Разаботка и использование эффективности системы ретровирусного переноса и экспрессии генов в клетках млекопитающих

Прасолов, Владимир Сергеевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Разаботка и использование эффективности системы ретровирусного переноса и экспрессии генов в клетках млекопитающих
ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Разаботка и использование эффективности системы ретровирусного переноса и экспрессии генов в клетках млекопитающих"

оз 9 г

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ИНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЙ БИОЛОГИИ ИМ. В.А.ЭНГЕЛЬГАРДТА

РАЗРАБОТКА И ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ЭФФЕКТИВНОЙ СИСТЕМЫ РЕТРОВИРУСНОГО ПЕРЕНОСА И ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ В КЛЕТКАХ МЛЕКОПИТАЮЩИХ

03.'00. 03 - молекулярная биология 03. 00. 25 - клеточная Сиология

Диссертация на соискание ученой степени доктора биологических наук в форме научного доклада

На правах рукописи

ПРАСОЛОВ ВЛАДИМИР СЕРГЕЕВИЧ

МОСКВА - 1992

Работа выполнена в Институте молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР.

Официальные оппоненты:

В.Г.ДеОабов, член-корреспондент АН СССР, доктор биологических наук, профессор.

A.Д.Альтштеян, доктор медицинских наук, профессор

B.В.Терских, доктор биологических наук.

Ведущая организация - Институт биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР.

Защита состоится г. в часов на заседании

Специализированного совета Д 002. 79. 01 по защите докторских диссертаций при Институте молекулярной биологии АН СССР по адресу 117984, Москва, ул. Вавилова, 32

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института молекулярной биологии АН СССР^. Автореферат разослан "/ФужЖ/и^^^Ц992 г.

секретарь /Специализированного совета канд. хим. наук А. М. Крицын

«а

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ.

^"Актуальность проблемы. Перенос и экспрессия генов в клетках млекопитающих, в том числе и человека, представляет значительный интерес как для фундаментальной молекулярной биологии, так и для прикладных ее областей, - биотехнологического производства, сельского хозяйства, современной медицины.

Очевидно, что бактериальные клетки не могут служить адекватной моделью для исследования регуляции экспрессии генов высших эукариот, а также для получения в утилитарных целях полноценных препаратов многих биорегуляторов белковой природы.

В первую очередь, это связано с отсутствием у прокариот молекулярных механизмов сплайсинга и посттрансляционных модификаций синтезированных полипептидных цепей, таких как гликозили-рование, фосфорилирование, специфическое разрезание белка-предшественника клеточными протеазами и др. В то же время накапливающиеся данные свидетельствуют о том, что для многих белков посттрансляционные модификации существенно влияют на их биологическую активность, стабильность, компартментализацию и секрецию.

В некоторой степени эти затруднения могут быть преодолены при использовании дрожжей, бакуловирусов и перевиваемых клеток насекомых, однако, далеко не всегда посттрансляционные модификации, осуществляемые в этих системах, идентичны таковым, происходящим в клетках млекопитающих. Наконец, очевидно, что основой возникающей сейчас генной терапии - новой области современной биомедицины, направленной на борьбу с наследственными и онкологическими заболеваниями,- является перенос и экспрессия нормальных генов, которые должны восполнить дефект, связанный с отсутствием или мутациями того или иного гена у пациента.

Существует несколько методов введения фрагментов ДНК в геном клеток млекопитающих. Наиболее распространен метод трансфек-ции, в котором очищенную ДНК соосоздают с фосфатом кальция или сульфатом декстрана, а затем осадок наносят непосредственно на

клетки, растущие на твердой подложке. Захваченная путем пиноци-тоза ДНК может интегрировать в геном и в его составе передаваться по наследству как обычный клеточный ген. Этот-метод имеет ряд ограничений. Во-первых, эффективность его довольно низка и лишь небольшая доля клеток в популяции ( 1 из 1000 в расчете на 1 мкг ДНК ) приобретает стабильно интегрированную ДНК. Во-вторых, клетки лишь небольшого числа линия, культивируемые в монослое на твердой подложке, могут быть трансфицированы. В суспензионных культурах трансфекция практически не происходит. В-третьих, при трансфекции встраивается неконтролируемое число копий ( от одной до нескольких десятков) фрагментов внесенной ДНК, что существенно затрудняет анализ их экспрессии. Предложен модифицированный вариант процедуры трансфекции, при котором осадок ДНК формируется непосредственно на поверхности трансфицируемых клеток ( Chen and Окауаиа, 1987 ). По сообщениям авторов, эффективность трансфекции при этом заметно увеличивается, однако два недостатка из упомянутых трех присущи и этому методу трансфекции .

За последние годы предложено несколько методов введения фрагментов ДНК в клетки млекопитающих, основанные на воздействии на клетки электрического поля i электролорация ), лазерных лучей, механических частиц, несущих на своей поверхности ДНК, а также - на слиянии протопластов бактериальных клеток, содержащих рекомбинантные плазмиды, с животными клетками и др. Следует отметить, что, несмотря на определенные специфические преимущества этих методов, они не свободны от недостатков, которые существенно ограничивают сферу их использования.

Несомненно, что системы переноса и экспрессии генов, основанные на использовании геномов вирусов животных, являются более физиологичными и перспективными и одновременно служат инструментом как переноса генов, так и их экспрессии. Особое место среди вирусных векторов занимают инфекционные ретровирусные векторы, сохраняющие ряд характерных особенностей природных ретро-вирусов. Следующие особенности ретровирусов делают их удобными для применения в качестве векторов для переноса генов в клетки высших эукариот: 1) высокая эффективность стабильной интеграции провируса в геном клетки-хозяина; 2) определенная структура и

риентация встроенных в геном клетки последовательностей ДНК [ровируса, которая задается длинными 5' - и 3' - концевыми повторами (LTR); 3) ограниченное число копий интегрированных прови-|усов; 4(разнообразие размеров генома (от 2 до 13 тыс.нуклеоти-юв I, что позволяет клонировать в ретровирусных векторах до-юльно большие фрагменты ДНК. Существенно, что для этих вирусов ;меется широкий спектр клеток-хозяев ( как по видовой, так и каневой специфичности ), определяемый, главным образом, глико-[ротеидом оболочки вируса. РетроЕирусы в большинстве случаев не |бладаот цитопатическим эффектом: зараженная клетка продуцирует ирусные частицы и продолжает делиться.

[ель и задачи нсследовавния. Главная цель состояла в создании ффективной системы переноса и экспрессии генов различной :рироды в клетках млекопитающих для решения задач фундаменталь-гай и прикладной молекулярной биологии. Конкретными задачами ¡ыли:

1 .Исследование возможности использования сконструированных :ами инфекционных ретровирусных векторов для переноса и экс-мессии генов-белков различной природы.

2. Использование ретровирусных векторов для анализа генов с :еизвестными функциями.

3. Исследование возможности использования ретровирусных ве-:торов для регуляции экспрессии генов ln vivo с помощью анти-мысловых РНК.

4. Установление возмоаетости иммунизации животных сингенными .летками, продуцирующими гетерологичный белок-антиген.

5. Исследование возможности локально направленного воз-еяствия на определенные ткани организма с помощью клеток-родуцентов биорегуляторов белковой природы.

Предполагалось, что в ходе работы будет создана эффективная етровирусная система переноса и экспресии геноЕ, которая поз-олит решить эти задачи.

аучная новизна.В ходе работы создано семейство инфекционных етровирусных векторов pPS-neo, выгодно отличающихся наличием олилинкерной области в участке клонирования экспрессируемых ге-ов под сильным промотором LTE вируса лейкоза мышей Молони и рисутствием второго участка клонирования l С2а1 ),что позволило

провести клонирование в одном векторе одновременно двух генов, кодирующих полипептидные цепи двух суеъединиц белка, и показать возможность использования для этой цели независимых промоторов. Показана хорошая совместимость сконструированных векторов pPS-пео с разными системами формирования инфекционных ретровирусных частиц, что позволяет в зависимости от целей опыта получать инфекционные ретровирусные частицы различной тропности. В конечном счете, это позволяет вносить необходимые гены в клетки животных и человека. Проведен анализ экспрессии ряда генов человека различной природы, как содержащих интроны, так и их лишенных (кДНК ) в перевиваемых клетках грызунов. Установлено, что в ходе однократного ретровирусного заражения может осуществляться полная утрата большего числа интронов (до семи ), однако эта особенность не универсальна: в некоторых случаях не удается получить лишенную всех интронов копию гена, исходно содержащего интроны, что определяется, вероятно, не свойствами использованной ретровирусной системы, а особенностями клонированных генов.

Показано, что экспрессия генов в норме, осуществляемая клетках специализированных тканей человека и животных, может быт достигнута и в неспециализированных клетках, таких, например, ка фибробласты. При этом природно секретируемые белки сохраняют эт особенность при культивировании клеток - продуцентов In vitro Полученные в этих опытах результаты существенны для развития ген ноя терапии соматических клеток. В результате клонирования корот ких тандемноповторяющихся фрагментов ДНК, соответствующих не транслируемой части и началу транслируемой части мРНК, но имевши противоположную ориентацию, нами был сконструирован ретровирусны вектор, эффективно направляющий синтез антисмысловой РНК. Показа но, что в определенных условиях происходит потеря коротких повто ров, входящих в ретровирусныя вектор.

Для выяснения нормальных функций клеточного гена р53 мы впервые применили ретровирусныя вектор, экспрессируюдай антисмысловые РНК р53 в виде коротких повторов, и показали, что экспрессия эндогенного гена р53 необходима для пролиферации нормальных и трансформированных клеток.

Для установления возможной роли недавно описанного гена sor. в клетках млекопитающих мы провели клонирование в экспрессирую-

нем векторе pPS-3-neo фрагмента ДНК. соответствующего 3'- конце-зои части транскрипта гена son и содержащего большую открытую рамку считывания, кодирующую 689 аминокислотных остатков. Получены трансформанты клеток различных линий, содержащие этот ре-комбинантный вектор. Показано, что значительная доля трансформантов имеет измененную морфологию: клетки этих клонов, наряду с эндогенным белком P92son, содержат новый белок с мол.массой -120 кДа, реагирующий с иммунной сывороткой к son-специфическому пептиду.

Практическая ценность. Разработана эффективная система переноса и экспрессии генов в клетках млекопитающих, которая может быть использована как для для фундаментальных исследований, так и прикладных работ. С помощью векторов семейства pPS-neo получены линии перевиваемых клеток млекопитающих, продуцирующие регуля-торные белки (гормоны, цитокины, ферменты) человека. Эти линии нашли применение в лабораториях ИМБ АН СССР и других институтах, где они используются для решения разного рода задач. Культура клеток фибробластов мыши, продуцирующая интерлейкин-2 человека, применяется в настоящее время для наработки среды для культивирования лимфоидных клеток. Такая среда обеспечивает более эффективный рост лимфоцитов по сравнению со средами, содержащими ре-комбинантный интерлейкин-2, синтезируемый в клетках E.coli. Подход, разработанный для подавления экспрессии гена р53 с помощью коротких тандемно повторяющихся антисмысловых фрагментов, может быть применен для исследования функций других генов. Разработана схема иммунизации животных путем введения в организм сингенных клеток, продуцирующих секретируемыи гетерологичный белок-антиген. Показана возможность использования клеток, продуцирующих " терапевтические" белки, для локального направленного воз-действя на ткани живого организма.

Апробация работы. Диссертационная работа была апробирована на заседании межлабораторного научного семинара Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта в октябре 1991 года.

Основные результаты исследований докладывались на конкурсе научных работ ИМБ АН СССР в 19вТг, на всесоюзном совещании проекта "Ревертаза-Онкоген" в Кярике (Эстония! в 1986г., на конференции "Актуальные проблемы молекулярной биологии и

онкологии" в Алуште в 1987 г., на 9-ом симпозиуме Европейской группы раковых исследований в Хельсинки в 1987 г., на Международном совещании по онкобелку р53 в Париже в 1987 г., на 14-ом Международном биохимическом конгрессе в Праге в 1988 г., на 6-ом симпозиуме СССР - Италия "Макромолекулы в функционирующей клетке" в Ленинграде в 1983 г., на Международном симпозиуме по молекулярной и клеточной онкобиологии в Таллине в 1988 г., на Всесоюзной конференции "Новые направления биотехнологии" в Пущино в 1988 г., на 4-ом и 5-ом Международных совещаниях по онкогенам во Фредерике (США) в 1988 и 1989 гг., на Э-ей Всесоюзной конференции "Макромолекулы клетки" в Москве в 1989 г., на:8-ом симпозиуме СССР-ФРГ "Организация генома и регуляция активности генов" в Иркутске в 1989 г., на Всесоюзной конференции "Новейшие направления генной и клеточной инженерии" в Пущино в 1990 г. Кроме того,материалы неоднократно докладывались на научных семинарах Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта АН СССР, Института экспериментальной кардиологии Всесоюзного кардиологического центра, на семинарах факультета естественных наук, и медицинского факультета Университета г. Турку (Финляндия) и Института вирусологии и иммунологии им. Г.Петте Университета г, Гамбурга (ФРГ), Отдела биологии клетки Коллеж де Франс (Париж, Франция). Структура работы. Диссертация изложена в настоящей работе в форме научного доклада. Основная часть результатов получена в соавторстве с П.М.Чумаковым, П.М.Рубцовым, И.М.Чумаковым, Ф.Б.Бердичевс-ким.Н.Н.Войтенком, А.Б.Панютичем, М.В.Резниковым А.Я.Шевелевым, Р.Л.Турецкой и С.А.Недоспасовым. Вклад других соавторов отражен в публикациях по теме диссертации. Всем коллегам автор приносит глубокую благодарность за участие в совместных работах. Выражаю искреннюю признательность А.А.Баеву и Л.Л.Киселеву за постоянный интерес, поддержку и обсуладение работы.

РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

1.Конструирование инфекционного ретровирусного вектора pPS-neo.

Исследование молекулярной организации ретровирусов и механизмов их взаимодействия с клеткой-хозяином показало, что возникновение репликационно-дефекгного трансформирующего вируса из репликационно-компетентного нетрансформирующего предшественника является следствием захвата геномом ретровируса нормальных клеточных генов - протоонкогенов, которые при этом выходят из-под контроля регуляторных механизмов клетки. В подавляющем большинстве случаев этот процесс сопровождается потерей части вирусного генома, причем делеции могут затрагивать один или несколько структурных генов ( гены ga.g, pol и env ). Активированные прото-оикогены, получившие название вирусных онкогенов, могут быть перенесены в новые клетки при их заражении, а затем в составе про-вируса встроены в геном клетки. Экспрессия активированных он-когенор приводит к изменению свойств зараженных клеток - их трансформации.

Таким образом, в результате заражения клеток трансформирующим ретровирусом осуществляется перенос генетического материала от одних клеток другим и его последующая экспрессия. Роль вектора при этом играет трансформирующий ретровирус. Существенно, что размножение дефектного трансформирующего ретровируса происходит лишь в условиях совместного заражения с вирусом-помощникон, сохраняющим неповрежденными все свои гены и таким образом восполняющим утраченные функции трансформирующего дефектного вируса. Эти данные прямо указывали на возможность использования ретровирусов для создания на их основе системы переноса и экспресии генов в клетках животных и человека, особенности ретровирусной системы переноса и экспрессии генов представлялись нам наиболее удобными для введения генов в клетки млекопитающих, в том числе и человека. К моменту начала работы (1964) в литературе сообщали о нескольких ретровирусных векторах, использование которых было сопряжено с определенными трудностями (Shlmotohno and Temin,

1981; Mulligan and Berg, 1981; Cepco et. all, 1984). Прежде все го, это было связано с ограниченными возможностями клонироват и сравнительно невысокими титрами инфекционных ретровируснь частиц. Вместе с тем, нам представлялось очевидным, что систеь ретровирусного переноса имеет ряд нереализованных возможностей которые мы хотели утилизовать.

Основой для конструирования инфекционного ретровирусног вектора нам послужили дан ные по организации генома типичнь ретровирусов млекопитающих. На рис.1 схематически изображен провирус-геном репликационно-компетентного ретровируса. 5 -

3 - концевые области \ LTR) при интеграции провируса стыкуются участками геномной клеточной ДНК. Функции LTE необходимы для ин теграции провируса в хозяйскую ДНК и транскрипции вирусной РНК провирусной матрицы. В состав LTR входит сильный промотор и эн хансер, который усиливает транскрипционную активность как про вирусной, так и расположенной по соседству клеточной ДНК. Непос редственно к 5 - концевому LTE примыкает участок вирусного гено ма, который небходим для упаковки геномной клеточной РНК в ви русспецифические белки при формировании вирусных частиц (¥-об ласть ). Участки РВ+ и PB- необходимы для синтеза ДНК провирус на РНК-матрице. LTR, ^-область и участки PB- обязательно должн входить в состав вирусного генома для нормального осуществлени жизненного цикла вируса. Эти функции не могут быть восполнен вирусом-помощником при совместном заражении. В то же время реп ликационно-дефектные ретровирусы способны использовать белки кодируемые генами gag, pol и env вируса-помощника, для осущест вления своего жизненного цикла.i Белки, кодируемые генами gag pol и env, входящими в состав генома репликационно-компетентны ретровирусов,необходимы для формирования вирусных частиц, обрат ной транскрипции, адсорбции и проникновения в клетку при зараже нии ).

Таким образом при конструировании инфекционных ретровирус ных векторов необходимо сохранить все области генома ретровиру са, выполняющие цис-функции (оба LTR, ^-область и РВ->, тогд как гены, кодирующие вирусспецифические белки, могут быть заме нены фрагментами ДНК не ретровирусноя природы. Очевидно, что состав ретровирусного вектора должны входить: LTR, ^-область РВ-. Обязательной составной частью должен быть участок начал

»епликации, взятый из генома бактерии, позволяющий проводить :тандартные генноинженерные манипуляции с ДНК вектора. Кроме то-•о, для отбора рекомбинантных клонов необходимо включение в сос-■ав вектора генов, обеспечивающих возможность селекции, например, юобшаюших клеткам устойчивость к антибиотикам. Нам представляюсь целесообразным использовать для селекции доминантные гены остойчивости к антибиотикам, в норме отсутствующие в животных :летках. Это позволяет существенно расширить спектр используемых клеток и, что особенно удобно, использовать для работы клетки ди-:ого типа.

цис-функции

□о

gag ро1 епу — —

1ЛК + РИ-ЬТК

РВ рв

гране—функции

>ис.1. Структурно - функциональная организация генома реплика-даонно-компетентного ретровируса. Элементы генома ретровируса, ¡ыполняющие цис-функции: НИ - синтез вирусной РНК и интегра-1ия провируса; ^-область - формирование вирусной частицы инкапсидация вирусной РНК вирусспецифическими белками); РВ- -;интез ДНК провируса. Элементы генома ретровируса, выполняющие пранс-функции: ген - структурные белки вирусной частицы; ген - обратная транскриптаза; ген епу - гликопротеиды оболочки шруснои частицы.

Конструирование ретровирусного вектора рРЗ-1-пео принци-шально состоит в следующем. В ДНК провируса лейкоза мышей Молони ¡водят дополнительный участок узнавания рестриктазы ВатН1 и уда-1яют участок узнавания рестриктазы Н1гШП, затем вместо области, солирующей вирусные структурные белки, вводят модифицированный юлилинкер из плазмиды рЗР64 и ген устойчивости к неомицину из 5актериального транспозона Тп5, находящийся под контролем раннего 1ромотора ЗУ40. Размер вектора рРБ-1-пео - 9,6 тысяч пар нуклео-"идов( т.п.н. ), а максимальная величина клонируемой ДНК - около

7 т.п.н.

Б состав вектора входят: 1) бактериальная векторная плазми да pSP64, у которой полилинкер заменен единичным участком узнава ния рестриктазы £coRI, плазмидная компонента содержит участок на чала репликации pUC и ген лактамазы, сообщающий клеткам E.col устойчивость к ампициллину; 2) два фрагмента ДНК провируса вирус лейкоза мышей Молони ( Mo-MLY ), включающие левый и правый LTR ^-область, ответственную за упаковку полных транскриптов ретрови русного вектора в вирионоподобные частицы, а также прилегающие LTB небольшие участки геномной ДНК клеток, из которых этот прови рус был исходно клонирован; 3) полилинкер, содержащий участки уз навания рестриктаз, по которым предполагается клонирование чуже родных генов; 4> участок начала репликации ДНК SV40, содержаши также ранний промотор SV40; 5) ген neo, сообщающий клеткам млеко питающих устойчивость к генетицину (G-418), а бактериальным -канамицину; 6) сигнал для сплайсинга из ранней области SV40 Схема вектора pPS-1-neo приведена на рис.2.

pPS-1-neo

Рис.2. Схематическое изображение вектора pPS-1-neo.

Встраивание чужеродных генов под промотор ретровируса производится в уникальные участки полилинкера Hlndlll и Sail, а в случае ограниченной рестрикции - и по участкам узнавания рестриктаз BamHI, EcoRI, Xbal и SacI полилинкера. Конструкция

PS-1-neo позволяет также встраивание чужеродных генов, находя-ихся под контролем собственных или гетерологичных промоторов, [о уникальному С1а1-участку, расположенному вправо от гена пео.

В целях оптимизации процедуры клонирования была проведена юдификация ретровирусного вектора pPS-1-neo, в ходе которой 'частки узнавания рестриктазами EcoEI и BamHI, не входящие в сослав полилинкера, были уничтожены, что привело к увеличению уникальных участков клонирования в векторе pPS-3-neo (Hindlll, Sali, BamHI, EcoRI ).

Перенос и экспрессия генов в клетках млекопитающих с по-ющью векторов pPS-neo осуществляется в два этапа: I) ДНК векто->а pPS-neo с клонированным геном вводят методом ДНК-трансфекции > клетки, экспрессируюшие структурные белки вируса лейкоза мышеи <олони ( упаковывающие клетки типа Ü-2 или им подобные); 2> посте селекции упаковывающих клеток, в которых осуществляется транс-срипция ретровирусного вектора, на культуральной среде с G-41Ö троизводят сбор инфекционных векторных частиц (в состав таких истиц входит только векторная РНК /Ч^-РНК/ и отсутствуют вирус-:пецифические f'-mPHK, направляющие в упаковывающих клетках синтез вирусных белков) и заражают ими клетки-мишени, в которых предполагается проводить экспрессию клонированного гена. Т.к. при этом одновременно осуществляется перенос гена пео, то отбор клонов трансформированных клеток удобно проводить на среде с G-418. Существенно, что процесс передачи вектора по горизонтали прекращается, т.к. клетки-мишени, как правило,не содержат функционально-активный вирус-помошник. Цикл переноса генов с помощью ретровирусного вектора pPS-neo представлен на рис.3.

Эффективность переноса генов, осуществляемого вектором pPS-1-пео, определяли,используя в качестве упаковывающих клеток линию 4-2 (Mann et all., 1983), а клеток-мишеней - фибробласты крысы Eatl.

Селекцию клеток ¥-2, трансфицированных pPS-1-neo или pPS-l--neo-mos, содержащим клонированный онкоген вируса саркомы мышей Молони, также как и клеток Rati после заражения, вели на среде DMEM + 10* FCS ( Gltco > в присутствии антибиотика G-418 1400 - 600 ыкг/мл). Как правило, отбор занимал около 2-х недель После отбора клеток V-2, трансфицированных векторной ДНК, массо-

вую культуру без последующего субклонирования наращивали дс субконфлюентного состояния в отсутствие G-418, вируссодержащу« среду собирали, пропускали через нитроцеллюлозный фильтр с диаметром пор 0,22 мк, проводили серийные разведения свежей средой, добавляли полибрен до концентрации 8 мкг/мл и использовали для заражения клеток-мишеней Rati. После заражения клетки Rati рас-севали так, чтобы можно было произвести подсчет индивидуальны> колоний клеток, устойчивых к G-418.

ДНК вектора

ltr

(E.coli) LTR

Трансфекция

I-

]

------рнк

Сборка

Выход в среду

Вирусная частица

Заражение

Обратная транскрипция

Интеграция

E.coli

Упаковывающие клетки

Куль тур аль ная среда

Клетки-мишени

Рис. 3. Цикл переноса генов с помощью ретровирусного вектора pPS-neo с использованием упаковывающих клеток.

Вектор pPS-1-neo с высокой эффективностью осуществляет перенос и экспрессию генов в перевиваемых фибробластах крысы Rati: при использовании упаковывающих клеток линии V-2 титр инфекционных ретровирусных частиц, несущих рекомбинантную векторную РНК, составлял 7x10 к.о.ч./мл среды культивирования. (Количество инфекционных частиц соответствовало количеству колоний клеток Rati, образовавшихся в присутствии 400 мкг/мл G-418 на 10

день после заражения 10 клеток 1 мл среды культивирования кле-

ток ф-2, содержащих интегрированную ДНК pPS-1-neo. Среди клеток Rati, зараженных pPS-1-neo и устойчивых к G-418, не было обнаружено клеток одновременно с этим имеющих морфологию, характерную для трансформиированных клеток. В случай рекомбинантного вектора, pPS-1-пео-тюБ, несущего онкоген v-mos, была достигнута эффективная экспрессия онкогена, приводящая к неопластической

трансформации. Эффективность переноса составляла 9 х 10 к.о.ед/ мл культуральноя среды, причем клетки более 70% колоний имели трансформированный фенотип. Клетки-трансформанты обладали характерной морфологией и давали начало опухолям в иммунодефицит-ных мышах. Следует отметить, что значительная доля трансформированных клеток имела шарообразную форму и характеризовалась крайне низкой адгезивностью. Эти особенности приводили к потере таких клонов через 7-10 пассажей.

Сравнение векторов pPS-1-neo и pPS-3-neo с имеющимися в нашем распоряжении инфекционными ретровирусными векторами серии pZip 1 Серсо et. al. 1934) показало, что эффективность инфекционного переноса, производимого вектором pPS-1-neo или pPS-3-neo, на 1,5 - 2 порядка выше, чем у векторов серии pZip при использовании упаковывающих клеток одних и тех же линий.

Использование упаковывающих клеток "амфотропных" линий позволяет использовать векторы pPS-neo для переноса и экспресии генов в клетках человек, однако титр инфекционных частиц pPS-neo, продуцируемых такими упаковывающими клетками значительно ниже, чем в случае использования упаковывающих клеток ip-2, продуцирующих экотропные вирусные частицы. В нашей работе мы использовали клетки РАЗ 17 (Miller & Buttlmore 1986), которые после трансфек-ции ДНК pPS-1-neo продуцировали рекомбинантные частицы, сообщающие клеткам почки человека линии 293 устойчивость к G-418 с

эффективностью 2-540 к.о.ч./мл культуральной среды.

Дальнейшее совершенствование векторов семейства pPS-neo было связано с введением в ретровирусную конструкцию гена дигидро-фолатредуктазы (DHFR) под контролем промотора ранней области SY-40 (вектор pPS-4-neo. рис.4 ). Наличие в векторе гена DHFR позволяет, как известно, осуществлять амплификацию всей интегрированной ДНК провируса вместе с фланкирующими участками генома при воздействии на клетки метатрексатом. Таким образом можно увели-

чить дозу гена и, как следствие, - количество белка, синтез которого направляется этим геном.

LTR у PL

SV40 SV40

Oli

ori пво

LTR

PL: SalI.HindIII.SalI, BamHI.EcoRI

pPS-4-neo

Рис.4. Схематическое изображение ретровирусных векторов pPS-4-neo и pPS-5-neo.

Увеличение эффективности экспресии того или иного клонированного гена может быть достигнуто при использовании более сильных, по сравнение с LTR Mo-MLV, промоторов. Одним из наиболее сильных промоторов, известных в настоящее время, является конститутивный промотор цитомегаловируса (CMV), успешно используемый для экспрессии белков в перевиваемых клетках млекопитающих (Cullen et. al., 1986.). Б инфекционном ретровирусном векторе pPS-5-neo (рис.4) экспрессия генов, клонированных в полилинкере, находится под контролем промотора CMV. Наличие в этом же векторе гена DHFR позволяет, как и в случае pPS-4-neo, осуществлять амплификацию интегрированного провируса с помощью метатрек-сата. Оба вектора, - pPS-4-neo и pPS-5-пео,- были использованы в Институте биоорганической химии им. М.М.Шемякина АН СССР

Е.И.Фроловой с сотрудниками для экспрессии г~интерферона в перевиваемых клетках грызунов. Селекция на среде с метатрексатом позволила получить клоны, клетки которых содержат амплифициро-ванный провирус, интегрированный в геном, и продуцируют интерферон. В стандартных условиях выход у-интерферона составлял 500 и 100ü единиц активности/мл/сутки при использовании для экспрессии кДНК гена интерферона векторов pPS-4-neo и pPS-5-neo, соответственно .

Очевидно, амплификация участков генома, в состав которых входит ген DHFR, может быть полезной для получения линий клеток, продуцирующих нужные белки, однако следует учитывать, что любые неконтролируемые перестройки генома, в том числе и вызываемые метатрексатом, могут приводить к существенным изменениям свойств клеток, таким, например, как переход в трансформированное состояние. Поэтому, нам представляется неоправданным использование любых приемов, приводящих к хромосомным аберрациям, в фундаментальных исследованиях биологии клетки и в генной терапии.

Исследование молекулярной природы трансформирующих ретрови-русов показало, что потеря интронов клеточными генами, захваченными ретровирусным геномом, является природной особенностью этой группы вирусов (Bishop,1988).. Поэтому представлялось целесообразным конструирование ретровирусного вектора, предназначенного для удаления интронов из клонированных в нем генов с интронами. Для этого следовало ввести в ретровирусную часть вектора между LTR участок начала репликации ДНК бактерий, что позволяет осуществлять в клетках E.coll амплификацию ДНК рекомбинантного провируса, выделенного из зараженных клеток, т.е. тогда, когда уже произошло удаление интронов из клонированного гена. На рис 6 представлена схема инфекционного ретровирусного вектора pPS-6- neo, полученного на основе вектора pPS-3-neo. Для создания генно-инженерной конструкции нового вектора проведена модификация плаэмиды P1AN7, заключающаяся в замене множественного клонирующего участка (полилинкера) участком узнавания рестриктазы Cial. Затем линеаризованную плазмиду вводили в Clal участок ретровирусного вектора pPS-3-пео. Полученный вектор pPS-6-neo содержит между двумя вирусными LTR репликон плазмиды P1AN7 и синтетический ген супрессорной тРНК, сообщающий специальному штамму E.coll МС1066 способность

расти на среде с канамицином.

pPS-6-neo

Рис.5. Схематическое изображение ретровирусного вектора

pPS-6-neo.

В целях упрощения схемы и сведения до минимума времени получения спланированных копий генов была проверена возможное^ использования транзиторной трансфекции при введении ДНК1рекомби-нантного вектора в упаковывающие клетки РА 317. В качестве контрольного гена с интронами для встраивания в вектор pPS-6-neo ис-пользоЕали ген фактора, стимулирующего рост колоний гранулоцито] и макрофагов (GM-CSF) человека (любезно предоставлен Е.И.Фроловой, ИБХ им. М.М.Шемякина АН СССР). Титр инфекционных вирионо: составлял 3,5 х 103 по сравнению с 1,2 х 1(Р для культурально! среды упаковывающих клеток, выращиваемых в течение трех недель hí среде с G-41в после трансфекции. Этог титр мы считали достаточны, для заражения клеток COSI, которое проводили с множественность! 1 к.о.ед./клетку или 0,01 к.о.ед./клетку. Через 72 часа после за ражения i время, необходимое для образования ДНК провируса поел' заражения клеток рекомбинантным ретровирусом и ее амплификации )

10ь клеток использовали для приготовления фракции эписомных ДНК (экстракт Хирта). После трансфекции экстрактов Хирта в клетки E.coll МС 10631РЗ) было получено 15 колоний при множественности заражения клеток COSI 0,01к.о.ед./мл и 316 колоний при множественности заражения 1 к.о.ед./мл. 12 колоний были использованы для выделения плазмидной ДНК и анализа размера вставки ДНК гена GM-CSF методом PCR. При этом 8 плазмид имели вставку размером около 500 п.н. ( удалены все интроны I, 3 плазмиды - около 600 п.н. ( не удален малый интрон ), и одна плазмида - около 1200 п.н. (не удален второй или третий интрон).

На основании полученных данных можно сделать выводы, что вектор pPS-6-neo может быть использован для сплайсирования генов, а также, что для этого применима упрошенная схема, включавшая транзиторную трансфекцию. Время от введения конструкта в клетки до получения процессированной копии ДНК составляет около 10 дней.

II. Перенос и экспрессия генов различной природы в перевиваемых клетках млекопитающих.

Регуляторные белки (гормоны, цитокины, иммуно- и нейромедиа-торы и др.), секретируемые специализированными клетками, играют важную роль в эмбриогенезе и поддержании нормальных функций зрелого организма. Многие болезни человека и животных, в том числе и наследственные, обусловлены нарушениями или полным отсутствием экспрессии генов регуляторных белков. Одним из перспективных подходов современной биомедицины является получение перевиваемых клеток, эффективно продуцирующих нужные белки-регуляторы. Подобные клетки могут быть использованы для биотехнологического производства или же (в случае сингенных клеток) применимы для генной терапии.Поэтому нам представлялось необходимым определить возможности ретровирусных векторов pPS-neo для переноса и экспрессии генов млекопитающих, в первую очередь, человека, разной природы в перевиваемых фибробластах.

II.1. Экспрессия гормона роста человека в перевиваемых фибробластах грызунов.

Гормон роста (соматотропин, СТГ) человека - полипептид, сек-ретируемьй в норме специализированными клетками гипофиза. Этот регуляторный белок, состоящий из 191 аминокислотного остатка (мол. масса 22 кДа), выполняет в организме важную функцию стимулятора роста соматических тканей. В последние годы получены данные, свидетельствующие о заметной роли СТГ в процессах старения. Недостаток СТГ в период развития организма приводит к задержке роста и, в конечном счете, к карликовости.

Рис.6. Схематическое изображение рекомбинантного ретровирусного вектора рРЗ-пео-ЗТН, содержащего кДНК гена предшественника гормона роста человека.

В нашем распоряжении была кДНК гена предшественника СТГ человека, любезно предоставленная П.М.Рубцовым. кДНК гена предшественника СТГ величиной 0,8 т.п.н. клонировали по ШпсПП участку вектора рРЭ-З-пео Iрис.6), после чего рекомбинантную векторную ДНК вводили в геном перевиваемых фибробластов мыши Ва1Ь/с, используя процедуру инфекционного ретровирусного переноса. Селекцию на С-418 проводили одновременно с клонированием на 96 луночных платах, что позволило получить индивидуальные клоны клеток Ва1Ь/с, продуцирующих СТГ, без промежуточных этапов клонирования. Концентрацию СТГ определяли иммунохимическим методом (Свешников и

human pre-STH

pPS-neo-STH

др., 1988 г.). При анализе способности клеток отдельных клонов продуцировать СТГ человека были выявлены как клоны, продуцирующие от 50 до 7800 нг/мл СТГ в условиях монослоя ( табл. 1), так и клоны, не продуцирующие СТГ.

Таблица 1

Концентрация зрелого СТГ человека в кондиционированной среде различных клонов Ва1Ъ/с-ЗТН.

Номер клона Среднесуточный Максимальная

ВаШс-ЭТН, выход СТГ концентрация 6

продуцирующего в среду, мкг/мл среде, мкг/мл

СТГ человека

2 1,7 5,8

5 2,0 7,8

8 1,6 5,3

9 1,6 5,3

12 1 Л 5,2

13 1 ,5 7,1

15 0 ,5 5,5

Анализ методом Саузерна геномной ДНК клеток индивидуальных клонов Ва1Ъ/с-ЗТН, как продуцирующих, так и не продуцирующих СТГ, так же как и геномной ДНК клеток Ва1Ъ/с и клеток Ва1Ъ/с, зараженных рРЗ-1-пео, показал, что клоны Ва1Ъ/с-ЗТН, не продуцирующие СТГ (так же, как клетки линии Ва1Ь/с и контрольные клетки клонов Ва1Ь/с~пео,> не содержат вставки гена пре-СТГ размером 0,8 т.п.н. в отличие от продуцирующих СТГ клонов Ва1Ь/с-ЗТН

На рис.7 представлены кривые накопления СТГ в культуральной среде клеток 3-х клонов Ва1Ъ/с-ЗТН. Несмотря на то, что клетки достигали монослоя на 4-ые сутки после пересева и суточная продукция СТГ практически не изменялась, кривые накопления СТГ в среде достигают максимума на 8-9 сутки, а затем выходят на плато. Небольшое снижение концентрации СТГ к 11-ым суткам культивирования свидетельствует, вероятно, о его частичной деградации в кондиционированной среде, содержащей протеаэы. Как бидно из рис.7.

накопление СТГ в среде идет медленнее, чем можно ожидать, суммируя суточную продукцию. Скорее всего, это связано с различным! условиями культивирования клеток в двух вариантах опыта. При определении суточной продукции СТГ клеткам ежедневно заменяли среду, а при снятии кривых накопления СТГ среда не менялась на протяжении всего опыта. Истощение культуральной среды, вызвавшее снижение пролиферативнои и метаболической активности клеток могло повлиять на экспрессию СТГ.

Рис.7. Содержание гормона роста человека в культуральной среде различных клонов Ва1Ь/с - БТН.

Для концентрации и очистки СТГ, содержащегося в культуральной среде, была использована колонка с иммуносорбентом. На имму-носорбент наносили 100 мл кондиционированной среды и проводил> элюцию СТГ в стандартных условиях. Это позволило очистить СТГ человека и повысить его концентрацию в 40 - 80 раз. Анализ препарата СТГ, очищенного на колонке с иммуносорбентом методом электрофореза в ПААГ по Лемли, свидетельствует об идентичности мол. масс

СТГ, секретируемого клетками Balb/c - STH,и СТГ, синтезируемого в клетках E.coll, содержащих рекомбинантную плазмиду с кДНК зрелого СТГ, - около 22 кДа (рис.81. Однако при длительной инкубации СТГ человека в кондиционированной среде (14 сут. и более), в условиях гибели монослоя , наблюдается его деградация до фрагмента с мол. массой 15 кДа, подобно тому, как это происходит с СТГ, выделенным из гипофиза человека, и рекомбинантным СТГ, синтезированным в клетках E.coll.

1 2 3

— ; 170 ^ ! 97,4

55,4

36,5

20,1 12,5

6,5 (kDa)

Рис.8. Анализ методом электрофореза в ПААГ в денатурирующих условиях СТГ человека, полученного из культуральной среды клеток клона Ва1Ь/с-ЗТН-5 путем аффинной хроматографии на колонке с иммуносорбентом (1 ). и зрелого СТГ человека, выделенного из клеток Е.соИ, содержащих соответ ствующую рекомбинантную плазмиду (3). 2- маркерные белки.

Анализ экспрессии СТГ в упаковывающих клетках ¥-2, содержащих интегрированный в геном рекомбинантный вектор рРЭ-пео-ЗТН, с помощью моноклональных антител к зрелому СТГ человека свидетельствует, что ни клетки, ни их культуральная среда практически не содержат СТГ человека. Возможно, что рекомбинантная РНК, транскрибируемая с интегрированной векторной ДНК в условиях эксперимента, быстро упаковывается вирусными белками в клетках ¥-2 и.

следовательно, не может образовывать продуктивный комплекс с ри босомами (рис.9).

1__2 3 и

'а б Ь а б Ь"а б Ь'а б Ь'

чк

Рис.9. Радиоавтограмма белков, меченных г Э 1метионином и раэде ленных электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях: 1,2 внутриклеточные белки и белки культуральной среды клето Ч'-рРЗ-пео-ЗТН, продуцирующих рекомбинантные вирусные частицы рРБ пео-ЭТН; 3,4 - внутриклеточные белки и белки культуральной сре ды клеток Ва1Ъ/с-5ТН, продуцирующих СТГ человека. Культуральную среду и клеточные лизаты обрабатывали различными антителами, затем-оболочками стафилококка. Белки преципитата наносили н гель: а - белки, взаимодействующие с неиммунной сывороткой; б белки, взаимодействующие с антителами к гормону роста человека; - белки, взаимодействующие с антителами к белку р53. Стрелкой по казан СТГ человека.

В клетках-мишенях,не содержащих вирусспецифических белков рекомбинантная РНК, транскрипция которой находится под контроле

регуляторных элементов 3'-концевого LTR pPS-neo-ЗТН, эффективно направляет синтез пре-СТГ. Лидерныя N-концевой пептид пре-СТГ обеспечивает трансмембранный перенос и созревание СТГ как в клетках Balb/c, так и Ratl: СТГ присутствует, в основном, в культу-ральной среде, и лишь небольшое количество гормона может быть обнаружено в самих продуцирующих фибробластах.

Используя идентичный подход, мы получили ряд клонов фибро-бластов крысы, секретирующих зрелый СТГ, однако уровень экспрессии СТГ был в 3-5 раз ниже, чем у клонов - продуцентов, полученных на основе фибробластов мыши Balb/c.

Таким образом, СТГ человека успешно синтезируется и секрети-руется перевиваемыми фибробластами, причем уровень экспрессии СТГ в перевиваемых фибробластах сопоставим с таковым в клетках S. се-revlslae, содержащих соответствующий рекомбинантный вектор ( Эль-даров и соавт., 1991 ). Перенос кДНК гена предшественника СТГ человека и его экспрессия эффективно достигаются с помощью инфекционного ретровирусного вектора pPS-neo. При этом осуществляется интеграция клонированного гена в геном клеток-мишеней (перевиваемых фибробластов !, в результате чего рекомбинантный провирус стабильно передается по наследству как природные гены. Экспрессия СТГ сохраняется практически без изменения при пассировании клеток более года.

II. 2. Экспрессия интерлейкина-2 человека в перевиваемых фибробластах грызунов.

Известно, что лимфокины играют одну из главных ролей в формировании иммунного ответа (см. Oppenheim, 1990 ). В настоящее время известно более 30 лимфокинов, большинство из которых глико-зилировано. При модуляции иммунного ответа лимфокины действуют как классические гормоны, связываясь со специфическими рецептор-ными белками, локализованными на клеточной поверхности. Следствием этих взаимодействий являются изменения в пролиферативной активности, биосинтезе белков и их секреции. Интерлейкин-2 1 ИЛ—2 ) выполняет важную защитную функцию, стимулируя пролиферацию Т-лимфоцитов, в том числе "хелперных", "цитотоксических" и "супрессорных" лимфоцитов. Наряду с этим все новые данные свидетельствуют о том, что действие ИЛ-2 не сводится к простому сти-

мулированию пролиферации Т-лимфоцитов, а носит более сложный полифункциональный характер, стимулируя, например, активацию природных киллерных клеток и так называемых лимфокин-активированных киллерных клеток (LAK). Анализ кДНК ИЛ-2 (Tanaguchl et al, 1983) свидетельствует о том, что ИЛ-2, подобно другим секретируем белкам млекопитающих, содержит N-концевую последовательность из 20 гидрофобных аминокислотных остатков, непосредственно следующих за инициаторным метионином. Эта лидерная последовательность ответственна за трансмембранный перенос и отщепляется от молекулы при секреции. Зрелая молекула с мол. массой 15,4 кДа состоит из 133 аминокислотных остатков. Остаток Thr в третьем положении гликози-лирован, однако значение этой модификации не ясно.

В последние годы предпринимаются попытки использовать ИЛ-2 человека как лекарственный препарат при терапии раковых заболеваний (Rosenberg et al., 1985). В связи с этим представлялось целесообразным исследовать возможность экспрессии гена ИЛ-2 человека в перевиваемых клетках и, в случае положительного результата, получить клоны клеток, стабильно продуцирующих ИЛ-2 человека.

Для решения этой задачи кДНК гена предшественника ИЛ-2 была клонирована по Hlndill участку полилинкера pPS-3-neo, после чего по описанной выше схеме получены инфекционные рекомбинантные ретровирусные частицы, использованные для переноса гена в составе провируса в геном клеток-мишеней. При заражении фибробластов крысы Rati были получены клоны клеток Ratl-neo-IL-2, устойчивые к G-416 и стабильно экспрессирующие секретируемый ИЛ-2 человека. Содержание биологически активного ИЛ-2 определяли по способности индуцировать пролиферацию перевиваемых ИЛ-2-зависимых Т-клеток

мыши линии CTLI-2, которую оценивали по включению Н-тимидина. В качестве контроля использовали кондиционированную среду исходны> клеток Rati, выращенных в тех же условиях.

Клетки выращивали на среде DMEM в стандартных условиях и через определенные промежутки времени отбирали аликвоты для опреде-

«5

ления активности ИЛ-2. Рассевали (3-51x10 клеток на 500 мл флакон Повицкой. Среднее время удвоения - 36 часов, культура достигала плотного монослоя на 4 день после рассева. Результаты определения содержания ИЛ-2 в культуральной среде одного из клонов представлены в таблице 2.

Таблица 2

Динамика продукции ИЛ-2 человека клетками клона

Eatl-neo-IL-2-B4.

Время после рассева, сутки

Клетки 0,5 1 2 3 4 5 6

Ratl-neo-IL-2-B4

- В4 (опыт) 5 20 60 100 140 170 180

Rati

(контроль) 5 5 5 5 5 5 5

Концентрация ИЛ-2 человека представлена в единицах BRMP на ыл культуральной среды.

Как видно из таблицы 2, максимальная продукция ИЛ-2 достигается на пятые сутки культивирования и составляет 170-160 ед BRMP/мл культуральной среды. Для сравнения: при получении ИЛ-2 в культуре лимфоцитов от 9 здоровых доноров при стимуляции клеток в оптимальном режиме супериндукции продукция составляла в среднем 47-46 BRMP ед/мл (Yoltenok, N. et al., 1984.!. Кроме того, для осуществления супериндукции в среду вносился ингибитор трансляции циклогексимид, который затем необходимо удалять из среды, тогда как кондиционированная среда Ratl-neo-IL-2-B4 может быть прямо использована как источник ИЛ-2 для выращивания ИЛ-2-зависимых клеток, (см., например,Сащенко и соавт., 1990). Сопоставимая продукция ИЛ-2 описана для культивируемых клеток Jurkat Т- лимфомы человека при их стимулировании форбол-миристат-ацетатом, который так же необходимо удалять. Следует отметить, что продукция ИЛ-2 клетками Jurkat непостоянна и резко падает уже через 3 недели после клонирования, т.е. для поддержания линии клеток- продуцентов требуется постоянное достаточно трудоемкое субклонирование (Robb, 1985). Напротив,клетки Rat-neo-IL-2-B4 стабильно экспрес-сируют секретируемый биологически активный ИЛ-2 человека при культивировании более полугода.

II.3. Экспрессия генов человека, содержащих интроны, в перевиваемых клетках.

В ходе переноса генов с интронами, осуществляемого с помощью инфекционных ретровирусных векторов, в результате сплайсинга рекомбинантной вирусной РНК образуются "минигены" с меньшим числом интронов, чем у исходно клонированных генов, или же полностью лишенные их. Известно несколько примеров успешного проведения подобной операции по освобождению от интронов, об«ектами которой служили фрагменты геномной ДНК вирусов полиомы (Donoghue et al., 1984), SY40 (Kriegler et al. 1934), ДНК генов а-глобина IShlraotohno and Temin , 19Ö2), lnt-1 (Brown, et al., 1986) и ß-глобина (Dzerzlak et al., 1988), содержащие от 1 до 3 интронов. Известно, что многие гены содержат большее число интронов, однако результатов по переносу и экспрессии таких генов с использованием ретровирусных векторов в литературе нами не обнаружено.

С целью исследования возможности переноса и экспрессии генов, содержащих большое, число интронов, нами проведено клонирование в pPS-3-neo гибридного (кДНК/геном) гена урокиназы человека, в котором сохранены 7 интронов из 10, присутствующих в природном хромосомном гене, а затем с помощью упаковывающих клеток ¥-2 получены рекомбинантные вирусные частицы. Для сравнения идентичные манипуляции проведены с кДНК гена урокиназы человека. Гибридный ген и кДНК урокиназы были получены в лаборатории Р.Ш.Биби-лашвили во Всесоюзном кардиологическом научном центре АМН СССР.

Урокиназа (КФЗ.4.21.31) является активатором плазминогена (малоспецифической сериновой протеаэы) и играет ключевую роль в регуляции протеолиза внеклеточного матрикса. (Blasl et al., 1987). Биосинтез урокиназы человека (УЧ) осуществляется на мРНК величиной в 2344 н., из которых 119 н. приходится на 5'- нетранслируе-мую и 923 н.—на 3'- концевую нетранслируемые области. После отщепления сигнального пептида величиной в 20 аминокислотных остатков и N-гликозилирования УЧ в проферментной форме секретируется во внеклеточную среду, где подвергается процессингу с образованием сначала высокомолекулярной (53кДА), а затем низкомолекулярной (34кДа) активных форм. Природный ген УЧ величиной в 6,4 т.п.н. содержит 11 экзонов.

Гибридный ген УЧ, который мы клонировали в полилинкере pPS-

3-пео, содержит 5'-концевой фрагмент кДНК, соответствующий первым

4-м экзонам природного гена, соединенный с фрагментом природного гена с 7-ю зкзонами и 7-ю интронами, начиная с пятого и четвертого, соответственно. Величина кДНК гена УЧ равна 1563 п.н., а гибридного гена - 4755 п.н. Рекомбинантный вектор, сконструированный на основе рРЭ-З-пео и содержащий гибридный ген УЧ, получил название рРЗ-114, а кДНК гена УЧ - рРБ-и5 (рис.10).

I-IV V VI VII VIII IX X XI

Рис.10. Схематическое изображение рекомбинантного вектора pPS-U4, римскими цифрами обозначены экзоны гибридного гена УЧ (а); кДНК гена УЧ, входящая в состав pPS-U5 (б).

Оба вектора с помощэю Са-фосфатной трансфекции были внесены в упаковывающие клетки ¥-2, которые после соответствующей селекции были использованы как источник рекомбинантных вирусных частиц для заражения клеток Rati и Balb/c. Клетки почти всех клонов, полученных на основе Rati, секретируют, примерно, одинаковое количество УЧ (5-15 ед/мл), независимо от того, какой рекомбинантный вектор был использован для их заражения, исходно содержащий кДНК УЧ или гибридный ген. В случае заражения клеток Balb/c уровень продукции выше (35-70 ед/мл). Исходные клетки Rati и Balb/c

или же клетки, зараженные рРБ-З-пео без вставки, не проявляют активности УЧ. На рис.11 показаны результаты ЭФ разделения в ПААГ материала из аликвот культуральной среды некоторых клонов-продуцентов с последующим иммуноблотингом или энзимографией.

1 2 34 5 6 7 М I?

Рис.11. Иммуноблотинг (а) и энзимограмма (б) белков, секретируе-мых в культуральную среду клетками: 1 - Rati, зараженными рРЗ-З-пео; 2 - Rati, зараженными pPS-U4, клон 1; 3 - Balb/c, зараженными pPS-3-neo; 4 - Balb/c, зараженными pPS-U5, клон F5; 5-7 -Balb/c, зараженными pPS-U5, клон D9. Среда содержала туникамицин в концентрации 0,5 и 5 мкг/мл - 6-ая и 7-ая дорожки, соответственно. Без туникамицина - 5-ая дорожка. M - высокомолекулярная (53 кДа) и низкомолекулярная (32 кДк) формы урокиназы. R - реком-бинантная урокиназа, образуемая в клетках Б. coll.

Видно, что подвижность основной полосы, выявляемой антителами против УЧ, совпадает с подвижностью высокомолекулярной формы природной УЧ (53 кДа). Энзимографический анализ подтверждает правильность отождествления наблюдаемого по активности и по связыванию с антителами материала. Обработка клеток ингибитором N-гликозилирования туникамицином приводит к изменению электрофо-ретической подвижности, которая возрастает и становится близкой подвижности рекомбинантнои негликозилированной УЧ с мол. массой

45 кДа, образующейся в клетках E.coll. В целом, полученные данные свидетельствуют о том, что клетки Rati и Balb/c, зараженные ре-комбинантным ретровирусным вектором, синтезируют и секретируют в культуральную среду высокомолекулярную, гликоэилированную и функционально активную урокиназу.

Количество фрагментов, гибридизуюшихся со специфической

•»2

Р-УЧ пробой, которые образуются при гидролизе геномной ДНК клеток-продуцентов УЧ рестриктазой BaœHl.вносящей один разрыв в интегрированный ген УЧ, а второй - в участки клеточной ДНК, фланкирующие рекомбинантный провирус, свидетельствует, что при заражении в геном клетки встраивается одна, реже две копии провируса (Рис.12 ).

а 5

1Z3M 1 2 3 4 5 6 M

-11200

• -11200

- 4445

• -4445

- >Ш - 1267

Рис.12. Определение числа копия рекомбинантного провируса, содержащих ген УЧ, интегрированных в геном зараженных клеток методом Саузерна. Гидролиз геномной ДНК осуществляли рестриктазой BamHI. а. ДНК клеток Rati, зараженных 1 - рекомбинантными частицами pPS- 3-пео; 2 - pPS- U5, (клон 12); 3 - pPS-U4, (клон 1). б. 1 - ДНК незараженных клеток Balb/c; 2 - ДНК клеток Balb/c, зараженных pPS-3-neo; 3-6 - зараженных pPS-SU5, клоны D3, D9, F3, F5, соответственно. М - маркерные фрагменты, приведена величина в т.п.н.

Определение величины гена УЧ в составе рекомбинантного про-вируса, интегрированного в геном клеток Rati, зараженных вирусными частицами, полученными на основе вектора pPS-U4, свидетельствует об отсутствии интронов в гене УЧ у всех 5 исследованных в этом отношении клонов клеток (рис.13). Таким образом, установлено, что в ходе переноса гибридного гена УЧ в составе вектора pPS-3-пео, одновременно происходит потеря всех 7 интронов, исходно присутствовавших в гене. Величина процессированного в ходе ретрови-русного переноса гена полностью совпадает с размером изначальной кДНК гена УЧ.

1 2 3 4 5 6 7 8

-4А45

-1267

Рис.13. Определение величины генов УЧ, интегрированных в геном клеток Rati. Совместный гидролиз клеточной ДНК проводили рестрик-ционными эндонуклеазаии BamHI и Hlndlll. 1 - ДНК исходных клеток Rati; 2 - ДНК клеток зараженных pPS-3-neo; 3 - зараженных pPS-U5, клон 12; 4-8 - зараженных pPS-U4, клоны 1-5, соответственно. Стрелками показано положение маркерных фрагментов, приведена величина в т.п.н.

Полное освобождение от всех интронов в ходе инфекционного переноса с помощью pFS-neo не является особенностью системы, универсальной для всех генов. Так, в ходе работы по получению на основе фибробластов Rati клеток, продуцирующих фактор некроза опухолей бета (лимфотоксин) человека, в векторе pPS-1-neo была клонирована модифицированная копия гена TNF-3, содержащая все три природных интрона (рис.14). Так же, как для УЧ, были получены

IВ II III IV E

sp t SV40 pPS-3-neo-LT

PL: SalI.HlndIII.SalI. BamHI.EcoRI

Рис.14. Схематическое изображение ДНК рекомбинантного вектора pPS-neo-LT, содержащего ген лимфотоксина человека. Римскими цифрами обозначении экзоны. Зачерненная область в III и IY экзонах -область гена, кодирующая зрелый лимфотоксин. Части II и III экзо-на, указанные стрелками, - область гена,кодирующая лидерную последовательность, отщепляемую при секреции лимфотоксина.

клоны клеток Rati, секретируюшие биологически активный лимфотоксин. Величина гена TNF-ß человека, интегрированного в геном Rati в составе рекомбинантного провируса, составляет не менее 1 т.п.н. (рис.15), что существенно больше величины гена, полностью лишенного интронов (0,6 т.п.н.). Вероятно, что при ретровирусном переносе один из интронов сохраняется. В то же время наличие полноценного лимфотоксина, секретируемого зараженными клетками, указывает на правильное вырезание оставшегося интрона при созревании рекомбинантнои РНК в этих клетках.

В ряде случаев ретровирусный перенос генов с интронами осуществляется с сохранением всех присутствующих в природном гене интронов. Так, недавно опубликовано сообщение о том, что при переносе полного гена инсулина величиной в 2,9 т.п.н. потери интронов не происходит (Perkins et al.,1969).

12 3 4 5

—1100 н.п.

Рис.15. Анализ интегрированной последовательности гена лимфоток-сина человека в индивидуальных клонах клеток Rati, зараженных ре-комбинантными частицами pPS-neo-LT, методом блот гибридизации по Саузерну после обработки ДНК рестриктазой BamHl. 1 - клон С4; 2 -клон С8; 3 - клон СЮ; 4 - клон С2; 5 - исходные клетки Rati. Стрелка указывает на интегрированный ген лимфотоксина.

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют, что ретровирусные векторы семейства pPS-neo обеспечивают эффективный инфекционный перенос и экспресссию генов различной природы в клетках млекопитающих. Наряду с экспрессией секретируемых белков, молекулы которых состоят из одной субЗединицы, нами также осуществлена экспрессия сложного пептидного гормона человека (хо-рионического гонадотропина), молекула которого состоит из 2-х различных суб&единиц, кодируемых разными генами, а также несекре-тируемых белков, имеющих внутриклеточную или мембранную локализацию (гены р53 и neo). Если в случае генов р53 и neo соответствующие ДНК клонированы в полилинкере под регуляторными элементами (LTR) вектора, то для переноса и экспрессии хорионического гонадотропина кДНК гена одной из суб&единиц клонировали в полилинкере, а другой - по уникальному участку узнавания рестриктазы Clal (рис.16). Для осуществления экспрессии этой субЬединицы ее кДНК

была встроена под сильный промотор СМУ таким образом, чтобы транскрипция обоих генов осуществлялась в одном направлении. Методом иммуноферментного анализа с использованием моноклональных антител, специфичных к двум разным суб&единицам хорионического гона-дотропина, показана секреция гетеродимеров гормона, состоящих из субЬединиц аир. Уровень содержания гормона в культуральной среде клеток Ва1Ь/с, зараженных рекомбинангными вирионами, несущими гены обеих суб&единиц хорионического гонадотропина, в стандартных условиях культивирования составляет 0,4-0,6 мкг/мл.

Рис.16. Схематическое изображение рекомбинантного ретровирусного вектора pPS-neo-hCG, направляющего образова- ние хорионического гонадотропного гормона человека в зараженных клетках. Стрелки указывают направление транскрипции.

Наличие в векторах pPS-neo участка orí SV40 позволяет осуществлять амплификацию рекомбинантноя векторной ДНК, внесенной в клетки, экспрессируюшие Т-антиген SV40. В результате этого возрастает доза гена и, как следствие,-уровень синтеза белка, кодируемого этим геном. В нашей работе мы использовали клетки обезьяны C0S1, в которых осуществляется синтез Т-антигена. При введении в эти клетки рекомбинантных Еекторов, содержащих различные гены

PrCMV

pPS-3-hCG

(например, ген гормона роста или Х-область вируса лейкоза крупного рогатого скота), соответствующие белки могут быть обнаружены уже через 3 дня после трансфекции. Этот прием может быть рекомендован для опытов, связанных с экспрессией внесенных генов и не требующих получения отдельных клонов.

III. Идентификация белка - продукта нового гена человека son и биологический эффект ори введении измененной формы этого гена в клетки илекопитаювдх.

Исследования, проведенные в лаборатории Л.Киселева в Институте молекулярной биологии им.Б.А.Энгельгардта АН СССР, показали, что геномы позвоночных, включая человека, содержат гены, е различной степени имеющие структурное сходство с геном mos (см. Kls-selev et al., 1985; Швец и др., 1990). Из клонотеки кДНК печени человека выделен и частично секвенирован ранее не описанный ген son, содержащий небольшие участки гомологии с геном mos (Берди-чевский и др., 1988). Анализ нуклеотидной последовательности гена son указывает на необычную структуру гипотетического продукта трансляции, его многодоменность, присутствие повторов и небольших участков гомологии с генами mos и туе. Показана также эволюционная консервативность гена son и его экспрессия в клетках многих типов различных млекопитающих (Бердичевский и др., 1987).

В нашей работе для идентификации белкового продукта гена son были использованы антитела I AT—S) к синтетическому пептиду, соответствующему последовательности 943-963 аминокислотных остатков белка son. Этот пептид был синтезирован д-ром Х.Иорваллом из Отдела белкового синтеза Центра биотехнологии Каролинского института. С помощью компьютерной программы было показано, что эта последовательность Asp-Asp-Asn-Val-Phe-Ser-Ser-Asn-Leu-Pro-Ser-Glu-Pro-Val-Asp-Ile-Ser-Thr-Ala-Met-Ser , возможно, расположена на поверхности белковой глобулы. Предполагается, что для таких пептидов велика вероятность обладать иммуногенными свойствами и связывать специфические иммуноглобулины в нативном состоянии.

С помощью AT-S мы совместно с И.Чумаковым попытались детектировать продукт гена son в лизатах культивируемых клеток человека. На рис.17 показан результат такого опыта с использованием меченных ( S1 метионином лизатов клеток перевиваемой линии 293

почки человека, трансформированных аденовирусом типа 5. Видно, что в данных клетках присутствует белок с кажущейся мол. массой 92 кДа, специфически реагирующий с AT-S. В качестве контроля мы использовали иммунную сыворотку после блокирования пептидом 943963, а также преиммунную сыворотку того же животного. Сходный белок мы наблюдали в первичных фибробластах человека, а также в перевиваемых клетках крысы Rat2 (рис. 17). Для всех этих клеток характерна активная транскрипция гена son.

Рис.17. Радиоавтографическая детекция балков, осажденных различными сыворотками кролика из меченных 3 лизатов клеток после фракционирования электрофорезом в ПААГ в денатурирующих условиях: 1,4,5 - преципитация антисывороткой против пептида 943-963; 2, 6 - преципитация иммунной сывороткой, блокированной пептидом 943-963; 3 - преципитация преиммунной сывороткой. 1-3 - клетки линии 293 человека; 4 - клетки Иа12, трансфицированные ДНК рРБ-З-пео(клон ГМ-г); 5,6 - клетки Яа.Х2, трансфицированные ДНК рРБ-зоп (клон ИЗ-4).

Многие белки с высоким содержанием пролина или основных аминокислотных остатков ведут себя аномально при электрофорезе в денатурирующих условиях, поэтому значение мол. массы 92 кДа белкового продукта гена son можно считать лишь приблизительной оценкой. Кроме того, в составе последовательности этого белка имеются 2 потенциальных участка N-гликозилирования и много участков для фосфорилирования сАМР-зависимой протеинкиназои. Эти модификации могут также сказываться на оценке молекулярной массы, определяемой по подвижности при электрофорезе.

12 3 4 5 6

200-

Таким образом, в клетках человека и животных присутствует белок, кодируемый геном son. Это открывает возможности для исследования роли продукта гена son в метаболизме клеток, его взаимодействия с другими генами и продуктами их экспрессии и выяснения функционального значения описанной выше гомологии с другими генами.

Для того, чтобы получить представление о возможной роли гена son в клетках млекопитающих, была создана конструкция на основе вектора pPS-3-neo, позволяющая экспрессировать 3'-концевую часть гена son, содержащую большую открытую рамку считывания, способную кодировать белок, состоящий из 889 аминокислотных остатков (рис.18). Pvull Nco[ NS6 sons №5хш Асе, т sacl sphl шпаш

II Г Г Г ! I II

I I

PsIlSphI

ИТ |

I/ Ecol

HindiII Ecolil

ЕсоШ

LTR

ATG

я во

LTR

pPS-son

Рис.18. Схематическое изображение ретровирусного вектора pPS-son, содержащего 3'-концевой участок кДНК гена son.

Мы воспользовались тем обстоятельством, что последовательности вокруг триплета, кодирующего Ме1-375, соответствуют консенсусу для эукариотического инициатора трансляции. Были получены и отобраны по росту на среде с С-416 трансфектанты, содержащие такую экспрессирующую конструкцию. Для трансфекции мы использовали перевиваемые фибробласты крысы Ва<-.2 и мыши Ва1Ь/с. Значительная доля первичных трансфектантов имела измененную морфологию. Клоны,

полученные на основе Rat2, содержали удлиненные крупные клетки, напоминающие первичные фибробласты крысы, (рис.19). Они занимали большую поверхность и содержали, примерно, в 1,5 раза больше белка, как было установлено путем измерения E260/E2S0 в клеточных лизатах, по сравнению с исходными клетками Rat2.

Рис. 19. Изменение морфологии клеток в культуре после трансфекции ДНК ретровирусного вектора рРЗ-гоп. 1 - клетки Rat2; 2 - клетки ЯаХ2, трансфицированные ДНК рРЗ-З-пео; 3 - клетки Яаг2. трансфицированные ДНК рРЗ-зоп; 4 - клетки Ва1Ь/с; 5 - клетки Ва1Ь/с трансфицированные ДНК рРЭ-З-пео; б - клетки Ва1Ь/с, трансфициро-

При иммунопреципитации белков из лизатов клеток этих клонов (например, RS-4, рис.17, дорожки 5 и 6) сывороткой с AT-S видно, что, наряду с белком p92son, они содержат новый белок с мол. массой 120 кДа. Б исходных клетках Rat2, а также клетках, полученных при трансфекции этих клеток вектором pPS-3-neo, не содержащим ген son (клон RN-3, рис. 17, дорожка 4), этот новый белок отсутствовал.

Клетки клонов, полученных на основе Balfc/c .также имели измененный вид и ростовые параметры. В отличие от исходных клеток они обладали граненым абрисом, внешне напоминая эпителиальные клетки (рис.19). Клетки Balb/с, которыми мы располагали, имели ограниченную способность к контактному торможению роста, со временем наползая друг на друга; напротив, клетки, содержащие конструкцию son, сохраняли регулярный монослой в течение длительного времени без дополнительного субклонирования. Можно считать, что после трансфекции клетки Ва1Ъ/с и Eat2 становятся более нормальными по морфологии, с более высокой степенью контактного торможения. Основываясь на этом наблюдении, мы попытались воспроизвести эффект при инфекции клеток NCC2 рекомбинантными вирусными частицами, содержащими описанную выше 3'-концевую область гена son (pPS-3- son). Клетки NCC2 получены в результате трансфекции геномной ДНК из метастазы смешанной аденокарциномы поджелудочной железы человека в фибробласты мыши линии NIH3T3. С помощью специфических зондов показано, что геном клеток NCC2 содержит активированный онкоген c-Ki-ras. Клетки NCC2 обладают свойствами, типичными для трансформированных клеток в условиях культивирования In vitro, и дают начало злокачественным опухолям при введении подкожно голым мышам. Нами получены предварительные данные, которые могут указывать на то, что заражение клеток NCC2 вирионами pPS-3-son, возможно, приводит к нормализации клеток: около Ь% зараженных и устойчивых к G-418 клеток представляли собой морфологические ревертанты (рис.20). Наблюдалось несколько морфологически различных типов этих клеток, некоторые из них, например, В2, не отличались от клеток NIH3T3, бывших исходными при получении линии NCC2. Клетки клона А1 обладают длинными дендрит-подобными отростками, но при этом хорошо растут в культуре.

Рис. 20. Изменение морфологии фибробластов мыши, трансформированных активированным онкогеном с-К1-газ человека, после заражения рекомбинантными частицами рГБ-воп. 1 - клетки ШНЗТЗ; 2 - клетки ИСС2, содержащие активированный онкоген с-К1-гаэ; 3-6 - клетки ИСС2, зараженные частицами рРЗ-зоп, клоны АЗ, В26 В1, А1, соответственно .

Таким образом, с помощью экспрессирующих вирусных конструкций получены указания о возможной биологической активности укороченного фрагмента гена son, выражающаяся в изменении морфологии и характера роста культивируемых фибробластов. Опыты по имплантации клеток линий NIH3T3, NCC2, В2 и А1 голым (бестимусным) мышам1

свидетельствуют о том, что, наряду с морфологическими изменениями, клетки, которым ввели зкспрессируюший вектор рРЭ-З-зоп, обладают измененным туморогенным статусом по сравнению с острозлокачественными клетками N002. Результаты этих опытов приведены в таблице 3.

Таблица 3

Опухолегенность клеток после введения голым мышам

_ Название I линии/клона I. Количество имплантированных клеток

I Т:Ы

I г З'Ю6 I 3 т 105 I зчо4 .....I .... I З'Ю3 ...I. ..... .......

Через 2 недели после имплантации

мнзтз 0:4 0:4 0:4 0: : 3

N002 4: :4 4:4 1:2 0: : 2

А1 0: :3 0:4 0:4 0: : 2

В2 0; :3 0:3 1:2 0: : 4

Через 4 недели после имплантации

ыхнзтз 0: : 4 0:4 0:4 0: : 3

N002 4: : 4 4:4 2:2 1: ; 2

А1 3: :3 0:4 0:4 0: : 2

В2 0: : 3 0:3 0:4 0: : 4

Через 2 месяца после имплантации

МНЗТЗ 1: : 4 1:4 0:4 0: : 3

N002 4: : 4 4:4 2:2 1: : 2

А1 3: : 3 3:4 0:4 0: : 2

В2 0: : 3 0:3 0:4 0: : 4

Примечание: N - общее количество мышей, которым вводили клетки, Т - количество мышей, у которых развились опухоли диаметром более 5 мм.

Опыш на голых мышах были проведены совместно с д-ром Е.Рамквистом из Отдела биологии опухолей Каролинского института (Стокгольм, Швеция).

Следует отметить, что клетки клона В2 не давали начало опухолям более 5 мм даже через 4 месяца после введения 3-х миллионов клеток. Пользуясь стандартными критериями оценки туморогенности клеток, можно дать следующую оценку использованных линия: 1 ) NIH3T3 - не^туморогенны, 2) NCC2 - высокотуморогенны"""*, 3) Al -слаботуморогенны*, 4) В2 - не- туморогенны, где *""* обозначают

клетки линий, дающих опухоли величиной 5 мм в диаметре за 4 неде-

4 •

ли при введении подкожно З'Ю клеток, а - клетки, дающие опус

холи диаметром 5 мм за 4 недели при введении З'Ю клеток. При

отсутствии видимых опухолей через 4 недели после введения 3 40 клеток они считаются нетуморогенными.

IV. Исследование роли белка р53 в пролиферации нормальных и трансформированных клеток с помощью ретровирусного вектора, экспрессиру«omero антисмысловую РНК р53-

За последние годы накопились данные, указывающие на важную роль ядерного белка р53 в процессах регуляции деления клеток.(см. обзоры Jenkins and Sturzbecher, 1988., Lane and Benchimol, 1990). Уровень этого белка в нормальных клетках низок, однако он заметно повышается под действием различных стимулирующих деление факторов. При микроин&екции моноклональных антител к р53 в клетки происходит подавление их способности входить в S-фазу клеточного цикла в ответ на стимуляцию сывороткой (В работе были использованы антитела, взаимодействующие как с р53 дикого типа,. так и мутантным р53) (Mercer et al., 1984). Существенным ограничением этого подхода является невозможность проведения длительных наблюдений за клетками, в которых содержание р53 снижено. В своей работе для подавления экспрессии белка р53 мы использовали антисмысловые РНК, инактивирующие комплементарные им эндогенные мРНК р53 in vivo. Для этого нами был сконструирован ретровирусный вектор, экспрессирующий 5'-концевую область мРНК р53 мыши в антисмысловой ориентации. Для повышения концентрации антисмысловых последовательностей в конструкции ввели тандемно повторяющийся £coRl-Xbal фрагмент, направляющий синтез антисмысловых РНК. Фрагмент соответствовал участку мРНК размером в 140 нуклеотидов, из которых 97 нуклеотидов приходится на 5'-концевую нетранслируе-

мую, а 40 - на белок-кодирующую область, и был повторен 8 раз в составе анти- смыслового сегмента, встроенного под промотор LTR вектора pPS-neo (рис. 21).

и_

tÉHHHK] р53 cDNA 1

ЕЯ PXR

pPS-(XR)g

\ \атрг рцС ¿} Р1,: Sall.HlncflH.SalI.

/ ВатШ.ЕсоШ

Рис.21. Схематическое изображение ретровирусного вектора рРЗ(ХН)д, содержащего р53 антисмысловоя фрагмент. Зачернена

кодирующая часть гена р53.

ДНК такого рекомбинантного вектора рРЭ-(Хй )д вводили в упаковывающие клетки ¥-2 и собирали вирионы для заражения через несколько дней после трансфекции (временная, или транзиторная экспрессия), либо после селекции на С-418 клеток, содержащих стабильно интегрированную ДНК вектора. В качестве контроля использовали вирионы без антисмыслового сегмента (вирионы рРБ-пео). Для заражения использовали клетки-мишени трех линии: условно нормальные фибробласты мыши ШНЗТЗ, клетки индуцированной метилхолантре-ном саркомы мышей СМ34 с повышенным содержанием р53 и фибробласты мыши ЗУТ2, трансформированные ЗУ40. После селекции зараженных клеток на С-418 проводили подсчет числа колоний и определяли их средний размер (количество клеток в колонии). Результаты приведены в таблице 4.

Таблица 4.

Число и размер колония клеток, устойчивых к генетицину после заражения вирионами рРЭМХЮд или рРБ-пео.

Тип Число колония после

вирионов заражения 1мл среды,

содержащей вирионы

Среднее число клеток в колониях

рРБ-пео рРЗ-(ХЮв

шнзтз

1 МО5 5Ч03

СМЭ4 ЭУТ2 Ы1НЗТЗ СМБ4 ЭУТ2

0,8-Ю5 2.8'105 412-62 442±46 822;96 2'104 2,6-105 28^15 220-95 840^4

Мы обнаружили, что возможность получения клонов клеток, зараженных рекомбинантными вирионами рРЗ-(ХЙ)& и устойчивых к й-418, зависела от того, в каких условиях осуществляется продукция вируса. При заражении клеток-мишеней вирионами, продуцируемыми клетками ¥-2 в ходе временной экспрессии, клоны, устойчивые к С-418, удалось получить только для клеток линии ЗУТ2, тогда как при заражении вирионами рРЭНХЮд, продуцируемыми клетками У-2, прошедшими селекцию на антибиотике, устойчивые клоны были получены и для клеток линий ИШЗТЗ и СМЭ4. Как показано в таблице 4, количество и величина колоний клеток этих двух линий, зараженных рРЭ-(Хй)д, значительно меньше, чем у клеток линии ЭУТ2, зараженных такими же вирионами, или же у этих же клеток (ШНЗТЗ и СМ34), но зараженных контрольными рекомбинантными вирионами рРЭ-пео, не содержащими антисмыслового сегмента. Особенно ярко эти различия проявляются у клеток линии Ы1НЗТЗ. Только меньшая часть клонов, полученных при заражении рРЭНХШд, сохраняют способность поддерживаться в культуре, тогда как большая часть вскоре после заражения переставала делиться и вслед за этим погибала. Клетки клонов МНЗТЗ и СМЭ4, зараженные рРЭ-(ХИ)а и сохранившие способность к пассированию в культуре, характеризуются замедленным ростом с периодом делен ия более 72 часов. Скорость роста клеток ЗУТ2, зараженных рРБ—(ХИ )д, не отличается заметно от таковой у контрольных клеток.

На следующем этапе мы исследовали способность клеток ШНЗТЗ, содержащих антисмысловые последовательности р53 и характеризующихся замедленным ростом, вступать в клеточный рост из стадии покоя (фаза ). Для этого клетки сначала переводили в покоящееся состояние, культивируя в течение 72 часов в ростовой среде с низким содержанием сыворотки, после чего стимулировали пролиферацию,

помещая клетки в среду с сывороткой и Н-тимидином. Через сутки клетки отмывали, фиксировали и подвергали радиоавтографии. У

ШНЗТЗ, зараженных рРЗ-пео, добавление сыворотки стимулировало

включение Н-тимидина в ДНК у 30-40Й клеток, тогда как в случае ШНЗТЗ, зараженных рРЗ-(ХН)„ и содержащих антисмысловые последовательности р53, включение Н-тимидина отмечено лишь у 5% клеток при стимулировании 20& сывороткой (рис.22). Очевидно, что подавление экспрессии р53 антисмысловой РНК препятствует переходу покоящихся клеток в митоз. Это наблюдение указывает на то, что р53, возможно, является фактором компетенции пролиферации клеток при регуляции -синтеза клеточной ДНК. Данные других авторов также свидетельствуют в пользу этого предположения (Касгтагек еХ. а1., 1986).

0,1%ЭС 10%ЭС ?.0%ЭС

Рис.22. Радиоавтография клеток ШНЗТЗ, зараженных частицами рРБ-3-пео (а, б, в) и клона А1 клеток ШНЗТЗ, зараженных частицами рРБ(ХН)в (г, д, е)г инкубированных с 0,5%-ной бычьей сывороткой

(а, г), 10%-ной (б, д) и 20%-ной (в, е) эмбриональной сывороткой теленка.

Мы проследили также уровень экспрессии белка р53 в клонах СМЭ4 и ШНЗТЗ клеток, содержащих антисмысловые конструкты. На рис.24 видно, что в этих клонах произошло заметное, но неодинако-

вое снижение синтеза белка р53 по сравнению с неэараженными клетками. Из исследованных в этом отношении клонов клеток СМ34 у клона А2 отмечена наибольшая экспрессия антисмысловых транскриптов (рис.23) и наиболее низкий уровень синтеза белка р53 (рис.24 а, дорожка 4). Низкий уровень синтеза р53 отмечен также в клоне А1 клеток ЬПНЗТЗ (рис.24 б), зараженных "антисмысловым" вирусом и характеризующихся медленным ростом (период удвоения >72 ч).

а.

Рис.23. Анализ транскрипции антисмыслового повтора в клетках СМ34. Слот-блот гибридизация тотальной РНК: 1 - из контрольных клеток СМЭ4; 2 и 3 - клеток СМ54, зараженных рРЭ(Хй )8, клоны А2 и

, соответственно, с меченной РНК, выявляющей антисмысловые транскрипы.

I г з

?i г

р 53

— 69 К

р53

— 45 К

Рис.24. Иммунопреципитация меченных S экстрактов клеток CMS4 (а) и NIH3T3 (б), зараженных и не зараженных рекомбинантным вирусом, экспрессируюшим антисмысловые РНК р53. а: дорожки 2-5 -преципитация моноклональными антителами , специфичными к белку р53; дорожка 1 - преципитация контрольной неиммунной сывороткой кролика. 1 и 2 - незараженные клетки CMS4; 3-5 - CMS4, зараженные pPS(XR)g, клоны Н2, А2 и ВЗ, соответственно, б: дорожки 2 и 3 -

преципитация моноклональными антителами к белку р53, дорожка 1 -преципитация контрольной неиммунной сывороткой кролика, 1 и 2 -NIH3T3, 3 - NIH3T3, зараженные pPS(XR)8 клон А1.

Анализ методом Саузерна антисмысловых сегментов в составе интегрированных рекомбинантных векторов в нескольких клонах клеток ШНЗТЗ и СМ34, зараженных "антисмысловым" вирусом, свидетельствует о том, что у всех исследованных в этом отношении клонов величина антисыыслового сегмента меньше, чем у исходно сконструированного тандема, состоящего из 8-ми повторяющихся фрагментов в 140 п.н.(рис .25).

1 23456789

Ш» "3,0

« -1,3

4 3 2

-0,3 (т.п.н.)

Рис.25. Состояние интегрированных антисмысловых последовательностей р53 в клетках клонов ШНЗТЗ и СМ34, полученных в результате заражения рекомбинантныыи вирионами. Клеточная ДНК (1 - 8) обработана рестриктазами РзЫ и ВапШ. 1- ДНК ШНЗТЗ, зараженных рРБ-пео; 2 - СМ34, зараженных рРБ-пео; 3 и 4 - ШНЗТЗ, зараженных рРБ!ХЛ)ц, клоны АЗ и А5, соответственно; 5-8 - СМЭ4, зараженных

рРЭ(ХЕклоны ВЗ, , Н2 и С5, соответственно. 9 - ДНК плазмиды

рЗР64(ХЕ)8, обработанной рестриктазами Н1п«1111 и ВашН1 ( полный

гидролиз), а также ЕссЕ1 (частичный гидролиз). Цифры 2-8 справа по оси ординат указывают положение и число олигомерных повторов 140,о п.н. антисмыслового сегмента. Гибридизация с меченной ""Р плазмидоя рЗР64(ХН)д.

Обнаружены заметные перестройки,сопровождающиеся потерей значительной части повторяющихся копий. Некоторые клоны зараженных клеток-мшпенея содержали одинаковая по величине укороченный антисмысловоя сегмент, что может свидетельствовать о том, что отмеченные перестройки, вероятно, происходят в упаковывающих клет-

ках ¥-2, трансфицированных ДНК рРЭ- (ХИ »а , в ходе селекции на в-418. При временной экспрессии упаковывающие клетки, скорее всего, продуцируют вирионы с неделетированным антисмысловым сегментом, включающим все 8 исходно клонированных фрагментов. Экспрессируе-мая такими рекомбинантными провирусами антисмысловая РНК настолько сильно подавляет пролиферацию зараженных Ы1НЗТЗ и СМ34 клеток, что их невозможно поддерживать как стабильно перевиваемую культуру. Можно предположить, что антисмысловая РНК, содержащая все 8 антисмысловых повторов, полностью или почти полностью предотвращает матричный синтез р53. В конечном счете это и приводит к остановке роста клеток. Однако в аналогичных условиях заражения рост клеток ЭУТ2 практически не отличался от роста незараженных клеток или клеток, зараженных контрольными вирионами рРБ-пео. Видимо, Т-антиген ЭУ40 также может выполнять функцию р53, необходимую для пролиферации клеток. Наши выводы о роли белка р53 в клеточном росте были подтверждены в работах других авторов (31ю&а1 еЬ а1., 1987).

V. Исследование возможности локально направленного воздействия на определенные ткани организма с помовыо клеток, продуцмруюидах биологически активный биорегулятор белковой природы.

Основой развития генной терапии является создание клеток, продуцирующих определенные полноценные белки, отсутствие которых в организме приводит к заболеванию. Последующее введение таких клеток-продуцентов больному должно восполнить отсутствующий в организме белок и, в идеальном случае, - привести к выздоровлению. В настоящее время широко обсуждаются (см. Уегша, 1990) многие аспекты этой проблемы, однако на практике предпринимаются лишь первые шаги в этом направлении. Идея создания "искусственных желез" заключается в создании в организме локальных участков роста клеток, секретирующих нужный белок. В качестве модельной системы мы решили создать локальные группы клеток, продуцирующих интерлея-кин-2 (ИЛ-2) человека в опухолях, развившихся в голых мышах после

введения подкожно злокачественных клеток НеЬа. В основу подхода

что

легли наблюдения о том, при терапевтическом введении препаратов ИЛ-2 больным со злокачественными опухолями происходит торможение роста опухолей. Известно, что ИЛ-2 является достаточно нестабиль-

ным цитокином и быстро разрушается в тканях почек и печени при циркуляции в организме. Попытки же внутривенного введения большего количества ИЛ-2 приводят к нежелательным побочным эффектам. Положительный эффект был достигнут при введении низких нетоксичных доз в опухолевые ткани (Bubenik et al., 1963, Bubenik et al., 1966).

В нашей работе мы исследовали возможность создания локальных зон повышенной концентрации ИЛ-2 путем имплантации перевиваемых клеток, эффективно экспрессируюших секретируемый ИЛ-2 человека непосредственно в опухоли. Для достижения этой цели мы использовали полученные с помощью ретровирусного вектора клетки Ratl-neo-IL-2-B4, описанные выше. Эти активно экспрессируюшие секретируемый ИЛ-2 клетки вводили непосредственно в опухоли, развившиеся у бестимусных nu/nu мышей, которым ввели подкожно острозлокачественные клетки цервикальной карциномы человека HeLa. Как показано

на рис.26 а, введение 340 клеток fiatl-IL-2-B4 в опухоли HeLa диаметром 0,5 см, развившиеся у 8-недельных мышей, приводит к существенному подавлению роста опухолей, тогда как при введении в опухоли такого же количества исходных клеток fiatl заметного торможения роста опухолей не было отмечено.

Эффект подавления развития опухолей воспроизводится при такой постановке опыта, когда мышам вводили подкожно одновременно клетки HeLa и Ratl-neo-IL-2-B4. При введении смеси клеток HeLa и Rati наблюдался практически такой же рост опухолей, что при имплантации одних клеток HeLa (рис.26, б).

Очевидно., что подавление роста опухолей связано с имплантацией клеток, продуцирующих ИЛ-2. Анализ, проведенный в лаборатории И.Бубеника в Институте молекулярной генетики АН ЧСФР (Прага), показал, что ИЛ-2, продуцируемый fiatl-neo-IL-2-B4, активирует клетки-киллеры (LAK) пи/пи мышей, что делает их цитотоксичными в отношении как клеток HeLa, так и других злокачественных клеток человека и мышей ( Т24, HU609T, MCI 1, YACI! In vitro. Исследование гистологических срезов опухолей HeLa, в которые ввели клетки, секретирующие ИЛ-2, показало, что на 6-ой день после введения происходит накопление моноядерных лейкоцитов в строме опухолей, а на 21-ый день - некроз опухолевой ткани, сопровождающийся обширной инфильтрацией моноядерных лейкоцитов (рис.27).

Рис.26. Влияние клеток Ratl-neo-IL2 на рост опухолей у бестимус-ных мышей, которым ввели подкожно клетки HeLa. По оси х - дни после имплантации, покоси у - среднее значение плошади большего

сечения опухолей в cir . (а),*-опухоль ввели фосфатный

буфер, PBS; о-о в опухоль ввели клетки Rati; •-*в

опухоль ввели клетки Ratl-neo-IL2. В каждой группе было по 10 мышей. (б), *-* ввели только клетки HeLa; о-о

совместно ввели HeLa и Rati;*-• совместно ввели Hela

и Ratl-neo-IL2. В каждой группе было по 8 мышея.

Рис.27. Гистологический анализ опухолей HeLa, в которые ввели клетки Ratl-neo-IL-2. (Материал для гистологических срезов получали из опухолей, развивавшихся, как показано на рис.25 а). 1 -8-ой день, видно накопление ыоноядерных лейкоцитов в строме опухоли (исходное увеличение 16 х 3,2); 2 - 21-ый день, некроз опухолевой ткани (исходное увеличение 6,3 х 3.2).

Полученные результаты свидетельствует о том, что разработанный подход может быть применен как для локальной "терапии", так и создания в организме очагов секреции необходимых биорегуляторов на основе сингенных клеток, которым ввели In vitro нужный экс-

премирующийся ген. Клетки могут быть введены в биокапсулах подкожно или же в условиях постоянной перфузии крови.

VI. Использование сингенных клеток, продуцирующих белок-антиген для иммунизации животных.

Известно много способов иммунизации животных и индукции иммунного ответа. Некоторые из них удобны для получения иммунных спленоцитов, которые используются для слияния с миеломныыи клетками и получения гибридом. Мы исследовали возможность иммунизации мышея сингенными фисробластами, экспрессируюшими белок-антиген. Для этого с помощью рекомбинантного ретровирусного вектора, содержащего зкспрессируеыыя ген СТГ человека, получены фибробласты мыши линии ВаИз/с, эффективно секретируюшие СТГ человека (Ва1Ъ/с-ЗТН). Иммунизацию осуществляли 2 способами: А) путем однократного введения в селезенку Ва1Ь/с мыши 4' 1С? клеток Ва1Ь/с-ЗТН или Б) комбинации внутрибрюшинного введения 1"106 клеток Ва1Ь/с-ЗТН и проводимого через 3 недели второго введения

4*10 этих же клеток в селезенку. Спленоциты мышей, подвергшихся подобной процедуре, сливали с клетками миеломы РЗХбЗ-АеВ.бйЗ и проводили отбор гибридом, продуцирующих антитела, специфически связывающиеся с СТГ.

Разведение среды (-tOQo) Рис.26. Уровень антител в культуре спленоцитов мышей Balb/c, иммунизированных: а. - путем однократного введения в селезенку клеток Balb/c-STH, секретирующих СТГ; б. - путем последовательного введения клеток Balb/c-STH в брюшную полость и в селезенку с интервалом в 3 недели. Антигены, использованные в ELISE: - СТГ, -------БСА.

К(1

На рис. 28 представлены результаты анализа антител, секрети-руемых спленоцитами мышея, иммунизированных по схеме А или Б. Видно, что иммунный ответ существенно выше в случае последовательного введения Balb/c-STH, вначале внутрибрюшинно, а затем в селезенку.

Анализ изотипов иммуноглобулинов, секретируемых анти-СТГ-позитивными первичными неклонированными-гибридомами, полученными слиянием со спленоцитами мышей, иммунизированных разными способами (А и Б), показал, что при иммунизации по схеме А все 15 исследованных в этом отношении гибридом продуцируют анти-СТГ-иммуноглобулины IgM, тогда как в случае иммунизации по схеме Б из 23 анти-СТГ-позитивных гибридом 12 продуцировало IgM, 2 - IgGl, а 9 - IgM/IgG.

Используя СТГ человека, продуцируемый клетками E.coll, содержащими рекомбинантную плазмиду, направляющую синтез СТГ, методом иммуноблотинга показали, что антитела, продуцируемые гибридомами, полученными с помощью описанного подхода, эффективно связываются с СТГ (рис.29).

1 2 3 4 5 6

Рис.29. Связывание анти-СТГ моноклональных антител с рекомби-нантным СТГ при Вестерн-блотинге. Все дорожки содержали одинаковое количество СТГ. После перееноса на нитроцеллюлозу дорожки инкубировали по отдельности с: 1 - моноклональными антитела, ми, полученными традиционным способом (контроль); 2-5 - моноклональными антителами, продуцируемыми гибридомами,полученными после иммунизации по схеме Б: 2 - 1ёС1, 3 - 1&М, 4 - 1гИ, 5 - . 7 -1йМ моноклональными антителами, продуцируемыми гибридомой, полученной после иммунизации по схеме А.

Очевидно, что иммунизация с помощью сингенных клеток, экспрессирующих гены гетерологичных белков, может быть эффективным приемом для получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела против белков, недоступных в очищенной форме или же к неприродным белкам, полученным методами белковой инженерии.

выводы

1. Сконструировано семейство инфекционных ретровирусных векторов pPS-neo для переноса и экспрессии генов в клетках млекопитающих. Отличительными особенностями pPS-neo являются высокая эффективность переноса генов, возможность клонировать фрагменты ДНК до 7 т.п.н., наличие полилинкера, облегчающего встраивание генов в нужной ориентации. Показана возможность использования векторов pPS-neo как для постоянной экспрессии при интеграции рекомбинантного вектора в геном клеток-мишеней, так и для транзмторной экспрессии, когда наличие в составе векторов участка начала репликации ДНК SV40 fori) обеспечивает амплификацию ретровирусной ДНК в эписомном состоянии при внесении в клетки мишени, экспрессируюшие большой Т-антиген SV40. Использование упаковывающих клеток различных линий позволяет осуществлять с помощью векторов семейства pPS-neo перенос и экспрессию генов как в клетках человека, так и животных (амфотропный и экотропный перенос )

2. С помощью ретровирусных инфекционных векторов pPS-neo осуществлены перенос и экспрессия ряда генов человека и других млекопитающих в перевиваемых клетках различных линия. Установлено, что экспрессия белков, обычно осуществляемая специализированными клетками, эффективно происходит и в перевиваемых неспециализированных клетках ( фибробластах и эпителиальных клетках ), содержащих в составе интегрированного ретровирусного вектора pPS-neo гены этих белков. Существенно, что белки, в норме секретируемые специализированными клетками, сохраняют это свойство и при экспрессии в фибробластах и эпителиальных клетках, что существенно для развития генной терапии соматических клеток.

3. Ретровирусные векторы pPS-neo обеспечивают перенос и экспрессию генов, имеющих как экзон-интронную структуру, так и не содержащих интроны ( кДНК ). В ходе однократного ретровирусного переноса, включающего формирование рекомбинантных инфекционных вирусных частиц в упаковывающих клетках и последующее заражение клеток-мишеней, клонированные гены освобождаются от интронов.

4- Показано, что перенос и экспрессия фрагмента гена son ,

содержащего большую открытую рамку считывания, в культивируемые фибробласты мышея и крыс приводит к изменению их морфологии. Экспрессия этого же фрагмента гена son в острозлокачественных клетках мыши NCC-2, содержащих активированный онкоген c-Kl-ras человека, приводит к реверсии злокачественного статуса клеток. Реверсия выражается в изменении морфологии клеток в сторону нормальной и потере способности давать начало росту злокачественных опухолей при имплантации голым мышам.

5. Установлено, что ретровирусные векторы могут служить для внесения и синтеза антисмысловых РНК и таким образом являются эффективным инструментом выключения определенных генов в клетках млекопитающих. Усиление ингибирующего воздействия антисмысловых РНК может быть достигнуто с помощью ретровирусных векторов, кодирующих антисмысловые транскрипты, содержащие множественные короткие повторы (140н.), соответствующие нетранслируемой и началу транслируемой области гена. Показано, что ретровирусные конструкции имеют тенденцию к потере таких коротких повторов. Используя pPS-3-neo.экспрессирующия антисмысловые РНК р53, показали, что подавление синтеза эндогенного р53 приводит к подавлению пролиферации клеток NIH ЗТЗ и трансформированных (CMS 4) клеток, при этом покоящиеся клетки утрачивают способность входить в S-фазу и митоз. Клетки, трансформированные SV40, не чувствительны к действию антисмысловых р53 РНК. По-видимому, для пролиферации клеток необходима постоянная экспрессия р53, функции которого в клетках, трансформированных SV40, возможно, выполняет Т-антиген.

6. С помошью pPS-neo на основе перевиваемых клеток грызунов получены линии клеток, стабильно продуцирующие секретируемые биорегуляторы I гормоны, цитокины, ферменты) белковой природы (гормон роста, хорионический гонадотропин, интерлейкин-2, фактор некроза опухолей-в.урокиназа человека ). Показано, что посттрансляционные модификации осуществляются эффективно, что, в частности, обеспечивает нормальную секрецию и выход зрелого биологически активного белка в среду. Анализ, проведенный с помощью специфического ингибитора N-гликозилирования туникамицина, свидетельствует о нормальном гликозилировании экспрессируемых чужеродных белков человека в клетках грызунов.

7. Разработан новый подход иммунизации животных путем имплантации сингенных клеток, секретируюших чужеродный

белок-антиген. Использование спленоцитов иммунизированных таким образом животных ( мышей ) позволяет с высокой эффективностью получать гибридомы, продуцирующие моноклональные антитела к белку-антигену.

6. Показана возможность использования клеток, продуцирующих "терапевтические" белки, для локального направленного воздействия на ткани организма. Введение фибробластов, продуцирующих интерлейкин-2 человека, непосредственно в опухоли, развившиеся у голых мышей после имплантации злокачественных клеток HeLa, приводит к резкому торможению роста опухолей.

СПИСОК работ, опубликованных по теме диссертации

1. V.S.Prassolov, H.Sakamoto, S.Nlsïilmura, M.Terada & T.Suglmura Actlvation of c-Kl-ras gene In human pancreatlc cancer. Jpn.J.Cancer Res. (Gann), 1985,v.76,p.792-795.

2. В.С.Прасолов, А.Н.Шахов, P. JI. Турецкая, С.А.Недоспасов, П.М.Чумаков. Использование ретровирусных векторов для экспрессии интронированнных хромосомных генов: получение биологически активного фактора некроза опухолей - бета

(лимфотоксина) человека. Докл. АН СССР, 1988, Т.300, с.1498-1501 .

3. P.V.Chumakov s= V.S.Prassolov. р53 expression ls requlred for prolifération of normal cells. Abstr. of p53 International workshop. Paris, 1987, p.8.

4. М.Н.Иванова, П.М.Чумаков, К.Г.Скрябин, Р.А.Кукайн, В.С.Прасолов. Разработка систем для экспрессии Х-белков вируса бычьего лейкоза в культурах клеток. Докл. АН СССР. 1988, т.301, С. 1007-1009.

5. В. С.Прасолов, П.М.Рубцов, С.М.Серов, К.Г.Скрябин, П.М.Чумаков. Экспрессия гена гормона роста в клетках млекопитающих. Сб. "Гормон роста человека" Пущино, 1988, с.83-85.

6. В.С.Прасолов, П.М.Чумаков. Антисмысловая РНК р53 подавляет пролиферацию нормальных и трансформированных клеток. Молекуляр. биология. 1988, т.22, с. 1405-1410.

7. J.Bubenlk, N.N.Voltenok, J.Kleler, V.S.Prassolov, P.M.Chumakov, D.Bubenlkova, &T.Jandlova. Local administrât loi

of cells containing an lncerted IL-2 gene and producing IL-2 Inhibits growth of human tumors in nu/nu mice. Immunology Lett.1986. v.19, p.279-282.

8. V.S.Prassolov & P.M.Chumakov. p53 production is required for proliferation of normal and transformed cells. Abstr. book of 4th meeting on oncogenes. Frederick, 1988, p.123.

9. М.В.Резников, Р.Фидлер, П.М.Рубцов, К.Г.Скрябин,

П.М.Чумаков, В.С.Прасолов, А.А.Баев. Экспрессия гормона роста человека в перевиваемых фибробластах мыши. Молекуляр. биология. 1989. Т.23, с. 1692-1699.

10. В.С.Прасолов. Ретровирусные векторы - эффективная система переноса и экспрессии чужеродных генов в клетках млекопитающих. Молекуляр. биология. 1989. т23, с. 348-355 (Обзор).

11. I.M.Chumakov, F.B.Berdlchevsky, M.E.Belova, N.V.Sokolova, R.Ohlson, V.S.Prassolov. The expression of truncated form of new human gene son drastically changes the morphology of nontransformed cell lines and normollzes Kl-ras transformed NIH3T3 cells. Abstr.Book of 5th meeting on oncogenes. Frederick,1989, p.411.

12. F.B.Berdlchevsky, M.V.Reznikov, I.M.Chumakov & V.S.Prassolov. New oncogene related human gene son exerts the biological effect upon the transfer into mammalian cells. Abstr. book. Molecular basis of cell growth regulation. NATO/EEC course. Mallorca (Spain), 1939, B12.

13. A.V.Panyutich, V.S.Prassolov, E.A.Shydlovskaya, M.V.Reznikov, P.M.Chumakov & N.N.Voitenok. The use of syngeneic cells produslng human somatotropic hormone for immunization of mice and development of hybrldomas. Hybrydoma. 1990. v.9, p.401-406.

14. A.M.Tarakhovsky, M.V.Reznikov, T.A.Zaichuk, M.Y.Tugusheva, Z.A.Butenko s= V.S.Prassolov. Polymorphic changes of cell phenotype caused by elevated expression of an exogenous NEU proto-oncogene. Oncogene. 1990, v.5, p.405-410.

15. А.М.Тараховский, М.В.Резников, Т.А.Зайчук, Н.К.Сахарова З.А.Бутенко, В.С.Прасолов. Полиморфные изменения клеточного фенотипа в условиях гиперэкспресссии протоонкогсна neu. ДОКЛ. АН СССР. 1989, Т.Зое, с.217-221.

16. И.М.Чумаков, Ф.Б.Бердичевския, Н.В.Соколова, М.В.Резников,

IT.

18.

19.

20.

21.

22.

23.

В.С.Прасолов. Идентификация белка - продукта нового гена человека son и биологический эффект при введении измененной формы этого гена в клетки млекопитающих. Молекуляр. биология. 1991. т.25, с.155-163.

A.Я.Шевелев, Р.В.Кондратов, И.Н.Рыбалкин, В.С.Прасолов. Экспрессия урокиназы человека в перевиваемых клетках грызунов. Утрата интронов в ходе перенноса гена с помощью ретровирусного вектора. Молекуляр. биология. 1992. т.26, с.

P.M.Chumakov, V.S.Prassolov. р53 antl-sense ENA may inhibit proliferation of normal and transformed cells. In: "Macromolecules in the functioning cell" Proc. 6th symposium USSR - Italy. Moscow, Nauka. 1991, p. 229 - 244. П.М.Чумаков, В.С.Прасолов. Вектор pPS-l-neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих. Авт& свид. №1440036, 1988, Москва.

B.С.Прасолов, П.М.Рубцов, С.М.Серов, К.Г.Скрябин, П.М.Чумаков. Штамм культивируемых клеток крысы, используемый для получения гормона роста человека. Авт.свид. № 1454853, 1988, Москва.

A.В.Панютич, Е.А.Шидловская, Н.Н.Войтенок, В.С.Прасолов, П М.Чумаков, М.В.Резников. Способ получения гибридом, продуцирующих моноклональные антитела к рекомбинантным белкам. Заявка № 4800444/13 от 20 ноября 1989. Решение выдаче авторского свидетельства от 15 февраля 1990.

B.С.Прасолов, А.Н.Шахов, Р.Л.Турецкая, С.А.Недоспасов, П.М.Чумаков. Штамм культивируемых клеток Rat rattus L -продуцент фактора некроза опухолей - бета человека. Авт. свид. № 1592332, 1990, Москва.

Е.И.Фролова, И.С.Павлова, М.Л.Маркелов, П.М.Чумаков, В.С.Прасолов. Вектор pPS-4-neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих. Автю свид. №1622395, 1990, Москва. Е.И.Фролова, И.С.Павлова, М.Л.Маркелов, П.М.Чумаков, В.С.Прасолов. Вектор pPS-5-neo для введения и экспрессии генов в культивируемых соматических клетках млекопитающих. АВТ. свид. № 1622396, 1990, Москва.

Информация о работе

Прасолов, Владимир Сергеевич
доктора биологических наук
Москва, 1992
ВАК 03.00.03

Автореферат

Похожие работы