Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Создание исходного селекционного материала люцерны и пшеницы, устойчивого к фузариозу, методом клеточной селекции

ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Создание исходного селекционного материала люцерны и пшеницы, устойчивого к фузариозу, методом клеточной селекции"

МОСКОВСКАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА И ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННАЯ АКАДЕМИЯ им. К. А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах рукописи МЕЗЕНЦЕВА Ольга Юрьевна

УДК 581.146.0

СОЗДАНИЕ ИСХОДНОГО СЕЛЕКЦИОННОГО МАТЕРИАЛА ЛЮЦЕРНЫ И ПШЕНИЦЫ, УСТОЙЧИВОГО К ФУЗАРИЮЗУ, МЕТОДОМ КЛЕТОЧНОЙ СЕЛЕКЦИИ

03.00.23 — биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

МОСКВА 1992

Работа выполнена на кафедре сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Научный руководитель—академик РАСХН, доктор с.-х. наук, профессор В. С. Шевелуха.

Официальные оппоненты: доктор биол. наук 3. Б. Шамина, канд. биол. наук Л. М. Хромова.

Ведущее учреждение—Научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии.

Защита состоится 6 июля 1992 г. на заседании специализированного ученого совета Д. 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева. с ¿О

Адрес: 127550, г. Москва, ул. Тимирязевская, д. 49, сектор защиты диссертаций.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА.

Автореферат разослан « . М^^^ . . . 1992 г.

Ученый секретарь специализированного совета— кандидат биологических наук

А. С. Лосева

-к-iX

1БЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

'"Актуальность проблемы.

Получение высоких урожаев зерновых и кормовых культур невозможно без долговременной устойчивости сортов к фитопатогенам. Для ускоренного создания ценного селекционного материала наиболее перспективен отбор резистентных форм в культуре клеток и тканей. Эффективность клеточной селекции повидается в тысячи раз по сравнению с традиционными методами, так как позволяет манипулировать с многомиллионными популяциями клеток, отбирать устойчивые и регенерировать из них растения. Осуществление направленнрго отбора в строго контролируемых условиях (in vitro ) дает возможность изучать небольшие количественные различия в полигенно наследуемой горизонтальной или общей устойчивости.

Проблема защиты от фузариоза - одна из наиболее актуальных во всех регионах возделывания пшеницы и люцерны. Это обусловлено сильной вредоносностью патогена, его широкой специализацией, экологической пластичностью, большим'разнообразием видов рода Fu-sariun Lfc способностью быстро образовывать новые агрессивные расы.

Возможность отбора in vitro устойчивых к фузариозу форм люцерны с использованием в качестве исходного материала клонов с высоким регенерационным потенциалом была установлена в работах американских ( Uartmaa et al IS84-) и итальянских ученых ( Аг-cioni et al 1987). Отбор осуществлялся на уровне каллусов, а в качестве селективного агента был использован культуралышй фильтрат гриба Fusaxiua oxysporum . Имеются также сведения по отбору клеточных линий, устойчивых к культурельному фильтрату гриба и регенерации из них растений ( Biaarova et al., IS90).

Однако, анализ других работ в этой нетрадиционной области селекции растений показал-, что наиболее эффективен отбор in vitro лишь в том случае, если в качестве селективного (¡актора используется химически определенный токсин или его аналог, а в качестве материала исследований - клеточные суспензионные культ^^ЭОа люцерна эта .Схема селекции in vitro до сих пор не испытывалась.

' Сведения по отбору в культуре клеток пшеницы устойчивых к фузарй09у,растений в научно-технической и патентной литературе таете, отсутствуют.

. Цель и задачи исследований.

' Цель настоящей работы - создание исходного материала люцерны и пшеницы, устойчивого к фузариозу, методами клеточной селекции.

В связи с этим в задачу наших исследований входило:

1. Усовершенствовать методику получения раотений-регенеран-тов люцерны при образовании КСХ непосредственно из эксплан'тов-отрсзков стеблей.

2. Отработать методику получения.растеннй-регенерантов пшеницы при образовании КСК из незрелых соцветий и отбор генотипов с хорошей регенерационной способностью.

3. Изучить влияние фузариевой кислоты и ферментов на клеточные и каллуенне культуры люцерны.

Ц. Изучить влияние фузариевой кислоты и ферментов на каллус-ные культуры пшеницы.

5. Выявить оптимальные селективные условия для отбора клеточных и каллусных линий с комплексной устойчивостью к фузариозу.

6. Изучить сомаклональную вариабельность признаков растений-регенерантов, полученных из отобранных линий.

7. Провести сравнительное изучение .устойчивости и фузариозу растений люцерны и пшеницы, полученных из клеточных ли1чШ, культивируемых в селективных и обычных условиях.

8. Усовершенствовать метода оценки отобранного материала л культуре in vitro.

Научноя новизна. Отработаны эффективные способы получения, культивирования и регенерации растений люцерны и пшеницы с использованием клеточных суспензионных культур, полученных непосредственно из тканей зкеплантоз. Предложена принципиально новая система отбора in vitro растений, устойчивых к фузариозу с использованием в качестве селективных (¿акторов пек™о- и целлюлолити-ческих ферментов совместно с фузариевой кислотой. Впервые разработан способ оценки растений на устойчивость к фузариозу, позволяющий вести отбор наиболее устойчивых генотипов на ранних этапах селекции. Способ защищен авторским свидетельством.

Практическая ценность и реализация результатов. Разработанные методы клеточной селекции люцерны и пшеницы позволяют существенно ускорить процесс отбора in vitro устойчивых к фузариозу (i'opf.: за счет сокращения традиционных этапов получения первичного каллуса. Эффективность клеточной селекции повышается в результате введения з культуру одновременно большого количества генотипов и быстрого получения гетерогенных популяций.

' В результате клеточной селекции получено. 8 запшй люцерны, устойчизкх к виду F. oxysporum и 2 линии, устойчивые к нескольким вида;,! Фузариев - oxyoporum, F. avsnaccum, F. sarabuoicun, F. culmoruia, F.Javaniciun, F.solani, F. redolenn. Отсолектц-

ро;2з:ю по одной клеточной линии, устойчивой к виду Р. охуаролла у соугоз пшенпцк Зыряновкаи Омская 19. Всего получено

18 клонов растений - регенератов сорта Зыряновка, 15 - сорта Омская 19. С устойчивостью к двум видам фузариев отобрана одна линия у сорта Омская 19 и две линии сорта Зыряновка. Всего получено 23 клона растений - регенерантов сорта Омская 19 и 18 - сорта Зыряновка.

Наряду с признаком устойчивости к фузариозу отселектирован-ные линии пшеницы обладали также высоким морфогенетическим и ре-генерациок„ым потенциалом.

Полученный материал перспективен для дальнейшей селекции при создании устойчивых к фузариозу сортов.

Разработанный универсальный способ оценки растений на устойчивость к фузариозу используется в лаборатории иммунитета ВНИИ кормов на ранних этапах иммунологической 'оценки при отбора устойчивых к фузариозу растений клевера лугового.

Апробация работы. Основные результаты исследований были доложены на научно-практической кййференции "Ученые Нечерноземья -развитию сельского хозяйства зоны" (Йемчиновка, 1991), на Всесоюзной научной конференции молодых ученых и аспирантов по актуальным проблемам интенсификации кормопроизводства (Москва, 1991), на научном сзминаре кафедры с/х биотехнологии ТСХА. (Москва, 1991).

/

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5" научных работ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания примененных методов и эксперименталь-■ных глав, заключения, :выводов, списка литературы, включающего 249 наименований, в том числе 127 иностранных, и приложения. Работа изложена на страницах.машинописи, содержит 25 таблиц

и иллюстрирована 29 рисунками.

ОБШШ К !.!ЕТОД.1 ИССЛЕДОВАНИЙ

Исходным материалом слукили 32-хромосомные растения клона P5't- сорта Дединолская люцерны северной ( Medicnco boroalis GrosnhJ, обладающего вискоим регонерационньш потенциалом и 8 сортов провой пшеницы: Московская 35, Ангара 86, Диане 3, Омская 19, Зыряновка, Энита, Академия, Highbury . Источником для получения клеточных суспензионных культур (КСК) и первичного каллуса у люцерны слукили сегменты растущей части стеблей, у пшеницы -незрелые соцветия. Индукции каллусогенеза у экснлантов люцерны осуществляли на агаризованной среде ИВ^ (Мезенцев, 1980), а эмбриогенеза - путей добавления в среду ЕЛП в концентрации 0,2 мг/л. Дальнейшую регенерацию растений проводили культивируя эмбриоген-ную ткань на безгормональной среде о уменьшенным вдвое содержанием всех основных компонентов.

Клеточные суспензионные культуры люцерны получали двумя способами: I) помещая первичные каллусы в жидкую среду MS и 2) помещая в ту же среду сегменты растущей части стеблей. Зо втором случае каллусообразование индуцировали непосредственно в жидкой среде, содержащей повышенное количество ауксина (б мг/л 2,4-Д). Образование эмбриоидов в обоих случаях осуцестзляли путем пятикратного уменьшения концентрации фитогормонов в среде.

Каллусные культуры пшеницы получали по способу, описанному в работе Нэддока и др. ( Maddock et al., 1983).

Клеточные суспензионные культуры пшеницы получали, помещая первичный каллус или сегменты незрелых соцветий в якдкую среду lis, содержащую в качестве ауксинэ - дпкамбу в концентрации

h мг/л, а токмо аминокислоты - Ь-пролпн, Ь-аспор-.гин и Ь-

- f -

глютамин. В среде повышали содержание хелата гселеза и сахарозы. На этапах получения эмбриогеиного каллуса и развития омбриоидов и побегов использовали кинетин,. НУК, а такие витамины по Ногп 91; а1. (1983).

Для клеточной селекции на устойчивость к' фузариозу использовали суспензионные культуры 2-го и 3-го'циклов выращивания в середине экспоненциальной фазы роста. Селективную среду создавали на основе агаризованной среды шз, добавляя в нее после автокла-вирования фузариевую кислоту и ферменты, простерилизованные фильтрованием через бактериальный фильтр с диаметром пор 0,2 шт. Клеточные суспензионные культуры высевали на селективные среды методом плейтинга. С целью проверки стабильности полученных изменений и отбора наследуемых мутаций клеточные линии последовательно пассировали на селективной и обычной (контрольной) средах. Каждый цикл селекции включал '2-3 пассака на селективной и 2-3 пас-сана на контрольной средах. Вшившие в конце какдого цикла колонии клеток переносили на свежую среду. Отобранные линии помещали на среду для морфогенеза. Регенерацию осуществляли из клеток, способных развиваться на среде с сублеталыюй концентрацией токсинов.

Для изучения устойчивости растений - регенерантов к фузарио-зу использовали чистые культуры наиболее патогенных штаммов еле-, дуюцих видов фузариев: Р. охузрогша, г. avonaceum> К. си1аогши, Р. затЬисз-пит, К. хейо1епа, Р. ¡)ауап1сит, Р. во1ап1, г. grami- .. пеагит. Инокулюм для создания искусственного инфекционного'фона готовили путем размножения чистой культуры фузариев на зернах овса; культуральный фильтрат получали при глубинном выращивании фузариев в жидкой среде Чапека. Споровую суспензию патогенных штаммов готовили по методу, описанному в Методах экспериментальной

микологии (1982).

Устойчивость растений-регенерантов в поколениях Н0 I: н^ оценивали методом увядания изолированных частей растения.в натив-ном фильтрате культуральной кидкости патогена и по степени мацерации тканей корня под действием пекто- и целлюлолитичеоких ферментов.

Сравнительную характеристику полученного признака у растений-регенерантов люцерны, исходного клона Р54 и сорта Северная гибридная проводили при хроматографическом анализе метенольннх экстрактов стеблей и корней растений.

Окончательную оценку полученных форм проводили в вегетационных сосудах в полевых условиях на жестком искусственном инфекционном фоне. Контролем служили неинокулированные растения, а также рэстения-регенеранты, полученные без предварительного отбора в селективных условиях на уровне клеток и каллусов.

Сонаклональиую вариабельность признаков растений-регенерантов люцерны и пшеницы изучали в условиях теплицы. На протяжении всего периода вегетации учитывались следующие показатели: у растений люцерны - высота растений, число стеблей, количество и форма листочков в листе, морфология цветка, тип корневой системы, наличие граней на стебле, сырая и сухая масса растений; у пшеницы -. высота растений, число стеблей, в том числе продуктивных, число и длина мендоузлий, длина и форма колоса, длина флагового листа, число колосков в колосе, число и пасса зерен в колосе, мясса 1000 зерен.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Регенерация растении люцерны и пшеницы. Листовые экспланты

люцерны, помеченные на среду для каллусогенеза, в течение первой -»

недели сохранялись зелеными, а затем приобретали светло-зеленый оттенок, что связано-с деструкцией хлоропластов. Через 3 недели инкубации не менео 8Ъ% листовых эксплантов образовали каллусы со средней массой около 500 мг.

Все полученные первичные каллусы имели желеобразную консистенцию, цвет их варьировал от светло-желтого и белого до свотло-салатового. В дальнейшем, при неоднократном пассировании каллусов обнаружилась их дифференциация но морфологически}.! признакам на 2 типа: каллусы желеобразной консистенции, сильно обводненные, в основном желтого цвета и более плотные: менее обводненные, от светло-салатового до темно-зеленого цвета.

Частота каллусообразовання у эксплантов пшеницы варьировала по сортам.

Помещение первичных каллусов люцерны в жидкую питательную среду и культивирование л условиях непрерывного встряхивания приводило к образовании более или менее агрегированных клеточных суспензий.

Рыхлые каллусы' быстро дезинтегрировались на отдельные клетки и небольшие клеточные агрегаты и уже к концу первой недели культивирования образовывали клеточную суспензию, состоящую на 60^ пз отдельных клеток и 8-16 клеточных агрегаюв. От солее плотных каллусов были получены более агрегированные суспензии, состояние на 65% пз многоклеточных, преимущественно 16-32 и болео клетофмх агрегатов. Образовавшиеся популяции быстро размножались., и через 2-3 недели кх численность (плотность) достигала 400-^50 тис. клеток/ил суспензия.

'Непосредственное помещение сегментов молодых стеблей в кид-Чгую питательную среду существенно ускоряло получение клеточных

-л'-

суспензионных культур (КСК) высокой плотности, причем, они отличались от КСК, полученных традиционным путем, большей жизнеспособностью и меньшей агрегированностью.

Эти :;;е культуры более длительное время сохраняли регенераци-онньй потенциал и были более эффективны для клеточной селекции люцерны на устойчивость к фитопатогенам, КСК, полученные "пряным" путем, после субкулмивирования в среде цб с добавлением БАП (0,2 кг/л) и аминокислоты ъ -аспарагина (750 мг/л) образовали в массовом количество эмбриогенные структуры - до 250 шт/мл суспензии.

Полученные в суспензионных культурах эмбриоиды при помещении на среду для регенерации уже в конце первого пассона (3-4 недели) начинали дифференцироваться. Появлялись темно-зеленые почки, затем начинали расти корни, первый простой и тройчатые листья. При помещении дифференцированных клеток на среда с добавлением НУК-4 мг/л и кинетина - 2 мг/л начинала образовываться иорфогенная ткань, в которой появлялись иеристемные зоны, где формировались стеблевые почки и корневые апексы. При развитии растений по мери-стематическому типу первым появлялся тройчатый лист.

Таким образом, развитие растений - регенерантов люцерны из клеток суспензионных культур шло двумя путями: как через образование эмбриоидов, так и через образование меристемных зон. Встречались и смешанные типы развития.

При помещении в жидкую среду первичного каллуса пшеницы,, полученного при 3-4-х кратном пассировании эксплзптов-сегментов незрелых соцветий на агрегированной среде, через 1-2 месяца образовывались клеточные культуры плотность» 150-200 тис. клеток/мл суспензии. Па интенсивность роста КСК и степень их агрегировашшс-•ги еддгьос влшшпо оказывали гепотпппчсские особенности зкепдонтоз

(табл. I).

Таблица I

Влияние генотипа на пролиферацию КСК пшеницы

Агрегирован- Жизнеспо-ность, % собность,

С°Р1а до 16 16-32 * клеток клеток и более

Средняя плотность КСК в конце первого пассажа тыс.кл/ мл

Продолжительность периода образования КСК плотностью 150 тысл_кл/[мл__________

число суб- дни культивирований (пассажи)

Московская 35 42 ,2 57,8 79, ,3 но 2-3 42- -63

Энита 48 ,9 51,1 82, Л 122 2-3 42- -63

Академия 58 ,8 87, ,7 116 2-3 42- -63

Зыряновка 70 ,3 29,7 89 .3 205 I 21- -28

Омская 19 76 ,5 23,5 85 ,6 200. I 21- -28

Ангара 86 80 ,1 19,9 . 88 Л 180 I 21- -28

Диана 3 69 А 39,6 83 ,3 160 I 21- -28

Highbury ■ 60 ,3 39,7 74 ,1 165 I 21- -28

Наиболее высоким темпом клеточных делений характеризовались культуры, полученные из каллусов раннеспелых сортов.

При субкультивировании клеточных суспензий в среде с увеличенным вдвое содержанием 2,4-Д и добавлении кинетика - 0,2 мг/л в отдельных вариантах через 4-6 недель начинали образовываться оваль-" ные белые глобулярные структуры (эмбриоиды) размером 1-1,5 мм в диаметре, исходные экспланты-каллусы разбивались на более мелкие агрегаты удлиненной, овальной или сферической формы. Часть из них - с бурыми включениями, другая часть - с белыми побёгообразными отростками длиной 3-4 мм. При пересадке этих морфогенных структур

на агаризованную среду ( МайДоск ot а1., 1983) в большинства случаев на разросшихся каллусах наблюдался ризогонез, и лишь четырех сортов (Зыряновка, Омская 19, Диана 3 и Ангара 86) на крупных светлых каллусах появлялись мелкие зеленые участки - проэмбриоиды, часть из которых в дальнейшем на среде без гормонов образовывала побеги, другая часть не была способна к дальнейшему росту или развивалась в уродливые нежизнеспособные структуры (сильно закрученные, спиральные или белые побеги и листья).

Наиболее плотные клеточные суспензии, состоящие преимущественно (на 60-80$ у всех генотипов) из единичных каллусного типа клеток были получены при помещении сегментов незрелых соцветий непосредственно в гсидкую среду.

Через 6-8 недель плотность клеточной суспензии в отдельных вариантах достигала 300-500 тыс. кл/мл среды. Сами эксплашы разрастались и начинали сильно каллусировать. Через 3-4 недели появлялись мелкие белого цвета глобулярные структуры диаметром от 0,10,2 мм до 0,5 мм.

Клеточная селекция люцерны на устойчивость к фузариозу. В первой селективной системе испытывалось шесть различных концентраций фузариевой кислоты (2,4,6,8,10 п 12 мг/л среды). В контрольном варианте токсин в среду не добавляли. Клеточные суспензионные культуры высевали на селективные среды методом плейтинга. Через 3-4 недели начинали образовываться колонии клеток и нонно было проследить четкие различия з ингибировании их роста.

От 80 до 100$ клеток погибало при концентрации 10-12 мг/л или 0,05-0,06 мМ. Вшившие единичные клетки образовывали колонии диаметром 0,5-1,0 мм, но способные к нормальному росту в обычных

-л-

условиях. Очевидно, высокие дозы этого токсина необратимо нарушали биохимические процессы в клетке. При добавлении токсина в концентрации 8 мг/л (0,04- ыМ) удалось отобрать отдельные колонии клеток, способные к росту при неоднократном пассировании на токсической среде.

Концентрация 6 мг/л (0,03 м!<!) вызывала гибель более половины клеток, а концентрация 0,01-0,02 мМ не оказывала существенного ингибирующего воздействия на рост и развитие популяции клеток в сравнении с контролем (табл. 2).

Регенерацию растений осуществляли из клеток, способных развиваться на среде с сублетальной концентрацией токсина (0,04 ыМ).

С целью проверки стабильности полученных изменений и отбора наследуемых мутаций клеточные линии люцерны последовательно пассировали на селективной и обычной (для каллусогенезз) средах.

Какдый цикл селекции включал 2-3 пассата на селективной, 2-3 пассажа на контрольной и вновь 2-3 пассажа на селективной среде. Отобранные линии помещали на. среду для морфогенеза (с уменьшенным уровнем гормонов и добавлением ЕАП и ь-аспарагина). На. этой среде через 3-4 недали образовывались эибриоиды, зачатки побегов и корней.

Всего было получено 8 линий люцерны, устойчивых к токсину фузариевой кислоте.

Для отбора клеточных линии с комплексной устойчивостью к фу-зариозу испытьшались различные селективные среды, содержащие фуза- . риевую кислоту в сочетании с ферментами пектиназой "Мосегоаупе Н-Ю" и целлюлозой "Опогика 1$-Ю" фирмы 31£та . в качестве селективной было выбрано такое сочетание концентраций этих токсических компонентов, при котором погибало около 80% клеточных линий. Выжившие колонии клеток последовательно пассировали на се-

-а-

Таблица 2

ВЛИЯНИЕ ФУЗАРИЕВОй КИСЛОТЫ НА РОСТ И РАЗЗЙТЙЕ КЛЕТОК ¡1 КАЛЛУСОВ ЛЮЦЕРНЫ КЛОНА Р 54

Концентрация Жизнеспособность клеточных Нш'.рост массы каллусоз в % о? контроля

фуззриевой линий, % ' (100%)

кислоты, мМ -----------------------------------------------------------------------------

I цикл II цикл III цикл ГУ цикл I цикл II цикл III цикл 1У цикл

0 (контроль) • 95,5 90,6 92,4 96,0 100 100 . 100 100

0,01 • 85,0 81,7 79,9 75,5 96,6 97,0 95,2 86,6

0,02 67,8 63,8 60,6 59,4 81,7 80,4 73,8 65,7

0,03 51,8. 46,6 40,2 37,1 63,1 62,4 60,5 58,2

0,04 30,2 25,4 21,8 11,0 ^5,5 39,8 37,8 28,4

& 0.05 ' 23,0 13,9 19,2 0 29,1 17,5 16,0 -

1 0,06 13,6 0 0 0 14,6 - - -

НСРпц 1.8 3,1 1,9 1,2 1,0 1,6 3,5

яективной и обычной средах (для каллусогенеза) с целью выбраковки эпигенетических изменений. В результате использования комплексной селективной среды были отобраны две наиболее устойчивые клеточные линии, из которых получены два клона растений-регенерантов.

При использовании в среде ыеньаих концентраций ферментов и фузариевой кислоты отобранные линии несли эпигенетические изменения, а линии, отселектировашше при оптимальных сублетальных концентрациях, обладали наследственно закрепленной устойчивостью.

Высокие концентрации ферментов и фузариевой кислоты вызывали снижение жизнеспособности отобранных линий или полное отсутствие их роста. При испытании линий, отобранных только на сублетальных концентрациях фузариевой кислоты, полученные регенераты обладали устойчивостью солько к одному виду фузариев - F• oxysporum и не были устойчивы К другому - F* avenaceum.

Клеточная селекция на устойчивость к фузариозу только с использованием пекто- и целлюлолитических ферментов также позволила выделить устойчивые генотипы, однако их степень устойчивости была ниже, чем при использовании комплексной селективной среды (фуза-риевая кислота + ферменты).

Отбор in vitro устойчивых к йуззркозу линий пшеницы. Испы-тывались две селективные системы отбора. В первой токсическим аген том служила фузариевая кислота, во втором - фузариевая кислота coi местно с пекто- и целлюлолитическшш ферментами.

Изучение каллусогенеза на селективных средах с различным содержанием фузариевой кислоты (от 0,01 до 0,4 мМ) показало, что 50% клеточных линий пшеницы погибало при 0,1 мМ токсина в среде, а при 0,4 ыМ выживало менее 10% (табл. 3), причем в сильной степе-

Таблица 3

Влияние фузариевой кислоты на рост и жизнеспособность каллусов пшеницы

Жизнеспособность каллусов пшеницы Масса каллусов в % к контролю (% выживших на селективной среде)

Концентрация фузариевой к-ты, иМ Концентрация фузариевой к-ты, ыЫ"

0 0,01 0,05 0,1 0,2 0,4 0,01 0,05 0,1 0,2 0,4

Московская 35 85,4 ?3,1 63,7 48,7 18,9 0,3 92,6 81,6 60,5 33,1 7,6

Академия 96,2. 89,3 70,6 51,0 20,3 " 0,9 91,4 83,8 61,4 30,2 9,6

Ьнктз 94,5 85,6 68,3 46,3 21,2 1.0 90,7 77,1 59,2 33,1 7,8

Зыряновка ■ 89,6 80,0 71,8 50,2 19,6 0,7 95,8 85,6 65,0 34,0 6,3

Омская 19 90,9 78,0 60,4 41,8 17,4 0,6 90,6 79,5 60,5 38,5 6,8

Диана 3 91,5 77,1 61,6 46,0 15,5 0 92,3 80,2 66,8 38,1 -

Ангара 86 90,2 81,8 57,9 38,1 13,3 0 92,1 73,8 63,6 32,9 -

Highbury 82,2 70,7 54,9 37,4 16,1 0 89,6 70,5 59,7 30,4 -

йср05 10,8 9,6 6,7 5,2 3,7 0,5 11,4 8,1 5,8 7,4 1,1

ни шпшбировался их дальнейший рост.

В качестве рабочей била выбрана сублетальная концентрация Фузариевой кислоты (0,2 к,М), при которой погибало около 80% клеточных линии, но большая часть викивцпх сохраняла морфогенетичес-кий потенциал. В этих условиях удалось отобрать восемь клеточных линий сорта Диана 3, шесть линий сорта Зыряновка и три линии сорта Омская 19. При дальнейшем культивировании способность к эмбриогенезу проявили только по одной лшши каждого сорта. В результате получено 18 клонов растениц-регенерантов сорта Зыряновка, 15 -сорта Омская 19 и 9 - сорта Диана 3.

Для отбора растений, устойчивых к нескольким видам фузарпев, клеточные линии культивировали ,з среде, содержащей комплекс инги-бируюцих рост веществ (фузариевая кислота + пекто- и целлгололити-чоские ферменты). В качестве селективной концентрации использовали такое сочетание этих компонентов, при котором погибало около 80% клеточных линий. Единичные жизнеспособные каллусы мозшо было отобрать во втором цикле селекции при концентрации пектиназы - 0,25 ед/мл, целлюлазы -1,5 ед/мл и 0,05 мИ фузариевой кислоты. Полученные в этих условиях линии пшеницы, при пересадке в контрольные (неселективные) условия, сохраняли морфогенетический потенциал, образовывали эмбриоиды и побеги. Бсего таким способом было отобрано 2 линии сорта Зыряновка и одна линия сорта Омская 19.

Из них получено 18 клонов растений-регенерантов сорта Зыряновка и' 23 клона - сорта Омская 19.

Опенка растений-регенерантов на устойчивость к фузариозу. При помещении расгений-регенврзнтоз в сосуды с зараженной иноку-лвмоы фузариев почвой наблюдалась значительно большая их устойчи-

гость по сравнению с раотонняии исходного клопа. Результат атш.-за корневой системы показали, «то уровень распространении ¡1 развития фуаариоза растзниц-регсиераитов онл суасствсшго игам уроки: иорахенности растений исходного клопа лнцерпы.

Тестирование растений-роги^ерантов полученных линнй па устойчивость к другим видам фузарпеч, в частносги к О-Ъ&ГМХИ¿СС^, показало их сильную восприимчивость к атим патогенам по срааиснн;.' с реакцией устойчивости регенератов, отобранных на салекгивнкх средах с комплексом токсинов (тао'я. 4).

Таблица 4

Устойчивость рэогеник-реговврадооа н и исходного клопа люцорка к ¿узвркозу

Образцы

F. cncysporum P. averucoum

P. охузрогип +• У. ovenaceuu

P % E % P % к r. P fa R ;5

V 61,0 25, ,6 ъ0,0 54,2 100 t'5, ,6

Va 58,0 19, 56,4 28,0 76,3 31,

Vo 60,0 22, ,4 71,7 30,7 62,1 20, ,5

100 80, ,0 100 76,4 100 til, ,7

icp05 5,0 ,0 4,7 6,5 6, ,0

Испытания, проведанные но полевов искусственном пвелкциокноа уоне, показали наличие устойчивости у огселектпрояашюго in vitro слона R30 к нескольким видам Фузариев ( oxysporun, F.avena-:eum, F. sambucinum, F. culnorum, P. redolena, F. зо1апх, F. ja-ranicura).

При помещенид листьев растений-регенератов и исходных сортов пшеницы в фильтрат катпяноп культуральной яидкости «Г-узагкзг у/;е через 2-4 часа наблюдались существенные различия по степени и:: увядания. Наибольшей устойчивостью к действию культуральной '.л'.дкости Г.охуарогшв характеризовались линии, полученные во второй системе отбора. Они не отличались повышенной устойчивостью к К.Егашхпеагит л совместному воздействию обоих патогенов (табл.5).

Таблица 5

Сравнительная оценка растений-регснерантов пшеницы и исходных сортов по среднему баллу увядания листьев в культуральной фильтрате фузарисв

Исходный Ли- Вариант F.oxysporum i'.grarainearura F.oxysporum + сорт НИИ F.^ramineerum

2ч 4ч 8ч 2ч 4ч 8ч 2ч 4ч 8ч

I 2 3 4 с; ь 7 8 9 10 II 12

Омская 19 L 13 Отбор 0 1,2 3,8 0 1,6 2,5 0 2,0 4,5

Контроль О 3,1 5,<? 2,1 3,3 6,0 2,0 5,0 7,8

Исх.сорт 2,2 4,5 7,6 4,0 6,1 8,1 5,5 9 9

Зыряновка L15 Отбор 0 1,6 3,2 0 1,7 4,0 0 3,0 5,3

Контроль 3,9 6,4 8,1 3,2 6,3 9 5,1 7,7 9

L17 Отбор 1,0 2,2 ¿,6 1,9 2,8 4,3 1,1 3,5 5,2

Контроль 2,1 6,6 8,2 3,4 5,8 8,0 4,5 о 9

Исх.сорт 3,5 7,1 9 4,2 6,9 9 5,8 9 9 .

Диана 3 l19 Отбор 3,1 5,7 9 3,8 4,3 9 4,7 7,3 9

Контроль 3,3 5,7 9 4,0 6,2 9 5,2 7,7 9 .

Исх.сорт 3,6 9 4,9 7,0 9 6,0 9 9

нср05 0,8 1,2 0,2 1,0 1,2 0,9 1,6 1,1 1,0

о

Предварительная селекция на клеточной уровне повысила ступень устойчивости растений сро/;п регенератов линии L13 в 1,52 раза, линии L15 в 2-2,5 раза и линии L17 в 2-3 раза. Растения, полученные из клеточной линии L19 сорта Диана 3 оказались полностью неустойчивы к патогену. По-видимому, устойчивость клеточных культур к токсически:.; веществам и, соответственно, регенерированных из них растений не была генетически обусловленной, а определялась физиологической адаптацией клеток к селективным условиям.

При оценке методом увядания наибольшую устойчивость показала линия Ъ13 сорта Омская IS. Существенное превышение уровня устойчивости контрольных растений над растениями исходного генотипа свидетельствует о спонтанном появлении устойчивых растений в процессе культивирования in vitro . Однако балл восприимчивости этих растений к фузариозу был существенно выше, чем у ре-генерантоз, получений в селективной системе отбора.

Сомаклональная вариабельность растений-регенерантов люцерны и пшеницы. Растения-регенеринтк люцерны, полученные из клеток суспензионных культур, отличались от исходного клона большей (на 24-45 см) высотой, более быстрым (в 1,2-1,8 раза) отрастанием после укосов, большим количеством стеблей на растение и, соответственно, большим значением сырой и сухой массы растений. Наибольшие различия по высоте уезду регенерантами и исходным клоном наблюдались на 2-й год :;:изни полученных in vitro растений.

Устойчивые к фузариозу растепия-регенеранты люцерны имели более мощную, сильно развитую корневую систему, по типу стеркне-ыочковатую и более четко выраненныч грани стебля.

- If/-

Раотения-регенеран'ш шипцщ, отличались от исходных форм г.«.(.нь-ьысотой, но большим числом стеблей на растение и большей (в 1,5-.раз/О длиной Флагового листа.

•1 Ы Е О Д II

j Клеточная. селекция растений на устойчивость к фузариозу наиболее

¡октеша на комплексной селективт£ среде, вювочаадей фузарковую г:;.слоту совместно с пысто- л пеллшслстпчесгаши ферментами. Отбор в :niix условиях позг.оля.;т выявить генотипы, устойчивые к различным ) i.. !>,:г. узарксв.

¿. Доказано, что непосредственное культивирование эксплантов в жид-Iлетательной среде с повксеинш иоодпшпдо ауксинов позволяет ь"с?ро получать готорогенике глз^очпмэ суспензионные культуры, наи-оод'Л: пригодные для меточной солекш/..

'i. Разработан метод ускоренной оценки растений на устойчивость к (.узариозу, позволяющий отбирать наиболее устойчивые формы на ранних этапах селекции.

<±. Выявлена' связь интенсивности каллусогенеза эксплантов пшеницы с. признаком раннеспелости исходного генотипа.

Ь. Признак устойчивости к фузариозу в процессе селекции клеток и тканей in vitro мокетг иметь как генетическую, так и эпигенетическую природу. Эпигенетические изменения устраняются при чередовании условий культивирования.

6. Результаты полевых и лабораторных методов оцанкп растений-регоне-рантов и их потомстеэ показали, что признак устойчивости, отобранный на клеточном уровне, эксирессируется на уровне целого растения и пзсодготся по наследству, что докузнлэет генетическую обусловленное^ признака устойчивости к фузариозу у отселектированных линий.

7. Клеточная селекция люцор :п повысила степень устойчивое'*1:: pacTOiniif-pcrcHCpanTOB в 2-4 раза по сравнении с исходным клоном; шешшд - в 2-3 раза, по сравнению с уровнем устойчивости исходных сортов.

8. 1,!орфо(Т»!зиологичсс1а:о отлпчля растепий-регенераптов дгаг-р-нп и пшениц!! от исходных форм обусловлены генетической гетерогенностью клеточных популяций.

9. Использование культуры ¡слеток к тканей d селекции растений на устойчивость к фузарнозу позволяет бистро к с ганималыш-ми затратами труда и средств получать резистентные fropni.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБтЖОЗ-ШИ-К ПО MATl'KLULU. ДОСЕРТ.\Ц!1Л

1. Мезенцева О.Ю. Использование тканевю: и клеточшпе культур в селекции на устойчивость к (тагаопатогонам// Селекция и семеноводство. - 1990. - М. - С. 52-G2.

2. Мезенцева О.Ю*. Способ оценки растений на устойчивость к фузарнозу// Бюллетень ПШТ СССР Открытия и изобретения/ A.C.

)5 1598920. - 1990. - J5 38. - С. IT.

3. 'Мезенцева О.Ю. Способ ускоренной оценки растений на устойчивость к фузарнозу// Доклада BA'JXiüIJI. - J99I. - Г2. - С.61-63.

4. Мезенцева О.Ю. Получение методом клеточной селекции рас-тений-регенерантоз люцерны, устойчивых г. Еизаг1лаа oxysporum // Тезисы докладов Всесоюзной научной конференции молодых ученых

и аспирантов по актуальным проблемам интенсификации кормопроизводства.' - 1991. - М. i ВЛОЖИ, БЯШК. - С. 88-89.

5. Мезенцева О.Ю. Выявление оптимальных селективных условий для отбора клеточных линей пшеннцы и люцерны на устойчивость к' фузарнозу// Тезисы выступлений. Материал! Всесоюзной научной конференции по сельскохозяйственной биотехнологии.-Целиноград.-TC0I.-С. 50-51. ' ■ : '

-¿и-