Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

СОЗДАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ КУЛЬТУР КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "СОЗДАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ КУЛЬТУР КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ"

ь-ътч

На правах рукописи

САВЧЕНКОВА ИРИНА ПЕТРОВНА

СОЗДАНИЕ МОДЕЛЬНЫХ СИСТЕМ КУЛЬТУР КЛЕТОК МЛЕКОПИТАЮЩИХ ДЛЯ РЕШЕНИЯ ПРОБЛЕМ БИОЛОГИИ И БИОТЕХНОЛОГИИ

03.00.23 — БИОТЕХНОЛОГИЯ

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

г. Дубровнцы, Московской области 1997

Диссертационная работа выполнена в лаборатории клеточкой инженерии отдела трансплантации эмбрионов Всероссийского НИИ животноводства, РАСХН

НАУЧИЬЩ КОНСУЛЬТАНТ:

Заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор биологических наук, профессор — Н, И. Сергеев.

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

Заслуженный деятель науки Российской Федерации, доктор биологических наук, профессор — Л. Пг Дьяконов, доктор биологических наук — В, Т, Какпаков, доктор биологических наук — Н. С Марзанов

Ведущее учреждение:

Всероссийский научно-исследовательский институт физиологии биохимии и питания сельскохозяйственных животных.

Защита диссертации состоится декабря 1997 года

в 10 часов на заседании диссертационного Совета Д.020,16,02.

при Всероссийском научно-исследовательском институте животноводства.

Адрес института: 142012. Московская обл.. Подольский р-н., п. Дуброенцы,

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ВИЖа.

Автореферат разослан « 1997 г.

Ученый секретарь диссертационного Совета, доктор сельскохозяйственных наук

Н, В. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Проблема создания новых клеточных систем остается актуальной для исследований по молекулярной биологии клетки, молекулярной биологии гена, эмбриологии, биологии развития, вирусологии, онкологии, иммунологии, генетике развития и генетической инженерии . Методы клеточной инженерии и использование эукариотической клетки в качестве модели стали необходимыми и рутинными для исследований, связанных с идентификацией и клонированием генов, которые ответственны за важные физиодого-биохимические характеристики организма, лежащие в основе роста, продуктивности, развития, устойчивости к заболеваниям животных и созданием банков генов сельскохозяйственных ЖИВОТНЫХ [Щелкунов С.Н., 1986; Эрнст Л. К., 1989; Глебов O.K., 19891. Актуальным является генетическая трансформация клеток в культуре, позволяющая смоделировать системы для изучения закономерностей экспрессии чужеродных генов, механизмов злокачественной трансформации, процессов репликации и рекомбинации ДНК и получить клетки-продуценты биологически активных белков , особенно для которых важны посттрансляционные модификации [Томилин К.В., 1986; Глебов O.K., 1989; Дьяконов Л.П., 1996]. В настоящее время особое значение приобретает использование целого ряда методов клеточной инженерии в биотехнологии воспроизводства и селекции крупного рогатого скота [Сергеев H.H., 1988; Завертяев Б.П., 1989]. В этом аспекте особенно важным является создание клеточных систем для понимания механизмов созревания, оплодотворения ооцитов и развития ранних эмбрионов крупного рогатого скота in vitro . Большую ценность представляет получение животных со стабильной интеграцией и экспрессией экзогенной ДНК в геноме (трансгенные животные) [Эрнст Л.К., 1989 ; Брэм Г. и др., 1993). В этой связи большое внимание привлекает культура эмбриональных стволовых клеток (ЭСК), выделенная из клеток внутренней клеточной массы эмбрионов мышей [ Martin G.R., 1981; Evans M.J., 19813. Генетически трансформированные в культуре ЭСК остаются способными передавать свои изменения через клетки зародышевого пути химерных животных и представляют перспективный материал для геномных манипуляций у млекопитающих.

Крайне существенным является создание адекватных клеточных систем для проведения исследований по выше перечисленным направлениям.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является создание модельных систем на основе генетически трансформированных культур клеток сельскохозяйственных животных, эмбриональных стволо-

вых клеток, первичных i использование для peiuei

»Моск. . .1 ¡^адвмин

им. К- к. 11$цир:

Инв: №.А:

та животных, и их

Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи:

- оптимизировать существующие и разработать новые методы для эффективного введения молекул экзогенных ДНК-плаэмид в клетки млекопитающих, культивируемые in vttro. с учетом их морфо-физимогических особенностей;

- получить стабильные генетически трансформированные клетки млекопитающих с экспрессией НП экзогенных ДНК и продукцией чужеродного белка;

- исследовать возможность регуляции экспрессии трансгена в культуре генетически трансформированных клеток;

- изучить возможность тестирования рекомбинантных векторов, как трансформирующего фактора в модельной клеточной системе tn vitro;

- показать возможность использования культуры эмбриональных стволовых клеток мыши , как перспективного материала для получения химерных животных и генетических манипуляций с ними;

- подобрать оптимальные условия для выделения, идентификации и поддержания в культуре эмбриональных стволовых клеток кролика;

- создать на основе первичных клеток, выделенных из репродуктивного тракта животных, клеточные системы для изучения и понимания механизмов созревания и экстрапорального оплодотворения ооцитов коров.

Научная новизна. Впервые проведен анализ компетентности мутант-ных клеток сельскохозяйственных животных (СПЭВ ТК~ и TP ГФРГ) к поглощению и экспрессии молекул экзогенных ДНК. Выделены наиболее компетентные клоны клеток к поглощению и экспрессии трансфецируемых ДНК плазмид pFF и psv2gpt. содержащих ген tic ВПГ-i и ген gpt Е. colt., соответственно. Показано, что дефектные по ТК клетки свиньи СПЭВ ТК" можно использовать для введения и экспрессии экзогенных ДНК с достаточно высокой частотой трансформации (2-6 10"3).

Анализ эффективности промоторов гена mt-i мыши и LTR вируса саркомы Рауса продемонстрировал, что эти промоторы обеспечивают конститутивную и индувдбельную экспрессии гена поверхностного антигена вируса гепатита Б человека в генетически трансформированных клетках СПЭВ ТК*, и продукция оболочечного белка-HBsAg достигает 5,12 мкг/106 клет. сут..

Впервые продемонстрировано, что сконструированный рекомбинант-ный ген , представляющий собой двухдоменную последовательность, 57-конец которого кодирует часть структурного гена VPi вируса гепатита А человека , а 3/-конец - полный ген поверхностного антигена вируса гепатита Б человека (S), поставленный под контроль промотора LTR ВСР, экспрессируется в клетках линии СПЭВ ТК" в виде секретируе-

мой надмолекулярной структуры со свойствами 20 нм частиц HBsAg.

Впервые проведено сравнительное изучение экспрессии гена S ВГБ в двух экспериментальных системах: в искусственной (генетически трансформированные клетки СПЭВ ТК+) и естественной ( клетки гепато-карциномы человека PLC/PRF-5). Показано, что по числу клеток, синтезирующих HBsAg, а также по активности секретируемого HBsAg, клетки трансформированных клонов превосходят клетки гепатокарциномы .

Впервые изучена роль дифференцировки гепатоцитов в регуляции экспрессии генов ВГБ, Установлено, что в клетках части клонов, характеризующихся более высокой степенью цитодифференцировки ( по скорости и характеру роста, экспрессии альфа-фетопротеина и способности к образовании опухолей у бестимусных мышей) усиливается экспрессия гена поверхностного антигена (S) и индуцируется экспрессия гена карового антигена (С) ВГБ.

с целью испытания рекомСинаятаых конструкций в культуре клеток был предложен новый, более простой и эффективный (превосходящий в системе временной экспрессии трансгена кальций-фосфатный способ в среднем в 30-50 раз) метод введения экзогенных ДНК-плазмид в культуру клеток СПЭВ и ТР. Научная новизна подтверждается решением о выдаче патента N93038111 от 10.03.1995 .

Показана возможность усиления экспрессии гена пей в культуре клеток сельскохозяйственных животных за счет встраивания в вектор pSV2neo фрагмента рибосомальной 28S ДНК человека (рАВВ).

Впервые в стране предпринята попытка подобрать оптимальные условия для выделения ЭСК кролика. Охарактеризованы морфологические и ростовые особенности ЭС-подобных клеток кролика, эмбриональный фенотип которых подтвержден путем индукции к дифференцировке in vitro.

Впервые в нашей стране электропорацией введены НП экзогенных ДНК в культуру ЭСК мыши . Получены клоны ЭСК линии ДЗ с фенотипом [Neo*]. в которых выявлена экспрессия репортерного гена IacZ Е. сои.

Практическая ценность работы. Охарактеризованы мутантнае штаммы клеток сельскохозяйственных животных (СПЭВ ТК~ и TP ГФРТ") по способности поглощать и зкспрессировать экзогенную ДНК, Показана пригодность мутантных клеток для генноинженерных работ в биотехнологии.

Получена серия генетически трансформированных клеток, в которых выявлена экспрессия гена поверхностного белка ВГБ - S, продукт которого HBsAg представляет интерес для решения практических задач биотехнологии и медицины.

Показано, что генетически трансформированные клетки СПЭВ ТК~ могут использоваться в качестве удобной модельной системы для изучения закономерностей экспрессии чужеродной ДНК (динамика, индукция.

активация).

Охарактеризованы клеточные мутантные клоны гепатокарциномы человека PLC/PRF-5, проявляющие различную степень дифференцировки. Результаты, выявившие связь менту степенью цитодифференцировки мутант-ных клеток PLC/PRF-5 и экспрессией генов ВГБ человека могут быть использованы в вирусологии и медицине.

Показана возможность тестирования эффективности векторов . в том числе их правильная сборка и функция регуляторных последовательностей ДНК (промоторов) . в культуре генетически трансформированных клеток сельскохозяйственных животных.

Предложен простой механический способ для введения молекул экзогенных ДНК в клетки млекопитающих в культуре, который позволяет получить большое количество клеток с временной продукцией чужеродного белка, что позволит вести обширные кинетические и биохимические исследования.

Разработаны условия для выделения ЭС-подобных клеток линий из предымплантационных эмбрионов самок кроликов , которые могут быть использованы для получения культуры ЭСК кролика.

Апробирован простой, неиньекционный способ получения химерных животных посредство« агрегации ЭСК с «орулами мыши.

Получены генетически маркированные по гену LacZ Е. colt ЭСК мыши линии ДЗ резистентные к генетицину, которые сохранили свой эмбриональный фенотип. Такие маркированные клетки могут представлять перспективный материал для исследования их судьбы в нормальном мышином эмбрионе.

Показано, что использование в качестве подложки монослоев соматических клеток, представленных клетками репродуктивного тракта животного, позволяет увеличить выход созревших и оплодотворенных m vitro ооцитов коров.

Основные положения, вьмоснмые на защиту:

- генетически трансформированные .клетки сельскохозяйственных животных , как модельные системы для изучения закономерностей экспрессии чужеродных генов, исследования свойств клонированных генов и получения продуктов чужеродных белков;

- зависимость эффективности трансформации мутантных клеток сельскохозяйственных животных (СПЭВ ТК" и TP ГФРГ) от степени компетентности к поглощению и экспрессии трансфецируемых ДНК-плазмид;

- зависимость экспрессии поверхностного (S) и корового (С) генов ВГБ от степени дифференцировки клеток гепатокарциномы человека PLC/PRF-5;

- механический метод трансфекции молекул экзогенных ДНК-плазмид

- 5 -

в культуру клеток сельскохозяйственных животных;

- использование культур эмбриональных стволовых клеток мши в качестве перспективного материала для получения химерных животных и генетических манипуляций с ними:

- влияние возраста культур бластоцист на эффективность получения ЭСК кролика.

Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены: на конференции "Современные направления создания медицинских диаг-ностикумов", г. Москва, декабрь 1990 г.; на 44-й научно-методической конференции аспирантов и молодых ученых ВИЖа, п. Дубровицы, июнь 1991 г.; на втором Всесоюзном симпозиуме " Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии", г. Самарканд, сентябрь 1991 г.: на научной конференции " Культуры клеток животных в биотехнологии и ветеринарии", г. Москва, май 1993 г.; на VI конференции Российской федерации "Новые направления биотехнологии", г. Пущино, май 1994 г.; на Международной конференции " Молекулярные и генетические маркеры", Киев. 1994; на 11-ой международной конференции "European embryo transfer association", Hannover, September 1995 г.; на Международной конференции, посвященной памяти академика А. А.Баева "Bayev memorial conference", г. Москва, май 19Э6 г.; на Международной научно-практической конференции " Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства", г. Горки, июнь 1996 г., на I Международной конференции по агробиотехнологии у растений и животных, г. Киев, май 1997 г.; на Всероссийской школе-конференции молодых ученых и аспирантов вузов НИИ РАСХН по актуальным проблемам животноводства, г. Москва, июнь 1997 г..

Публикации. По теме диссертации опубликована 21 научная работа: вт. ч. 1 патент на изобретение и 1 методические рекомендации. Основная часть результатов получена самостоятельно, а также при участии аспиранта Айтбаева Н.Е., защитившего диссертацию под руководством автора . Вклад других авторов отражен в публикациях по теме диссертации.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на _ стр., содержит _ табл., _ рис., состоит из введения, _ глав, выводов,

практических предложений, списка литературы ( 488 названий в т. ч. 435 на иностранном языке).

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

I. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

В настоящей работе были использованы 14 постоянных клеточных линий, Мутантные клональные сублинии от двух перевиваемых культур сельскохозяйственных животных, полученные Тугизовым ULM. и др,,

1985: СПЭВ ТК" (мутантные клональные сублинии клеток почки плода свиньи, несущие одинарную по ТК мутацию); СПЭВ ТК'-Уабре3-(мутантные клональные сублинии клеток почки плода свиньи, несущие двойные по ТК"-Уаб?еэ- мутации ): TP ГФРТ" (мутантные клональные сублинии клеток трахеи эмбриона коровы , несущие одинарную по ферменту ГФРТ мутацию ); TP ГФРТ"-Уаб?вэ- (мутантные клональные сублинии клеток трахеи эмбриона коровы, несущие двойные по ГФРТ~-Уабрвэ■ мутации). Культура клеток гепатокарциномы человека PLC/PRF-5 [Alexander et al.. 1976]; СПЭВ (почка плода свиньи); FBT (трахея эмбриона коровы); ЗТЗ (фибробласты эмбрионов мышей линии Balb/c); 3T3/MIH (фибробласты эмбрионов мышей линии NIH); ST0 (фибробласты эмбрионов мышей); ST0 [Neo*] (генетически трансформированные фибробласты эмбрионов мышей , проявляющие резистентность к генетицину ); ДЗ (ЭСК мыши [Doetschman et al., 19851); RK23 (мутантный клон ЭСК линии ДЗ); BRL (печень крысы. продуцируют фактор, ингибирующий дифференцировку ). Перечисленные линии культур клеток были получены из коллекции клеточных культур института вирусологии им, Д. И, Ивановского РАМН ( Москва). Часть из них , в том числе культуры ЭСК были предоставлены профессором г. Брэмом (Вена, Австрия) и профессором Э. Вольфом (Мюнхен, Германия).

Первичные культуры клеток были получены в лаборатории, эмбриональные фибробласты кролика (КЭФ) выделяли из 16-17-ти сут плодов кролика , а эмбриональные фибробласты мыши (МЭФ) из 13-14-ти сут плодов мыши [по Robertson. 1987]. Эпителиальные клетки яйцевода соскребали из яйцеводов коров и крольчих. Для осаждения клеток крови и получения чистой суспензии клеток яйцевода использовали 50% и ВОЯ растворы Перколла (Sigma). Клетки гранулезы изолировали из фолликулярной жидкости при аспирации фолликулов коров , Все первичные культуры клеток после первого пассажа наращивали в большом количестве и замораживали . с целью получения банка клеток с идентичными мор-фо-физиологическими характеристиками. Фидерные слои готовили по [Robertson, 1987]. Митотическую активность клеток подавляли, обрабатывая их свежеприготовленным раствором митомицина С фирмы Sigma.

В экспериментах использовали стандартные питательные среды и растворы отечественного и зарубежного производства.

Перевиваемые линии клеток культивировали согласно их паспортным данным. МЭФ и КЭФ культивировали в среде ДНЕМ, в которую добавляли 10JE сыворотки плода коров (ФСК) , 2 мМ альфа-глутамина и антибиотики. Клетки гранулезы культивировали в минимальной среде Игла (МОИ) с 10% ФСК. 2 шМ альфа-глутамином и антибиотиками. Монослои клеток, полученные из эпителия яйцеводов, культивировали в среде П2/ДМЕМ до-

полненной 10%-ми ФСК. 2 мМ альфа-глутамином и антибиотиками. Для предотвращения появления ревертантов мутантные клетки линий СПЭВ ТК~ . СПЭВ ТК"-УабРеэ■, TP ГФРТ" и TP ГФРГ-Уаб-рез- периодически (.через каждые 20-30 пассажей) культивировали в течении 2-3 пассажей в среде, содержащей соответствующие аналоги. ЭСК культивировали по [Robertson, 1987] на монослое митотически блокированных клеток, представленных МЭФ или ST0.

Пересев клеток, их концентрацию и жизнеспособность , криокон-сервирование и хранение клеточных культур осуществляли по стандартным методикам [Дьяконов Л.П., 1980; Адаме, 1983; Robertson, 1987].

Для трансфекции клеток млекопитающих в культуре использовали ДНК рекомбинантных векторов: 1. Плазмида pSV2gpt (Serva), сконструирована на основе векторной плазмиды pBR322, содержит маркерный ген ксантингуанин фосфорибозилтрансферазу (gpt) Е. cotí [Mulligan et al., 1980].

2. Плазмида pFF была предоставлена доктором биол. наук Ф.П. Филатовым (институт вирусологии РАМН, Москва), в составе вектора плазмида pBR322, ВАМ HI-Q фрагмент ДНК ВПГ1 человека размером 3,6 тыс.п.н., содержащий ген tfc этого вируса [Филатов Ф.П.. 1991].

3. Плазмида pRPAS-27 также бшга предоставлена доктором биол. наук Ф.П. Филатовым. Плазмида содержит рекомбинантный ген PAS. который был собран из НП гена S вируса гепатита Б (ВГБ) и участка ДНК гена VF—1 вируса гепатита А <ВГА) , поставленных под контроль промотор длинного концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса (ВСР). В состав плазмиды входят НП : вируса обезьяны (SV40) , гриппа А человека (IAV), гены белков HBsAg (S) с участками зон pre-Si . pre-S¿ и гена X. часть гена HBcAg (С) и энхансер (Е). ATG-инициаторные кодоны генов РИЗ и собственно HBsAg [Филатов Ф.П., 1991].

4. Плазмида pMSHB5 , содержащая ген S ВГБ человека, под контролем промотора гена металлотионеина (mt-1> мыши была предоставлены канд. биол. наук Г.Н. Ениколоповым (институт молекулярной биологии РАН, Москва). Рекомбинантная конструкция pMSHBS, собранная на основе плазмиды pUC-19. помимо клонированной комплементарной ДНК гена S ВГБ, содержала промоторную область, включающую энхансер (промотор и часть -концевой нетранслируемой области мРНК) гена mt-1 мыши, а также донорный и акцепторный участки сплайсинга из ранней области вируса SV40 и участок полиаденилирования из этой же области.

5. Плазмида pSV2neo содержит участок плазмиды pBR322, последовательности вируса SV40 ( области ранних и поздних генов, ранних и поздних вирусных промоторов а также участки полиаденилирования и терминации транскрипции ) и НП бактериального гена neo. Предоставле-

- 8 -

на НИИ сельскохозяйственной биотехнологии.

6. Плазмида pSV2neoABB предоставлена канд. биол. наук A.B. Чи-чиловым (ВШ, Дубровицы). Вектор pSVneoABB был создан путем вставки Фрагмента рибосомальной 28S ДНК человека (рАВВ) в плазмилу pSV2neo . Фрагмент рибосомальной ДНК человека рАВВ (образец ДНК-повтора) был предоставлен доктором биол. наук Л.Н. Гиндилисом.

7. Плазмида pCMVlacZ содержит НП бактериального гена lacZ Е. coll. поставленные под контроль промотора цитомегаловируса человека (CMV). Предоставлена доктором биол. наук Чумаковым (институт молекулярной биологии РАН).

8. Линейная форма плазмиды pRSVlacZ также предоставлена институтом молекулярной биологии РАН. Конструкция собрана на векторе pUC-19 и содержит НП днк бактериального гена lacZ Е. cotí (длиной 3063 п. н. из лактозного оперона Е. coli) под контролем промотора длинного З7-концевого повтора (LTR) вируса саркомы Рауса (RSV) длиной 584 п.н.. В конструкцию входит 3'-концевой участок гена гормона роста быка (786 п.н.), который содержит сигналы сплайсинга, полиаде-нилирования и терминации транскрипции.

9. Линейная форма плазмиды pPGKlacZ предоставлена доктором биол. наук М. Мюллером (центр аграрной биотехнологии Тулльн. Австрия). Конструкция собрана на основе плазмиды pUC-19 и содержит НП ДНК бактериального гена lad Е. сои, поставленные под контроль промотора фосфоглицерат киназного гена мыши (pgte) а также сигналы сплайсинга, полнаденилиро вания и терминации транскрипции вируса SV40. «

10. ДНК-носитель. В качестве ДНК-носителя использовали ДНК спермы лосося (Serva).

Молекулы экзогенных ДНК вводили в клетки различными методами: кальций-фосфатным [Wlgler et al.. 1977] модифицированным 1Савченкова И.П. и др.. 19941 , электропорацией и предложенным новым способом [Савченкова И.П. и др., 1993], которые использовались с учетом мор-фо-физиологических особенностей клеток.

Перед трансфекцией смесь экзогенных ДНК двукратно переосаждали этанолом и растворяли в стерильном буфере (0,1 мМ ЭДТА, 1мМ трис-HCl, рН-8. 0).

Электропорацию ЭСК осуществляли с помощь» прибора для электрослияния Gene Pulser. Bio-Rad, в специальной геликамере при условиях: среда ДМЕМ, 300 В, 500 мкФ (Савченкова И.П.. 1996].

Генетически трансформированные клетки с фенотипом [ТК+] и [ГФРТ] культивировали в среде ГАТ ( ростовая среда с тимидином , гипоксантином и аминоптершом ) [Llttlefleld et al., 1964).. Выделение генетически трансформированных клеток с фенотипом [ffeo+] прово-

дили в селективной среде с генетициком (G418, serva и НИК антибиотиков. Москва), концентрация которого подбиралась предварительным титрованием. В качестве отрицательного контроля служили клетки в которые вводили только ДНК-носитель или нетрансфецированные клетки. Выросшие на 9-14 сут колонии транформированных клеток выделяли с помощью титановых цилиндров по методике [Абрамян Д.С. и др.,1981]. либо фиксировали метанолом 15 мин и окрашивали 10% раствором Гимза. Выделенные колонии размножали на соответствующих селективных средах и замораживали. Анализ клонов проводили спустя 5-10 сут культивирования на селективной среде после размораживания клеток.

Наличие в клетках бета-галактозидазы. продукта экспрессии гена LacZ Е. cotí, выявляли гистохимически . используя в качестве субстрата X-gal фирмы Sigma. Долю клеток продуцирующих бета-галактозида-зу рассчитывали при анализе 1000 клеток.

Экспрессию гена поверхностного антигена ВГБ - S определяли с помощью моноклональных антител (МкА) к HBsAg. полученных и проверенных на специфичность в лаб. клеточной инженерии института им. Д. И. Ивановского РАМН [Кущ A.A., 1986].

Наличие HBsAg в культуральной жидкости и клеточном лизате выявляли с помощью двух методов: в реакции пассивной ге«агглютинации (использовали коммерческий эритроцитарный диагностикум производства Нижегородского ШИЭМ) и твердофазного иммуноферментного анализа , разработанного в институте вирусологии им. Д. И. Ивановского [Кущ A.A. И др., 1987]

Очистку МкА к HBsAg проводили на протеине А, иммобилизованном на сефарозе СМВг колонки фирмы "Pharmacia" методом аффинной хроматографии.

IgG к HBsAg метили пероксидазой хрена (ПХ) фирмы Sigma с R2 =3.0. ПХ связывали с IgG к HBsAg в белковом соотношении 1:1 по перйодатному методу [Hakane et al.. 1984].

Число клеток в культуре, продуцирующих HBsAg и HBcAg , определяли с помощью иммуноцитохимических методов: непрямой иммунофлюорес-ценции (ИФ) и клеточного ИФА (кИФА) на основе анализа 1000 клеток в каждом варианте опыта. Клетки выращивали в пеницилиновых Флаконах с покровными стеклами. Концентрация клеток составляла 1,5-2,0 ю5 клеток/мл, объем суспензии 1,5-2,0 мл. Клетки фиксировали при комнатной температуре холодным метанолом в течение 15 мин. При проведении ИФ использовали кроличьи антитела против IgG мыши , меченные ФИТЦ (Sigma). Клетки микроскопировали под водной иммерсией на микроскопе "Люман", используя фильтры с длиной волны 470-490 нм. При постановке кНФА применяли козлиные антитела против IgG мыши меченные ПХ

(Bio-Rad) и 3,3-диаминбензидин тетрахлорид фирмы Signa в качестве субстрата.

Внутренний (коровый) бедок вируса гепатита Б человека определяли с помощью иммуноглобулинов анти-HBcAg человека.

Электронно-микроскопическое исследование наличия частиц HBsAg ВГБ было выполнено в институте вирусологии им. Д. И. Ивановского канд. биол. наук ю, П. Кадоюиковын.

Молекулярно-генетичеокий анализ экзогенные ДНК выполняли с помощью дот-гибридизации. Выявление ДНК s-гена в клетках клонов-трансформантов проводилось в институте вирусологии им. д. И. Ивановского канд. биол, наук Е.А, Русавской. Анализ ДНК генов neo и пеоАВВ в клетках с фенотипом 1Ыео+] был сделан в ВИЖе канд. биол, наук A.B.Чичиловым и А.Н.Поповым.

Степень дифференцировки клеток гепатокарциномн человека PLC/PRF-5 оценивали по скорости и характеру роста, способности синтезировать альфа-фетопротеин (АФП) и альбумин , образовывать опухоли у бестимуснах мышей.

Наличие АФП в культуре клеток гелатокарциномы человека PLC/PRF-5 выявляли с помощью метода пероксидаза-антипероксидаза [Taylor et al., 19781 . МкА к АФП были предоставлены канд. биол. наук А.К. Язовой (НИИ Канцерогенеза ОКЦ РАМН}. Антивидовая сыворотка и ПАЛ-комплекс были предоставлены канд. биол. наук Т.Д. Эрайзер (НИИ Канцерогенеза ОНЦ РАМН). Перед окраской клетки фиксировали 10%-ным забуференным ФСБ формалином (20 мин, комнатная температура), а затем дофиксировали 70%-ным этанолом (20 мин, комнатная температура). Долю АФП-синтезирующих клеток рассчитывали при анализе 2000 клеток.

Скорость роста определяли по времени образования монослоя при посеве с кратностью 1:2. Способность роста в мягком агаре слой агара "Difco") определяли по частоте образования колоний, клонирование клеток осуществляли путем посева их в различных концентрациях (1 Юг, 2 102 . 5 102 . t 103} на чашку Петри диаметром 6 см. Клетки Фиксировали в 70% этаноле и окрашивали по Гимзе. подсчитывали число выросших клонов и определяли коэффициент эффективности клонирования , как отношение числа выросших клонов к общему числу посеянных клеток.

Онкогенные потенции клеток изучали путем введения бестимусным мышам линии Balb/D (nu/nu или bg/nu) подкожно в область спины 2 10е клеток. Число мышей с опухолями подсчитывали через 3 недели.

Эмбриональный фенотип культуры ЭСК мыши определяли по морфологическому, биохимическому , иммунологическому критериям и способности образовывать.эмбриоидные тела (ЭТ) in vitro .

Морфологическую степень дифференцировки выявляли визуально. Активность щелочной фосфотазы в ЗСК мыши оценивали с помощью кита (Sigma) по рекомендации фирмы. Наличие SSEA-1 антигена в ЭСК мыши исследовали в реакции непрямой ИФ, МкА были предоставлены профессором Э. Вольфом (Мюнхен, Германия). Перед окраской клетки фиксировали холодным метанолом в течение ю мин на льду. В качестве вторых антител использовали IgG козла против IgG мыши, меченные ФИТЦ.

Индукцию ЭСК к лиМеренцировке в культуре осуществляли по [Robertson , 1937]. Формируемые клеточные агрегаты культивировали в суспензии в течение 4-7-и сут.

Химерных мышей получали неиньекционным способом - агрегацией морул мыши с ЭСК [Nagy et al.. 1993]. Эмбрионы (8-16 клеточные мору-лы) извлекали из яйцеводов мышей линии CD-I . Агрегационные эмбрионы культивировали в течение 24 ч до стадии бластоцисты и трансплантировали в рога матки ложнобеременных самок линии CD-I. Степень химериз-ма родившихся мышат оценивали визуально по окраске шерсти (процент цвета шерсти агути у белых мышей).

Суперовуляцию у крольчих вызывали путем введения в кадальную мышцу 20 ME фолликулостимулирующего гормона на 1кг живой массы (Intergonan, Германия). Через 3 сут самок осеменяли и внутривенно вводили 180 НЕ хорионического гонадотропина (Ekluton, Германия).

Эмбрионы вымывали из рогов матки после забоя супер ов улир ованных крольчих на 4 сут после коитуса. Для выделения ЭСК кролика использовали эмбрионы только хорошего и отличного качества. Для удаления зоны пеллюцида у эмбрионов использовали 0,5%-ный раствор проназы (Serva).

Результаты экспериментов документированы микрофотографиями.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Анализ компетентности двух мутантных штаммов клеток сельскохозяйственных животных {СПЭВ ТК" и TP ГФРТ") к поглощении и экспрессии трансфецируемых НЛ экзогенной ДНК.

Изучали степень компетентности к трансфецируемым ДНК плазмид у независимо полученных мутантных клональных сублиний от двух перевиваемых культур сельскохозяйственных животных (СПЭВ ТК" и TP ГФРТ").

Использовали девять мутантных сублиний (из культуры TP), дефектных по ГФРТ и уабаину и десять мутантных сублиний (из клеток СПЭВ), дефектных по ТК (из клеток СПЭВ) и уабаину . Мутантные штаммы клеток СПЭВ (Д5, Д54-1, Д54-7. Д5-12. Д5-7. Al. С6, В2. A4, ДЗ) И TP (Д1-1-ТГ, АГ-13, АГ-9, АГ-15, АГ-6, МП-7, НП-11, АГ-9-4. А6-ТГ) проявляли чувствительность к среде ГАТ [Тугизов Ш.М,, 1985]. Реверсион-ный анализ выявил низкую частоту реверсии исследуемых клеточных суб-

линий к дикому типу. Частота реверсии для мутантных клеток СПЭВ ТК~ составляла 1-5'10"& клеток. Для мутантных клеток ТР ГФРТ* этот показатель находился в пределах 1-6•ю-7 клеток.

Для оптимизации условий трансфекции и анализа эффективности и частоты трансформации мутантных штаммов клеток использовали кольцевые формы рекомбинантных плазмид р2У2§р1 и рГГ. Клетки трансфециро-вали в присутствии ДНК-носителя. Конечная концентрация ДНК составляла 20 мкг/мл. Транофекцию клеток проводили кальций-фосфатным методом.

При проведении серии экспериментов было установлено, что исследуемые клетки проявляют разную степень компетентности к поглощению и экспрессии экзогенных ДНК-плазмид, Причем были обнаружены существенные различия в экспрессии маркерных генов не только в мутантных сублиниях разных культур клеток (СПЭВ ТК* и ТР ГФРТ*), но и среди мутантных клонов одной и той же видовой принадлежности. Результаты анализа представлены в табл.1 и табл.2.

Таблица 1

Анализ частоты и эффективности трансформации клеток мутантных штаммов ТР-ГФРТ" при использовании плазмиды pSV2gpt

N п/п Название клонов Устойчивость Частота трансформации Эффективность трансформации"

препарат конц. мкг/мл

1 Д1-1-ТГ 6-ТГ 0,5 1.2-1,4 10"6 0,6-0,8 10*6

2 АГ-13 8-АГ 10 1.0-3,0 10*6 0,5-1,5 10*6

3 АГ-9 8-АГ 50-100 0.8-1,0 10"6 0,1-0,5 10"6

4 АГ-15 1,5-2.2 10"6 0,7-1,0 10*6

5 АГ-6 _ г _ -"- 4,0-4,5 10"6 2,0-2,5 10*6

6 МП-7 6-МП 10 2,0-3,0 10"6 1,7-2,0 10*.6

7 МП-11 6-МП 10 - -

8 АГ-9-4 8-АГ 50-100

уабаин 0.05 3,5-5,0 10** 1,7-2,5 10*4

9 А6-ТГ 6-ТГ 1.0 - -

Примечание: ТГ-тиогуанин; АГ-азагуанин; МП-меркаптопурин. ' - число образовавшихся генетически трансформированных клонов из Ю6 клеток, использованных в эксперименте .

** - число генетически трансформированных клонов, полученных из общего числа использованных в эксперименте клеток, на 1 мкг/мл плаз-мидной днк. приведенные величины получены после вычитания частоты спонтанной реверсии к ГАТ-резистентному фенотипу в популяции исследуемых клеток.

Высококомпетентными к трансфекции гена gpt Е.со И оказались клетки мутантного клона АГ-9-4, которые имели двойные мутации

ГФРТ-Уабр", Эффективность трансформации составляла 1.7-2.5' 10"1 на 1 мкг плазмидной ДНК. Шесть клонов дефектных по ГФРТ обладали низкой эффективностью трансформации (0,1-2,5-10~6), еще два клона оказались не способными аккумулировать НП экзогенной ДНК плазмиды

Количественный анализ трансформантов, полученных из мутантных штаммов клеток СПЭВ ТК*, показал, что высокоэффективной компетентностью к поглощению и экспрессии гена Ш ВПГ-1 обладали также два клона, несущие двойные мутации (ТК~-Уабрез'}. из 10 исследованных. При этом эффективность трансформации составляла 1,0-З,0*10"3 на 1мкг плазмидной ДНК , Эффективность трансформации 5-ти клонов СПЭВ ТК~ была значительно ниже (0,5-4,3-10~5), 3 клона оказались некомпетентными к поглощению и экспрессии гена Ск ВПГ-1.

Из представленных результатов видно, что высокоэффективной компетентностью к поглощению и экспрессии чужеродных генов, входящих в состав применяемых плазмид, обладали клоны, несущие двойные мутации (ТК~-Уабрез) и (ГФРТ"-УаОрез■). Как известно, уабаин ингибирует (На*/К*1-АТФ-азу. Можно предположить, что различия в компетентности клеток поглощать чужеродную ДНК связаны с изменением свойств цитоп-лазмагической мембраны и обусловлены функциональным нарушением На*/К*-зависимой АТФазы.

Таблица 2

Анализ частоты и эффективности трансформации клеток мутантного штамма СПЭВ ТК~ при использовании плазмиды рЕТ

N п/п Название клонов Устойчивость Частота трансформации Эффективность трансформации* *

препарат конц. мкг/мл

1 Д5 5-БДУ 200 8,0 10"5 4,0 10'5

2 Д54-7 5-БДУ 200

уабаин 1.5 2,0-6,0 Ю-3 1,0-3,0 10"э

3 Д54-1 5-БДУ 200

уабаин 1,5 1,0-1,5 10"3 0,5-0,7 10"э

4 Д5-12 5-БДУ 200 7,0-8,6 10'5 3,5-4,3 10~5

5 Д5-7 -"- -"- 3,5-5.0 Ю-5 1,7-2,5 10-*

6 А1 5-БДУ 20-70 - -

7 С6 5-БДУ 20-70 - -

8 В2 5-БДУ 20-70 1,0-1,7 Ю*5 0,5-0,7 Ю-5

9 А4 5-БДУ 200 - -

10 ДЗ 5-БДУ 20-70 4.2-5,0 10"5 2,1-2,5 10*5

';** - то же, что в табл.1.

Для проведения дальнейших исследований по изучению экспрессии гена поверхностного антигена вируса гепатита Б мы выбрали клетки мутантного клона Д5 линии СПЭВ ТК*, частота трансформации которого плазмидой рГР составляла 8,0-Ю"5 клеток. Наш выбор был обусловлен

тем. что клоны Д54.7 , Д54-1 и АГ-9-4, которые проявили наибольшую степень компетенции к поглощению молекул экзогенной ДНК, после генетической трансформации были склонны, от части, к суспензионному росту. Это затрудняло дальнейшие исследования, так как популяция трансформированных клеток была весьма гетерогенна по характеру роста.

2.2. Изучение экспрессии гена поверхностного антигена вируса гепатита Б человека в генетически трансформированных клетках.

Выбор гена был обусловлен несколькими обстоятельствами. Во-первых. наличием векторов, содержащих НП клонированного рекомбинантного гена S ВГБ и МкА к HBsAg, полученных и проверенных на специфичность [Кущ A.A.,19861. Во-вторых, продукт гена S ВГБ человека - поверхностный мембранный белок HBsAg непосредственно участвует в адсорбции вируса на клеточной мембране и проникновении в цитоплазу. Однако многие вопросы, связанные со структурой и функцией этого антигена остаются до сих пор невыяснеными из-за отсутствия культуры клеток в которой вирус мог бы размножаться. В-третьих, HBsAg является диагностическим маркером , который присутствует в крови инфицированных вирусом и его получевие необходимо для создания чувствительных тест-систем, которые применяются в детекции анти-HBsAg антител в крови больных пациентов, поэтому получение генетически трансформированных клеток, содержащих НП гена S ВГБ человека может рассматриваться, как удобная модельная система для изучения закономерностей экспрессии этого гена и его продукта белка - HBsAg. Настоящая работа и была в своей первой части направлена на создание такого рода экспериментальной модели.

2.2.1. Получение генетически трансформированных клеток СПЭВ ТК*. содержащих НП гена S ВГБ под контролем промотора LTR ВСР.

В клетки мутантного клона Д5 почки эмбриона свиньи, дефектные по ТК (СПЭВ ТК~), кальций-фосфатным методом вводили кольцевые формы рекомбинантных плазмид pRPAS и pFF.

В результате серии экспериментов было получено 73 клона клеток с фенотипом ТК* (табл.3). Эффективность трансформации на 1мкг ДНК составляла 8 • 10*5 клеток. Экспрессию гена S в экспериментальных клетках определяли по наличию HBsAg в РПГА. Материалом для анализа служила неконцентрированная культуральная жидкость от всех 73-х клонов-трансформантов. Положительными по этому тесту оказались 13 клонов с фенотипом тк+ » что подтверждалось и данными дот-гибридизации ДНК - клеток-трансформантов с ДНК С32Р) - зондами из рекомбинантного гена. Это составляло от общего числа ТК+-трансформантов 17,8%. Продукция HBsAg оказалась неодинаковой в клетках положительных по ДНК гена tic ВПГ-1. В трех клонах (23% от числа положительных по

HBsAg) уровень синтеза рекомбинантного HBsAg достигал высоких титров 1:512. 1:256, в одном клоне (7,6%) активность HBsAg выявлена в титре 1:32, у 6-ти (46%) этот показатель был значительно ниже 1:8, а у остальных 3-х клонов (23.1%) HBsAg выявлялся в титре 1:4. Продукция HBsAg клетками разных клонов варьировала от 0,4 нг до 5,12 мкг/ю6 клет. сут.

Клетки ГАТ-резистентных клонов (N1. N2, КЗ), отличавшиеся наиболее высокой (по данным РПГА) секрецией HBsAg, анализировали в реакции клеточного ИФА с применением МкА к HBsAg. Результаты показали, что для клеток этих клонов характерна цитоплазматическая локализация HBsAg; который был обнаружен в 70-80% клеток .

Клоны с наиболее высокой и стабильной экспрессией рекомбинантного гена были нами отобраны и реклонированы. Результатом стало получение 18 реклонов положительных по экспрессии гена s ( титр HBsAg в РИГА 1:32, 1:4). Из 18-ти реклонов 6 сохраняли стабильную.экспрессию гена S на протяжении 10-20 пассажей.

Полученные данные были подтверждены при анализе культуральной жидкости 10 клонов в ИФА ( превышение оптической плотности в опытных образцах по сравнению с контрольными составляло 5-7 раз).

Кроме того, гибридные белки обнаруживались в тест-системах на HBsAg в градиентах плотности 1,20-1,22 г/мл (плотность 20 ни частиц HBsAg). Электронно-микроскопическое исследование подтвердило наличие подобных частиц в экспериментальных образцах.

2.2.2. Получение генетически трансформированных клеток СПЭВ ТК*, содержащих НП гена S ВГБ под контролем промотора гена mt-l мыши.

При проведении серии экспериментов по котрансфекции кальцийфос-фатным методом мутантного клона Д5 клеток СПЭВ ТК~ рекомбинантными конструкциями pMSHBS и pFF было получено 150 ГАТ-резистентных клонов (табл.3). Эффективность трансформации на 1 мкг ДНК составляла 8,5 10*5 клеток . Все 150 клонов с фенотипом ТК* были проанализированы на экспрессию гена S ВГБ. Из 150 клонов в 24-х (16% от общего числа ГК1 трансформантов) выявлен HBsAg (данные РПГА). Продукция HBsAg клетками разных клонов варьировала от 0,4 нг до 1,28 мкг/106 клеток сут. 11 клонов с фенотипом ТК* (45.6% от числа положительных по HBsAg продуцировали HBsAg с титром 1:64. В двух клонах (8.3%) продукция HBsAg составляла 1:32. У остальных ll-ти клонов (45,8%) выявлена продукция HBsAg в титрах 1:3, 1:4 .

С помощью непрямой реакции ИФ с КкА к HBsAg было проанализировано 7 клонов. Выявлена продукция HBsAg в 45-50Я трансформированных клеток.

Клетки четырех ГАТ-резистентных клонов , которые показали наиболее сильную и стабильную продукцию HBsAg. мы также реклонировали. Полученные реклоны анализировали на присутствие НВ;зА£. Из 53 полученных реклонов с фенотипом ТК* были отобраны 14 в которых выявлялась продукция НВЗА§ . Причем . мы получили реклоны превосходящие по уровню синтеза НВзАй первоначально полученные материнские клоны в 3 раза. Наиболее эффективным в этом отношении был клон N7 ( титр 1:64), из которого были реклонированы и отобраны по экспрессии гена 5 5 реклонов. Продукция HBsAg в этих 5 реклонах варьировала от 1:256 до 1:8. Данные, полученные в РИГА, подтвердились в реакции непрямой ИФ с применением МкА к НВзАв. Большинство реклонов (7 из 14 полученных) характеризовались синтезом HBsAg в 27-57% клеток.

Таблица 3

Получение генетически трансформированных клеток СПЭВ ТК*, содержащих НП гена 5 ВГБ под контролем разных промоторов

Показатели ген S под контролем промотора LTR ВСР ген S под контролем промотора гена mt-1 мыши

Число % Число %

Эффективность трансформации на 1МКГ ДНК

Получено клонов с фенотипом ТК* Из них проанализировано на экспрессию гена Э в РПГА Получено клонов НВзде*

51Í

64

32

8

4

8 1(Г5 73

73 13 3

Наличие HBsAg в клетках клонов-трансформантов (данные кИФА и ИФ) Получено реклонов с фенотипом ТК из них HBsAg* (РПГА)

79 16

17,8 23,1

7,6 46,1 23,1

70-80

22,7

8,5 10"5 150

150 24

И

2 6 5

53 14

16,0

45.8 8,3 25.0 20,8

45-50

25.9

Таким образом мы получили генетически трансформированные клетки СПЭВ, содержащие ген белка оболочки вируса гепатита Б человека, который tn vivo экспрессируется только в гепатоцитах человека.

2.2.3. Изменение экспрессии гена S ВГБ в клетках СПЭВ клонов-трансформантов при длительном непрерывном культивировании.

Экспрессия рекомбинантного гена s в клетках клонов-трансформантов была изучена в динамике. Результаты исследований показали, что в процессе длительного непрерывного культивирования клеток ГАТ-резис-тентных клонов происходило постепенное снижение и затем утрата про-

дукции НВзА§ (Рис.1).

-

г$б ■ 12& -613215 ■

а

4 -г-

5 ю 15 20 25 30 ,55 40 45 50

Рис.1. Динамика экспрессии гена 5 БГЕ в клетках наиболее сильных и стабильных клонов-трансформантов при непрерывном культивировании;

1 - ген под контролем промотора ЬТК ВСР

2 - ген под контролем промотора гена тпС-1 мыши

По оси абцисс-номер пассажа. По оси ординат-активность НВзАя в РПГА, титр.

Анализ экспрессии рекомбшантного гена Б, поставленного под контроль промотора Ш ВСР показал, что три наиболее сильных продуцента (клоны N1, N2, КЗ) снижали синтез НВзА§ начиная с 6-го пассажа в селективных условиях (по ТК). Продукция НВбАв сохранялась до 45-го пассажа, но в низких титрах (1:2, 1:4). При дальнейшем культивировании клеток ТК* - трансформантов нам не удалось выявить экспрессию гена 3. Остальные 10 клонов потеряли продукцию вирусного гена в течение 4-5 пассажей.

Изучая экспрессию гена 5 ВГЕ (промотор гена мыши) в динамике мы наблюдали снижение секреции НВзА§ в клетках, наиболее сильных продуцентов клонов-трансформантов с 14 пассажа. К 29 пассажу уровень продукции HBsAg в этих клонах характеризовался титром 1:2. Продукция НВзАй в культуральной жидкости составляла 0.5-1,0 нг/мл. При анализе экспрессии гена 5 в клетках трансформированных клонов, только 2-3% клеток обнаруживали НВзАв. На 31 пассаже синтез НВбАй прекращался, остальные 13 ГАТ-резистентных клонов теряли экспрессию

Б-гена в течение 4-6 пассажей.

2.2.4. выявление ЯП ДНК гена £ ВГБ в клетках клонов-трансформантов.

Представляло интерес' выяснить, какова причина утраты продукции НВгАв в клетках. Мы провели анализ ДНК в 19-ти трансформированных клонах. Параллельно тестировали НВзАе в культуральной жидкости в ИФА в динамике. Результаты дот-гибридизации ДНК 12 клонов трансформантов с меченными (*згР) ДНК-зондами, представляющими рекомбинантную ДНК, которая содержала НП гена 5 приведены на рис.2 и в табл.4. Они демонстрируют, что все 7 клонов, потерявшие продукцию HBsAg в результате длительного непрерывного культивирования, лишались также и вставки рекомбинантных последовательностей, 5 клонов, содержащие ДНК гена г, экспрессировали вирусный трансген.

Таблица 4

Сравнительный анализ ДНК Я-гена и продукции НВзАв в клетках клонов-трансформантов при длительном культивировании

номер дота Название клонов Время наблюдений (пассаж) НВзАв в культ, ЖИДКОСТИ (ИФА) Наличие ДНК

А1 3 10 + +

В1 3 19 +

С1 2 8 + +

Д1 2 17 + +

Е1 2-2 17 + *

Г1 2-2 23 - -

А2 3-А4 9 + +

В2 1-1 И + +

С2 1-1 19 - -

Д2 1-4 9 + +

Е2 1-4 18 - -

Г2 1-6 8 - -

АЗ 1-6 15 - -

ВЗ 1-2 6 +

СЗ 1-2 16 + +

ДЗ 1-5 7 + 4-

ЕЗ 1-5 14 + +

РЗ 1-5 17 - -

А4 3-А6 5 ■ + +

В4 3-А6 10 - -

С4 3-А6 21 - -

Д4 4-В4 5 +■ +

Е4 4-В4 10 - -

Г4. 1-3 4 + +

А5 1-3 9 +

- 19 -

1 2 Л 4 5 б ;

Рис.2. Анализ ДНК гена 3 ВГБ в клетках клонов-трансформантов. Клеточную ДНК (10® клеток) экстрагировали из генетически трансформированных клеток СПЭВ трансфецированных вектором рР.РАЗ и использовали для дот-гибридизации с днк зондом рРРАЭ, меченным эгР. В качестве положительного контроля использовали клетки гепатокарциномы РЬС/РКГ-б, содержащих в своем геноме НЛ гена г ВГБ. Отрицательным контролем служили нетрансформированные клетки СПЭВ (дот41>. Дот N42 - контроль для зонда рКРАЗ.

2.2.5. Активация экспрессии гена Б ВГБ в клетках клонов-трансформантов.

Была изучена возможность усиления продукции НВэАе в клетках клонов-трансформантов путем экспериментального воздействия на регу-ляторные элементы (промоторы) рекомбинантного гена 5.

Так как известно, что активность гена т(-1 мыши регулируется на уровне транскрипции тяжелыми металлами и глкжокортикоидными гормонами, являющимися индукторами в этой системе [Ни еЬ а1., 1990], клетки СПЭВ ТК\ содержащие ген 5 под контролем промотора гена ш-1 мыши, были обработаны солью кадмия и дексаметазоном (синтетическим глюко-кортикоидным гормоном) . Результаты анализа показали , что обработка клеток трансформированных клонов с помощью ионов кадмия (Сс1г+) в течение 6-10 часов приводила к 4-х кратному увеличению продукции НВэАе. Обработка клеток дексаметазоном не оказывала никакого влияния на продукцию НВэАз . Это свидетельствует в пользу существующего представления об амплификации трансгена, находящегося под контролем промотора гена тС-1 мыши в процессе индукции солями тяжелых металлов [Нагаег е[ а1., 1982].

В настоящее время исследуется механизм еще одной регуляторной

системы - это гены, стимулируемые стероидными гормонами Шо М. е1 а!.. 1989]. Предполагается, что гормон связывается с белковым рецептором, который в результате этого приобретает способность специфически присоединяться к определенным последовательностям ДНК и активировать траскрипцию соответствующих генов. Одну из групп стероидных гормонов составляют глюкокортикоиды.

Для изучения влияния глюкокортикоидных гормонов на экспрессию гена 3 (промотор ига ВОР) в клетках СПЭВ с фенотипом ТК* клетки обрабатывали гормонами и подвергали анализу. Анализ проводили в то время, когда продукция НВзА? в клетках ГАТ-резистентных клонов значительно снижалась в результате длительного непрерывного культивирования и достигала значений: в культуральной жидкости 0,5-1,0 нг/мл, а в клетках клонов-трансформантов 3-5% клеток. Результаты анализа показали, что обработка клеток трансформированных клонов глюкокорти-коидными гормонами в течение 24 ч привела в некоторых клонах (5 из ю-ти изученных) к 3-4 кратному усилению продукции НВзАя. Продукция НВэАё в культуральной жидкости после обработки дексаметазоном и гидрокортизоном составляла 2-4 нг/мл. а в клетках 12-155!. Синтетический аналог дексаметазона - дексазон и белково-пептидный гормон инсулин не оказывали стимулирующего эффекта на синтез НВзАв. Механизм, согласно которому мы наблюдали активацию экспрессии гена 5 неизвестен. Можно предположить , что способность отвечать на индукцию глюкокор-тикоидныш гормонами связана с ретровирусным иге.

2.3. Сравнительный анализ экспрессии гена 5 ВГБ в двух экспериментальных системах: в генетически трансформированных клетках СПЭВ и клетках гепатокарциномы человека РЬС/РМ^б, имеющих природно-интег-рированный геном вируса гепатита Б.

Параллельно с изучением экспрессии гена £ в трансформированных клетках СПЭВ мы изучали экспрессию этого гена в культуре клеток гепатокарциномы человека РЬС/Р1гГ-5. Работа по изучению закономерностей естесственной экспрессии генов ВГБ, дает возможность сравнить ее с закономерностями проявления генов ВГБ в искусственной системе, в данном случае - это трансформированные клетки сельскохозяйственного животного.

2.3.1. Экспрессия гена 5 ВГБ в клетках гепатокарциномы человека Р1Х/Р1?Г-5.

Исходная линия гепатокарциномы РЮ/РИГ-б обнаружила свойства, позволяющие считать ее низкодифференцированной (табл. 5). Так, . до 60-80% клеток этой линии содержали эмбриональный онкогенный белок -афп . Скорость роста в культуре была высокой (время удвоения популяции 48-72 ч), клетки были способны к росту в полужидкой среде, при

введении Се сгинусным мышам клетки образовывали опухоли , которые перевивались до 6 пассажей tn vivo. Из вирусных антигенов ВГБ в куль-туральной жидкости выявлен только HBsAg, причем в незначительных количествах (0,5-1 нг/мл). Число клеток, которые продуцировали HBsAg составляло 1-5Я, Локализация HBsAg наблюдалась в цитоплазме и клеточной мембране .

2.3.2. Влияние фенотипа дифференцировкн на экспрессии генов ВГБ в клетках гепатокарциномы человека.

На основе клеток гепатокарциномы человека PLC/PRF-5 (трижды клонированный вариант) в лаборатории клеточной инженерии института вирусологии им. Д.И.Ивановского РАМН были получены мутантные клоны гепатокарциномы, устойчивые к антиметаболитам и цитостдтикам [Туги-зов Ш.М. и др, 1989]. Отбор вариантов клеток, устойчивых к препаратам, проводили путем многошаговой селекции с постоянно возрастающей концентрацией .

Таблица 5

Зависимость экспрессии генов S и с ВГБ от степени дифференцированное™ клеток линии PLC/PRF-5, клона А7 и его субклонов

Экспрессия S Экспрессия С Число Онко-

генность

И Число Титр HBsAg Число Титр HBcAg клеток клеток в

п/п клеток в культу- клеток в клеточ- с бести-

клонов с ральной с ном гомо- АФП мусных

HBsAg жидкости HBcAg генате (В %) мышах

(в %) (В РПГА) (в %) (в ИФА)

PLC/PRF-5 3-5 - 0 - 60-80 Образ, опухоли

PLC/PRF-5-7 10-15 - 0 - 60-80 «

4 (Будр) 4-13 1:2-1:8 0 - 3-20 11

14 (Будр) 1-3 (АГ) 10-12 1:2-1:4 0 - 60-80 i,

3-5 1:2-1:4 0 - 60-80 п

13-2 (АГ) 8-10 - 0 - 70-80 i.

41-1 (МХ) 2-3 - 0 - 70-80 ■i

2 (АГ) 20-80 1:128-1:256 10-15 1:64 0,3-18 Не образ

* опухоли к

17 (КХ) 40-50 1:32-1:128 20-40 1:5 8-10

52 (КХ) 60-80 1:8-1:16 0-15 1:20 3-20 и

70 (ВКр) 44-53 1:8-1:64 40-50 1:5 10-16 м

72 (ВКр) 25-42 1:8-1:32 20-30 1:5 0, 5-13 it

92 (Пур) 11-53 1:64-1:128 40-50 1:5 3-13 и

95 (Пур) 50-90 1:32-1:128 30-40 1:25 1-12 н

Примечание: Приведены крайние значения по результатам нескольких повторных опытов. Прочерк - белок не выявляется титрованием. Будр-5-бром-2-дезоксиуридин; АГ-азагуанин; МХ-метатрексат; ВКр-винк-ристин; КХ-колхицин; Пур-пуромицин.

В процессе селекции регулярно определяли экспрессию генов Б и С

ВГБ, а также АФП. Отбор устойчивых вариантов продолжался от 5-6 месяцев до года. Были отобраны как высокодифференцированные, так и низкодифференцированные клоны гепатокарциномы. Наиболее высокодифференцированные клоны характеризовались резким снижением или отсутствием синтеза АФП . потерей клонообразущей способности на полужидкой среде и твердом субстрате, потерей опухолеобразующей способности при введении бестимусным мышам, медленным ростом с низким коэффициентом пересева.

Было проведено сравнительное иммуноцитохимическое изучение экспрессии генов ВГБ в клетках мутантных клонов, проявляющих признаки дифференцировки в различной степени. Результаты анализа показали, что почти во всех исследованных высокодифференцированных клонах наблюдалось усиление экспрессии гена S и индукция ранее репрессированного гена С ВГБ. В табл. 5 приведены данные о свойствах 12-ти изученных мутантных клонов.

Анализ результатов эксперименов показал, что приобретение клетками гепатокарциномы устойчивости к использованным токсическим веществам в ряде случаев может сочетаться с индукцией признаков дифференцировки. Одновременное приобретение лекарственной устойчивости и признаков дифференцировки известно и для клеток другого происхождения [Ставровская A.A. и др., 19901. Наши результаты свидетельствуют о том, что процесс дифференцировки гепатоцитов линии PLC/PRF-5. вероятно, играет существенную роль при экспрессии генов вирусных антигенов (HBsAg и HBcAg) ВГБ. В частности, возможно, что включение или усиление экспрессии вирусных генов связано со стадиями цитодифферен-цировки, на которых происходит индукция синтеза специфических ядерных факторов гепатоцитов, участвующих, как известно, в регуляции экспрессии генов ВГБ [Chang et al., 19891.

2.4. Тестирование рекомбннантных конструкций (векторов) в культуре клеток сельскохозяйственных животных.

Возможность ввести экзогенную ДНК в клетки животных, культивируемые in vitro, важна для широкого ряда экспериментальных подходов . Одним из таких направлений является тестирование рекомбннантных конструкций, в том числе генетических элементов (промоторов, энхан-серов), участвующих в регуляции экспрессии чужеродных генов. Изучение свойств рекомбинантной ДНК in vitro позволяет быстро тестировать различные вектора и сравнивать их эффективность перед введением в организм животного.

2.1.1. Сравнительный анализ эффективности векторов pSVSneo и pSV2neoABB для генетической трансформации клеток СЛЭВ и FBT в культуре.

В отделе биотехнологии ВИЖа сельскохозяйственных животных была создана плазмида pSV2neoABB путем вставки фрагмента рибосомальной 28S ДНК человека (рЛВВ) в исходную плазмиду p3V2neo. Представляло интерес сравнить эффективность двух рекомбинантных конструкций : pSV2neo и pSV2neoABB для генетической трансформации клеток линий СПЭВ и FBT, культивируемых in vitro . Трансфекцию проводили кальций-фосфатным методом .

При проведении серии экспериментов были получены клоны генетически трансформированных клеток с фенотипом Neo". Анализ результатов выявил . что эффективность трансформации клеток, опосредованная плазмидой pSV2neoABB, была в два раза выше, чем с плазмидой pSV2neo во всех исследуемых клетках (табл.6). Результаты подтверждались дот-гибридизацией. На радиоавтографе уровень ДНК в образце со вставкой (pSV2neoABB) был выше, чем в контроле (pSV2neo).

Таблица 6

Сравнительный анализ частоты трансформации клеток СПЭВ и FBT при использовании ДНК плазмид pSV2neo и pSV2neoABB

Линия клеток pSV2neo pSV2neoABB

Кол. -во клонов Частота трансформации Количество клонов Частота трансформации

СПЭВ FBT 15 21 3 10"? 5 Ю'5 29 44 6 10"5 9 10~5

Примечание: частота трансформации - количество полученных клонов-трансформантов на 5 Ю-5 клеток

Полученные данные свидетельствуют о возможности усиления уровня экспрессии экзогенной ДНК за счет встраивания в исходную конструкцию Фрагмента рибосомальной 283 ДНК человека. Возможно, что повторяющиеся последовательности рДНК человека имеют определенную гомологию в случае с экспериментальными культурами клеток, и вставка в вектор НП ДНК, содержащих умеренные повторы, позволяет повысить эффективность рекомбинантной конструкции . используемой в качестве трансформирующего фактора клеток млекопитающих в культуре.

2.4.2, Создание нового метода трансакции молекул экзогенной ДНК в клетки млекопитающих в культуре.

В настоящее время существует несколько методов введения экзогенной ДНК в культуру клеток млекопитающих . Наши теоретические и практические исследования привели к выводу, что в большинстве используемых методов трансфекции лежит один и тот же принцип: для того чтобы чужеродная ДНК проникла в клетку необходимо частичное нарушение ее клеточной мембраны. Основываясь на этих наблюдениях мы попы-

тались создать простой и доступный способ трансфекции экзогенной ДНК-плазмид в культуру клеток.

2.4.2.1. Использование нового метода трансфекции для временной экспрессии НП экзогенной ДНК в клетках млекопитающих in vitro.

За день перед трансфекцией клетки рассевали в чашки Петри с d-3,5 см в концентрации 10* см2 и инкубировали при 37° с в течение ночи. Смесь экзогенных ДНК (pCMVlacZ и носитель) в 0.2 мл буфера (0.1 мм ЭДТА, 1 мМ трис-HCl, рН-8,0) добавляли к клеткам, находящимся в ФСБ-2 или НСИ { без сыворотки) до конечной концентрации ДНК 5-60 мкг/мл. Клетки в растворе с экзогенной ДНК накрывали стерильным покровным стеклом и слегка придавливали перпендикулярно поверхности монослоя . Затем покровное стекло осторожно удаляли, а клетки инкубировали при 37°С с 5% C0Z в этом же растворе в течение 40-60 мин. Буфер с экзогенной ДНК меняли на нормальную ростовую среду. Для определения жизнеспособности клеток после проведенных манипуляций часть исследуемых клеток окрашивали 0,15! раствором трипанового синего . Анализ временной экспрессии прокариотического гена lacZ проводили через 24 ч после трансфекции .

Серией экспериментов были определены условия для эффективной трансфекции клеток перевиваемых линий СПЭВ, ГБТ и ЗТЗ Balb/c. Оптимальное время для инкубирования клеток в растворе с экзогенной ДНК, при котором выявлялось максимальное количество клеток, продуцирующих Сета-галактозидазу, составило от 40 до 60 минут. При этом было зарегистрировано 34-533! клеток положительных по бета-галактозидазе, Результаты опытов показали , что оптимальный уровень концентрации экзогенной ДНК в растворе ФСБ-2 составил 10-40 мкг/мл. Изучали влияние буфера для трансфекции: среды Игла (МСИ) без сыворотки и ФСБ-2. Нами не было отмечено сильных различий в эффективности трансфекции при применении указанных растворов. Однако при проведении трансфекции в МСИ выживало около 65 % клеток, в то время, как при использовании ФСБ-2 оставались жизнеспособными. 55?! клеток.

2.4.2.2. Сравнительный анализ эффективности двух методов трансфекции.

Сравнивали эффективность предложенного нами метода трансфекции с кальций-фосфатным . Использовали ДНК плазмид pCMVlacZ и pRSVlacZ, которые вводили в клеточные линии СПЭВ и FBT.

В своих экспериментах мы не отметили существенной зависимости уровня белкового синтеза от характера использованных нами промоторов, контролирующих ген lacZ E.coli . В табл. 7 представлены данные экспериментов, характеризующие эффективность двух методов трансфекции во временной системе экспрессии трансгена.

Таблица 7

Сравнительный анализ эффективности двух методов трансфекции во временной экспрессии гена la.cZ Е.со и

линия клеток Кальций-фосфатный метод Предложенный способ

Количество клеток, продуцирующих бета-галактозид. (se)

pCMVlacZ pRSVlacZ pCMVlacZ pRSVlacZ

СПЭВ FBT 2 1 0,8 3 за 53 40 27

Сравнительный анализ полученных данных позволяет предположить, что новый метод является не только простым . но и более эффективным для временной экспрессии гена lacZ Е. cotí,

2,4.2.3. Использование нового метода транфекцин для стабильной экспрессии HD экзогенной ДНК.

Для получения стабильных клонов-трансформантов клеток СПЭВ и FBT смешивали ДНК плазмид pCMVlacZ, pSV2neo и ДНК спермы лосося (конечная концентрация 20 мкг/мл). Ко-трансфекцию проводили так, как описано в предыдущем разделе. После трансфекции клетки культивировали в нормальной ростовой среде сут. Затем среду меняли на селективную с генетицином ( конечная концентрация 400 мкг/мл).

В результате проведенной серии экспериментов было получено 60 и 90 клонов клеток с фенотипом [Ыео+] на 2 10® использованных клеток СПЭВ и FBT , соответственно. Было отмечено, что не все образовавшиеся колонии оказались компетентными к росту и расширению. Наши попытки выделить и расширить генетически трансформированные клетки оказались неудачными. В некоторых клонах наблюдалась остановка роста клонов ( на уровне 20-40 клеток) с частичной дегенерацией. Только 1-2% из полученных клонов с фенотипом INeo*] были способны размножаться в селективных условиях. Каковы причины такой неудачи не ясны и требуют дальнейшего изучения.

Таким образом предложенный нами метод, как и все существующие в настоящее время способы трансфекции, также имеет свои преимущества и недостатки. Метод прост в исполнении и не дорог. Он представляет ценность для получения большого количества клеток в которых выявляется временная продукция чужеродных белков. Способ может быть применим в генно-инженерных лабораториях для быстрого анализа и характеристики клонированных генов. Он выгодно отличается от других методов трансфекции тем, что для переноса НП экзогенных ДНК не требуется введения в клетку каких-либо дополнительных чужеродных молекул (например липосом, эритроцитов, ДЕАЭ-декстрана, шариков вольфрама и

др.), поскольку ДНК добавляется прямо в среду, окружающую клетку. К недостаткам относится относительно низкая эффективность при получении стабильной экспрессии НП экзогенной ДНК. Наш способ применим не для всех клеточных культур ( например, ЭСК) и более предпочтителен для клеток, обладающих хорошими адгезивными способностями.

2.5. Использование культуры эмбриональных стволовых клеток (ЭСЮ мыши для получения химерных животных.

Эмбриональные стволовые клетки мыши, выделенные из клеток внутренней клеточной массы (ВИН) предымплантационных эмбрионов, обладают уникальной способностью сохранять свои тотипотентные свойства в культуре. В связи с тем, что при возвращении ЭСК в эмбрион они принимают участие в формировании всех тканей, органов и, в первую очередь, гонад химерных животных, они представляют перспективный материал для генетических манипуляций . Однако, культура ЭСК (даже без видимых морфологических изменений) представляет собой смесь истинных, т.е. "нормальных", обладающих тотипотентностыо, и "ненормальных" клеток . Длительное культивирование ЗСК . с одной стороны, мо-Ткет привести к прогрессии дифференцированных клеток, с другой стороны. к селекции "ненормальных" клеток, характеризующихся более высоким ростом и тератокарцинома-подобным фенотипом. Считается, что такие клетки имеют ограниченные способности для формирования зародышевых линий химер, но часто индуцируют опухоли .

2.5.1. Поддержание и сохранение эмбрионального фенотипа ЭСК му-тантного клона RK23 линии ДЗ ньши при длительном культивировании.

Изучали возможность поддержания и сохранения эмбрионального фенотипа при длительном культивировании ЭСК мутантного клона RK23 линии ДЗ . Для идентификации эмбрионального фенотипа ЭСК использовали периодические тесты на целочную фосфотазу и экспрессию эмбрионального антигена SSEA-1 . Результаты показали, что пассирование ЭСК на фидерных слоях МЭФ или STd каждые вторые сутки (1:8-1:10) в высоког-люкозосодержащей ДНЕМ среде, дополненной 15 % ФСК, Ю~4 шИ 2-меркап-тоэтанолом и рекомбинантным фактором человека, ингибирующим лейкемию (LIF) в концентрации 1000 ME/мл с ежедневной сменой среды, тормозит дифференцировку ЭСК. Культура поддерживалась при плотности 2*10® клеток на чашку с d-Эсм. При посадке ниже и выше клетки имели тенденцию дифференцироваться (до 55!). даже когда использовалась LIP содержащая среда.

2.5.2. Неинъекционный способ получения химерных животных с использованием ЭСК мыши.

С целью изучения тотипотентных свойств клона RK23 лиши ДЗ ЭСК мыши (17 пассаж) в системе in vivo были проведены эксперименты по

получению химерных мышей неиньекционным способом. Анализ полученных результатов выявил высокую эффективность агрегационного метода для получения химерных эмбрионов. При использовании этого метода в среднем около 83,7% агрегированных с ЭСК морул развивались в культуре до стадии бластоцист. Нами не наблюдались значительные различия в получении химерных бластоцист при использовании различных методов агрегации морул с ЭСК (табл. 8 )

Таблица 8

Сравнительный анализ двух методов агрегации для получения химерных бластоцист в культуре

метод агрегации Количество используемых морул Количество агрегированных с ЭСК морул Количество химерных бластоцист

"Простой сэндвич" "СЛОЖНЫЙ сэндвич" 16 60 14 58 14 24

Из 38 бластоцист, перенесенных в рога матки синхронизированных реципиентов родилось 8 мышат (2195), которые были жизнеспособными и развивались во взрослых животных. Получено химерное потомство с частотой рождения химерных животных 25%. Из 8 родившихся мышат 2-е были химерными . Степень химеризма оказалась разной. Самка имела около 5% окраски агути, в то время как самец имел 25-ЗОЖ,

2.6. Генетическая трансформация эмбриональных стволовых клеток

мыши.

Для переноса экзогенной ДНК в ЭСК мыши обычно используют те же методы, что и для перевиваемых линий клеток млекопитающих. Следует отметить, что технология гомологичной рекомбинации , которую применяют для генного таргетинга в ЭСК, предъявляет особые требования к способу трансфекции . Во-первых, поскольку явление гомологичной рекомбинации довольно редкое событие , важна высокая эффективность метода. Во-вторых, способ введения молекул экзогенных ДНК не должен индуцировать дифферендаровку ЭСК.

2.6.1. Введение гена lacZ Е. coli в мьшиные ЭСК линии ДЗ элект-ропорацией.

Были подобраны оптимальные условия для введения молекул экзогенной ДНК в ЭСК мыши линии D3 электропорацией. Использовали плазми-ду pCMVlacZ . Трансфекцию проводили двумя методами: кальций-фосфатным и электропорацией. В таблице 9 приведены результаты анализа влияния некоторых параметров электропорации на жизнеспособность ЭСК. линии ДЗ и эффективность временной экспрессии гена lacZ E.coli в них.

Таблица 9

Эффективность трансфекции и жизнеспособности эск мыши линии ДЗ при различных условиях электропорации

Условия Кол-во клеток. Кол-во клеток.

с бета-галактоз. выживших после

<%) трансфекции (Ж)

Фосфатно-солевой

буфер (ФСБ)

250 В. 500МКФ 19 67

300 В, 500мкФ 21 61

350 В, 500МКФ 28 52

ДМЕМ

250 В. 500МКФ 27 82

300 В, 500мкФ 35 78

350 В, 500мкФ 38 69

Наилучше результаты были получены при электропорации клеток в среде ДМЕМ при кратковременном воздействии электрического тока с параметрами: 300 В и 500 мкФ. Продукция прокариотаческой бета-галакто-зидазы выявлялась у 3535 клеток и при этом погибало 22 % клеток.

При использовании кальций-фосфатной методики трансфекции экспрессия гена lacZ Е. colt обнаруживалась у 0,1-3% от общего количества ЭСК, применяемых в опыте. Сравнительный анализ эффективности двух методов трансфекции в системе временной экспрессии гена lacZ в ЭСК линии ДЗ выявил преимущество элетропорации.

2.6,2. Получение генетически маркированных ЭСК мыши.

В ЭСК линии ДЗ электропорацией вводили линейные формы плазмид pRSVlacZ или pPGKlacZ . которые смешивали с ДНК вектора pSV2neo. Котрансфекции выполняли электропорацией. В качестве фидерного слоя использовали генетически трансформированные фибробласты мыши ST0 с фенотипом (Neo+], В результате была получена серия трансформантов ЭСК с фенотипом [ííeo+] с частотой трансформации 1 колония на 104 использованных в эксперименте клеток. Для анализа экспрессии гена lacZ отбирали по 100 клонов из каждой серии трансформантов . Результаты представлены в табл. 10.

Для оценки степени сохранности эмбрионального фенотипа ЭСК в культуре после перенесенных манипуляций часть чашек с клонами ЭСК, резистентными к генетицину, фиксировали и окрашивали на наличие щелочной фосфатазы и эмбрионального антигена SSEA-1. Параллельно проводили морфологическую оценку колоний. В результате было проанализировано 100 клонов . В 21 (21 X) из исследованных клонов отмечены признаки дифференцировки . Большая часть клонов (79 Ж) ЭСК резистентных к генетицину сохраняла свой эмбриональный фенотип после перенесенных манипуляций. Отсутствие признаков морфологической диффе-

ренцировки сопровождалось активностью щелочной фосфотазы и наличием эмбрионального антигена мши ЗЗЕА-1 . Таким образом мы получили ге-нетически-трансформированные ЭСК, устойчивые к генетицину , продуцирующие бета-галактозидазу (Рис, 3) и сохранившие свой эмбриональный фенотип, что, возможно, позволит изучить судьбу маркированных ЭСК в нормальном эмбрионе.

Рис.3. Эмбриональные стволовые клетки мыши линии ДЗ. с фенотипом Кео+, продуцирующие бета-галактозидазу.

Таблица 10

Эффективность экспрессии гена lacZ Е. сои., находящегося под контролем разных промоторов в ЭСК мыши линии дз

Показатели Вектор

pRSVlacZ pPGKlacZ

Временная экспрессия гена lacZ (количество клеток с бета-галактозидазой, SS) Получено клонов с фенотипом [Neo*] Из них проанализировано на экспрессию гена tacz Получено- клонов, положительных по бета-галактозидазе 23 300; 597: 284 100 14 27 486; 203; 259 100 38

2.7. Получение и характеристика эмбриональных стволовых клеток кролика.

Выбор животного был обусловлен несколькими причинами. Во-пер-

вых. кролик - домашнее животное, которое разводят по экономическим причинам. Во-вторых, это удобное модельное животное с хорошо отработанными условиями суперовуляции tKennely,65] и коротким периодом сукрольности (31 сут). В начале наших исследований в литературе отсутствовали данные о получении ЭСК кролика. Поэтому наша работа носила поисковый характер.

2.7.1, Выделение эмбриональных стволовых клеток кролика.

Сравнивали два способа получения ЭСК из предымплантационных эмбрионов кролика. В первом варианте бластоцисты кролика культивировали в капле ростовой среды ( ДМЕМ с 10%-ми ФСК) под парафиновым маслом в течение 36-48 ч до стадии вылупленил. Клетки вылупившихся бластоцист разобщали (раствор трипсин/ЭДТА) и диссоциированные клетки переносили на фидерные слои, представленные КЭФ или МЭФ. Во втором варианте кроличьи бластоцисты, с удаленной прозрачной зоной пел-люцида. культивировали на фидерном слое до их прикрепления клетками трофэктодермы к субстрату и визуализации клеток зародышевого узелка в течение 5-7 сут,. Затем клетки эмбриобласта механически отделяли соскребанием и также разобщали. Клеточную суспензию переносили в чашки с фидерными слоями. Разобщенные клетки культивировали в среде ДМЕМ, дополненной 15% ФСК. 2 мМ альфа-глутамином, 10'* мМ 2-меркапто-этанолом, 1х раствором несущественных аминокислот и гентамицином (50 мкг/мл).

Результаты анализа показали, что более эффективным для получения клонов с ЭС-подобной морфологией оказалась диссоциация клеток вылупившихся бластоцист. Из 34 контрольных эмбрионов 16 достигли 1-го пассажа и было получено 5 клеточных линий с ЭС-подобной морфологией. Во втором варианте при использовании 27 контрольных эмбрионов только 7 достигли 1-го пассажа и была получена одна клеточная линия с подобной морфологией.

Попытка экстраполировать технику выделения клеток ВКМ у эмбрионов мышей для изоляции клеток эмбриобласта у зародышей кролика оказалась неудачной. Клетки ВКМ эмбриона кролика растут не гроздью, а представлены упорядоченной группой маленьких плотно упакованных клеток , которые хорошо видны в центре клеток эмбрионального разрастания. Эти клетки оказались очень хрупкими и чувствительными. Соскабливание их с последующей дезагрегацией приводило к большой потере . что , частично, могло объяснить полученные нами результаты , Чтобы ответить на вопрос . связана ли эффективность получения ЭСК кролика непосредственно с техникой выделения клеток эмбриобласта, или же с продолжительностью культивирования бластоцист tn vitro, мы изменили методику во втором варианте. Бластоцисты кролика, с удаленной зоной

пеллюцида, переносили каждую отдельно в 96-луночные планшеты с фидерными слоями. Прикрепившиеся к фидеру эмбрионы культивировали в основной среде в течение 5-7 сут. Затем среду осторожно удаляли и содержимое каждой лунки разбивали с помощью раствора трипсин/ЭДТА до однородной клеточной суспензии ротовой пипеткой (¿1-20-30 мкм) с оплавленным кончиком. Клеточную суспензию переносили в новые чашки Петри (4-х луночные. с1-1см) с фидерными слоями. В результате из 30-ти используемых в эксперименте бластоцист 8 достигли 1-го пассажа и была выделена одна клеточная линия с ЭОподобной морфологией. Из полученных результатов можно предположить, что возраст культуры кроличьих бластоцист играет, неизвестную пока нам, роль в выделении ЭСК кролика.

2.7.2. Характеристика ЭС-подобных клеток кролика в культуре. Индукция к днфференцировке.

На 7-9 сут наблюдали клеточные клоны с различной морфологией. Выделялись клоны, представленные компактными маленькими клетками с округлым , крупным ядром и небольшой, почти незаметной цитоплазмой. Различить отдельные компоненты таких клеток было трудно. Некоторые клетки легче всего увидеть у краев клонов . По своей морфологии клетки напоминали мышиные ЭСК , однако, в отличие от них росли медленнее (интервал пассирования 4-5 сут). Клетки проявляли фидерзави-симость. Мы назвали их ЭС-подобные (Рис. 4). При удалении фидерного слоя и пассировании ЭС-подобных клеток кролика в высокой плотности наблюдали формирование клеточных агрегатов - ЭТ (Рис. 5).

Рис.4. Колония клеток кролика с ЭС-подобной морфологией.

Рис.5. Индукция к дифференцировке ЭС-подобных клеток кролика с образованием эмбриоидных тел (ЭТ на 5 сут культивирования).

Мы не смогли достоверно подтвердить тотипотентные свойства полученных нами из эмбрионов крольчих ЭС-подобных клеток, поскольку в наших экспериментах не было возможности получить химерных животных. Однако ряд характеристик ЭС-подобных клеток кролика позволяют нам предположить, что выделенные клеточные клоны имеют эмбриональный фенотип . Кроме того, некоторые авторы высказывают мнение, что способность ЭСК образовывать ЭТ в культуре является подтверждением их то-типотенгности [Evans,1990].

2.8. Использование соматических клеток , выделенных из репродуктивного тракта животных для хо-культивировання ооцитов коров, оплодотворенных in vitro.

В настоящее время разработаны методы, позволяющие выделять из яичников коров ооциты, культивировать их и оплодотворять вне организма. Конечной целью экстрапорального оплодотворения ооцитов коров является получение биологически полноценных эмбрионов, в данной области работа ведутся в двух направлениях, одним из которых является применение монослоев соматических клеток для совместного культивирования. Несмотря на существенные результаты достигнутые в работах, посвященных этим проблемам, нужно констатировать, что до сих нор не найдены оптимальные условия для успешного созревания, оплодотворения ооцитов коров in vitro и культивирования полученных эмбрионов.

2.6.1. Степень влияния клеток гранулезы на созреваяие и оплодотворение ооцитов коров в культуре.

Изучали влияние клеток гранулезы на созревании и экстрапораль-

ное оплодотворение ооцитов коров. Для этого были созданы две экспериментальные группы (табл.11).

Таблица 11

Влияние клеток гранулезы на созревание и оплодотворяемость ооцитов коров в культуре

Показатели МПМ+20% эстральной сыворотки+ФСГ

клетки гранулезы контроль (без кл.)

Использовано ооцитов (п) Достигли стадии метафа-зы II (п-%) Получено зигот (п-%) Получено эмбрионов (п-%): 2-бластомерных 3-4-Сластомерных 6-8-бластомерных до 16-бластомеров 473 451-95,3 387-85, 8 40-10, 3 115-29,7 232-59, 9 230 172-74,8 62-36,0 16-25,8 10-16.1 2-3,2 1-1,6

Как видно из результатов, приведенных в табл. 11, наилучшие результаты по созреванию ооцитов (95,32) были получены при культивировании на монослоях , представленных клетками гранулезы. Уровень оп-лодотворяемости также был выше в этой экспериментальной группе и превышал контрольную на 49,8ЯЕ. Выход ранних эмбрионов до стадии дробления 6-8 бластомеров превосходил уровень контрольной группы на 56.7S, однако до стадии 16-ти бластомеров эмбрионы не развивались. Можно предположить, что клетки гранулезы влияют на уровень зрелости ооплазмы. Однако для преодоления блока в развитии эмбрионов, полученных In vitro, требуются , вероятно, какие-то дополнительные субстанции.

2.8.2. Влияние монослоев эпителиальных клеток яйцеводов коров и кроликов на развитие ранних эмбрионов коров, полученных in vitro.

Известно, что эмбрионы крупного рогатого скота, полученные in vitro останавливаются в развитии на 8-16 клеточной стадии развития . Однако при культивировании таких эмбрионов на монослоях эпителиальных клеток, выделенных из яйцевода коров, они развивались до стадии поздней морулы или бластоцисты [Ellington et al.,19901. Литературные данные о видоспецифическом влиянии клеток репродуктивного тракта на развитие ранних эмбрионов коров противоречивы. Представляло интерес определить степень влияния первичных эпителиальных клеток яйцевода разных видов млекопитающих (коров и крольчих) на развитие ранних эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro. Для этого ооциты коров, оплодотворенные экстрапорально переносили в культу-ральные 4-х луночные чашки (Nunc) с приготовленными заранее фидерными слоями, которые были представлены эпителиальными клетками яйцево-

да коров и крольчих. В качестве контроля часть оплодотворенных ооци-тов коров продолжали культивировать в среде Паркера (МПА). дополненной 20% эстральной сыворотки.

Таблица 12

Сравнительный анализ эффективности культивирования экстрапо-рально оплодотворенных ооцитов коров на различных монослоях соматических клеток

Условия Кол-во ооцитов п Степень дробления и развития ( % )

Дегенер. 165-172 часа 2-16 клеточн. Морула

Контроль 88 30,7 54,6 14,7

МПА+203! эстрал.

сыворотки

Монослой эпите-

лиальных клеток 68 29,4 48,5 22,1

яйцевода коров

Монослой эпите-

лиальных клеток 52 26,9 50,0 23,1

яйцевода крольчих

Анализ результатов проведенных экспериментов не выявил видоспе-цифической зависимости между степенью дробления эмбрионов и используемым монослоем эпителиальных клеток яйцевода. Можно предположить, что факторы, необходимые для развития экстрапорально полученных эмбрионов коров, не являются строго видоспецифическими. Полученные нами результаты показывают, что первичные эпителиальные клетки, выделенные. как из яйцевода коров, так и крольчих, могут быть полезными для культивирования ранних эмбрионов крупного рогатого скота, полученных in vitro.

вывода

1. Анализ компетентности мутантных штаммов клеток сельскохозяйственных животных (СПЭВ ТК~ и TP ГФРТ") к поглощению и экспрессии молекул экзогенных ДНК показал, что клетвд трех мутантных клонов, из 19 исследованных, проявляют высокую чувствительность к трансфецируе-мым ДНК плазнид. Максимальная частота трансформации (2-6-10"3) превышает таковую для большинства изученных клеточных линий.

2. Клетки 37 клонов-трансформантов СПЭВ ТО* продуцируют HBsAg в количестве 0,4 нг до 5,12 мкг/106 клет. сут. максимальная специфическая активность секретируемого HBsAg характеризовалась титром 1:512-1:256 в РПГА. Стабильную экспрессию вирусного гена сохраняли 15 клонов-трансформантов в течение 2,5 месяцев непрерывного культивирования.

3. Показано увеличение продукции HBsAg (промотор LTR) после обработки глюкокортикоидными гормонами (дексаметазон и гидрокортизон) в 3-4 раза. Такое же воздействие оказывала обработка клеток, экс-преосирующих ген S ВГБ под контролем промотора гена mt-1 мыши, солями кадмия.

4. Сравнительный анализ экспрессии гена S ВГБ в генетически трансформированных клетках почки эмбриона свиньи и в культуре клеток гепатокарциномы человека PLC/PRF-5, содержащих интегрированный геном ВГВ показал, что по числу клеток, синтезирующих HBsAg, а также по активности секретируемого HBsAg, клетки клонов-трансформантов превосходят клетки гепатокарциномы .

5. Впервые выявлена роль дифференцировки гепатоцитов в регуляции экспрессии поверхностного (S) и корового (С) генов ВГБ в высоко-дифференцированных и низкодифференцированных клонах гепатокарциномы PLC/PRF-5. Показано, что в клетках мутантных клонов гепатокарциномы PLC/PRF-5. характеризующихся высокой степенью дифференцировки (по скорости и характеру роста, экспрессии альфа-фетопротеина и способности к образованию опухолей у бестимусных мышей) усиливается экспрессия гена S в 100-1000 раз и наблюдается индукция гена С ВГБ,

6. в системе генетически трансформированных клеток протестированы и охарактеризованы рекомбинантные конструкции: pRPAS. pMSHB5. pSVZneo, pSV2neoABB, pRSVlacZ. и pCMVlacZ и pPGKlacZ .

а) Впервые продемонстрировано, что сконструированный рекомби-нантный ген , представляющий собой двухдоменную последовательность, б7-конец которого кодирует часть структурного гена VP1 вируса гепатита А человека , а 3/-конец - полный ген-S поверхностного антигена вируса гепатита Б человека , поставленный под контроль промотора LTR ВСР, экспрессируется в клетках линии СПЭВ ТК+ в виде секретируемой надмолекулярной структуры со свойствами 20 нм частиц HBsAg.

б) Анализ эффективности промоторов гена mt-i мыши и LTR ВСР в плазмидах pRPAS-27 и pMSHB5 показал, что эти промоторы обеспечивают конститутивную и индуцибельную экспрессию гена S ВГБ в генетически трансформированных клетках СПЭВ. Установлено, что более высокую и стабильную продукцию HBsAg в исследуемых клетках обеспечивает промотор LTR ВСР.

в) Установлено, что плазмида pSV2neoABB (со вставкой рибосомных повторов-р/ШВ) в 2 раза эффективнее плазмиды pSV2neo для получения генетически трансформированных клеток сельскохозяйственных животных с фенотипом Neo*. Показана возможность усиления экспрессии гена neo за счет вставки в вектор фрагмента рибосомальной 28S ДНК человека (рЛВВ).

7. Разработан и предложен новый механический метод трансфекции культур клеток СПЭВ и FBT . который превосходит кальций-фосфатный способ по количеству клеток, продуцирующих чужеродный белок в среднем в 30-50 раз.

8. Показана возможность поддержания и сохранения эмбрионального фенотипа ЭСК мыши линии ЛЗ (мутантный клон RK23) при длительном культивировании (17 пассажей). Посредством агрегации ЭСК с морулами мыши получено химерное потомство с частотой рождения химерных животных 25% и степенью химеризма 5-305!.

9. С помощью электропорации получены клоны ЭСК мыши линии ДЗ с фенотипом INeo*]. в которых выявлена продукция репортерного гена tacZ Е. соЦ . После трансфекции электропорацией 79% генетически маркированных клонов ЭСК сохраняли свой эмбриональный фенотип.

10. Впервые выявлено влияние возраста культуры бластоцист на эффективность получения ЭСК кролика. Установлено, что более эффективным методом для получения ЭСК кролика является диссоциация клеток вылупившихся эмбрионов.

11. Охарактеризованы клеточные линии кролика с ЭС-подобной морфологией, которые сохраняли свой эмбриональный фенотип при культивировании на фидерных слоях в течении 4 пассажей, а при индукции к дифференцировке в культуре образовывали эмбриоидные тела.

12. Показан^ . что культура клеток гранулезы способствует улучшению условий созревания ооцитов коров in vitro и увеличивает выход оплодотворенных экстрапорально ооцитов коров на 49,8 % по сравнению с контролем .

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Изданы методические рекомендации по введению экзогенной ДНК в клетки млекопитающих, культивируемые in vitro , Дубровицы, 1994, 9с.. Утверждены Ученым Советом ВИЖа. Протокол N26 от 25 ноября 1993 г..

2. Рекомендуем использовать мутантные штаммы клеток сельскохозяйственных животных СПЭВ ТК" и TP ГФРТ" для генноинженерных работ в биотехнологии.

3. Генетически трансформированные клетки сельскохозяйственных животных в культуре можно использовать в качестве продуцентов чужеродного белка.

4. Предложен новый, более простой и эффективный (превосходящий в системе временной экспрессии трансгена кальций-фосфатный способ в среднем в 30-50 раз) метод введения экзогенных ДНК плазмид в культуру клеток сельскохозяйственных животных СПЭВ и ТР.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Савченкова И.П., Тугизов Ш.М.. Анализ компетентности клеток млекопитающих к поглощению и экспрессии трансфецируемых генов// Тезисы докладов. Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии, - М, - 1991,- С. 169.

2. Тугизов Ш. М., Савченкова И.П., Грабовская И.Л., Эрайзер Т.Л., Кущ A.A.. Связь степени дифференцировки клеток гепатокарциномы человека с экспрессией интегрированных генов вируса гепатита В// Тезисы докладов. Теоретические и прикладные аспекты молекулярной биологии.- И,- 1991.- С. 195,

3. Савченкова И.П.. Изучение экспрессии гена S ВГБ в клетках почки эмбриона свиньи и в культуре клеток гепатокарциномы человека PLC/PRF-5// Сборник науч. работ - ВИЖ. - 1992.- вып. 106. - С. 94-98.

4. Тугизов HI, М.. Савченкова и. П.. грабовская И. Л., Кущ A.A.. Изменение экспрессии генов вируса гепатита Б в клетках гепатокарциномы человека PLC/PRF-5 в процессе приобретения ими лекарственной устойчивости// Вопросы вирусологии.- 1992.- Т.34. - N5/6.- С.238-241.

5. Филатов Ф.П., Тугизов HI.М.. Савченкова И.П., Кумарев В. П., Беликов Ф.С.. Кадошников ¡0. П., Кущ A.A., Урываев Л. В.. Рекомбинант-ный поверхностный белок вируса гепатита Б, экспонирующий иммунодоми-нанту мембранного белка вируса ВИЧ1// ДАН - 1992.- Т.327.- N1.-С. 172-175.

6. Tugizov Sh.M, savchenkova LP.. Grabovskaya I.L., Mak.arova N. E.. Eralzer T.L., Revazova E. P. and Kushch A.A. Ciianges In expression of surface and core antigens of hepatitis В virus in different mutant clones of hepatoma PLC/PRF-5 cells// Virus Research . - 1993.- V. 30,- ИЗ. - P. 189-203,

7. Савченкова И.П., Сергеев Н.И.. Тестирование генных конструкций в культуре клеток млекопитающих in vitro// Тезисы докладов 1-й международной конференции по молекулярно-генетическим маркерам.- Киев- 1994.- С. 62.

8. Савченкова И.П., Сергеев Н.И.. Получение плюрипотентных эмбриональных клеточных колоний из бластошст кролика// Тезисы докладов. Новые направления биотехнологии.- Пущино.- 1994,- С.143.

9. Савченкова И.П., Сергеев Н.И.. Экспрессия гена lac-Z E.colt в культуре клеток сельскохозяйственных животных// Тезисы докладов. Новые направления биотехнологии,- Пущино,- 1994.- С.144.

10. Савченкова И.П., Сергеев Н.И., Шихов И.Я., Айтбаев Н.Е.. Методические рекомендации по введению экзогенной днк s клетки млекопитающих культивируемые In vitro // Дубровицы.- 1994.- 9с.

11. Савченкова И.П., Сергеев Н.И., Айтбаев Н.Е.. Сравнительный анализ развития предымплантационных эмбрионов кролика на различных монослоях клеток// Цитология. - 1994.- Т. 36.- N9/10.- С. 955-958.

12. Савченкова И.П., Сергеев Н.И.. способ введения экзогенной ДНК в клетки млекопитающих культивируемые In vitro// Заявка на изобретение N 93038111, приоритет от 26 июля 1993 года. Решение о выдаче патента от 10.03.95 г.

13. Савченкова К.П., Сергеев H.H.. Введение экзогенной ДНК плазмид в культуру клеток сельскохозяйственных животных// Доклады РАСХН. - 1994.- N6. - С. 26-28.

14. Savchenkova I., SergeyevN,, Bulla J., Brem G.. Derivation of embryonic stem (ES) cell like cells from rabbit blastocysts// The 1995 Annual Meeting of Europen Embryo Transfer Association (A.E.T.E.).- Hannover. - September 1995.- P. 238.

15. Savchenkova I., Taradajnik T., Slrotkln A,, Bulla J. The use of mamma11as oviduct cells for the culture of bovine embryos produced in vitro// J. Farm. Anim. Scl.- 1995.- V.28.- P. 197-200.

16. Чичилов А.в, Шихов И.я., Айтбаев н.. Савченкова И.П., Попов А.Н.. Трансформация клеток рекомбинантной плазмидой pSV2neo с фрагментом рибосомальной ДНК // Сборник науч. трудов.- Генноинженерные сельскохозяйственные животные. - 1995.- Т. 1,- С. 395-399.

17. Савченкова И. П.. Зиновьева H.A., Булла Й., Брэм Г., Эмбриональные стволовые клетки, их генетическое изменение путем гомологичной рекомбинации и использование в получении трансгенных животных// Успехи совр. биологии." 1996.- Т.116,- N.1.- С.78-92.

18. Савченкова И,, Фляйшманн М., Булла Й.. Врэм Г.. Использование эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши для получения химерных животных// Цитология.- 1996.- Т.38.- N10.- С. 1118-1123.

19. Савченкова И.П., Фляйшманн М.. Неиньекционный способ получения химерных животных с использованием плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) мыши// Тезисы докладов. Международная конференция, посвященная памяти академика А.А. Баева.- Москва. -1996,- С, 61.

20. Савченкова И.П.. Введение гена lac-Z Е. coli в эмбриональные стволовые клетки мыши D3 электропорацией// Докл. РАСХН,- 1996.-N.6.- С.36-37.

21. Савченкова И.П., Чичилов А.В., Попов А.Н., Сергеев Н.И.. Шихов И.Я.. Сравнительный анализ эффективности векторов pSV2neo и pSV2neoAAB для генетической трансформации клеток млекопитающих// Сборник науч. трудов международной научно-практической конференции (6-8 июня 1996г): Актуальные проблемы интенсивного развития животноводства,- Горки,- 1996,- С. 224-227.

Зак. [468

отпечатано в Щербинской типографии 113623, Москва, ул. Типографская, 10