему, не требующую для репликиции вируса-помощника, и эщую основой формирования активных вирусных частиц.

2) SV40(brd) характеризуется, интенсивной экспрессией синтетичес-последовательности "гена" брадикинина в трансформированных реком-1 нтом клетках CV-Í"h 293 штамма.

3) Культура кардиомиоцитов новорожденных крысят использована в стве новой высокочувствительной системы детекции синтетического икинина и" тестирования физиологической активности "регамбинантного" икинина.

4) Физиологическая активность полученного пептида соответствует ености синтетического пептида брадикинина.

Апробация работы. .Результаты исследования были представлены на V ной-конференции по генетике соматических клеток в культуре t Чер-ловка, 1993 г.), на 4-ой конференции "Геном человека"-94 ( Черно-вка, 1994 г.) и на научном семинаре института генетики человека-РАМН, состоявшемся в мае 1994 г.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано-4 работы, 4 щятся в печати, получено .1 удостоверение на рационализаторское ложение.

Структура и объем работы. Работа изложена на ЮЗ страницах ма-шисного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания ¡риалов и методов исследования, полученных результатов и их обсук-¡я, общего заключения, выеодов и списка литературы. Диссертация со-

i

- 5 -

держит 16 рисунков и 3 таблицы. Список литературы содержит Х1Ч источ 'никое, из них "8 отечественных-и 96 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. ,

Бактериальные штаммы и_ плазмиды. В работе использован штамм Eshe rir.ia coli HB 101 ( rec AB, ara-14, pro A2, lac Jl, gal К2, rps 120 .ху:-5, mtl-l, sup E44, Д~).

Среды. Вырадшвание микроорганизмов и культивирование кардиомиоци тоь проводилось по страндартным методикам на соответствующих среда ( Маниатис Т. и др., 1984; Иванова Н.Л. и др., 1990).

Плазмиды. В работе были использовании две исходные плазмиды, а основании которых получен рекомбинантный геном SV40(brd). Это pLB 55-содержалш синтетический ген брадикинина, любезно предоставленный В. Добрыниным и В.Г.Коробко ( институт биоорганической химии РАН ) и pSE н&сусая в своем составе целый геном вируса SV40. •

Приготовление компетентных клеток и_ тоакстормация Е. coli Н31С плазмидами проводилось как рекомендовано Гловером и др., 1988.

Выделение плззмидной ДНК из Е. coíi НВ101 осуществлялось с ' пс мощью "Triton - boiling" метода. ( An. biochem., 1981 ).

Генно - инженерное конструирование', dot-гибРИДИзаийонный анали; niel-:-трансляция ДНК, измерение радиоактивности _в нук-ириусдму кислота? оадпоавтогоаФия. здектдодюрез РНК в денатуоиоуюыем геле, перенос РНК ЛHК на нитооцеллйлозные и нейлоновые оильтры проводили согласно мете ликам, изложенным в руководстве Маниатиса Т. и др., .1984 г.'

Определение первичной структуры ДНК проводили по методу Максама Гилберта. С Maxau, Gilbert, 1980 ).

. Выделение и_ гибоидизаиионный анализ мРНК проводили AGPS-методо) предложенным chemezyraki P., Sacchl ., 1987 и согласно-методике, " изл( женной Е руководстве Макиатиса Т. и др., 1984 г.

• Тестирование физиологической активности брадикинина в среде ку. тивирования клеток 293 штамма, трансфицированных SV40(brd), провод; лось на 4-7-дневной первичной культуре кардиомиоцитов по методик предложенной ранее Ивановой Н.Л., 1990 .

Методы статистического■анализа. При оценке полученных данных ан. лидировали изменение частоты сокращений кардиомиоцитов ( уд./мин ) формуле :

i n i i « i I

z = i 1 - ---- I x ICO %

П

i' 2 i i i-i ■

- где j - исходная частота сокращений в каждом опте;

i - максимально измененная частота во время развития эффекта; п - число измерений.

Изменение сократительной активности оценивали по изменениям амп-. уды сокращений. Для учета фактора вариабельности амплитуды сокрзще-оценивали среднюю амплитуду сокращений исходно и при каксимально.м витии эффекта по формуле:

Р. к

S fj(ti) = < А > '

'■^i-0

j -о

где f(t) - функция зависимости амплитуды от времени [ так как . функции f(t) линейны, то их суша есть глг&браичес- -кая сумма fj (i)]; р - число сокращений за данный промежуток времени; < А > - средняя амплитуда сокращений, т.е. инотропный эффект, оценивали по формуле: п

| . 2 < Ai > J % = I 1 - -------- I X 100 z

- • I - 2 < > J

где < h¡> - средняя исходная амплитуда сокращений во время развития эффекта; < A¡> - максимально измененная средняя амплитуда сокращений во время развития эффекта; п - число измерений.

При.математической обработке полученных данных использовали непа-трический критерий-Манна - Вилкоксона - Уитни (Ашмарин К.П. , 1988).

(

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

1. Создание 5У40СЬгсП. Одной из основных задач данной работы яви, лось создание рекомбинантного генома БУ40-(Ьг<1), . несущего. ,в своем составе синтетический ген брадикинина, так как изучение его экспрессии в эукариотической системе представляет собой 'большой теоретический и практический интерес. Источником ДНК ЗУ40 при создании рекомбинантного генома ЗУ40(Ьгт1), послужила плазмида РБЕ1 (рис.1), представляюшдя собой вектор рВЮ25, в сайт ВатН1 которого встроен нейтральный фрагмент ДНК, ограниченный Вв111-сайтами. При таком встраивании исчезает собственный сайт ВашН1-вектора рВ!?325. В сайт ЕсоИ р61?325 встроена ДНК целого вируса БУ40. Таким образом, в составе плазмиды рБЕ1 остается только один сайт ВахпН1, локализованный в 3'-области гена УР1 на расстоянии 60 п.н. от терминирующего кодона белка УР1. Источником синтетического "гена" брадикинина, являлась плазмида, полученная на основе вектора рЬВ55-1 (рис.1), ЕсоР1-ВашН1 - фрагмент которого, заменен на синтетический "ген" брадикинина ( рис. 1), фланкированный с 5'- и 3'-концов ЕсоИ и ВатН1-сайтами ( см. рис.1).

а) Получение фрагмента 4.6 т.п.н. Конструирование рекомбинантногс вируса выполняли в несколько зталов. На первом этапе плазмида р5Е1 была переведена в линейную форму с помошъю рестриктазы ВашН1. Полученные в результате действия рестриктазы ВашН! "липкие" концы застраивали с помошью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы 1 до тупых.концов ( см. рис.! Затем линейная форма плазмиды рБЕ1 была рестрицирована по сайту Ба161 Один из двух полученных фрагментов длинной 4,6 т.п.н. ( см. рис.1 ) сс держал часть гена УР1, фланкированного с З'-конца застроенным ВатН1 сайтом; ген- Ыа; точку начала репликации рВИ 325. Этот фрагмент был злюирован из IX легкоплавкого агарозного геля. • - *

б) Получение шрагмента 0.3 т.п.н. На втором этапе плазмида рЬВ5с -1 была рестрицирована эндонуклеазой ЕсоИ по сайту, фланкирующему гек брадикинина с 5'-конца. "Липкие" концы, образованные эндонуклеазой

- ЕсоЮ, .также застраивались с помощь» фрагмента Кленова ДНК-полимеразь . V (см. рис.1). После застраивания", проводили расщепление линейной плаг миды рЬВ55-1 по сайту 5а1(31. Фрагмент, содержащий 0,3 т.п.н., .бьш-*также элюирован из 1% легкоплавкой агарозы. Полученный фрагмент лйгирова-• ли- с ранее выделенным ( 4,6 т.п.н.), дотированной смесью трансформировали Е.соП НВ101 и скринингом отбирали ампициллин-устойчивые клоны, содержащие плазмиду рЗВ ( см. рис.1), в составе которой часть последо-

£coHI \ L^S

¿мша f ) P^i.CxtMa реконструира&ашя рехомЬинашной тазниды SMO'jffrxf).

■ Офшорной /trwvea о&яюуем* ДЩ плазмиЭ pS£T и р (.655-£ Мойной

вируса Si/Щ сплошная черна/г banning симтетиирс^ии„ген"5раЗс/ким/на, S, R, сайты рестрикции Ват W, £coRI, Sa£Gl соот&с/пап$ема.

Г,"

I

I <о

t

I

i

вательности гена VP1-"слита" с геном брадикинина. Эта гибридная стр> тура фланкирована с 3'-конца сайтом BamHl.

в) Получение рекомбинантной ДНК SV40Cbrd). На третьем этапе фрг ■ мент BamHl.- SalGl-из-плазмиды pSB был заменен ■. на BanHl - Sal Gl - ф[ гмент из; плазмиды pSEl, который содержал всю остальную последовате; ность генома вируса SV4Ö. Таким образом, была получена плазм1 pSE(brd) (рис. 1 ), имеющая в своем составе целый, геном вируса SV40 • встроенным геном брадикинина. Полученная плазмида pSE(brd) трансфорь ровалась в Е. coll НВ101, скринингом отбирались устойчивые к ампищ лину клоны и наращивались на среде LB с антибиотиком. После амплифш ции в Е. coli НВ101, плазмиду pSE(brd) выделяли 9 помощью "Triton-bc ling" метода, очищали равновесным центрифугированием в градие> плотности CsCl с добавлением EtBr и подвергали рестрикционному анаи Затем ДНК вируса SY40 со встроенным "геном" брадикинина вырезали плазмиды pSE(brd) по -сайтам EcoRl и лигировали для образования колы вой формы. - _

2. Анализ структуры рекомбинантной ДНК.

а) Рестрикционный анализ плазмиды pSE(brd). Чтобы подтвердив что структура полученной плазмиды соответствует заданной, была npoi дена рестрикция рекомбинантной ДНК с помощью эндонуклеазы EcoRl. I электрофорезе с маркерной ДНК Я.Hindill в 17. агарозном геле, предст; ленном на рис.2, были выявлены два фрагмента в области 5.3 и 6,0 т. н., что соответствует расчетной величине, то есть была проанализиро] на плазмида, неотличимая по величине и сайтам узнавания рестрикт; EcoRl от pSE(brd).

1 ZI

Рис.2. Рестрикционный анализ плазмиды pSE(brd).

1.' Фаг А,, рестрицированный эндонуклеазой Hind 111.

2. pSE(brd), рестрицирован-

. ная эндонуклеазой EcoRl.•. .

3. pSE(brd) - нативная.

б-) Определение рамки считывания грнд. боалчкинин?.. Следующим зта-нашей работы было определение нуклеотидной последовательности нестыковки генов УР1 к "гена" брадикинин в рекомбияантной ДНК ЬгсЗ), которое проводилось по методу Максама-Гилберта (рис.4). Про-ы сиквенса были фракционированы в 67. полиакриламидном денатурирую-( 8 М мочевина ) геле. " ' -

Как видно из полученного радиоавтографа, рамка считывания встро-ого фрагмента ( гена брадикинина ) совпадает с рамкой считывания УР1 и, следовательно, экспрессия клонированной последовательности дится под контролем промотора этого гена. Таким образом, должна скрибироваться последовательность, у которой 5'-коядевая часть- -ставлена геном УР1, кодирующим основной структурный белок оболочки, -концевая, включает последовательность "гена" брадикинхна ( рис.3).

ГлиАспГлуФенМе1АргПроПроГлиФенСерПроФенАрг беебАТбААТТСАТБСбТССТССТббТТТСТСбССТТТССб. ЕсоИ

■ - УР-1 •- ' ■ - ВгсЗ .

Рис.3. Нуклеотидная последовательность места соединения гена УР1 и "гена" брадикинина ( Вгс! ).

3. Изучение репликации и экспрессии рекомбинантного генома ГЬгсП. Подтверждением того факта, что геном ЗУ40 и "ген" брадики-, объединенные в составе рекомбинанта, нормально. реплицируются в гуре эпителиальных клеток почки зеленой мартышки (СУ-1) и культуре ж эмбриональной почки человека (293 штамм) послужили результаты аейших исследовании. Полученный в результате последовательных ген-

1

- 12

Рис. 4-. Определение нуклеотидной после- -довательности места стыковки генов УР1 ■и брадикинина в ре-комбинантной ДНК рЗЕ(Ьп1).

-инженерных стадий и очинённый в CsCl рекомбиначтный геном 3V40(brd) помощью ДЭАЭ-декстринового метода трачсшицироватся в клетки млексли-ющих ( Калинин В.Н.. и др.. 1993).

-гЛорфофукшюнат^кы&'йзменения в результате траксфеиши 3V40ioró) пермиссиЕной для Еируса 3V40 клеточной линии 293 штамма были ь.чюа-ны в нарушении митотического режима, появлении паталогических мкто-в. многоядерных клеток и клеток с гигантскими ядрами и отражали ансформирующее действие рекомбинанта на культуру клеток эмбрионапь-й почки человека. ( Калинин В.Н. и др., 1993 ). Морфофункционасьное учение трансфицированных SV40(brd) пермиссивных (CV-1) клеток вудеи-специфические для вируса SV40 изменения, выражающиеся в 'вакуолиза-и цитоплазмы."деформации и пикнозе ядер, появлении многоядерных кле-к. Изучение динамики этих изменений позволило оценить инфекционнссть ннс-инженерной конструкции, начиная с ранних сроков инфекции, и убе-гься з идентичности развития литической инфекции, рекомбинантного. и ^ того вирусов, что свидетельствует об эффективной репликации mvtsht-го вируса ( Калинин З.Н. и др., 1993 ).

а) Рог-гибридизаиионный анализ. Оценку способности молекулярной зструкции сохраняться в культуре клеток проводили с помощью, dot-гиб-цизационного анализа с ДНК, содержащейся в лизированных клетках ;;v-i 293 штамма. В кач_естве зондов.-использовали ДНК рЬВ55-1.Для. Фильтра и рЗЕ1 для фильтра N11. Из полученных данных !рис.5) следует, что \ образующаяся в клеткау. CV-1 и £93 штамма проявляет озкнаксгые зйства. то есть сохраняет в своем составе встроенную синтетическую зледовательность', кодирующую брадикинин.

а 5 € а 5 %

У.1

Рис.-5". Dot - гкбрйдизационный анализ.

ДНК клеток^ трансфицированных- SV40(brd). 2. ДНК клеток, трансфицированных 3V40. а,б.в - повторноста опыта.

1

- 14 - .

б) МсЛЬегп-гибр'/лизационный анализ. Наследующем этапе-работы мы проЕели ряд гибридизационных экспериментов, позволяющих утверждать. что встроенная последовательность "гена" брадикинина транскрибируется в составе РНК рекомбиначтного генома. Для.., выявления к характеристики' самого транскрипта, содержащего исследуемый фрагмент, необходимо было провести эксперименты по Но^егп-гибридизации меченной по 32Р. плазмиды рЬВ55-1 с РНК, выделенной из клеток СУ-1 и 293 штамма: чистых, трансфицированных .диким вирусом 5У40, ДНК БУ40 и ДНК ЗУ40(ЬпЗ) ( рис. 6). Полученная гибридизационная картина характеризуется интенсивным связыванием метки, проявляющимся в наличии одной гибридизацион-ной полосы только в случае фракционированной мРНК, выделенной из культуры СТ-1 ( а также и 293 штамма ), трансфицированной -. рекомбинантным геномом БУ40(Ьгс1).

Таким образом, мы считаем, что интересующая нас последовательность присутствует в мРНК гибридного вируса и входит в состав транскрипта размером.163.

4 г з н

■ \ -

Рис. С. Результаты Ио^егп - гибридизации плазмиды р1_В55-1 с тотальной РНК, иммобилизованной на нейлоновых фильтрах. РНК. . выделенная из клеток СУ-1: 1 - чистых; 2 - инфишфованных диким Еирусом ЗУ40-, 3 - трансфицированных ДНК 5У40; 4 - ДНК ЗУ40(Ьгс1); 5 - тотальная РНК в 17. денатурирующем геле (контроль).

Результаты описанных экспериментов свидетельствуют, что реплика-ля синтетического "гена" брадикинина в клетках млекопитающих в гостг-? рекомбиначтной ДНК SV40íbrd! осуществляется с высокой точностью, эй. этом остается неизменной как Физическая структура, так и биапоги-»ская активность рекомбинантного вирусного генома, вплоть до слоссб-эсти. вызывать литическую вирусную инфекцию, а в непермиссивных клет--зх - интеграцию в клеточную ДНК.

5. Определение биологической активности брадикинина на культуре юдиомиоиитов. Выяснение физиологической активности зкспрессируемого ;комбинантом SV40(brd) бргликинина является следующей задачей данного :ледования. Известно несколько-методов-определения брадикинина в биотических жидкостях ( Пасхияа Т.е. и др., 1969 ), один из них - по «ращению гладкой мускулатуры определенных органов отдельных видов [вотных. • Однако, чувствительность существующих методов довольно низ-i i. Поэтоэму для тестирования брадикинина нами была апробирована новая яель - культура кардиомионитов. успешно зарекомендовавшая себя при ределении действия опиоклных пептидов ка сократительную активность Рдиомиоцитое ( Иванова Н.Л. и др., 1990 ).

а) -Моршофункциональная характеристика каодкомиоцитов новооо.таен-х крысят в культуре: Через 5-10 часов после посева обработанной 1% ипсинсм ("Serva") суспензии клеток миокарда на подложке оОнаруяива-ся единичные распластывасщнеся уиониты.

На вторые сутки роста у-т/льтура представлена хорошо распластанными етками веретеновидной' и полигональной ?ормы с многочисленными ст-отками. На этой стадии отдельные клетки начинают спонтанно сокра-гься, что подтверждает принадлежность к культуре кардисмиоцитов.

На третьи сутки роста ir. vitro клетки увеличиваются в размере,, в' ззрачной цитоплазме хорошо видно округлое ядро, между отдельными этками возникают контакты.

Одиночно лежащие сокращающиеся клетки, с-хорошо-развитыми клеточки контактами, к концу четвертых суток образуют единичные кластеры, ¡меры, и количество которых увеличивается по мере культивирования здкемиоцитов.

На пятые сутки культивирования кардиомиоцитов на больших участках ;мируется практически единая кластерная сеть, которая сокращается в IHOM ритме. Частота сокращений кардиомиоцитов в среднем составляет

40 уд./мик. На такой' культуре проводилось исследование биологической активности брадикинина синтетического и полученного генно-инженерным

ГГ/Т^М»

б) Изучение эффектов воздействия на кардиомиоцити синтетического брадикинина. Действие брадикинина на' культуру кардиомиоцитов изучалось в диапазоне концентраций 10"17 - 10_еМ: Регистрацию сократительной активности кардиомиоцитов проводили на стабилизированной культуре. Анализ зависимости положительных х.ронотропных и инотропных эффектов брадикинина от концентрации;-.-:'3)пептида показал (см.- табл.1, рис.5,5.'), что максимум эффекта достигался при действии брадикинина в концентрации Ю-ИМ и составлял 46.?~2,8Х ( Р<0,05 ) от исходного уровня сократительной активности для инотропного эффекта и 67,^3,9%; ( Р<0,05 ) для хронотропного эффекта.

Дальнейшее увеличение концентрации брадикинина до 10-3М не приводило к увеличению инотропного и хронотропного эффектов ( 45,2-7,4% и 66,0-2,«; Р<0,05, соответственно ).

Статистический анализ полученных данных свидетельствует о достоверности положительного инотропного и хронотропного эффектов, вызываемых брадикинином в диапазоне концентраций от. 10-17М до 10-"м.

При изучении эффектов- воздействия на кардиомиоциты неселективного антагониста кининовых рецепторов - пармидина, вводимого в культураль-ную среду за 20 минут до начала эксперимента в концентрации 10-еМ -30-£М. наблюдалось блокирование положительных инотропного и хронотропного- эффектов, регистрируемых при действии брадикинина в диапазоне концентраций 10-17М - 10-^М (см.. рис. 7 ).

>

Таблица 1. Зависимость изменения частоты и амплитуды сокращений от юнтрации синтетического брадикинина в 7,7,.

| Концентрация | Изменение частоты Изменение амплиту- !

1 -1г.[ М ]. | .сокращений в 7.7,. ды сокращений в 7,7,. ]

1 1 1 1 м!ш м!т |

1 1 1 8 ■ | 66.0i2.l_.. _. .. . .45,2-7,4 .. .

\ 11 1 67,1^3,9 46,212,8 |

1 14 | 29.7^,2 28,б11,4 |

1 15 | 24,Л,1 ■ 17,7^4,3 ' |

1 16 у 1 15.7^,8 10,7±1,3 " |

1 ■ ^ 1 | 1! | ! 1 6,3^,6 10,6^0,8 !

Примечание: во всех случаях Р<0.05 по" сравнению "с контролем: п-10 -12

а) к.онтр.

5) -10* М

коигр.

РисЯФрагменты записей'сокращений кардиомиоцитов' (оптическая регистрация).

1. Увеличение амплитуды и частоты сокращений под влиянием брадики-нина:

а) .верхний ряд - контроль; б) нижний ряд - сокращения при развитии положительных инотропного и хронотропного эффектов (Ю-11 М; 10-17М). ■ \

2.Отсутствие положительных инотропного и хронотропного эффектов после предварительного введения блокатора брадикининовых рецеп-. торов, пармидина (10-,5М): а) контроль; б) сокращения на фоне

. действия, .пармидина; , ■ . ......■

в) сокращения на фоне действия брадикинина, после предварительной обработки пармидином.

в) Сравнение зайектов воздействия на каодиомиоыкты синт°тического 'рекомбинантного" брадикинина. Исследование физиологической активен орадикинина. экспрессируемого в составе рекомбинантного генома. 10(Ьгс1) показало способность "рекомбинантного" брадикинина (.анало-■1но синтетическому) вызывать'положительные инотропные и хронотропнке ректы на культуре кардиомиоцитов новорожденных крысят, что свиде-иьстЕует о биологической активности пептида, экспрессируемого

ансгенными метками человека. Обнаружена прямая зависимость между гивностью "рекомбинантного" брадикинина и сроками культивирования ачсФицированных клеток Срис.8 ,9 ,табл.2).

При замене культуральной среды с ЗУ40(ЬгсП на среду кулътивирова-я клеток, трансфицирозачных' плазмидой, имеющую аналогичную последо-тельность, но без "гена" брадикинина, не наблюдалось повыиения уроЕ-сократительной активности КМЦ, что служит еще одним доказательством экологической активности синтетического "гена" брадикинина в система

На основании 'сопоставления полученной ранее "эталонной" кривой висимости положительного хронотропного и инотропного эффектов синте-ческого брадикинина от его концентрации и аналогичных эффектов -"ре-мбиначтного" брадикинина, получаемых при действии стоков на разных оках- культивирования трансфицированных клеток,, мы.пришли к выводу, о действие концентраций "рекомбинантного" брадикинина соответствует ицентрациям синтетического брадикинина в диапазоне Ю"1' - 10"°М (1-? сутки культивирования;.

Наблюдаемая зависимость эффектов "рекомбинантного" .брадикинина от гаков его культивирования аналогична зависимости эффектов синтетичес-)Г0 брадикинина от его концентраций, т.е. имеет вид "5"-образной кри-ш.

На этом основании можно полагать, что "рекомбинантный" брадикинин . ¡разуется в физиологически активном состоянии и его концентрация за-1сит от сроков культивирования.

Тагам образом, показано, что "эталонная кривая" зависимости син-гтического брадикинина от его концентрации позволяет производить 'енку биологической активности "рекомбинантного" брадикинина.

Таблица 2. Зависимость изменения частоты и амплитуды сокращений от концентрации "рекомбинантного" брадикинина в 7.7,.

! Характе- I I Номер Бремя куль- | Изменение I , Изменение' |

| ристика I стока тивирования | частоты I. амплитуды |

| стога.N (в сутках). I сокращений | сокраще- |

| штамма. | В 7.7,. 1 ний в 7.7.. |

I 1 * 1 м!ш 1 1 М1ш |

| 293 1 I 333 18 1 I 13,814,6 1 1 26,0^1,7 —|

| • 293 |- 351 35 1 14,211,4 | 33.8^2,0 |

| 293 | 417 73 I 2б,013,0 | 39,712,5 |

! 293 |. 446 87 | 34,612,2 1 | 42,813,4 ' | ! 1

Примечание: вс всех случаях Р<0,05 по сравнению с контролем; п=10-

2. дни культивилоейния

, Рис.8 . Зависимость изменения хронотропного эффекта от концентрации брадикинина. . . _ \ ■ • - По оси абсцисс 1 - концентрация брадикинина в молях. ' /■ По оси абсцисс 2 - время культивирования в сутках. По оси ординат - относительная величина частоты сокращений, выраженная е 7.7, к исходной.частоте сокращений. Каждая точка соответствует средней 8 - 10 опытов; указаны стандартные отклонения средней. а - "рекомбинактный" брадикинин; ° - синтетический брадикинин..

Рис ¿3 Зависимость изменения инотролного эффекта от концентрации радиккнина.

По оси абсцисс 1 - концентрация брадикинина в молях.

По оси абсцисс 2 - время культивирования в сутках.

По оси ординат - относительная величина амплитуды сокращений,, выжженная в 7.7. к исходной амплитуде. Каждая точка соответствует средней ; - 10 опытов; указаны стандартные отклонения средней. - "рекомбинантный" брадикинин; °- синтетический брадикинин.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.

Для обеспечения существования и эффективной экспрессии "гена" |радикинина в клетках млекопитающих была сконструирована рейомбинант-;ая ДНК ЗУ40(Ьга), в которой в. 3'-концевую часть гена УР1 встраивалась :интетическая последовательность, кодирующая биологически активный [изкомолекулярный нейропептид брадикинин. При этом рамка считывания ¡страиваемого фрагмента совпадала с.рамкой считывания гена УР1, из че--•о следовало, что "ген" брадикинина находится под контролем промотора иого гена.

Проведенные молекулярно-генетические исследования ДНК и РКК, зыбленных из клеток СУ-1 и 293, штата позволили сделать однозначный ¡ывод, что полученный рекомбинант характеризуется стабильностью, обес-ючивает без вируса-помощника. высокий уровень экспрессии брадикинина ! зараженных клетках млекопитающих и служит основой формирования инфекционных вирусных частиц.

Таким образом,' зстраивкй'ие 6 3'-концевую 'область гена УР1 синтети-

J - ~

1

1 ческой последовательности гека" брадикинина не приводит к утрат Функциональных свойств рекомбинанта, присущих дикому вирусу.

Стабильность, и экспрессия созданного рекомбинанта подтверждаете данными исследования биологической активности "рекомбинантного" брадк кинина на разработанной нами системе тестирования этого нейооп&птида помощью культуры кардиомиоцитов новорожденных крысят.

Анализ показал способность "рекомбинантного"' брадикинина (. ачалс гично синтетическому ) вызывать положительные хронотропные и инотрог ные эффекты на культуре, кардиомиоцитов новорожденных крысят, чт.о св1-детельствует о биологической активности нейропептида, экспрессируемог клетками штамма 293. • ' '. \ '

" Попытка количественной оценки активности "рекомбинантного" брад! кинина, основанной на сопоставлении "эталонной" кривой (зависимое! эффектов синтетического брадикинина от его концентраций), полученш при действии "рекомбинантного" брадикинина,. .позволяет предполагай что концентрации "рекомбинантного" брадикинина находятся примерно диапазоне от Ю~17 до 10"8 М синтетического брадикинина и' зависят < сроков ( 18 - 87 сутки ) культивирования трансфицированных клеток.

Таким образом, -впервые удалось не только получить биологичес> активный "рекомбинактный" брадикинин, но и провести оценку его физи( логической активности, ■ сопоставимой с активностью синтетического не] ропептида брадикинина.

ВЫВОДЫ.

1. На основе ДНК вируса 5У40 сконструирован рекомбинантный ге» 5У40(Ьгс1), в котором в 3'-концевую часть гена УР1, .кодирующего осно: ной структурный белок оболочки вируса, встроена синтетическая нукле! тидная последовательность "гена" брадикинина.

2. Молекулярно-генетическими методами на ■ трансфишрованн; 5УД0(Ьгс1) клеточных линиях СУ-1 чи 293 штамма показана стабильнее

■ "рекомбинантного" генома БУ40(Ьгс1) и-сохранение им биологической а тивности соответствующей-природному вирусу ЭУ40. . • ' "- '

3. Впервые разработана система тестирования ." физиологической а тивности брадикинина на культуре кардиомиоцитов новорожденных крыся Чувствительность метода на 5-5.порядков выше традиционно-используемы методов тестирования этого пептида на'гладкомышечнш препаратах нек торых органов и ткачей отдельных видов животных.

4. С - использованием разработанной высокочувствительной системы зтирования - культуры кардиомиоцитов, зарегистрирована физиологичес-я активность "рекомбинантного" брадикиника, сравнимая с активностью . нтетического брадикинина,'находящейся в диапазоне от 10~17М - 10~SM. . ' 5. Физиологическая активность "рекомбинантного" 'брадикинина! нахо- .' гея в зависимости от сроков культивирования травсфицированных клеток 3-штамма и • соответствует' активности < Ю~1бМ - 10" 12Ы концентраций нтетического брадикинина. - -

Список"работ, опубликованных по теме.диссертации. .

• ' ' »

1. Калинин .. В.Н., Неверова- М.Е., Фролова И;П., Петрова Т.В. Соз- -ние на основе-ДНК вируса SV40 вектора, как экспериментальной "модели

я изучения экспрессии генов. Вестник РАМН, 1993, N3., с. 6-10.

2. Калинин В. Н., Неверова М. Е., Фролова И. П., Петрова Т. В., Го-днецкая H.A.-, Иванова Н.Л. Получение .вектора на основе вируса SV40 синтетическим "геном" нейропептида брадикинина и изучение его физио-гической активности. Мол. ген.. микроб., вирусол., 1993, N4, с. 27-31.

3.Неверова М.Е., Петрова Т.В., Мамаева Т.В., Митаюпов Ш.М., Ми-, швдова М.М.Иванов В.И. Разработка модельной системы генотералии на -:нове синтетического _"гена", биологически. активного пептида бради-[нина. 4-я коиф. -'Геном человека"-94, 9-11 марта 1994 г.-,' Черноголов-

L, с. 64-65. .

4. Неверова М. Е., Петрова" Г. В., Наумкина Е. С.; Мамаева Т.В., Кашин В.Н. Экспериментальная система, созданная на основе вируса SV40 целью изучения экспрессии генов человека. Конф. по ген. сом. клеток культуре, 22-24, XI, 1993 г., с. 31.

: ; 1

ч.

X